多能哺乳动物细胞的体外胰腺分化
阅读：194发布：2020-05-13
专利汇可以提供多能哺乳动物细胞的体外胰腺分化专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及多能细胞在体外分化为胰腺祖细胞，通过i)在定形内胚层(DE)培养基中培养多能细胞以生成定形内胚层细胞的细胞群，该培养基包括TGFβ配体、 成 纤维 细胞 生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、PI3K 抑制剂 和可选的GSK3β抑制剂，ii)在第一胰腺培养基中培养定形内胚层细胞以生成背侧前肠细胞的细胞群，所述第一胰腺培养基含有激活素拮抗剂；FGF；视黄酸；和BMP抑制剂；iii)在第二胰腺培养基中培养所述背侧前肠细胞，所述第二胰腺培养基含有FGF、视黄酸、BMP抑制剂和hedgehog 信号 传导抑制剂，以及；iv)在第三胰腺培养基中培养内胚层细胞，所述第三胰腺培养基含有FGF。这样生成的祖细胞可以进一步分 化成 胰腺内分泌细胞。这些方法可能是有用的，例如，在生成胰腺细胞用于 治疗 或 疾病 建模时。，下面是多能哺乳动物细胞的体外胰腺分化专利的具体信息内容。
1.一种产生胰腺祖细胞的细胞群的方法，包括：
i)提供人类诱导多能干(iPS)细胞的细胞群；
ii)在定形内胚层(DE)诱导培养基中培养所述细胞群，以产生定形内胚层细胞的细胞群，其中，所述定形内胚层(DE)诱导培养基是一种化学成分确定的培养基，它包括TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、PI3K抑制剂和可选的GSK3β抑制剂；
iii)在第一胰诱导培养基中培养所述定形内胚层细胞的细胞群，以产生背侧前肠细胞的细胞群，其中，所述第一胰诱导培养基是一种化学成分确定的培养基，它包括激活素拮抗剂；FGF；视黄酸；和BMP抑制剂；
iv)在第二胰诱导培养基中培养所述背侧前肠细胞，其中，所述第二胰诱导培养基是一种化学成分确定的培养基，它包括FGF、视黄酸、BMP抑制剂和hedgehog信号传导抑制剂；
v)在第三胰诱导培养基中培养在步骤iv)中产生的细胞，其中，所述第三胰诱导培养基是一种化学成分确定的培养基，它包括FGF；
从而产生胰腺祖细胞的细胞群。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，定形内胚层(DE)诱导培养基是一种化学成分确定的培养基，它包括TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和PI3K抑制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述定形内胚层(DE)诱导培养基是一种化学成分确定的培养基，由添加有激活素、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和LY294002的基础培养基组成。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，人类iPS细胞在所述培养基中培养2至4天，以产生DE细胞的细胞群。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(ii)包括：
(a)在所述DE诱导培养基中培养人类iPS细胞的细胞群，其中，所述DE诱导培养基进一步包括GSK3β抑制剂，
(b)在不含GSK3β抑制剂的定形内胚层诱导培养基中进一步培养所述细胞群；以及，(c)在含有TGFβ配体和成纤维细胞生长因子的前定形内胚层(ADE)诱导培养基中进一步培养所述细胞群。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述前定形内胚层(ADE)诱导培养基是一种化学成分确定的培养基，由添加有激活素和成纤维细胞生长因子(FGF)的基础培养基组成。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述细胞群在步骤a)至c)的每一步中培养24小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述定形内胚层细胞表达SOX17、CXCR4和GSC。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一胰诱导培养基是一种化学成分确定的培养基，由添加有SB-431542；FGF；视黄酸；和头蛋白的基础培养基组成。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述背侧前肠细胞表达RFX6、FOXA2、HNF1b、SOX2、HNF4a和HLXB9。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二胰诱导培养基是一种化学成分确定的培养基，由添加有FGF；视黄酸；头蛋白；和KAAD-环巴胺的基础培养基组成。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第三胰诱导培养基是一种化学成分确定的培养基，由添加有FGF的基础培养基组成。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第三胰诱导培养基还包含视黄酸。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述胰腺祖细胞表达PDX1、SOX9、HNF6、NKX6.1和PTF1a。
15.一种产生胰腺内分泌细胞的细胞群的方法，包括通过根据权利要求1所述的方法产生胰腺祖细胞的细胞群，并使胰腺祖细胞在体外成熟以产生胰腺内分泌细胞的细胞群。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述胰腺祖细胞通过以下步骤成熟i)在第一内分泌诱导培养基中培养和ii)在第二内分泌诱导培养基中培养，以产生所述胰腺内分泌细胞的细胞群，
其中，所述第一内分泌诱导培养基是化学成分确定的培养基，包括Notch信号传导抑制剂；且所述第二内分泌诱导培养基是不含分化因子的化学成分确定的培养基。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一内分泌诱导培养基是由一种补充基础培养基和N-[N-(3,5-双氟苯乙酰基)-1-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)组成的一种化学成分确定的培养基；以及所述第二内分泌诱导培养基是由补充基础培养基组成的一种化学成分确定的培养基。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述胰腺祖细胞通过以下步骤成熟i)在第一内分泌诱导培养基中培养和ii)在第二内分泌诱导培养基中培养，以产生所述胰腺内分泌细胞的细胞群，
其中，所述第一内分泌诱导培养基是化学成分确定的培养基，包括Notch信号传导抑制剂和视黄酸；且所述第二内分泌诱导培养基是除了视黄酸以外不含分化因子的化学成分确定的培养基。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一内分泌诱导培养基是由补充基础培养基、N-[N-(3,5-双氟苯乙酰基)-1-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)和视黄酸组成的一种化学成分确定的培养基；以及所述第二内分泌诱导培养基是由补充基础培养基和视黄酸组成的一种化学成分确定的培养基。
20.根据权利要求15所述的方法，其中，所述胰腺内分泌细胞表达NGN3、INS、SST和GLU。
21.根据权利要求1所述的方法，包括监测和/或检测在分化中的细胞的所述细胞群中的一种或多种细胞标志物的表达。
22.根据权利要求1所述的方法，包括扩大所述胰腺祖细胞的细胞群。
23.根据权利要求22所述的方法，包括培养和维持所述胰腺祖细胞的细胞群。
24.根据权利要求23所述的方法，包括存储所述胰腺祖细胞的细胞群。
25.根据权利要求15所述的方法，包括培养和维持所述胰腺内分泌细胞的细胞群。
26.根据权利要求25所述的方法，包括存储所述胰腺内分泌细胞的细胞群。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人类诱导多能干细胞是来自于具有与胰腺病症相关的遗传背景的个体的诱导多能干细胞。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人类诱导多能干细胞是来自于具有与胰腺病症相关的遗传疾病的个体的诱导多能干细胞。
多能哺乳动物细胞的体外胰腺分化
技术领域
[0001] 本发明涉及体外诱导多能哺乳动物细胞中的胰腺分化。
背景技术
[0002] 胰腺β细胞的生成代表了再生医学的主要目标。事实上，这些细胞的大量供应将使基于细胞的糖尿病疗法得以发展，该疗法目前受限于缺乏捐赠器官和在体外扩大胰岛素分泌细胞的难度。胚胎来源(人类胚胎干细胞或hESC)[1]或由重编程体细胞(人类诱导多能干细胞或hIPSC)[2]产生的人类多能干细胞(hPSC)提供了绕过这些限制的前景。事实上，这些细胞能够在体外无限增殖，同时保持分化成各种类型细胞的能力，包括胰腺祖细胞[3-6]。然而，在确定成分培养条件下允许生成这些细胞的同质群体的健全的方法尚未确立。实际上，现有的方法包含一些未限定的动物产品，如饲养物、胎牛血清(FBS)和基质胶。
[0004] 大多数目前用于hPSC直接分化的培养系统模仿正常发育，因为这种方法可以促进全功能的细胞类型的生成。因此，来自于小鼠或其它脊椎动物模型研究的知识已被用来提供人类hPSC向特定种系发展的策略的信息。
[0005] 胰腺和肝脏约在胚胎第8.5天到9.5天，在诱导信号的影响下从发育中的原始前肠的相邻区域出现，这些诱导信号由附近的中胚层分泌[9]。这些信号有可能指挥对胰腺特化必要的转录因子的表达，如标志着胰芽形成前的背侧前肠的HXLB9[10，11]和标志着腹侧和背侧胰芽出现的前肠区域的PDX1[12，13]。
[0006] 新形成的胰腺祖很快表达其它的标志物，包括PTF1A、NKX6.1和SOX9，这些祖细胞产生了胰腺的内分泌(胰岛)和外分泌(腺泡和导管细胞)细胞。类似的机制控制着肝的特化，虽然它们涉及不同的转录因子组，如HEX、GATA6、PROX1和HNF4α[14]和不同的信号传导通路，如BMP和的FGF[15]。虽有这样广泛的知识，但是用以协调胰腺或肝祖细胞转录网的细胞外信号传导通路的分子机制，尤其是在人体内的机制，仍有待阐明，而且hPSC可能具有独特的优势来完成这一主要任务。
发明内容
[0007] 本发明涉及一种用于多能细胞体外高效分化成胰腺祖细胞和胰腺内分泌细胞的方法。本方法对于例如在基于细胞的疗法或疾病建模中产生胰腺细胞可能是有用的。
[0008] 本发明的一个方面提供了一种产生胰腺祖细胞的细胞群的方法，包括：
[0009] i)提供多能细胞的细胞群；
[0010] ii)在定形内胚层(DE)诱导培养基中培养该细胞群，以产生定形内胚层细胞的细胞群，其中，所述DE诱导培养基含有TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、PI3K抑制剂和可选的GSK3β抑制剂；
[0011] iii)在第一胰诱导培养基中培养定形内胚层细胞的细胞群，以产生背侧前肠细胞的细胞群，该第一胰诱导培养基含有激活素拮抗剂；FGF；视黄酸；和BMP抑制剂；
[0012] iv)在第二胰诱导培养基中培养背侧前肠细胞，该第二胰诱导培养基含有FGF、视黄酸、BMP抑制剂和hedgehog信号传导抑制剂；
[0013] v)在第三胰诱导培养基中培养内胚层细胞，该第三胰诱导培养基含有FGF；
[0014] 从而产生胰腺祖细胞的细胞群。
[0015] 所述胰腺祖细胞可进一步分化成胰腺内分泌细胞。例如，一种方法可以进一步包括；
[0016] (vi)在第一内分泌诱导培养基和第二内分泌诱导培养基中培养胰腺祖细胞的细胞群，以产生胰腺内分泌细胞的细胞群。
[0017] 多能细胞是一种显示出未分化的表型的细胞，具有潜在的多能性，即它能够分化成三个胚层(内胚层、中胚层和内胚层)中的任何一层的任何胎儿或成人细胞类型。多能细胞不同于全能细胞，其不能产生胚外细胞系。多能细胞可以表达下列多能相关标志物中的一种或多种：Oct4、Sox2、碱性磷酸酶、POU5f1、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60、KLF-4和c-myc，优选为POU5f1、NANOG和SOX2。人类多能细胞可能会缺乏与特定分化命运相关的标志物，如Bra、Sox17、FoxA2、αFP、Sox1、NCAM、GATA6、GATA4、Hand1和CDX2。
[0018] 多能细胞可以是哺乳动物细胞，优选为人类细胞。
[0019] 多能细胞群可以是克隆的，即从单个共同的祖先细胞传代而来的遗传上相同的细胞。
[0020] 适用于本方法的多能细胞群可以基本上不含一种或多种其它细胞类型。多能细胞可以是，例如，使用本领域技术人员所公知的任何技术由其他类型的细胞中分离而来，上述本领域技术人员所公知的任何技术包括那些基于依靠抗体和磁珠或荧光激活细胞分选(MACS或FACS)的细胞外表位识别的技术，这些技术包括使用抗在干细胞上发现的分子的胞外区域如SSEA4的抗体。
[0021] 多能细胞可以包括胚胎干细胞(ESC)、胎儿和成人体干细胞和iPS细胞。
[0022] 合适的胚胎干细胞可以用常规技术来获得。例如，ESC细胞可以由培养的ESC细胞系中获得，例如，从hESC细胞系中获得。许多培养的hESC细胞系是可从储存库(例如，美国国立卫生研究院的人类胚胎干细胞登记处)公开获得的，如CHB-1至CHB-12、RUES1至RUES3、HUES1至HUES28、HUES45、HUES48、HUES49、HUES53、HUES62至HUES66、WA01(H1)、WA07(H7)、WA09(H9)、WA13(H13)、WA14(H14)、NYUES1至NYUES7、MFS5和UCLA1至UCLA3。合适的人类胚胎干细胞系的其它实例在这些文献中描述(Thomson JA等人.科学282：1145-1147(1998)；Reubinoff等人.自然生物技术18：399-404(2000)；Cowan,C.A.等人.英格兰医学杂志.350，
1353-1356(2004)，Gage,F.H.等人.神经科学年度评论.18 159-192(1995)；以及Gotlieb(2002)神经科学年度评论25 381-407)；Carpenter等人.干细胞.5(1)：79-88(2003)。潜在临床级hESC在Klimanskaya,I.等人.柳叶刀365，1636-1641(2005)以及Ludwig,T.E.等人.自然生物技术.24，185-187(2006)中有描述。
1353-1356(2004)，Gage,F.H.等人.神经科学年度评论.18 159-192(1995)；以及Gotlieb(2002)神经科学年度评论25 381-407)；Carpenter等人.干细胞.5(1)：79-88(2003)。潜在临床级hESC在Klimanskaya,I.等人.柳叶刀365，1636-1641(2005)以及Ludwig,T.E.等人.自然生物技术.24，185-187(2006)中有描述。
[0023] 合适的hESC可以在不破坏人类胚胎的情况下获得。
[0024] 在其他具体实施方式中，所述多能细胞不是hESC，并且可以是，例如，胎儿或成人体干细胞或iPS细胞，优选为人类iPS细胞。
[0025] iPS细胞是由非多能、完全分化的始祖细胞衍生而来的多能细胞。合适的始祖细胞包括成人成纤维细胞和外周血细胞。始祖细胞通常通过引入多能性基因或蛋白，如Oct4、Sox2和Sox1到细胞内进行重编程。上述基因或蛋白可以通过任何合适的技术，包括质粒或更优选为病毒转染或直接蛋白输送，被引入分化的细胞内。其它基因，例如Kif基因，如Kif-1、-2、-4和-5；Myc基因，如C-myc、L-myc和N-myc；nanog；以及Lin28也可导入细胞以增加诱导效率。引入多能性基因或蛋白后，可以培养所述始祖细胞。表达多能性标志物的细胞可被分离和/或纯化，以产生iPS细胞的细胞群。用于产生iPS细胞的技术是本领域众所周知的(Yamanaka等人自然2007；448：313-7；Yamanaka 6 2007年6月7日；1(1)：39-49；Kim等人自然.2008年7月31日；454(7204)：646-50；Takahashi细胞.2007年11月30日；131(5)：861-
72.Park等人自然.2008年1月10日；451(7175)：141-6；Kimet等人细胞干细胞.2009年6月5日；4(6)：472-6；Vallier,L.等人.干细胞，2009.9999(999A)：无页数)
72.Park等人自然.2008年1月10日；451(7175)：141-6；Kimet等人细胞干细胞.2009年6月5日；4(6)：472-6；Vallier,L.等人.干细胞，2009.9999(999A)：无页数)
[0026] iPS细胞可来源于取自没有遗传病症的个体的细胞，如成纤维细胞。衍生自没有遗传病症个体的iPS细胞可以如本文所述，用以产生具有正常(即非疾病相关的)基因型的胰腺祖细胞和胰腺内分泌细胞。
[0027] iPS细胞可来源于取自具有不寻常的遗传背景的个体的细胞，如成纤维细胞。例如，iPS细胞可从取自具有一种胰腺状况，例如糖尿病病症如1型和2型糖尿病的个体的细胞中、具有一种高风险胰腺状况和/或一种低风险胰腺状况的个体产生。本文所述的由具有不寻常的遗传背景的个体产生的胰腺细胞可能在研究胰腺状况，如糖尿病，的机制和确定治疗靶点中是有用的。
[0028] iPS细胞可以来源于取自具有遗传性疾病的个体的细胞，如成纤维细胞，例如影响胰腺发育和/或胰腺功能障碍相关的遗传性疾病，包括糖尿病病症(如1型和2型糖尿病)、胰发育不全、遗传性胰腺炎、家族性胰腺炎、舒-戴二氏综合征(Schwachman-Diamond syndrome)和胰腺癌或具有胰腺症状或并发症的遗传性疾病。遗传性疾病可以包括单基因疾病。
[0030] 由取自具有遗传性疾病的个体的细胞产生的iPS细胞可如本文所述地用以生成具有该遗传性疾病基因型的胰腺细胞，所述遗传性疾病例如影响胰腺发育和/或胰腺功能障碍相关的遗传性疾病。典型地，所述胰腺细胞会含有与遗传性疾病相关的基因突变或缺陷。这些细胞可以是对治疗患有如上所述的遗传性疾病的患者或对包括糖尿病病症在内的胰腺疾病的建模有用的。
[0031] 多能细胞可以用常规的技术从多能细胞系中获得(Vallier,L.等人发育生物学275，403-421(2004)，Cowan，C.A.等人.新英格兰医学杂志.350，1353-1356(2004)，Joannides,A.等人.干细胞24，230-235(2006)Klimanskaya,I.等人.柳叶刀365，1636-1641(2005)，Ludwig,T.E.等人.自然生物技术.24，185-187(2006))。本方法中使用的多能细胞可以生长在限定的条件下或在饲养细胞上。例如，多能干细胞可以在培养皿内，在适当密度
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(例如10至10个细胞/60mm皿)的一层饲养细胞上培养，饲养细胞如辐照小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，或在一个适当的具备饲养物条件的底物上或定义的培养基中培养。本方法中使用的多能细胞可通过酶法或机械手段进行传代。用于多能细胞的合适的培养基包括敲除Dulbecco改良的Eagle培养基(KO-DMEM)，其中添加有20％的血清替代品，1％的非必需氨基酸，1mM的L-谷氨酰胺，0.1mM的β-巯基乙醇和4ng/ml至10ng/mL的FGF2。
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(例如10至10个细胞/60mm皿)的一层饲养细胞上培养，饲养细胞如辐照小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，或在一个适当的具备饲养物条件的底物上或定义的培养基中培养。本方法中使用的多能细胞可通过酶法或机械手段进行传代。用于多能细胞的合适的培养基包括敲除Dulbecco改良的Eagle培养基(KO-DMEM)，其中添加有20％的血清替代品，1％的非必需氨基酸，1mM的L-谷氨酰胺，0.1mM的β-巯基乙醇和4ng/ml至10ng/mL的FGF2。
[0032] 用于多能细胞的其它合适的培养基包括添加有4ng/ml的FGF2的敲除(KS)培养基；添加有20％的血清替代品、1％的非必需氨基酸、1mM的L-谷氨酰胺、0.1mM的β-巯基乙醇和
4ng/ml至10ng/mL的人FGF2的敲除Dulbecco改良的Eagle培养基(KO-DMEM)；以及添加有
20％敲除血清替代品(KSR)、6ng/ml的FGF2(PeproTech公司)、1mM的L-谷氨酰胺、100μM的非必需氨基酸、100μM的2-巯基乙醇、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的DMEM/F12。
4ng/ml至10ng/mL的人FGF2的敲除Dulbecco改良的Eagle培养基(KO-DMEM)；以及添加有
20％敲除血清替代品(KSR)、6ng/ml的FGF2(PeproTech公司)、1mM的L-谷氨酰胺、100μM的非必需氨基酸、100μM的2-巯基乙醇、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的DMEM/F12。
[0033] 在优选的具体实施方式中，用于本方法的多能细胞群可以在化学成分确定的培养基(CDM)中培养，该培养基中含有激活素A(10ng/mL)和FGF2(20ng/mL)，以保持下文所述的诱导分化前的多能性(Vallier等人，2005)。多能细胞可以使用无胶原酶试剂获得，例如AccutaseTM(BioWest公司)。
[0034] 在一些具体实施方式中，多能干细胞可以包括一种报告基因，优选为一种荧光报告基因，其可操作地连接至一个组织特异性启动子(即胰腺特异性启动子)。分化成如本文所述的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞后，表达报告基因的细胞可以从其他细胞类型中被分离和/或纯化出，例如通过荧光激活细胞分选(FACS)。
[0035] 所述多能干细胞可以经过四步过程分化成胰腺祖细胞。首先，多能细胞群被诱导分化成定形内胚层(DE)细胞的细胞群。然后将DE细胞诱导分化成背侧前肠细胞，再经过两个步骤被诱导分化成胰腺祖细胞。
[0036] 每一步中所述细胞群的分化程度可以在细胞培养期间通过监测和/或检测分化细胞群中的一种或多种细胞标志物的表达来确定。例如，可以检测分化程度较高的细胞类型中特征性的标记物表达的提高，或分化程度较低的细胞类型中特征性的标记物表达的下降。细胞标志物的表达可通过任何合适的技术来确定，包括免疫细胞化学、免疫荧光、RT-PCR、免疫印迹、荧光激活细胞分选(FACS)和酶法分析。
[0037] 每个步骤之后，该步骤产生的部分分化的细胞群可以是基本上不含其他细胞类型的。例如，在培养基中培养之后，该群可以包含85％或更多、90％或更多、95％或更多、或98％或更多的部分分化的细胞。优选地，细胞群不含其它细胞类型的程度已经足够，没有必要再进行纯化。如果需要的话，部分分化的细胞群可用任何方便的技术进行纯化，如FACS。
[0038] 通过本文所述的方法的一个步骤产生的部分分化的细胞群可以在下一分化步骤之前被培养、维持或扩大。部分分化的细胞可以通过任何方便的技术进行扩大。
[0039] 每一步的分化诱导涉及在化学成分确定的培养基(CDM)中培养细胞，所述化学成分确定的培养基优选为人源化CDM，其添加有一组诱导细胞进行分化步骤的分化因子。每个培养基所列出的一组分化因子最好是详尽的，且培养基可以不含其它分化因子。
[0040] 化学成分确定的培养基(CDM)是用于培养细胞的营养液，其仅包含指定的成分，优选为已知化学结构的成分。CDM不含不确定的成分或包括不确定成分的组分，如饲养细胞、基质细胞、血清、基质胶、血清白蛋白和复杂的细胞外基质。优选地，化学成分确定的培养基是人源化的。人源化化学成分确定的培养基中不含来自非人类的动物的成分或添加物，如胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)和小鼠饲养细胞。条件培养基包括从来自培养的细胞的不明确的成分，并且不是化学成分确定的。
[0041] 合适的化学成分确定的基础培养基包括高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Price等人焦点(2003)25 3-6)。高级DMEM是本领域中公知的技术且可容易地从商业来源获得(例如生命科技公司，美国)。高级DMEM中的成分示于表1。在一些优选的具体实施方式中，高级DMEM可以在本文所述的胰诱导培养基中作为基础培养基使用。
[0042] 其它合适的化学成分确定的基础培养基包括CDM-PVA(Johansson和Wiles(1995)分子细胞生物学15，141-151)，其添加有聚乙烯醇、胰岛素、转铁蛋白和成分确定的脂质。Johansson和Wiles的CDM组成：50％的IMDM(Gibco公司)加50％的F12NUT-MIX(Gibco公司)；
7μg/ml胰岛素；15μg/ml转铁蛋白；1mg/ml的聚乙烯醇(PVA；1％的化学成分确定的脂质浓缩物(Invitrogen公司)；和450μM1-硫代甘油。在一些优选的具体实施方式中，CDM-PVA可以在本文所述的内胚层诱导培养基中使用。
7μg/ml胰岛素；15μg/ml转铁蛋白；1mg/ml的聚乙烯醇(PVA；1％的化学成分确定的脂质浓缩物(Invitrogen公司)；和450μM1-硫代甘油。在一些优选的具体实施方式中，CDM-PVA可以在本文所述的内胚层诱导培养基中使用。
[0043] 其它合适的化学成分确定的基础培养基包括RPMI-1640(Moore,G.E.和Woods L.K.,(1976年)组织培养协会手册.3，503-508)。在一些优选的具体实施方式中，RPMI-1640可以使用在本文所述的前定形内胚层诱导培养基中。
[0044] 其它合适的化学成分确定的基础培养基是本领域已知的并且可从商业来源(例如，Sigma-Aldrich公司，密西根，美国；生命科技公司，美国)获得。
[0045] 如本文所述的合适的化学成分确定的基础培养基可以包括无血清培养基添加物(即含有添加物的基础培养基)。合适的无血清培养基添加物包括B27和NS21并且如本文其它地方所描述的。优选地，本文所述的培养基是无血清的。使用无血清条件和无动物产品有助于临床应用的扩大培养。
[0046] 化学成分确定的基础培养基，如CDM/PVA、RPMI-1640或高级DMEM，可以添加一组特定的分化因子以制成内胚层或胰诱导培养基，或如本文所述的内分泌诱导。
[0047] 分化因子是调节信号传导通路的因子，信号传导通路介导哺乳动物细胞的分化，前述调节如促进或抑制。分化因子可包括生长因子和抑制剂，其调节一个或多个激活素/Nodal、FGF、Wnt或BMP信号传导通路。分化因子是蛋白质，优选为重组人的因子。
[0048] 分化因子的实例包括FGF2、BMP4、视黄酸、TGF、GDF3、LIF、IL、激活素和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂。
[0049] 在一种或多种本文所述的培养基中使用的分化因子包括TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、PI3K抑制剂、激活素/TGFβ拮抗剂；视黄酸；BMP拮抗剂；hedgehog信号传导抑制剂；notch信号传导抑制剂和GSK3β抑制剂。
[0050] TGFβ配体是TGFβ超家族的肽，在哺乳动物细胞内刺激SMAD2和SMAD3介导的细胞内信号传导通路。TGFβ超家族的成员具有一个特征结构，并且是本领域中众所周知的。
[0051] 该TGFβ配体可以是激活素、TGFβ、Nodal或GDF3，优选为激活素。
[0052] 激活素(激活素A：NCBI GeneID：3624核酸参考序列NM_002192.2GI：62953137，氨基酸参考序列NP_002183.1GI：4504699)是二聚体多肽，其通过刺激激活素/Nodal通路发挥一系列的细胞效应(Vallier等人，细胞科学118：4495-4509(2005))。激活素是容易从商业来源获得的(例如Stemgent公司，马萨诸塞州，美国)。在本文中所描述的培养基中激活素适宜的浓度可以是 优选为100ng/ml左右。
[0053] TGFβ(NCBI GeneID：7040核酸参考序列NM_000660.4GI：260655621，氨基酸参考序列NP_000651.3GI：63025222)是一种同二聚体多肽，其调节增殖和分化(Watabe，T.等人(2009).细胞研究.19：103-115)。重组人TGFβ是容易从商业来源获得的(例如Stemgent公司，马萨诸塞州，美国)。培养基中TGFβ适宜的浓度可以是 优选为100ng/ml左右。
[0054] Nodal(NCBI GeneID 4838核酸序列参考NM_018055.4GI：222352097，氨基酸序列参考NP_060525.3GI：222352098)是TGFβ超家族中的一员，其调节分化(Hamada等人自然综述遗传学.3(2)：103-13)。Nodal是容易从商业来源获得的(例如Abcam有限公司，英国)。培养基中TGFβ适宜的浓度可以是 优选为100ng/ml左右。
[0055] GDF3(NCBI GeneID 9573核酸序列参考NM_020634.1GI：10190669，氨基酸序列参考NP_065685.1GI：10190670)是TGFβ超家族的一员，它的特点具有多元蛋白酶解加工位点，该位点被切割生成含有7个保守半胱氨酸残基的成熟GDF3蛋白。培养基中GDF3适宜的浓度可以是 优选为100ng/ml左右。
[0056] 成纤维细胞生长因子是一种其通过结合到成纤维细胞生长因子受体(FGFR)刺激细胞生长、增殖和细胞分化的蛋白因子。适合的成纤维细胞生长因子包括FGF家族的任何成员，例如FGF1至FGF14以及FGF15至FGF23中的任意一个。
[0057] 优选地，所述成纤维细胞生长因子是FGF2(NCBI GeneID：2247，核酸序列NM_002006.3GI：41352694，氨基酸序列NP_001997.4GI：41352695)；FGF7(也称为角质化细胞生长因子(或KGF)，NCBI GeneID:2247，核酸序列NM_002006.3GI：41352694，氨基酸序列NP_
001997.4GI：41352695)；或FGF10(NCBI GeneID:2247，核酸序列NM_002006.3GI：41352694，氨基酸序列NP_001997.4GI：41352695)。最优选地，所述成纤维细胞生长因子是FGF10(Amit,M.等人，发育生物学227：271-278(2000))。在本文中所描述的培养基中FGF适宜的浓度可以是 例如 或 优选为
20ng/ml左右。
001997.4GI：41352695)；或FGF10(NCBI GeneID:2247，核酸序列NM_002006.3GI：41352694，氨基酸序列NP_001997.4GI：41352695)。最优选地，所述成纤维细胞生长因子是FGF10(Amit,M.等人，发育生物学227：271-278(2000))。在本文中所描述的培养基中FGF适宜的浓度可以是 例如 或 优选为
20ng/ml左右。
[0058] 成纤维细胞生长因子，如FGF2、FGF7和FGF10，可以用常规重组技术来制备，或从商业供应商(例如，研发系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州；Stemgent公司，美国)处获得。
[0059] 在一些具体实施方式中，FGF可以被表皮生长因子(EGF；NCBI GeneID：1950，核酸序列NM_001178130.1GI：296011012，氨基酸序列NP_001171601.1GI：296011013)。表皮生长因子是一种通过结合至一表皮生长因子受体(EGFR)刺激细胞生长、增殖和细胞分化的蛋白因子。EGF可以用常规重组技术来制备或从商业供应商(例如，研发系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州；Stemgent公司，美国)处获得。
[0060] 骨形态发生蛋白(BMP)骨形态发生蛋白与骨形态发生蛋白受体(BMPR)结合，并通过由SMAD1、SMAD5和SMAD9介导的通路刺激细胞内信号传导。合适的骨形态发生蛋白包括BMP家庭的任何成员，例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6或BMP7。优选地，第二TGFβ配体是BMP2(NCBI GeneID：650，核酸序列NM_001200.2GI：80861484；氨基酸序列NP_001191.1GI：4557369)或BMP4(NCBI GeneID：652，核酸序列NM_001202.3GI：157276592；氨基酸序列NP_
001193.2GI：157276593)。合适的骨形态发生蛋白包括BMP4。在本文所描述的培养基中骨形态发生蛋白适宜的浓度，可以是 优选为10ng/ml左右，其中骨形态发生蛋
白例如BMP2或BMP4。
001193.2GI：157276593)。合适的骨形态发生蛋白包括BMP4。在本文所描述的培养基中骨形态发生蛋白适宜的浓度，可以是 优选为10ng/ml左右，其中骨形态发生蛋
白例如BMP2或BMP4。
[0061] 骨形态发生蛋白可以用常规重组技术来制备或从商业供应商(例如，研发系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州；Stemgent公司，美国)处获得。
[0062] PI3K抑制剂抑制磷脂酰肌醇3-激酶，如磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(EC2.7.1.153)的活性。
[0063] 合适的PI3K抑制剂包括渥曼青霉素；LY301497(17-b-羟基渥曼青霉素)；LY294002(2-吗啉-4-基-8-苯基铬-4-酮：Maclean等人(2007)干细胞25 29-38)；CLB1309(KN309：(±)-2-({1-[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧代-吡啶并[1,2-a]嘧啶-9-基]乙基}氨基)苯甲酸)；PX-866((1E，4S，4aR，5R，6aS，9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(双-2-丙烯-1-基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧甲基)-4a,6a-二甲基环戊烷[5,6]萘并[1,2-C]吡喃-2,7,10(1H)-三酮)；IC87114(喹诺酮吡咯并嘧啶)；GDC-0941(2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)-1-哌嗪基]甲基]-4-(4-吗啉基)-噻吩并[3,2-d]嘧啶)；TGX-221(7-甲基-2-(4-吗啉基)-9-[1-(苯基氨基)乙基]-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮)，槲皮素；
BEZ235；XL147；Xl765；PX-866；ZSTK474(2-(2-二氟甲基苯并咪唑-1-基)4,6-二吗啉基-1,
3,5-三嗪)；和SF1126(2-〔2-甲氧基乙氨基]-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)。其它PI3K抑制剂是本领域中可获得的。
BEZ235；XL147；Xl765；PX-866；ZSTK474(2-(2-二氟甲基苯并咪唑-1-基)4,6-二吗啉基-1,
3,5-三嗪)；和SF1126(2-〔2-甲氧基乙氨基]-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)。其它PI3K抑制剂是本领域中可获得的。
[0064] 在一些优选的具体实施方式中，PI3K抑制剂是LY294002。
[0065] 合适的PI3K抑制剂可以从商业供应商(例如Calbiochem公司，加利福尼亚州，美国)处获得。
[0066] 例如，一种培养基可含有1至100μM的PI3K抑制剂，如LY294002，优选10μM左右。
[0067] 激活素/TGFβ拮抗剂抑制激活素/Nodal信号传导并促进前肠细胞特化成胰腺，而不是肝系。
[0068] 合适的激活素/TGF-β拮抗剂包括SB431542(4-(5-苯[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺水合物；Sigma，Tocris生命科学公司，布里斯托尔，英国；(Inman等人分子药理学杂志(2002)62 1 65-74)，柚皮素(5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮)，SIS3(6,7-二甲氧基-2-((2E)-3-(1-甲基-2-苯基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-基-丙-2-烯酰基))-1,2,3,4-四氢异喹啉)，A83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)和可溶性蛋白因子，如lefty(例如人类lefty 2：NP_003231.2GI：27436881)，cerberus(如人类Cerberus 1：NP_005445.1GI：4885135)或卵泡抑素(follistatin)(如人类卵泡抑素：NP_006341.1GI：5453652)。优选地，所述激活素/TGFβ拮抗剂为SB-431542。
[0069] 培养基中激活素/TGFβ拮抗剂适宜的浓度可以是 优选为10μM左右。
[0070] 视黄酸((2E，4E，6E，8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯酸)是一种维生素A的代谢物，其通过结合至视黄酸受体(RAR)调节转录并调节一定范围内的细胞类型的分化。在本文中所描述的培养基中优选采用全反式视黄酸。
[0071] 培养基中视黄酸适宜的浓度可以是 优选为2μM左右。
[0072] 视黄酸可以从商业供应商(例如Sigma Aldrich公司，美国；Stemgent公司，美国)处获得。
[0073] BMP拮抗剂在细胞中抑制BMP信号传导。各种BMP拮抗剂是本领域已知的，包括LDN-193189(4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉；Yu等人(2008)自然化学生物学4 33-41))、GDF3、头蛋白(Noggin)、和dorsomorphin(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1，5-a]嘧啶；Yu等人(2008)自然化学生物学4 33-41))。优选地BMP拮抗剂是头蛋白。
[0074] 培养基中BMP拮抗剂适宜的浓度可以是 例如 优选为50ng/ml左右。
[0075] hedgehog信号传导抑制剂通过Sonic Hedgehog(SHH)和Smoothened(SMO)介导的hedgehog信号传导通路抑制信号传导。合适的hedgehog信号传导抑制剂是本领域众所周知的，并且包括3-酮基-N-(氨基乙基-氨基己酰基-二氢化肉桂酰)环巴胺(KAAD-环巴胺)、saridegib、vismodegib和erismodegib。优选地，所述hedgehog信号抑制剂是KAAD-环巴胺。培养基中hedgehog信号传导抑制剂适宜的浓度可以是 优选为50ng/ml左
右。
右。
[0076] Notch信号传导抑制剂抑制通过Notch信号传导途径抑制信号的通路，所述Notch信号传导途径是由Notch受体介导的，前述Notch受体如哺乳动物细胞中的Notch-1至Notch-4。合适的Notch信号传导抑制剂是本领域所熟知的，并且包括N-[N-(3，5-双氟苯乙酰基)-1-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)。
[0077] 培养基中notch信号传导抑制剂适宜的浓度可以是 优选为1mM左右。
[0078] GSK3β抑制剂抑制糖原合成酶激酶3β(Gene ID 2932：EC2.7.11.26)的活性。适合的抑制剂包括CHIR99021(6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)烟腈；Ring D.B.等人，糖尿病，52：588-595(2003))阿斯特帕罗酮(alsterpaullone)、坎帕罗酮(kenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)和SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)。例如，定形内胚层诱导培养基可含有0.3至30μM的一种GSK3β抑制剂，如CHIR99021，优选3μM左右。
[0079] 合适的hedgehog信号传导传导抑制剂、notch信号传导抑制剂和GSK3β抑制剂可从商业供应商(例如Stemgent公司，马萨诸塞州，美国；Cayman化学公司，密西根州，美国)处获得。
[0080] 多能干细胞的细胞群在定形内胚层诱导培养基中培养以诱导分化成DE细胞。hESC和人hIPSC分化成定形内胚层(DE)的邻近同质细胞群的合适方法的是本领域已知的(Teo AK等人(2011)基因与发育25：238-250；WO2008/056166；WO2012/025725)。
[0081] 内胚层诱导培养基可以是化学成分确定的培养基(CDM)，它包括一种TGFβ配体，优选为激活素、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、一种PI3K抑制剂和可选的一种糖原合成酶激酶3β抑制剂，优选为CHIR99021。在一些具体实施方式中，这些可能是所述培养基中仅有的分化因子。
[0082] 在一些具体实施方式中，一个单步步骤方法可以用于诱导多能细胞分化成定形内胚层(DE)细胞，该多能细胞例如ES细胞。该方法可以包括在内胚层诱导培养基中培养细胞。合适的方法和培养基在WO2008/056166中有描述。内胚层诱导培养基可以由化学成分确定的基础培养基，如CDM-PVA或高级DMEM，添加TGFβ配体，优选为激活素，(例如优选为10ng/ml左右)，FGF2(例如 优选为20ng/ml左右)，BMP-4(例如在
优选为10ng/ml左右)，一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂，优选LY294002(例如
5-30μM，优选为5-10μM)组成。
优选为10ng/ml左右)，一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂，优选LY294002(例如
5-30μM，优选为5-10μM)组成。
[0083] 多能细胞群可以在内胚层诱导培养基中培养2至4天，最优选为3天，以产生定形内胚层细胞的细胞群。
[0084] 在一些具体实施方式中，一个三步步骤方法可以用于诱导多能细胞分化成定形内胚层(DE)细胞，该多能细胞例如iPS细胞。该方法可以包括先在含有GSK3β抑制剂的内胚层诱导培养基中培养细胞，然后在不含GSK3β抑制剂的内胚层诱导培养基中培养细胞，随后在ADE诱导培养基中培养。合适的方法和培养基在WO2012/025725中有描述。例如，多能细胞群分化为DE细胞可以包括；
[0085] (a)在一种上文所述的内胚层诱导培养基中培养多能细胞群，所述培养基内添加有一种糖原合成酶激酶3β抑制剂，优选为CHIR99021；
[0086] (b)进一步在不含糖原合成酶激酶3β抑制剂的内胚层诱导培养基中培养上述细胞群，以及
[0087] (c)进一步在含有TGFβ配体和成纤维细胞生长因子活性的ADE诱导培养基中培养上述细胞群以生成定形内胚层(DE)细胞的细胞群。
[0088] 所述细胞可以在每种培养基中孵育如12-36小时，优选为24小时左右。
[0089] 所述糖原合成酶激酶3β抑制剂可以以浓度为0.3-30μM，优选为3μM左右的浓度存在于步骤(a)的所述培养基中。
[0090] 所述前定形内胚层(ADE)诱导培养基可以是一种化学成分确定的培养基(CDM)，它包括一种TGFβ配体，优选为激活素，和成纤维细胞生长因子(FGF)。在一些具体实施方式中，这些可能是所述培养基中仅有的分化因子。
[0091] 例如，一种合适的ADE培养基可以由一种化学成分确定的基础培养基，例如RPMI-1640；一种TGFβ配体，优选为激活素，(例如， 优选为100ng/ml左右)；和
FGF，如FGF2(例如 优选为40ng/ml左右)组成。所述化学成分确定的基础培
养基可添加有一种无血清培养基添加物，如B27或NS21。
FGF，如FGF2(例如 优选为40ng/ml左右)组成。所述化学成分确定的基础培
养基可添加有一种无血清培养基添加物，如B27或NS21。
[0092] 定形内胚层细胞的细胞群可表达内胚层标志物，如SOX17、CXCR4和GSC，并且可能会缺乏多能标志物或与外胚层或中胚层细胞系相关的标志物的表达。例如定形内胚层细胞可能不表达可检测水平的以下一种或多种，优选为全部；Oct4、Sox2、碱性磷酸酶、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、TRA-1-60和KLF-4。
[0093] 所述定形内胚层细胞的细胞群在一系列的胰腺诱导培养基中培养以诱导分化成胰腺祖细胞。
[0094] 采用第一胰诱导培养基来诱导定形内胚层细胞分化为背侧前肠细胞。
[0095] 第一胰诱导培养基是化学成分确定的培养基(CDM)，它包括激活素/TGF-β拮抗剂；FGF；视黄酸；和BMP拮抗剂。在一些具体实施方式中，这些可能是所述培养基中仅有的分化因子。
[0096] 例如，该第一胰诱导培养基可以由化学成分确定的基础培养基，如高级DMEM，添加有一种激活素/TGF-β拮抗剂，优选为SB-431542(例如，5-25μM，优选为10μM左右)，FGF，优选为FGF10(例如5-100ng/ml，优选为50ng/mL左右)，视黄酸(例如0.5-20μM，优选为2μM左右)以及一种BMP拮抗剂，优选为头蛋白(例如100-500ng/ml)组成。
[0097] 优选地，定形内胚层细胞的细胞群可以培养2至4天，最优选为3天，以生成背侧前肠细胞的细胞群。
[0098] 背前肠细胞的细胞群可表达标记物；Hex、RFX6、FOXA2、HNF1b、SOX2、HNF4a和HLXB9。背前肠细胞可能会缺乏与较低分化程度的细胞相关的标记物的表达，如SOX17、CXCR4和GSC。
[0099] 采用第二和第三胰诱导培养基来诱导背侧前肠细胞分化称为胰祖细胞。
[0100] 第二胰诱导培养基是化学成分确定的培养基(CDM)，它包括FGF、BMP抑制剂、视黄酸和hedgehog信号传导抑制剂。在一些具体实施方式中，这些可能是所述培养基中仅有的分化因子。
[0101] 例如，该第二胰诱导培养基可以由化学成分确定的基础培养基，如高级DMEM，添加有一种FGF，优选为FGF10(例如5-100ng/ml，优选为50ng/mL左右)；视黄酸(例如0.5-20μM，优选为2μM左右)；hedgehog信号传导抑制剂，优选为KAAD-环巴胺(例如0.1-1μM，优选为0.25μM左右)；以及一种BMP拮抗剂，优选为头蛋白(例如5-500ng/ml或100-500ng/ml，优选为50ng/ml左右)组成。
[0102] 所述背侧前肠细胞可以在第二胰诱导培养基中培养2到4天，最优选3天。
[0103] 在第二胰诱导培养基培养后，分化中的细胞可以是在第三胰诱导培养基中培养。
[0104] 该第三胰诱导培养基是一种化学成分确定的培养基(CDM)，它含有FGF。在一些具体实施方式中，FGF和可选的视黄酸可以是培养基中的仅有的分化因子。
[0105] 例如，所述第三胰诱导培养基可以由化学成分确定的基础培养基，如高级DMEM，添加有一种FGF，优选为FGF10或FGF7(KGF)(例如5-100ng/ml，优选为50ng/mL左右)。在一些优选的具体实施方式中，化学成分确定的基础培养基可进一步添加有视黄酸。
[0106] 细胞可以在第三胰诱导培养基中培养2到4天，最优选3天，以生成胰祖细胞的细胞群。
[0107] 胰腺祖细胞的细胞群可能表达标志物PDX1、SOX9、HNF6、NKX6.1和PTF1a。胰祖细胞可能会缺乏与较低分化程度的细胞相关的标记物的表达，如HLXB9。
[0108] 在一些具体实施方式中，所述胰腺祖细胞可以是进一步分化和/或成熟，以生成胰腺内分泌细胞的细胞群。用于胰腺内分泌细胞的成熟的合适的方法是在本领域可获得的(参见Kroon E等人(2008)自然生物技术26：443-452)。例如，胰腺祖细胞可以在第一内分泌诱导和第二内分泌诱导中进行培养。
[0109] 该第一内分泌诱导培养基是一种化学成分确定的培养基(CDM)，它含有Notch信号传导抑制剂。在一些具体实施方式中，所述第一内分泌诱导培养基可进一步包含视黄酸。在一些具体实施方式中，Notch信号抑制剂和可选的视黄酸，可以是培养基中的仅有的分化因子。除Notch信号传导抑制剂和可选的视黄酸以外，所述第一内分泌诱导培养基可包含一种基础培养基，优选为高级DMEM，添加有一种无血清培养基补充物，优选为B27。
[0110] 例如，该第一内分泌诱导培养基可以由化学成分确定的基础培养基，如高级DMEM，添加有B27和Notch信号传导抑制剂，优选为DAPT(例如0.1-10mM，优选为1mM左右)。在一些具体实施方式中，第一内分泌诱导培养基可进一步包含视黄酸。
[0111] 合适的无血清培养基补充物包括B27(Brewer等人脑研究(1989)494 65-74；Brewer等人神经科学研究杂志35 567-576(1993)；Brewer等人焦点16 1 6-9；Brewer等人(1995)神经科学研究杂志.42：674-683；Roth等人微量元素医学生物学杂志(2010)24 130-
137)和NS21(Chen等人神经科学方法杂志(2008)171 239-247)。无血清培养基补充物，如B27和N21，是本领域所公知的并可广泛地从商业渠道购买(例如，Invitrogen公司；Sigma Aldrich公司)。
137)和NS21(Chen等人神经科学方法杂志(2008)171 239-247)。无血清培养基补充物，如B27和N21，是本领域所公知的并可广泛地从商业渠道购买(例如，Invitrogen公司；Sigma Aldrich公司)。
[0112] 胰腺祖细胞可以在第一内分泌诱导培养基中培养2到4天，最优选3天。
[0113] 第二内分泌诱导培养基可以是没有额外分化因子或者可以包括视黄酸的化学成分确定的培养基(CDM)。第二内分泌诱导培养基可包含一种基础培养基，优选为高级DMEM，添加有一种无血清培养基补充物，优选为B27。在一些具体实施方式中，第二内分泌诱导培养基可进一步包含视黄酸。
[0114] 胰腺祖细胞可以在第二内分泌诱导培养基中培养2到4天，最优选3天。
[0115] 胰腺内分泌细胞的细胞群可能表达标记物NGN3、INS、SST和GLU。
[0116] 优选地，胰腺内分泌细胞的细胞群可以经葡萄糖刺激分泌胰岛素。
[0117] 胰腺内分泌细胞可能缺乏分化程度较低的胰腺或内胚层细胞特征标记物的表达，如PDX1、SOX9、HNF6、NKX6.1和PTF1a。
[0118] 哺乳动物细胞的培养是本领域公知的技术(参见，例如，基础细胞培养技术，C.Helgason，Humana出版公司美国(2004年10月15日)ISBN：1588295451；人细胞培养技术(分子医学中的方法S.)Humana出版公司，美国(2004年12月9日)ISBN：1588292223；动物细胞培养：基础技术手册，R.Freshney，John Wiley&Sons公司(2005年8月2日)，ISBN：0471453293，Ho WY等人免疫学方法杂志(2006)310：40-52，干细胞手册(编辑R.Lanza)ISBN：0124366430)。培养基和其中的成分可从商业渠道(如Gibco公司、罗氏公司、Sigma公司、欧洲生物制品公司、研发系统公司)获得。上述培养步骤中可以采用标准的哺乳动物细胞培养条件，例如37℃、21％的氧气、5％的二氧化碳。培养基优选为每两天换一次且允许细胞由于重力影响而沉淀。
[0119] 在培养基中培养之后，所述群可以包含80％或更多、85％或更多、90％或更多、或95％或更多的胰腺祖细胞或，如果成熟的话，胰腺内分泌细胞。
[0120] 在一些具体实施方式中，所述胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可以是基本上不含其它细胞类型的，以使其不需要进一步纯化。例如，该群可以是同质或基本上同质的。
[0121] 在本文所述方法的任何阶段产生的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以是被分离和/或纯化的。
[0122] 细胞群中的胰腺祖细胞或内分泌细胞可以使用本领域技术人员所公知的任何技术同其他类型的细胞分离，上述本领域技术人员所公知的任何技术包括那些基于依靠抗体和磁珠或荧光激活细胞分选(MACS或FACS)的细胞外表位识别的技术，包括使用上文所述的抗特征标记物胞外区域的抗体。
[0123] 如本文所述生成的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可以使用标准的哺乳动物细胞培养技术被扩大、繁殖或维持。
[0124] 在一些具体实施方式中，胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可以生长或维持在三维(3D)培养系统中。合适的3D系统是本领域已知的并且可从商业供应商(例如Sigma-Aldrich公司)处获得的，合适的3D系统例如合成或天然聚合物支架。
[0125] 细胞群中胰腺祖细胞或内分泌细胞执行一个或多个胰腺细胞功能的能力可以被监测和/或检测。例如，细胞执行一个或多个以下功能；胰岛素表达、胰岛素分泌、葡萄糖响应和移植到动物模型中的能力，可以被监测和/或检测。
[0126] 用于确定胰腺细胞功能的合适的方法是本领域所公知的。
[0127] 在一些具体实施方式中，如本文所述生成的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可以被存储，例如通过冷冻干燥和/或冷冻保存存储。
[0128] 本发明的另一个方面提供了一个通过如上所述的方法生成的分离的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群。
[0129] 该群可以包含80％或更多、85％或更多、90％或更多、或95％或更多的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞。
[0130] 该细胞可以是临床级细胞，其没有被暴露于不确定的培养基成分或其它潜在的污染物中过。
[0131] 该细胞可以显示出一个或多个成熟胰腺细胞的功能或功能性特征，或者可以是在植入或移植到哺乳动物宿主内后，能够显示出一个或多个这样的功能或功能性特征。例如，没有植入哺乳动物宿主或者植入哺乳动物宿主之后，所述细胞能够显示出胰岛素表达；胰岛素分泌；和葡萄糖响应中的一个或多个。
[0132] 胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可以在治疗方法中使用，例如可用于具有胰腺症状，如糖尿病的患者的治疗中。细胞群可以在用于治疗胰腺症状，例如糖尿病药物的制造中使用。
[0133] 在一些具体实施方式中，被施用于个体的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以被基因操纵以产生治疗分子，例如一种药物或生长因子(Behrstock等人，基因治疗2006年3月；13(5)：379-88，Klein SM等人，人类基因治疗2005年4月；16(4)：509-21)。
[0134] 本发明的其他方面涉及在治疗中或在生产用于治疗的成熟胰腺细胞中，使用分离的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群的方法。
[0135] 一种治疗胰腺病症的方法可以包括；
[0136] 对需要的个体施用一种如本文所述产生的分离的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群。
[0137] 适于治疗的胰腺病症可以包括遗传性和家族性胰腺炎和糖尿病病症，如I型和II型糖尿病。
[0138] 所述胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以被移植、输注或以其它方式施用到个体的胰腺。合适的技术是本领域众所周知的。
[0139] 用于治疗方法的细胞可以配制成治疗组合物。
[0140] 本发明延伸到一种治疗组合物、药物或其他组合物，该其他组合物包括如本文所述生成的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞，一种包括给患者施用这种胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞的方法，例如用于治疗(可包括预防性治疗)如上所述的一种胰腺病症，以及制备一种治疗组合物的方法，该治疗组合物包括将这种胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞或胰腺内分泌细胞与治疗上可接受的赋形剂、媒介物或载体，以及可选的一种或多种其它成分混合。
[0141] 根据本发明的一种治疗组合物，以及符合本发明的使用方法的一种治疗组合物，除了细胞以外，还可包括药学可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂或其它本领域技术人员公知的材料。这样的材料应该是无毒的，并且不应干扰细胞的活性。所述载体或其它材料的精确性质将取决于给药的途径。
[0143] 所述组合物可以是以肠胃外可接受的水溶液形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。那些本领域的相关技术人员完全能够制备合适的溶液，例如采用等渗载体，如氯化钠、林格氏注射液，或乳酸林格氏注射液。组合物可使用人造脑脊液制备。
[0144] 胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以通过本领域已知的任何技术植入或注入到患者体内(例如Lindvall，O.(1998)运动障碍性疾病.13，增刊1：83-7；Freed，C.R.等人；(1997)细胞移植，6，201-202；Kordower，等人，(1995)新英格兰医学杂志，332,1118-1124；
Freed,C.R.，新英格兰医学杂志，327，1549-1555，Le Blanc等人，柳叶刀2004年5月1日；363(9419)：1439-41)。特别地，细胞悬浮液可以被注射或输注到患者的胰腺或邻近区域内或注射到患者的门静脉内。胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以单独或与其他细胞如内皮细胞组合注射。在一些具体实施方式中，细胞可在移植前被用于形成离体血管化组织。
Freed,C.R.，新英格兰医学杂志，327，1549-1555，Le Blanc等人，柳叶刀2004年5月1日；363(9419)：1439-41)。特别地，细胞悬浮液可以被注射或输注到患者的胰腺或邻近区域内或注射到患者的门静脉内。胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以单独或与其他细胞如内皮细胞组合注射。在一些具体实施方式中，细胞可在移植前被用于形成离体血管化组织。
[0145] 根据本发明的组合物优选以“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，尽管预防可以被认为是治疗)施用，这足以显示对个体的益处。实际给药量和施用的速率和时间过程，将取决于正在治疗的疾病的性质和严重性。治疗处方，例如对计量等的决定，是在全科医生和其他医生的责任范围内的。
[0146] 组合物可以单独使用或与其它治疗结合施用，以同时或按顺序地方式取决于待治疗的病症。
[0147] 在一些优选的具体实施方式中，如本文所述生成的胰腺祖细胞和内分泌细胞可以对糖尿病病症，如I型和II型糖尿病的治疗是有用的。
[0148] 本发明的其他方面涉及在疾病建模和/或筛选中使用分离的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群的方法。
[0149] 例如，分离的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可能在胰腺病症建模中有用。胰腺病症可以包括影响胰腺发育的遗传性疾病和非遗传病症，包括糖尿病病症如1型和2型糖尿病。
[0150] 如上所述，胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以由具有一种遗传性疾病的个体的iPS细胞产生，该遗传性疾病优选为一种单基因疾病。具有一种遗传性疾病的基因型的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可能在建模或表征胰腺病症及其影响中是有用的。具有一种遗传性疾病的基因型的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以显示出一种与胰腺病症相关的基因型或一种或多种与胰腺病症相关的病理。这可能在疾病建模和筛选用于治疗的化合物中有用。
[0151] 遗传性疾病包括与胰腺功能不全或发育相关的疾病，如胰腺发育不全、遗传性和家族性胰腺炎，舒-戴二氏综合征(Schwachman-Diamond Syndrome)、1型和2型糖尿病和胰腺癌。
[0152] 生成具有遗传性疾病基因型的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群的方法可以包括；
[0153] 提供来自于具有一种遗传性疾病的个体的iPS细胞，和；
[0154] 如上所述由该iPS细胞生成胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群，[0155] 所述胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞具有遗传性疾病的基因型。
[0156] 一旦生成，具有遗传性疾病基因型的胰腺祖细胞的细胞群或胰腺内分泌细胞的细胞群可以被培养、扩大和维持，例如用于疾病建模或筛选。
[0157] 一种筛选化合物的方法可以包括；
[0158] 让用本文所述方法生成的分离的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞与一种测试化合物接触，并且；
[0159] 检测测试化合物对所述胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞上的影响和/或所述细胞对测试化合物的影响。
[0160] 胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞的增殖、生长或生存力或它们执行一个或多个细胞功能的能力的可以以存在测试化合物相对于不存在测试化合物来检测。在增殖、生长、生存力或执行一个或多个细胞功能的能力的下降指示该化合物具有毒性作用，而生长、生存力或执行一个或多个细胞功能的能力增强指示该化合物具有改善效果
[0161] 细胞的功能可以包括胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞的胰岛素表达、胰岛素分泌或葡萄糖响应性。
[0162] 例如，测试化合物增加胰岛素分泌和/或刺激如本文所述的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞增殖的能力可以被检测。
[0163] 细胞中的基因表达可以存在测试化合物相对于不存在测试化合物来检测。例如，胰腺标记物例如NGN3、INS、SST、GLU、PDX1、SOX9、HNF6、NKX6.1和PTF1a的表达可被检测。表达降低表明该化合物具有细胞毒性作用。基因表达可以在核酸水平检测，例如通过RT-PCR，或者在蛋白质水平检测，例如，通过免疫学技术，如ELISA，或通过活性测定法检测。
[0164] 在一些具体实施方式中，胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞的表型状态可以通过高含量筛选来确定。对于高含量筛选合适的技术和装置是本领域熟知的，并且包括共焦成像的平台，如ImageXpress UltraTM(分子仪器公司，美国)，OperaTM(PerkinElmer公司，美国马萨诸塞州)，和IN Cell 3000TM(GE安玛西亚生命科学公司，英国)和宽视场成像平台，如Arrayscan VTITM(Cellomics公司)和IN Cell分析仪2000TM(GE医疗公司，美国新泽西州)。
[0165] 在筛选或建模方法中使用的胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞可以显示一种正常的基因型或一种遗传性疾病的基因型。
[0166] 如本文所述的方法可以用来鉴定对胰腺病症具有治疗活性的化合物或对开发用于这种治疗的治疗化合物有用。例如，一种方法可以包括鉴定一个测试化合物的步骤，所述化合物降低或改善一种或多种在胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞中的胰腺表型或疾病病症或胰腺疾病。降低疾病症状或表型的化合物可能是对开发治疗的胰腺病症或其症状的疗法是有用的。
[0167] 使用一次或多次初步筛选鉴定出来的对胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞具有有益效果的测试化合物，它可以进一步采用二级筛选进行评估。
[0168] 二级筛选可以包括体外和/或体内生物功能或活性的测试，前述体内如在动物模型中。例如，测试化合物在疾病动物模型上减少或改善疾病进展或一种或多种症状或与胰腺疾病相关的病理的能力可以被检测。
[0169] 鉴定出一种在胰腺祖细胞或胰腺内分泌细胞内降低或改善胰腺疾病的一种或多种症状，和/或刺激胰岛素分泌和/或增殖的测试化合物后，该化合物可以被分离和/或纯化或者可选择地，它可用重组表达或化学合成的常规技术来合成。此外，它可在配制品中被制造和/或使用，也就是一种组合物例如药剂、治疗组合物或药物的制造和配方。这些可给个体施用以治疗胰腺病症或其症状。
[0170] 在一些优选的具体实施方式中，如本文所述生成的胰腺祖细胞和内分泌细胞可能对糖尿病病症建模，如I型和II型糖尿病，或者鉴定显示出对治疗糖尿病病症有有效活性的化合物是有用的。
[0171] 本发明的其它方面和具体实施方式提供了用术语“由……组成”替代术语“包括”的上文所述的方面和具体实施方式，以及用术语“基本上由……组成”替代术语“包括”的上文所述的方面和具体实施方式。
[0172] 上述具体实施方式的改进，及其进一步的具体实施方式和它们的改进对本领域技术人员在阅读本文公开的内容的基础上是显而易见的，因此，这些都在本发明的范围之内。
[0174] 本文中使用“和/或”之处应被看作是对两个特定特征或要素的每一个，无论存在或不存在另一个的详细公开。例如“A和/或B”应被视为详细公开(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个，就好像每一个在本文中都是单独列出的。
[0175] 应当理解，本申请公开了任意上述方面和具体实施方式相互之间的所有组合，除非上下文另有要求。相似地，本申请公开了优选和/或可选的特征的所有组合，单独地或同任何的其它方面在一起地，除非上下文另有要求。
附图说明
[0177] 图1示出了从hESC和hIPSC生成肝和胰腺祖细胞的方法。
[0178] 图2至图4示出了由hESC衍化而来的定形内胚层在确定成分的培养条件下向胰腺祖细胞的分化。
[0179] 图2示出了RA、BMP、FGF10和激活素/TGFβ对由hESC生成的DE细胞的胰腺分化的功能。QPCR分析示出了PDX1/HLXB9/HNF6/CDX2/AFP/SOX9/PTF1A在视黄酸(RA)、SB431542(SB)或激活素10ng/ml(Act)、FGF10 50ng/ml(FGF)或SU5402 10μM(SU)和头蛋白100ng/ml(Nog)或BMP4 10ng/ml的多样性组合的存在下培养了3天的DE细胞内的表达。
[0180] 图3示出了能显示出从定形内胚层到前肠然后向胰腺祖细胞和激素表达细胞的连续分化模式的标记物的连续表达。
[0181] 图4示出了FACS分析结果，显示出在DE细胞内(第3天)CXCR4的表达以及在胰腺祖细胞内(第12天)PDX1的表达。偶联同种型作为阴性对照以作为阳性群的阈门。
[0182] 图5和6示出了从背侧前肠产生的胰腺祖细胞能够在体外和体内分化成激素表达细胞。
[0183] 图5示出了在由胰腺祖细胞(第18天)产生的内分泌细胞的培养基中经葡萄糖刺激的C-肽分泌。数据表示为3次生物学重复的平均值以及误差棒示出标准差。在低葡萄糖(2.2mM)中生长的细胞作为阴性对照。
[0184] 图6示出了移植胰腺祖细胞(第12天)的小鼠在移植20周后腹膜内注射葡萄糖。在指定的时间取血样用ELISA对C多肽进行测定。ND＝未检出，断线＝测定限度。
[0185] 图7和8示出了激活素诱导定形内胚层向腹侧前肠的特化。
[0186] 图7示出了VF和肝芽标志物在激活素存在下生长了5天的DE细胞内的表达。
[0187] 图8示出了显示出SB431542(SB)对激活素信号传导的抑制，头蛋白(Nog)对BMP的抑制以及SU5402对FGF的抑制减小了DE细胞中肝标志物的表达的Q-CPR分析结果。
[0188] 图9至图12示出了由hESC衍化而来的定形内胚层在确定成分的培养条件下向胎儿肝细胞的分化。
[0189] 图9示出了肝细胞标志物在诱导肝分化的条件下生长了25天的DE细胞内的表达。
[0190] 图10示出了显示白蛋白(ALB)α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和α-1-胎蛋白(AFP)在由hESC衍化的胎儿肝细胞(第25天)中共表达的FACS分析结果。
[0191] 图11示出了显示由hESC衍化的胎儿肝细胞的培养基中α-抗胰蛋白酶(AAT)和白蛋白的分泌的ELISA分析结果。
[0192] 图12示出了在由hESC衍化的胎儿肝细胞中CYP3A4被地塞米松(DEX)诱导的可诱导活性。
[0193] 图13至16表明HEX对体外腹侧前肠的肝特异性分化是必要的。
[0194] 图13示出了显示在向肝胚层分化中的ShHEX-hESC(shHEX98和shHEX02)中HEX降低的Q-PCR分析结果。ShScramble-hESC被用作阴性对照。
[0195] 图14示出了显示HEX降低对腹前肠细胞肝特异性分化效果的Q-PCR分析结果。
[0196] 图15示出了在向肝胚层分化中的ShScramblehESC和ShHEX-hESC中凋亡细胞的分数。
[0197] 图16示出了在向胰腺祖细胞分化中的ShHEX-hESC中胰腺标志物的表达。
[0198] 图17和18表明HLXB9对体外背侧前肠的胰特异性分化是必要的。
[0199] 图17示出了显示hHLXB9降低对胰腺分化的效果的Q-PCR分析结果。
[0200] 图18示出了在肝分化过程中HLXB9的表达。hESC在诱导肝分化的培养基中生长25天，且每6天(第12天＝D12，第18天＝D18，第25天＝D25)采用Q-PCR分析HXLB9的表达一次。hESC被用作阴性对照，分化了9天的胰腺祖细胞(胰D9)用作阳性对照。
具体实施方式
[0201] 实验
[0202] hESC和hIPSC培养条件。
[0203] hESC(购自WiCell公司的H9)和hIPSC(BBHX8、A1ATD-1、JRO1D)(Rashid S等人(2010)临床研究杂志120：3127-3136)在成分确定的培养基中生长(Brons等人(2007)自然448：191-195)。如先前所描述(Brons等人(2007))，细胞每周用胶原酶IV传代并保持在添加有激活素A(10ng/ml)和FGF2(12ng/ml)的化学成分确定的培养基(CDM)中。分化如图1中所述的方式进行。在整个分化过程中每天更换培养基。在DE阶段(阶段1)后，将细胞在添加有SB-431542(10μM；Tocris公司)、FGF10(50ng/ml；AutogenBioclear公司)、全反式视黄酸(RA，2μM；西格玛公司)以及头蛋白(50ng/ml；研发系统公司)的高级DMEM(Invitrogen公司)中培养3天。第3阶段，将细胞在高级DMEM+人FGF10(50ng/ml；AutogenBioclear公司)、全反式视黄酸(RA，2μM；Sigma公司)、KAAD-环巴胺(0.25μM；多伦多研究化学品公司)和头蛋白(50ng/ml的；研发系统公司)中培养3天。第4阶段，将细胞在人KGF(FGF7)或FGF10(50ng/ml；
研发系统公司)中培养3天。对于胰腺祖细胞的成熟，细胞在高级DMEM+1％体积/体积B27和DAPT(1mM)中生长3天，并在高级DMEM+1％体积/体积B27中额外再培养3天。可代替地，第4阶段，将细胞在人KGF(FGF7)或FGF10(50ng/ml；研发系统公司)和全反式视黄酸(RA，2μM；
Sigma公司)中培养3天。可代替地，对于胰腺祖细胞的成熟，细胞在高级DMEM+1％体积/体积B27、全反式视黄酸(RA，2μM；Sigma公司)和DAPT(1mM)中生长3天，并在高级DMEM+1％体积/体积B27和全反式视黄酸(RA，2μM；Sigma公司)中额外再培养3天。
研发系统公司)中培养3天。对于胰腺祖细胞的成熟，细胞在高级DMEM+1％体积/体积B27和DAPT(1mM)中生长3天，并在高级DMEM+1％体积/体积B27中额外再培养3天。可代替地，第4阶段，将细胞在人KGF(FGF7)或FGF10(50ng/ml；研发系统公司)和全反式视黄酸(RA，2μM；
Sigma公司)中培养3天。可代替地，对于胰腺祖细胞的成熟，细胞在高级DMEM+1％体积/体积B27、全反式视黄酸(RA，2μM；Sigma公司)和DAPT(1mM)中生长3天，并在高级DMEM+1％体积/体积B27和全反式视黄酸(RA，2μM；Sigma公司)中额外再培养3天。
[0204] RT-QPCR、免疫染色和FACS分析
[0205] RT-QPCR的方法在Touboul T等人(2010)肝脏病学51：1754-1765.中已描述。所有的数据均表示为3次独立生物学重复的平均值以及误差棒表示标准差。
[0206] 细胞色素P450的活性
[0207] Cyp3A4活性测定采用P450-Glo测定试剂盒(Promega公司)根据制造商的说明书进行三次重复测定。然后用P450-GloMax 96微孔板光度计分析细胞色素活性。
[0208] 过碘酸雪夫(PAS)染色
[0209] PAS染色用试剂盒(Sigma公司395B-1KT)根据制造商说明书的指导，在细胞上进行三次重复。随后进行淀粉酶消化，以确认阳性染色是由于糖原的存在。
[0210] LDL的摄取
[0211] Dil-LDL染色试剂盒购自于(Cayman化学公司，马萨诸塞州)并根据制造商的说明书进行测定。
[0212] HEX和HLXB9下调
[0213] 利用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，将针对HEX和HLXB9的ShRNA表达载体(开放生物系统公司)稳定转染hESC(H9)(Valier等人(2004)干细胞22：2-11)。然后用嘌呤霉素选择稳定转染的细胞，并将所得的菌落单独挑出用于进一步的分析。100个hESC亚系(每个shRNA表达载体挑10个hESC亚系)被用于进行分别分化为肝脏或胰腺祖细胞后HEX和HLXB9的降低分析。进一步地分析在至少2种表达不同ShRNA序列的hESC亚系上系统地进行。
[0214] 动物研究
[0215] 分化的细胞(5×106)用连接到一个正位移移液管的24G导管移植到NOD/SCID小鼠的肾囊下。在不同的时间间隔从尾部移取血样进行C-肽分析。在指定的时间点获取肾脏，并将含有移植细胞的部分在4％多聚甲醛中固定、蜡包埋并处理用于免疫组织化学法。用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)使抗体结合可见。
[0216] 微阵列图谱
[0217] 使用 Mini试剂盒，根据制造商的方案(Qiagen公司)提取总RNA。RNA样品在微阵列上杂交之前，首先评估它们的RNA完整性。采用制造商的标准方法，对第4.5天和第4.5天-激活素+SB的分化的hESC中每个条件下的五个生物学重复样本与Illumina的人HT-
12v4.0R1表达微珠芯片进行杂交。没有通过Illumina信号检测的微珠芯片探针集，在至少一个样品组的所有重复样本中统计的阈值p<0.01的被去除而不进行下一步的分析。对于所有的样品，剩余的探针集进行背景校正、归一化并使用RMA模型23的默认参数进行总结。阵列处理使用用于R统计编程语言的Bioconductor软件套装的微珠阵列包进行。探针集使用由生产商提供的转录信息注释。所描述的原始微阵列数据已经上传到ArrayExpress库(EBI)中(实验名称：Vallier hESC内胚层。ArrayExpress加入：E-MEXP-2373分化调节分析)。在Bioconductor的limma包中进行的24的改良t检验法(moderated t-statistic)被用来评估样本组之间的差异基因(探针集)表达的显著性。为了减少与这种规模下的多重假设检验相关联的错误，所获得的显着性p值用25的FDR方法转换为校正的q值。具有相关q<
0.001(FDR 0.1％)的探针集被认为样本组之间显示出显著的差异表达。数据可视化：基因表达的热图，是将RMA处理的微阵列基因表达数据的相关子集导入到Java树形(Java Treeview)数据可视化包中，从而创建的。在一个基因是通过在阵列上的多个探针集所代表的情况下，根据对所有样品的最高平均表达(即不考虑组中成员的最可靠的样品杂交)选择单个探针集在热图中代表基因的表达。所描述的原始微阵列数据已经上载到ArrayExpress库(EBI)中。
12v4.0R1表达微珠芯片进行杂交。没有通过Illumina信号检测的微珠芯片探针集，在至少一个样品组的所有重复样本中统计的阈值p<0.01的被去除而不进行下一步的分析。对于所有的样品，剩余的探针集进行背景校正、归一化并使用RMA模型23的默认参数进行总结。阵列处理使用用于R统计编程语言的Bioconductor软件套装的微珠阵列包进行。探针集使用由生产商提供的转录信息注释。所描述的原始微阵列数据已经上传到ArrayExpress库(EBI)中(实验名称：Vallier hESC内胚层。ArrayExpress加入：E-MEXP-2373分化调节分析)。在Bioconductor的limma包中进行的24的改良t检验法(moderated t-statistic)被用来评估样本组之间的差异基因(探针集)表达的显著性。为了减少与这种规模下的多重假设检验相关联的错误，所获得的显着性p值用25的FDR方法转换为校正的q值。具有相关q<
0.001(FDR 0.1％)的探针集被认为样本组之间显示出显著的差异表达。数据可视化：基因表达的热图，是将RMA处理的微阵列基因表达数据的相关子集导入到Java树形(Java Treeview)数据可视化包中，从而创建的。在一个基因是通过在阵列上的多个探针集所代表的情况下，根据对所有样品的最高平均表达(即不考虑组中成员的最可靠的样品杂交)选择单个探针集在热图中代表基因的表达。所描述的原始微阵列数据已经上载到ArrayExpress库(EBI)中。
[0219] 在诱导胰腺特化的培养条件下生长了18天的hESC，在葡萄糖刺激之前先在无胰岛素的分化培养基中培养24小时。然后将细胞在PBS中洗涤三次，并在添加有2.2mM葡萄糖的DMEM(Invitrogen公司)中在37℃下预孵育60分钟。为了评估葡萄糖诱导的胰岛素分泌，预孵育的细胞在含有22mM葡萄糖或可替代地2.2mM葡萄糖的DMEM中生长15或60分钟。收集上清液用于测定C肽的释放。ELISA分析如下进行。高结合表面COSTAR 96孔板(Corning公司，纽约，USA)用亲和纯化的抗α1-抗胰蛋白酶兔多克隆抗体(Abcam公司31657，剑桥，英国)和抗白蛋白兔多克隆抗体(Abcam公司87564，剑桥，英国)以2μg/ml的浓度在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Na2CO3/NAHCO3，PH值9.5)中包被过夜。洗涤(0.9％w/v的氯化钠，0.05％v/v的吐温20)后，将板在封闭缓冲液(PBS，0.25％w/v的BSA，0.05％v/v的吐温20)中封闭2小时。培养基用封闭缓冲液稀释并在每孔中各加入50μL，然后孵育2小时。洗涤后，各孔用相应的单克隆抗体(1μg/ml稀释在封闭缓冲液中)孵育，孵育2小时。结合的单克隆抗体用兔抗-小鼠IgG HRP-标记的抗体(Sigma Aldrich公司，黑弗里尔，英国，1：20,000)检测1小时。该反应用TMB液体底物(Sigma Aldrich公司，黑弗里尔，英国)在黑暗中显影10分钟，且用1M的H2SO4终止反应。用Thermo-max酶标仪(分子仪器公司，桑尼维尔，加州，美国)在450nm处读取吸光度。
[0220] 免疫染色
[0221] 将hESC或它们的分化祖细胞在4℃下在4％的多聚甲醛中固定20分钟，然后用PBS洗涤三次。细胞在室温下在含有10％驴血清(Serotec公司)的PBST(PBS中含0.1％的Triton X100；西格玛公司)中孵育20分钟，随后在4℃下用一抗孵育过夜，该一抗用含1％驴血清的PBST稀释。然后将细胞用PBS洗涤三次，并在室温下用溶于含1％驴血清的PBST中的二抗孵育2小时。未结合的二抗用三次5分钟的PBS洗涤除去。在第一次洗涤中加入Hoechst 33258(Sigm-Aldrich公司；1：10,000)。为了使脂质可视，采用一种脂质特异性染料BODIPY(硼二吡咯亚甲基； 493/503Invitrogen公司.D-3922)。
[0222] 流式细胞术
[0223] 在胰腺分化方法的特定阶段的贴壁细胞用PBS洗涤两次，然后在37℃下再在细胞解离缓冲液(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加州)中孵育20分钟。细胞通过轻柔的移液进行分离并以每毫升约0.1-1×105个细胞密度在含有0.1％叠氮化物(Serotec有限公司，牛津，英国)的PBST+3％正常驴血清(NDS)中重悬。然后将细胞在4℃下在4％的多聚甲醛中固定20分钟，然后在PBS中洗涤三次。细胞沉淀并重悬于2毫升的SAP缓冲液(含0.1％(w/v)皂苷的Hanks平衡盐溶液)中。细胞在室温下用溶于SAP缓冲液的一抗孵育2小时。然后将细胞用PBS+3％NDS洗涤三次，然后用溶于SAP缓冲液的二抗在室温下孵育2小时。未结合的二抗用PBS洗涤三次除去。然后用FACS Calibur流式细胞仪(BD生命科学公司，圣何塞，加利福尼亚州，美国)对细胞进行分析。将三次独立实验的平均值记录为阳性细胞的数目。
[0224] 结果
[0225] 在视黄酸的存在下的激活素和BMP信号传导的抑制在由hESC衍化而来并生长在完全确定的培养条件下的内胚层细胞中诱导PDX1的表达。
[0226] 我们最近建立了一个确定的培养体系，以将hESC和hIPSC分化为定形内胚层(DE)细胞的近同质群(near homogenous populations)(Teo AK等人.(2011)遗传和发育25：238-250)。重要的是，该培养系统依赖不含动物产品的化学成分确定的培养基(CDM)，所述动物产品包括牛血清白蛋白(BSA)、血清、复杂的细胞外基质(如MatrigelTM或饲养细胞)；因此避免了可能干扰试验结果的未知因素的存在。为了进一步延伸本方法，我们筛选了众多生长因子和信号传导通路抑制剂的组合，以确定驱使DE细胞分化成胰腺祖细胞的培养条件。这些分析显示：RA、FGF10、头蛋白(BMP抑制剂)和SB431542(激活素/TGFβ受体拮抗剂)的组合能够在由hESC衍化而来的DE细胞中诱导胰腺标志物PDX1、HNF6、PTF1A、Sox9和HLXB9的表达，同时抑制肠道(CDX2)和肝标志物(AFP)的表达(图2)。重要的是，这种因子的混合物仅在特定基础培养基(高级DMEM)中诱导PDX1，而血清、MatrigelTM或饲养物的存在抑制胰腺祖细胞分化证实了DE分化可以受多种因素影响。然后我们试图验证并优化这些添加剂中每一个的作用。缺少RA而存在头蛋白、FGF10和SB431542(SB)抑制胰腺标志物的表达(图2)证实了RA对诱导胰腺特异性分化是必需的(Mfopou JK等人(2010)胃肠病学138：2233-2245，
2245e2231-2214)。缺少头蛋白或在分化过程中的任何时间添加BMP4(图2)导致胰腺祖细胞标志物表达的显著下降，而诱导了肠道(CDX2)和肝标志物(AFP)，从而巩固了先前的研究结果，显示BMP信号传导抑制了胰腺特化从而促进了另外的细胞命运(Cai J等人(2010)分子细胞生物学杂志2：50-60)。使用SU5402(FGF受体拮抗剂)抑制FGF信号传导或增加FGF2/7/
10的剂量不影响胰腺祖细胞标志物如PDX1、SOX9和HLXB9的表达(图2)。然而，不存在FGF信号传导时，肠道标志物CDX2的表达(Wells等人(2000)发育127：1563-1572)是增加的，而PTF1A的表达是大大减少的，表明在胰芽特异性分化的过程中，FGF10能阻断PDX1表达细胞向十二指肠的特异性分化(Wells等人(2000)，Spence等人(2011)自然470：105-109)。此外，FGF抑制引起大量细胞死亡暗示着FGFs对胰腺祖细胞的体外增殖和存活也是必要的。更重要的是，我们观察到添加激活素消除了胰腺标志物的表达，而用SB抑制激活素/TGFβ信号传导有相反的效果(图2)，这首次表明激活素/TGFβ信号传导会抑制体外胰腺特异性分化。
2245e2231-2214)。缺少头蛋白或在分化过程中的任何时间添加BMP4(图2)导致胰腺祖细胞标志物表达的显著下降，而诱导了肠道(CDX2)和肝标志物(AFP)，从而巩固了先前的研究结果，显示BMP信号传导抑制了胰腺特化从而促进了另外的细胞命运(Cai J等人(2010)分子细胞生物学杂志2：50-60)。使用SU5402(FGF受体拮抗剂)抑制FGF信号传导或增加FGF2/7/
10的剂量不影响胰腺祖细胞标志物如PDX1、SOX9和HLXB9的表达(图2)。然而，不存在FGF信号传导时，肠道标志物CDX2的表达(Wells等人(2000)发育127：1563-1572)是增加的，而PTF1A的表达是大大减少的，表明在胰芽特异性分化的过程中，FGF10能阻断PDX1表达细胞向十二指肠的特异性分化(Wells等人(2000)，Spence等人(2011)自然470：105-109)。此外，FGF抑制引起大量细胞死亡暗示着FGFs对胰腺祖细胞的体外增殖和存活也是必要的。更重要的是，我们观察到添加激活素消除了胰腺标志物的表达，而用SB抑制激活素/TGFβ信号传导有相反的效果(图2)，这首次表明激活素/TGFβ信号传导会抑制体外胰腺特异性分化。
[0227] 有趣的是，仅在分化的前3天需要SB存在，这表明激活素/TGFβ信号传导对PDX1表达前的胰腺特异性分化的最早步骤起作用。这些结果一起表明，RA充当一个驱使DE细胞向胰腺细胞系分化的诱导信号，而TGFβ信号传导途径(即激活素+BMP)则作为本细胞命运选择的有效抑制剂。
[0228] 发育的自然途径之后的激活素/TGFβ的抑制诱导内胚层分化成胰腺祖细胞的近同质群
[0229] 根据上述结果，我们建立了4步法用确定的培养基使hESC分化成胰腺祖细胞(Def-Panc，图1)。在第一步(第1-3天)中，hESC生长在添加有激活素/BMP/FGF2/LY294002(PI 3-K抑制剂)(Teo等人(2011))的CDM中。由此产生的细胞的DE标志物包括SOX17、CXCR4、HEX、FOXA2和EOMES的表达为阳性，而同时多能标志物OCT-4、NANOG和SOX2以及原条标志物T(Brachyury)和Mixl1的表达为阴性(图3)。Def-Panc方法的第二步包括在RA/头蛋白/FGF10/SB431542的存在下让DE细胞生长3天(第4-6天)。所得细胞表达HNF1β、FOXA2、HNF4、RFX6和HLXB9(图4)，所有这些都标志着早期哺乳动物发育过程中的前肠(图3)。值得注意的是，HLXB9的表达以及HEX表达的缺失提供了这些前肠细胞的背侧同一性的指示，而CDX2的缺失排除了中肠或尾肠细胞的存在(图3)。在方法的第三步，背侧前肠细胞在RA/头蛋白/FGF10/环巴胺存在的情况下再生长3天(第7-9天)。所得的细胞表达前肠标志物(HNF1β、SOX2、FOXA2和HLXB9)和胰腺祖细胞标志物(SOX9、HNF6、PTF1A和PDX1)的组合(图3)。在方法的第四步中，通过加入FGF10培养3天(第10-12天)，胰腺祖细胞标志物的表达被进一步加强。得到的细胞表达NKX6.1、SOX9、HNF6、PTF1A、PDX1、HNF1β、Sox2和FOXA2，而HLXB9的表达则急剧减少(图3)。第一步最后的FACS分析显示，DE富集细胞的CXCR4呈现同质化的阳性，在方法的第四步后(第12天)80％的细胞表达PDX1(图4)。免疫染色分析证实，PDX1与SOX9、HNF6、HNF4、NKX6.1和GATA4在相同细胞中共表达。这些结果一起表明，Def-Panc方法驱使hESC在特异性分化的连续事件后向胰腺祖细胞的近同质群分化，使人联想到那些在胰腺发育过程中发生的事情。
[0230] 在确定的培养条件下产生的PDX1的内胚层可以在体外和体内分化成胰岛素分泌细胞。
[0231] 为证实胰腺祖细胞进一步向内分泌细胞系分化的能力，将阶段4结束时获得的PDX1表达细胞在先前已显示出能刺激内分泌细胞分化的培养条件下(Kroon E等人(2008年)自然生物技术26：443-452)再生长6天。Q-PCR分析表明，在3天后，PDX1表达降低而NGN3和激素标志物(胰岛素、胰高血糖素和促生长素抑制素)的表达逐渐增加(图3)。到第18天，10％的染色细胞呈C-肽阳性。
[0232] 有趣的是，这些由hESC衍化而来的胰岛素表达细胞能够在葡萄糖刺激模拟β细胞胰岛素释放时释放C-肽(图5)。尽管如此，当与人成年胰岛细胞相比时，激素标志物(胰岛素、SST和GSC)的表达相对较低，而胰腺内分泌特异性标志物的表达维持(NKX6.1、NGN3和Sox9)。
[0233] 此外，一小部分C-肽表达细胞也被发现是胰高血糖素或促生长素抑制素阳性的(聚激素(poly-hormonal)表达可能标志着胚胎来源的β细胞(Polak M等人(2000)糖尿病49：225-232)，由此确认我们的体外培养条件不足以产生完全功能的内分泌细胞。为了克服体外系统中的这种局限，分化12天后的胰腺祖细胞被注射至NOD-SCID小鼠的肾囊下，以提供一个已知的有利于它们分化成内分泌细胞环境(Kroon E等人(2008)自然生物技术26：
443-452)。移植后12周一到，8个移植动物中的3个的血流中就检测出了低水平的C-肽(阴性对照＝0.021ng/ml；小鼠1＝0.1ng/ml，小鼠2＝0.43ng/ml，以及小鼠3＝0.1635ng/ml)中。
此外，移植了胰腺祖细胞的小鼠，在体内分化20周之后进行的肾囊中的胰腺标志物的组织学分析揭示胰岛的存在看起来像表达胰高血糖素和C-肽细胞的细胞簇。
443-452)。移植后12周一到，8个移植动物中的3个的血流中就检测出了低水平的C-肽(阴性对照＝0.021ng/ml；小鼠1＝0.1ng/ml，小鼠2＝0.43ng/ml，以及小鼠3＝0.1635ng/ml)中。
此外，移植了胰腺祖细胞的小鼠，在体内分化20周之后进行的肾囊中的胰腺标志物的组织学分析揭示胰岛的存在看起来像表达胰高血糖素和C-肽细胞的细胞簇。
[0234] 总之，这些结果表明，用Def-Panc方法生成的胰腺祖细胞具有进一步分化成内分泌细胞的能力，因此代表着早期胰腺祖细胞。最后，3个hIPSC细胞系也获得了类似的结果，表明该Def-Panc方法可成功地用于从不同的hPSC生成胰腺祖细胞。
[0235] 激活素/TGFβ驱使内胚层细胞分化成可以分化为胎肝细胞的肝祖细胞[0236] 在上述的培养条件的筛选中，我们注意到，在激活素存在下生长的DE细胞获得了具有大的暗色胞质空间和小管样结构的胎肝细胞的外观。进一步的分析证实，在激活素的存在下生长5天的DE细胞表达标志着腹侧前肠的基因，腹侧前肠是肝芽形成的位点(图7中的HEX、SOX17、HNF4、FOXA1、FOXA2、TBX3)。相反，由SB引起的激活素抑制降低了HNF4α、SOX17、HEX和TBX3的表达，同时阻止了已知肝诱导剂如FGF信号传导，也降低了肝芽基因如HEX、SOX17和TBX3的表达(图8)。出人意料的是，头蛋白只诱导HNF4表达的适度减少，提供了BMP信号传导可能在体外肝特异性分化中具有有限的功能的暗示。可替代地，未知信号传导途径可激活相同的分化程序。合在一起考虑，这些结果表明激活素、BMP和FGF的组合效果对于充分促进DE细胞的体外肝特异性分化是必要的。
[0237] 基于该观察，我们开发了一个3步的方法，在确定的培养条件下从hPSC生成肝细胞(Def-Hep，图1)。Def-Hep方法的第一步在于上文已经描述的hESC分化为DE细胞，第二步涉及促进DE向着肝细胞系的特异性分化，先采用单独的激活素3天，然后用激活素与BMP4和FGF10的结合。在Def-Hep方法的第三步中，肝内胚层细胞在制瘤素M和HGF、控制成肝细胞分化为肝细胞的两个已知的生长因子的存在下另外再生长15天。
[0238] 因此，利用Def-Hep方法生成的细胞表达肝标志物，如白蛋白(ALB)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、αAPOF、TAT、TDO2、TTR、HNF4α和HEX(图9)。这些观察结果被免疫染色和FACS分析所证实，这显示了ALB、细胞角蛋白18、AAT和AFP的同质共表达(图10)。这些细胞还显示了肝细胞的功能特性，如：(ⅰ)ALB和AAT分泌(图11)，(ⅱ)地塞米松可诱导的Cyp3A4活性(图12)，(ⅲ)胆固醇摄取(如DIL试验所示)和(ⅳ)糖原贮积(如PAS染色所示)。总之，这些数据表明，激活素驱使DE向类VF细胞特异性分化，然后向肝内胚层特异性分化，肝内胚层具有分化成显示出胎肝细胞特征的细胞的能力。
[0239] hESC的胰腺和肝分化过程中HEX和HLXB9的下调分别阻断肝和胰腺的分化。
[0240] 然后，我们决定利用Def-Panc和Def-Hep培养体系研究激活素控制胰腺和肝细胞系之间细胞命运选择的机制。为此，我们进行了基因表达谱实验，以确定在胰腺特异性分化的过程中，通过激活素的存在而被上调或下调的基因。在存在激活素/RA/Nog/FGF(D45A)或SB/RA/Nog/FGF(D45SB)的条件下生长36小时的DE细胞的这些分析，揭露了激活素可激活或阻断基因众多基因的表达，包括HEX和HLXB9，这是众所周知的是前肠发育的必要条件。因此，我们假设激活素可以通过控制这些转录因子的表达指导DE特异性分化。为了检验这一假设，我们用稳定表达的shRNA调低了hESC中HEX或HLXB9的表达。所得的hESC亚系(ShHEX-hESC和ShHLXB9-的hESC)随后如图1中所示那样分化。Q-PCR分析显示在DE分化期间HEX表达的下调(图13)与肝标志物如AFP和ALB的下调(图14)呈系统相关。类似的下降并没有在由ShHLXB9-hESC hESC衍化而成的DE细胞或由稳定过表达非靶向的shRNA的hESC(ShScramble–hESC)衍化而成的DE细胞中被观察到。但是，我们也观察到减少的HEX的表达增加了在VF分化过程中的细胞死亡(图15)。因此，HEX表达似乎对类VF细胞在体外存活以及向肝细胞系分化是必要的。最后，ShHEX-hESC能够分化成先后表达HLXB9和PDX1的胰腺祖(图16)。
[0241] 对ShHLXB9-hESC进行的相似的实验表明，在前肠分化过程中HLXB9表达的下调急剧地降低了胰腺祖标志物包括PDX1/SOX9的表达(图17)。有趣的是，HLXB9表达的减少没有影响前肠标志物如HNF4α、FOXA2和HNF1β的表达(图17)，从而提供了指示：HLXB9对于背侧前肠特异性分化不是必需的，但是对于其向胰腺细胞系的分化是必需的。重要的是，HLXB9在肝分化期间不表达(图18)，因此从ShHLXB9-hESC生成的DE细胞在激活素存在时，能分化成类VF细胞以及分化成肝胚层。总的来说，这些结果概括了在小鼠胚胎中进行的研究，表明HEX的缺失破坏了肝芽发育，却不会影响背侧胰腺特异性分化，而HLXB9是诱导PDX1在胰腺中表达的必要条件(Habener JF等人(2005)内分泌学146：1025-1034)。因此，它们表现出我们的培养体系在DE发育建模和体外早期胰脏和肝脏器官形成研究中的普遍适用。
[0242] 允许在兼容临床应用的培养条件下，从hPSC生成肝脏和胰腺祖细胞的同质群的健全的方法尚未确立。实际上，可获得的方法通常包含未明确的动物产品，如饲养物或胎牛血清(FBS)。为了应对这些挑战，我们确定了明确的培养条件，以使来自多种hPSC细胞系的人定形内胚层(DE)分化为胰腺和肝脏内胚层的近同质细胞群。
[0243] RA被认为在促进胰腺特异性分化中具有重要的功能，而BMP信号传导阻断了胰腺标志物PDX1的表达，巩固了之前的研究(Mfopou等人(2010)胃肠病学138：2233-2245，2245e2231-2214；[Cai等人(2010)分子细胞生物学杂志2：50-60)。然而，我们涉及到FGF信号传导功能的结果与之前的研究(Ameri J等人(2010年)干细胞28：45-56)相抵触，我们的结果表明FGF起到胰腺特化的容许信号的作用，而不是诱导信号的作用。这种明显的差异可能是由于在我们的培养条件下不存在饲养物、血清和基质胶TM，所有这些都包含未知组分，它们很容易干扰FGF信号传导。
[0244] 此外，我们观察到FGF信号传导的抑制减少了胰腺祖细胞的存活，从而证明了在我们的方法中使用了FGF。更重要的是，我们的分析还表明，激活素/TGFβ通过在促进肝细胞系的同时，抑制背侧前肠(DF)特异性分化，从而控制DE细胞向胰腺细胞系的命运选择。以前的研究已经表明，TGFb信号传导控制着小鼠胚胎中的腹侧胰芽的诱导(Wandzioch E，Zaret KS(2009)科学324：1707-1710)，因此，我们的数据首次表明类似的机制可以发生在背侧胰腺中，从而证实了我们的培养体系对于体外前肠发育建模的益处。
[0245] 最后，这些结果具有重要的现实意义，因为现有的从hPSC生成胰腺细胞的方法往往依赖于饲养物、基质胶TM和血清，所有这些都代表了潜在的TGFβ信号传导来源，TGFβ信号传导具有降低胰腺特异性分化的能力。此外，最近的研究表明，Nodal表达的内源水平可决定特定hIPSC细胞系分化成为胚层衍生物的能力(Ramos-Mejia V，Melen GJ，Sanchez L等人，(2010)分子疗法18：2173-2181)。Nodal/TGFβ生长因子内源水平的这种差异可能影响不同hPSC细胞系分化为胰腺祖的能力，且用SB抑制这一信号传导途径可以绕过这个限制。因此，我们目前用我们的4步方法分化了10个hIPSC细胞系成为胰腺祖，并且我们观察到，只有那些未能分化成DE的hIPSC细胞系(10个中有2个)也缺乏分化为胰腺细胞的能力。在DE分化过程中抑制TGFβ信号传导的另一优点在于消除污染的多能细胞的可能性。事实上，我们和其他人已经广泛地证明，激活素/Nodal/TGFβ信号传导的抑制诱导了hPSC的分化(Vallier Let等人，(2009)发育136：1339-1349)。因此，在DE特异性分化过程中抑制激活素可以减少由未分化的细胞造成的污染。因此，我们在移植胰腺祖细胞的小鼠中从未观察到畸胎瘤的形成。因此，在胰腺特异性分化过程中抑制激活素信号传导可以允许生成用于基于多能细胞的疗法的“更安全”的胰腺祖。
[0246] 总结，我们的研究可以极大地方便用于临床应用的、在确定的培养条件中的胰和肝细胞的同质细胞群的生成。然而，这种培养体系还提供了一个强大且高效的用于研究人内胚层分化的体外发育模型。
[0247]
[0248]
[0249]
[0250] 表1
[0251] 参考文献
[0252] [1]Thomson JA等人(1998)科学282:1145-1147
[0253] [2]Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M等人(2007)细胞131:861-872
[0254] [3]D'Amour KA等人(2006)自然生物技术24:1392-1401
[0255] [4]Jiang W等人(2007)细胞研究17:333-344
[0256] [5]Maehr R等人(2009)美国科学学院院报106:15768-15773
[0257] [6]Zhang D,Jiang W,Liu M等人(2009)细胞研究19:429-438
[0258] [7]Kroon E等人(2008)自然生物技术26:443-452
[0259] [8]Kelly OG等人(2011)自然生物技术29:750-756
[0260] [9]Zaret KS,Grompe M(2008)科学322:1490-1494
[0261] [10]Harrison KA等人(1999)自然遗传学23:71-75
[0262] [11]Li H等人(1999)自然遗传学23:67-70
[0263] [12]Jonsson J等人(1994)自然371:606-609
[0264] [13]Offield MF等人(1996)发育122:983-995
[0265] [14]Sherwood RI等人(2009)发育动力学238:29-42
[0266] [15]Wandzioch E,Zaret KS(2009).科学324:1707-1710
[0267] [16]Rashid ST等人(2010)临床研究杂志120:3127-3136
[0268] [17]Brons IG等人(2007)自然448:191-195
[0269] [18]Touboul T等人(2010)肝脏病学51:1754-1765
[0270] [19]Vallier L等人(2004)干细胞22:2-11
[0271] [20]Teo AK等人(2011)遗传与发育25:238-250
[0272] [21]Mfopou JK等人(2010)肠胃病学138:2233-2245,
[0273] [22]Cai J等人(2010)分子细胞生物学杂志2:50-60
[0274] [23]Wells JM,Melton DA(2000)发育127:1563-1572
[0275] [24]Spence JR等人(2011)自然470:105-109
[0276] [25]Polak M等人(2000)糖尿病49:225-232
[0277] [26]Habener JF等人(2005)内分泌学146:1025-1034
[0278] [27]Ameri J等人(2010)干细胞28:45-56
[0279] [28]Nostro MC等人(2011)发育138:861-871
[0280] [29]Kunisada Y等人(2012)干细胞研究8:274-284
[0281] [30]Brown S等人(2011)干细胞29:1176-1185
[0282] [31]Inamura M等人分子疗法19:400-407
[0283] [32]Bort R等人(2004)发育131:797-806
[0284] [33]Kubo A等人(2009)肝脏病学51:633-641
[0285] [34]Ramos-Mejia V等人(2010)分子疗法18:2173-2181
[0286] [35]Vallier L等人(2009)发育136:1339-1349
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