一种分离纯化哺乳动物胰岛的方法
阅读：599发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种分离纯化哺乳动物胰岛的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种新型高效 哺乳动物 胰岛纯化方法。其特征在于该纯化方法是针对于胰岛纯化过程中由于嵌入式胰岛（胰岛表面围绕的外分泌细胞超过其表面积一半时，该胰岛称之为嵌入式胰岛）的存在干扰纯化结果的问题而发明的。该纯化方法是在进行不连续 密度 梯度离心前，采用高低渗法去除包裹在胰岛外的外分泌细胞及部分外分泌细胞团。本发明的胰岛纯化方法不仅可以提高胰岛的产量，降低嵌入率、提高纯度，同时也提高了分离液的利用率，降低成本。，下面是一种分离纯化哺乳动物胰岛的方法专利的具体信息内容。
1.一种分离纯化哺乳动物胰岛的方法，其特征在于：将哺乳动物的胰腺组织采用胶原酶法分离得到胰岛粗提物，过筛后，高渗-低渗法处理去除部分外分泌细胞，最后再进行不连续密度梯度离心，获得胰岛，纯度高达95％以上。
2.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于：整个制备过程均在无菌条件下进行，具体操作过程如下，
（1）获得新鲜哺乳动物的胰腺组织，热缺血时间<10分钟；
（2）将步骤（1）的胰腺组织灌注胶原酶溶液后，机械剪碎，胶原酶处理30-45分钟，获得胰岛粗提物；
其中，胶原酶为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的一种或二种以上，酶的使用浓度即每种酶浓度在0-2mg/ml，溶液中总酶浓度0.5-2mg/ml，该步骤在35-37℃下完成；
（3）将步骤（2）得到的胰岛粗提物过10-325目筛网，得到通过筛网的胰岛组织团粗提物；
（4）将步骤（3）得到的胰岛组织团采用高低渗法处理，即先将胰岛组织团悬于
100-1000mmol/L的高渗液中，0-25℃无菌搅拌，转速为0-200rpm/min，1-120min后，过滤或离心，再将胰岛组织团粗提物换用低渗液重悬，0-25℃无菌搅拌，转速为0-200rpm/min，
1-120min，过10-325目筛网，去除部分外分泌细胞，得到通过筛网的胰岛组织团粗提物；
步骤（4）中高渗液配制方法是以RPMI1640培养基、MEM培养基、DMEM培养基、Medium199培养基、或生理盐水、PBS缓冲液、Hank`s缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或二种以上为液相基质，其中加入葡萄糖，使葡萄糖于液相基质中的终浓度100-1000mmol/+ -
L，并调整液相基质中的以下几种离子的终浓度为：Na0-600mmol/L、Cl0-600mmol/L、
2+ -1 +
Ca 0-600mmol/L、HCO3 0-600mmol/L、K0-600mmol/L；
低渗液配方为配制方法以RPMI1640培养基、MEM培养基、DMEM培养基、Med ium199培养基、或生理盐水、PBS缓冲液、Hank`s缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或二种以上为液相基质，其中加入或不加葡萄糖，使葡萄糖于液相基质中的终浓度0-300mmol/+ -
L，并调整液相基质中的以下几种离子的终浓度为：Na0-300mmol/L、Cl0-300mmol/L、
2+ -1 +
Ca 0-300mmol/L、HCO3 0-300mmol/L、K0-300mmol/L；
（5）将步骤（4）得到的胰岛组织团粗提物与密度1.084g/mlDextran或Ficoll或percoll或碘克沙醇分离液混合，按粗提物与分离液1:5-1:10的体积比例下于混匀器中混匀后，加入离心管底部，然后再向离心管中依次加入与1.084g/ml分离液等体积的密度为
1.065g/ml、1.060g/ml、1.054g/ml、1.036g/ml的Dext ran或Ficoll或percoll或碘克沙醇分离液；0-25℃离心，0-800rpm，0-10min，在此基础上提高转速到1000-2500rpm，继续离心1-60min；胰岛组织细胞于离心管中分层，取分离出的每层细胞，用上述液相基质离心清洗2-3次，其中位于密度1.084g/ml与1.065g/ml间细胞层，即为所要获取的分离纯化好的胰岛。
3.根据权利要求书2所述的制备方法，其特征在于：灌注胶原酶的用量与胰腺组织重量的关系为0.5-5ml/g；胰岛组织粗提物与与高渗液或低渗液的体积比为1:1-1:50。
4.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于：所述哺乳动物的胰腺组织为人、猴、猪、狗、猫或啮齿类等各种哺乳动物的胰腺组织。
一种分离纯化哺乳动物胰岛的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及了一种新型高效哺乳动物胰岛纯化方法，具体地说本发明是可以降低胰岛嵌入率，提高胰岛纯度及产量的纯化方法。
背景技术
[0002] 近年来，糖尿病在世界范围内大幅度的增加，而传统的胰岛素注射治疗并不能避免并发症的产生。由于胰岛是胰腺的内分泌单位，其具有重要的调节血糖的生理作用，因此科研人员期望通过胰岛移植治疗来减轻患者长期注射胰岛素的痛苦，并解决并发症的产生。胰岛移植是一种极具潜力的胰岛素依赖型糖尿病的临床治疗方法，与胰腺移植相比胰岛移植具有简单、安全、有效、副作用小等优点，因此其应用前景更加广泛。但是人源胰腺供体的短缺是制约胰岛移植治疗的主要问题，因此异种胰岛移植是解决胰岛来源的最佳方法[Moon-Kyu Lee.Cell transplantation for endocrine disorders，Advanced Drug Delivery Reviews，2000，42:103-120][Reinhard G.Islet celltransplantation today.Langenbecks Arch Surg，2007，392:239-253]。但是，患者的免疫排斥反应制约着其在临床的应用。生物微胶囊技术则为最终解决免疫排斥问题提供了可能，微囊化胰岛细胞移植可以实现全内分泌替代治疗，通过对血糖进行持续监测和精细的调节，可使糖代谢恢复正常而不增加低血糖的发生率，从而防止或减缓心、肾、眼等病变的发展。同时对Ⅱ型糖尿病患者来说，胰岛细胞移植可以部分替代尚存在功能的胰岛细胞发挥作用，有助于患者胰腺功能的修复及发挥正常的作用，使患者逐步摆脱对药物或胰岛素的依赖。因此如何获得大量高活性的胰岛是制约微囊化胰岛治疗进入临床的关键因素。由于哺乳动物胰腺组织结构在不同物种之间，甚至在同物种间，也存在着明显的差别，所以增加了分离纯化难度，此外在胰岛的分离纯化过程中，也存在着诸多变量因素，使得胰岛的产量高度不一。目前科研人员根据胰岛密度及外分泌细胞密度，通常直接采用连续或不连续密度梯度离心法去除外分泌细胞，目的使其分离纯化。纯化方法大多采用Ficoll、Dextran或Biocoll液进行4℃离心机梯度特异性地对胰岛细胞进行分离纯化。但是由于胰岛的密度为：～1.059g/ml，外分泌细胞的密度为：1.059～1.074g/ml，对于嵌入式胰岛即被外分泌细胞包围的胰岛，它们的密度与外分泌细胞类似，所以仅用梯度离心的方法很难纯化分离开，因此降低了胰岛纯度，影响胰岛回收率，此外分离液价格昂贵，也增加了胰岛获取的成本。因此本发明考虑优化胰岛纯化方案，达到提高胰岛纯度、降低嵌入率、提高分离液利用率和降低纯化成本的目的。
发明内容
[0003] 针对上述问题，本发明提出了一种新型高效哺乳动物胰岛纯化方法。本发明纯化方法中采用了反复过筛处理，去除过大的组织块及单细胞。采用高低渗法去除嵌入式胰岛，由于嵌入式胰岛的密度与外分泌组织类似，所以仅仅采用密度梯度离心法很难分离开，降低了胰岛的纯度，而本发明采用高低渗法，可去除嵌入式胰岛外围包裹的外分泌细胞，提高了胰岛的纯度及产量。经过过筛及高低渗处理的胰岛粗提物再进行密度梯度离心后，可明显提高分离液的利用率，降低了成本。
[0004] 本发明新型高效哺乳动物胰岛纯化方法的高低渗法原理如下图1所示：
[0005] 由于胰岛表面含有转运葡萄糖的蛋白（如图1-A），即GLUT-2，而外分泌细胞不含有该蛋白，所以可以通过渗透压的改变来去除外分泌细胞，在高糖高渗溶液下（如图1-B），胰岛表面的GLUT-2可以调节细胞的膨胀而达到平衡，而外分泌细胞无此功能，所以外分泌细胞通过水的外排作用，瞬时收缩，一段时间后，通过离子作用增加内部的离子浓度来平衡外部葡萄糖浓度，所以大多数的外分泌细胞又恢复了体积（如图1-C），当将这些细胞处于低渗溶液中时，相反的过程发生，没有GLUT-2的细胞膨胀而破裂，此过程仅会对外分泌细胞产生破坏的作用，对胰岛无影响（如图1-D）。
[0006] 本发明采用了一种新型高效哺乳动物胰岛纯化方法，该纯化方法可以降低嵌入式胰岛的嵌入率和提高胰岛纯度。该哺乳动物胰岛纯化方法中包括采用过筛处理和高渗-低渗溶液处理，即在温和的搅拌条件下去除嵌入式胰岛外的外分泌细胞及部分外分泌细胞团，最后进行不连续密度梯度离心纯化。
[0007] 其中，哺乳动物胰岛的纯化包括对人、猴、猪、狗、猫或啮齿类等各种哺乳动物的胰岛的分离纯化。
[0008] 该纯化方法包含过筛处理、高渗-低渗溶液处理、不连续密度梯度离心；
[0009] 该纯化方法的过筛处理为将得到的胰岛粗提物过10-325目筛网。
[0010] 该纯化方法的高低渗处理的溶液配制含量为：高渗液配制方法是以RPMI1640、MEM、DMEM、Medium199等培养基或生理盐水、PBS、Hank`s、HEPES、Tris、平衡盐溶液为水+ - 2+相，其中含葡萄糖100-1000mol/L、Na0-600mmol/L、Cl0-600mmol/L、Ca 0-600mmol/L、-1 +
HCO3 0-600mmol/L、K0-600mmol/L；低渗液配方为配制方法是以RPMI1640、MEM、DMEM、Medium199等培养基或生理盐水、PBS、Hank`s、HEPES、Tris、平衡盐溶液为水相，其中含葡萄+ - 2+ -1
糖0-300mmo l/L、Na0-300mmol/L、Cl0-300mmol/L、Ca 0-300mmol/L、HCO3 0-300mmol/L、+
K0-300mmol/L。
HCO3 0-600mmol/L、K0-600mmol/L；低渗液配方为配制方法是以RPMI1640、MEM、DMEM、Medium199等培养基或生理盐水、PBS、Hank`s、HEPES、Tris、平衡盐溶液为水相，其中含葡萄+ - 2+ -1
糖0-300mmo l/L、Na0-300mmol/L、Cl0-300mmol/L、Ca 0-300mmol/L、HCO3 0-300mmol/L、+
K0-300mmol/L。
[0011] 该纯化方法中高渗溶液的搅拌时间为1-120min，在低渗溶液的搅拌时间为1-120min。
[0012] 该纯化方法的不连续密度梯度离心的分离液可采用Dextran或Ficoll或percoll或碘克沙醇分离液。
[0013] 该新型高效哺乳动物胰岛纯化方法的操作步骤如下：无菌条件下，[0014] （1）获得新鲜哺乳动物的胰腺组织，热缺血时间<10分钟，
[0015] （2）将步骤（1）的胰腺组织灌注胶原酶后，机械剪碎，胶原酶处理30-45分钟，获得胰岛粗提物。其中，胶原酶为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的一种或二种以上，酶的使用浓度即每种酶浓度在0-2mg/ml，溶液中总酶浓度在0.5-2mg/ml，该步骤在35-37℃下完成。
[0016] （3）将步骤（2）得到的胰岛粗提物过10-325目筛网，得到胰岛组织团。
[0017] （4）将步骤（3）得到的胰岛组织团采用高渗-低渗法处理，即先将胰岛组织团悬于100-1000mmo l/L的高渗液中，0-25℃无菌搅拌，转速为0-200rpm/mi n，1-120min后，换用低渗液重悬，0-25℃无菌搅拌，转速为0-200rpm/min，1-120min，过10-325目筛网，去除部分外分泌细胞，得到胰岛组织团粗提物。
[0018] 步骤（4）中高渗液配制方法是以RPMI1640、MEM、DMEM、Medium199等培养基或生理盐水、PBS、Hank`s、HEPES、Tris、平衡盐溶液为水相，其中含葡萄糖100-1000mmol/L、+ - 2+ -1 +Na0-600mmol/L、Cl0-600mmol/L、Ca 0-600mmol/L、HCO3 0-600mmol/L、K0-600mmol/L；
低渗液配方为配制方法是以RPMI1640、MEM、DMEM、Medium199等培养基或生理盐水、PBS、+
Hank`s、HEPES、Tris、平衡盐溶液为水相，其中含葡萄糖0-300mmol/L、Na0-300mmol/L、- 2+ -1 +
Cl0-300mmol/L、Ca 0-300mmol/L、HCO3 0-300mmol/L、K0-300mmol/L。
低渗液配方为配制方法是以RPMI1640、MEM、DMEM、Medium199等培养基或生理盐水、PBS、+
Hank`s、HEPES、Tris、平衡盐溶液为水相，其中含葡萄糖0-300mmol/L、Na0-300mmol/L、- 2+ -1 +
Cl0-300mmol/L、Ca 0-300mmol/L、HCO3 0-300mmol/L、K0-300mmol/L。
[0019] （5）将步骤（4）得到的胰岛组织团与密度1.084g/ml Dextran或Ficoll或percoll或碘克沙醇分离液混合，1:5-1:10的比例下混匀器混匀后，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Dextran或Ficoll或percoll或碘克沙醇分离液。0-25℃离心，0-800rpm，0-10min，在此基础上提高转速到1000-2500rpm，继续离心1-60min。取分离出的每层细胞，用培养基离心清洗2-3次，其中1.084-1.065层即获得分离纯化好的胰岛组织。
[0020] 本发明是一种能在胰岛纯化过程中，降低嵌入式胰岛含量，提高胰岛纯度，提高分离液利用率，并且可以有效地提高分离后胰岛的活性。该纯化方法是针对于胰岛纯化过程存在嵌入式胰岛干扰纯化结果的问题而发明的。
[0021] 本发明的效果如下：
[0022] 1.可避免嵌入式胰岛的引入，使得密度梯度离心能明显区分内外分泌细胞，减轻下游工作的难度。
[0023] 2.可降低嵌入式胰岛的比例，提高分离液的利用率，降低成本。
[0025] 图1为高低渗法演示图；
[0026] 图2（a）粗分离得到的胰岛；（b）经过高-低渗处理的胰岛粗提物；
[0027] 图3（a）纯化优化实验组；图3（b）对照组；
[0028] 图4纯化优化实验后的胰岛-DTZ染色。
具体实施方式
[0029] 实施例1：
[0030] 一种新型高效小鼠胰岛纯化方法的具体操作步骤：
[0031] 配制试剂：用RPMI1640基础培养基配制高、低渗液，使得葡萄糖终浓度分别为300mmol/和0mmol/L，搅拌均匀后0.22um无菌过滤备用。配制Dextran分离液，设定不连续密度梯度为：1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。
[0032] 摘取新鲜哺乳动物的胰腺组织，使得热缺血时间<10分钟，胰腺组织灌注胶原酶溶液后，机械剪碎，胶原酶处理30-45分钟，获得胰岛粗提物。将胰岛粗提物用4℃含10％血清的Hank`s重悬后进行过筛处理，先过20目不锈钢筛网，去除大的组织块，收集滤过物，再过325目筛网，去除单细胞，收集胰岛粗提物进行高低渗法处理，先将胰岛粗提物悬于高渗液中，4℃无菌搅拌，转速为50rpm/min，30min后，过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，换用低渗液重悬，4℃无菌搅拌，转速50rpm/min，15min。过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，离心清洗，弃上清。最后采用不连续密度梯度离心，将高低渗处理后的细胞颗粒与密度为1.084g/ml的Dextran液1:10的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Dextran液，4℃离心5min，900rpm；20min，2000rpm。取1.084-1.065层的细胞，用RPMI1640培养基离心清洗2次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。
[0033] 对照组为：将由胶原酶灌注法分离提取的胰岛粗提物用4℃含10％血清的Hank`s重悬后，过20目不锈钢筛网，去除大的组织块，收集滤过物，直接进行不连续密度梯度离心。细胞颗粒与密度为1.084g/ml的Dextran液1:10的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Dextran液，4℃离心5min，900rpm20min，2000rpm。取1.084-1.065层的细胞，用培养基离心清洗2次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。
[0034] 检测方法：
[0035] 对采用或未采用高低渗处理的胰岛进行DTZ染色（如图2），可见嵌入式胰岛外的外分泌细胞（如图2-a）经高低渗处理后可去除（如图2-b）。通过检测分离后胰岛的纯度和嵌入率（纯度检测方法：:取三份200ul纯化前后的样品细胞颗粒，经DTZ染色后，镜下拍照，Image J记录并分析被DTZ染色的胰岛以及未染色的细胞团数，胰岛纯度=DTZ染色的胰岛/细胞团总数×100％；嵌入率检测方法：取三份200ul纯化前后的样品细胞颗粒，经DTZ染色后，镜下拍照，Image J记录并分析，胰岛嵌入率=嵌入式胰岛数/胰岛总数×100％），发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度高达98％（如图3），嵌入率为0。通过检测分离后胰岛的活力和功能（活力检测方法：台酚蓝细胞活死染色；功能检测方法：猪胰岛素快速检测试剂盒），发现该新型纯化方法得到的胰岛与常规纯化相比活力提高了1.1倍，功能活性提高了1.5倍。
[0036] 实施例2：
[0037] 一种新型高效大鼠胰岛纯化方法的具体操作步骤：
[0038] 配制试剂：用DMEM基础培养基配制高、低渗液，使得葡萄糖终浓度分别为350mmol/和0mmol/L，搅拌均匀后0.22um无菌过滤备用。配制Ficoll分离液，设定不连续密度梯度为：1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。摘取新鲜哺乳动物的胰腺组织，使得热缺血时间<10分钟，胰腺组织灌注胶原酶溶液后，机械剪碎，胶原酶处理30-45分钟，获得胰岛粗提物。将胰岛粗提物用4℃含5％血清的PBS重悬后进行过筛处理，先过18目不锈钢筛网，去除大的组织块，收集滤过物，再过270目筛网，去除单细胞，收集滤布上的细胞进行高低渗法处理，先将胰岛粗提物悬于高渗液中，4℃无菌搅拌，转速为40rpm/min，8min后，过270目滤布筛网，收集滤网上的细胞，换用低渗液重悬，4℃无菌搅拌，转速40rpm/min，
15min。过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，离心清洗，弃上清。最后采用不连续密度梯度离心，将高低渗处理后的细胞颗粒与密度为1.084g/ml的Ficoll液1:9的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Ficoll液，4℃离心20min，2000rpm。取1.084-1.065层的细胞，用DMEM培养基离心清洗3次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度高达100％（如图4），嵌入率为0。胰岛活力提高了1.3倍，功能活性提高了1.6倍。
15min。过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，离心清洗，弃上清。最后采用不连续密度梯度离心，将高低渗处理后的细胞颗粒与密度为1.084g/ml的Ficoll液1:9的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Ficoll液，4℃离心20min，2000rpm。取1.084-1.065层的细胞，用DMEM培养基离心清洗3次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度高达100％（如图4），嵌入率为0。胰岛活力提高了1.3倍，功能活性提高了1.6倍。
[0039] 实施例3：
[0040] 一种新型高效猪胰岛纯化方法的具体操作步骤：
[0041] 配制试剂：用Hank`s盐溶液配制高、低渗液，使得葡萄糖终浓度分别为600mmol/和0mmol/L，搅拌均匀后0.22um无菌过滤备用。配制Ficoll分离液，设定不连续密度梯度为：1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。将灌注胶原酶法分离提取的胰岛粗提物用4℃含10％血清的Hank`s盐溶液重悬后进行过筛处理，先过10目不锈钢筛网，去除大的组织块，收集滤过物，再过325目滤布筛网，去除单细胞，收集滤布上的细胞进行高低渗法处理，先将胰岛粗提物悬于高渗液中，4℃无菌搅拌，转速为20rpm/min，30min后，过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，换用低渗液重悬，4℃无菌搅拌，转速20rpm/min，60min。过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，离心清洗，最后采用不连续密度梯度离心，将高低渗处理后的细胞颗粒与密度为1.084g/ml的Ficoll液1:8的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Ficoll液，室温离心25min，2500rpm。取1.084-1.065层的细胞，用培养基离心清洗2次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度为95％，嵌入率为0。胰岛活力提高了0.9倍，功能活性提高了1.1倍。
[0042] 实施例4：
[0043] 一种新型高效猪胰岛纯化方法的具体操作步骤：
[0044] 配制试剂：用HBSS盐溶液配制高、低渗液，使得葡萄糖终浓度分别为200mmol/和0mmol/L，搅拌均匀后0.22um无菌过滤备用。配制Dextran分离液，设定不连续密度梯度为：
1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。将胶原酶灌注法分离提取的胰岛粗提物用4℃含
5％血清的HBSS盐溶液重悬后进行过筛处理，先过16目不锈钢筛网，去除大的组织块，收集滤过物，再过270目筛网，去除单细胞，收集滤布上的细胞进行高低渗法处理，先将胰岛粗提物悬于高渗液中，25℃无菌搅拌，转速为35rpm/min，15min后，过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，换用低渗液重悬，25℃无菌搅拌，转速35rpm/min，75min。过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，离心清洗，弃上清。最后采用不连续密度梯度离心，将高低渗处理后的细胞颗粒与密度为1.084g/ml的Dextran液1:10的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Dextran液，室温离心20min，1500rpm。
取1.084-1.065层的细胞，用培养基离心清洗3次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。
发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度为96％，嵌入率为0。胰岛活力提高了1.2倍，功能活性提高了1.3倍。
1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。将胶原酶灌注法分离提取的胰岛粗提物用4℃含
5％血清的HBSS盐溶液重悬后进行过筛处理，先过16目不锈钢筛网，去除大的组织块，收集滤过物，再过270目筛网，去除单细胞，收集滤布上的细胞进行高低渗法处理，先将胰岛粗提物悬于高渗液中，25℃无菌搅拌，转速为35rpm/min，15min后，过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，换用低渗液重悬，25℃无菌搅拌，转速35rpm/min，75min。过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，离心清洗，弃上清。最后采用不连续密度梯度离心，将高低渗处理后的细胞颗粒与密度为1.084g/ml的Dextran液1:10的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Dextran液，室温离心20min，1500rpm。
取1.084-1.065层的细胞，用培养基离心清洗3次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。
发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度为96％，嵌入率为0。胰岛活力提高了1.2倍，功能活性提高了1.3倍。
[0045] 实施例5：
[0046] 一种新型高效狗胰岛纯化方法的具体操作步骤：
[0047] 配制试剂：用Medium199基础培养基配制高、低渗液，使得葡萄糖终浓度分别为650mmol/和0mmo l/L，搅拌均匀后0.22um无菌过滤备用。配制percoll分离液，设定不连续密度梯度为：1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。将胶原酶灌注法分离提取的胰岛粗提物用4℃含10％血清的Hank`s盐溶液重悬后进行过筛处理，先过14目不锈钢筛网，去除大的组织块，收集滤过物，再过270目筛网，去除单细胞，收集滤布上的细胞进行高低渗法处理，先将胰岛粗提物悬于高渗液中，25℃无菌搅拌，转速为45rpm/min，35min后，过270目筛网，收集滤网上的细胞，换用低渗液重悬，25℃无菌搅拌，转速45rpm/min，65min。过325目滤布筛网，收集滤网上的细胞，离心清洗，弃上清。最后采用不连续密度梯度离心，将高低渗处理后的细胞颗粒与密度为1.084g/ml的percoll分离液1:7的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的percoll分离液，4℃离心0-5min，800rpm；5-20min，2000rpm。取1.084-1.065层的细胞，用培养基离心清洗3次，
1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。结果发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度高达95.5％，嵌入率为0。胰岛活力提高了1倍，功能活性提高了1.5倍。
1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。结果发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度高达95.5％，嵌入率为0。胰岛活力提高了1倍，功能活性提高了1.5倍。
[0048] 实施例6：
[0049] 一种新型高效人胰岛纯化方法的具体操作步骤：
[0050] 配制试剂：用RPMI1640基础培养基配制高、低渗液，使得葡萄糖终浓度分别为260mmol/和0mmol/L，搅拌均匀后0.22um无菌过滤备用。配制Dextran分离液，设定不连续密度梯度为：1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。将采用胶原酶灌注法分离提取的胰岛粗提物用4℃含10％血清的RPMI1640基础培养基重悬后进行过筛处理，先过10目不锈钢筛网，去除大的组织块，收集滤过物，再过325目滤布筛网，去除单细胞，收集滤布上的细胞进行高低渗法处理，先将胰岛粗提物悬于高渗液中，4℃无菌搅拌，转速为55rpm/min，10min后，过230目滤布筛网，收集滤网上的细胞，换用低渗液重悬，4℃无菌搅拌，转速55rpm/min，10min。过230目滤布筛网，收集滤网上的细胞，离心清洗，弃上清。最后采用不连续密度梯度离心，将高低渗处理后的细胞颗粒与密度为1.084g/ml的Dextran液1:8的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Dextran液，4℃离心6min，500rpm；20min，2000rpm。取1.084-1.065层的细胞，用培养基离心清洗2次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。结果发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度高达96.5％，嵌入率为0。胰岛活力提高了1倍，功能活性提高了1.3倍。
[0051] 实施例7：
[0052] 一种新型高效人胰岛纯化方法的具体操作步骤：
[0053] 配制试剂：用MEM基础培养基配制高、低渗液，使得葡萄糖终浓度分别为450mmo l/L和0mmo l/L，搅拌均匀后0.22um无菌过滤备用。配制Ficoll分离液，设定不连续密度梯度为：1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。将胶原酶灌注法分离提取的胰岛粗提物用4℃含5％血清的MEM重悬后进行过筛处理，先过18目不锈钢筛网，去除大的组织块，收集滤过物，再过270目滤布筛网，去除单细胞，收集滤布上的细胞进行高低渗法处理，先将胰岛粗提物悬于450mmol/L高渗液中，25℃无菌搅拌，转速为60rpm/min，10min后，过230目滤布筛网，收集滤网上的细胞，换用低渗液重悬，25℃无菌搅拌，转速60rpm/min，60min。过230目滤布筛网，收集滤网上的细胞，离心清洗，弃上清。最后采用不连续密度梯度离心，将高低渗处理后的细胞颗粒与密度为1.084g/ml的Ficoll液1:10的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的Ficoll液，4℃离心
15min，2500rpm。取1.084-1.065层的细胞，用培养基离心清洗3次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度高达99％，嵌入率为0。胰岛活力提高了1.4倍，功能活性提高了1.6倍。
15min，2500rpm。取1.084-1.065层的细胞，用培养基离心清洗3次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度高达99％，嵌入率为0。胰岛活力提高了1.4倍，功能活性提高了1.6倍。
[0054] 实施例8：
[0055] 一种新型高效猫胰岛纯化方法的具体操作步骤：
[0056] 配制试剂：用PBS溶液配制高、低渗液，使得葡萄糖终浓度分别为550mmol/L和0mmol/L，搅拌均匀后0.22um无菌过滤备用。配制碘克沙醇分离液，设定不连续密度梯度为：1.084、1.065、1.060、1.054、1.036g/ml。将灌注胶原酶法分离提取的胰岛粗提物用4℃含5％血清的PBS溶液重悬后进行过筛处理，先过12目不锈钢筛网，去除大的组织块，收集滤过物，再过230目筛网，去除单细胞，收集滤布上的细胞进行高低渗法处理，先将胰岛粗提物悬于高渗液中，4℃无菌搅拌，转速为65rpm/min，35min后，过230目滤布筛网，收集滤网上的细胞，换用低渗液重悬，4℃无菌搅拌，转速65rpm/min，15min。过270目滤布筛网，收集滤网上的细胞，离心清洗，弃上清。最后采用不连续密度梯度离心，将高低渗处理后的细胞颗粒与密度为1.084g/ml的碘克沙醇分离液1:6的比例混匀器下混匀，加入离心管底部，然后再依次加入1.065、1.060、1.054、1.036g/ml的碘克沙醇分离液，25℃离心15min，
2500rpm。取1.084-1.065层的细胞，用培养基离心清洗2次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度高达95％，嵌入率为0。胰岛活力提高了0.9倍，功能活性提高了1.2倍。
2500rpm。取1.084-1.065层的细胞，用培养基离心清洗2次，1000rpm/min 2min，去上清，纯化结束。发现采用该改良后的纯化方法后胰岛的纯度高达95％，嵌入率为0。胰岛活力提高了0.9倍，功能活性提高了1.2倍。
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