一种纤维素降解方法、纤维素降解方法的工艺参数优化方法及其纤维素降解菌筛选方法
阅读：728发布：2020-06-13
专利汇可以提供一种纤维素降解方法、纤维素降解方法的工艺参数优化方法及其纤维素降解菌筛选方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 纤维 素降解方法、 纤维素 降解方法的工艺参数优化方法及其纤维素降解菌筛选方法。其中，所述优化方法如下步骤：测定木质纤维素原料各组分的含量；分别为木质纤维素原料的酸法预处理、 碱 法预处理以及酸碱联合预处理方法设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个 水 平；依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件；分别对木质纤维素原料依据所述多组预处理实验条件进行预处理；最后对预处理后的木质纤维素原料进行酶解并测定计算木质纤维素原料的 糖化 率。结合多种不同的化学预处理方法，合理的设置实验条件，从而完成工艺参数的整体考量，揭示了各影响因素之间的相互作用关系，有效的实现了工艺参数的优化。，下面是一种纤维素降解方法、纤维素降解方法的工艺参数优化方法及其纤维素降解菌筛选方法专利的具体信息内容。
1.一种纤维素降解工艺参数的优化方法，其特征在于，包括如下步骤：
测定木质纤维素原料各组分的含量；
分别为木质纤维素原料的酸法预处理、碱法预处理以及酸碱联合预处理方法设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个水平；
依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件；
分别对木质纤维素原料依据所述多组预处理实验条件进行预处理；
对预处理后的木质纤维素原料进行酶解并测定计算木质纤维素原料的糖化率。
2.根据权利要求1所述的优化方法，其特征在于，采用NREL法测定木质纤维素原料各组分的含量；采用葡萄糖试剂盒测定法测定计算所述木质纤维素原料的糖化率。
3.根据权利要求1所述的优化方法，其特征在于，所述依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件包括：采用正交实验设计方法，设计碱法处理的若干组预处理实验条件。
4.根据权利要求3所述的优化方法，其特征在于，所述正交实验设计使用L16(44)正交表，具体包括反应时间、反应温度、纤维素降解酶用量以及碱的用量四个实验因素；每个实验因素均设置四个水平。
5.一种纤维素降解工艺参数的优化方法，其特征在于，包括如下步骤：
测定木质纤维素原料各组分的含量；
分别为木质纤维素原料的酸法预处理、碱法预处理以及酸碱联合预处理方法设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个水平；
依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件；
对木质纤维素原料依据所述预处理实验条件进行预处理；
对预处理后的木质纤维素原料进行酶解并且
利用薄层层析法测定计算木质纤维素原料的糖化率；
所述利用薄层层析法测定计算木质纤维素原料的糖化率的步骤具体包括：
确定葡萄糖的Rf值；
通过苯酚硫酸法绘制葡萄糖标准曲线并计算曲线方程；
测定某一预处理实验条件的木质纤维素原料酶解后的葡萄糖含量；
计算木质纤维素原料的糖化率。
6.根据权利要求5所述的一种优化方法，其特征在于，所述薄层层析的展开剂pH值为
5.0。
7.一种使用如权利要求1或5任一所述的优化方法获得的纤维素降解方法，其特征在于，包括如下步骤：
使用0.15mg的氢氧化钠，在80℃的条件下对木质纤维素原料进行预处理；
将预处理后的木质纤维素原料使用1.5ml的源自于纤维素降解菌种的纤维素降解酶进行处理。
8.一种筛选如权利要求7所述的纤维素降解菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采集红棕象甲幼虫样品并制备红棕象甲幼虫的菌悬液；
选择使用CMC-Na作为培养基的唯一碳源，KNO3作为培养基的唯一氮源来富集培养所述菌悬液中的纤维素降解菌；
筛选并初步鉴定所述纤维素降解菌；
分离纯化已初步鉴定的纤维素降解菌；
对分离纯化后的纤维素降解菌进行酶活力测定。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，筛选所述纤维素降解菌的具体步骤包括：
将富集培养后获得的菌液进行梯度稀释；
稀释后菌液涂布于培养基中进行培养；
培养基长出菌落后，将菌落转接到初筛培养基上；
通过刚果红染色法对初筛培养基进行染色并观察菌落透明圈情况。
一种纤维素降解方法、纤维素降解方法的工艺参数优化方
法及其纤维素降解菌筛选方法
技术领域
[0001] 本发明涉及纤维素降解技术领域，尤其涉及一种纤维素降解方法、其工艺参数的优化方法及其纤维素降解酶筛选方法。
背景技术
[0003] 但现有纤维素降解工艺中主要存在以下的一些问题。例如，纤维素分子链牢牢连在一起，形成高结晶结构，不溶于水，具有抗解聚能力。与纤维素结合在一起的木质素对纤维素降解成葡萄糖也会形成物理屏障，木质素会不可逆无效地吸收纤维素酶，导致纤维素水解率较低。工业化规模生产高活性纤维素酶尚未能有效实现。上述这些问题使得木质纤维素酶解效率(即糖化率)较低，无法有效的实现大规模工业生产。
[0004] 另外，由于化学预处理法能有效降低纤维素的结晶度，除去半纤维素或木质素，具备能耗低、周期短、效率高、条件较温和等优点。所以，在工业化应用中通常会采用酸/碱法预处理等预处理方法来降低纤维素的结晶度，除去木质素，从而实现更好的纤维素降解效果。但现有研究多针对某一具体方面或者反应机理的研究，尚未有对不同化学预处理方法进行系统分析、全面评价的研究成果。
[0005] 因此，现有技术还有待发展。
发明内容
[0006] 鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种纤维素降解方法、其工艺参数的优化方法及其纤维素降解酶筛选方法，旨在解决现有技术在纤维素降解工业化生产中酶解效率较低的问题。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
[0008] 一种纤维素降解工艺参数的优化方法，其中，包括如下步骤：测定木质纤维素原料各组分的含量；分别为木质纤维素原料的酸法预处理、碱法预处理以及酸碱联合预处理方法设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个水平；依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件；分别对木质纤维素原料依据所述多组预处理实验条件进行预处理；对预处理后的木质纤维素原料进行酶解并测定计算木质纤维素原料的糖化率。
[0010] 所述的优化方法，其中，所述依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件包括：采用正交实验设计方法，设计碱法处理的若干组预处理实验条件。
[0011] 所述的优化方法，其中，所述正交实验设计使用L16(44)正交表，具体包括反应时间、反应温度、纤维素降解酶用量以及碱的用量四个实验因素；每个实验因素均设置四个水平。
[0012] 一种纤维素降解工艺参数的优化方法，其中，包括如下步骤：测定木质纤维素原料各组分的含量；分别为木质纤维素原料的酸法预处理、碱法预处理以及酸碱联合预处理方法设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个水平；依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件；对木质纤维素原料依据所述预处理实验条件进行预处理；对预处理后的木质纤维素原料进行酶解并且利用薄层层析法测定计算木质纤维素原料的糖化率。
[0013] 所述利用薄层层析法测定计算木质纤维素原料的糖化率的步骤具体包括：确定葡萄糖的Rf值；通过苯酚硫酸法绘制葡萄糖标准曲线并计算曲线方程；测定某一预处理实验条件的木质纤维素原料酶解后的葡萄糖含量；计算木质纤维素原料的糖化率。
[0014] 所述的一种优化方法，其中，所述薄层层析的展开剂pH值为5.0。
[0015] 一种使用如上所述的优化方法获得的纤维素降解方法，其中，包括如下步骤：使用0.15mg的氢氧化钠，在80℃的条件下对木质纤维素原料进行预处理；将预处理后的木质纤维素原料使用1.5ml的纤维素降解酶进行处理。
[0016] 一种筛选如上所述的纤维素降解菌的方法，其中，包括如下步骤：采集红棕象甲幼虫样品并制备红棕象甲幼虫的菌悬液；选择使用CMC-Na作为培养基的唯一碳源，KNO3作为培养基的唯一氮源来富集培养所述菌悬液中的纤维素降解菌；筛选并初步鉴定所述纤维素降解菌；分离纯化已初步鉴定的纤维素降解菌；对分离纯化后的纤维素降解菌进行酶活力测定。
[0017] 所述的筛选方法，其中，筛选所述纤维素降解菌的具体步骤包括：将富集培养后获得的菌液进行梯度稀释；稀释后菌液涂布于培养基中培养；培养长出菌落后，再将菌落转接到初筛培养基上，通过刚果红染色法对初筛培养基进行染色并观察菌落透明圈情况。
[0018] 有益效果：本发明提供的一种纤维素降解方法、其工艺参数的优化方法及其纤维素降解酶筛选方法。结合多种不同的化学预处理方法，合理的设置实验条件，从而完成对纤维素降解工艺参数的整体考量，揭示了各影响因素之间的相互作用关系，有效的实现了工艺参数的优化。并且进一步的提供了一种筛选高效降解纤维素的菌种的方法，同时对预处理和后续酶解操作两个步骤的效率优化均进行了改进，从而进一步的大幅提升纤维素酶解的效率。附图说明
[0020] 图2为本发明具体实施例的纤维素降解方法的方法流程图
[0021] 图3为本发明具体实施例的纤维素降解菌的筛选方法的方法流程图
[0022] 图4为本发明具体实施例的筛选出的纤维素降解真菌的示意图。
[0023] 图5为本发明具体实施例的筛选出的纤维素降解真菌的透明圈示意图。
[0024] 图6为本发明具体实施例的筛选出的纤维素降解细菌的透明圈示意图。
[0025] 图7为本发明具体实施例的筛选出的纤维素降解另一细菌的透明圈示意图。
具体实施方式
[0026] 本发明提供一种纤维素降解方法、其工艺参数的优化方法及其纤维素降解酶筛选方法。为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027] 如图1所示为本发明的纤维素降解工艺参数的优化方法的具体实施例。
[0028] 所述优化方法包括如下步骤：
[0029] S1、测定木质纤维素原料各组分的含量。
[0030] 在以木质纤维素进行酶解的过程中，纤维素、半纤维素的含量多少与总糖得率直接相关。三组分(纤维素、半纤维素以及木质素)的含量变化更是评价预处理、酶解及发酵工艺条件的重要依据。因此需要首先测定木质纤维素原料各组分的含量。
[0031] 在本发明一具体实施例中，可以采用NREL法进行测定。这一方法是由美国国家可再生能源实验室(NREL)提供的系统测定木质纤维素原料中三组分含量的方法，操作简单而且可进行大批量同时测定，已经被广泛应用，为本技术领域人员所熟知，在此不作赘述。
[0032] S2、分别为木质纤维素原料的酸法预处理、碱法预处理以及酸碱联合预处理方法设置若干个实验因素以及为每一实验因素设置若干个水平。
[0033] 在现有的化学预处理方法中，通常均采用碱或者酸处理，并未对两者的处理效果进行比较。采用上述方式，能够系统的比较不同预处理工艺的效果，从而实现整体的优化及考虑。
[0034] S3、依据设置的实验因素及水平设计多组预处理实验条件(即多个实验组)。具体可以采用多种合适的实验设计方法完成上述步骤。例如，可以采用正交实验设计的方法设置实验组。当然，还可以使用其他统计学模型设置。
[0035] S4、分别对木质纤维素原料依据所述多组预处理实验条件进行预处理。
[0036] S5、对预处理后的木质纤维素原料进行酶解。
[0037] S6、测定计算木质纤维素原料的糖化率。所述木质纤维素原料的糖化率可以通过现有合适的测定葡萄糖浓度的方法来测定并经过计算获得。例如，可以使用商业化的葡萄糖试剂盒来进行测定。
[0038] 在获得不同实验组的糖化率后(亦即实验结果)，通过相应的计算来获得木质纤维素的最优处理工艺参数。具体计算方式可以依据步骤S3中具体采用的实验设计方法所确定。如采用正交实验设计时，则使用相对应的正交分析表。
[0039] 实施例1
[0040] 本实施例为采用酸法预处理的木质纤维素降解工艺参数的优化方法。
[0041] 一、制作木质纤维素原料(去除油脂成分的原料椰壳粉)：取废弃椰壳，先切成小块，在中药粉碎机下，打成粉末，烘干，称重。然后，将上述干燥椰壳粉加入圆底烧瓶中，加入适量无水乙醇于95℃水浴中索式抽提完全，风干，得到原料椰壳粉，称重。
[0042] 二、NREL法测定木质纤维素原料：
[0043] 浓酸的处理：取三支干燥试管，分别加入0.5g、1.0g、2.0g的原料椰壳粉，再分别加入72％的硫酸3ml、6ml、12ml,摇匀，30℃水浴60min。将上述浓酸的水解液转移至锥形瓶中，并稀释酸的浓度至4％，所加蒸馏水包括冲洗水在内分别是51ml、102ml、204ml，将其放置在立体式压力蒸汽灭菌器，于121℃保温45min。取出三支试管，过滤，滤液用NaOH溶液调节pH至2，滤渣用蒸馏水洗涤至中性，再烘干，称重。
[0044] 三、预处理工艺参数的优化实验设计：
[0045] 取98％的浓硫酸。根据公式98/X＝A(即1ml98％的硫酸可配Aml浓度为X％，那么加蒸馏水(A-1)ml)配置出其他所需不同浓度的硫酸。
[0046] (1)不同的酸浓度预处理实验：取原料椰壳粉140mg，于五支干燥试管中，分别编号0.5％、1％、2％、3％、4％，再加入对应浓度的硫酸，在70℃HH-S型水浴锅中反应60min。
[0047] (2)不同的反应时间预处理实验：取原料椰壳粉140mg，于五支干燥试管中，分别编号20min、40min、60min、80min、100min,再加入1％的硫酸5ml,在70℃HH-S型水浴锅反应，再依次取出各支试管。
[0048] (3)不同的反应温度预处理实验：取原料椰壳粉140mg，于五支干燥试管中，分别编号60℃、80℃、100℃、120℃、160℃，再加入1％的硫酸5ml，在HH-S型水浴锅中，每个温度反应60min。
[0049] (4)不同的酸量预处理实验：取原料椰壳粉140mg，于四支干燥试管中，分别编号5ml、10ml、15ml、20ml，加入相应量的1％的硫酸，在70℃HH-S型水浴锅中反应60min。
[0050] 四、预处理后的纤维素酶解：
[0051] 将上述不同条件的预处理后的溶液进行过滤，弃去滤液，留下残渣待用。调节残渣的pH为5左右。
[0052] 取丹麦诺维信公司纤维素酶液：葡萄糖苷酶液＝7：1混合配置酶溶液。然后取上述酶溶液1ml，分别加入过滤之后的残渣液中，置于37℃的恒温水浴锅中，反应60min。
[0053] 五、糖化率的测定：
[0054] 用容量瓶将所有反应后的水解液稀释至100ml。
[0055] 将葡萄糖试剂盒中的R1、R2溶液等比例混合，置于37℃恒温水浴锅中15min。
[0056] 用移液枪取90μl稀释水解液于干燥试管，并做上相应标记，再加R1、R2溶液1ml，加蒸馏水2ml,混合均匀，置于37℃恒温水浴锅中60min。
[0057] 取0.1ml标准葡萄糖溶液于干燥试管中，再加R1、R2溶液1ml，加蒸馏水2ml,混合均匀后，同样置于37℃恒温水浴锅中60min。
[0058] 取上述标准葡萄糖反应后溶液适量于比色皿中，放入WFJ-7200型可见分光光度仪，在505nm处测量吸光度。取其他待测液依次测量吸光度并记录数据。
[0059] 五、结果：
[0060] 表1：木质素含量测定结果
[0061]原料量/g 0.5 1.0 2.0
残渣量(即木质素)/g 0.1724 0.3391 0.6682
残渣量(即木质素)/g 0.1724 0.3391 0.6682
[0062] 实验结果显示，半纤维素含量极少，可以忽略不计。因此，在此仅显示木质素含量[0063] 表2：不同的酸浓度预处理实验的结果
[0064]
[0065] 如表2中所示，随着酸浓度的增加，吸光度降低，水解的葡萄糖的含量相应减少。酸浓度的升高，反而抑制了酶对纤维的水解。酸浓度在0.5％时，转化率最大。
[0066] 表3：不同的反应时间预处理实验的结果
[0067]
[0068] 如表3中所示，随着时间的延长，吸光度先增加后降低，水解后葡萄糖的含量相应的先升高后减少。当反应时间为60min时，转化率达到最大。
[0069] 表4：不同的反应温度预处理实验的结果
[0070]
[0071]
[0072] 如表4所示，随着温度的升高，吸光度在降低，水解后的葡萄糖的量在相应的减少。并且每次温度的升高，与前一次相比，波动幅度较大。当温度是60℃时，转化率达到最大值。
[0073] 表5：不同的酸量预处理实验的结果
[0074]
[0075] 如表5所示，随着酸的体积的增加，吸光度在降低，水解后葡萄糖的含量相应的减少，并且最后趋于平衡。当酸量在5ml时，转化率到达最大。
[0076] 实施例2
[0077] 本实施例为采用碱法预处理的木质纤维素降解工艺参数的优化方法。除“预处理工艺参数的优化实验设计”外，其他的步骤均与实施例1相同，因此对其他步骤不作赘述。
[0078] (1)不同NaOH浓度的预处理:取1gNaOH固体颗粒，定容至100ml的容量瓶中，可得到1％的NaOH溶液。同理分别可以配置2％，3％，4％，5％的NaOH溶液。取原料椰壳粉140mg，于五支干燥试管中，分别编号1％、2％、3％、4％、5％，再加入对应浓度的NaOH溶液，在70℃恒温水浴锅中反应60min。
[0079] (2)不同反应时间的预处理:取原料椰壳粉140mg，于五支干燥试管中，分别编号20min、40min、60min、80min、100min,再加入3％的NaOH溶液5ml,在70℃恒温水浴锅反应，再依次取出各支试管。
[0080] (3)不同反应温度的预处理:取原料椰壳粉140mg，于五支干燥试管中，分别编号60℃、80℃、100℃、120℃、160℃，再加入3％的NaOH溶液5ml，在恒温油浴锅中，每个温度反应60min。
[0081] (4)不同碱量的预处理:取原料椰壳粉140mg，于四支干燥试管中，分别编号5ml、10ml、15ml、20ml，加入相应量的3％的NaOH溶液，在70℃的水浴锅中反应60min。
[0082] 具体实验结果如下：
[0083] 表2.1：不同的碱浓度预处理实验的结果
[0084]
[0085] 如表2中所示，随着碱浓度的增加，样品吸光度先升高后降低，说明纤维素的转化率也是先高后低，在NaOH浓度2％时，转化率最大。
[0086] 表3：不同的反应时间预处理实验的结果
[0087]
[0088] 如表3中所示，随着时间的延长，吸光度先增加后降低，水解后葡萄糖的含量相应的先升高后减少。当反应时间为80min时，转化率达到最大。
[0089] 表4：不同的反应温度预处理实验的结果
[0090]
[0091] 如表4所示，随着温度的升高，吸光度先升高后降低，水解后葡萄糖的量相应变化。当温度为60℃时，转化率达到最大值。可能原因是在温度不断升高的条件下，椰壳纤维逐渐被碳化了。
[0092] 表5：不同的碱量预处理实验的结果
[0093]
[0094]
[0095] 如表5所示，随着碱量的增加，样品吸光度先升高后趋于平稳。当纤维素为140mg时，碱的用量是15ml，纤维素的转化率达到最大69.1％。
[0096] 实施例3
[0097] 本实施例为采用酸碱联合预处理的木质纤维素降解工艺参数的优化方法。除“预处理工艺参数的优化实验设计”外，其他的步骤均与实施例1相同，因此对其他步骤不作赘述。
[0098] (1)不同酸浓度预处理：取五支试管，编号。每支试管中加入脱脂后干燥样品0.14g，各加入2％NaOH 10mL，静置1小时，调pH＝7，分别加入1％、2％、3％、4％、5％浓度的硫酸10mL，均放入60℃水浴锅中加热60min，静置1小时，调pH＝4.8，过滤，滤渣待用。
[0099] (2)不同酸反应时间预处理：取五支试管，编号。每支试管中加入脱脂后干燥样品0.14g，各加入2％NaOH 10mL，静置1小时，调pH＝7，均加入1％浓度的硫酸10mL，分别放入60℃水浴锅中加热40min、60min、80min、100min、120min，静置1小时，调pH＝4.8，过滤，滤渣待用。
[0100] (3)不同酸反应温度预处理：取五支试管，编号。每支试管中加入脱脂后干燥样品0.14g，各加入2％NaOH 10mL，静置1小时，调pH＝7，均加入1％浓度的硫酸10mL，分别放入50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴锅中加热60min，静置1小时，调pH＝4.8，过滤，滤渣待用。
[0101] (4)不同碱浓度预处理：取五支试管，编号。每支试管中加入脱脂后干燥样品0.14g，各加入1％硫酸10mL，静置1小时，调pH＝7，分别加入1％、2％、3％、4％、5％浓度的NaOH 10mL，均放入80℃水浴锅中加热80min，静置1小时，调pH＝4.8，过滤，滤渣待用。
[0102] (5)不同碱反应时间预处理：取五支试管，编号。每支试管中加入脱脂后干燥样品0.14g，各加入1％硫酸10mL，静置1小时，调pH＝7，均加入2％浓度的NaOH 10mL，分别放入80℃水浴锅中加热40min、60min、80min、100min、120min，静置1小时，调pH＝4.8，过滤，滤渣待用。
[0103] (6)不同碱反应温度预处理：取五支试管，编号。每支试管中加入脱脂后干燥样品0.14g，各加入1％硫酸10mL，静置1小时，调pH＝7，均加入2％浓度的NaOH 10mL，分别放入
50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴锅中加热80min，静置1小时，调pH＝4.8，过滤，滤渣待用。
50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴锅中加热80min，静置1小时，调pH＝4.8，过滤，滤渣待用。
[0104] 具体实验结果如下：
[0105] 表3.1：不同酸浓度预处理结果
[0106]
[0107]
[0108] 如表中所示，硫酸浓度在0.5％时预处理效果是最优的，高于该浓度的预处理后的转化率均有所下降。
[0109] 表3.2：不同酸反应时间预处理结果
[0110]
[0111] 如表中所示，反应时间在60min时预处理效果最适，低于或高于该时间预处理后的纤维素转化率会降低。
[0112] 表3.3：不同酸反应温度预处理结果
[0113]
[0114] 如表中所示，反应温度在60℃左右是预处理效果最佳，低于或高于该温度预处理后的纤维素转化率会降低。
[0115] 表3.4：不同的碱浓度预处理实验结果
[0116]NaOH浓度 样品吸光 样品体积/ 水解后质量 水解前质量 转化率/％
[0117](％) 度 ml /g /g
1 0.487 78.2 0.049 0.091 53.8
2 0.575 85.6 0.069 0.091 75.6
3 0.469 76.4 0.063 0.091 69.5
4 0.413 79.6 0.062 0.091 68.6
5 0.420 81.3 0.059 0.091 65.1
1 0.487 78.2 0.049 0.091 53.8
2 0.575 85.6 0.069 0.091 75.6
3 0.469 76.4 0.063 0.091 69.5
4 0.413 79.6 0.062 0.091 68.6
5 0.420 81.3 0.059 0.091 65.1
[0118] 如表中所示，NaOH浓度在2％左右是预处理效果最佳，低于或高于该浓度预处理后的纤维素转化率会降低。
[0119] 表3.5：不同碱反应时间预处理结果
[0120]
[0121] 表3.3：不同碱反应温度预处理结果
[0122]
[0123] 如表中所示，预处理反应时间在80℃时效果最佳，低于或高于改浓度预处理后纤维素转化率会降低。
[0124] 通过上述实验结果可以看出，碱浓度对椰壳纤维酶解率的影响占主导作用，其次是反应时间、反应温度。其中反应温度的波动不大，而反应时间的波动较大。
[0125] 实施例4
[0126] 本实施例为采用正交实验设计方法设计碱法预处理的多组预处理实验条件。其中，设置有反应时间、反应温度、纤维素降解酶用量以及碱的用量四个实验因素，每个实验因素均设置四个水平，并使用L16(44)正交表。
[0127] 一、原料组分测定(在此实施例中采用薄层层析的方法)
[0128] 取废弃椰壳，在粉碎机下，打成粉末，烘干，称量质量。将上述干燥椰壳粉加入圆底烧瓶中，加入适量无水乙醇于95℃水浴中索式抽提完全，风干，得到原料椰壳粉，称量其质量。
[0129] 取三支干燥试管，分别加入0.5g、1.0g、2.0g的原料椰壳粉，再分别加入72％的硫酸3ml、6ml、12ml,摇匀，30℃水浴60min。将上述浓酸的水解液转移至锥形瓶中，并稀释酸的浓度至4％，所加蒸馏水包括冲洗水在内分别是51ml、102ml、204ml，将其放置在高压灭菌锅，于121℃保温45min。取出三支试管，过滤，滤液用NaOH溶液调节pH至2，滤渣用蒸馏水洗涤至中性，再烘干，称量质量。
[0130] 二、薄层层析定性分析：
[0131] 点样：首先在距底边1.5cm或2cm处,轻轻画出点样的起始点标记,然后用微量注射器直接将0.4μl样品液或标准液点加到板上,在一块板上可同时2～3个样点,样点间应保持1.5～2.0cm的距离。
[0132] 展开：将展开剂倒入槽内,深度约5～6mm,待槽内为展开溶剂蒸气所饱和,然后将点好样的薄层板,底边向下轻轻斜置槽内溶剂中(由于槽内充满溶剂蒸气,薄层板上的溶剂不再蒸发,可消除边沿效应,同时速度也较快)。展开高度为距原点10～12cm(也根据情况也可上升至15cm)。
[0133] 应当说明的是，采用常规的分析用展开剂时，样品点展开时出现比较明显的拖尾现象。通过对展开剂的pH值进行调整，较佳的将所述薄层层析的展开剂pH值调整为5.0后，样品点展开正常。
[0135] 三、薄层定量分析：
[0136] 精确称取无水葡萄糖5g，至500ml容量瓶稀释定容。500ml容量瓶中分别取0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml至试管，分别加蒸馏水至2ml，0.4μl样品液或标准液点加到板上，再按照薄板层析的方法展开，将画圈位置处薄层板硅胶刮下,用7ml水洗脱,离心10min后,取5ml定容至10ml,然后取该溶液2ml,加入苯酚0.5ml,硫酸5ml,放置10min,最后在25～30℃水浴,放置10min,在分光光度计上测490nm吸光度并记录，完成标准曲线的绘制。
[0137] 按正交实验设计表，取预处理椰壳纤维后稀释至100ml,利用薄层定性分析确定标准样点位置，将上述画圈位置处薄层板硅胶刮下,用7ml水洗脱,离心10min后,取5ml定容至10ml,然后取该溶液2ml,加入苯酚0.5ml,硫酸5ml，放置10min,最后在25～30℃水浴放置10min,在分光光度计上测490nm吸光度。
[0138] 四、其他：
[0139] 反应条件参数的控制以及实验方法可以采用实施例1-3所述的方法。本实施例中使用的纤维素降解酶源自于本发明所述筛选方法选出的具有纤维素降解能力的菌种的组合(具体为下述实施例中筛选出的一株真菌以及两株细菌)。具体从菌种中获取纤维素降解酶的方法为本领域技术人员所熟知，在此不作赘述。
[0140] 正交实验设计表：
[0141]
[0142]
[0143] 四、具体实验结果如下：
[0144] (1)薄层定性分析结果：
[0145]
[0146] (2)葡萄糖标准曲线：
[0147]
[0148] 经过计算，回归方程为y＝0.111x+0.110，葡萄糖质量在0.4μg-2.8μg内符合比尔定律。
[0149] (3)薄层定量分析结果：其中纤维素质量的单位为mg；葡萄糖浓度的单位为mg/ml；葡萄糖质量的单位为mg。
[0150]
[0151]
[0152] (5)正交实验分析结果：
[0153] 正交分析表：反应时间单位为min、反应温度单位为℃、酶的用量单位为ml、氢氧化钠单位为mg。
[0154]
[0155]
[0156] 由上表可知，最优组合为反应温度80℃(B2)、加入酶量1.5ml(C2)、0.15mg氢氧化钠(D1)。采用与本实施例相同的纤维素转化率(糖化率)测定方法，最优组合实验条件下转换率为89.8％。与现有的纤维素酶解转化率相比，上述处理工艺的转化率具有明显的提升。
[0157] 二、方差分析(未考虑因素间相互作用)：
[0158]
[0159] 由上表所知，因素B的p值小于0.01(即变量关联中偶然性造成的概率小于1％)。
[0160] 取P＝0.05，因素A、C、D均远大于此值。因此，尚无充分理由认为这三个因素具有统计学上的意义。应当说明的是，本方差分析的前提为“不考虑因素间的相互作用”，上述分析结果并未排除温度及时间等两个因素之间相互影响的可能。
[0161] 依据上述优化方法，本发明还提供一种纤维素降解方法。如图2所示，所述方法包括如下步骤：
[0162] A1、使用0.15mg的氢氧化钠，在80℃的条件下对木质纤维素原料进行预处理。
[0163] A2、将预处理后的木质纤维素原料使用1.5ml的纤维素降解酶进行处理。
[0164] 如上所述，在使用与实施例4相同的纤维素降解酶的条件下，采用实施例1-3所述的糖化率测定和计算方法，上述纤维素降解方法的纤维素糖化率达到了89.5％。
[0165] 现有公认降解能力最佳的诺维信公司的纤维素降解酶的转换率基本为58％。与其相比，采用上述优化工艺以及本发明所述筛选方法筛选出的菌种的纤维素降解酶的纤维素降解效率远大于现有最佳的纤维素降解效率。所述降价方法具有良好的应用前景。
[0166] 本发明还进一步提供了一种筛选适用于所述纤维素降解方法的纤维素降解菌的方法，从而进一步的优化纤维素的降解工艺。
[0167] 如图3所示，所述筛选方法具体包括如下步骤：
[0168] B1、采集红棕象甲幼虫样品并制备红棕象甲幼虫的菌悬液。
[0170] 由于红棕象甲幼虫具有钻蛀椰子或者棕榈科植物茎干取食的生物学特性。因此，其体内含有分泌高效纤维素酶的特种微生物的可能性非常大。选取其作为筛选基因库，能够极大的提高筛选出高效纤维素酶的可能性。
[0171] B2、选择使用CMC-Na作为培养基的唯一碳源，KNO3作为培养基的唯一氮源来富集培养所述菌悬液中的纤维素降解菌。应当说明的是，CMC-Na的浓度太大会使目的菌不能完全降解CMC-Na,从而导致观察不到透明圈，遗漏目的菌。在本发明的较佳实施例中，在实现较好的菌落生长情况下避免目的菌的遗漏，可以将CMC-Na的浓度设置为0.1％。
[0172] B3、筛选并初步鉴定所述纤维素降解菌。初步鉴定是指初步确定某一单菌落菌体是否具备可信的纤维素降解能力。
[0173] B4、分离纯化已初步鉴定的纤维素降解菌。
[0174] B5、对分离纯化后的纤维素降解菌进行酶活力测定。
[0175] 当然，在筛选、分离纯化完成后，还可以对筛选出的菌种作进一步的鉴定，包括分子生物学上的鉴定，确定其种属关系，生物学特性等等。
[0176] 具体的，筛选纤维素降解菌的操作步骤可以包括：首先，将富集培养后获得的菌液进行梯度稀释。然后，将稀释后菌液涂布于培养基中培养。最后，在培养长出菌落后，再将菌落转接到初筛培养基上。最后，通过刚果红染色法对初筛培养基进行染色并观察菌落透明圈情况。可以依据具体情况来设置筛选条件(即菌落周边透明圈需要满足的条件)[0177] 与一般的直接在CMC-Na刚果红初筛培养基上进行培养初筛不同，所述筛选步骤首先对菌液进行培养，然后在进行刚果红染色初筛，从而有效的避免了菌株在所述初筛培养基上无法生长、不能产生透明圈的问题，筛选效果更佳。
[0178] 实施例5
[0179] 本实施例为筛选红棕象甲幼虫的菌悬液中的真菌的方法。
[0180] 一、样品采集及菌液制备
[0181] 红棕象甲幼虫取自海南省文昌县中国热带作物科学院椰子研究所，放置在有盖的塑料器皿中，1周左右喷洒1次水，实验室内饲养。
[0182] 选取10头红棕象甲，放置冰上稍微冷冻使其活动性减弱。用70％的酒精擦拭无菌操作台，然后把在载物台上滴一滴0.9％生理盐水，用解剖镊子夹一头红棕象甲放在上面。按住头部，在尾部用镊子轻轻的往外拉，整个肠道即被拉出，截取后肠部分和去皮的部分加少量水磨碎后分别转移至10ml CMC2富集培养基中(即为红棕象甲幼虫后肠菌和胃菌悬液)。
[0183] 二、富集培养
[0184] 分别取上述红棕象甲后肠和胃菌悬液各10ml至无菌的三角瓶中，30℃条件下振荡培养1～3天后，按2％的接种量，取0.2ml菌液转接至10ml新的富集培养基CMC2中进行第2次富集培养。
[0185] 三、初筛
[0186] 分别取富集培养后的两种菌悬液各1ml做系列稀释，选取合适倍数(本实验中稀释到105～107倍)。每种菌液取0.1ml分别涂布于真菌培养基PDA选择平板，每种菌悬液稀释倍数做三个平行板，平板于30℃恒温培养1～3天，以平板上出现均匀的单菌落为准。待长出单菌落后(以40个菌落为准)选取4个平板。
[0187] 用接种环挑选真菌单菌落点种在真菌初筛培养基上，每板接种5株菌株。每株菌株点种两个平板，一个平板用于刚果红染色，另一个作为保存平板。
[0188] 刚果红染色步骤为：30℃培养1-3天后，测量记录各菌落直径后用70％乙醇将菌落洗掉，然后用0.1％的刚果红浸染30min，倾去染液，再用1mol/L的NaCl浸泡脱色30min，倾去NaCl浸泡液。
[0189] 观察刚果红染色平板的菌落周围有无透明圈，若有透明圈，测量记录透明圈的直径，计算透明圈的直径与菌落直径大小的比值(HC值)。挑选HC值大于1的菌株作为初筛菌种。
[0190] 四、分离纯化
[0191] 通过连续划线法分离纯化初筛菌种，经镜检后，得到的初筛菌株转接到真菌保种培养基(PDA)保藏斜面，4℃条件下保藏备用。
[0192] 五、复筛：
[0193] 在各菌株的平板菌落边缘，用接种环挑取菌丝体薄片2块接种于含60ml复筛液体培养基的100ml三角瓶中，置于30℃，120r/min摇床中培养7天，取发酵液10ml，在4℃下，10000r/min离心10min，收集上清液作为粗酶液，用于酶活性的测定。
[0194] 六、酶活力测定(在本实施例中，酶活力单位(U/ml)定义为：1ml酶液在特定反应条件下在1min内使底物降解，生成1μmol葡萄糖所需的酶量)
[0195] 可以利用DNS法原理来进行酶活力测定。亦即纤维素经纤维素酶水解后生成的还原糖能将DNS中的硝基还原为氨基，生成棕红色的氨基化合物。在一定的浓度范围内，还原糖的量与棕红色的深浅呈正比关系，可通过比色法测定。
[0196] 上述真菌的酶活力测定可以包括滤纸酶活力(FPA)、外切葡聚糖酶(C1)活力、β－葡萄糖苷酶活力(BGL)测定。
[0197] 其中，本实施例中使用的材料具体如下：
[0198] 富集培养基CMC2：KH2PO4 0.2％，MgSO40.015％，KNO30.1％，CMC-Na 1％，共100ml。
[0200] 真菌初筛培养基：K2HPO42.0g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaCl 6g、CMC-Na 15g、琼脂粉1.5％、(NH4)2SO42.0g、CaCl20.1g、KH2PO40.5g、pH7.0～7.4、蒸馏水1000ml。
[0201] 真菌复筛及发酵培养液：K2HPO42.0g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaCl6g、CMC-Na 15g、(NH4)2SO4 2.0g、CaCl2 0.1g、KH2PO4 0.5g、pH7.0～7.4、蒸馏水1000ml。
[0202] 真菌保种培养基：即真菌培养基(PDA)。
[0203] 筛选结果：在本实施例中，筛选到一株具有纤维素分解能力的真菌。如图4及图5所示，为所述真菌及其菌丝形成的透明圈。
[0204] 实施例6
[0205] 本实施例为筛选红棕象甲幼虫的菌悬液中具有纤维素降解能力细菌的方法。本实施例中大部分步骤与实施例5中的相同，为陈述简便，在此仅对不相同的步骤作出描述。
[0206] 三、初筛
[0207] 分别取富集培养后的两种菌悬液各1mL做系列稀释，选取合适倍数(本实验中稀5 7
释到10～10 倍)每种菌液取0.1mL分别涂布于细菌培养基选择平板，每种稀释倍数做三个平行板，平板于30℃恒温培养1～3天，以平板上出现均匀的单菌落为准。待长出单菌落后(以40个菌落为准)选取4个平板。
释到10～10 倍)每种菌液取0.1mL分别涂布于细菌培养基选择平板，每种稀释倍数做三个平行板，平板于30℃恒温培养1～3天，以平板上出现均匀的单菌落为准。待长出单菌落后(以40个菌落为准)选取4个平板。
[0208] 用接种环挑选细菌单菌落点种在细菌初筛培养基上，每板接种5株菌株。每株菌株点种两个平板，一个平板用于刚果红染色，另一个作为保存平板。
[0209] 观察刚果红染色平板的菌落周围有无透明圈，若有透明圈，测量记录透明圈的直径，计算透明圈的直径与菌落直径大小的比值(HC值)。挑选HC值大于1的菌株作为初筛菌种。
[0210] 四、分离纯化
[0211] 挑选HC值大于1的菌株作为初筛菌种，通过连续划线法分离纯化，经革兰氏染色镜检后，得到的初筛菌株转接到细菌保种培养基保藏斜面，4℃条件下保藏备用。
[0212] 其中，本实施例中使用的材料具体如下：
[0213] 富集培养基CMC2:KH2PO40.2％，MgSO40.015％，KNO30.1％，CMC-Na 1％，共100mL。
[0214] 细菌培养基:牛肉浸膏0.15％，蛋白胨0.5％，CMC-Na 0.1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％,共500mL
[0215] 初筛培养基：牛肉浸膏0.15％，蛋白胨0.5％，CMC-Na 0.1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％,共500mL
[0216] 复筛及发酵培养液：K2HPO42.0g、MgSO4·7H2O 0.1g、NaCl6g、CMC-Na 15g、(NH4)2SO42.0g、CaCl20.1g、KH2PO40.5g、pH 7.0～7.4、蒸馏水1000mL。
[0217] 细菌保种培养基：即细菌培养基。
[0218] 筛选结果：在本实施例中，分离到两株具有纤维素降解能力的细菌。如图6及图7所示，为所述细菌形成的透明圈。
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