抗线虫棉花转化事件GHM3
阅读：282发布：2020-05-14
专利汇可以提供抗线虫棉花转化事件GHM3专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 提供了抗 线虫 棉 花转化事件GHM3，并提供了相关的创制方法、检测方法和应用，属于 植物 生物 技术领域。具体地，本申请以棉花品种材料YZ-1为受体经过转基因，得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物的棉花植株，其中外源基因插入物包含抗线虫基因。本申请所获得转化事件GHM3，所插入的外源基因位于棉花基因组的非功能位点，不影响植物自身其他基因的表达，在使转基因棉花植物获得抗虫特性的同时，保持了其良好的农艺性状。，下面是抗线虫棉花转化事件GHM3专利的具体信息内容。
1.核酸分子，其为：
i)包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸和/或第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；
ii)包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸和第3335-3722位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；
iii)包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位核苷酸和第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；或者
iv)包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸，第3335-3722位核苷酸和第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO:1所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。
3.如权利要求1或2所述的核酸分子，其包含表达抗线虫基因的表达盒，如SEQ ID NO:1的第2482-3991位核苷酸所示序列。
4.如权利要求1或2所述的核酸分子，其通过将如SEQ ID NO:1的第2482-3991位核苷酸所示的表达抗线虫基因的表达盒导入棉花的基因组中获得。
5.如权利要求1或2所述的核酸分子，其存在于棉花植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分中。
6.用于检测棉花转化事件的探针，其包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸或第
3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。
7.用于检测棉花转化事件的引物对，其能够特异性扩增产生包含SEQ ID NO:1的第
374-1036位核苷酸或第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；
任选地，所述引物对为：
i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸所示序列的引物对；
ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位核苷酸所示序列的引物对；
iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位核苷酸所示序列的反向引物；或者iv)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位核苷酸所示序列的反向引物；
任选地，所述引物对为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列或其互补序列；或者SEQ ID No:12和SEQ ID No:13所示的核苷酸序列或其互补序列。
8.用于检测棉花转化事件的试剂盒或微阵列，其包含权利要求6所述的探针和/或权利要求7所述的引物对。
9.检测棉花转化事件的方法，其包括利用以下来检测待测样品中是否存在所述转化事件：
-权利要求6所述的探针；
-权利要求7所述的引物对；
-权利要求6所述的探针和权利要求6所述的引物对；或者
-权利要求8所述的试剂盒或微阵列。
10.对棉花进行育种的方法，所述方法包括以下步骤：
1)获得包含权利要求1或2所述的核酸分子的棉花；
2)将步骤1)所获得的棉花通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，
3)对步骤2)所获得的后代植物进行抗线虫鉴定，并利用权利要求8所述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。
抗线虫棉花转化事件GHM3
技术领域
背景技术
[0002] 棉花作为一种特殊的经济作物，在种植过程中很容易受到外界因素的影响。除了温度、湿度、施肥等因素的影响外，棉花种植过程中容易受到病虫害的影响，如果不及时采取必要的病虫害预防措施，将会影响棉花的整体产量，同时给棉花种植带来不利影响。
[0003] 棉花病害分为侵染性病害和非侵染性病害两大类。其中侵染性病害是由病原生物，例如真菌、细菌、线虫、病毒等引起的。虽然可以采用喷洒农药杀虫剂的方法来预防棉花虫害，但杀虫剂残留对于棉花产品的安全性存在一定的隐患，因而开发抗病虫的棉花品种是从根部上防治虫害爆发的根本。
[0004] 转基因技术可以应用于棉花品种的开发，使棉花具备抗虫害体质，是目前流行的防治虫害的强有力手段。用于棉花的抗虫基因主要是针对鳞翅目害虫和同翅目昆虫，如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的内毒素蛋白基因、豇豆胰蛋白酶抑制基因(Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI)和植物凝集素基因(1ectin)。对于土壤中危害棉花的线虫，尚有待于开发有效的转基因抗性品种。发明内容
[0005] 一方面，本申请提供了核酸分子，其为：i)包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸和/或第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；ii)包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸和第3335-3722位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；iii)包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位核苷酸和第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；或者iv)包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸，第3335-3722位核苷酸和第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。
[0006] 在一实施方案中，本申请提供的核酸分子包含SEQ ID NO:1所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。
[0007] 在另一实施方案中，本申请提供的核酸分子包含表达抗线虫基因的表达盒，如SEQ ID NO:1的第2482-3991位核苷酸所示序列。
[0008] 在又一实施方案中，本申请提供的核酸分子，其通过将如SEQ ID NO:1的第2482-3991位核苷酸所示的表达抗线虫基因的表达盒导入棉花的基因组中获得。
[0010] 另一方面，本申请提供了用于检测棉花转化事件的探针，其包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸或第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。
[0011] 又一方面，本申请提供了用于检测棉花转化事件的引物对，其能够特异性扩增产生包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸或第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。
[0012] 在一实施方案中，本申请提供的用于检测棉花转化事件的引物对为：i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸所示序列的引物对；ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位核苷酸所示序列的引物对；iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位核苷酸所示序列的反向引物；或者iv)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位核苷酸所示序列的反向引物。
[0013] 在另一实施方案中，本申请提供的引物对为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列或其互补序列；或者SEQ ID No:12和SEQ ID No:13所示的核苷酸序列或其互补序列。
[0015] 还一方面，本申请提供了检测棉花转化事件的方法，其包括利用以下来检测待测样品中是否存在所述转化事件：上述的探针；上述的引物对；上述的探针和上述的引物对；或者上述的试剂盒或微阵列。
[0016] 本申请还提供了对棉花进行育种的方法，所述方法包括以下步骤：1)获得包含上述的核酸分子的棉花；2)将步骤1)所获得的棉花通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，3)对步骤2)所获得的后代植物进行抗线虫鉴定，并利用上述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。
[0018] 图1是转化载体pZZ00074的结构示意图，其中的英文及各缩写含义列举如下：
[0019] Omega：欧米茄序列，增强子
[0020] Kozak sequence：Kozak序列，增强子
[0021] Cystatin：优化的Cystatin基因序列
[0022] polyA：多聚腺苷酸序列
[0023] T-NOS：胭脂碱合成酶终止子
[0024] T-BORDER(right)：T-DNA右边界序列
[0025] CaMV35S promoter：黄瓜花叶病毒35S启动子
[0026] CaMV35S polyA：黄瓜花叶病毒35S多聚腺苷酸序列，终止子
[0027] T-BORDER(left)：T-DNA左边界序列
[0028] Bp：碱基对
[0029] kanamasin(R)：卡那霉素抗性序列
[0030] pBR322ori：pBR322起始区序列
[0031] pBR322born：pBR322骨架区序列
[0032] pVS1rep：pVS1复制子
[0033] pVS1sta：pVS1转录起始区
[0034] 图2是棉花转化事件GHM3基因组DNA的Southern印迹检测结果图，其中：泳道1(GHM3)为转化事件GHM3；泳道2(YZ-1)为非转基因植株阴性对照；泳道3(P)为阳性质粒对照；泳道4(M)为分子量标记。
[0035] 图3是棉花转化事件GHM3的插入位点检测结果及DNA电泳照片，其中：泳道1(M)为分子量标记；泳道2和泳道5(WT)为野生型植株DNA模板PCR结果；泳道3(ddH2O)和泳道6(ddH2O)分别为空白模板PCR结果；泳道4(L)和泳道7(R)分别是以转化事件GHM3植株DNA模板，采用不同引物对的PCR结果。
具体实施方式
[0036] 提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
[0037] 本技术领域人员公知，外源基因在植物体内的表达具有位置效应，即受到插入染色体位置的影响，这种影响可能是由于染色体结构或整合位点附近的转录调节元件造成的。因此，通常需要生产数百个不同的转化事件，并从这些事件中筛选出外源基因表达水平及模式符合预期要求的优异转化事件，以达到商业化生产应用的目的。
[0038] 优异的转化事件可通过常规育种方法即有性杂交的方式将外源基因转育到其它遗传背景的种质中，其后代保持了原始转化体的转基因表达特性。
[0039] 本申请涉及通过从诸多转化事件中筛选出的优异棉花转化事件GHM3。
[0040] 在本申请中，“转化事件GHM3”是指以棉花品种材料YZ-1为受体经过转基因，得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物(T-DNA插入物)的棉花植株，其中外源基因插入物包含抗线虫基因。本申请所获得转化事件GHM3，所插入的外源基因位于棉花基因组的非功能位点，不影响植物自身其他基因的表达，在使转基因棉花植物获得抗虫特性的同时，保持了其良好的农艺性状。
[0041] 在具体实例中，转基因后所得到的T-DNA插入物具有SEQ ID NO:1的第512-4016位核苷酸所示序列。转化事件GHM3可以指这一转基因过程，也可以指由这一过程所得到的基因组内的T-DNA插入物，或T-DNA插入物与侧翼序列的组合，或可以指由这一转基因过程得到的棉花植株。转化事件GHM3还可以指由上述植物进行无性繁殖、有性繁殖、减倍或加倍繁殖或以上的组合而得到的后代植物。
[0042] 在其他实施方案中，该事件也适用于同样的外源基因(SEQ ID NO:1的第512-4016位核苷酸所示序列)转化其他植物受体品种，从而将T-DNA插入物插入到同样基因组位置而获得的植物。适用的植物包括双子叶植物，例如大豆、花生、向日葵等。
[0043] 在本申请中，获得了以SEQ ID NO:1的第1-511位核苷酸为左侧侧翼序列和SEQ ID NO:1的第4017-4517位核苷酸为右侧侧翼序列的T-DNA插入物(SEQ ID NO:1的第512-4016位核苷酸)。侧翼序列并非仅限于SEQ ID NO:1的第1-511位核苷酸和第4017-4517位核苷酸，由于列出的侧翼序列仅是用于表示T-DNA插入物在基因组中的位置，即T-DNA插入物的插入位点位于棉花第9号染色体90496812处，因此本申请的侧翼序列可以根据基因组序列而向两侧延伸。
[0044] 由于转化事件GHM3产生向基因组中特定位点插入的T-DNA插入物，因此其插入位点是特异性的，可以用于检测生物样品中是否包含转化事件GHM3。在具体实施方案中，包含转化事件GHM3的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的任何序列，均可用于检测本申请的转化事件GHM3，包括但不限于包含上游插入位点(左侧翼序列与T-DNA插入物的接合位点)或下游插入位点(右侧翼序列与T-DNA插入物的接合位点)的以下序列或其片段或其变体或其互补序列中的一种或多种：i)包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸所示序列；ii)包含SEQ ID NO:1的第1-1036位核苷酸所示序列；iii)包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位核苷酸所示序列；iv)包含SEQ ID NO:1的第512-4016位核苷酸所示序列；v)包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位核苷酸所示序列；vi)包含SEQ ID NO:1的第3657-4517位核苷酸所示序列；vii)包含SEQ ID NO:1的第374-4356位核苷酸所示序列；viii)包含SEQ ID NO:1所示的序列。
[0045] 在具体实例中，可用于检测本申请的转化事件GHM3的序列为包含上游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列，如包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第1-1036位核苷酸所示序列，或者为包含下游插入位点的序列，例如，包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第3657-4517位核苷酸所示序列，或者为包含上游插入位点的序列与包含下游插入位点的序列的组合。
[0046] 在另一实例中，可用于检测本申请的转化事件GHM3的序列为包含上游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列与包含T-DNA插入物的序列或其片段或其变体或其互补序列的组合，例如，包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第1-1036位核苷酸所示序列，与包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第512-4016位核苷酸所示序列的组合。
[0047] 在另一实例中，可用于检测本申请的转化事件GHM3的序列为包含下游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列与包含T-DNA插入物的序列或其片段或其变体或其互补序列的组合，例如，包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第3657-4517位核苷酸所示序列，与包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第512-4016位核苷酸所示序列的组合。
[0048] 在另一实例中，可用于检测本申请的转化事件GHM3的序列为包含SEQ ID NO:1的第374-4356位核苷酸所示序列或其片段或其变体或其互补序列，或者为包含SEQ ID NO:1所示的序列或其片段或其变体或其互补序列。
[0049] 因此，能够特异性检测转化事件GHM3的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的引物对、探针、以及引物对和探针的组合均可用于检测本申请的转化事件GHM3。
[0051] 在一些实施方案中，本申请还涉及核酸序列的片段，其是指完整部分中的不完整的更小片段的部分。例如，SEQ ID NO：1的片段包括SEQ ID NO：1的完整序列的至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、或至少约50个核苷酸的序列或更多。
[0052] 在一些实施方案中，可以对本申请的核酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照双子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用双子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请还涉及核酸序列的变体。一般来讲，特定核酸片段的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、
80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。
80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。
[0054] 在具体实施方案中，本申请所提供的用于检测转化事件GHM3的DNA探针，包括包含SEQ ID NO：1的足够长度的连续核苷酸的序列或其完全互补序列，该DNA探针在严格杂交条件下与包含上游插入位点或下游插入位点的核苷酸序列杂交并且在严格杂交条件下不与不含上游插入位点或下游插入位点的核苷酸序列杂交。
[0055] 在具体实例中，本申请所提供的探针包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸或第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。如本文所用，“引物”是分离的多核苷酸，其通过核酸杂交形成引物和靶DNA链之间的杂交体而与互补靶DNA链退火，然后凭借例如DNA聚合酶沿着靶DNA链伸展。引物对涉及其靶多核苷酸扩增用途，例如通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法。
[0056] 在具体实施方案中，本申请所提供的用于检测转化事件GHM3的引物对包括第一DNA分子以及不同于第一DNA分子的第二DNA分子，其中所述第一DNA分子和第二DNA分子各自包含SEQ ID NO：1的足够长度的连续核苷酸的核苷酸序列或其完全互补序列，且其中所述第一DNA分子存在于SEQ ID NO：1的T-DNA插入物中和所述第二DNA分子存在于SEQ ID NO：1的侧翼序列中，当与来自转化事件GHM3的DNA在扩增反应中共同使用时，该DNA引物产生用于检测样品中转化事件GHM3 DNA的扩增子，且其中所述扩增子包含SEQ ID NO:1的第374-1036位核苷酸或第3657-4356位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。
[0057] 在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1的第374-1036位或第1-1036位核苷酸所示序列的引物对。
[0058] 在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位或第3657-4517位核苷酸所示序列的引物对。
[0059] 在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第374-1036位或第1-1036位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位或第3657-4517位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第374-1036位或第1-1036位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位或第3657-4517位核苷酸所示序列的反向引物。
[0060] 在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第374-1036位或第1-1036位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位或第512-4016位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第374-1036位或第1-1036位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位或第512-4016位核苷酸所示序列的反向引物。
[0061] 在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位或第512-4016位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位或第3657-4517位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位或第512-4016位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位或第3657-4517位核苷酸所示序列的反向引物。
[0062] 在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第374-1036位或第1-1036位核苷酸所示序列的引物对，ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3335-3722位或第512-4016位核苷酸所示序列的引物对，和iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3657-4356位或第3657-4517位核苷酸所示序列的引物对。
[0063] 在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列的引物对。
[0064] 在具体实例中，所述引物对为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列或其互补序列；或者SEQ ID No:12和SEQ ID No:13所示的核苷酸序列或其互补序列。
[0065] 设计和使用引物和探针的方法是本领域熟知的，例如在Joseph Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)和Current Protocols in Molecular Biology，Wiley-Blackwell中描述。
[0066] 如本文所用，“试剂盒”或“微阵列”是指用于生物样品中棉花转化事件GHM3的鉴定和/或检测目的的试剂组或芯片。为质量控制(例如种子批次的纯度)、植物材料中或包含植物材料或来源于植物材料的材料例如但不限于食品或饲料产品中事件GHM3的检测的目的，可以使用试剂盒或芯片，并且其组分可以具体地调整。
[0067] 在具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒或探针包括本申请所提供的任一种探针或任一种引物对。在另一具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒或探针包括本申请所提供的任一种探针或任一种引物对的组合。
[0068] 此外，本申请还提供了转基因棉花植物、后代、种子、植物细胞或植物部分及其制品，包括但不限于工业原料。这些植物、后代、种子、植物细胞、植物部分及其制品中均包含可检测的本申请所提供的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的核酸分子序列。
[0069] 进一步地，本申请还提供了对棉花进行育种的方法，包括以下步骤：1)获得包含本申请所提供的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的核酸分子序列的棉花；2)将步骤1)所获得的棉花通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地步骤3)，对步骤2)所获得的棉花植物进行抗线虫鉴定，并利用本申请所提供的探针、引物对、试剂盒或阵列来检测其中是否存在转化事件GHM3。
[0070] 此外，本申请提供了在田间控制或杀死线虫的方法。
[0071] 在具体实施方案中，本申请所提供的控制或杀死线虫的方法，包括向所述线虫喂食有效量的转化事件GHM3的棉花植物。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。
[0072] 若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0073] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0074] 以下实施例所涉及的棉花品种材料YZ-1因其较高的愈伤组织诱导能力而被广泛应用于棉花遗传转化，最初由华中农业大学张献龙老师提供，经中国种子集团自行繁种。
[0075] 实施例
[0076] 实施例1棉花转化事件GHM3的获得及分子检测
[0077] 1、基因优化
[0078] 利用Vector NTI软件对cystatin基因(Roderick,H.,Tripathi,L.,Babirye,A.,Wang,D.,Tripathi,J.,Urwin,P.E.&Atkinson,H.J.(2012)Generation of transgenic plantain(Musa spp.)with resistance to plant parasitic nematodes.Molecular Plant Pathology 13:842-851.)编码序列进行棉花密码子偏好性优化，并在5’端添加表达增强元件omega序列(Daniel R.Gallie.The 5-leader of tobacco mosaic virus promotes translation through enhanced recruitment of eIF4F.Nucleic Acids Res.2002Aug 1；30(15):3401–3411)和Kozak序列(Kozak M.Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.Cell.1986Jan 31；44(2):283-92.)，改造后的DNA序列命名为omegaMCYS，其序列如SEQ ID NO:1第3335-3722位核苷酸所示，其中，1-68bp为omega序列；69-76bp为Kozak序列；77-388bp为cystatin基因编码序列。
[0079] 2、载体构建
[0080] 人工合成omegaMCYS基因(5’端带有BamHI酶切位点，3’端带有SacI酶切位点)。
[0081] 使用限制性内切酶BamHI和SacI处理omegaMCYS片段和表达载体pBI121。将处理过的omegaMCYS片段插入载体pBI121(NCBI登录号:AF485783)BamHI和SacI位点之间，与载体上原有的CaMV 35s启动子和NOS终止子组成表达盒PCaMV35s-OmegaMCYS-Tnos，其序列如SEQ ID NO:1第2482-3991位核苷酸所示。
[0082] 使用限制性内切酶HindIII和EcoRII切下pBI121上的PCaMV35s-OmegaMCYS-Tnos表达盒，然后再插入pUC19(Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis.Norrander J,Kempe T,Messing
J.Gene.1983 Dec；26(1):101-6.10.1016/0378-1119(83)90040-9)多克隆位点，该载体命名为pZZ01108。
J.Gene.1983 Dec；26(1):101-6.10.1016/0378-1119(83)90040-9)多克隆位点，该载体命名为pZZ01108。
[0083] EcoRI单酶切处理pZZ01108；T4-DNA聚合酶补平酶切产生的粘末端，纯化回收；HindIII处理回收的线性质粒，获得PCaMV35s-OmegaMCYS-Tnos片段。
[0084] 使用限制性内切酶HindIII和PmeI处理pCambia3300载体，该载体带有P35S-NPTII-T35spolyA元件，切口处pCambia3300载体连入处理后的PCaMV35s-OmegaMCYS-Tnos片段，获得含有P35S-NPTII-T35spolyA和PCaMV35s-OmegaMCYS-Tnos两个表达元件的转化载体，命名为pZZ00074，该载体为本发明首次成功构建的，其结构示意图如图1所示。
[0085] 3、遗传转化
[0086] 将转化载体pZZ00068通过电击法转入农杆菌EHA105中，并利用农杆菌介导棉花遗传转化，具体操作如下。
[0087] 1)无菌苗的种植：
[0088] 棉花种子去壳后用75％的酒精灭菌30秒，然后用20％的漂白水溶液表面灭菌30分钟，然后用无菌水漂洗4-5次播种于菌苗培养基(1/2MS+1.5％葡萄糖+0.3％phytagel，PH值调至5.9)中，在28℃培养7天(或光照或黑暗或黑暗与光照交替)。
[0089] 2)农杆菌的准备：
[0091] 3)农杆菌菌液的活化：
[0092] 将扩繁的载体菌株用含有100μm AS的MGL液体培养基(5g胰化蛋白胨+5gNaCl+0.1MgSO4.7H2O+0.25gKH2PO4+5g甘露醇+1.16g甘氨酸钠，PH值调至5.9)活化，OD600＝0.3，活化好的菌液将用于下胚轴的侵染。
[0093] 4)农杆菌菌液的侵染：
[0094] 将去掉叶子和根部的棉花下胚轴切成0.5cm的小段，用活化好的农杆菌菌液浸染15分钟，吸干菌液后放入共培养基(共培养基：MS+B5+3％葡萄糖+0.3％phytagel胶+1mg/l IBA+0.5mg/l kinetin+1g/LMgCl2，PH值调至5.9)中于21℃暗培养2-3天。
[0095] 5)胚性愈伤的诱导及筛选：
[0096] 将共培养后的下胚轴转移到加有卡那霉素的筛选培养基(MS+B5+3％葡萄糖+0.3％phytagel胶+1mg/l IBA+0.5mg/l kinetin+1g/LMgCl2+(75/50mg/L)卡那霉素+
400mg/LCef，PH值调至5.9)中诱导胚性愈伤，于28℃光照培养筛选4-6个月，每2-4周更换培养基一次。
400mg/LCef，PH值调至5.9)中诱导胚性愈伤，于28℃光照培养筛选4-6个月，每2-4周更换培养基一次。
[0097] 6)分化与生根
[0098] 当出现胚性愈伤之后，将其转移到分化培养基(MS(无NH4NO3，KNO3加倍)+B5+3％葡萄糖+0.3％phytagel胶+0.5mg/l IBA+0.15mg/l kinetin+2.0g/l glutamine+1.0g/l asparagines，PH值调至5.9)中诱导胚性愈伤成苗，将成苗的植株转移到生根培养基(1/2MS+B5+1.5％葡萄糖+0.3％phytagel胶，PH值调至5.9)中，光照培养进行生根。
[0099] 7)移栽
[0100] 当生根培养基中的转基因植株生长到一定大小后移栽至小盆中生长，同时取样用于分子检测。
[0101] 4、分子鉴定
[0102] 对T0代转化苗，利用分子手段实现阳性检测、拷贝数检测和骨架检测。
[0103] 采用天根生化科技(北京)有限公司DNA secure Plant Kit(Cat.#DP320)对T0代128个棉花转化事件基因组进行DNA抽提，以SAD1为内参基因(Gossypium hirsutum cultivar TM-1chromosome 22,ASM98774v1(12841100-12841304))，进行qRT-PCR检测。
[0104] 各引物序列如下：
[0105]
[0106] PCR反应在ABI 7900上进行，实时PCR反应体系如下表所示，反应程序如下：95℃预变性10min；95℃变性10s；60℃复性与延伸55s，30个循环。
[0107]
[0108] 实时PCR反应完成后，根据仪器生成的内参基因和目标基因的平均Ct(扩增循环数)值，根据公式RQ＝2-ΔCt，计算对应样本的RQ值。
[0109] 因为内参基因SAD1为棉花单拷贝基因，所以可以推断，理论上当转化事件的RQ值为0.5左右时，该事件为单拷贝杂合；当RQ值接近1.0时，该事件为双拷贝纯合。因此我们可以根据RQ值，来推断出目的基因的拷贝数。对高世代的转化事件进行基因分型的方法同上。
[0110] 因为无骨架样品在整个扩增区间中无扩增曲线，即Ct值为35cycles，所以可以根据骨架元件ori的平均Ct值来筛选无骨架插入的转基因样品。
[0111] 分子检测结果显示，在128个转化事件中，有122个转入了含有omegaMCYS基因的外源片段。其中，转化事件GHM3的T0代转化苗外源基因omegaMCYS的RQ值为0.41，而野生型对照样品的RQ值为0，骨架元件Ori扩增的Ct值为35，因此该转化苗为阳性，低拷贝，无骨架的优质转化事件。
[0112] 5、Southern印迹检测
[0113] Southern杂交探针标记及杂交与显影采用Roche公司的DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I。具体实验方法如下：
[0114] 步骤1.CTAB法抽提转化植株总基因组DNA。
[0115] 取叶片0.5-1g，放入预冷的研钵中，加入液氮快速将叶片研磨成粉末，倒入2mL离心管中。加入700uL预热至65℃的1.5％CTAB提取液并摇匀，65℃水浴保温30-60min，期间摇动几次；室温冷却后，加入700μL氯仿，摇匀后，颠倒轻摇10min，室温下8000rpm离心10min；移上清至另一离心管，加入等体积的沉淀液(异丙醇)，-20℃下沉淀30分钟，室温下8000rpm离心10min；用700μL 75％乙醇漂洗2-3次，风干后溶于50μL TE中-20℃保存备用。
[0116] 步骤2.基因组DNA的酶切。
[0117] 选用限制性内切酶Hind III酶切总基因组DNA，酶切反应体系如下表，混匀后37℃酶切24h左右，酶切后先取少量进行预电泳检测酶切效果，然后用酶切好的总DNA在1％的琼脂糖凝胶中进行低电压(30-40V)电泳过夜，使DNA充分分开。
[0118]
[0119] 步骤3.转膜。
[0120] 将凝胶修整后切去右下角作为标记，浸泡在0.25mol/L HCl至溴酚蓝变黄，蒸馏水洗两次；碱变性液[1.5M NaCl，0.5M NaOH]中变性45min，去离子水漂洗；中和液[1M Tris-HCl(PH7.4)，1.5M NaCl]中漂洗30min，更换中和液漂洗15min；置于搭好的转膜台上，用10×SSC溶液作为转膜液，Hybond-N+尼龙膜漂洗于去离子水液面，直至完全湿润，浸入转移缓冲液中；用10×SSC溶液进行毛细管法转移16-20h，将胶上的DNA转移到尼龙膜上。转移结束后，将尼龙膜用2×SSC溶液简单漂洗后，紫外交联仪上交联1min后，室温晾干，用保鲜膜将膜包好，4℃下保存备用。
[0121] 步骤4.探针扩增与标记。
[0122] 探针扩增：以转化载体筛选标记NPT II基因设计探针，引物序列如SEQ ID No:8(5’-CCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCC-3’)和SEQ ID No:9(5’-TCTGATGCCGCCGTGTTCCG-3’)所示，探针长度为191bp，探针序列如SEQ ID No:1第1356-1546位核苷酸所示。
[0123] 探针标记：取1μg或者(10ng-3μg)回收的探针DNA，加灭菌ddH2O至16μl；PCR仪95℃，10分钟，迅速放冰上；加入4μl DIG-High Prime短暂离心；37℃PCR仪或水浴1h或者过夜；65℃，10分钟或者加入2μl 0.2mol/L EDTA(PH 8.0)以终止反应。
[0124] 步骤5.探针效率检测。
[0125] 将已完成标记的探针，稀释成8个浓度梯度；每个稀释度各取1μl点于尼龙膜上，120℃下烘30分钟；将膜放入杂交管，在杂交管中加入20ml马来酸，杂交炉里室温转动2分钟；倒掉马来酸，加入10ml 1×封闭液，室温转动30分钟；倒掉1×封闭液，加入10ml抗体溶液(Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments)，室温转动30分钟；倒掉抗体溶液，加入20ml洗涤液，室温转动15分钟；倒掉洗涤液，加入10ml检测缓冲液，室温转动2-5分钟；随后将膜用镊子轻轻取出，放入封口袋，在袋中加入2ml显影液(NBT/BCIP Stock Solution)，5-10分钟暗处显影，忌摇动。显色适时，将膜放于TE或ddH2O中浸泡冲洗。根据显色结果，确定标记探针上样量为40ug。
[0126] 步骤6.杂交。
[0127] 加热杂交液DIG Easy Hyb(10ml/100cm2)，在杂交炉中42℃下预杂交30分钟；95℃下变性探针(25ng/ml)，5分钟后置于冰上；将变性探针加入到预先加热的DIG Easy Hyb中(3.5ml/100cm2)，混匀；倒掉预杂交液，加入含有变性探针的杂交液；杂交炉中42℃下杂交14小时。
[0128] 步骤7.洗膜与显色。
[0129] 倒掉杂交液，然后用2×SSC，0.1％SDS室温下洗涤两次，每次5分钟；最后用0.5×SSC，0.1％SDS，65℃下洗涤两次，每次15分钟。显色方法同探针效率检测操作。
[0130] 理论上，HindIII酶切杂交获得的条带应该大于2Kb，实际获得的杂交条带大小为3Kb左右，符合预期，并且转化事件GHM3Southern印记杂交只有一条阳性带，因此可以确认该转化事件为单位点单拷贝插入(如图2所示)。由此，获得棉花单拷贝转化事件GHM3。
[0131] 实施例2棉花转化事件GHM3的繁育及田间表现
[0132] 1、转化事件田间繁育
[0133] 如实施例1所述，本实施例转化事件的受体材料为棉花品系YZ1，在获得T0代的转化事件(单拷贝插入且无载体骨架污染)后，以该转化事件为母本，连续自交3个世代获得纯合的转基因株系种子。期间，根据T0代分化苗qRT-PCR结果，实验方法同实施例1，选择RQ值小于1.2且无骨架元件插入的转基因株系，用于繁种。将种子发芽，得到T1代植株，取样提取T1代植株基因组DNA，进行qRT-PCR检测并选取T1代植株中RQ值接近1的株系，继续自交，直到性状不再分离；之后，将纯合种子种植，在苗期鉴定对棉花线虫的抗性，选取抗虫性好的株系继续繁种。
[0134] 也就是说，将棉花转化事件GHM3在温室大棚中连续繁育3代，针对每一世代都通过RT-PCT检测来确定棉花植株外源NPTII或omegaMCYS基因以及载体骨架片段存在与否，同时计算外源插入基因与棉花内参基因SAD1的RQ值，从而确定外源插入基因阳性且无骨架残留的转基因株系，并选择RQ值接近1的纯合株系。考察结果显示，转化事件GHM3连续3个世代的外源插入基因PCR结果均呈阳性，骨架片段PCR结果均呈阴性，且从T1代开始RQ值分别为1.2、1.09、0.95，均接近1。
[0135] 可见，棉花转化事件GHM3为单拷贝无骨架且遗传稳定的优质事件。
[0136] 2、转化事件田间表现
[0137] 步骤1.转化事件种质纯化考察。根据对每一世代转基因株系RT-PCR检测的结果，计算并记录转化事件外源插入基因的纯合情况，通过RQ值辅助选择优质无骨架的单拷贝纯合株系。
[0138] 步骤2.棉花线虫抗性鉴定。
[0139] 1)肾型肾状线虫的培养和分离。肾型肾状线虫采集于浙江杭州，在中国农科院植保所温室检测和纯化后，在大豆中黄13根系中大量培养，培养介质为沙土，培养条件为26℃，光照16h，黑暗8小时，保持土壤湿润。每周浇营养液1次，培养75d后，从收集大豆的根系，采用次氯酸钠法，从根系中分离肾型线虫的卵块。将收集的卵块放置于无菌水中，25℃孵化，收集孵化高峰前后3d的二龄幼虫(J2)在显微镜下定量至3000头/ml后，4℃保存，用于接种。
[0140] 2)棉花培养及接种。将棉花种植置于湿润的滤纸上，25℃黑暗条件下催芽。催芽后挑取比较健壮的种植与含有无菌沙土中花盆中，表面盖上一层无菌土后，置于25℃的培养室进行培养。14d后，将棉花植株移栽植至单个的花盆中。继续培养4d后，将收集的肾型肾状线虫接种至植株的根部，每株接种1.4ml线虫混合液(4000头)。接种后3d内采用喷壶每天喷洒少量无菌水保湿，4d后即可正常浇水管理。接种35d后检测根表面的雌虫数目。
[0141] 3)检测和统计。小心的将棉花从沙土中磕出来，在清水中轻轻摆动，洗去根表面的沙土，采用McCormick Schilling食品红进行染色后，在显微镜下观察和计数每棵植株的雌虫数目。目前，国内外暂无肾型肾状线虫抗性检测的统一标准，仅以统一雌虫指数分级标准作为参考。当供试品种雌虫平均数与对照比较存在显著差异时，计算雌虫减退率。
[0142] 线虫指数(Nematode Index)＝供试品种的平均雌虫量/对照的平均雌虫量×100％。
[0143] 雌虫减退率＝(供试品种的平均雌虫量-对照的平均雌虫量)/对照的平均雌虫量×100％
[0144] 棉花肾形肾状线虫活体接虫试验显示，棉花转化事件GHM3(GHM3，样本数为12)和野生型棉花(WT，样本数为13)的雌虫平均数分别为12和25.54，棉花转化事件GHM3的雌虫减退率均值为53％。方差分析发现，转化事件GHM3与WT之间在0.05水平有显著性差异(表1)。
[0145] 表1：棉花转化事件和对照材料根系上的雌虫统计结果
[0146]
[0147]
[0148] *：方差分析(p<0.05)
[0149] 实施例3棉花转化事件GHM3的左(5’)和右(3’)侧翼序列的分离
[0150] 一般而言，检测转基因植物的DNA引物序列和方法简单并且一致，这些检测方法通常集中在频繁使用的基因表达元件，如启动子、终止子和标记基因，因为对于许多转化载体而言，编码序列区是可互换的。因此，这些方法并不能用于区分仅编码序列不同的构建体，也不能用于区分不同的转化事件，特别是那些使用相同的转化载体产生的事件，除非与插入的异源DNA相邻的染色体DNA即“侧翼DNA”的序列已知。为此，本实施例通过“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)对棉花转化事件GHM3进行了全基因组重测序，进而精确定位到外源插入序列及其侧翼序列。
[0151] 测序委托苏州金唯智公司完成，测序深度为30X。参考基因组来源为：NCBI数据库(具体请参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝cotton)。将测序数据与参考基因组比对后，获得了棉花转化事件GHM3的5’和3’侧翼序列以及部分转化载体序列，共计4517bp，如SEQ ID NO:1所示，其中，1-511bp为5’侧翼序列(序列长511bp)；4017-4517bp为3’侧翼序列(序列长501bp)；中间第512-4016bp序列为外源插入T-DNA序列，长3505bp；与表达载体pZZ00074相比，插入的T-DNA序列右侧缺失了包括右边界在内的41bp碱基。NCBI数据库分析显示，该插入位点位于棉花第9号染色体的90496812处。进一步分析显示，插入位点位于功能基因LOC107955236下游4870bp处和功能基因LOC107955234上游4347bp处，推断对棉花功能基因无影响。
[0152] 实施例4棉花转化事件GHM3侧翼序列的应用
[0153] 利用棉花转化事的侧翼基因组序列和外源片段中的NPTII和MCYS序列设计3-5对引物，建立该转化事件及其衍生产品的定性PCR鉴定方法。
[0154] 依据转化事件GHM3外源片段整合位点5’端棉花基因组设计的上游引物(csp-6386)为5’-GATACGTTATTGATTGGGTTTCGAC-3’(SEQ ID No:10)，依据NPTII序列设计的下游引物(csp-6387)为5’-CGCTTTTCTGGATTCATCGA-3’(SEQ ID No:11)，理论扩增长度为663bp。
PCR反应程序为94℃5min(94℃30s，55℃30s，72℃1min)35个循环，72℃，7min。
PCR反应程序为94℃5min(94℃30s，55℃30s，72℃1min)35个循环，72℃，7min。
[0155] 依据转化事件GHM3外源片段整合位点3’端棉花基因组设计的下游引物(csp-6799)为5’-AAGCCATGGGAGAACTTCAAAGAGC-3’(SEQ ID No:12)，依据NPTII序列设计的上游引物(csp-6389)为5’-CAAAGGACGAGGACTTAATTGATTG-3’(SEQ ID No:13)，理论扩增长度为
701bp。PCR反应程序为95℃5min，(94℃30s，60℃30s，72℃1min)35个循环，72℃，7min。
701bp。PCR反应程序为95℃5min，(94℃30s，60℃30s，72℃1min)35个循环，72℃，7min。
[0156] 采用CTAB法提取转化事件GHM3的DNA样品，以水、非转基因植株DNA样品作为阴性对照，使用上述引物进行扩增。结果显示，阴性对照均无扩增条带，转化事件GHM3的DNA样品均有特异性目标片段扩增(如图3所示)。转化事件GHM3的DNA扩增序列分别有特异性663bp和701bp目的条带。
[0157] 本实施例表明，利用转化事件GHM3的5’和/或3’侧翼序列进行PCR检测，可以特异性地检测该转化事件及其制品。
[0158] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
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