在许多栽培芸苔(Brassica)的地区，根肿病是引起严重问题的 流行病(综述参见例如Dixon(1999)Grower 4月29日，28-29页)。 这种疾病是由单细胞生物体甘蓝根肿菌(Plasmodiophora brassicae) 引起的。这种疾病的症状包括最终腐烂的带有硬肿胀(棒状物)的根 畸形。这种疾病也引起了由于减少生长而引起的矮化，并且在水分胁 迫下观察到了叶片萎蔫。这种疾病的化学控制没有效果。因此，农作 物优良的遗传抗性对于保护其免受该疾病的侵害是重要的。
芸苔属(Brassica)包括几种商用目的物种，诸如芜菁(B.rapa) (大白菜(Chinese cabbage)，白菜(pak choi)，芜菁)，欧洲油 菜(B.napus)(油籽油菜，芜青甘蓝)，芥菜(B.juncea)(芥菜)， 黑芥(B.nigra)(黑芥)和甘蓝(B.oleracea)(花椰菜，嫩茎花 椰菜，卷心菜，抱子甘蓝，皱叶甘蓝，羽衣甘蓝，球茎甘蓝，羽衣甘 蓝和其它)。尽管芸苔属物种中的亚种通常是性亲和的，但是在芸苔 属不同物种之间不一定是这种情况。例如，芜菁(B.rapa)和甘蓝(B. oleracea)没有相同数量的染色体(10条染色体对9条染色体)，因 此不是性亲和的。这使得从一种芸苔物种到另一种芸苔物种的性状转 移特别困难。
已经描述了芸苔属中根肿病抗性的几种来源(参见，例如 Bradshaw等.(1997)Ann.Appl.Biol.130：337-348；Gowers(1982) Euphytica 31：971-976)。有些抗性是单基因的，有些是多基因的， 有些是显性的，有些是隐性的。已经描述了芜菁(B.rapa)和欧洲油 菜(B.napus)中的单基因显性抗性，诸如，例如芜菁(B.rapa)大 白菜中单基因显性抗性(Yoshikawa(1983)Japan Agricultural Research Quarterly，17卷，1期，6-11页)。尽管小数量的根肿病 株系(“品种”)能破坏这种抗性，但是已经证明具有这种抗性的大 白菜F1杂种具有抗根肿病的优良保护。这种品种看起来在亚洲比在欧 洲更普遍。
相反，在芸苔物种甘蓝(B.oleracea)中只描述了多基因、隐 性抗性来源(参见，例如Voorrips(1995)Euphytica 83：139-146)。 证明这种来源不仅不充分地抗根肿病，而且它们在商品甘蓝(B. oleracea)系之间的转移也是非常困难的。这使得抗性育种成为困难 和费时的任务。
因此，需要具有对根肿病改进抗性的甘蓝(B.oleracea)植物， 其中该抗性也容易育种并且转移到商业甘蓝(B.oleracea)系，这种 需要还未实现。

因此，本发明致力于解决甘蓝(B.oleracea)中根肿病的不满 意抗性问题。为了获得甘蓝(B.oleracea)中对该疾病改进的抗性， 本发明公开了根肿病单基因显性抗性从大白菜(芜菁(B.rapa))到 甘蓝(B.oleracea)嫩茎花椰菜的转移，然后再转移到其它甘蓝(B. oleracea)，诸如白球甘蓝(white cabbage)，花椰菜和抱子甘蓝。 为了克服芜菁(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)之间的性不亲和性， 通过利用胚拯救技术的种间杂交，接着通过重复回交和在所有回交代 中检测疾病的方法转移根肿病抗性。在所得到的甘蓝(B.oleracea) 植物中获得了高水平的根肿病抗性。该抗性是稳定的，并且可以传递 到以后的世代和转移到易感性或弱抗性的甘蓝(B.oleracea)植物。
因此，本发明公开了抗根肿病的甘蓝(B.oleracea)植物，其 中根肿病抗性是单基因和显性的，包括所述植物的种子和材料及其后 代。本发明也公开了产生抗根肿病的甘蓝(B.oleracea)植物方法， 转移根肿病抗性到易感或弱抗性的甘蓝(B.oleracea)植物的方法。 本发明也公开了与根肿病抗性连锁的分子标记。
本发明特别优于甘蓝(B.oleracea)中已存在的根肿病抗性， 因为本发明抗性容易在甘蓝(B.oleracea)植物和商品系之间转移。 由于抗性植物不发生疾病，所以获得高的产量。而且当栽培本发明的 甘蓝(B.oleracea)植物时，很少需要或者根本不需要农作物保护化 学药剂。
因此，本发明公开了：
抗根肿病，更具体地抗由病原体甘蓝根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起的根肿病的甘蓝(B.oleracea)植物。在本发明具 体实施方式中，根肿病抗性是单基因和显性的。优选地，在具有1-9 等级的疾病检测中，优选地诸如实施例2中所述的，甘蓝(B.oleracea) 植物的等级为水平2或以下。优选地，在具有1-9等级的疾病检测中， 优选地诸如实施例2中所述的，甘蓝(B.oleracea)植物的等级为水 平1。优选地，在具有0-5等级的疾病检测中，优选地诸如实施例2 中所述的，甘蓝(B.oleracea)植物的等级为水平1或以下。优选地， 在具有0-5等级的疾病检测中，优选地诸如实施例2中所述的，甘蓝 (B.oleracea)植物的等级为水平0。在另一个优选的实施方式中， 甘蓝(B.oleracea)植物抗根毛感染。在另一个优选的实施方式中， 甘蓝植物是嫩茎花椰菜(broccoli)，白球甘蓝(white cabbage)、 花椰菜、抱子甘蓝、羽衣甘蓝(Borecole)、皱叶甘蓝(Savoy)或红 球甘蓝(red cabbage)。在另一个优选的实施方式中，甘蓝(B. oleracea)植物对根肿病抗性是纯和或杂合的。在另一个优选的实施 方式中，根肿病抗性与分子标记遗传连锁。优选地，可以通过PCR获 得分子标记。优选地，该抗性在所述分子标记的10cM内，优选地小于 6cM内，优选地小于5cM内，更优选地小于3cM内，甚至更优选地小 于1.5cM内。在另一个优选的实施方式中，根肿病抗性与可利用引物 020(SEQ ID NO：1)或引物Y13(SEQ ID NO：2)，通过PCR扩增获 得的分子标记连锁。在另一个优选的实施方式中，可以从根肿病抗性 芜菁(B.rapa)植物，优选地从大白菜F1杂种Parkin获得抗性。在 另一个优选的实施方式中，可以从保藏在NCIMB，保藏号NCIMB41134 的品系CFL667获得本发明根肿病抗性。在另一个优选的实施方式中， 抗性来源于或获自品系CFL667，或者来源于包含所述抗性的品系 CFL667的后代或祖先。在另一个优选的实施方式中，该植物是近交系 或杂种。在另一个优选的实施方式中，该植物是双单倍体。然而，在 另一个优选的实施方式中，该植物是细胞质雄性不育(CMS)。
在另一个优选的实施方式中，本发明公开了包含赋予根肿病抗性 的基因座的甘蓝(B.oleracea)植物。优选地，该基因座位于利用引 物020(SEQ ID NO：1)或引物Y13(SEQ ID NO：2)，通过PCR扩增 可获得的分子标记的10厘摩(cM)内，优选地所述分子标记的6cM 内，优选地5cM内，更优选地3cM内，甚至更优选地1.5cM内。在另 一个优选的实施方式中，抗性位于对应于保藏在NCIMB，保藏号 NCIMB41134的品系CFL667中所包含基因座的基因座，并且优选地与 品系CFL667中存在的抗性共分离。在另一个优选的实施方式中，赋予 根肿病抗性的基因座可以从保藏在NCIMB，保藏号NCIMB41134的品系 CFL667获得，或者从包含所述抗性的品系CFL667后代或祖先获得。 在另一个优选的实施方式中，抗性基因座来源于或获自品系CFL667， 或者来源于包含所述抗性的品系CFL667的后代。
本发明进一步公开了：
上述公开植物的种子，包括其后代，其中所述种子或后代包含本 发明抗性。
上述公开植物的果实。上述公开植物的部分，包括所述植物的花 粉、胚珠和胚。
本发明还公开了：
包含根肿病抗性的甘蓝(B.oleracea)植物，其中当所述植物 对所述抗性是纯合的，并且对所述抗性是纯合的所述植物与对根肿病 单基因和显性抗性是纯合的“检测者”植物杂交时，从所述杂交产生 的第一代子代植物显示1∶0的根肿病抗性分离。在优选的实施方式中， 当所述第一代子代的所述植物自花授粉时，所获得的第二代子代植物 显示1∶0的根肿病抗性分离。在优选的实施方式中，“检测者”植物 是来源于保藏在NCIMB，保藏号NCIMB41134的品系CFL667并且包含 所述品系CFL667中所含有的根肿病单基因和显性抗性的植物，或者是 包含所述品系CFL667中所含有的根肿病单基因和显性抗性的所述品 系CFL667的子代或祖先。在优选的实施方式中，“检测者”植物通过 细胞融合来源于品系CFL667的植物，或者来源于品系CFL667的子代 植物。在另一个优选的实施方式中，“检测者”植物是雄性不育的。
包含根肿病抗性的甘蓝(B.oleracea)植物，其中当所述植物 对所述抗性是杂合的，并且对所述抗性是杂合的所述植物与对根肿病 单基因和显性抗性是杂合的“检测者”植物杂交时，从所述杂交产生 的第一代子代植物显示3∶1的根肿病抗性分离。在优选的实施方式中， 当所述第一代子代的所述植物进一步与对所述抗性是杂合的所述植物 杂交时，所获得的第二代子代植物显示5∶1的根肿病抗性分离。在进 一步的优选的实施方式中，“检测者”植物是保藏在NCIMB，保藏号 NCIMB41134的品系CFL667的植物，或者是包含所述品系CFL667中所 含有的根肿病单基因和显性抗性的所述品系CFL667的子代或祖先，或 者是来源于保藏在NCIMB，保藏号NCIMB41134的品系CFL667并且包 含所述品系CFL667中所含有的根肿病单基因和显性抗性的植物。在另 一个优选的实施方式中，当计算各个植物的子代时，根据第一代后代 中每种植物的遗传状态(分别是杂合，纯合抗性或纯合易感性)，所 获得的第二代子代显示3∶1，1∶0或1∶1的抗性分离比率。
在另一个优选的实施方式中，所述根肿病抗性是单基因的，优选 地单基因和显性的。在优选的实施方式中，甘蓝(B.oleracea)植物 对该抗性是纯合的。在另一个优选的实施方式中，甘蓝(B.oleracea) 植物对该抗性是杂合的。
本发明进一步公开了：
上述公开植物的种子，包括其后代，其中所述种子或后代包含本 发明的抗性。
上述公开植物的果实。上述公开的植物部分，包括所述植物的花 粉、胚珠和胚。
本发明进一步公开了：
本发明根肿病单基因和显性抗性赋予甘蓝(B.oleracea)植物 对该疾病抗性的用途。优选地，所述抗性可以获自芜菁(B.rapa)植 物，优选地获自大白菜F1杂种Parkin。
本发明进一步公开了：
产生包含根肿病单基因和显性抗性的甘蓝(B.oleracea)植物 的方法，该方法包括步骤：a)获得抗根肿病的芜菁(B.rapa)植物； b)杂交所述芜菁(B.rapa)植物和甘蓝(B.oleracea)植物；c) 拯救从步骤b)的杂交所获得的胚；d)从步骤c)的胚再生植物；e) 筛选步骤d)抗根肿病的植物；f)回交从步骤e)所获得的植物和甘 蓝(B.oleracea)植物。在优选的实施方式中，该方法进一步包括渐 渗该抗性到原种(elite)甘蓝(B.oleracea)近交系中。在另一优 选的实施方式中，该方法进一步包括杂交所述近交系和另一种甘蓝(B. oleracea)近交系以产生杂种。
本发明进一步公开了：
通过上述公开方法可以获得的甘蓝(B.oleracea)植物，包括 杂种植物。
本发明进一步公开了：
转移根肿病单基因和显性抗性给对这种疾病敏感或弱抗这种疾 病的甘蓝(B.oleracea)植物的方法，该方法包括步骤：a)获得包 含根肿病单基因和显性抗性的甘蓝(B.oleracea)植物；b)杂交步 骤a)的所述甘蓝(B.oleracea)植物和对根肿病敏感或弱抗根肿病 的甘蓝(B.olera cea)植物；c)选择来自步骤b)的杂交的抗根肿 病植物。在优选的实施方式中，该方法进一步包括回交所述抗性到对 根肿病敏感或弱抗根肿病的甘蓝(B.oleracea)植物中。在优选的实 施方式中，在具有1-9等级的该疾病检测中，对该疾病敏感或有弱抗 性的甘蓝(B.oleracea)植物的等级为4或以上，优选地3或以上的 水平，或者在具有0-5等级的该疾病检测中，对该疾病敏感或有弱抗 性的甘蓝(B.oleracea)植物的等级为3或以上，优选地2或以上的 水平。
本发明进一步公开了：
从芸苔属基因组扩增的DNA片段，其中所述DNA片段长度大约是 400bp，并且包含SEQ ID NO：1。
从芸苔属基因组扩增的DNA片段，其中所述DNA片段长度大约是 640bp，并且包含SEQ ID NO：2。
在优选的实施方式中，上述公开的DNA片段表明芸苔属植物中根肿 病显性和单基因抗性的存在。
上述公开的DNA片段用于鉴定抗根肿病芸苔属植物的用途。
引物020(SEQ ID NO：1)检测芸苔属基因组中约400bp的DNA片 段的用途。
引物Y13(SEQ ID NO：2)检测芸苔属基因组中约640bp的DNA片 段的用途。
引物020或Y13鉴定抗根肿病芸苔属植物的用途。
在优选的实施方式中，芸苔属植物是甘蓝(B.oleracea)。
一种用于检测甘蓝(B.oleracea)植物中根肿病单基因和显性 抗性的试剂盒，该试剂盒包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所 述寡核苷酸。
本发明进一步公开了：
转移根肿病单基因和显性抗性给对这种疾病敏感或弱抗这种疾 病的甘蓝(B.oleracea)植物的方法，该方法包括步骤：a)获得包 含根肿病单基因和显性抗性的甘蓝(B.oleracea)植物；b)杂交步 骤a)的所述甘蓝(B.oleracea)植物和对根肿病敏感或弱抗根肿病 的甘蓝(B.olera cea)植物；c)选择包含可通过PCR扩增获得和与 抗性共分离的DNA片段的植物。优选地，利用引物020(SEQ ID NO： 1)或引物Y13(SEQ ID NO：2)，通过PCR扩增可获得该DNA片段。 优选地，步骤c)的所述植物抗根肿病。在优选的实施方式中，该方 法进一步包括回交所述抗性到对根肿病敏感或弱抗根肿病的所述甘蓝 (B.oleracea)植物中。
本发明进一步公开了：
鉴定抗根肿病的甘蓝(B.oleracea)植物的方法，该方法包括 步骤：a)从甘蓝(B.oleracea)植物获得样品；b)检测所述样品中 利用引物020(SEQ ID NO：1)或引物Y13(SEQ ID NO：2)，通过 PCR扩增可以获得的DNA片段，其中步骤b)的所述甘蓝(B.oleracea) 植物抗根肿病。
本发明进一步公开了：
从甘蓝(B.oleracea)植物群体中选择抗根肿病甘蓝(B. oleracea)植物的方法，该方法包括步骤：a)提供甘蓝(B.oleracea) 植物群体；b)获得所述群体植物的样品；c)检测所述样品中利用引 物020(SEQ ID NO：1)或引物Y13(SEQ ID NO：2)，通过PCR扩 增可以获得的DNA片段，其中步骤b)的所述甘蓝(B.oleracea)植 物抗根肿病。
定义
性状：特征或表型，例如对疾病的抗性。性状可以通过显性或隐性 方式遗传，或者其可以是单基因或多基因的。例如，性状是对疾病诸 如根肿病的抗性。
抗性：不显示疾病症状或显示不明显疾病症状的植物特征或表型。 因此，优选地抗性是：植物减少病原体发展的能力。(参见，例如 Robinson，R.A.，1969：Review Applied Mycology 48，593-606)。
单基因的：由单基因座所确定的。
多基因的：由一个以上基因座所确定的。
显性的：当以杂合或纯合状态存在时，决定表型。
隐性的：只有以纯合状态存在时才会显示的。
基因座：染色体上的区域，其包含一个或多个遗传因子，例如，一 个或多个基因，有贡献于性状诸如对疾病抗性性状。
遗传连锁：由于它们在相同染色体上的位置，染色体区域一起遗传 的倾向。通过基因座之间重组百分数测定(厘摩，cM)。
基因纯化的：除非由于异源DNA序列的存在或缺少而可能不同外， 遗传上相同的植物。
标记辅助选择：指通过检测来源于植物的一种或多种核酸，在一种 或多种植物中选择期望的一种或多种性状的过程，其中该核酸与期望 的性状相关。
双单倍体：(例如，通过花药培养或小孢子培养)，基因组单倍体 (单染色体)状态的加倍，产生完整纯合植物。
“检测者”植物：用于遗传表征待检测植物中性状的植物。通常地， 待检测植物与“检测者”植物杂交，并且计算杂交子代中性状的分离 比率。
本发明公开了抗根肿病，更具体地抗由病原体甘蓝根肿菌 (Plasmodiophora brassicae)引起的的根肿病的甘蓝(B.oleracea) 植物。特别地，本发明公开了甘蓝(B.oleracea)植物，其包含所述 疾病的单基因、显性抗性。当与甘蓝(B.oleracea)中已存在的抗性 比较，这种抗性提供了对疾病改进的抵抗，并且可以容易地在甘蓝(B. oleracea)植物之间转移。
例如，在P.H.Williams(Screening Crucifers for multiple disease resistance，Workshop 1981，Un.Wisconsin-Madison)中 描述了芸苔属物种和亚种，并且在Song，KM等.TAG 75，1988，784-794； TAG 76，1988，593-600和TAG79，1990，497-506(3篇论文系列)中 进一步遗传分析了芸苔属物种和亚种。
在优选的实施方式中，例如，本发明的甘蓝(B.oleracea)植物 是：
Brassica oleracea L.(甘蓝作物)
●var.acephala DC.(羽衣甘蓝)
●var.albiflora Sun[＝B.alboglabra](芥蓝)
●var.alboglabra[＝B.alboglabra](芥蓝)
●var.botrytis L.(花椰菜，heading broccoli)
●var.capitata L.(甘蓝)
●var.chinensis Prain(缅甸野油菜(burma sarson))
●var.fimbriata Mill.(烹调用羽衣甘蓝(kitchen kale))
●var.fruticosa Metz.(thousand-head kale(千头羽衣甘蓝))
●var.gemmifera DC.(抱子甘蓝)
●var.gongylodes L.(球茎甘蓝(kohl rabi))
●var.italica Plenck.(嫩茎花椰菜，花茎甘蓝)
●var.sabauda L.(皱叶甘蓝(savoy cabbage))
●var.sa bellica(羽衣甘蓝(collards))
●var.tronchuda L.H.Bailey(tronchuda cabbage)
●var.costata(Portugese cabbage)
●var.medullosa(marrow stem kale)
●var.pamifolia(羽衣甘蓝，Jersey kale)
●var.ramona(千头羽衣甘蓝)
●var.selensia(羽衣甘蓝(borecole))
本发明优选的甘蓝(B.oleracea)植物是白球甘蓝，花椰菜， 抱子甘蓝和嫩茎花椰菜。
根据本发明，根肿病单基因显性抗性从大白菜(B.rapa)转移到 嫩茎花椰菜(B.oleracea)。在做为雌性亲本的嫩茎花椰菜(B. oieracea var.italica)和做为雄性亲本的芜菁(B.rapa)之间进 行种间杂交。选定嫩茎花椰菜近交系做为雌性以阻止杂交终产物中不 同来源的细胞细胞器。种间杂交的雄性亲本是来源于日本，商品名称 为“Parkin”(Takii Seeds，Japan)的抗根肿病大白菜F1杂种。 每次杂交或回交后，计数所获得植物的染色体以评估植物的倍性水平 和趋向获得甘蓝(B.oleracea)染色体组的进展。根据Chiang等(1979) Euphytica 28：41-45的方法进行染色体计数。用Partec CA II (Partech，UK)进行流式细胞仪工作。
通过胚拯救(embryo rescue)获得由杂交产生的F1杂种。因为 芜菁(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)没有相同数量的染色体，并 且因此不是性亲和的，所以必需使用胚拯救。胚拯救可以克服胚乳降 解问题。使用Harbert等(Euphytica 18(1969)425-429页)所述胚 拯救技术。将授粉后10-12天龄的灭菌胚珠切成两半，并且引入到恒 定运动中所保持的培养基。培养基基本是含有8％蔗糖和400ppm酪蛋 白水解物的White氏培养基。从胚珠洗掉胚，并且在液体培养基中培 养。
抗根肿病的F1植物与嫩茎花椰菜杂交(即，回交)。也需要上 述胚拯救以获得由第一次回交产生的植物(即，BC1植物)。
抗根肿病的BC1植物再次与嫩茎花椰菜回交。通过正常的结籽获 得3株抗根肿病的BC2植物。植物进一步与嫩茎花椰菜回交，并且由 第四次回交产生的植物(BC4)被用做其它甘蓝(B.oleracea)农作 物抗性的来源。
实施例1中描述了引起根肿病抗性转移到甘蓝(B.oleracea) 的详细试验方法。实施例2中描述了用于检测抗性存在的疾病检测。 实施例3中示出了证明根肿病抗性的田间试验结果。
包含本发明根肿病单基因显性抗性的代表性甘蓝(B.oleracea) 品系，品系CFL667在2002年6月28日保藏在NCIMB，Aberdeen AB2 1RY，Scotland，UK，保藏号是NCIMB 41134。品系CFL667植物是细 胞质雄性不育系，并且对所述抗性是杂合的。
因此，本发明的根肿病抗性可以从保藏在NCIMB，保藏号是NCIMB 41134的品系CFL667获得。
在本发明优选的实施方式中，抗根肿病的甘蓝(B.oleracea) 植物定义为在这里实施例2的0-5等级中评估为0或1等级的植物， 或者定义为在这里实施例2的1-9等级中评估为1或2等级的植物。
利用芸苔属领域中熟知的标准育种技术，将根肿病抗性转移到其 它甘蓝(B.oleracea)，特别是白球甘蓝，花椰菜和抱子甘蓝。该性 状也进一步渐渗到到甘蓝(B.oleracea)原种系中。例如，通过轮回 选择育种，例如通过回交实现抗性渐渗到原种系中。在这种情况下， 原种系(回归亲本)首先与带有抗性的供体近交系(非回归亲本)杂 交。然后，该杂交的子代与回归亲本回交，接着在所得到的子代中选 择根肿病抗性。用根肿病抗性选择，与回归亲本回交3个，优选地4 个，更优选地5个或以上世代后，子代对包含抗性的基因座是杂合的， 但是大多数或几乎所有其它基因都类似回归亲本(参见，例如 Poehlman & Sleper(1995)Breeding Field crops，第4版，172-175； Fehr(1987)Principles of Cultivar Development，1卷：Theory and Technique，360-376，这里将这篇文献并入为参考文献)。每次杂交后 进行根肿病抗性选择。在优选的实施方式中，因此，本发明包括转移 根肿病显性和单基因抗性到对该疾病敏感或弱抗该疾病的甘蓝(B. oleracea)植物中的方法，该方法包括下面步骤：杂交第一种甘蓝(B. oleracea)植物和第二种甘蓝(B.oleracea)植物，其中第一种植物 包含根肿病显性和单基因抗性，选择由杂交获得的抗根肿病植物。例 如，在具有1-9等级的该疾病检测中，对该疾病敏感或弱抗该疾病的 甘蓝(B.oleracea)植物等级为4或以上，优选地3或以上水平，或 者在具有0-5等级的疾病检测中，对该疾病敏感或弱抗该疾病的甘蓝 (B.oleracea)植物的等级为3或以上，优选地2或以上水平。该方 法进一步包括回交上述选择的植物和第二种甘蓝(B.oleracea)植物， 直到该抗性转移到第二种甘蓝(B.oleracea)植物中。
优选地，根肿病抗性被转移到甘蓝(B.oleracea)商品系。例 如，这种品系是近交系。做为可替代的方案，商品系是通过杂交两种 近交系获得的杂种。在这种情况下，根肿病抗性可以存在于亲本近交 系之一或两种亲本近交系中。因此，在优选的实施方式中，本发明公 开了包含根肿病单基因显性抗性的甘蓝(B.oleracea)近交系或杂种 系，包括所述近交系或杂种的种子和材料及其子代。优选地，抗性可 获自芜菁(B.rapa)，优选地获自大白菜F1杂种“Parkin”。在另 一个优选的实施方式中，本发明的根肿病抗性存在于保藏在NCIMB， 保藏号是NC IMB 41134的品系CFL 667中。
在另一个优选的实施方式中，本发明抗根肿病的甘蓝(B. oleracea)植物是雄性不育的。因为正常花自花授粉，所以在甘蓝(B. oleracea)杂种种子育种中雄性不育具有价值。雄性不育系不产生能 生育的花粉，并且不能自花授粉。通过消除杂交中一种亲本品种的花 粉，植物育种者确保获得均一质量的杂种种子。特别有利的雄性不育 系统是细胞质雄性不育(CMS)。芸苔属中这种CMS的例子是最初在萝 卜中发现的Ogura CMS(参见，例如Ogura(1968)Mem.Fac.Agric. Kagoshima Univ.6：39-78；Makaroff(1989)Journal of Biol.Chem. 264：11706-11713；US 5,254,802)。因此，本发明公开了雄性不 育，特别是包含根肿病单基因显性抗性的CMS甘蓝(B.oleracea)植 物，包括所述植物的种子和材料及其子代。优选地，抗性可获自芜菁 (B.rapa)，优选地获自大白菜F1杂种“Parkin”。优选地，CMS 来源于Ogura基因组。
可以通过本领域熟知的方法恢复雄性不育植物的雄性能育性。优 选地，通过细胞融合恢复CMS植物，特别是CMS甘蓝(B.oleracea) 植物的雄性可育性。为此，CMS植物细胞与雄性能育植物细胞融合以 在能育细胞质背景中，用不育植物的核置换能育植物的核，恢复能育 性。细胞融合技术是本领域熟知的，并且例如，如Sigareva和Earle (1997)Theor.Appl.Genet.94：213-320中描述了该技术。利用该 技术，再生雄性能育植物，并且允许自花授粉或与另一种植物杂交。
性状，特别是具有可计分表型诸如对疾病抗性的性状可以通过杂 交在遗传学上被追踪，并且在从杂交获得的子代中可以计分性状的分 离。例如，这可以确定一种性状是显性还是隐性的。例如，这也允许 检测性状的遗传因子是在相同基因座(例如相同基因或不同基因，相 同等位基因或不同等位基因)还是在不同的连锁或未连锁基因座。
例如，当对性状是纯合的植物与对具有相同表型的显性性状是纯 合的“检测者”植物杂交时，杂交子代不分离性状表型(1∶0比率)。 当该性状的遗传因子在相同基因座或在不同基因座时，计分该1∶0比 率。当上述杂交的第一代子代植物自花授粉时，对于基于位于待检测 植物和“检测者”植物相同基因座的遗传因子的显性性状，观察到1∶0 比率。相反，对基于位于待检测植物和“检测者”植物不同、非连锁 基因座的遗传因子的显性性状，观察到15∶1比率。如果遗传因子在不 同基因座，但遗传连锁，该比率通常在1∶0和15∶1之间。
在另一个例子中，当对显性性状是杂合的待检测植物与对具有相 同表型的显性性状也是杂合的“检测者”植物杂交时，杂交子代3∶1 分离抗性表型。该性状遗传因子在相同基因座或在不同基因座时，计 分该3∶1比率。当上述杂交的第一代子代植物本身与“检测者”系植 物或者再次与对该性状是杂合的待检测植物杂交时，对基于位于相同 基因座的遗传因子的显性性状，观察到3∶1比率，而对基于位于不同 非连锁基因座的遗传因子的显性性状，观察到23∶9的比率。如果两种 遗传因子在不同但是遗传连锁的基因座，该比率通常在这两种比率之 间。
在另一个优选的实施方式中，单独分析各个植物的第二代子代。 在这种情况下，对于相同基因座的遗传因子，当与杂合植物杂交时， 在第二代中后代植物50％再次3∶1分离，25％以1∶0分离和25％以 1∶1分离。在第二代中，对于在待检测植物中的不连锁遗传因子，50 ％后代植物再次以3∶1分离，25％以7∶1分离和25％以1∶1分离(在 第二代中没有固定抗性的植物)。
如果性状是对疾病的抗性，并且该疾病检测引起了敏感植物的死 亡或者阻止了敏感植物开花，由于敏感性第一代子代植物子代的死亡 和缺少，在第二代子代中会计分不同的分离比率。例如，在这种情况 下，分别观察到的不是上述3∶1和23∶9的比率，而是5∶1和19∶5的 比率。如果单独计分各个植物，第二代子代对于在相同基因座的遗传 因子是2/33∶1和1/31∶0，对于在不同基因座的遗传因子是2/33∶1 和1/37∶1。
可以使用其它杂交策略，例如使用其它纯合或杂合植物联合，或 者不包含该性状的植物。然后计分子代中性状的分离。这些杂交策略 和它们相应的分离比率是本领域技术人员熟知的，本领域技术人员也 知道如何获得和使用适合的“检测者”植物，和如何解释从这种杂交 获得的分离比率。在另一个优选的实施方式中，上述示例的杂交方案 应用于本发明上下文中的根肿病抗性。因此，在另一个优选的实施方 式中，本发明公开了对根肿病抗性是纯合或杂合的甘蓝(B.oleracea) 植物，其中当所述根肿病抗性在待检测植物中是纯合的，并且所述待 检测植物与对根肿病抗性是纯合的“检测者”植物杂交时，所述杂交 的第一代子代显示1∶0的根肿病抗性分离比率。例如，用于这种杂交 的“检测者”植物是来源于保藏在NCIMB，保藏号是NCIMB 41134的 品系CFL667和包含本发明抗性的植物。在优选的实施方式中，“检测 者”植物通过细胞融合，来源于品系CFL667植物或者来源于品系 CFL667中植物后代。包含本发明抗性的其它雄性能育植物也可以用做 “检测者”植物。在优选的实施方式中，当第一代子代植物被允许自 花授粉时，所获得的第二代子代显示了1∶0的抗性分离比率。在另一 个优选的实施方式中，当第一代子代植物被允许自花授粉时，所获得 的第二代子代显示了15∶1的抗性分离比率。然而，在另一个优选的实 施方式中，自花授粉后，在第二代子代中计分到1∶0和15∶1之间的分 离比率。因此，根据分离比率，确定待检测植物抗性和“检测者”植 物抗性是否位于相同基因座或者不同的、连锁或不连锁的基因座。
在另一个优选的实施方式中，本发明公开了对根肿病抗性是纯合 或杂合的甘蓝(B.oleracea)植物，其中当所述根肿病抗性在待检测 植物中是杂合的，并且所述待检测植物与对根肿病抗性是杂合的“检 测者”植物杂交时，所述杂交的第一代子代显示3∶1的根肿病抗性分 离比率。例如，用于这种杂交的“检测者”植物是保藏在NCIMB，保 藏号是NCIMB 41134的品系CFL667的植物，或者是包含本发明抗性的 品系CFL667子代植物。包含本发明抗性的任何其它植物也可以用做 “检测者”植物。在另一个优选的实施方式中，当第一代子代植物进 一步与对抗性是杂合的待检测植物杂交时，预期所获得的第二代子代 显示3∶1的抗性分离比率。然而，因为敏感植物一般不能经受根肿病 抗性疾病检测而存活，或者在这种检测后阻止了开花，第二代子代产 生了5∶1分离比率。在另一个优选的实施方式中，当第一代子代植物 进一步与“检测者”系植物杂交时，预期所获得的第二代子代显示23∶9 的抗性分离比率，而一般产生19∶5的分离比率。然而，在另一个优选 的实施方式中，在第二代子代中计录5∶1和19∶5之间的分离比率。当 分别计分各个植物的子代时，观察到了上述比率。因此，根据分离比 率，确定待检测植物抗性和“检测者”植物抗性是位于相同基因座还 是不同的、连锁或不连锁的基因座。
在另一个优选的实施方式中，本发明公开了分子标记，其与单基 因显性根肿病抗性连锁。这种分子标记允许在抗性和敏感植物之间在 分子水平进行区分，因此表明芸苔属植物，优选地甘蓝(B.oleracea) 植物中单基因和显性抗性。这些分子标记是基于抗性和敏感植物之间 的遗传多态性，并且位于抗性基因座或紧靠其附近。例如，分子标记 用于育种和获得抗性植物，以跟踪育种期间抗性的存在，或者控制商 品种子批中抗性的存在。
因此，在优选的实施方式中，本发明提供了作图芸苔属植物，优 选地甘蓝(B.oleracea)植物中根肿病抗性的方法，确定抗性是否存 在于芸苔属植物，优选地甘蓝(B.oleracea)植物中的方法，和转移 抗性到敏感或弱抗性芸苔属植物，优选地甘蓝(B.oleracea)植物的 方法。例如，在育种新抗性植物或品系或者控制种子批次质量中使用 该方法。这里所公开的分子标记允许抗性品系更快地投放市场和商业 种子批次更好的质量控制。因此，可以避免疾病测定，并且通过分子 标记的使用置换疾病测定。
在产生商业品种的各种步骤中，诸如育种程序中和种子生产过程 中，本发明的分子标记和方法特别有益。例如，本发明可用于渐渗抗 性到甘蓝(B.oleracea)植物，例如原种近交系中。通过用分子标记 测试由每次杂交产生的种子或植物进行根肿病抗性选择。在优选的实 施方式中，因此，本发明包括转移根肿病显性和单基因抗性到对该疾 病敏感或弱耐受该疾病的甘蓝(B.oleracea)植物中的方法，该方法 包括步骤：杂交抗病的第一种植物和敏感或弱抗病的第二种植物，收 获由杂交获得的种子，获得种子或由其生长的植物样品的，在所述样 品中检测本发明分子标记，所述分子标记的存在表明所述种子或植物 中疾病的抗性，选择所述标记存在阳性的植物，其中所述植物优选地 抗病。优选地，然后，该抗性进一步回交到敏感或弱抗性植物中。
在稳定的均一近交系或栽培品种(有时也称为品种)的生产中也 可以方便地使用本发明的分子标记，由此，自花授粉特定的品系直到 达到满意的品系纯度和同质性。相似地，本发明用于特定品系或栽培 品种种子的商业生产。每次杂交后，这里本发明的方法再次地应用于 由杂交产生的种子，并且只选择抗性植物。在优选的实施方式中，因 此本发明的方法包括产生抗根肿病种子或植物的方法，该方法包括下 面步骤：杂交抗性植物和其本身，收获由杂交产生的种子，获得种子 或从其生长的植物的样品，检测所述样品中本发明的分子标记，所述 分子标记的存在表明所述种子或植物中疾病的抗性。
相似地，本发明用在杂种种子生产中。在这种情况下，本发明用 于确保田地中发芽和生长的所有杂种种子都是抗病的。优选地，本发 明的分子标记也用在质量保证中以确保疾病抗性存在于杂种种子中。 在优选的实施方式中，因此，本发明包括产生种子的方法，该方法包 括下面的步骤：杂交第一种植物和第二种植物，其中这两种植物之一 抗根肿病，收获由杂交产生的种子，获得种子或从其生长的植物的样 品，检测所述样品中本发明的分子标记，所述分子标记的存在表明所 述种子或植物中疾病的抗性。因此，本发明为商业育种和种子生产方 法提供了重要的进步。
在优选的实施方式中，本发明的分子标记位于距根肿病抗性基因 座的10厘摩(cM)内，优选地距根肿病抗性基因座的6cM内，优选地 5cM内，更优选地3cM内，甚至更优选地1.5cM内，因此紧密地与抗 性共分离。
本发明上下文中优选的多态性包括例如，单序列重复(SSR，参 见，例如Hearne等.(1992)Trends Genet 8：288-294)，单核苷 酸多态性(SNP，Botstein B等.(1980)Am J Hum Genet 32：314-331)， 和任何其它类型DNA重排，诸如缺失，扩增，交换。本领域熟知的多 态性检测方法可以应用在本发明上下文中以产生连锁抗性的分子标 记。优选的方法包括基于PCR扩增技术例如SSR技术和RAPDs技术的 方法(Williams等.(1990)Nucl Acids Res 18：6531-6535)。一 般地，PCR优选的核苷酸长度约是8到50nt，更优选地长度是10到 30nt。优选地，包含含有本发明多态性的位点的PCR扩增的DNA片段 长度是约100-3,000nt，更优选地长度是约200到2,000nt，甚至更优 选地长度是约300到1,000nt。可以用于本发明的筛选或检测多态性 的其它方法包括核酸的直接测序，单链多肽性测定，连接酶链式反应， 酶促切割和Southern杂交。
可替代的方法包括利用称为“CAMPS”，即“切割扩增修饰多态 性序列”的方法，也称为dCAPS的方法(Neff等，1998.Plant J.14： 387-392；Michaels and Amasino，1998.Plant J 14：381-385)， 检测切割扩增多肽性序列(CAPS；Konieczny等，The Plant Journal 4 (2)：403-410，1993)和检测单核苷酸多态性(SNPs)的几种方法。在 CAPS方法中，利用位于限制位点侧翼的引物，扩增含有多态性限制位 点的核酸。用对应于多态性限制位点的限制内切核酸酶消化所得到的 PCR产物，并且通过凝胶电泳分析所消化的产物。
Southern杂交也是鉴定序列中差异的有效方法，尤其是利用RFLP (限制性片段长度多态性)技术(Botstein B等.(1980)Am J Hum Genet 32：314-331)。
在优选的实施方式中，本发明公开了利用RAPDs技术获得的紧密 连锁根肿病抗性的分子标记(参见这里的实施例4)。
下面的实施例的目的是提供本发明应用的示例。下面实施例的目 的不是完全定义或以其它方式限定本发明的范围。
这里所引用的所有参考文献在该申请中整体并入为参考文献。
实施例
实施例1：转移抗性至甘蓝(B.oleracea)
F1
进行抗根肿病大白菜(Chinese cabbage)F1杂种Parkin和嫩茎 花椰菜(broccoli)(B.oleracea)之间的几百次杂交。从这些杂交， 拯救胚(Harbert等，Euphytica 18(1969)425-429页)。这些胚中的 4个胚发育成植物，证明其中两株植物是抗病的。这两株抗病植物有 19条染色体。表型是大白菜和嫩茎花椰菜之间的杂种。
BC1
再次进行胚拯救以获得BCl植物。嫩茎花椰菜近交系用做回交亲 本。嫩茎花椰菜系也用做随后代的回交亲本。上述两株F1植物中只有 一株植物应答并且5个胚发育成植物。其中4个抗根肿病。
BC1植物表型更接近嫩茎花椰菜回交亲本。因为BC1植物中芜菁 (B.rapa)基因组染色体分配是随机的，所以该植物含有甘蓝(B. oleracea)的18条染色体和芜菁(B.rapa)的0-10条染色体。因此， 观察到了具有18-28条染色体的植物。
BC2
通过BC1植物的种子结实获得BC2植物。证明来源于来自上述 BC1、命名为植物B的植物种子结实的9株植物抗根肿病。用流式细胞 仪测定染色体数和与正常DNA含量的偏差。在此程序中进一步使用3 株植物，B23，B27和B28。
BC3和BC4
BC3和BC4也通过种子结实获得。在BC2中已经是二倍体的植物 B27已经掺入了显性根肿病抗性基因。回交代BC3和BC4显示了预期 的1∶1分离。
如后面世代所示，该抗性也已经渐渗到植物B23和B28中。
田间试验
用来源于B27的BC3苗期试验的抗性植物进行初步田间试验。在 德国Kleve我们的试验站，在严重受侵染的田间种植植物。当成熟时 挖出所有植物时，所有这些植物都是健康的并且没有显示症状。 转移给其它甘蓝(B.oleracea)
抗性B27用做嫩茎花椰菜、花椰菜、甘蓝(cabbage)和抱子甘蓝 回交程序的根肿病抗性来源，产生了例如实施例3中所公开的抗性品 种。
实施例2：疾病检测
在PH＜6，含有2∶1比例沙子和泥炭土混合物的多用花盆 (multipot)中播种一周后移植幼苗。移植后1天，将1ml 1.106 cysts (孢囊)/ml的溶液注射到花盆中。该溶液是具有ECD编号16/3/30， 16/23/30，16/3/14和16/7/30的根肿病来源的混合物(Buczacki等， 1975：Trans.Br.Mycol.Soc.65，295-303)。最初两周保持土壤湿 润，此后土壤可以干燥一点。温室中培养温度是18-20℃。移植后4-5 周，将根洗干净，并且对疾病计分。
做为可替代的方案，在标准沙子：泥炭土混合物(2∶1 EGO，pH5-6， 每个多用花盆中1颗种子)中多用花盆盘中直接播种种子。正常地， 检测20-30株植物/品系。播种后大约7-10天，接种植物，第一次接 种后2-5天后是第二次接种。如果怀疑种子发芽不好，在黑色碟子中 成排地进行播种，并且在7-10天后将植物移植到多用花盆。培育温度 是22-22℃。
标准接种物是分离菌9(在德国，从感染田间分离的侵袭性分离 菌)。从贮藏在-20℃冰箱中塑料袋中的感染根制备接种物。将根转移 到混合器(1份根，5份水)ca.2分钟。然后，用粗棉布过滤小颗粒， 并且计算孢囊数(圆形，浅色(少许蓝色))。在植物基部，用Eppendorf 移液管向植物基部茎/根添加1ml 0.5-1×107孢囊/ml。需要有规律地 振荡接种物以在悬浮液中均匀地混合可用的孢囊。
根据试验的大小，需要存在足够的对照。敏感性对照是例如：White Rock(花椰菜)，Maximus或其它F1(孢子甘蓝)，Marathon(白球 甘蓝)。可以添加做为抗性对照的Parkin或Storkin(大白菜)。因 为如果接种成功，Hopkin(敏感性大白菜)在早期产生征兆，因此也 可以添加它。
在试验期间，植物需要保持足够的湿润。有规律的施肥是必需的， 但是植物不要过分生长。温度是22-20℃(白天/夜晚)，16小时光照。 接种后4(夏季)-6(冬季)周后，可以从土壤拔出植物，冲洗和计 分症状。
例如，疾病检测的观察等级是：
0＝无棒状物(clubs)，健康的根系统；
1＝侧根上1-2个小棒状物，有时根显现一些变褐；
2＝侧根上几个小棒状物，有时主根有些增粗；
3＝主根最大部分地增粗；
4＝主根严重增粗，并且与棒状侧根合生，还存在一些正常的根；
5＝一块根，不存在正常根；
然后，得分是0的植物(有时也是1，取决于温室检测的严重度 和所涉及的遗传学)从温室转移到感染根肿病的田间(例如，在 Enkhuizen的De Wit田间)。正常地，从温室逃逸的植物在田间严重 感染，并且容易观察到(矮化的生长)。然而，这些只是非常稀少的 植物。
例如，另一种疾病检测的观察等级是：
1＝无可见的生长菌瘿的根；
2＝侧根上单个菌瘿(gall)；
3＝侧根上几个小菌瘿(植物健康)；
4＝直根轻微的菌瘿生长，侧根上几个小菌瘿；
5＝直根中度的菌瘿生长，侧根上许多小或几个大菌瘿；
6＝直根几个菌瘿生长，侧根上许多大菌瘿；
7＝严重菌瘿化，保留了几个健康的根；
8＝严重菌瘿化，几乎没有健康根存在；
9＝严重菌瘿化，没有健康根存在。
实施例3：田间试验的结果
表1
在澳大利亚的Victoria，Werribee进行田间试验。在2002年1 月，将植物移植到感染根肿病的土壤。移植后6周后的评估已经显示 了(表1)与敏感品种(White Rock和Triumphant)和用不同数量杀 真菌剂(歇利防霉剂(Shirlane))和增加生石灰(增加pH，对根肿病 严重性具有降低作用，例如Dixon&Page，1998，Acta Horticul turae， 459，343-349)处理的敏感品种(Triumphant)比较，本发明抗根肿病 花椰菜杂种(F308和F311)的作用。在下面试验中使用具有1-9分级 的上述观察等级。
处理                                        花椰菜
                                            根得分
                                            0-9等级
1.生石灰(Quicklime)(2.5t/ha)                4.11
2.歇利防霉剂(Shirlan)(3L/ha)                2.33
3.歇利防霉剂(3L/ha)+生石灰(2.5t/ha)         2.22
4.歇利防霉剂(Shirlan)(2L/ha)                3.00
5.对照-Triumphant                           5.06
6.F308                                      1.00
7.F311                                      1.00
8.White Rock                                5.11
表2
使用来源于澳大利亚3个不同地点(Cora Lyn，Werribee和 Trentham)的分离菌对花椰菜幼年植物检测的结果。用与上述类似的方 法接种该分离菌。White Rock是敏感对照，E70是根据本发明的抗性 杂种花椰菜。在下面试验中使用了具有1-9分级的上述观察等级。
                            处理平均数
               Cora Lyn       Werribee       Trentham
White Rock     8.2            8.7            3.9
E70            1              1              1
表3
两年中，在自然感染根肿病的欧洲不同地点进行的田间试验的结 果。D249，D506，E245，E246是本发明抗性花椰菜杂种。White Rock 是敏感花椰菜品种，SPR666和A876是本发明抗性抱子甘蓝 (B.sprouts)杂种，Romulus和Maximus是敏感抱子甘蓝品种，F1182、 F1187是本发明抗性白球甘蓝杂种，Marathon是敏感白球甘蓝品种。 在生长季最后，以0-5个等级(参见上述)进行评估(di05)。  记录号 类型 地点  年份  di05  D249 花椰菜 Hannover  2000  0.0  D506 花椰菜 Hannover  2000  0.0  White Rock 花椰菜 Hannover  2000  1.8  D249 花椰菜 Halsall-UK  2000  0.0  White Rock 花椰菜 Halsall-UK  2000  4.3  SPR666 抱子甘蓝 Halsall-UK  2000  0.0  Romulus 抱子甘蓝 Halsall-UK  2000  4.5  SPR666 抱子甘蓝 Roeselaere-比 利时  2000  0.0  Romulus 抱子甘蓝 Roeselaere-比 利时  2000  3.3  A876 抱子甘蓝 Halsall-UK  2001  0.0  Maximus 抱子甘蓝 Halsall-UK  2001  4.5  E245 花椰菜 Halsail-UK  2001  0.0  White Rock 花椰菜 Halsall-UK  2001  4.6  Fl187 白球甘蓝 Halsall-UK  2001  0.0  Marathon 白球甘蓝 Halsall-UK  2001  3.5  E246 花椰菜 Hannover  2001  0.0  White Rock 花椰菜 Hannover  2001  1.9  F1182 白球甘蓝 Hannover  2001  0.0  Marathon 白球甘蓝 Hannover  2001  3.6
实施例4：分子标记
利用两种白球甘蓝种群(D1544和D1545)开发了与抗性连锁的 RAPDs标记。分别地用引物020和Y13获得两种分子标记，产生紧密 连锁根肿病抗性的PCR扩增产物。种群D1544中，020和Y13是94.6 ％(56中的53)与疾病检测结果(抗性或敏感)相关，表明5.4cM 的连锁距离。对于种群D1555，020是100％与疾病检测相关，而Y13 是95.7％(47中的45)与疾病检测相关，表明020和抗性之间的紧 密连锁(0cM)及Y13和抗性之间的4.3cM。当在140株植物的双单倍 体白球甘蓝种群中检测该RAPDs时，020显示了100％(0cM)，Y13 显示了98.6％(1.4cM)与疾病检测结果的相关性。
引物020(5′-ACA CAC GCT G-3′)产生了大约400bp的特异性片段。 引物Y13(5′-GGG TCT CGG T-3′)产生了大约640bp的特异性片段。 下面描述了扩增条件。PCR后，25μl DNA在1.8％琼脂糖凝胶上电泳。 -DNA                      ：μl(从标准小量制备来的稀释的DNA) -引物(10μM)              ：1.0μl -dNTP(2.5mM)              ：2.0μl -Platinum Taq缓冲液       ：2.5μl(200mM Tris-HCl pH8.4，500mM 10×                                                     KCl减去MgCl2) -MgCl2(50mM)              ：0.75μl -Platinum                 ：0.2μl(5U/μl) Taq(BRL/life) -无菌水                   ：μl(取决于所用DNA多少)                             25μl终体积
PCR程序
3′94℃
-Ramp 0：00 94℃    0.10 
-Ramp 0：00 36℃    0.30   1个循环，PCR循环(Perkin Elmer 9600)
-Ramp 0：45 72℃    1.05 
  3′94℃
-Ramp 0：00 94℃    0.10   40个循环，PCR循环(Perkin Elmer 9600)
 Ramp 0：00 36℃    0.30 
-Ramp 0：45 72℃    1.05 
-5′72℃
                            序列表
<110>Syngenta Participations AG
<120>疾病抗性芸苔
<130>70059WO_PCT
<140>
<141>
<150>GB 0217406.8
<151>2002-07-26
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>1
acacacgctg                                                    10
<210>2
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>2
gggtctcggt                                                    10
PCT/RO/134表
关于保藏的微生物的说明
(PCT实施细则第13条之二) A.以下所作的说明涉及说明书第 11页第 17-19行所指的微生物。 B.保藏物标识                       更多的保藏物标识见附页□ 保藏单位名称： 国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB) 保藏单位地址(包括邮政编码和国家)： Aberdeen，AB2 1RY，Scotland，UK(英国) 保藏日期：2002年6月28日 保藏编号：NCIMB 41134 C.其它说明(如果不适用则留空)        该信息续在附页上□ D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国) E.单独提交的说明(如果不适用则留空) 以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)     本栏由受理局填写 □本页和国际申请一起收到 授权官员     本栏由国际局填写 □国际局于以下日期收到本页：     年  月  日 授权官员 PCT/RO/134表