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对昆虫害虫具有抗性的植物

阅读:300发布:2022-12-14

专利汇可以提供对昆虫害虫具有抗性的植物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及使用干扰核糖核酸(RNA)分子对昆虫 害虫 物种的侵扰进行的遗传控制,特别是对 植物 害虫侵扰的 预防 和/或控制。本发明提供了(i)表达或能够表达本发明的干扰RNA并且(ii)对昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的转基因植物。,下面是对昆虫害虫具有抗性的植物专利的具体信息内容。

1.一种转基因植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达至少一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被一种昆虫害虫物种摄入后起到下调所述害虫内的一种靶基因的表达的作用,
其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链包含与该靶基因内的一个靶核苷酸序列至少部分地互补的一个核苷酸序列或由其组成,并且
其中该靶基因
(i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、160、161、262到265、163、
162、164、266到 269、165、167、166、270 到273、168、170、169、274 到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到
325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、
302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到
253、156、157、254到 257、158、159、258 到 261、160、161、262到 265、163、162、164、266 到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
(ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到
58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到 265、163、
162、164、266到 269、165、167、166、270 到 273、168、170、169、274到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
(iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到
58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到 281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到
297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、
27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、
143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、
131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、134、
222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、
250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、
314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%一致,或
(iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、
180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、
139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、
15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、
24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、
298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214 到217、124、
133、218到 221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226到 229、127、148、136、230 到
233、128、149、184、137、185、234到 237、302 到305、129、138、238 到 241、150、151、242 到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、
63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到 221、146、125、134、222到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、
158、159、258到 261、160、161、262 到265、163、162、164、266 到 269、165、167、166、270 到
273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、
203、306到309、318到321、386、387、388、389所表示的序列中的任一个至少75%一致,或(v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%一致。
2.如权利要求1所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中该RNA的沉默元件包含与该靶基因内的一个靶核苷酸序列互补或至少部分地互补的一个至少21个连续核苷酸的序列或由其组成。
3.如权利要求1或权利要求2所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中该RNA包含至少两个沉默元件,其中每一个沉默元件包含与一种靶基因内的一个靶核苷酸序列至少部分地互补的一个核苷酸序列或由其组成。
4.如权利要求3所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中这些沉默元件各自包含与一个不同的靶核苷酸序列互补的一个不同的核苷酸序列或由其组成。
5.如权利要求4所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中这些不同的靶核苷酸序列来源于单一靶基因或不同的靶基因。
6.如权利要求5所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中这些不同的靶基因来源于相同的昆虫害虫物种或来源于不同的昆虫害虫物种。
7.如权利要求1到6中任一项所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中该昆虫害虫物种选自属于以下目的昆虫物种:鞘翅目、半翅目、鳞翅目、双翅目、网翅目、直翅目以及蚤目。
8.如权利要求7所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中该昆虫害虫物种选自下组,该组由以下各项组成:铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫))。
9.如权利要求1到8中任一项所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中该靶基因编码选自下组的一种昆虫蛋白质,该组包括(i)来自肌蛋白/肌丝复合物的一种蛋白质,该复合物选自下组,该组包括肌钙蛋白I(例如CG7178 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、支持蛋白(例如CG7107 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、原肌球蛋白1蛋白(例如CG4898 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、原肌球蛋白2蛋白(例如CG4843 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、肌球蛋白重链(例如CG17927 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、肌球蛋白轻链细胞质蛋白(例如CG3201 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、鱼翅瓜蛋白(例如CG3595 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、拉链蛋白(例如CG15792 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、肌钙蛋白C(例如CG2981、CG7930、CG9073、CG6514、CG12408、CG9073、CG7930、CG2981、CG12408或CG6514 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物);(ii)选自下组的一种昆虫核糖体蛋白,该组包括核糖体蛋白S3A(例如CG2168 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白LP1(例如CG4087 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S3(例如CG6779 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L10Ab(例如CG7283 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S18(例如CG8900 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L4(例如CG5502 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S27(例如CG10423 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L6(例如CG11522 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S13(例如CG13389 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)以及核糖体蛋白L12(例如CG3195 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L26(例如CG6846 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L21(例如CG12775 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S12(例如CG11271 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S28b(例如CG2998 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L13(例如CG4651 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L10(例如CG17521 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L5(例如CG17489 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S15Aa(例如CG2033 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L19(例如CG2746 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L27(例如CG4759 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物);(iii)线粒体细胞色素c化酶亚单位II蛋白(例如CG34069 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物);(iv)ATP合酶-γ链(例如CG7610 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物);(v)泛素-5E(例如CG32744 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物);(vi)蛋白酶体β型亚单位(例如CG17331 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物);(vii)作为CG13704 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物的蛋白质;以及(viii)Rpn12蛋白(例如CG4157 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)。
10.如权利要求9所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中与暴露于一种靶向非必需基因的干扰RNA或一种不下调该害虫物种内的任何基因的干扰RNA的害虫物种相比,该害虫靶基因表达的下调引起该害虫的生长、发育、生殖或存活下降。
11.如权利要求1到10中任一项所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材
料、或培养的转基因植物细胞,其中该转基因植物、由其得到的材料或植物细胞另外地包含一种异源基因。
12.如权利要求11所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中该异源基因编码对一种植物害虫物种有毒的一种蛋白质。
13.如权利要求12所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中该蛋白质选自下组,该组由以下各项组成:一种马铃薯茎特异蛋白、一种苏金芽孢杆菌杀虫蛋白、一种致病杆菌杀虫蛋白、一种光杆状菌杀虫蛋白、一种侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白以及一种球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
14.如权利要求13所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养
的转基因植物细胞,其中所述苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自下组,该组由以下各项组成:
Cry1、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白TIC810或TIC812的组合、以及二元杀虫蛋白PS149B1。
15.如权利要求11所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中该异源基因编码一种赋予除草剂耐受性的蛋白质。
16.如权利要求15所述的转基因植物、用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,其中该蛋白质选自一种草甘膦不敏感型式的5-烯醇丙酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS);能够分解麦草畏的一种分解代谢酶,如麦草畏单加氧酶;或能够使草铵膦分解代谢的一种草丁膦乙酰转移酶基因。
17.由如权利要求1到16中任一项所述的转基因植物产生的种子
18.一种用于产生对昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的转基因植物的方法,包括:
(a)用包含编码一种干扰核糖核酸(RNA)的一种多核苷酸序列的一种DNA构建体转化
植物细胞,该干扰核糖核酸在被一种昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫物种中的一种靶基因的表达的作用,
其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链包含与该靶基因内的一个靶核苷酸序列至少部分地互补的一个核苷酸序列或由其组成,并且
其中该靶基因
(i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、160、161、262到 265、163、
162、164、266到 269、165、167、166、270 到273、168、170、169、274 到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到
325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、
302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到
253、156、157、254到 257、158、159、258 到 261、160、161、262到 265、163、162、164、266 到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
(ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到
58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到 277、172、173、278到 281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、160、161、262到265、163、
162、164、266 到269、165、167、166、270 到 273、168、170、169、274到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
(iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到
58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到 221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到
297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、
27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、
143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、
131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、134、
222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、
250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、
314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%一致,或
(iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、
180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、
139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、
15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、
24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、
298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到 217、124、
133、218到 221、146、125、134、222 到225、147、126、135、226 到 229、127、148、136、230 到
233、128、149、184、137、185、234到 237、302 到305、129、138、238 到 241、150、151、242 到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、
63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、
158、159、258到 261、160、161、262 到265、163、162、164、266 到 269、165、167、166、270到
273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、
203、306到309、318到321、386、387、388、389所表示的序列中的任一个至少75%一致,或(v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到 221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%一致;
(b)从该转化的植物细胞再生一种植物;并且
(c)在适合从该DNA构建体表达该干扰RNA的条件下使该转化的植物生长,因此与一种未转化的植物相比,所述植物对所述害虫具有抗性。
19.如权利要求18所述的方法,其中该转基因植物是如权利要求1到16中任一项所定
义的。
20.如权利要求18或权利要求19所述的方法,其中该方法另外地包括以下步骤:从该转化的植物产生一个或多个子代并且测试该后代对该昆虫害虫的抗性。
21.一种用于产生对昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的转基因植物的方法,包括:
(i)使通过如权利要求18或权利要求19所述的方法获得的一种转基因植物与一种第
二植物杂交,
(ii)选择对所述害虫具有抗性的后代。
22.如权利要求21所述的方法,另外包括以下步骤:使对一种昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的后代植物与该第二植物回交,并且进一步选择对所述害虫具有抗性的后代。
23.一种产生对昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的转基因植物的方法,包括:
(i)使通过如权利要求18或权利要求19所述的方法获得的一种转基因植物与缺乏对
昆虫侵扰的抗性的一种第二植物有性杂交,从而产生多株后代植物;
(ii)选择对所述昆虫害虫物种具有抗性的一种第一后代植物;
(iii)使所述第一后代植物自交,从而产生多株第二后代植物;
(iv)使所述后代重复自交1、2、3、4、或5代以上;并且
(v)从这些后代植物的任一个中选择对一种昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的一种植
物。
24.如权利要求21到23中任一项所述的方法,其中该抗昆虫的后代是通过检测一种
编码干扰核糖核酸(RNA)的多核苷酸序列或一种干扰RNA的存在而被鉴定的,其中该干扰RNA在被一种昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫物种中的一种靶基因的表达的作用,其中该靶基因
(i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到 265、163、
162、164、266到 269、165、167、166、270 到273、168、170、169、274 到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到
325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、
302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到
253、156、157、254到 257、158、159、258 到 261、160、161、262到 265、163、162、164、266 到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
(ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到
58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到 277、172、173、278到 281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、160、161、262到265、163、
162、164、266 到269、165、167、166、270 到 273、168、170、169、274到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
(iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到
58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到 221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到
297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、
27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、
143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、
131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、134、
222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、
250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、
314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%一致,或
(iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、
180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、
139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、
15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、
24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、
298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到 217、124、
133、218到 221、146、125、134、222 到225、147、126、135、226 到 229、127、148、136、230 到
233、128、149、184、137、185、234到 237、302 到305、129、138、238 到 241、150、151、242 到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、
63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、
158、159、258到 261、160、161、262 到265、163、162、164、266 到 269、165、167、166、270到
273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、
203、306到309、318到321、386、387、388、389所表示的序列中的任一个至少75%一致,或(v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到 221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%一致。
25.如权利要求21到24中任一项所述的方法,其中该第二植物另外地包含一种异源基因。
26.如权利要求25所述的方法,其中该异源基因编码对一种植物害虫物种有毒的一种蛋白质。
27.如权利要求26所述的方法,其中该蛋白质选自下组,该组由以下各项组成:一种马铃薯块茎特异蛋白、一种苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、一种致病杆菌杀虫蛋白、一种光杆状菌杀虫蛋白、一种侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白以及一种球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
28.如权利要求27所述的方法,其中苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自下组,该组由以下各项组成:Cry1、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100和TIC101、杀虫蛋白ET29或ET37与杀虫蛋白TIC810或TIC812的组合、以及二元杀虫蛋白PS149B1。
29.如权利要求25所述的方法,其中该异源基因编码一种赋予除草剂耐受性的蛋白
质。
30.根据权利要求18到29中任一项所述的方法,其中对昆虫害虫的侵扰具有抗性的该植物选自花、马铃薯、稻、卡诺拉、向日葵、高粱、珍珠粟、玉米、草莓、大豆、苜蓿、番茄、茄子、胡椒以及烟草
31.一种通过如权利要求18到30中任一项所述的方法产生的转基因植物。
32.由如权利要求31所述的植物产生的种子。
33.通过使第一近交植物与第二不同近交植物杂交所产生的杂交种子,其中这些近交植物的至少之一是如权利要求31所述的转基因植物,并且其中该植物选自棉花、马铃薯、水稻、卡诺拉、向日葵、高粱、珍珠粟、玉米、草莓、大豆、苜蓿、番茄、茄子、胡椒以及烟草。
34.一种用于产生如权利要求33所述的杂交种子的方法,其中杂交包括以下步骤:
(i)种植第一和第二近交植物的种子;
(ii)将所述第一和第二近交植物的种子培养成开花植物;
(iii)防止该第一或该第二近交植物的至少之一的自花授粉
(iv)允许该第一近交植物与该第二近交植物之间发生异花授粉;并且
(v)在该第一或该第二近交植物的至少之一上收获种子,所述种子由所述异花授粉产生。
35.一种用于预防和/或控制作物植物田地中的昆虫害虫侵扰的方法,所述方法包括
在所述植物中表达一种有效量的一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被一种昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫物种中的一种靶基因的表达的作用,
其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链包含与该靶基因内的一个靶核苷酸序列至少部分地互补的一个核苷酸序列或由其组成,并且
其中该靶基因
(i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、
162、164、266到 269、165、167、166、270 到 273、168、170、169、274到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到
325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、
302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到
253、156、157、254到 257、158、159、258 到 261、160、161、262到 265、163、162、164、266 到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
(ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到
58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到 221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、
162、164、266到 269、165、167、166、270 到 273、168、170、169、274到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到 265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
(iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到
58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到 221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到
297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、
27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、
143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、
131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、134、
222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、
250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、
314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%一致,或
(iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、
180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、
139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、
15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、
24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、
298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214 到217、124、
133、218到 221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226到 229、127、148、136、230 到
233、128、149、184、137、185、234到 237、302 到305、129、138、238 到 241、150、151、242 到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、
63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到 221、146、125、134、222到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、
158、159、258到 261、160、161、262 到265、163、162、164、266 到 269、165、167、166、270 到
273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、
203、306到309、318到321、386、387、388、389所表示的序列中的任一个至少75%一致,或(v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%一致。
36.一种选自下组的分离的多核苷酸,该组由以下各项组成:
(i)包含如由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、
294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、129、
138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到 317、402、186、
202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个所表示的一种核苷酸序列的至少21个连续核苷酸的一种多核苷酸,或
(ii)包含如SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、
141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、
19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75 到78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、129、
138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250 到253、156、157、
254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266 到269、165、167、
166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到 281、200、201、314到 317、402、
186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个中所表示的一种核苷酸序列的至少21个连续核苷酸的一种多核苷酸,由此使得当最佳地比对并且比较两种序列时,所述多核苷酸与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到
325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、
302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到
253、156、157、254到 257、158、159、258 到 261、160、161、262到 265、163、162、164、266 到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
(iii)包含如SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、
294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210 到213、
290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222 到225、147、126、
135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、
129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250 到253、156、
157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266 到269、165、
167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到 281、200、201、314到317、
402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个中所表示的一种核苷酸序列的至少21个连续核苷酸的片段的一种多核苷酸,并且其中所述片段或所述互补序列具有一种核苷酸序列,当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、
5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、
204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到
301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、
149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242 到245、152、
153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、
173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318 到321、386、
387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、
3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、
14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、
67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、
286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到
217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、
230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%一致,或(iv)编码一种氨基酸序列的一种多核苷酸,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列
时,该氨基酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、
294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、129、
138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314 到317、402、186、
202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%一致,
并且
其中所述多核苷酸不长于10000个核苷酸。
37.如权利要求36所述的多核苷酸,该多核苷酸被包含在一种DNA构建体中。
38.如权利要求37所述的DNA构建体,该DNA构建体是一种表达构建体,其中该多核苷酸序列被可操作地连接到至少一个能够驱动该多核苷酸序列的表达的调控序列
39.一种宿主细胞,包含如权利要求36所述的多核苷酸或如权利要求37或38所述的
DNA构建体。
40.如权利要求39所述的宿主细胞,其中该宿主细胞是一种原核细胞或一种真核细
胞。
41.如权利要求40所述的宿主细胞,其中该宿主细胞是一种细菌细胞或一种植物细
胞。
42.如权利要求1到16中任一项所述的转基因植物,如权利要求17或权利要求32所
述的种子,如权利要求18到30或34到35中任一项所述的方法,如权利要求33所述的杂交种子,如权利要求36或权利要求37所述的分离的多核苷酸,如权利要求38所述的DNA构建体,或如权利要求39到41中任一项所述的宿主细胞,其中该靶基因
(i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到
209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、
136、230到233或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、
2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到 313、401、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、
90%、95%、98%或99%一致,或
(ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、
206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、
132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226 到229、
127、148、136、230到233或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO
1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、
142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、
210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、
147、126、135、226到229、127、148、136、230到233中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、
206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、
132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226 到229、
127、148、136、230到233或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、
286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到
217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、
230到233中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到
313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、
180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310 到313、401、121、142、176、
182、130、177、183、206到 209、286 到 289、298到 301、145、122、144、178、131、179、210 到
213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222 到225、147、
126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、
282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214 到217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
(v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、
95%、98%或99%一致。
43.如权利要求1到16中任一项所述的转基因植物,如权利要求17或权利要求32所
述的种子,如权利要求18到30或34到35中任一项所述的方法,如权利要求33所述的杂交种子,如权利要求36或权利要求37所述的分离的多核苷酸,如权利要求38所述的DNA构建体,或如权利要求39到41中任一项所述的宿主细胞,其中该靶基因
(i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、
152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、160、
161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到
269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、
90%、95%、98%或99%一致,或
(ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、
152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、160、
161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、
9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、
17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、
162、164、266到269、165、167、166、270到273中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266 到269、
165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、
95%、98%或99%一致,或
(iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、
152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、160、
161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、
13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、
22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250 到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、
157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266 到269、165、
167、166、270到273或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、
85%、90%、95%、98%或99%一致,或
(iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到
34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到
54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、
150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到 257、158、
159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 3、4、
31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、
51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到
70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、
159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、
35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
44.如权利要求1到16中任一项所述的转基因植物,如权利要求17或权利要求32所
述的种子,如权利要求18到30或34到35中任一项所述的方法,如权利要求33所述的杂交种子,如权利要求36或权利要求37所述的分离的多核苷酸,如权利要求38所述的DNA构建体,或如权利要求39到41中任一项所述的宿主细胞,其中该靶基因
(i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
(ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中任一个的一个至少
21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO
1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、
404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、
180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、
180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、
2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
(v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。

说明书全文

对昆虫害虫具有抗性的植物

发明领域

[0001] 本发明总体上涉及对昆虫害虫物种的侵扰的遗传控制,特别是对植物的害虫侵扰的预防和/或控制。更具体地说,本发明涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子下调昆虫害虫
物种中靶基因的表达。本发明还提供了(i)表达或能够表达本发明的干扰RNA并且(ii)
对昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的转基因植物。
[0002] 发明背景
[0003] 存在大量能够侵染或侵扰多种环境和宿主生物体的昆虫害虫物种。昆虫害虫包括以下昆虫目中的多个物种:半翅目(Hemiptera)(蝽类昆虫)、鞘翅目(Coleoptera)
(甲虫)、蚤目(Siphonaptera)(跳蚤)、网翅目(Dichyoptera)(蟑螂和螳螂)、鳞翅目
(Lepidoptera)(蛾和蝴蝶)、直翅目(Orthoptera)(例如蚱蜢)以及双翅目(Diptera)(苍
蝇)。害虫侵扰会导致严重的损害。侵扰植物物种的昆虫害虫在农业上特别成问题,因为
它们会对作物造成严重损害并且显著降低植物产量。多种不同类型的植物都对害虫侵扰敏
感,包括经济作物,如稻、花、大豆、铃薯以及玉米。
[0004] 传统上,通过使用化学杀虫剂来预防或控制昆虫害虫的侵扰。然而,这些化学品不总是适用于处理作物,因为它们可能对其他物种有毒并且会造成显著的环境损害。
在最近几十年中,研究者已经开发出控制害虫侵扰的更环境友好的方法。举例来说,已
经使用了天然地表达对昆虫害虫有毒的蛋白质微生物,如苏金芽孢杆菌(Bacillus
thuringiensis)细菌。科学家还分离出编码这些杀虫蛋白的基因并使用它们来产生对昆虫
害虫具有抗性的转基因作物,例如基因工程化为产生Cry家族蛋白质的玉米和棉花植物。
虽然细菌毒素在控制某些类型的害虫方面一直非常成功,但是它们并非对所有的害虫物种
都有效。因此,研究者们已经寻找到其他更有针对性的害虫控制方法,特别是将RNA干扰或‘基因沉默’作为在遗传水平上控制害虫的手段的方法。
[0005] RNA干扰或‘RNAi’是用以在细胞或整个生物体环境下以序列特异性方式下调基因表达的一种方法。RNAi是目前本领域中用于抑制或下调多种生物体(包括害虫生物体,
真菌线虫以及昆虫)中的基因表达的一种成熟的技术。此外,之前的研究已经显示,下调昆虫害虫物种中的靶基因可以被用作控制害虫侵扰的一种手段。
[0006] WO 2007/074405描述了抑制无脊椎动物害虫(包括科罗拉多马铃薯甲虫)中靶基因的表达的方法。另外,WO 2009/091864描述了用于抑制昆虫害虫物种(包括来自草盲蝽
(Lygus)属的害虫)中的靶基因的组合物和方法。
[0007] 虽然使用RNAi来下调害虫物种中的基因表达在本领域中是已知的,但是将这种技术用作害虫控制措施的成功取决于选择最适当的靶基因,即功能缺失导致必需生物过程
严重破坏和/或生物体死亡的那些基因。因此,本发明针对将下调害虫中的特定靶基因作
为一种手段来实现昆虫害虫侵扰,特别是植物的昆虫害虫侵扰的更有效预防和/或控制。

发明内容

[0008] 本发明人试图使用遗传方法来鉴定用于预防和/或控制昆虫害虫侵扰的改良的手段。具体来说,他们研究了使用RNAi按以下方式来下调基因:削弱昆虫害虫存活、生长、进展通过昆虫生命周期的不同阶段(例如从蛹变态成为成虫)、定殖特定环境和/或侵扰宿
主生物体的能并且由此限制由害虫造成的损害。
[0009] 因此,根据本发明的一个方面,提供了一种转基因植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达至少一种干扰核糖核酸(RNA或双链RNA),该干扰核糖核酸在被一种昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的一种
靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火
互补链的一个双链RNA区域,其中一条链包含与该靶基因内的一个靶核苷酸序列至少部分
地互补的一个核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶基因
[0010] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到 217、124、133、218到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、
162、164、266到 269、165、167、166、270 到 273、168、170、169、274到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对
并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到
325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、
302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到
253、156、157、254到 257、158、159、258 到261、160、161、262 到 265、163、162、164、266 到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0011] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、
162、164、266到 269、165、167、166、270 到 273、168、170、169、274到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个组成的一种核苷酸序列,或
[0012] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中任一个的一个至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、
55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、
700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、
174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310 到313、401、3、4、
31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、
51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到
70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214 到217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO
1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310 到313、401、3、
4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、
14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、
67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、
286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到
217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、
230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238 到241、150、151、
242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到
261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、
274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、
95%、98%或99%一致,或
[0013] (iv)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中任一个的一个至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、
55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、
700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到
325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、
302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到
253、156、157、254到 257、158、159、258 到 261、160、161、262到 265、163、162、164、266 到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、
6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到
74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、
98%或99%一致,或
[0014] (v)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到
34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到
54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、
23、24、71到 74、25、26、75 到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206 到 209、286 到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到 217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到 281、200、201、314到 317、402、186、202、187、203、306 到 309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具
有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到
297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0015] (vi)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、
5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、
204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到
301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、
149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242 到245、152、
153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、
173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318 到321、386、
387、388、389中的任一个所编码的氨基酸序列至少70%,优选至少75%、80%、85%、90%、
95%、98%或99%一致。
[0016] 在本发明的一个具体方面,由本发明的植物表达的干扰RNA分子包含至少一个双链区,典型地是该干扰RNA的沉默元件,它包含通过与一个反义RNA链互补配对而退火
的一个有义RNA链,其中dsRNA分子的有义链包含与位于该靶基因的RNA转录物内的一个
核苷酸序列互补的一个核苷酸序列。
[0017] 在一个实施例中,本发明涉及一种转基因植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰RNA分子,该干扰RNA分子包
含至少一个双链区,典型地是该干扰RNA分子的沉默元件,它包含通过与一个反义RNA链互
补碱基配对而退火的一个有义RNA链,其中dsRNA分子的有义链包含一个至少17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、
175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、
1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的序列,该序列与位于来自肌蛋白/肌丝复合物
的靶基因的RNA转录物内的一个核苷酸序列至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、
98%、99%或100%互补。
[0018] 在一个实施例中,该靶基因编码一种昆虫wings up A(肌钙蛋白I)蛋白(例如CG7178Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 1、2、174、404、175、
180、181、188和189表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 79、349、
405、352或356中的一个或多个具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0019] 在一个实施例中,该靶基因编码一种支持蛋白(upheld protein)(例如CG7107 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 121、130、142、143、176、177、182和183表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 330、350或353中的一
个或多个具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0020] 在一个实施例中,该靶基因编码原肌球蛋白1蛋白(例如CG4898 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)或原肌球蛋白2蛋白(例如CG4843 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),
所述靶基因是由SEQ ID NO 123和132表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与
SEQ ID NO 332具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。在一个实施例中,该靶基因编码肌球蛋白重链(例如CG17927 Dm蛋白的一种昆虫直
向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 122、131、144、145、178和179表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 331或351中的一个或多个具有至少85%、90%、
92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0021] 在一个实施例中,该靶基因编码肌球蛋白轻链细胞质蛋白(例如CG3201 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 124和133表示。在一个优选实施例
中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 333具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0022] 在一个实施例中,该靶基因编码鱼翅瓜蛋白(例如CG3595 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 125和134表示。在一个优选实施例中,该昆虫直
向同源物与SEQ ID NO 334具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的一致性。
[0023] 在一个实施例中,该靶基因编码拉链蛋白(例如CG15792 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 126和135表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向
同源物与SEQ ID NO 335具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的一致性。
[0024] 在一个实施例中,该靶基因编码肌钙蛋白C(例如CG2981、CG7930、CG9073、CG6514、CG12408、CG9073、CG7930、CG2981、CG12408或CG6514 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 127和136、或128和137、或184和185表示。在一个
优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 336、337和354中的一个或多个具有至少
85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0025] 根据另一个方面,本发明涉及一种转基因植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰RNA分子,该干扰RNA分子包
含至少一个双链区,典型地是该干扰RNA分子的沉默元件,它包含通过与一个反义RNA链互
补碱基配对而退火的一个有义RNA链,其中dsRNA分子的有义链包含一个至少17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、
175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、
1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的序列,该序列与位于编码一种昆虫核糖体蛋白的
一种靶基因的RNA转录物内的一个核苷酸序列至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、
98%、99%或100%互补。
[0026] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S3A(例如CG2168 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 11、12和141表示。在一个优选实施例中,该
昆虫直向同源物与SEQ ID NO 84或328中的一个或两个具有至少85%、90%、92%、94%、
96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0027] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白LP1(例如CG4087 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 3和4表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向
同源物与SEQ ID NO 80具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0028] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S3(例如CG6779 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 7和8表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向
同源物与SEQ ID NO 82具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0029] 在一个实施例中,由SEQ ID NO 9和10表示的靶基因编码核糖体蛋白L10Ab(例如CG7283Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 83具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0030] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S18(例如CG8900 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 13和14表示。在一个优选实施例中,该昆虫直
向同源物与SEQ ID NO 85具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0031] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L4(例如CG5502Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 5和6表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同
源物与SEQ ID NO 81具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0032] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S27(例如CG10423 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 15和16、204和205表示。在一个优选实施例
中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 86和359中的一个或两个具有至少85%、90%、92%、
94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0033] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L6(例如CG11522 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 17和18表示。在一个优选实施例中,该昆虫直
向同源物与SEQ ID NO 87具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0034] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S13(例如CG13389 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 19和20表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQ ID NO 88具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0035] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L12(例如CG3195 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 21和22表示。在一个优选实施例中,该昆虫直
向同源物与SEQ ID NO 89具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0036] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L26(例如CG6846 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 158和159表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQ ID NO 343具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0037] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L21(例如CG12775 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 165、166以及167表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 347和348具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、
99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0038] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S12(例如CG11271 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 156和157表示。在一个优选实施例中,该昆
虫直向同源物与SEQ ID NO 342具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0039] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S28b(例如CG2998 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 160和161表示。在一个优选实施例中,该昆
虫直向同源物与SEQ ID NO 344具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0040] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L13(例如CG4651 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 154和155表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQ ID NO 341具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0041] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L10(例如CG17521 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 163和164表示。在一个优选实施例中,该昆
虫直向同源物与SEQ ID NO 345具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0042] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L5(例如CG17489 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 152和153表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQ ID NO 340具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0043] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S15Aa(例如CG2033 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 150和151表示。在一个优选实施例中,该昆
虫直向同源物与SEQ ID NO 339具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0044] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L19(例如CG2746 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 200和201表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQ ID NO 357具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0045] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L27(例如CG4759 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 386表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同
源物与SEQ ID NO 390具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0046] 在一个实施例中,该靶基因编码线粒体细胞色素c化酶亚单位II蛋白(例如CG34069Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 25和26表示。在
一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 91具有至少85%、90%、92%、94%、
96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0047] 在一个实施例中,该靶基因编码ATP合酶-γ链(例如CG7610 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO129和138表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQIDNO338具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0048] 在一个实施例中,该靶基因编码泛素-5E(例如CG32744 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 186和187、202和203表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 355和358中的一个或两个具有至少85%、90%、92%、94%、
96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0049] 在一个实施例中,该靶基因编码蛋白酶体β型亚单位(例如CG17331 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 387表示。。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 391具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0050] 在一个实施例中,该靶基因编码作为CG13704 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物的蛋白质,所述靶基因是由SEQ ID NO 388表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与
SEQ ID NO 392具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0051] 在一个实施例中,该靶基因编码Rpn12蛋白(例如CG4157 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 389表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源
物与SEQ ID NO 393具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0052] 根据本发明的另一个方面,提供了一种分离的多核苷酸,该多核苷酸选自下组,该组由以下各项组成:
[0053] ·(i)包含如由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、
43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、
59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到 229、127、148、136、230 到233、128、149、184、137、185、234 到 237、302 到
305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250 到253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266 到269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到 277、172、173、278到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个所表示的一种核苷酸序列的至少21个,优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、
40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、
550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的一种多核苷酸,或·
[0054] (ii)由如SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、129、
138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314 到317、402、186、
202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个所表示的一种核苷酸序列的至少21个,优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、
60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、
800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸组成的一种多核苷酸,或
[0055] (iii)包含如在SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、
43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、
59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到 229、127、148、136、230 到233、128、149、184、137、185、234 到 237、302 到
305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到 253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266 到269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到 277、172、173、278到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个中所表示的一种核苷酸序列的至少21个,优选至少22、23或24、25、26、27、28、29、30、
35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、
500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的一种多核苷酸,当最佳地比对并且比较两个序列时,所述多核苷酸与SEQ ID NO 1、174、
404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到
34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到
54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、
23、24、71到 74、25、26、75 到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206 到 209、286 到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到 217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到 281、200、201、314到 317、402、186、202、187、203、306 到 309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、
95%、98%或99%一致,或
[0056] (iv)包含如在SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、
43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、
59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到 229、127、148、136、230 到233、128、149、184、137、185、234 到 237、302 到
305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到 253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到277、172、173、278 到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个中所表示的一种核苷酸的一个至少21个,优选至少22、23或24、25、26、27、28、29、30、
35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、
500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种多核苷酸,并且其中所述片段或所述互补序列具有一种核苷酸序列,当将所
述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310 到313、401、3、4、31 到34、139、5、6、35 到38、140、7、8、39 到42、9、10、43到 46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、
282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、
9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、
17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、
142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、
210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、
147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到 277、172、173、278到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0057] (v)由如在SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210 到213、
290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222 到225、147、126、
135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、
129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到 249、154、155、250到253、156、
157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到 265、163、162、164、266到269、165、
167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、200、201、314到317、
402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个中所表示的一种核苷酸的一个至少21个,优选至少22、23或24、25、26、27、28、29、30、35、
40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、
550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段组成的一种多核苷酸,并且其中所述片段或所述互补序列具有一种核苷酸序列,当将所
述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到 313、401、3、4、31到 34、139、5、6、35到 38、140、7、8、39到 42、9、10、43到 46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,或
[0058] (vi)编码一种氨基酸序列的一种多核苷酸,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到
285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、
43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、
59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到 229、127、148、136、230 到233、128、149、184、137、185、234 到 237、302 到
305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到 253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到277、172、173、278 到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个所编码的氨基酸序列至少70%,优选至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致并且
[0059] 其中所述多核苷酸不长于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。
[0060] 由本发明的靶基因编码的氨基酸序列是由SEQ ID NO 79、349、405、352、356、80、326、81、327、82、83、328、84、329、85、86、359、87 到 91、330、350、353、331、351、332 到 336、
337、354、338到344、346、345、347、348、357、355、358、390到393表示。
[0061] 在本发明的一个具体方面,该分离的多核苷酸是干扰RNA分子的一部分,典型地是沉默元件的一部分,它包含至少一个双链区,该双链区包含通过与一个反义RNA链互补
碱基配对而退火的一个有义RNA链,其中dsRNA分子的有义链包含与位于该靶基因的RNA
转录物内的一个核苷酸序列互补的一个核苷酸序列。更具体地说,该分离的多核苷酸是在
有义和反义方向克隆到一种DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成一个dsRNA
分子,该分子在被害虫摄入后起到抑制或下调所述害虫内的靶基因的表达的作用。
[0062] 在某些方面中,本发明涉及多种分离的多核苷酸,该多核苷酸是在有义和反义方向克隆到一种DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成一个dsRNA分子,该分子
在被昆虫摄入后起到抑制或下调肌钙蛋白/肌丝复合物内的靶基因的表达的作用。在一个
实施例中,该靶基因编码一种昆虫wings up A(肌钙蛋白I)蛋白(例如CG7178 Dm蛋白的
一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 1、2、174、404、175、180、181、188和189表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 79、349、405、352或356中的一个或多个具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0063] 在一个实施例中,该靶基因编码一种支持蛋白(例如CG7107 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO121、130、142、143、176、177、182和183表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 330、350或353中的一个或多个具有
至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0064] 在一个实施例中,该靶基因编码原肌球蛋白1蛋白(例如CG4898 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)或原肌球蛋白2蛋白(例如CG4843 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),
所述靶基因是由SEQ ID NO 123和132表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与
SEQ ID NO 332具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0065] 在一个实施例中,该靶基因编码肌球蛋白重链(例如CG17927 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 122、131、144、145、178和179表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 331或351中的一个或多个具有至少85%、
90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0066] 在一个实施例中,该靶基因编码肌球蛋白轻链细胞质蛋白(例如CG3201 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 124和133表示。在一个优选实施例
中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 333具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0067] 在一个实施例中,该靶基因编码鱼翅瓜蛋白(例如CG3595 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 125和134表示。在一个优选实施例中,该昆虫直
向同源物与SEQ ID NO 334具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的一致性。
[0068] 在一个实施例中,该靶基因编码拉链蛋白(例如CG15792 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 126和135表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向
同源物与SEQ ID NO 335具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的一致性。
[0069] 在一个实施例中,该靶基因编码肌钙蛋白C(例如CG2981、CG7930、CG9073、CG6514、CG12408、CG9073、CG7930、CG2981、CG12408或CG6514 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 127和136、或128和137、或184和185表示。在一个
优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 336、337和354中的一个或多个具有至少
85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0070] 根据其他实施例,本发明涉及一种分离的多核苷酸,该多核苷酸是在有义和反义方向克隆到一种DNA构建体中使得有义和反义多核苷酸转录后形成一个dsRNA分子,该分
子在被昆虫摄入后起到抑制或下调一种编码昆虫核糖体蛋白的靶基因的表达的作用。
[0071] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S3A(例如CG2168 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 11、12和14表示。在一个优选实施例中,该
昆虫直向同源物与SEQ ID NO 84或328中的一个或两个具有至少85%、90%、92%、94%、
96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白LP1(例如CG4087 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 3和4表
示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 80具有至少85%、90%、92%、
94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0072] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S3(例如CG6779 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 7和8表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向
同源物与SEQ ID NO 82具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0073] 在一个实施例中,由SEQ ID NO 9和10表示的靶基因编码核糖体蛋白L10Ab(例如CG7283Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 83具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0074] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S18(例如CG8900 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 13和14表示。在一个优选实施例中,该昆虫直
向同源物与SEQ ID NO 85具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0075] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L4(例如CG5502 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 5和6表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向
同源物与SEQ ID NO 81具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0076] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S27(例如CG10423 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 15和16、204和205表示。在一个优选实施例
中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 86和359中的一个或两个具有至少85%、90%、92%、
94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0077] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L6(例如CG11522 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 17和18表示。在一个优选实施例中,该昆虫直
向同源物与SEQ ID NO 87具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0078] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S13(例如CG13389 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 19和20表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQ ID NO 88具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0079] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L12(例如CG3195 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 21和22表示。在一个优选实施例中,该昆虫直
向同源物与SEQ ID NO 89具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0080] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L26(例如CG6846 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 158和159表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQ ID NO 343具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0081] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L21(例如CG12775 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 165、166以及167表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同源物与SEQ ID NO 347和348具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、
99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0082] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S12(例如CG11271 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 156和157表示。在一个优选实施例中,该昆
虫直向同源物与SEQ ID NO 342具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0083] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S28b(例如CG2998 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 160和161表示。在一个优选实施例中,该昆
虫直向同源物与SEQ ID NO 344具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0084] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L13(例如CG4651 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 154和155表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQ ID NO 341具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0085] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L10(例如CG17521 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 163和164表示。在一个优选实施例中,该昆
虫直向同源物与SEQ ID NO 345具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0086] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L5(例如CG17489 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 152和153表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQ ID NO 340具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0087] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白S15Aa(例如CG2033 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 150和151表示。在一个优选实施例中,该昆
虫直向同源物与SEQ ID NO 339具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0088] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L19(例如CG2746 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 200和201表示。在一个优选实施例中,该昆虫
直向同源物与SEQ ID NO 357具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0089] 在一个实施例中,该靶基因编码核糖体蛋白L27(例如CG4759 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物),所述靶基因是由SEQ ID NO 386表示。在一个优选实施例中,该昆虫直向同
源物与SEQ ID NO 390具有至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%的氨基酸序列一致性。
[0090] 优选地,本发明的方法可实际应用于预防和/或控制昆虫害虫侵扰,特别是控制以下作物植物的害虫侵扰:例如(但不限于)棉花、马铃薯、水稻、草莓、苜蓿、大豆、番茄、卡诺拉、向日葵、高粱、珍珠粟、玉米、茄子、胡椒以及烟草。此外,可以通过常规遗传工程技术将本发明的干扰RNA引入到有待保护的植物中。
[0091] 因此,根据本发明的另一个方面,提供了一种用于产生对昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的转基因植物的方法,包括:
[0092] (a)用包含编码一种干扰核糖核酸(RNA)的一种多核苷酸序列的一种DNA构建体转化植物细胞,该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的一种
靶基因的表达的作用,其中该靶基因
[0093] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到
325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、
302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到
253、156、157、254到 257、158、159、258 到261、160、161、262 到 265、163、162、164、266 到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0094] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、
162、164、266 到269、165、167、166、270 到 273、168、170、169、274到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个组成的一种核苷酸序列,或
[0095] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、
205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、
25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到 301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242 到245、152、153、
246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到
265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、
278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318 到321、386、387、
388、389中任一个的一个至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、
70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、
900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列,当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、
6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到
74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、
6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到
74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242 到245、152、153、
246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到
265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、
278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318 到321、386、387、
388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0096] (iv)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、
205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、
25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到 301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242 到245、152、153、
246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到
265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、
278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318 到321、386、387、
388、389或其互补序列中任一个的一个至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、
45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、
600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、
7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、
322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、
143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、
131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、134、
222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、
250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、164、
266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、200、
201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1-26、
121-205、386-389、394、400或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少
80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0097] (v)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ IDNO1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到
34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到
54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、
23、24、71到 74、25、26、75 到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206 到 209、286 到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214 到217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到 277、172、173、278到 281、200、201、314 到317、402、186、202、187、203、306 到 309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具
有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到
297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0098] (vi)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、
5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、
204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到
301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、
149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242 到245、152、
153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、
173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318 到321、386、
387、388、389中的任一个所编码的氨基酸序列至少70%,优选至少75%、80%、85%、90%、
95%、98%或99%一致;
[0099] (b)从该转化的植物细胞再生一种植物;并且
[0100] (c)在适合从该重组DNA构建体表达该干扰RNA的条件下使该转化的植物生长,因此与一种未转化的植物相比,所述植物对所述害虫具有抗性。
[0101] 在另一个方面,在此提供的是一种用于预防和/或控制作物植物田地中的昆虫害虫侵扰的方法,所述方法包括在所述植物中表达一种有效量的一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫物种中的一种靶基因的表
达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一
个双链RNA区域,其中一条链包含与该靶基因内的一种靶核苷酸序列至少部分地互补的一
种核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶基因
[0102] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、
75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、
144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、
125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、
185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、
154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、160、161、262到265、163、
162、164、266 到269、165、167、166、270 到 273、168、170、169、274 到 277、172、173、278 到
281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对
并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到
325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、
302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到
253、156、157、254到 257、158、159、258 到 261、160、161、262到 265、163、162、164、266 到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
[0103] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有
一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、
2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、
205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、
25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到 301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、
6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到
74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中的任一个至少75%一致,或
[0104] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其
中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、
294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、129、
138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314 到317、402、186、
202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、
7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、
322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到 281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%一致,或
[0105] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到
34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到
54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、
23、24、71到 74、25、26、75 到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206 到 209、286 到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到 217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有
的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、
63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、
158、159、258到 261、160、161、262 到265、163、162、164、266 到 269、165、167、166、270 到
273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、
203、306到309、318到321、386、387、388、389所表示的序列中的任一个至少75%一致,或[0106] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、
6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到
74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%一致。
[0107] 在本发明的所有方面,在优选实施例中,该靶基因
[0108] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到 221、146、125、134、222到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、
404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到 297、310到313、401、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0109] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段
的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、
294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到
301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0110] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到 221、146、125、134、222到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段
的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到
209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、
136、230到233中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸
序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298 到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到 221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0111] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到 313、401、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,
该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、
282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到
289、298 到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0112] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到 313、401、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少
90%、95%、98%或99%一致。
[0113] 在一个优选实施例中,靶基因编码一种选自肌钙蛋白/肌丝复合物的昆虫蛋白,该复合物选自下组,该组包括肌钙蛋白I蛋白(例如CG7178 Dm蛋白的一种昆虫直向同源
物)、支持蛋白(例如CG7107 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、原肌球蛋白1蛋白(例如
CG4898 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、原肌球蛋白2蛋白(例如CG4843 Dm蛋白的一种
昆虫直向同源物)、肌球蛋白重链(例如CG17927 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、肌球
蛋白轻链细胞质蛋白(例如CG3201 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、鱼翅瓜蛋白(例如
CG3595 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、拉链蛋白(例如CG15792 Dm蛋白的一种昆虫直向
同源物)、以及肌钙蛋白C蛋白(例如CG2981、CG7930、CG9073、CG6514、CG12408、CG9073、CG7930、CG2981、CG12408或CG6514 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)。
[0114] 在本发明的所有方面,在优选实施例中,该靶基因
[0115] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列
时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、
250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、
90%、95%、98%或99%一致,或
[0116] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使
得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到
269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、
90%、95%、98%或99%一致,或
[0117] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ
ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到
50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、
21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列
与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、
157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266 到269、165、
167、166、270到273或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、
85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0118] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、
150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254 到257、158、
159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度
使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 3、4、
31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、
51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到
70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、
159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或[0119] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 3、4、31到34、139、
5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、
204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、
242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到
261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0120] 在一个优选实施例中,靶基因编码一种昆虫核糖体蛋白,该昆虫核糖体蛋白选自下组,该组包括核糖体蛋白S3A(例如CG2168 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋
白LP1(例如CG4087 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S3(例如CG6779 Dm蛋
白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L10Ab(例如CG7283 Dm蛋白的一种昆虫直向同源
物)、核糖体蛋白S18(例如CG8900 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L4(例
如CG5502 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S27(例如CG10423 Dm蛋白的一
种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L6(例如CG11522 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核
糖体蛋白S13(例如CG13389 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)以及核糖体蛋白L12(例如
CG3195 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L26(例如CG6846 Dm蛋白的一种昆虫
直向同源物)、核糖体蛋白L21(例如CG12775 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋
白S12(例如CG11271 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S28b(例如CG2998 Dm
蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L13(例如CG4651 Dm蛋白的一种昆虫直向同源
物)、核糖体蛋白L10(例如CG17521 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L5(例
如CG17489 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S15Aa(例如CG2033 Dm蛋白的一
种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L19(例如CG2746 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、以及
核糖体蛋白L27(例如CG4759 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)
[0121] 在本发明的所有方面,在优选实施例中,该靶基因
[0122] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核
苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到
297、310到313、401或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、
98%或99%一致,或
[0123] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包
含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到
285、294到297、310到313、401中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或[0124] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、
174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、
404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0125] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳
地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0126] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0127] 在优选实施例中,该靶基因可以编码一种昆虫肌钙蛋白I蛋白(例如CG7178Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)。该昆虫肌钙蛋白I蛋白可以具有与如SEQ ID NO 79、349、405、
352或356中的任一个中所存在的氨基酸序列至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%一致(当最佳地比对所述编码的蛋白质时)的一个氨基酸序列。
[0128] 表格和附图的简要说明
[0129] 表1由第一次筛选鉴定的豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)新颖靶。
[0130] 表1B在Lh594途径中的豆荚草盲蝽新颖靶。
[0131] 表1C由第二轮筛选鉴定的豆荚草盲蝽新颖靶。
[0132] 表2在豆荚草盲蝽中鉴定的靶基因的多核苷酸序列。
[0133] 表3在豆荚草盲蝽中鉴定的靶基因的氨基酸序列。
[0134] 表4相应于豆荚草盲蝽靶基因的dsRNA(由等效DNA序列表示的有义链)和用于产生这些dsRNA的引物。
[0135] 表5根据剂量反应曲线(DRC)并且与基准靶Lh423和Lh105相比较进行分级的豆荚草盲蝽靶。
[0136] 表6来自第二轮筛选的豆荚草盲蝽靶-根据DRC并且与基准靶Lh423和Lh594相比较进行分级。
[0137] 表7有关携带豆荚草盲蝽发夹的转基因马铃薯的测试的综述。
[0138] 表8用于qRT-PCR的靶基因和两种看家基因的扩增子的序列。
[0139] 表9在科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)中鉴定的靶基因的多核苷酸序列。
[0140] 表10在CPB中鉴定的靶基因的氨基酸序列。
[0141] 表11相应于CPB靶基因的dsRNA(由等效DNA序列表示的有义链)和用于产生这些dsRNA的引物。
[0142] 表12在褐色飞虱(BPH)中鉴定的靶基因的多核苷酸序列。
[0143] 表13在BPH中鉴定的靶基因的氨基酸序列。
[0144] 表14相应于BPH靶基因的dsRNA(由等效DNA序列表示的有义链)和用于产生这些dsRNA的引物。
[0145] 表15基于豌豆蚜基因组序列而用于扩增蚜虫cDNA的引物。
[0146] 表16在蚜虫中鉴定的靶基因的多核苷酸序列。
[0147] 表17在蚜虫中鉴定的靶基因的氨基酸序列。
[0148] 表18相应于蚜虫靶基因的dsRNA(由等效DNA序列表示的有义链)和用于产生这些dsRNA的引物。
[0149] 表19用于扩增CPB Ld594cDNA的简并引物
[0150] 表20用于扩增BPH cDNA的简并引物
[0151] 表21:来自该筛选的马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)新颖靶。
[0152] 表22:褐飞虱(Nilaparvata lugens)的新颖鉴定的靶。
[0153] 表23:豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的新颖鉴定的靶。
[0154] 图1:板Lh001_009的第二次确认测定。暗条:在第3天到第6天的死亡率;亮条:在第6天到第8天的死亡率。使用“Lygxxx”筛选代码和“Lhxxx”靶命名代码将候选克隆
命名。
[0155] 图2:板Lh010_020的第二次确认测定。暗条:在第3天到第6天的死亡率;亮条:在第6天到第8天的死亡率。使用“Lygxxx”筛选代码和“Lhxxx”靶命名代码将候选克隆
命名。
[0156] 图3:来自板Lh001到Lh009的草盲蝽新颖靶的死亡率分析,以在10天的时间段内的死亡率%表示。对照以虚线表示。阳性对照:Lh423 dsRNA(RpL19)。阴性对照:GFP dsRNA和仅饲料(对照)。
[0157] 图4:来自板Lh010到Lh020的草盲蝽新颖靶的死亡率分析,以在10天的时间段内的死亡率%表示。对照以虚线表示。阳性对照:Lh423(RpL19)。阴性对照:GFP和仅饲料(对照)。
[0158] 图5含有豆荚草盲蝽hpRNA盒的植物表达载体的示意性图示。RB:右边界;LB:左边界;P35S:花椰菜花叶病毒35S启动子;T35S:花椰菜花叶病毒35S终止子;TNOS:胭脂碱合成酶终止子;GFP:绿色荧光报告基因;NPT II:新霉素磷酸转移酶II基因的编码序列;
KmR:卡那霉素抗性基因;pBR322 ori:pBR322复制起点;pBR322 bom:pBR322动员;pVS1 rep:pVS1复制子;pVS1sta:pVS1稳定元件。
[0159] 图6马铃薯-草盲蝽植物体内(in planta)测定设置。白色箭头表示昆虫损害。
[0160] 图7到11豆荚草盲蝽新颖靶-在从0.4到0.025μg/μl范围内的纯化的合成dsRNA浓度下的剂量反应曲线(在该图中,单位“μg/μl”未示出)。使用GFPdsRNA和
millQ水作为阴性对照。靶的dsRNA是使用如实例部分1.1中所描述的引物产生。
[0161] 图12在从0.05到0.001μg/μl范围内的dsRNA浓度下的Lh594剂量反应曲线。使用GFP dsRNA和millQ水作为阴性对照。
[0162] 图13A在不存在tRNA的情况下在豆荚草盲蝽生物测定中的dsRNA活性:Lh594(5μg/μl);阳性对照:Lh423(5μg/μl);阴性对照:GFPdsRNA(5μg/μl)和millQ水;B使用递减浓度的dsRNA(从5μg到0.25μg)的Lh594活性极限的鉴定。阴性对照:
GFP dsRNA(5μg/μl)和millQ水。
[0163] 图14第二次筛选靶的板Lh010到Lh020的第二次确认测定。暗条:在第4天到第8天的死亡率;亮条:在第4天到第6天的死亡率。使用“Lygxxx”筛选代码和“Lhxxx”靶
命名代码将候选克隆命名。
[0164] 图15在固定的0.5μg/μl下测试的草盲蝽肌钙蛋白途径靶的测定结果。
[0165] 图16A-B来自肌钙蛋白途径的豆荚草盲蝽新颖靶-在从0.4到0.025μg/μl范围内的纯化的合成dsRNA浓度下的剂量反应曲线(在该图中,单位“μg/μl”并不总是示
出)。使用GFP dsRNA和millQ水作为阴性对照。
[0166] 图17A-D第二次筛选靶的豆荚草盲蝽新颖靶-在从0.5到0.05μg/μl范围内的纯化的合成dsRNA浓度下的剂量反应曲线。使用GFP dsRNA和millQ水作为阴性对照。
[0167] 图18A-B GUS转基因事件的测试和选择。在豆荚草盲蝽单盆测定中测试GUS发夹转基因系(P001)的八个独立事件并且与WT小植株相比较。所有小植株都经历相同的处理。
将一日龄的豆荚草盲蝽若虫添加到每一个盆中并且检查在9天内的存活率。
[0168] 图19Lh423转基因事件的测试:在豆荚草盲蝽单盆测定中测试28个独立的转基因事件(P006系)。将Lh423转基因小植株与WT小植株并且与GUS转基因事件(P001系)相
比较。将单个一日龄的豆荚草盲蝽若虫添加到每一个盆中并且检查在9天内的存活率。
[0169] 图20Lh423转基因事件的测试:示出了导致>60%的存活率的6个独立的转基因事件(P006)。将Lh423转基因小植株与WT小植株并且与GUS转基因系(P001)相比较。将
单个一日龄的豆荚草盲蝽若虫添加到每一个盆中并且检查在9天内的存活率。
[0170] 图21Lh594转基因事件的测试:在豆荚草盲蝽单盆测定中测试25个独立的转基因事件(P007)。将Lh594转基因小植株与WT小植株并且与GUS转基因事件(P001)相比较。
将单个一日龄的豆荚草盲蝽若虫添加到每一个盆中并且检查在11天内的存活率。
[0171] 图22Lh594转基因事件的测试:示出了导致60%的存活率的6个独立的转基因事件(P007)。将Lh594转基因小植株与WT小植株并且与GUS转基因系(P001)相比较。将单
个一日龄的豆荚草盲蝽若虫添加到每一个盆中并且检查在11天内的存活率。
[0172] 图23在饲喂含有GUS发夹或Lh423发夹的转基因植物5天之后的昆虫中的Lh423mRNA水平的相对值。用扩增Lh423的引物来分析样品。使用GeNorm,用2种看家基
因Lh425和Lh427使数据归一化。
[0173] 图24用1μg的dsRNA Ld594、Ld619以及Ld620处理的CPB幼虫的存活率分析。阳性对照包括基准靶Ld513和Ld049的1μg的dsRNA。阴性对照包括millQ水和FP。
[0174] 图25相比于未处理的对照(UTC),Ld594、Ld619以及Ld620 dsRNA对CPB 4龄幼虫化蛹的作用。向虫子饲喂分配在马铃薯叶盘中的1μg的dsRNA,然后饲喂未处理的马铃
薯叶(A)持续4天,然后放在蛭石上。为了评估dsRNA的作用,从蛭石中挖出死昆虫(因为
Ld594 dsRNA所诱导的强烈作用,不能从蛭石中回收到蛹,并且因此,没有获得此靶dsRNA
的图像)(B)。
[0175] 图26CPB Ld594、619以及620 dsRNA对CPB成虫的存活率和健康的作用。在第4、6、7、8、11以及13天进行评估。对照MQ:millQ水。
[0176] 图27来自Nl594途径的dsRNA在褐色飞虱中的活性。在0.1%的CHAPSO存在下测试0.5μg/μl的DsRNA。阳性对照:NI537 dsRNA(0.5μg/μl);阴性对照:GFP
dsRNA(0.5μg/μl)和仅饲料。
[0177] 图28来自Ap594、Ap423、Ap537以及Ap560的dsRNA对豌豆蚜的活性。在5μg/μl的tRNA存在下测试0.5μg/μl的DsRNA。阴性对照:GFPdsRNA(0.5μg/μl)。
[0178] 图29马铃薯叶甲幼虫关于用dsRNA处理的人工饲料的死亡率百分比。Ld583、Ld584、Ld586以及Ld588表示靶克隆。阳性对照:Ld513;阴性对照:FP。
[0179] 发明详细说明
[0180] 本发明人已发现,通过RNAi下调昆虫害虫物种中特定靶基因的表达可以用于有效地预防和/或控制所述昆虫害虫的侵扰。使用RNAi下调昆虫害虫物种中靶基因的表达
在此适用于产生对昆虫害虫的侵扰具有抗性的植物。
[0181] 因此,在一个第一方面,本发明提供了对昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的转基因植物。具体来说,在此提供了表达或能够表达至少一种干扰核糖核酸(RNA)的转基因植物,如在此其他地方所描述,该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述害虫内靶
基因的表达的作用。该干扰RNA可以是如下文所披露的那些中的任一个。优选地,该干扰
RNA包含至少一个沉默元件或由其组成,并且所述沉默元件是包含退火的互补链的一个双
链RNA区域,其中一条链(有义链)包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核
苷酸序列。下调害虫靶基因可以用于破坏害虫中的必需生物过程或功能,其中‘必需’是指以下事实:该过程或功能是引发或维持害虫侵扰所必需的。
[0182] 如在此所使用的,术语‘植物’可以包括植物的任何生殖或繁殖材料。提到植物还可以包括植物细胞、植物原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物丛以及在植物或植物的部分中完好的植物细胞(如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖等)。在此描述的任一种转基因植物的后代、变体以及突变体都在本发明的范围内。还包括由所述转基因植物中的任一种产生的种子。
[0183] 如在此所使用的,术语“控制”害虫侵扰是指对害虫产生的用来限制和/或减少害虫生物体的数目和/或由害虫引起的损害的任何作用。因此,优选的靶基因是控制或调控昆虫害虫内的一种或多种必需生物功能的必需基因,这些生物功能为例如细胞分裂、生殖、能量代谢、消化、神经功能等。通过RNAi技术下调这些必需基因可以导致昆虫的死亡,或者以另外的方式显著地延缓生长和发育或者削弱害虫在环境中定殖或侵扰宿主生物体的能
力。
[0184] 诸位发明人现已鉴定出属于草盲蝽属、马铃薯叶甲属、褐飞虱属以及豌豆蚜属的昆虫害虫物种的优良靶基因,这些靶被设想单独地或组合用作RNAi介导性控制农艺学上
重要作物的昆虫侵扰的一种有效手段。这些新鉴定的靶基因的直向同源物可以用于其他昆
虫物种中以控制相应的相关作物的害虫侵扰。
[0185] 更具体来说,诸位发明人在此描述了编码肌钙蛋白/肌丝复合物的蛋白质的基因形成了供通过RNA抑制机构进行抑制的极佳靶基因。这些靶基因中的一种编码昆虫肌钙蛋
白I蛋白(wings up A),它是果蝇CG7178蛋白的一种直向同源物。此蛋白质涉及于肌肉
收缩中并且属于一种生理途径,该生理途径并未针对通过RNA抑制进行(昆虫)害虫控制
而加以完全地探索。此外,因为这种蛋白质复合物具有动物特异性,并无已知的植物基因同源物或直向同源物,所以在植物中表达靶dsRNA时,降低了异型株(off-type plant)表型
险。另外,在果蝇中,肌钙蛋白I被描述为一种单倍不足的基因,在杂合子状态中呈现一种突变体表型。这类基因对mRNA表达水平的降低特别敏感并且因此可以被视为理想的
RNAi靶。
[0186] 以下列出了这种肌钙蛋白/肌丝复合物中其他感兴趣的靶基因并且针对在豆荚草盲蝽和其他昆虫害虫物种中的RNAi控制进行进一步研究:
[0187]注释ID 细胞学 Dm标识符
up 支持蛋白 CG7107
Tm1 原肌球蛋白1 CG4898
Tm2 原肌球蛋白2 CG4843
Mhc 肌球蛋白重链 CG17927
Mlc-c 肌球蛋白轻链细胞质 CG3201
sqh 鱼翅瓜 CG3595
zip 拉链 CG15792
[0188] 在一个方面,本发明提供了一种转基因植物、源自其的生殖或繁殖材料、或培养的植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用。
[0189] 在一个实施例中,本发明涉及一种植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链
包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶
基因
[0190] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到 221、146、125、134、222到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、
404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到 313、401、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0191] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233、或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、
294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到
301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0192] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到 221、146、125、134、222到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233、或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到
209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、
136、230到233中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸
序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298 到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到 221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0193] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到 313、401、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到229、127、148、136、230到233、或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因
时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到
30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0194] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到 313、401、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少
90%、95%、98%或99%一致。
[0195] 在一个优选实施例中,该靶基因编码一种选自肌钙蛋白/肌丝复合物的昆虫蛋白,该复合物选自下组,该组包括肌钙蛋白I(例如CG7178 Dm蛋白的一种昆虫直向同源
物)、支持蛋白(例如CG7107 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、原肌球蛋白1蛋白(例如
CG4898 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、原肌球蛋白2蛋白(例如CG4843 Dm蛋白的一种
昆虫直向同源物)、肌球蛋白重链(例如CG17927 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、肌球
蛋白轻链细胞质蛋白(例如CG3201 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、鱼翅瓜蛋白(例如
CG3595 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、拉链蛋白(例如CG15792 Dm蛋白的一种昆虫直
向同源物)、肌钙蛋白C(例如CG2981、CG7930、CG9073、CG6514、CG12408、CG9073、CG7930、CG2981、CG12408或CG6514 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)
[0196] 在其他实施例中,本发明涉及一种植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链
包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶
基因
[0197] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列
时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、
250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、
90%、95%、98%或99%一致,或
[0198] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使
得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到
269、165、167、166、270到273、或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、
90%、95%、98%或99%一致,或
[0199] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ
ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到
50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、
21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列
与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、
157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266 到269、165、
167、166、270到273、或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、
85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0200] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、
150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254 到257、158、
159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度
使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 3、4、
31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、
51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到
70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、
159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或[0201] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 3、4、31到34、139、
5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、
204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、
242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到
261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0202] 在一个优选实施例中,该靶基因编码一种昆虫核糖体蛋白,该昆虫核糖体蛋白选自下组,该组包括核糖体蛋白S3A(例如CG2168 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体
蛋白LP1(例如CG4087 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S3(例如CG6779 Dm
蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L10Ab(例如CG7283 Dm蛋白的一种昆虫直向同
源物)、核糖体蛋白S18(例如CG8900 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L4(例
如CG5502 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S27(例如CG10423 Dm蛋白的一
种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L6(例如CG11522Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖
体蛋白S13(例如CG13389 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)以及核糖体蛋白L12(例如
CG3195 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L26(例如CG6846 Dm蛋白的一种昆虫
直向同源物)、核糖体蛋白L21(例如CG12775 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋
白S12(例如CG11271 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S28b(例如CG2998 Dm
蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L13(例如CG4651 Dm蛋白的一种昆虫直向同源
物)、核糖体蛋白L10(例如CG17521 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L5(例
如CG17489 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白S15Aa(例如CG2033 Dm蛋白的一
种昆虫直向同源物)、核糖体蛋白L19(例如CG2746 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)、核糖
体蛋白L27(例如CG4759 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)
[0203] 在一个实施例中,本发明涉及一种植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链
包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶
基因
[0204] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核
苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到
297、310到313、401、或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、
98%或99%一致,或
[0205] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包
含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到
285、294到297、310到313、401、中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、
401、或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0206] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO
1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、
174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或
99%一致,或
[0207] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当
最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、
180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0208] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0209] 在优选实施例中,该靶基因可以编码一种昆虫肌钙蛋白I蛋白(例如CG7178 Dm蛋白的一种昆虫直向同源物)。该昆虫肌钙蛋白I蛋白可以具有与如SEQ ID NO 79、349、
405、352或356中的任一个中所存在的氨基酸序列至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、
99%一致(当最佳地比对所述编码的蛋白质时)的一个氨基酸序列。
[0210] 在一个实施例中,本发明涉及一种植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链
包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶
基因
[0211] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 141、11、12或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 141、11、12或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少
80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0212] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 141、11、12或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 141、11、12中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO141、11、12或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0213] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 141、11、12或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片
段与SEQ ID NO 141、11、12中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 141、11、12或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少
75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0214] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 141、11、12或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的
相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 141、11、12所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0215] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 141、11、12中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0216] 在一个实施例中,本发明涉及一种植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链
包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶
基因
[0217] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 17、18或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列
时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 17、18或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、
85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0218] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 17、18或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使
得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 17、18中的任一个最佳地比对并且比较时,
所述核苷酸序列与SEQ ID NO 17、18或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、
85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0219] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 17、18或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与
SEQ ID NO 17、18中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷
酸序列与SEQ ID NO 17、18或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少
80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0220] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 17、18或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似
程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO
17、18所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0221] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 17、18中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0222] 在一个实施例中,本发明涉及一种植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链
包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶
基因
[0223] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 19、20或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列
时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 19、20或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、
85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0224] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 19、20或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使
得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 19、20中的任一个最佳地比对并且比较时,
所述核苷酸序列与SEQ ID NO 19、20或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、
85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0225] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 19、20或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与
SEQ ID NO 19、20中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷
酸序列与SEQ ID NO 19、20或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少
80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0226] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 19、20或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似
程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO
19、20所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0227] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 19、20中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0228] 在一个实施例中,本发明涉及一种植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链
包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶
基因
[0229] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 165、166、167或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 165、166、167或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0230] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 165、166、167或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 165、166、167中的任一个最佳地比
对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 165、166、167或其互补序列中的任一个至少
75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0231] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 165、166、167或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述
片段与SEQ ID NO 17、18中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所
述核苷酸序列与SEQ ID NO 165、166、167或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少
75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0232] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 165、166、167或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面
的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ
ID NO 165、166、167所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、
98%或99%一致,或
[0233] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 165、166、167中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0234] 在一个实施例中,本发明涉及一种植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链
包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶
基因
[0235] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 143、121、142、176、182、130、177、183或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 143、121、142、176、182、
130、177、183或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或
99%一致,或
[0236] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 143、121、142、176、182、130、177、183或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序
列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 143、121、
142、176、182、130、177、183中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 143、121、142、176、182、130、177、183或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少
80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0237] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 143、121、142、176、182、130、177、183或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序
列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 143、121、142、176、182、130、177、183中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 143、121、
142、176、182、130、177、183或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少
80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0238] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 143、121、142、176、182、130、177、183或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源
物所具有的序列与SEQ ID NO 143、121、142、176、182、130、177、183所表示的这些序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0239] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 143、121、142、176、182、130、177、183中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或
99%一致。
[0240] 在一个实施例中,本发明涉及一种植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链
包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶
基因
[0241] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0242] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具
有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 145、122、144、178、
131、179中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 145、122、144、
178、131、179或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或
99%一致,或
[0243] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其
中当将所述片段与SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0244] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有
的序列与SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0245] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一
致。
[0246] 在一个实施例中,本发明涉及一种植物、或用于转基因植物的生殖或繁殖材料、或培养的转基因植物细胞,它表达或能够表达一种干扰核糖核酸(RNA),该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆虫害虫中的靶基因的表达的作用,其中该RNA包含至少一个沉默元件,其中该沉默元件是包含退火的互补链的一个双链RNA区域,其中一条链
包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且其中该靶
基因
[0247] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 128、149、184、137或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 128、149、184、137或其互补序列中的任一个至少
75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0248] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 128、149、184、137或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 128、149、184、137中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 128、149、184、137或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0249] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 128、149、184、137或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 128、149、184、137中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 128、149、184、137或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0250] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 128、149、184、137或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与
SEQ ID NO 128、149、184、137所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、
90%、95%、98%或99%一致,或
[0251] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 128、149、184、137中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0252] 如在此所使用的,“靶基因”包含意图在害虫中下调的任何基因。在一个优选实施例中,下调靶基因以例如通过破坏害虫中发生的必需生物过程,或者通过降低昆虫的致病性,来控制害虫侵扰。因此,优选的靶基因包括(但不限于)在调控摄食、存活、生长、发育、生殖、侵扰以及侵染方面发挥关键作用的那些基因。根据一个实施例,该靶基因使得当其表达被下调或受抑制时,昆虫害虫被杀死。根据另一个实施例,该靶基因使得当其表达被下调或受抑制时,阻止或延缓或妨碍或延迟或阻碍了害虫的生长,阻止了害虫生殖,或阻止了害虫通过生命周期转变。根据本发明的又一个实施例,该靶基因使得当其表达被下调或受抑
制时,由害虫引起的损害和/或害虫侵染或侵扰环境、表面和/或植物或作物物种的能力降
低;或者害虫停止从其天然食物资源(如植物和植物产物)中摄食。术语“侵扰(infest)”
和“侵染(infect)”或“侵扰(infestation)”和“侵染(infection)”总体上在通篇是可互换地使用的。
[0253] 这些靶基因可以在昆虫害虫细胞的全部或一些中表达。此外,这些靶基因可以仅在昆虫害虫的生命周期的特定阶段由其表达,例如成熟的成虫期、未成熟的若虫期或幼虫
期或卵形期。
[0254] 如在此所使用的,“害虫”物种优选地是引起侵染或侵扰,优选引起植物的侵染或侵扰的昆虫物种。
[0255] 根据本发明的优选的植物致病性昆虫是选自下组的植物害虫,该组由以下各项组成:马铃薯叶甲属(Leptinotarsa spp.)(例如马铃薯叶甲(L.decemlineata)(科罗拉多
马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(L.juncta)(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(L.texana)
(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(Nilaparvata spp.)(例如褐飞虱(N.lugens)
(褐色飞虱));灰飞虱属(Laodelphax spp.)(例如灰飞虱(L.striatellus)(褐色小
飞虱)));黑尾叶蝉属(Nephotettix spp.)(例如二点黑尾叶蝉(N.virescens)或黑尾
叶蝉(N.cincticeps)(青叶蝉)或二条黑尾叶蝉(N.nigropictus)(稻叶蝉));白背飞
虱属(Sogatella spp.)(例如白背飞虱(S.furciera)(白背飞虱));禾草螟属(Chilo
spp.)(例如二化螟(C.suppressalis)(水稻二化螟)、台湾稻螟(C.auricilius)(金
线二化螟)或稻多丽螟(C.polychrysus)(台湾稻螟));蛀茎夜蛾属(Sesamia spp.)
(例如大螟(S.inferens)(粉红色稻螟));蛀禾螟属(Tryporyza spp.)(例如稻白螟
(T.innotata)(白稻螟)或三化螟(T.incertulas)(黄稻螟));花象属(Anthonomus
spp.)(例如棉铃象甲(A.grandis)(棉铃象鼻虫));猿叶甲属(Phaedon spp.)(例如辣
根猿叶甲(P.cochleariae)(芥菜叶甲虫));食植瓢虫属(Epilachna spp.)(例如墨西
哥豆瓢虫(E.varivetis)(墨西哥豆甲虫));拟谷盗属(Tribolium spp.)(例如赤拟谷
盗(T.castaneum)(红色地板甲虫));根萤叶甲属(Diabrotica spp.)(例如西方玉米
根萤叶甲(D.virgifera virgifera)(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(D.barberi)(北
方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi)(南方玉米根
虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgifera zeae)(墨西哥玉米根虫);秆野螟属(Ostrinia
spp.)(例如欧洲玉米螟(O.nubilalis)(欧洲玉米螟(European corn borer)));呆蓟
马属(Anaphothrips spp.)(例如玉米黄呆蓟马(A.obscrurus)(草蓟马));红铃麦蛾
属(Pectinophora spp.)(例如棉红铃虫(P.gossypiella)(粉红色棉铃虫));实夜蛾属
(Heliothis spp.)(例如烟芽夜蛾(H.virescerns)(烟草蚜虫));粉虱属(Trialeurodes
spp.)(例如纹翅粉虱(T.abutiloneus)(结翅粉虱)、温室白粉虱(T.vaporariorum)
(温室粉虱));小粉虱属(Bemisia spp.)(例如叶粉虱(B.argentifolii)(银叶白粉
虱));蚜属(Aphis spp.)(例如棉蚜(A.gossypii)(棉花蚜虫));草盲蝽属(Lygusspp.)
(例如牧草盲蝽(L.lineolaris)(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(L.hesperus)(西方无泽
盲蝽));美洲蝽属(Euschistus spp.)(例如斑点美洲蝽(E.conspersus)(具散点的椿
象));Chlorochroa spp.(例如佐井氏蝽(C.sayi)(佐井氏椿象(Say stinkbug)));绿
蝽属(Nezara spp.)(例如稻绿蝽(N.viridula)(南方绿椿象));蓟马属(Thrips spp.)
(例如烟蓟马(T.tabaci)(葱蓟马));花蓟马属(Frankliniella spp.)(例如烟草褐蓟马
(F.fusca)(烟蓟马)或西花蓟马(F.occidentalis)(西花蓟马));蟋蟀属(Acheta spp.)
(例如家蟋蟀(A.domesticus)(室内蟋蟀));瘤蚜属(Myzus spp.)(例如桃蚜(Mpersicae)
(绿桃蚜));长管蚜属(Macrosiphumspp.)(例如马铃薯长管蚜(M euphorbiae)(马铃薯
蚜));土长蝽属(Blissus spp.)(例如麦长蝽(B.leucopterus leucopterus)(麦小蝽));
拟缘蝽属(Acrosternum spp.)(例如拟绿蝽(A.hilare)(绿椿象));稻螟属(Chilotraea
spp.)(例如稻多丽螟(C.polychrysa)(稻茎螟));稻水象属(Lissorhoptrus spp.)(例
如稻水象甲(L.oryzophilus)(稻水象鼻虫));缢管蚜属(Rhopalosiphum spp.)(例
如玉米蚜(R.maidis)(玉米叶蚜));以及圆尾蚜属(Anuraphis spp.)(例如玉米根蚜
(A.maidiradicis)(玉米根蚜))。
[0256] 根据更具体的实施例,本发明可适用于属于叶甲科或叶甲虫科的物种。金花虫科甲虫(如科罗拉多马铃薯甲虫、跳甲、玉米根虫)和象鼻虫科(如苜蓿象鼻虫)是特别重
要的害虫。根据本发明进行控制的特定马铃薯叶甲属物种包括科罗拉多马铃薯甲虫(马
铃薯叶甲)和伪马铃薯甲虫(伪马铃薯叶甲)。CPB是针对我们国产马铃薯、其他培养的
和野生的带茎和不带块茎的马铃薯物种以及其他茄属(茄属植物)植物物种的的一类
(严重的)害虫,这些物种包括作物物种番茄、茄子、胡椒、烟草(烟草属物种,包括观赏植物)、地樱桃、水稻、玉米或棉花;以及杂草/药草物种,卡罗来纳茄、常见茄属植物、曼陀罗、天仙子以及刺萼茄。玉米根虫包括在根萤叶甲属中所发现的物种(例如黄瓜十一星
叶甲(D.undecimpunctata undecimpunctata)、黄瓜十一星叶甲食根亚种、长黄瓜甲虫
(D.longicornis)、西方玉米根虫(D.virgifera)以及黄瓜条叶甲(D.balteata))。玉米根
虫对玉米和瓜类造成了重大损害。
[0257] 根据一个更具体的实施例,本发明可适用于属于半翅目(蚜总科)的物种,如桃蚜(绿桃蚜、蚕豆蚜(Aphis fabae)(黑豆蚜虫)、豌豆蚜(Acyrthosiphum pisum)(豌豆蚜
虫)、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)(甘蓝蚜虫)、麦长管蚜(Sitobion avenae)(谷类蚜
虫)、埃二尾蚜(Cavariella aegopodii)(胡萝卜蚜虫)、豆蚜(Aphis craccivora)(落花
生蚜虫)、棉蚜(Aphis gossypii)(棉花蚜虫)、桔二叉蚜(Toxoptera aurantii)(黑色柑
桔蚜虫)、二尾蚜属(Cavariella spp)(柳蚜)、毛蚜属(Chaitophorus spp)(柳叶蚜虫)、
长足大蚜属(Cinara spp.)(黑色松蚜虫)、枫长镰管蚜(Drepanosiphum platanoides)(美
国梧桐蚜虫)、高蚜属(Elatobium spp)(云杉蚜虫),它们对以下各植物造成损害:如李属
树,特别是桃树、杏树以及李树;主要培养用于生产木材的树,如柳树和白杨;行栽作物,如玉米、棉花、黄豆、小麦以及水稻;茄科、藜科、菊科、十字花科以及葫芦科的蔬菜作物,包括(但不限于)朝鲜蓟、芦笋、菜豆、甜菜、西兰花、球芽甘蓝、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、香瓜、芹菜、玉米、黄瓜、小茴香、羽衣甘蓝(kale)、大头菜、芜菁、茄子、莴苣、芥菜、秋葵、欧芹、欧洲防风草、豌豆、胡椒、马铃薯、萝卜、菠菜、南瓜、番茄、芜菁、水田芥以及西瓜;或田地作物,如(但不限于)烟草、糖用甜菜以及向日葵;花卉作物或其他观赏植物,如松树和针叶树。其
他半翅类昆虫属于褐飞虱属(例如褐飞虱、白背飞虱)并且对水稻植物造成损害。其他半
翅类昆虫属于草盲蝽属(例如豆荚草盲蝽、长毛草盲蝽(Lygus rugulipennis)、牧草盲蝽、Lygus sully以及盲蝽科的其他植食性昆虫物种,并且对以下植物造成损害:棉花、马铃薯植物、草莓、棉花、苜蓿、卡诺拉、桃树、李树、葡萄树、莴苣、茄子、洋葱、青豆。若干地中海树和若干观赏树也一样,如榆树(榆属(Ulmus spp.))、松仁(意大利伞松(Pinus Pinea))、
英国梧桐(二球悬铃木(Platanus Acerifolia))、白紫荆(Malus alba)。其他半翅类昆虫
属于蝽科,它们通常被称作盾虫、丘斯特臭虫(chust bug)以及椿象(例如棕色大理石纹
椿象(茶翅蝽(Halyomorpha halys))、具散点的椿象(斑点美洲蝽)、南方绿椿象(稻绿
蝽(Nezara viridula))、森林红蝽(红足真蝽(Pentatoma rufipes))、卷心菜斑色蝽(卷
心菜斑色蝽(Murgantia histrionica))、稻椿象(美洲稻蝽(Oebalus pughax)))并且对
以下各项造成损害:水果,包括苹果、桃、无花果、桑椹、柑桔类水果以及柿子、黑莓;以及蔬菜,包括甜玉米、蕃茄、大豆、利马豆及青椒、甘蓝、花椰菜、芜箐、辣根、羽衣甘蓝(collard)、芥菜、球芽甘蓝、马铃薯、茄子、秋葵、菜豆、芦笋、甜菜,杂草、果树,以及田地作物,例如田地玉米和大豆。椿象也是草、高粱以及水稻的一种害虫。
[0258] 有待用于本发明的方法中的植物或根据本发明的转基因植物涵盖任何植物,但优选地是对植物致病性昆虫的侵扰敏感的一种植物。
[0259] 因此,本发明扩展到如在此所描述的植物和方法,其中该植物选自以下植物(或作物)的组:苜蓿、苹果、杏子、朝鲜蓟、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、球芽甘蓝、甘蓝、卡诺拉、胡萝卜、木薯、花椰菜、谷物、芹菜、樱桃、柑桔、克菜氏小柑橘(clementine)、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、茄子、菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、地樱桃、奇异果、莴苣、韭葱、柠檬、酸橙、松树、玉蜀黍、芒果、甜瓜、粟、蘑菇、坚果燕麦、秋葵、洋葱、橙子、观赏植物或花卉或树、番木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、豌豆(peat)、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜籽、覆盆子、水稻、黑麦、高粱、黄豆、大豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、橘子、茶、烟草、番茄、藤本植物、西瓜、小麦、薯蓣以及小西葫芦。
[0260] 在特定实施例中,本发明提供了靶基因,这些靶基因编码涉及wings up A(肌钙蛋白I)、线粒体细胞色素c氧化酶亚单位II蛋白或如表1中所指定的一种核糖体蛋白质的功能的蛋白质。
[0261] 在优选实施例中,本发明提供了靶基因,这些靶基因选自以下基因的组,这些基因(i)具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与
SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到
313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到
66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、
206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、
132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226 到229、
127、148、136、230到 233、128、149、184、137、185、234 到 237、302到 305、129、138、238 到
241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254 到257、
158、159、258到 261、160、161、262 到 265、163、162、164、266到 269、165、167、166、270 到
273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、
203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(ii)具有由SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、
6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到
74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中的任一个组成的一种核苷酸序列,或(iii)具有包含SEQ ID NO 1、
174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到
70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214 到217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389或其互补序列中任一个的一个至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、
450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基
因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、
47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到
66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、
206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、
132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226 到229、
127、148、136、230到 233、128、149、184、137、185、234 到 237、302到 305、129、138、238 到
241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254 到257、
158、159、258到 261、160、161、262 到 265、163、162、164、266到 269、165、167、166、270 到
273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、
203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、
63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到 221、146、125、134、222到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、
158、159、258到 261、160、161、262 到265、163、162、164、266 到 269、165、167、166、270 到
273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、
203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(iv)具有包含SEQ ID NO1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、
6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到
74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中任一个的一个至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、
50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、
600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、
7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、
322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO
1-26、121-205、386-389、394、400或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(v)具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、
174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到
70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到 217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389中的任一个所编码的氨基酸序列至少70%,优选至少75%、80%、
85%、90%、95%、98%或99%一致,或(vi)该基因为一种基因的一种昆虫害虫直向同源
物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、
294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、129、
138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314 到317、402、186、
202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两
种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、
27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、
143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、
131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226 到229、127、148、136、230 到233、128、149、184、137、185、234 到
237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致;
[0262] 并且其中所述基因的核苷酸序列不长于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。
[0263] 由本发明的靶基因编码的氨基酸序列是由SEQ ID NO 79、349、405、352、356、80、326、81、327、82、83、328、84、329、85、86、359、87 到 91、330、350、353、331、351、332 到 336、
337、354、338到344、346、345、347、348、357、355、358、390到393表示。
[0264] 如在此所使用的,术语“具有”与“包含”具有相同含义。
[0265] 如在此所使用的,术语“序列一致性”用于描述两种或更多种核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系。两个序列之间的“序列一致性”百分比是通过在一个比较窗(限定数目的位置)中比较两个最佳比对的序列来测定,其中该比较窗中的序列的部分可以包含如与参照序列相比较的插入或缺失(即,缺口)以便实现最佳比对。序列一致性百分比是通过以
下方式来计算:测定在两个序列中出现一致的核苷酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得
到‘匹配’位置的数目,用匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数并且结果乘以100。用于测定序列一致性的方法和软件在本领域中是可获得的并且包括Blast软件和GAP分析。
对于核酸,优选通过BlastN比对工具来计算一致性百分比,凭借该比对工具来计算在询问
的核苷酸序列的全长内的一致性百分比。
[0266] 本领域的普通技术人员将认识到,可以鉴定出由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、
205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、
25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到 301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389中的任一个所表示的靶基因的同源物或直向同源物(存在于不同物种中的同源物)。这
些害虫的同源物和/或直向同源物也在本发明的范围内。优选的同源物和/或直向同源物
是这样的一些基因,它们在核苷酸序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较两种基
因时,该同源物和/或直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、
181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、
140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到
58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%或85%,更优选至少90%或95%,并且最优
选至少约99%一致。类似地,同样优选的同源物和/或直向同源物是这样的一些蛋白质,它们在氨基酸序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该同源物
和/或直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 79到91、326-359、390-395中的任一个至少
75%,优选至少80%或85%,更优选至少90%或95%,并且最优选至少约99%一致。
[0267] 其他同源物是这样的一些基因,它们是包含如由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、
205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、
25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到 301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242 到245、152、153、
246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到
265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、
278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318 到321、386、387、
388、389中的任一个所表示的序列的基因的等位基因。其他优选的同源物是相比于包含如
由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到
313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到
50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、
21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、
214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到 229、127、
148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238 到241、
150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254 到257、158、
159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、165、167、166、270到273、
168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、
306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个所表示的序列的基因,包含至少一种单核苷酸多态性(SNP)的基因。
[0268] 本发明的‘干扰核糖核酸(RNA)’涵盖了能够使靶基因的表达下调或‘沉默’的任何类型的RNA分子,包括(但不限于)有义RNA、反义RNA、短干扰RNA(siRNA)、微小
RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、发夹RNA(RNA)等。用于测定功能性干扰RNA分子的方法在
本领域中是众所周知的并且被披露于在此的其他地方。
[0269] 本发明的干扰RNA分子通过结合于靶基因内的靶核苷酸序列来实现靶基因表达的序列特异性下调。结合发生的原因是干扰RNA与靶核苷酸序列的互补区之间的碱基配
对。如在此所使用的,术语‘沉默元件’是指包含与靶基因内的靶核苷酸序列互补或至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成的干扰RNA的部分或区域,并且该部分或区域作为干扰
RNA的活性部分起作用以指导所述靶基因表达的下调。在本发明的一个实施例中,该沉默元件包含与靶基因内的靶核苷酸序列互补的具有至少17个连续核苷酸,优选至少18或19个
连续核苷酸,更优选至少21个连续核苷酸,甚至更优选至少22、23、24或25个连续核苷酸
的序列或由其组成。
[0270] 如在此所使用的,“靶基因表达”是指由靶基因编码的RNA转录物的转录和积累和/或mRNA翻译成蛋白质。术语‘下调’意图指干扰RNA分子借以降低由靶基因产生的初级RNA转录物、mRNA或蛋白质水平的本领域己知的方法中的任何一种。在某些实施例中,下
调是指借以使由一种基因产生的RNA或蛋白质的水平降低至少10%,优选至少33%,更优
选至少50%,又更优选至少80%的一种情况。在特别优选的实施例中,下调是指如与适当
控制的昆虫害虫(例如尚未暴露于干扰RNA或已经暴露于对照的干扰RNA分子的昆虫害
虫)相比,在昆虫害虫细胞内由一种基因产生的RNA或蛋白质的水平的至少80%,优选至
少90%,更优选至少95%,并且最优选至少99%的降低。用于检测RNA或蛋白质水平的降
低的方法在本领域中是众所周知的,并且包括RNA溶液杂交、Northern杂交、逆转录(例如
定量RT-PCR分析)、微阵列分析、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及Western印迹。
在本发明的另一个实施例中,下调是指如与适当的害虫控制相比,RNA或蛋白质水平降低到足以导致害虫表型的可检测的变化,例如细胞死亡、生长停止等。因此,可以使用本领域中的常规技术,通过昆虫害虫的表型分析来测量下调。
[0271] 在本发明的一个优选实施例中,干扰RNA通过RNA干扰或RNAi来下调基因表达。RNAi是典型地由双链RNA分子(如短干扰RNA(siRNA))所介导的一种序列特异性基因调控
方法。siRNA包含通过与反义RNA链互补碱基配对而退火的一个有义RNA链。siRNA分子
的有义链或‘引导链’包含与位于靶基因的RNA转录物内的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
因此,siRNA的有义链能够通过沃森一克里克型(Waston-Crick-type)碱基配对与RNA转录
物退火,并且靶向该RNA以在称为RNAi诱导沉默复合物或RISC的细胞复合物内降解。因
此,在本发明的优选的干扰RNA分子的情况下,如在此所提及的沉默元件可以是包含退火
的互补链的双链区,其中至少一条链包含与靶基因内的靶核苷酸序列互补或至少部分地互
补的核苷酸序列或者由其组成。在一个实施例中,该双链区具有至少21、22、23、24、25、30、
35、40、50、55、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、
1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个碱基对的长度。
[0272] 在本发明的范围内还考虑了更长的双链RNA(dsRNA)分子,这些分子包含一个或多个如在此的其他地方所描述的功能性双链沉默元件并且能够发生RNAi介导的基因沉
默。这类更长的dsRNA分子包含至少80、200、300、350、400、450、500、550、600、700、800、
900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个碱基对。这些dsRNA分子可以充当活性siRNA分子的前体,这些活性siRNA分子引导RNA转录物至RISC复合物以进行随后
的降解。存在于生物体或其细胞周围的环境中的dsRNA分子可以被生物体摄取并且被称
为Dicer的酶加工以得到siRNA分子。可替代地,dsRNA可以在体内产生,即由存在于细胞
(例如细菌细胞或植物细胞)内的编码该dsRNA的一种或多种多核苷酸转录,并且在摄入
了更长的前体dsRNA后,然后通过宿主细胞内或优选在昆虫害虫细胞内的Dicer加工。该
dsRNA可以由借助于互补碱基配对而退火的两条单独的(有义和反义)RNA链形成。可替代
地,dsRNA可以是一条单链,它能够自身重新折叠以形成发夹RNA(RNA)或茎环结构。在一
条RNA的情况中,双链区或‘茎’是由该RNA的两个区域或区段形成,这些区域或区段基本上是彼此的反向重复并且具有足够的互补性以允许形成一个双链区。在该分子的这个‘茎区
域’中可以存在一个或多个功能性双链沉默元件。反向重复区域典型地被RNA中称为‘环’区的一个区域或区段隔开。这个区域可以包含任何赋予足够柔性以允许在RNA的侧翼互补
区域之间发生自配对的核苷酸序列。总体而言,该环区实质上是单链的并且充当反向重复
之间的间隔子元件。
[0273] 本发明的所有干扰RNA分子通过结合于靶基因内的靶核苷酸序列来实现靶基因表达的序列特异性下调。结合发生的原因是干扰RNA的沉默元件与靶核苷酸序列之间的互
补碱基配对。本发明的干扰RNA分子包含至少一个或至少两个沉默元件。在本发明的一个
实施例中,该靶核苷酸序列包含如由靶基因的RNA转录物所表示的核苷酸序列或其片段,
其中该片段优选地是至少17个核苷酸,更优选至少18、19或20个核苷酸,或最优选至少
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、
200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、
1500、2000或3000个核苷酸。在本发明的一个优选实施例中,靶核苷酸序列包含等效于
由选自下组的任一个多核苷酸所编码的RNA转录物的一种核苷酸序列,该组由以下各项组
成:(i)包含如由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、
141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、
19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75 到78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、129、
138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250 到253、156、157、
254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266 到269、165、167、
166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到 281、200、201、314到317、402、
186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个所表示的核苷酸序列的至少21个,优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、
60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、
800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸的一种多核苷酸,或(ii)由如由SEQ ID NO 1、
174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到 297、310到313、401、3、4、
31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、
51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到
70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214 到217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个所表示的核苷酸序列的至少21个,优选至少 22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、
200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、
1500、2000或3000个连续核苷酸组成的一种多核苷酸,
[0274] 或(iii)包含如在SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、
18、59到 62、19、20、63到 66、21、22、67到 70、23、24、71到 74、25、26、75到 78、143、121、
142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、
210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、
147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到277、172、173、278 到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个所表示的核苷酸序列的至少21个,优选至少22、23或24、25、26、27、28、29、30、35、40、
45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、
600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的一种多核苷酸,由此当最佳地比对并且比较两种序列时,所述多核苷酸与SEQ ID NO 1、174、404、
180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、
139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、
15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、
24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、
298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214 到217、124、
133、218到 221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226到 229、127、148、136、230 到
233、128、149、184、137、185、234到 237、302 到305、129、138、238 到 241、150、151、242 到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到 281、200、201、314到 317、402、186、202、187、203、306 到 309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、
95%、98%或99%一致,或(iv)包含如在SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、
27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、
143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、
131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、134、
222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、
250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、
314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个所表示的核苷酸的一个至少21个,优选至少22、23或24、25、26、27、28、29、30、
35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、
500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种多核苷酸,并且其中所述片段或所述互补序列具有一种核苷酸序列以使得当
将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到
297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、
282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、
9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、
17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、
142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、
210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、
147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到 277、172、173、278到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,
[0275] 由如在SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、
19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到 78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、129、
138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314 到317、402、186、
202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个所表示的核苷酸的一个至少21个,优选至少22、23或24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、
70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、
900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段组成的一种多核苷酸,并且其中所述片段或所述互补序列具有一种核苷酸序列,当将所述片段与SEQ ID NO
1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到 313、401、3、
4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、
14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、
67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、
286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到
217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、
230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238 到241、150、151、
242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到
261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、
274到277、172、173、278到281、200、201、314到 317、402、186、202、187、203、306到309、
318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到 313、401、3、4、31到 34、139、5、6、35到 38、140、7、8、39到 42、9、10、43到 46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(vi)编码一种氨基酸序列的一种多核苷酸,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、
4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、
14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、
67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、
286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到
217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、
230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238 到241、150、151、
242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到
261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、
274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个所编码的氨基酸序列至少70%,优选至少75%、80%、
85%、90%、95%、98%或99%一致。在以上的一个更优选的实施例中,所述多核苷酸不长于
10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。
[0276] 优选地,本发明的干扰RNA分子包含至少一个双链区,典型地是该干扰RNA的沉默元件,它包含通过与反义RNA链互补碱基配对而退火的有义RNA链,其中dsRNA分子的有义
链包含与位于靶基因的RNA转录物内的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0277] 沉默元件或其至少一条链(当沉默元件为双链时)可以与靶基因的靶核苷酸序列完全地互补或部分地互补。如在此所使用的,术语“完全地互补”意指沉默元件核苷酸序列的所有碱基都与靶核苷酸序列的碱基互补或‘匹配’。术语“至少部分地互补”意指沉默元件的碱基与靶核苷酸序列的碱基之间存在小于100%的匹配。本领域的技术人员将理解,为了介导靶基因表达的下调,沉默元件仅需要与靶核苷酸序列至少部分地互补。本领域已知,相对于靶序列而具有插入、缺失以及错配的RNA序列在RNAi方面仍然可以有效。根据本发
明,优选的是,沉默元件与靶基因的靶核苷酸序列共有至少80%或85%的序列一致性,优
选至少90%或95%的序列一致性,或更优选至少97%或98%的序列一致性并且再更优选
至少99%的序列一致性。可替代地,在24个部分地互补的核苷酸的每个长度上,如与靶核
苷酸序列相比,沉默元件可以包含1、2或3个错配。
[0278] 本领域的普通技术人员将了解,沉默元件与靶核苷酸序列之间共有的互补性程度可以取决于有待下调的靶基因或者取决于基因表达有待控制的昆虫害虫物种而改变。
[0279] 在发明的另一个实施例中,沉默元件包含一种核苷酸序列,该核苷酸序列为选自下组的任一个多核苷酸的RNA等效物,该组由以下各项组成:包含如由SEQ ID NO 1、174、
404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到
34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到
54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、
23、24、71到 74、25、26、75 到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206 到 209、286 到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到 217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389或其到补序列中的任一个所表示的核苷酸序列的至少21个,优选至少 22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、
200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸的一种多核苷酸,或(ii)包含如在SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、
27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、
143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、
131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、134、
222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、
250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到 265、163、162、164、
266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、200、
201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个所表示的核苷酸序列的至少21个,优选至少22、23或24、25、26、27、28、
29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、
450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的一种多核苷酸,由此当最佳地比对并且比较两种序列时,所述多核苷酸与SEQ ID NO
1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310 到313、401、3、
4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、
14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、
67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、
286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到
217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、
230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238 到241、150、151、
242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到
261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、
274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、
95%、98%或99%一致,或(iii)包含如在1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、
282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、
9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、
17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、
142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、
210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、
147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到277、172、173、278 到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个所表示的核苷酸的一个至少21个,优选至少22、23或24、25、26、27、28、29、30、35、40、
45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、
600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种多核苷酸,并且其中所述片段或所述互补序列具有一种核苷酸序列以使得当将所述
片段与SEQ ID NO 1-26、121-205、386-389、394、400中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、
282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、
9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、
17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、
142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、
210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、
147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到277、172、173、278 到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,其中所述多核苷酸不长于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。
应了解,在这样的实施例中,沉默元件可以包含一个双链RNA区域或由其组成,该区域包含退火的互补链,其中一条链,即有义链,包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列。
[0280] 靶核苷酸序列可以选自靶基因或其RNA转录物的任何合适区域或核苷酸序列。举例来说,靶核苷酸序列可以位于靶基因或RNA转录物的5′UTR或3′UTR内,或者基因的
外显子或内含子区域内。
[0281] 本领域的技术人员熟知在全长靶基因背景下鉴定最合适的靶核苷酸序列的方法。举例来说,可以对靶向靶基因不同区域的多种沉默元件进行合成并测试。可替代地,用如
RNAse H等酶消化RNA转录物可以被用来确定RNA上构象对基因沉默敏感的位点。靶位点
也可以使用计算机模拟(in silico)方法,例如使用被设计成基于靶向全长基因内的不同
位点来预测基因沉默效力的计算机算法进行鉴定。
[0282] 本发明的干扰RNA可以包含一个沉默元件或多个沉默元件,其中每个沉默元件包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,并且在被昆虫害
虫物种摄入后起到下调所述靶基因的表达的作用。通过引用结合在此的WO 2006/046148
中描述了这种类型的多联体RNA构建体。在本发明的上下文中,术语‘多个’意指至少两个,至少三个,至少四个等并且直到至少10、15、20个或至少30个。在一个实施例中,干扰RNA包含单一沉默元件的多个拷贝,即结合于一个特定靶基因内的一个特定靶核苷酸序列的沉
默元件的重复。在另一个实施例中,干扰RNA内的沉默元件包含与不同靶核苷酸序列互补
的不同核苷酸序列或由其组成。应该清楚的是,与结合于不同靶核苷酸序列的沉默元件组
合的相同沉默元件的多个拷贝的组合是在本发明的范围内。
[0283] 为了实现昆虫害虫物种中特定靶基因的下调的改善,不同靶核苷酸序列可以来源于一种昆虫害虫物种中的单一靶基因。在这种情况下,沉默元件在干扰RNA中可以按靶核
苷酸序列在靶基因中存在的原始顺序组合,或者如与靶基因中靶核苷酸序列的顺序相比,
沉默元件在干扰RNA的环境中可以打乱并按任何等级次序随机地组合。
[0284] 可替代地,不同靶核苷酸序列代表着单一靶基因,但来源于不同昆虫害虫物种。
[0285] 可替代地,不同靶核苷酸序列可以来源于不同靶基因。如果将干扰RNA用于预防和/或控制害虫侵扰,那么优选的是,不同靶基因是选自调控昆虫害虫物种的必需生物功
能的基因的组,这些生物功能包括(但不限于)存活、生长、发育、生殖以及致病性。靶基因可以调控相同或不同的生物途径或过程。在一个实施例中,至少一个沉默元件包含与靶基
因内的靶核苷酸序列至少部分地互补的核苷酸序列或由其组成,其中该靶基因选自如更早
描述的基因的组。
[0286] 在本发明的另一个实施例中,由不同沉默元件靶向的不同基因来源于相同的昆虫害虫物种。这种方法被设计用来实现针对单一昆虫害虫物种的增强的攻击。具体来说,不
同靶基因可以在昆虫生命周期的不同阶段,例如成熟的成虫期、未成熟的幼虫期以及卵形
期有差别地表达。因此,本发明的干扰RNA可以用于在昆虫生命周期的一个以上阶段中预
防和/或控制昆虫害虫侵扰。
[0287] 在本发明的一个替代性实施例中,由不同沉默元件靶向的不同基因来源于不同的昆虫害虫物种。因此,本发明的干扰RNA可以用于同时预防和/或控制一种以上昆虫害虫
物种的侵扰。
[0288] 沉默元件可以安排为干扰RNA的一个连续区域或者可以通过接头序列的存在加以隔开。接头序列可以包含不与任何靶核苷酸序列或靶基因互补的短的随机核苷酸序列。
在一个实施例中,该接头是条件性自切割RNA序列,优选是pH敏感性接头或疏水敏感性接
头。在一个实施例中,该接头包含与内含子序列等效的核苷酸序列。本发明的接头序列的
长度可以在从约1个碱基对到约10000个碱基对的范围内,其条件是该接头不会削弱干扰
RNA下调靶基因的表达的能力。
[0289] 除了该一个或多个沉默元件和任何接头序列之外,本发明的干扰RNA还可以包含至少一种另外的多核苷酸序列。在本发明的不同实施例中,该另外的序列选自(i)能够保
护干扰RNA免于RNA加工的序列,(ii)影响干扰RNA的稳定性的序列,(iii)允许蛋白质结
合以例如促进干扰RNA被昆虫害虫物种的细胞摄入的序列,(iv)促进大规模产生干扰RNA
的序列,(v)作为结合于受体或结合于昆虫害虫细胞表面上的分子以促进摄入的适体的序
列,或(v)催化昆虫害虫细胞中干扰RNA的加工并由此增强干扰RNA的效力的序列。用于增
强RNA分子的稳定性的结构在本领域中是众所周知的并且进一步描述在WO 2006/046148
中,该案通过引用结合在此。
[0290] 本发明的干扰RNA的长度需要足以被昆虫害虫物种的细胞摄入并且使害虫内的靶基因下调,如在此的其他地方所描述的。然而,长度的上限可以取决于(i)干扰RNA被害
虫细胞摄取的要求和(ii)干扰RNA在害虫细胞中被加工以通过RNAi途径介导基因沉默的
要求。也可以通过生产方法和用于递送干扰RNA到细胞中的配制品来制定长度。优选地,
本发明的干扰RNA的长度将在21与10000个核苷酸之间,优选在50与5000个核苷酸之间
或在100与2500个核苷酸之间,更优选长度在80与2000个核苷酸之间。
[0291] 该干扰RNA可以包含DNA碱基、非天然碱基或者糖一磷酸骨架的非天然骨架连接或修饰,例如以增强储存期间的稳定性或增强对核酸酶降解的抗性。此外,该干扰RNA可以由本领域的普通技术人员通过手动或自动反应化学地或酶促地产生。可替代地,该干扰RNA可以由编码其的多核苷酸转录。因此,在此提供了编码任一个本发明的干扰RNA的一种分
离的多核苷酸。
[0292] 在此还提供了一种分离的多核苷酸,该多核苷酸选自下组,该组由以下各项组成:(i)包含如由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到
297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、
11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、
20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、
177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到
293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、
238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到
257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、
187、203、306到309、318到321、386、387、388、389、或其互补序列中的任一个所表示的核苷酸序列的至少21个,优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、
90、100、110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、
1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的一种多核苷酸,或(ii)由如由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、
21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、
214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到 229、127、
148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238 到241、
150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254 到257、158、
159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、165、167、166、270到273、
168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、
306到309、318到321、386、387、388、389、或其互补序列中的任一个所表示的核苷酸序列的至少21个,优选至少22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、
110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100或1115个连续核苷酸组成的一种多核苷酸,或(iii)包含如在SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、
6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到
74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389、或其互补序列中的任一个中所表示的核苷酸序列的至少21个,优选至少22、23或24、
25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、
300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000 或
3000个连续核苷酸的一种多核苷酸,由此当最佳地比对并且比较两种序列时,所述多核苷
酸与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、
47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到
66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、
206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、
132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226 到229、
127、148、136、230到 233、128、149、184、137、185、234 到 237、302到 305、129、138、238 到
241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254 到257、
158、159、258到 261、160、161、262 到 265、163、162、164、266到 269、165、167、166、270 到
273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、
203、306到309、318到321、386、387、388、389、或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(iv)包含如在SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、
5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、
204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到
301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、
149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242 到245、152、
153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、
173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318 到321、386、
387、388、389、或其互补序列中的任一个中所表示的核苷酸的一个至少21个,优选至少
22、23 或 24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、
200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、
1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种多核苷酸,并且其中所述片段或所述互补序
列具有一种核苷酸序列以使得当将所述片段与SEQ ID NO 1-26、121-205、386-389、394、
400中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1-26、
121-205、386-389、394、400或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少
80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或(v)由如在SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、
175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到
38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、
55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、
26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、
137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到
249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389、或其互补序列中的任一个中所表示的核苷酸的一个至少21个,优选至少22、23或24、
25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、250、
300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000 或
3000个连续核苷酸的片段组成的一种多核苷酸,并且其中所述片段或所述互补序列具有一
种核苷酸序列以使得当将所述片段与SEQ ID NO 1-26、121-205、386-389、394、400中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、
6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到
74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到 245、152、153、
246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到
265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、
278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318 到321、386、387、
388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、
95%、98%或99%一致,或(vi)编码一种氨基酸序列的一种多核苷酸,当最佳地比对并且
比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、
27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、
143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、
131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226 到229、127、148、136、230 到233、128、149、184、137、185、234 到
237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个所编码的氨基酸序列至少70%,优选至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,并且其中所述多核苷酸不长于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。
[0293] 在优选实施例中,该分离的多核苷酸是干扰RNA分子的一部分,典型地是沉默元件的一部分,它包含至少一个双链区,该双链区包含通过与反义RNA链互补碱基配对而退
火的有义RNA链,其中dsRNA分子的有义链包含与位于靶基因的RNA转录物内的核苷酸序
列互补的核苷酸序列。因此,dsRNA的有义链能够与RNA转录物退火并且靶向该RNA以在
RNAi诱导沉默复合物或RISC内降解。
[0294] 本发明的多核苷酸可以通过常规分子克隆技术插入到本领域中已知的DNA构建体或载体中。因此,根据一个实施例,提供了包含任一个本发明的多核苷酸的DNA构建体。
优选地,在此提供了包含一种编码至少一个本发明的干扰RNA的多核苷酸的一种DNA构建
体。该DNA构建体可以是重组DNA载体,例如细菌或酵母载体或者植物载体。在本发明的
一个优选实施例中,DNA构建体是一种表达构建体并且该多核苷酸被可操作地连接到至少
一个能够驱动多核苷酸序列的表达的调控序列。术语‘调控序列’应取广义并且旨在指能够影响所可操作地连接的多核苷酸的表达的任何核苷酸序列,包括(但不限于)启动子、增强
子以及其他天然产生的或合成的转录激活元件。调控序列可以位于该多核苷酸序列的5′
或3′端。术语‘可操作地连接’是指调控序列与多核苷酸序列之间的功能性连接,该连接使得该调控序列驱动该多核苷酸的表达。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。
[0295] 优选地,该调控序列是一种启动子,该启动子选自下组,该组包括(但不限于):组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子以及生长/发育阶段特异性启动子。在一个实施例中,多核苷酸被置于强组成型启动子的控制之下,该启动子是如选自下组的任何一种,该组包括:CaMV35S启动子、双CaMV35S启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子、GOS2启动子、玄参花叶病毒34S启动子。在另一个实施例中,调控序列是用于调控植物中多核苷酸的表达的一种植物启动子。涵盖在本发明的范围内的植物启动
子,特别是组织特异性植物启动子于在此的其他地方进行了更详细地描述。
[0296] 任选地,一种或多种转录终止序列可以被合并到本发明的表达构建体中。术语‘转录终止序列’涵盖在转录单元末端处的控制序列,它发送初级转录物的转录终止、3′加工以及多聚腺苷酸化信号。另外的调控元件,包括(但不限于)转录或翻译增强子,可以被合并到表达构建体中,例如与双增强CaMV35S启动子一样。
[0297] 本发明还涵盖了一种用于产生任一种本发明的干扰RNA的方法,包括以下步骤:(i)使编码所述干扰RNA的多核苷酸或包含该多核苷酸的DNA构建体与不含细胞的组分相
接触;或(ii)将编码所述干扰RNA的多核苷酸或包含该多核苷酸的DNA构建体引入(例如
通过转化、转染或注射)到细胞中。
[0298] 因此,本发明还涉及由在此描述的多核苷酸表达产生的任何双链核糖核苷酸。
[0299] 因此,在此还提供了用在此描述的任一种多核苷酸转化的一种宿主细胞。本发明进一步涵盖了包含任一种本发明的干扰RNA、任一种本发明的多核苷酸或包含这些多核苷
酸的DNA构建体的宿主细胞。该宿主细胞可以是一种原核细胞,包括(但不限于)革兰氏
阳性和革兰氏阴性细菌细胞;或一种真核细胞,包括(但不限于)酵母细胞或植物细胞。优
选地,所述宿主细胞是一种细菌细胞或一种植物细胞。细菌细胞可以选自下组,该组包括
(但不限于)革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞,包含埃希氏菌属(Escherichia spp.)(例如
大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)(例如苏云金芽孢杆菌)、根瘤菌属(Rhizobium
spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、假单胞菌属
(Pseudomonas spp.)以及农杆菌属(Agrobacterium spp.)。本发明的多核苷酸或DNA构
建体在宿主细胞中可以作为染色体外元件存在或维持,或者可以稳定地合并到宿主细胞基
因组中。在选择为了本发明的目的的宿主细胞中的特别感兴趣的特征包括编码干扰RNA的
多核苷酸或DNA构建体可以被引入到宿主中的容易性、相容的表达系统的可用性、表达的
效率以及干扰RNA在宿主中的稳定性。
[0300] 优选地,本发明的干扰RNA是在植物宿主细胞中表达的。优选的感兴趣的植物包括(但不限于)棉花、马铃薯、水稻、番茄、卡诺拉、黄豆、向日葵、高粱、珍珠粟、玉米、苜蓿、草莓、茄子、胡椒以及烟草。
[0301] 在干扰RNA在宿主细胞中表达和/或被用于预防和/或控制宿主生物体的害虫侵扰的情况下,优选的是干扰RNA不展现出显著的‘脱靶’效应,即干扰RNA不影响宿主内的基因表达。优选地,沉默基因不展现与除靶基因的既定靶核苷酸序列之外的核苷酸序列的显
著互补性。在本发明的一个实施例中,沉默元件显示出与宿主细胞或生物体的任何基因的
小于30%,更优选小于20%,更优选小于10%并且甚至更优选小于5%的序列一致性。如
果宿主生物体的基因组序列数据是可得到的,那么人们可以使用标准的生物信息学工具交
叉检验与沉默元件的一致性。在一个实施例中,在有17个连续核苷酸的区域内,更优选在
有18个或19个连续核苷酸的区域内,并且最优选在有20个或21个连续核苷酸的区域内,
沉默元件与来自宿主细胞或宿主生物体的基因之间不存在序列一致性。
[0302] 在本发明的切实可行的应用中,本发明的干扰RNA可以用于预防和/或控制属于鞘翅目、鳞翅目、双翅目、网翅目、直翅目、半翅目以及蚤目的任何昆虫害虫。
[0303] 在此还提供了一种用于预防和/或控制害虫侵扰的方法,包括使昆虫害虫物种与有效量的至少一种干扰RNA相接触,其中该RNA在被所述害虫摄入后起到下调必需的害虫
靶基因的表达的作用。该必需的靶基因可以是涉及于调控害虫引发或维持侵扰所需的必需
生物过程的任何害虫基因,该生物过程包括(但不限于)存活、生长、发育、生殖以及致病
性。具体来说,该靶基因可以是如在此的其他地方描述的任何一种害虫基因。
[0304] 此外,在此提供了一种用于预防和/或控制作物植物田地中的昆虫害虫侵扰的方法,所述方法包括在所述植物中表达有效量的如在此所描述的干扰RNA。
[0305] 在该方法用于控制害虫侵扰的情况下,短语‘有效量’扩展至对害虫产生表型作用以使得侵扰宿主生物体的害虫生物体的数目减少和/或由害虫引起的损害量减少所需的干扰RNA的量或浓度。在一个实施例中,表型作用是害虫的死亡并且使用干扰RNA实现了如
与对照昆虫害虫相比,至少20%、30%、40%,优选至少50%、60%、70%,更优选至少80%或90%的害虫死亡率。在另一个实施例中,表型作用包括(但不限于)妨碍害虫生长、摄
食停止以及产卵减少。因此,如与对照害虫相比,侵扰宿主生物体的害虫生物体的总数目可以减少至少20%、30%、40%,优选至少50%、60%、70%,更优选至少80%或90%。可替代地,如与对照昆虫害虫相比,由昆虫害虫引起的损害可以降低至少20%、30%、40%,优选至少50%、60%、70%,更优选至少80%或90%。因此,本发明的方法可以用于实现至少20%、
30%、40%,优选至少50%、60%、70%,更优选至少80%或90%的害虫控制。
[0306] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297或310到313或者其互补序列中的任一个的至少21个
连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫
或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯
叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡
颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽
属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿
桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米
根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根
虫)。
[0307] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297或310到313或者其互补序列中的任一个的至少21个
连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫
或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯
叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡
颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽
属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿
桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米
根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米
根虫),其中这些直向同源基因编码一种蛋白质,该蛋白质所具有的氨基酸序列与如SEQ ID NO 79、349、405、352或356中的任一个中所存在的氨基酸序列至少85%、90%、92%、94%、
96%、98%、99%一致(当最佳地比对所述编码的蛋白质时)。
[0308] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 141、11、12、47到50或其互补序
列中的任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅类昆
虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃
薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如
褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲
蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根
虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西
哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。
[0309] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 141、11、12、47到50或其互补序
列中的任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅类昆
虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃
薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如
褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲
蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根
虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西
哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫),其中这些直向同源基因编码一种蛋白质,该蛋白质所
具有的氨基酸序列与如SEQ ID NO 328或84中的任一个中所存在的氨基酸序列至少85%、
90%、92%、94%、96%、98%、99%一致(当最佳地比对所述编码的蛋白质时)。
[0310] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 17、18、59到62或其互补序列中
的任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半
翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲
(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱
(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));
瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴
氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根
萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。
[0311] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 17、18、59到62或其互补序列中的
任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅
类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪
马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐
色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜
属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根
萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤
叶甲(墨西哥玉米根虫),其中这些直向同源基因编码一种蛋白质,该蛋白质所具有的氨基
酸序列与如SEQ ID NO 87中所存在的氨基酸序列至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、
99%一致(当最佳地比对所述编码的蛋白质时)。
[0312] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 19、20、63到66或其互补序列中
的任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半
翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲
(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱
(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));
瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴
氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根
萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。
[0313] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 19、20、63到66或其互补序列中的
任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅
类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪
马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐
色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜
属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根
萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤
叶甲(墨西哥玉米根虫),其中这些直向同源基因编码一种蛋白质,该蛋白质所具有的氨基
酸序列与如SEQ ID NO 88中所存在的氨基酸序列至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、
99%一致(当最佳地比对所述编码的蛋白质时)。
[0314] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 165、167、166、270到273或其互
补序列中的任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅
类昆虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马
铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例
如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽
盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米
根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西
哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表
达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 165、
167、166、270到273或其互补序列中的任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列
或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶
基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科
罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃
薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)
或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方
玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚
种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫),其中这些直向同源基因编
码一种蛋白质,该蛋白质所具有的氨基酸序列与如SEQ ID NO 347或348中的任一个中所
存在的氨基酸序列至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%一致(当最佳地比对所述编码的蛋白质时)。
[0315] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 143、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301或其互补序列中的任一个中的至少21个连续核苷酸
互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆
虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例
如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲
(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草
盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤
叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、北美玉米根虫(北方玉米根虫)、黄瓜
十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。
[0316] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 143、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301或其互补序列中的任一个中的至少21个连续核苷酸
互补的核苷酸序列或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆
虫中的直向同源靶基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例
如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶
甲(德克萨斯伪马铃薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧
草盲蝽(无泽盲蝽)或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根
萤叶甲属(例如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄
瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫),其
中这些直向同源基因编码一种蛋白质,该蛋白质所具有的氨基酸序列与如SEQ ID NO 330、
350或353中的任一个中所存在的氨基酸序列至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%一致(当最佳地比对所述编码的蛋白质时)。
[0317] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179、210到213、290到293或其互补序列中的任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列
或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶
基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科
罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃
薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)
或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方
玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚
种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。
[0318] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 145、122、144、178、131、179、210到213、290到293或其互补序列中的任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列
或由其组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶
基因的表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科
罗拉多马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃
薯甲虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)
或豆荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方
玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚
种(南方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫),其中这些直向同源基因编
码一种蛋白质,该蛋白质所具有的氨基酸序列与如SEQ ID NO 331或351中的任一个中所
存在的氨基酸序列至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%一致(当最佳地比对所述编码的蛋白质时)。
[0319] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 128、149、184、137、185、234到237、
302到305或其互补序列中的任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其
组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的
表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多
马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲
虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆
荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米
根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南
方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。
[0320] 在此描述的用以下调昆虫害虫物种中的靶基因的表达的方法中,可以使用包含至少21bp的双链RNA分子(其中一条链包含与SEQ ID NO 128、149、184、137、185、234到237、
302到305或其互补序列中的任一个中的至少21个连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其
组成)来下调鞘翅类昆虫、半翅类昆虫、鳞翅类昆虫或双翅类昆虫中的直向同源靶基因的
表达,该昆虫选自下组,该组包括(但不限于)马铃薯叶甲属(例如马铃薯叶甲(科罗拉多
马铃薯甲虫)、伪马铃薯叶甲(伪马铃薯甲虫)或胡颓子叶茄叶甲(德克萨斯伪马铃薯甲
虫));褐飞虱属(例如褐飞虱(褐色飞虱));草盲蝽属(例如牧草盲蝽(无泽盲蝽)或豆
荚草盲蝽(西方无泽盲蝽));瘤蚜属(例如桃蚜(绿桃蚜));根萤叶甲属(例如西方玉米
根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南
方玉米根虫)或墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫),其中这些直向同源基因编码一种
蛋白质,该蛋白质所具有的氨基酸序列与如SEQ ID NO 337或354中的任一个中所存在的
氨基酸序列至少85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%一致(当最佳地比对所述编码的蛋白质时)。
[0321] 。在一个实施例中,有待处理的植物经过工程改造以通过合并到其中的多核苷酸的转录在细胞内表达干扰RNA。因为害虫以植物组织为食,所以包含干扰RNA的细胞将在昆
虫的消化道中分解,并且由此将在昆虫体内散布干扰RNA,导致靶基因的下调。
[0322] 因此,根据本发明的另一个方面,提供了一种用于产生对昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的转基因植物的方法,包括以下步骤:(a)用包含编码干扰核糖核酸(RNA)的多核苷
酸的DNA构建体转化植物细胞,该干扰核糖核酸在被昆虫害虫物种摄入后起到下调所述昆
虫害虫物种中的靶基因的表达的作用,(b)从该转化的植物细胞再生一种植物;并且(c)在
适合于从该重组DNA构建体表达干扰RNA的条件下使该转化的植物生长,因此与未转化的
植物相比,所述植物对所述害虫具有抗性。
[0323] 由植物或其部分所表达的干扰RNA可以是如在此的其他地方所披露的那些中的任何一种。优选地,干扰RNA包含至少一个沉默元件或由其组成并且所述沉默元件是包含
退火的互补链的双链RNA区域,其中一条链(有义链)包含与靶基因内的靶核苷酸序列至
少地部分互补的核苷酸序列。在干扰RNA的一部分是双链的情况下,该分子的两条链可以
由至少两个单独的多核苷酸表达或者可以由编码干扰RNA的单一多核苷酸编码,该干扰
RNA具有例如在此的其他地方所描述的茎环结构或所谓的发夹结构。
[0324] 由植物或其部分所表达的干扰RNA可以靶向如在此的其他地方所描述的害虫基因中的任何一种。具体来说,靶基因可以选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO
1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、
31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、
51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到
70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到 217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258 到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389、或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、
188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、
6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到
74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、
145、122、144、178、131、179、210到 213、290 到293、123、132、214 到 217、124、133、218 到
221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、
184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、
389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致;或选自以下基因的组,这些基因具有由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、
7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、
322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到 277、172、173、278到 281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个组成的一种核苷酸序列;或选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1-26、121-205、386-389、394、400或其互补序列中任一个的一个至少20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、125、150、175、200、225、
250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、
2000或3000个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将
包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、
10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、
18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到 229、127、148、136、230 到233、128、149、184、137、185、234 到 237、302 到
305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到 253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到277、172、173、278 到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到
30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到
42、9、10、43到46、141、11、12、47 到50、13、14、51到 54、15、204、16、205、55到58、322 到
325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、
302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到
253、156、157、254到 257、158、159、258 到 261、160、161、262到 265、163、162、164、266 到
269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致;或选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到
285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、
43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、
59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到 229、127、148、136、230 到233、128、149、184、137、185、234 到 237、302 到
305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到 253、
156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到 269、
165、167、166、270到 273、168、170、169、274 到277、172、173、278 到 281、200、201、314 到
317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中任一个的一个至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、
110、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、
1100、1200、1300、1400、1500、2000或3000个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、
294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302 到305、129、
138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314 到317、402、186、
202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、
7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、
322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到
78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、
178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、146、125、
134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、
234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、
155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262 到265、163、162、
164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278 到281、
200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或
99%一致。靶基因也可以是一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、
3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、
14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、
67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、183、206到209、
286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到
217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、
230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、203、306到309、318到
321、386、387、388、389或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有
的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401、3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、
63到66、21、22、67到70、23、24、71到74、25、26、75到78、143、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233、128、149、184、137、185、234到237、302到305、129、138、238到241、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、
158、159、258到 261、160、161、262 到265、163、162、164、266 到 269、165、167、166、270 到
273、168、170、169、274到277、172、173、278到281、200、201、314到317、402、186、202、187、
203、306到309、318到321、386、387、388、389所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致。
[0325] 在一个实施例中,该靶基因
[0326] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、
404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到 297、310到313、401、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0327] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到 221、146、125、134、222到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段
的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、
121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、
179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到
225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、
294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到
301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0328] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、
183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、
123、132、214到 217、124、133、218 到221、146、125、134、222 到 225、147、126、135、226 到
229、127、148、136、230到233或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段
的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、
189、27到30、282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到
209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、
136、230到233中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸
序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、
310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到289、298 到301、145、
122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218 到221、
146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0329] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到 313、401、121、142、
176、182、130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、
126、135、226到229、127、148、136、230到233或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,
该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、
282到285、294到297、310到313、401、121、142、176、182、130、177、183、206到209、286到
289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214 到217、
124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、226到229、127、148、136、230到233所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0330] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310 到313、401、121、142、176、182、
130、177、183、206到209、286到289、298到301、145、122、144、178、131、179、210到213、290到293、123、132、214到217、124、133、218到221、146、125、134、222到225、147、126、135、
226到229、127、148、136、230到233中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少
90%、95%、98%或99%一致。
[0331] 在一个实施例中,该靶基因
[0332] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列
时,该核苷酸序列与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、
250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、
90%、95%、98%或99%一致,或
[0333] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到
245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到 261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使
得当将包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、
39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、
163、162、164、266到269、165、167、166、270到273中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到
46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到
62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到
269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、
90%、95%、98%或99%一致,或
[0334] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、
16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、
160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中任一个的一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ
ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到
50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、
21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、
270到273中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列
与SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、
12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、
157、254到257、158、159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266 到269、165、
167、166、270到273或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、
85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0335] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 3、4、31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、
150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254 到257、158、
159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度
使得当最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 3、4、
31到34、139、5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、
51到54、15、204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到
70、150、151、242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、
159、258到261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或[0336] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 3、4、31到34、139、
5、6、35到38、140、7、8、39到42、9、10、43到46、141、11、12、47到50、13、14、51到54、15、
204、16、205、55到58、322到325、17、18、59到62、19、20、63到66、21、22、67到70、150、151、
242到245、152、153、246到249、154、155、250到253、156、157、254到257、158、159、258到
261、160、161、262到265、163、162、164、266到269、165、167、166、270到273中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0337] 在一个实施例中,该靶基因
[0338] (i)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313或401、或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当最佳地比对并且比较两种序列时,该
核苷酸序列与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0339] (ii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313或401或其互补序列中任一个的
一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,或具有一种核苷酸序列以使得当将
包含所述片段的所述基因与SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313或401中的任一个最佳地比对并且比较时,所述核苷酸序列与
SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313或401或其互补序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0340] (iii)选自以下基因的组,这些基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313或401或其互补序列中任一个的
一个至少21个连续核苷酸的片段的一种核苷酸序列,并且其中当将所述片段与SEQ ID NO
1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313或401中的任一个中的相应片段最佳地比对并且比较时,所述片段的所述核苷酸序列与SEQ ID NO
1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313或401或其互补序列中的任一个的所述相应片段至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0341] (iv)为一种基因的一种昆虫害虫直向同源物,该基因具有包含SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313或401或其互补序列中的任一个的一种核苷酸序列,其中两种直向同源基因在序列方面的相似程度使得当
最佳地比对并且比较这两种基因时,该直向同源物所具有的序列与SEQ ID NO 1、174、404、
180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401所表示的序列中的任一个至少75%,优选至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致,或
[0342] (v)选自以下基因的组,这些基因具有编码一种氨基酸序列的一种核苷酸序列,当最佳地比对并且比较两种氨基酸序列时,该氨基酸序列与由SEQ ID NO 1、174、404、180、188、2、175、181、189、27到30、282到285、294到297、310到313、401中的任一个所编码的氨基酸序列至少85%,优选至少90%、95%、98%或99%一致。
[0343] 优选地,所述靶基因的核苷酸序列不长于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000或1500个核苷酸。此外,重要的是,该干扰RNA不破坏植物宿主中任何基因的表达。
[0344] 如在此所使用的,术语‘转基因植物’或‘转基因植物细胞’是指已经过基因工程化或者由已经过基因工程化从而携带外源多核苷酸序列的植物传下来的任何植物或植物细胞。‘外源’是指该多核苷酸来源于植物细胞外部的事实。典型地,该外源多核苷酸对于转基因植物来说不是天然的,即它被发现不是天然存在于植物的基因组中。
[0345] 如在此所使用的,术语‘转化’是指将外源多核苷酸分子引入到植物或其细胞中。用于将多核苷酸引入到植物中的技术在本领域中是已知的。在本发明的一个实施例中,用
多核苷酸或包含其的DNA构建体‘稳定地转化’植物,即,引入到植物细胞中的多核苷酸或DNA构建体被整合到植物的基因组中并且能够由其后代遗传。用于将多核苷酸或DNA构建
体引入到植物细胞中的转化方案可以取决于相关植物的类型而改变。合适的转化方法包括
(但不限于)显微注射、电穿孔、农杆菌介导转化以及弹道粒子加速。使用位点特异性重组
系统将多核苷酸或DNA构建体靶向插入到植物基因组的特定位置处的方法在本领域中也
是已知的。
[0346] 包含编码活性干扰RNA分子的多核苷酸的DNA构建体可以是适合于植物细胞转化的任何载体。合适的载体包括(但不限于)细菌质粒(例如根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)的Ti质粒)和病毒载体系统。引入到植物细胞中的DNA构建体不能对植物
有害或有毒和/或不能对以所述植物为食的更高级食物链的任何生物体有害或有毒。
[0347] 在一个实施例中,DNA构建体是包含编码干扰RNA的多核苷酸的一种表达构建体,该干扰RNA可操作地连接到一种能够驱动植物中多核苷酸序列的表达的调控序列,如选自
下组的任一种,该组包括:CaMV35S启动子、双CaMV35S启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖二磷酸羧化酶启动子、GOS2启动子、玄参花叶病毒34S启动子以及双重增强的
CaMV35S启动子。优选地,该调控序列是选自本领域中已知的那些的一种植物启动子。在
一些实施例中,可以优选的是,植物仅在将与昆虫害虫物种相接触和/或被昆虫害虫物种
损害的植物部分(例如植物的地上部分、根等)中产生干扰RNA分子。这种作用可以通过
使用组织特异性植物启动子来实现,这些组织特异性植物启动子包括(但不限于)本领域
中已知的叶特异性启动子、根特异性启动子、茎特异性启动子、花特异性启动子以及果实特异性启动子。根特异性启动子的合适的实例是PsMTA和第III类几丁质酶启动子。叶和茎
特异性或光合作用组织特异性启动子(也是光敏化的)的实例是来自糖用甜菜的两种叶绿
素结合蛋白(cab1和cab2)、由rbcS编码的核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)、叶绿体甘油
3-磷酸脱氢酶的A(gapA)和B(gapB)亚单位的启动子、编码叶和茎特异性(ST-LS1)蛋白质
的马铃薯(Solanum tuberosum)基因的启动子、茎调控性防御诱导型基因的启动子(例如
JAS启动子)、花特异性启动子(如查酮合酶启动子)以及果实特异性启动子(如来自草
莓RJ39的启动子)。
[0348] 在其他实施例中,可以优选的是,植物仅在其生长的特定阶段产生干扰RNA分子。这种作用可以通过使用仅在植物发育的某些阶段期间驱动表达的发育特异性植物启动子
来实现。具体来说,重要的是在植物生长的早期阶段期间或在开花(例如在水稻的情况下)
期间或在结果或果实成熟或充种期间保护植物免受害虫侵扰,因为这是植物可能受到最严
重损害的时间。
[0349] 根据本发明方法用于转化植物的DNA构建体可以包含一种以上编码本发明的干扰RNA分子的多核苷酸。在一个实施例中,不同的多核苷酸可以编码出靶向同一靶基因内
的不同核苷酸序列的干扰RNA分子。在另一个实施例中,不同的多核苷酸可以编码出靶向
不同靶基因内的不同核苷酸序列的干扰RNA分子,其中这些不同靶基因来源于相同或不同
的昆虫害虫物种。在DNA构建体编码一种以上干扰RNA的情况下,可以通过处于在如在此
的其他地方所描述的不同组织特异性启动子序列的控制下来使这些RNA在植物的不同组
织中有差别地表达。在一个实施例中,植物经过工程改造以在叶中表达使以叶为食的昆虫
中的靶基因的表达下调的干扰RNA,并且另外地在根中表达使在土壤中定殖并以植物根为
食的昆虫中靶基因的表达下调的干扰RNA。
[0350] DNA构建体还可以包含至少另一种感兴趣的多核苷酸,例如编码另外的调控RNA分子的多核苷酸、编码对昆虫害虫物种有毒的蛋白质的多核苷酸和/或编码赋予除草剂
性或耐受性的蛋白质的多核苷酸。
[0351] 根据本发明的方法,使用本领域己知的技术由转化的植物细胞使植物再生。一种此类技术包括酶促消化植物细胞壁以产生植物原生质体,该原生质体可以随后经历多轮细
胞分裂和分化以产生成年植物。随后可以对以此方式产生的成年植物对害虫侵扰的抗性进
行测试。如在此所使用的‘抗性’应该从广义上解释并且是指植物针对来自典型地能够对植物造成损害或损失的害虫的攻击进行防御的能力。抗性可以是意指植物不再对害虫侵扰敏
感或者由害虫侵扰所造成的任何疾病症状减少至少约20%,优选至少30%、40%或50%,
更优选至少60%、70%或80%,并且最优选至少90%。测量植物对昆虫害虫物种的抗性的
技术在本领域中通常是已知的,并且包括(但不限于)测量随时间推移的平均病变直径、害
虫生物量或重量、害虫存活率和/或死亡率,和/或腐烂的植物组织的总百分比。
[0352] 在一个实施例中,产生转基因植物的本发明方法还包括由转基因植物产生子代或后代并测试该后代对昆虫害虫的抗性的步骤。可以产生两代或更多代以确保抗性性状的表
达得到稳定地维持并遗传。也可以从亲本转基因植物和/或其后代收获种子以测试对昆虫
害虫的抗性。
[0353] 本发明中还涵盖一种用于产生对昆虫害虫物种的侵扰具有抗性的转基因植物的方法,包括以下步骤:使携带了编码干扰RNA(它起到下调害虫靶基因的表达的作用)的
DNA构建体的第一转基因植物与缺少所述DNA构建体的第二植物杂交,并且选择对所述害
虫具有抗性的后代。杂交可以通过在植物育种背景下常规使用的任何方法进行。针对害虫
抗性所选择的后代可以另外地自花授粉或‘自交’而产生下一代的害虫抗性后代。在一个
实施例中,可以进行多轮自花授粉或自交以产生2、3、4、5或更多代的后代。可以测试所得后代的害虫抗性以确保稳定地维持并遗传抗性性状的表达。
[0354] 在另一个实施例中,由携带感兴趣的DNA构建体的第一转基因亲本植物与缺少所述DNA构建体的第二亲本植物的杂交得到的任何害虫抗性后代植物可以与第二亲本植物
回交,并且随后测试后代对害虫侵扰的抗性。可以通过如在此的其他地方所描述的表型分
析或通过标准分子技术来测试植物或其后代对害虫侵扰的抗性。举例来说,可以通过对编
码干扰RNA的多核苷酸序列的存在进行检测来鉴定害虫抗性植物,该干扰RNA在被昆虫害
虫物种摄入后起到下调靶基因的表达的作用。用于检测细胞内特定多核苷酸序列的存在的
技术在本领域中是已知的,并且包括PCR、酶促消化以及SNP分析。
[0355] 本发明的方法可以用于产生‘堆积转基因的’植物,这些植物对昆虫害虫物种具有抗性并且任选地具有至少另一种所希望的性状。如在此所使用的,‘堆积’转基因的植物是指携带了一种以上外源多核苷酸序列的植物。短语‘一种以上’是指植物携带至少2种、至少3种、至少4种外源多核苷酸的可能性。在一个实施例中,用编码靶向害虫基因的干扰RNA的DNA构建体转化的植物细胞可以预先被工程改造成携带一种单独的外源多核苷酸。可替代地,如在此所描述的由植物细胞产生转基因植物的方法可以包括共转化方案,其中编码
本发明的干扰RNA的DNA构建体是与单独的外源多核苷酸同时或依次递送到植物细胞。
[0356] 呈现出害虫抗性的堆积转基因的植物也可以由标准植物育种技术产生。在一个实施例中,使第一害虫抗性转基因植物与工程改造成表达一种赋予所希望的植物性状的外源
多核苷酸或异源基因的第二植物杂交。可以针对害虫抗性和另外的所希望的性状的获得对
所产生的任何后代进行测试。可替代地或者另外地,由杂交产生的任何害虫抗性后代可以
与第二亲本回交以产生另一个后代,该后代可以被选择用于遗传该第二亲本所携带的异源
基因,并且因此遗传该另外的所希望的的植物性状。由本发明的堆积转基因的植物所携带
的外源多核苷酸可以在植物的相同部分中表达或者可以根据不同组织特异性启动子控制
每一个的表达的事实有差别地表达。
[0357] 在一个实施例中,赋予另一种所希望的性状的外源多核苷酸或异源基因编码另一种靶向相同或不同昆虫害虫物种的干扰RNA。在又一个实施例中,该异源基因编码对植物昆虫害虫物种有害或有毒的蛋白质,例如选自下组的杀虫蛋白,该组包括(但不限于)苏云金
芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白、球形芽孢杆菌杀虫蛋白以及VIP杀虫蛋白,如选自下组的蛋白质,该组包括(但不限于)Cry1Ab、Cry1C、Cry2Aa、Cry3、CryET70、Cry22、CryET33、CryET34、CryET80、CryET76、TIC100、TIC101、TIC851、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417以及PS149B1杀虫蛋白。在另一个实施例中,该异源基因编码赋予除草剂抗性或耐受性的蛋白质。赋予除草剂抗性或耐
受性的基因的实例包括Bar、赋予草甘膦抗性的EPSPS、赋予咪唑啉酮和磺脲抗性的ALS以
及赋予溴苯腈抗性的bxn。
[0358] 在此还提供了一种由通过本发明的方法产生的任何一种转基因植物产生杂交种子的方法,所述方法包括以下步骤:(i)种植从第一近交植物获得的种子和从第二近交植
物获得的种子,其中这些近交植物中至少一种是对害虫侵扰具有抗性的转基因植物,(ii)
将种子培养成开花的植物,(iii)防止第一或第二成年植物中的至少一种自花授粉,(iv)
允许在第一与第二植物之间发生异花授粉;并且(v)收获由异花授粉产生的种子。通过这
种方法产生的杂交种子和由培养所述种子产生的杂交植物在本领域的范围内。由这种方法
产生的杂交植物典型地将是遗传均匀的并且可能展现出杂种优势或杂交优势。因此,可以
通过此种方法产生具有增加产量的潜力的作物。
[0359] 本发明的转基因植物的组中包括由在此描述的任何一种方法产生的转基因植物。因此,在本发明的一个实施例中,这些转基因植物包含堆积转基因的性状,这些性状携带了赋予害虫抗性的第一外源多核苷酸和至少另一种赋予另外的所希望的植物性状的外源多
核苷酸或异源基因。该另外的异源基因可以包含编码另外的杀虫剂的基因、编码对昆虫害
虫物种有毒或有害的蛋白质的基因和/或编码如在此的其他地方所描述的赋予除草剂抗
性的蛋白质的基因。
[0360] 优选的根据本发明的转基因植物包括(但不限于)棉花、马铃薯、水稻、番茄、卡诺拉、黄豆、向日葵、高粱、珍珠粟、玉米、苜蓿、草莓、茄子、胡椒以及烟草。
[0361] 在此还提供了如在此所描述的干扰核糖核酸(RNA)或如在此所描述的DNA构建体用于预防和/或控制昆虫害虫侵扰,优选地植物昆虫害虫侵扰的用途。
[0362] 参照以下非限制性实例将进一步理解本发明。
[0363] 实例
[0364] 实例1鉴定昆虫害虫物种中的靶基因
[0365] 1.1.豆荚草盲蝽归一化的cDNA文库和在多孔板中制备dsRNA用于筛选测定
[0366] 从不同生命阶段的豆荚草盲蝽若虫中分离核酸,这些豆荚草盲蝽若虫包括刚孵TM
出的若虫、2、4、6以及9日龄的若虫以及成虫。使用SMARTer PCR cDNA合成试剂盒,遵
循制造商的说明书(Clontech目录号634925)来制备cDNA文库。使用Trimmer试剂盒
(Evrogen(Evrogen)目录号NK001)使cDNA文库归一化并且在PCR4-TOPO载体(英杰
(Invitrogen))中进行克隆。将归一化的克隆引入M2适体(Trimmer试剂盒,Evrogen,SEQ
ID NO 92:AAGCAGTGGTATCAACGCAG)中,在这些克隆的每一端处相对地定向。将重组载体构建体转化至大肠杆菌菌株TOP10(英杰)的细胞中。随后将转化的细胞稀释并且铺板,由此
获得单一集落或克隆。检查这些克隆以确保该库的克隆冗余不超过5%。在96孔深孔板中
的液体LB(Luria肉汤(Luria-broth))培养基中挑选单个克隆,并且使其在37℃下生长过
夜。这些板还包括阳性(Lh423)和阴性(FP)对照克隆。
[0367] 为了产生dsRNA,通过PCR产生含有T7启动子序列的有义和反义DNA片段。简单来说,对于每个克隆,对应地基于M2和T7-M2序列,将1μl的细菌悬浮液分配到
含有REDTaq (西格玛(Sigma)目录号D4309)以及引物oGCC2738(SEQ ID NO 93:
AAGCAGTGGTATCAACGCAG)和oGCC2739(SEQ ID NO 94:GCGTAATACGACTCACTATAGGAAGCAGTGGT
ATCAACGCAG)的多孔PCR板中。在PCR反应之后进行体外转录,其中对于每个克隆,将6μl
TM
的PCR产物添加到9μl的RiboMAX 大规模RNA生产系统一T7(普洛麦格(Promega)目录
号P1300)中并且在37℃下孵育过夜。在含有15%蔗糖和5μg/μl酵母tRNA(英杰目录
号15401-029)的豆荚草盲蝽蔗糖饲料中将最终dsRNA溶液稀释2倍,并且用于筛选。相应
于阳性Lh423对照克隆的dsRNA是SEQ ID NO 101并且相应于阴性FP对照克隆的dsRNA
是SEQ ID NO 104(参见表4)。
[0368] 1.2.使用dsRNA表达cDNA文库筛选新颖并且有效的豆荚草盲蝽靶基因
[0369] 已经开发出一种针对有效豆荚草盲蝽靶的新的筛选测定。该测定设置如下:96孔板的每个孔容纳一只一日龄的豆荚草盲蝽若虫,使其在tRNA存在下暴露于含有蔗糖饲料
石蜡膜小袋中,该蔗糖饲料包括测试dsRNA或对照dsRNA。每个板含有来自90种不同克
隆的dsRNA、3×Lh423(阳性对照)以及3×FP(荧光蛋白;阴性对照)。在三个板上重复每
个克隆(测试dsRNA)。在暴露三天之后,记录若虫的存活数目并且用不存在dsRNA的新鲜
饲养(复合)饲料替换该饲料。在第4天、第6天以及第8天评定死亡率。第一和第二轮
确认测定使用相同的设置,并且对应地具有8只和20只昆虫,每孔一只若虫。
[0370] 使用相应于Lh423靶的dsRNA作为阳性对照并且用荧光蛋白dsRNA作为阴性对照来验证该测定系统:对应地,在90%以上是真阳性并且在5%以下是假阳性
[0371] 已经测试了含有1800个单独的克隆的命名为Lh001到Lh020(参见图1和2的底线)的二十个96孔板。在第一轮确认测定中鉴定并测试了205种候选物。设置临界值在
显示≥50%的死亡率,鉴定出41个独立的克隆并且使其进展到第二轮确认。在该测定中,
将这些克隆与阳性对照Lh423(RpL19)和Lh105.2(Sec23)以及阴性对照Pt(编码珊瑚荧
光蛋白)相比较。相应于阳性(Lh423)对照克隆的dsRNA是SEQ ID NO 101,相应于阳性
Lh105.2对照克隆的dsRNA是SEQ ID NO 102并且相应于阴性(Pt)对照克隆的dsRNA是
SEQ ID NO 104(参见表4)。
[0372] 针对第一次确认中显示≥50%的死亡率的所有测试dsRNA开始第二轮确认测定,每一测试dsRNA测试20只昆虫(图1和2)。用“Lhxxx数字”命名相应于确认的测试dsRNA
的候选靶(参见表1)。使用≥50%的死亡率的相同截止值,在第一次筛选中确认了15个
靶。
[0373] 进行第二次筛选以鉴定更多的豆荚草盲蝽靶。第二轮确认测定的结果呈现在图14中。使用≥50%的死亡率的相同截止值,在第二次筛选中确认了若干靶(参见表1C)。
[0374] 1.3.草盲蝽靶的鉴定
[0375] 在确认昆虫测定的同时,给相应于阳性克隆的插入物测序并且使用针对果蝇和拟谷盗蛋白数据库的BlastX搜索来确认靶的一致性。表1提供了新颖鉴定的豆荚草盲蝽靶
序列的生物信息分析和当前注释的概述。
[0376] 在第一次筛选中鉴定出十五种新颖的豆荚草盲蝽靶并且在第二次筛选中鉴定出11种新颖的豆荚草盲蝽靶。所有靶都展现出针对豆荚草盲蝽若虫的高效能,表明包含在其
中的编码双链RNA的cDNA对于害虫存活来说是必需的并且因此代表了为了害虫控制的感
兴趣的靶基因。因此,对这些靶基因的DNA序列和推断的氨基酸序列进行测定并且对应地
提供在表2和3中。
[0377] Lh594是果蝇肌钙蛋白I的豆荚草盲蝽直向同源物,涉及肌肉收缩并且因此不存在于植物中,它代表了属于动物特异性生理途径但尚未针对GM-RNAi进行探索的一类新颖
的靶。在果蝇中,肌钙蛋白I被描述为一种单倍不足基因,在杂合子状态中呈现一种突变体表型。这类基因对mRNA表达水平的降低会特别敏感并且因此可被视为理想的RNAi靶。
[0378] 在此Lh594途径中,选择八个靶(参见表1B)。对于每个靶,基于不同昆虫(包括蜜蜂、拟谷盗以及蚜虫)的序列比对,设计出多达4对简并PCR引物。这些引物被用来扩增
来自豆荚草盲蝽靶的片段。对这些靶基因的DNA序列和推断的氨基酸序列进行测定并且对
应地提供在表2和3中。
[0379] 表1:根据第二次确认测定结果(第一次筛选)的按死亡率%分级的豆荚草盲蝽新颖靶。
[0380]
[0381]
[0382] 表1B:Lh594途径中的豆荚草盲蝽新颖靶
[0383]
[0384] *不清楚:在根据e值分级的科中有多个命中
[0385] 表1C:根据第二次确认测定结果(第二次筛选)的按死亡率%分级的豆荚草盲蝽新颖靶。
[0386]
[0387]
[0388] 1.4.通过RACE(cDNA末端快速扩增)的全长cDNA克隆
[0389] 为了克隆全长cDNA,从来自最有效靶的内部片段的已知克隆开始,使用5′/3′RACE试剂盒(罗氏(Roche),目录号1 734 792;基于萨姆布鲁克,J.(Sambrook,
J.)和拉塞尔,D.M(Russell,D.M))。然后进行在使用手册(Instruction Manual)中所描
述的标准方案。简单地说,对于5′RACE,根据已知序列设计靶序列特异性反义引物并使用草盲蝽RNA作为模板,将其用于第一链cDNA的合成。向第一链cDNA中添加尾部并将其用
作一种锚用于第二链合成和转录物未知末端部分的扩增。对于3′RACE,使用寡聚dT锚定
引物进行第一链cDNA合成。对于5′和3′RACE,在第二次PCR反应中使用靶序列特异性
套式引物。在琼脂糖凝胶上分析PCR片段,纯化,克隆并测序以供确认。
[0390] 在VectorNTi(一种用于DNA序列分析的完全整合的序列分析软件包(英杰))中组装相应于这些靶的全长cDNA序列。
[0391] 实例2用于基因沉默的双链RNA的体外产生
[0392] 2.2.相应于豆荚草盲蝽靶基因的部分序列的dsRNA的产生
[0393] 合成毫克量的双链RNA。首先,通过PCR产生两条单独的5′T7 RNA聚合酶启动子模板(有义模板和反义模板)。设计并进行PCR以产生有义和反义模板多核苷酸,这些多
核苷酸各自具有在相对于有待转录的靶序列的不同方向上的T7启动子。
[0394] 对于每一种靶基因,使用靶特异性T7正向引物和靶特异性反向引物产生有义模板。使用靶特异性正向引物和靶特异性T7反向引物产生反义模板。用于通过PCR扩增每
一种靶基因的有义和反义模板的对应引物的序列提供在表4中。通过琼脂糖凝胶电泳来分
析PCR产物并且将其纯化。将所得T7有义与反义模板混合并且通过添加T7RNA聚合酶进
行转录。使由这些模板转录产生的单链RNA退火,用DNA酶和RNA酶处理,并且通过沉淀加
以纯化。由每一种靶基因产生的所得dsRNA的有义链提供在表4中。
[0395] 2.2.新颖豆荚草盲蝽靶的存活分析测定
[0396] 为了能够根据效能分级,合成了相应于新颖靶的体外dsRNA并且在10天存活分析生物测定中将其施用于豆荚草盲蝽。简单来说,将一日龄的豆荚草盲蝽若虫放在具有蔗糖
密封的96孔板中,这些密封含有0.5μg/μl的靶dsRNA,补充有5μg/μl的酵母tRNA。在
标准草盲蝽饲养条件下将这些板孵育3天。在第3天、第6天以及第8天,用仅含有草盲蝽
饲料的密封更新饲料密封。使用Lh423(RpL19)作为阳性对照并且使用GFP dsRNA和蔗糖
饲料作为阴性对照。
[0397] 来自这些存活分析的结果确认了来自第一次和第二次确认测定的数据。Lh594被确立为高度有效的靶,其中活性和杀灭速度比强对照Lh423更强。
[0398] 到目前为止,针对新颖靶的草盲蝽筛选鉴定出活性比阳性对照Lh423更高或在其范围内的新靶,这些新靶包括Lh429、Lh594、Lh609、Lh610、Lh611、Lh617以及Lh618。由这些靶所诱导的死亡率示于图3和4中。
[0399] 为了允许根据这些靶的活性将它们更精确地分级,进行了剂量反应浓度分析。在体外测定中测试新颖靶,其中浓度在从0.4到0.025μg/μl的范围内。对于每种条件,在
96孔板设置中,在补充有dsRNA和tRNA载体的蔗糖饲料中对24只一日龄的若虫进行测试。
结果呈现为在10日实验中的存活率%(图7到11)并且汇总在表5中。
[0400] 基于浓度曲线分析,通过比较基准对照Lh423和Lh105将这些靶分级(表5)。
[0401] 表5:根据DRC并且与基准靶Lh423和Lh105相比较进行分级的草盲蝽新颖靶。
[0402]
[0403] 进一步确认Lh594的效能。在其他靶以及基准阳性对照Lh105和Lh423之前至少一天,清楚地观察到这种靶效应。因为Lh594是高度有效的,在标准DRC实验中未达到LD50,其中浓度在从0.4到0.025μg/μl dsRNA的范围内(图8),因此重复Lh594实验,包括在
从0.05到0.001μg/μl dsRNA范围内的更低的浓度(图12)。总之,在低到0.0025μg/
μl的浓度下观察到Lh594活性并且用0.025μg的dsRNA在第6天获得了约90%的杀灭
(相应于约10%的存活率)。
[0404] 为了进一步探索在豆荚草盲蝽中的RNAi反应中Lh594的效能和tRNA载体的作用,设置了在不存在载体tRNA的情况下的另外的体外摄食测定。使用标准方法在体外产生
Lh594、Lh423(基准对照)以及GFP(阴性对照)dsRNA。纯化这些dsRNA并且在不存在tRNA
的情况下以5μg/μl进行测试(图13A)。
[0405] 在不存在tRNA的情况下,靶Lh594和Lh423在草盲蝽若虫中诱导了高致死率。后来已经重现了来自这个实验的结果。靶dsRNA能够在不存在tRNA的情况下在草盲蝽若虫
中诱导经由摄食的RNAi效应(RNAi-by-feeding effect)。
[0406] 为了研究在不存在载体tRNA的情况下在更低浓度的dsRNA的活性,使用递减量的dsRNA设置了另外的实验(图13B)。
[0407] 在第二次筛选中鉴定的草盲蝽靶遵循了相似的方法。为了允许根据这些靶的活性将这些靶进行分级,进行了剂量反应浓度分析。在体外测定中测试新颖靶,其中浓度在从
0.5到0.05μg/μl的范围内。对于每种条件,在96孔板设置中,在补充有dsRNA和tRNA
载体的蔗糖饲料中对24只一日龄的若虫进行测试。结果呈现为在9日实验中的存活率%
(图17A-D)。Lh594和Lh423已经被包括在该测定中作为参考靶。结果汇总在表6中。基
于浓度曲线分析,通过与基准对照Lh423比较将这些靶分级。
[0408] 表6:来自第二次筛选的草盲蝽新颖靶-根据DRC并且与基准靶Lh423和Lh594比较进行分级。
[0409]
[0410]
[0411] 实例3肌钙蛋白途径筛选
[0412] 为了能够测试肌钙蛋白途径靶,合成了相应于Lh619、Lh620、Lh621、Lh622、Lh622、Lh623、Lh624、Lh625以及Lh626的体外产生的dsRNA并且在10天存活分析生物测定中将其施用给豆荚草盲蝽。简单来说,将一日龄的豆荚草盲蝽若虫放在具有蔗糖密封的96孔板
中,这些密封含有0.5μg/μl的靶dsRNA,补充有5μg/μl的酵母tRNA。在标准草盲蝽饲
养条件下将这些板孵育3天。在第3天、第6天以及第8天,用仅含有草盲蝽饲料的密封更
新饲料密封。使用Lh594(肌钙蛋白I)作为阳性对照并且使用GFP dsRNA和蔗糖饲料作为
阴性对照(图15)。然后在体外测定中的剂量反应曲线分析中纳入四个靶,其中浓度在从
0.4到0.025μg/μl的范围内。对于每种条件,在96孔板设置中,在补充有dsRNA和tRNA
载体的蔗糖饲料中对24只一日龄的若虫进行测试。结果呈现为在10日实验中的存活率%
(图16A-B)。
[0413] 实例4对昆虫害虫物种具有抗性的植物的产生
[0414] 4.1.用于转化马铃薯或棉花的包含豆荚草盲蝽发夹序列的植物表达载体的组装
[0415] 因为RNA干扰的机制通过dsRNA片段操作,在反义和有义方向上克隆了靶多核苷酸序列,这些序列被间隔区(SEQ ID NO 98:CTCGAGCCTGAGAGAAAAGCATGAAGTATACCCA
TAACTAACCCATTAGTTATGCATTTATGTTATATCTATTCATGCTTCTACTTTAGATAATCAATCACCAAACAA
TGAGAATCTCAACGGTCGCAATAATGTTCATGAAAATGTAGTGTGTACACTTACCTTCTAGA, 或 SEQ ID NO
385:TCTAGAAGGTAAGTGTACACACTACATTTTCATGAACATTATTGCGACCGTTGAGATTCTCATTGTTTGG
TGATTGATTATCTAAAGTAGAAGCATGAATAGATATAACATAAACTAGTAACTAATGGGTTAGTTATGGGTATA
CTTCATGCTTTTCTCTCAGGCTCGAG)隔开,从而形成dsRNA发夹构建体。将来源于如在此所提
到的靶基因的编码豆荚草盲蝽dsRNA分子的dsRNA发夹构建体亚克隆到植物表达载体中。
类似地,将GUS dsRNA发夹对照构建体亚克隆到植物表达载体中,其中在反义和有义方向上克隆编码GUS的有义多核苷酸序列(SEQ ID NO 97:CCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCA
CTCATTACGGCAAAGTGTGATGGAGCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTG
CCGGGAAAAGTGTACGTATCTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTGGGCATTCAGTCTGGATCGCGAAAACTGTGG
AATTGATCCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGCAAGGCATATTCGGGTG
AAGGTTATCTCTATGAACTGTGCGTCACAGCCAAAAGCCAGACAGAGT),该序列被相同的内含子(SEQ ID NO98或SEQ ID NO385)隔开。
[0416] 该植物表达载体还包含在细菌细胞中维持质粒所必需的元件。dsRNA发夹构建体位于左边界(LB)和右边界(RB)之间,在花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S)的3′下游和
TNOS终止子的5′上游。将包含侧接P35S启动子和终止子的GFP序列的GFP报告子表达
盒亚克隆到含有豆荚草盲蝽发夹盒的植物转化载体中。将包含侧接P35S启动子和终止子
的NPT II序列的NPT II表达盒用于选择已经被有效转化的植物。通过测序来确定该植物
表达载体中基因片段的正确组装(图5)。
[0417] 随后将包含单独的豆荚草盲蝽靶发夹的植物表达载体转化到根癌农杆菌中。对于在此所提到的所有豆荚草盲蝽靶基因,可以按类似方式选择片段并将其克隆为发夹。
[0418] 4.2.用包含豆荚草盲蝽发夹序列的植物表达载体转化马铃薯并且测试转化的马铃薯植物对豆荚草盲蝽的抗性
[0419] 以下提供的实例例证说明了如下发现:表达靶基因特异性发夹RNA的转基因马铃薯植物对昆虫害虫物种的存活和/或发育有不利影响。
[0420] 豆荚草盲蝽在植物中经由摄食的RNAi
[0421] 在豆荚草盲蝽的dsRNA摄食实验中获得了阳性结果之后,进行了植物体内实验原理证明。
[0422] 用体外马铃薯小植株开展植物体内测定,这些马铃薯小植株可以维持昆虫存活至少8天,保持低的背景死亡率。豆荚草盲蝽若虫靠野生型马铃薯小植株存活并以之为食。这受到由昆虫引起的可以在叶和芽上观察到的可见损害的支持(图6)。
[0423] 在该测定中,豆荚草盲蝽以转基因马铃薯为食,该转基因马铃薯表达靶向在此鉴定的豆荚草盲蝽靶的发夹dsRNA。产生了携带发夹构建体和GUS对照的质粒。
[0424] 在繁殖之前,通过PCR分析小植株以确定T-DNA的整合和该发夹的存在。对于每种构建体,为了获得至少30个独立事件,产生过量的的外植体。
[0425] 马铃薯转化
[0426] 使用在NSF马铃薯基因组项目(http://www.potatogenome.org/nsf5)处通过朱莉·吉尔伯特(Julie Gilbert)接收到的调适方案获得稳定转化的马铃薯植物。使用来源
于易感的二倍体马铃薯6487-9的马铃薯‘Line V’(最初是从位于荷兰PRI瓦赫宁根(PRI
Wageningen,the Netherlands)的植物育种实验室获得)的茎节间外植体作为转化的起始
R
材料。用含有发夹构建体的根癌农杆菌C58C1Rif 接种体外来源的外植体。在共培养三天之后,将外植体放在含有100mg/L卡那霉素和300mg/L特美汀(Timentin)的选择培养基上。
转化后6周之后,取下第一批推定的嫩枝并且使其在选择培养基上生根。将源自于不同外
植体的嫩枝处理为独立事件,源自于相同愈伤组织的嫩枝被称做‘同胞’直到其克隆状态可以通过Southern印迹进行验证,并且嫩枝的节点插枝被称为‘克隆’。
[0427] 通过GFP荧光或通过用于+/-PCR针对插入的靶序列检查生根的嫩枝的转基因状态。然后在组织培养中无性繁殖阳性嫩枝以确保足够的复制品可用于豆荚草盲蝽测定。将
这些嫩枝保持在组织培养基中或转移到土壤中,从而允许针对豆荚草盲蝽若虫/成虫的抗
性进行测试的更大灵活性。转化后十四周的第一批植物可用于测试。
[0428] 生物测定
[0429] 将幼小的转基因马铃薯植物保持在组织培养基中,或使其在植物生长室中的土壤中在以下条件下生长:25℃±1℃,50%±5%的相对湿度,16∶8小时的亮∶暗光周期。对
于每种构建体,产生多个事件(例如,二十个),其中每个事件用合适数目的克隆(例如,十个)。将多只幼小的草盲蝽若虫/成虫放在单独装笼的幼小(例如,处于4-5片未展开的叶
子的阶段)马铃薯植物上并维持至少七天,然后根据若虫/幼虫/成虫存活率降低、发育延
迟以及生长矮小和/或植物摄食损害的减少来评定对豆荚草盲蝽的抗性。
[0430] 在使用了表达相应于草盲蝽靶基因的发夹的转基因马铃薯的一项测定中测试了针对草盲蝽的作物保护的植物体内RNAi的可行性。表7汇总了所产生和测试的转基因马铃
薯的数目。用相应于草盲蝽靶Lh423(Lh423的发夹序列呈现在SEQ ID NO 402中;靶Lh423
的有义序列呈现在SEQ ID NO 101中)和Lh594(Lh594的发夹序列呈现在SEQ ID NO 401
中;靶Lh594的有义序列呈现在SEQ ID NO 2中)、以及作为对照的GUS(GUS的发夹序列呈
现在SEQ ID NO 403中;GUS的有义序列呈现在SEQ ID NO 97中)产生转基因事件。在这
个测定中,使用了SEQ ID NO 385作为内含子。
[0431] 表7
[0432]
[0433] 首先在盒子中,然后在含有MS生根培养基(4.4g/L的MS盐和维生素、30g/L的蔗糖、10g/L的Gelrite,pH5.7)的单独的盆中繁殖这些小植株,以为草盲蝽摄食测定做准备。
从在2个独立实验中所测试的8个独立事件中选出两个独立的GUS事件(图18A-B)。在该
测定中,对同一事件的20-30棵转基因植物(各自种植在一个单独的盆中)进行测试,并且
将其与WT小植株相比较。对于携带Lh423和Lh594发夹的转基因系,对应地测试28个和
25个独立的事件;并且对于每个独立的转基因事件,测试20到30棵小植株,各自种植在一
个单独的盆中(图6)。
[0434] 如在初级转化株中所预期的,观察28个独立的Lh423转基因事件的活性范围(图19);6个独立的P006事件在第9天诱导了60%以上的致死率,并且在一个事件中,致死率
在第9天达到80%(图20)。
[0435] 如在初级转化株中所预期的并且如关于Lh423初级转化株所见,还观察到25个独立的Lh594转基因事件的活性范围(图21);6个独立的P007事件在第9天诱导了60%以
上的致死率并且在一个事件中,致死率在第9天达到80%(图22)。另外,在存活昆虫中清
楚地观察到生长延迟和生长迟缓。
[0436] 关于植食性草盲蝽的qRT-PCR的结果
[0437] 为了证明在以表达针对内源性基因的发夹的转基因马铃薯小植株为食的草盲蝽中所观察到的存活率降低是一个真实的RNAi反应,通过定量实时PCR(qRT-PCR)对靶
mRNA(Lh423)的下调水平进行测量。允许昆虫以携带Lh423发夹的3个事件(P006/59、/22
以及/29)为食并且以携带作为对照的GUS发夹对照(P001/28)的一个事件为食。5天后收
集这些昆虫并且立即在液氮中冷冻。使用TRI试剂并且根据制造商的说明书(西格玛),
从5只昆虫的5个池中提取总RNA。在用DNA酶I(普洛麦格)处理以移除基因组DNA,接
着进行苯酚一氯仿提取和乙醇沉淀之后,将沉淀的RNA溶解于水中。对于每个样品,用随
机六聚体与锚定的寡聚dT引物的混合物反转录1μg的RNA。使用iQ SYBR Green超混液
(伯乐(Biorad))并且使用制造商所推荐的条件,在伯乐I-Cycler上进行qRT-PCR PCR。
使用BeaconDesign设计qRT-PCR引物(表8);为了避免在被昆虫摄入的植物表达的dsRNA
存在下可预见的PCR人工产物,将引物序列定位于dsRNA序列的3′。使用2种看家基因
Lh425(SDHAand)和Lh427(rpl 11),使用GeNorm算法将靶mRNA的水平归一化。
[0438] 在对照GUS转基因植物中,没有观察到昆虫Lh423内源性靶mRNA的下调。但是结果清楚地显示出相应于由以Lh423转基因植物的3个不同事件为食的动物所摄入的dsRNA
的内源性草盲蝽Lh423 mRNA的下调(图23)。
[0439] 4.3.用包含豆荚草盲蝽发夹序列的植物表达载体转化棉花并测试转化的棉花愈伤组织材料或植物对豆荚草盲蝽的抗性
[0440] 以下提供的实例例证说明了如下发现:表达靶基因特异性发夹RNA的转基因棉花植物或愈伤组织对昆虫害虫物种的存活和/或发育有不利影响。
[0441] 棉花转化
[0442] 使用首先在70%的乙醇中洗涤5分钟,并且然后在每升加有10滴非离子型洗涤剂Tween 20的20%漂白剂(美国高乐氏公司(Clorox Co.USA),1%的可用氯)溶液中
振荡,将Coker 312种子表面灭菌。然后将种子在无菌蒸馏水中冲洗3次,然后在无菌滤纸
上吸干。使无菌种子在发芽(SG)培养基上发芽,持续4-6天,并且在此时,收获下胚轴并切成0.5cm的长度,以为农杆菌接种做好准备。将切割的部分放在覆盖有不含植物激素的基
于Murashige和Skoog的培养基的无菌滤纸上。在接种之前,以16∶8小时的日∶夜周期,
在28℃+/-2℃下,将外植体孵育3天。
[0443] 为了接种,使根癌农杆菌液体LB培养物(10ml),即含有所选择的RNA发夹靶和编R
码潮霉素抗性的植物选择盒的菌株GV3101(pMP90)Gent 或菌株LBA4404生长过夜,并且在
接种前一晚使用5ml来接种100ml的培养物。使培养物旋转沉淀,再悬浮于细菌稀释培养
基中并稀释到OD600为0.15。
[0444] 用该农杆菌悬浮液接种下胚轴区段,持续5分钟。在此之后,将外植体吸到无菌滤纸上以去除过量的细菌悬浮液。在黑暗中在棉花共培养培养基(CCM)上将外植体孵育48小时。然后将这些外植体放在选择性愈伤组织诱导培养基(SCIM)上,该培养基含有10mg/
l的潮霉素和500mg/l的头孢噻肟并且包含植物激素2,4-二氯苯氧乙酸(0.1μg/ml)和激
动素(0.1μg/ml)。在4-6周之后,观察第一抗性愈伤组织,并且可以将其移到新鲜的SCIM
中并进一步扩增以用于分子评估和昆虫生物测定。每4-6周更新这些板以维持养分和抗生
素选择。
[0445] 选择在昆虫摄食生物测定中显示阳性结果的愈伤组织用于再生,并将愈伤组织转移到非选择性培养基上用于体细胞胚成熟,该方法是基于Trolinder与Goodin的出版物,
1986。一旦这些胚达到了4mm的长度并且已经分化为子叶和胚根(在转移到成熟培养基之
后2-3个月),可以将其转移到根伸长培养基中。这由在大试管中的用补充有激动素、赤霉
酸(添加二者到最终浓度为0.1mg/l)的基于tewart & Hsu(1977)的液体培养基浸泡过的
灭菌的蛭石组成。在28℃下,在16∶8的日/夜周期中孵育胚,并且一旦它们达到了2-3
片叶子的阶段,可以使小植株在封装于繁殖罐中以维持湿度的蛭石盆中经受耐寒锻炼。一
旦这些植物完全耐寒(4-6片真叶的阶段),就可以将其盆栽到50∶50的泥炭∶壤土混合
物中,并且使其以14∶10的光周期在30℃/20℃的日/夜下生长。
[0446] 生物测定
[0447] 将豆荚草盲蝽若虫放在含有表达靶发夹RNA的未分化的棉花愈伤组织的皮氏培养皿中。对于每种构建体,产生多个转化的棉花愈伤组织并在摄食生物测定中对若虫/成
虫存活率的降低和/或发育延迟以及生长矮小进行测试。不表达豆荚草盲蝽靶发夹RNA基
因片段的转基因愈伤组织用作阴性对照。此外,使由转基因愈伤组织再生的幼小棉花植物
在植物生长室中的土壤中在以下条件下生长:30℃/20℃的日/夜,50%±5%的相对湿度,
14∶10小时的亮∶暗光周期。对于每种构建体,产生多个事件(例如二十个)。将多只幼
小的豆荚草盲蝽若虫/成虫放在单独装笼的幼小(例如,处于4-5片未展开的叶子的阶段)
植物上并维持至少七天,然后根据若虫/成虫存活率降低、发育延迟以及生长矮小和/或植
物摄食损害的降低来评估对豆荚草盲蝽的抗性。未用豆荚草盲蝽靶发夹RNA基因片段转化
的棉花植物用作阴性对照。
[0448] 实例5马铃薯叶甲中靶基因的鉴定
[0449] 5.1.马铃薯叶甲归一化的cDNA文库和在多孔板中制备dsRNA用于筛选测定
[0450] 从不同阶段的马铃薯叶甲幼虫中分离核酸。使用SMARTerTM PCR cDNA合成试剂盒,遵循制造商的说明书(Clontech目录号634925)来制备cDNA文库。使用Trimmer试
剂盒(Evrogen目录号NK001)使cDNA文库归一化并且克隆到PCR -BLUNTII-TOPO 载
体(英杰)中。将归一化的克隆引入M2适体(Trimmer试剂盒,Evrogen,SEQ ID NO 92:
AAGCAGTGGTATCAACGCAG)中,在这些克隆的每一端处相对地定向。将重组载体构建体转化
至大肠杆菌菌株TOP10(英杰)的细胞中。随后将转化的细胞稀释并且铺板,从而获得单一
集落或克隆。检查这些克隆以确保该库的克隆冗余不超过5%。将单一克隆接种到96孔
板中的液体LB(Luria肉汤)培养基中,并且使其在37℃下生长过夜。这些板还包括阳性
(Ld513)和阴性(FP)对照克隆。
[0451] 为了产生dsRNA,通过PCR产生含有T7启动子序列的有义和反义DNA片段。简单来说,对于每个克隆,对应地基于M2和T7-M2序列,将1μl的细菌悬浮
液分配到含有REDTaq (西格玛目录号D4309)和引物oGCC2738(SEQ ID NO 93:
AAGCAGTGGTATCAACGCAG)和oGCC2739(SEQ ID NO 94:GCGTAATACGACTCACTATAGGAAGCAGTGGT
ATCAACGCAG)的多孔PCR板中。在PCR反应之后进行体外转录,其中对于每个克隆,使用在
含有由RiboMAXTM大规模RNA生产系统一T7试剂盒(普洛麦格目录号P1300)所提供的转
录试剂的20μl反应体积中的6μl的PCR产物并且在37℃下孵育过夜。将最终dsRNA溶
液稀释在无菌millQ水中并且用于筛选。相应于阳性Ld513对照克隆的dsRNA是SEQ ID
NO 400(参见表11)并且相应于阴性FP对照克隆的dsRNA是SEQ ID NO 104(参见表4)。
[0452] 5.2.使用dsRNA表达cDNA文库筛选新颖并且有效的马铃薯叶甲靶基因
[0453] 48孔板的每个孔含有0.5mL的人工饲料,该饲料用25μl(或1μg)的测试或对照dsRNA的局部覆盖进行预处理。在每个孔中放一只L2幼虫并且每个克隆测试3只幼虫。
在第4天、第7天以及第10天评估CPB存活数目。
[0454] 在第二次生物测定中,CPB幼虫是以用局部施用的测试dsRNA处理的饲料为食,该测试dsRNA是由来源于归一化的cDNA文库的克隆产生的。在48孔多孔板的一个孔中放一
只幼虫,该多孔板含有用25μL的40ng/μL dsRNA溶液的局部覆盖进行预处理的0.5mL的
饲料。每次处理(克隆)测试总共二十四只幼虫。在第4天、第5天、第6天、第7天、第8
天以及第11天评估存活的昆虫的数目。相对于第0天(测定开始)来计算幼虫死亡率百
分比(参见图29)。
[0455] 5.3.马铃薯叶甲甲虫靶的鉴定
[0456] 已经在马铃薯叶甲中鉴定出由5.2.的筛选得到的新靶序列和相应于肌钙蛋白途径靶的靶序列,这些序列与草盲蝽Lh594、Lh619以及Lh620序列是直向同源的。提供Ld594
的相关cDNA片段的引物列在表19中。确定这些靶基因的cDNA序列和推断的氨基酸序列
并且分别提供在表9和10中。
[0457] 5.4.相应于马铃薯叶甲靶基因的部分序列的dsRNA的产生
[0458] 使用如表11中所提供的引物合成dsRNA。由这些靶基因产生的所得dsRNA的有义链提供在表11中。
[0459] 5.5.新颖的马铃薯叶甲靶的存活分析测定
[0460] 早期幼虫测定
[0461] 产生了Ld594、Ld619以及Ld620这3个靶的合成dsRNA,并且在摄食测定中对CPB幼虫进行测试(参见图24)。在48孔板中,在补充有每孔1μg dsRNA的人工饲料(基于格
尔曼(Gelman)等人,《昆虫科学杂志》(J Ins Sc),1∶7,1-10:用于饲养科罗拉多马铃薯甲虫的人工饲料(Artificial diets for rearing the Colorado Potato Beetle))上进
行10日测定,其中每种条件12只幼虫。
[0462] 可以观察到对幼虫发育的明显作用。设置第二次测定以研究这些dsRNA在化蛹和变态过程期间的作用(参见下文的化蛹测定)。
[0463] 化蛹测定
[0464] 设置CPB化蛹测定以研究在化蛹和变态期间Ld594、Ld619以及Ld620的RNAi敲低(knock-down)作用。使四龄幼虫摄食1μg的分配在马铃薯叶盘上的体外合成的dsRNA,
并且然后将其转移到含有未处理的新鲜马铃薯叶的盒子中。四天后,将存活的昆虫放在蛭
石上允许其化蛹。Lh594处理的昆虫较慢、更小,而且大部分不能够经历化蛹。在实验结束时对蛹的孵化进行评估。对于未处理的对照,24只幼虫化蛹并且全部都孵化成了健康的成
虫。对于Ld620,观察到进展至化蛹的幼虫的数目减少。对于所测试的三个靶,没有幼虫进展到健康的蛹并且没有出现成虫。从蛭石回收的死昆虫显示出不同程度的畸形(图25)。
[0465] 在CPB幼虫测定中,Ld594、Ld619以及Ld620最初以不致死性靶形式出现,虽然在dsRNA处理的昆虫中清楚地观察到活力降低。另一方面,在化蛹测定中,所有3个靶都诱导
强烈的作用并且抑制进入到化蛹和/或变态阶段。
[0466] 成虫测定
[0467] 为了评估Ld594、Ld619以及Ld620在CPB成虫中的活性,设置一项叶盘测定。用dsRNA或对照涂覆马铃薯叶盘(直径1.7cm)并且将其放在具有一只成年甲虫的3.5cm皮氏
培养皿中。第二天,向这些昆虫提供新鲜处理的叶盘。在第三天,将成虫转移到含有足够的新鲜、未处理的马铃薯叶的盒子中以维持未处理的对照的存活。对于每次处理,测试6只成虫并且从第6天到第13天以有规律的间隔时间对存活者和垂死昆虫的数目进行计数。如
果在将昆虫仰卧放置之后它们不能够恢复正常,那么将其视为是垂死的。
[0468] 尽管在这个特定测定中的阴性对照中有相对较高的背景水平,但对于已经暴露于Ld594或Ld619 dsRNA的昆虫观察到了明显的作用(图26)。
[0469] 实例6褐飞虱中的靶基因的鉴定
[0470] 6.1.褐飞虱靶的鉴定
[0471] 已经在褐色飞虱(褐飞虱)中鉴定出相应于肌钙蛋白途径靶并且命名为Nl594(肌钙蛋白I)、Nl619(肌钙蛋白T)以及Nl626(肌钙蛋白C)的新靶序列。使用BPH
cDNA作为模板,通过简并引物PCR来克隆草盲蝽基因的直向同源序列,这些序列命名为
Nl594(肌钙蛋白I)、Nl619(肌钙蛋白T)以及Nl625/626(肌钙蛋白C)。另外,使用RACE(参
见以上方法),鉴定出Nl594的全长cDNA。遵循制造商的说明书并且在用于简并引物PCR反
应的标准条件下,使用AmpliTaq Gold PCR系统(应用生物系统(Applied Biosystems)),
这些标准条件典型地如下:在95℃下10分钟的1个循环,接着40个循环,其中在95℃下30
秒,在50℃下1分钟并且在72℃下1分钟,接着在72℃下10分钟。为了增加成功率,基于
在其他物种中的直向同源序列的比对,设计出多达10种不同的简并引物(正向和反向),并
且以不同的组合加以使用。通过凝胶提取试剂盒(凯杰(Qiagen)目录号28706)从凝胶纯
化出所获得的PCR片段并且克隆到TOPO TA载体(英杰)中。对这些克隆进行测序并且将
共有序列用于针对不同的可用昆虫序列数据库进行的Blast搜索中,以确定插入片段的关
联性。导致成功扩增的简并引物列在表20中。
[0472] 确定这些靶基因和另一个靶基因(Nl537)的DNA序列和推断的氨基酸序列并且分别提供在表12和13中。
[0473] 6.2.相应于褐飞虱靶基因的部分序列的dsRNA的产生
[0474] 使用如在表14中所提供的引物合成dsRNA。从这些靶基因中的每一种产生的所得dsRNA的有义链提供在表14中。
[0475] 6.3.新颖的褐飞虱靶的存活分析测定
[0476] 合成dsRNA并且在预先优化的BPH经由摄食的RNAi的测定中,在两性离子型洗涤剂CHAPSO存在下,以0.1%的最终浓度进行测试。以0.5μg/μl的最终浓度测试dsRNA。
使用在BPH测定中的一种有效靶Nl537作为该测定中的基准靶。在9天的过程中对昆虫存
活率进行评估。
[0477] 生物测定的结果显示,在BPH中Nl594、Nl619以及Nl626也是BPH中的有效RNAi靶(图27)。
[0478] 实例7豌豆蚜中的靶基因的鉴定
[0479] 7.1.豌豆蚜靶的鉴定
[0480] 已经在蚜虫中鉴定出新靶序列并且遵循相同的命名法“Apxxx”(其中“Ap”相应于豌豆蚜并且“xxx”相应于靶的ID),将其命名为Ap423、Ap537、Ap560以及Ap594。基于
AphidBase(参考:http://www.aphidbase.com/)中的公共结构域基因预测来设计引物(表
15)。
[0481] 确定这些靶基因的DNA序列和推断的氨基酸序列并且分别提供在表16和17中。
[0482] 7.2.相应于蚜虫靶基因的部分序列的dsRNA的产生
[0483] 使用如在表18中所提供的引物合成dsRNA。由这些靶基因中的每一种产生的所得dsRNA的有义链提供在表18中。
[0484] 7.3.新颖的蚜虫靶的存活分析测定
[0485] 在具有Ap594、Ap423、Ap560、Ap537这4个靶的豌豆蚜(豌豆蚜虫)中测试经由摄食的RNAi。使用基于公共结构域序列信息(http://www.aphidbase.com)设计的引物以及
从蚜虫制备的cDNA,通过PCR来扩增序列。制备合成性dsRNA并且在蔗糖饲料中以0.5μg/
μl的最终浓度,在5μg/μl的酵母tRNA存在下进行测试。将十只新生的豌豆蚜若虫放在
一个小的皮氏培养皿(32mm)中。将五十微升的饲料(具有tRNA和dsRNA)用移液管移取
到第一层石蜡膜的顶部上。第二层石蜡膜覆盖饲料并且产生一个摄食小袋,蚜虫可以在其
中摄食。对于每个靶,设置了10只新生若虫的五次重复。使用GFP dsRNA作为阴性对照。
在测定的第4天和第7天更新饲料并且评估存活率(图28)。
[0486] 表2
[0487]靶ID cDNA序列(有义链)5′→3′
Lh594 SEQ ID NO 1
Lh609 SEQ ID NO 3
Lh610 SEQ ID NO 5
Lh610(b) SEQ ID NO 139
Lh611 SEQ ID NO 7
Lh611(b) SEQ ID NO 140
Lh617 SEQ ID NO 9
Lh618 SEQ ID NO 11
Lh618(b) SEQ ID NO 141
Lh429 SEQ ID NO 13
Lh423 SEQ ID NO 95
Lh105.2 SEQ ID NO 96
Lh560 SEQ ID NO 15
Lh615 SEQ ID NO 17
Lh612 SEQ ID NO 19
Lh246 SEQ ID NO 21
Lh597 SEQ ID NO 23
Lh598 SEQ ID NO 25
Lh619 SEQ ID NO 121
Lh619(b) SEQ ID NO 142
Lh619(c) SEQ ID NO 143
Lh620 SEQ ID NO 122
Lh620(b) SEQ ID NO 144
Lh620(c) SEQ ID NO 145
Lh621 SEQ ID NO 123
Lh622 SEQ ID NO 124
Lh623 SEQ ID NO 125
Lh623(b) SEQ ID NO 146
Lh624 SEQ ID NO 126
Lh624(b) SEQ ID NO 147
Lh625 SEQ ID NO 127
Lh625(b) SEQ ID NO 148
Lh626 SEQ ID NO 128
Lh626(b) SEQ ID NO 149
Lh614 SEO ID NO 129
Lh627 SEQ ID NO 150
Lh628 SEQ ID NO 152
Lh629 SEQ ID NO 154
Lh630 SEQ ID NO 156
[0488]Lh631 SEQ ID NO 158
Lh632 SEQ ID NO 160
Lh633.1 SEQ ID NO 162
Lh633.2 SEQ ID NO 163
Lh634.1 SEQ ID NO 165
Lh634.2 SEQ ID NO 167
Lh595.1 SEQ ID NO 168
Lh595.2 SEQ ID NO 170
Lh596 SEQ ID NO 172
[0489] 表3
[0490]靶ID 如表2中所呈现的cDNA克隆的相应氨基酸序列
Lh594 SEQ ID NO 79
Lh609 SEQ ID NO 80
Lh610 SEQ ID NO 81
Lh610(b) SEQ ID NO 326
Lh611 SEQ ID NO 82
Lh611(b) SEQ ID NO 327
Lh617 SEQ ID NO 83
Lh618 SEQ ID NO 84
Lh618(b) SEQ ID NO 328
Lh429 SEQ ID NO 85
Lh429(b) SEQ ID NO 329
Lh423 SEQ ID NO 99
Lh105.2 SEQ ID NO 100
Lh560 SEQ ID NO 86
Lh615 SEQ ID NO 87
Lh612 SEQ ID NO 88
Lh246 SEQ ID NO 89
Lh597 SEQ ID NO 90
Lh598 SEQ ID NO 91
Lh619 SEQ ID NO 330
Lh620 SEQ ID NO 331
Lh621 SEQ ID NO 332
Lh622 SEQ ID NO 333
Lh623 SEQ ID NO 334
Lh624 SEQ ID NO 335
Lh625 SEQ ID NO 336
Lh626 SEQ ID NO 337
Lh614 SEQ ID NO 338
Lh627 SEQ ID NO 339
Lh628 SEQ ID NO 340
Lh629 SEQ ID NO 341
Lh630 SEQ ID NO 342
[0491]Lh631 SEQ ID NO 343
Lh632 SEQ ID NO 344
Lh633.1 SEQ ID NO 345
Lh633.2 SEQ ID NO 346
Lh634.1 SEQ ID NO 347
Lh634.2 SEQ ID NO 348
[0492] 表4
[0493]
[0494]
[0495] 表8
[0496]
[0497] 表9
[0498]
[0499] 表10
[0500]
[0501] 表11
[0502]
[0503] 表12
[0504]
[0505]
[0506] 表13
[0507]
[0508] 表14
[0509]
[0510] 表15
[0511]靶 正向引物序列 反向引物序列
Ap594SEQ ID NO 369 SEQ ID NO 370
Ap423SEQ ID NO 371 SEQ ID NO 372
Ap537SEQ ID NO 373 SEQ ID NO 374
Ap560SEQ ID NO 375 SEQ ID NO 376
[0512] 表16
[0513]靶ID cDNA序列(有义链)5′→3′
Ap594 SEQ ID NO 188
Ap423 SEQ ID NO 200
Ap537 SEQ ID NO 202
Ap560 SEQ ID NO 204
[0514] 表17
[0515]靶ID 如表16中所呈现的cDNA克隆的相应氨基酸序列
Ap594 SEQ ID NO 356
Ap423 SEQ ID NO 357
Ap537 SEQ ID NO 358
Ap560 SEQ ID NO 359
[0516] 表18
[0517]
[0518] 表19
[0519]靶 正向引物 反向引物
Ld594 SEQ ID NO 377 SEQ ID NO 378
[0520] 表20
[0521]靶 正向引物 反向引物
Nl594 seq id no 379 seq id no 380
Nl619 seq id no 381 seq id no 382
Nl626 seq id no 383 seq id no 384
[0522] 表21
[0523]
[0524] 表22
[0525]
[0526] *不清楚:在科中有多个命中
[0527] 表23
[0528]
[0529] 本领域技术人员应当理解的是,在不偏离如一般地描述的这个测定的精神和范围的情况下,可以对上文提到的测定作出多种变化和/或修改。本领域技术人员将认识到或
仅使用常规实验就能够确定这些具体实例的多个等效方案,并且这些等效方案预期被本发
明涵盖。因此,本发明的实例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。
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