一种利用多基因转化培育淀粉含量提高转基因植物的方法
阅读：423发布：2022-11-01
专利汇可以提供一种利用多基因转化培育淀粉含量提高转基因植物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用多基因转化培育 淀粉 含量提高转基因 植物 的方法。本发明提供一种培育转基因植物的方法，为将筛选标记基因、腺苷二 磷酸 葡萄糖 焦磷 酸化 酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、 蔗糖 合成酶 基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物。本发明的实验证明，可通过一次基因枪轰击一次性转化同时转入多个基因，大大缩短转基因材料培育的周期和工作量，具体同时转入4种与淀粉代谢相关的基因，使得转基因再生植株的总淀粉含量高于野生型植物。，下面是一种利用多基因转化培育淀粉含量提高转基因植物的方法专利的具体信息内容。
1.一种培育转基因植物的方法，为如下1)或2)：
1)为将腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物；
2)为将筛选标记蛋白基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物；
所述筛选标记蛋白为PPT，其氨基酸序列为序列表中序列6；
所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基为Bt2，其氨基酸序列为序列表中序列7；
所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基为Sh2，其氨基酸序列为序列表中序列8；
所述蔗糖合成酶为Sh1，其氨基酸序列为序列表中序列9；
所述颗粒结合型淀粉合成酶为GBSSIIa，其氨基酸序列为序列表中序列10；
所述筛选标记蛋白基因为Bar；
所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因为Bt2；
所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因为Sh2；
所述蔗糖合成酶基因为Sh1；
所述颗粒结合型淀粉合成酶基因为GbssIIa；
所述筛选标记蛋白基因通过重组表达载体pTRAuxBar导入目的植物中；所述重组表达载体pTRAuxBar为含有Bar基因表达盒的重组载体；所述Bar基因表达盒具体包括Ubi启动子、Bar基因和nos终止子；
所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因通过重组表达载体pGt1-Bt2导入目的植物中；所述重组表达载体pGt1-Bt2为含有Bt2基因表达盒的重组载体；所述Bt2基因表达盒具体包括Gt1启动子、Bt2基因和35S终止子；
所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因通过重组表达载体pISA-Sh2导入目的植物中；所述重组表达载体pISA-Sh2为含有Sh2基因表达盒的重组载体；所述Sh2基因表达盒具体包括ISA启动子、Sh2基因和35S终止子；
所述蔗糖合成酶基因通过重组表达载体pB1hor-Sh1导入目的植物中；所述重组表达载体pB1hor-Sh1为含有Sh1基因表达盒的重组载体；所述Sh1基因表达盒具体包括B1hordein启动子、Sh1基因和35S终止子；
所述颗粒结合型淀粉合成酶基因通过重组表达载体pHMW-GbssIIa导入目的植物中；
所述重组表达载体pHMW-GbssIIa为含有GbssIIa基因表达盒的重组载体；所述GbssIIa基因表达盒具体包括HMW-Glutenin启动子、GbssIIa基因和35S终止子；
所述植物为玉米。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述筛选标记蛋白基因Bar的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第2036-2584位核苷酸；
所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因Bt2的核苷酸序列为序列表中序列2自
5’末端第1935-3362位核苷酸；
所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因Sh2的核苷酸序列为序列表中序列3自
5’末端第1085-2635位核苷酸；
所述蔗糖合成酶基因Sh1的核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第592-3000位核苷酸；
所述颗粒结合型淀粉合成酶基因GbssIIa的核苷酸序列为序列表中序列5自5’末端第478-2307位核苷酸。
3.一种向目的植物中共转入多个目的基因的方法，包括如下步骤：
1)分别制备混合载体和转基因受体：所述混合载体由等摩尔比的多个重组表达载体组成；
每个所述重组表达载体含有对应的一个所述目的基因的载体；所述转基因受体按照如下方法制备：
A、将目的植物的外植体进行预培养，得到预培养后外植体；
B、将所述预培养后外植体进行高渗预培养，得到高渗预培养后外植体，即为转基因受体；
2)将所述混合载体包被金粉，再通过基因枪导入所述转基因受体中，得到轰击后外植体；
3)将所述轰击后外植体依次进行传代培养、筛选培养、分化培养和生根培养，即得到转基因植物，实现向目的植物中共转入多个目的基因；
所述多个目的基因为权利要求2所述的筛选标记蛋白基因Bar、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因Bt2、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因Sh2、蔗糖合成酶基因Sh1和颗粒结合型淀粉合成酶基因GbssIIa共5个基因；
所 述 多 个 重 组 表 达 载 体 为pTRAuxBar、pGt1-Bt2、pISA-Sh2、pB1hor-Sh1 和pHMW-GbssIIa共5个重组表达载体；
所述重组表达载体pTRAuxBar为含有Bar基因表达盒的重组载体；
所述重组表达载体pGt1-Bt2为含有Bt2基因表达盒的重组载体；
所述重组表达载体pISA-Sh2为含有Sh2基因表达盒的重组载体；
所述重组表达载体pB1hor-Sh1为含有Sh1基因表达盒的重组载体；
所述重组表达载体pHMW-GbssIIa为含有GbssIIa基因表达盒的重组载体；
所述Bar基因表达盒具体包括Ubi启动子、Bar基因和nos终止子；
所述Bt2基因表达盒具体包括Gt1启动子、Bt2基因和35S终止子；
所述Sh2基因表达盒具体包括ISA启动子、Sh2基因和35S终止子；
所述Sh1基因表达盒具体包括B1hordein启动子、Sh1基因和35S终止子；
所述GbssIIa基因表达盒具体包括HMW-Glutenin启动子、GbssIIa基因和35S终止子；
所述植物为玉米。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述预培养采用的培养基为愈伤组织诱导培养基N6E，所述愈伤组织诱导培养基N6E按照如下方法制备：向N6基本培养基中添加终浓度为2.76g/L脯氨酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为100mg/L水解酪蛋白、终浓度为25uM硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积；
所述高渗预培养采用的培养基为N6OSM培养基，所述N6OSM培养基按照如下方法制备：
向N6基本培养基中添加终浓度为0.69g/L脯氨酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为100mg/L水解酪蛋白、终浓度为36.4g/L山梨醇、终浓度为36.4g/L甘露醇、终浓度为29mg/L硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积；
步骤2)中，所述金粉与所述混合载体的质量比为20：1-500：1；
步骤3)中，所述传代培养为将所述轰击后外植体进行传代培养，得到传代培养外植体；
所述传代培养采用的培养基为所述愈伤组织诱导培养基N6E；
所述筛选培养为将所述传代培养外植体进行筛选培养，得到愈伤组织；
所述筛选培养采用的培养基为N6S培养基；所述N6S培养基按照如下方法制备：向N6基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为2mg/L双丙胺膦、终浓度为6mg/L硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积；
所述分化培养为将所述愈伤组织进行分化培养，得到带有幼叶的愈伤组织；
所述分化培养采用的培养基为RMI培养基；所述RMI培养基按照如下方法制备：向MS基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为3mg/L Bialaphos、终浓度为60g/L蔗糖和终浓度为3g/L植物凝胶，用水补足体积；
所述生根培养为将所述带有幼叶的愈伤组织进行生根培养，即得到转基因植物；
所述生根培养采用的培养基为RMII培养基；所述RMII培养基按照如下方法制备：向MS基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为60g/L蔗糖和终浓度为3g/L植物凝胶，用水补足体积。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述预培养的条件为25-28℃、暗培养1-3天；
所述高渗预培养的条件为25-28℃、暗培养4-10h；
步骤3)中，所述传代培养的条件为25-28℃暗培养14-21天；
每一次所述筛选培养的条件为25-28℃暗培养2-3周，所述筛选次数为3-6次；
所述分化培养的条件为23-25℃、暗培养1-3周；
所述生根培养的条件为22-25℃、16h光/8h暗培养15天、光照强度为4000-8000lux；
在步骤2)和步骤3)之间还包括如下步骤：将所述轰击后外植体经过再次高渗预培养；所述再次高渗预培养采用的培养基为N6SOM培养基，所述再次高渗预培养的条件为
25-28℃暗培养12-24h；
所述目的植物为授粉后12天植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述预培养的条件具体为28℃、暗培养3天；
所述高渗预培养的条件具体为28℃、暗培养8h；
所述传代培养的条件具体为28℃暗培养14天；
每一次所述筛选培养的条件具体为28℃暗培养3周，所述筛选次数为3次；
所述分化培养的条件具体为25℃、暗培养3周；
所述生根培养的条件具体为25℃、光照强度为4000lux；
所述再次高渗预培养的条件具体为28℃再次高渗预培养20h。
一种利用多基因转化培育淀粉含量提高转基因植物的方法
技术领域
背景技术
[0002] 1977年Ackermann等首先用Ri质粒转化烟草细胞获得再生植株，开创了植物转基因的历史。此后，有多种技术被发明并应用于植物转基因，主要有农杆菌介导法、基因枪法、原生质体法和花粉管通道法，另外还有病毒介导法、电击法、显微注射法、超声波导入法、吸涨法、花粉携带法、脂质体法、激光微束穿刺法、离子束法等，应用这些方法，已有大量的植物物种被转化成功并产生了转基因植株。这些转化方法，一般是一次将一个目的基因导入植物细胞、并使其稳定整合到植物基因组中。
[0003] 为了提高农作物的产量或其它农艺性状，常需要将几个基因导入到受体植物中，采用普通转基因方法只能采用分多次、每次转入一个基因的策略，转化效率较低，因此，产生了一些多基因转化方法，一是在构建转化载体时，将多个基因表达框串联到T-DNA区上，该技术构建载体比较繁琐,受Ti质粒容量的限制无法构建包含大于50Kb插入序列的载体；二是将不同外源基因分别构建到不同表达载体上的T-DNA区域,然后将含不同基因的表达载体转入同一农杆菌细胞中，进行多基因转化,但采用这种方法时需要考虑农杆菌容纳多个质粒的能力。此外还可以通过其它策略将多个转基因导入同一植物材料中，例如将含有不同转基因的植物进行杂交，但这些方法不可避免的需要多个植物生长周期才能实现。
[0004] 很多基因的表达具有组织特异性，某些淀粉合成、谷蛋白合成相关基因仅在禾谷类作物的种子中特异表达，其产物主要催化各种淀粉和谷蛋白的合成，它们构成了胚乳的主要成分，这些基因的组织特异性表达是由其启动子的特异性决定的，如：小麦高分子量谷蛋白（HMW）启动子、大麦D组醇溶蛋白（D-hordin）启动子、大麦B组醇溶蛋白（B-hordin）启动子、水稻谷蛋白（Gt1）启动子、大麦异淀粉酶（Isa）启动子等。
[0005] 在禾谷类作物的种子中，往往大量积累淀粉，与淀粉合成相关的基因，也在胚乳发育时期特异的大量表达，其中比较重要的关键酶或限速酶基因有：蔗糖合成酶基因（Sh1）；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）大、小亚基，分别由Sh2和Bt2基因编码；颗粒结合型淀粉合成酶（GBSSIIa）基因，决定直链淀粉的合成。
发明内容
[0006] 本发明的一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0007] 本发明提供的方法，为如下1）或2）：
[0008] 1）为将腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物；
[0009] 2）为将筛选标记蛋白基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因、蔗糖合成酶基因和颗粒结合型淀粉合成酶基因共导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物组织的总淀粉含量高于所述目的植物。
[0010] 上述方法中，所述筛选标记蛋白为PPT（它是Bar基因的蛋白表达产物，英文名Phosphinothricin N-acetyltransferase,中译草丁膦N-乙酰转移酶），其氨基酸序列为序列表中序列6；
[0011] 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基为Bt2，其氨基酸序列为序列表中序列7；
[0012] 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基为Sh2，其氨基酸序列为序列表中序列8；
[0013] 所述蔗糖合成酶为Sh1，其氨基酸序列为序列表中序列9；
[0014] 所述颗粒结合型淀粉合成酶为GBSSIIa，其氨基酸序列为序列表中序列10。
[0015] 所述筛选标记蛋白基因具体为Bar，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第2036-2584位核苷酸；
[0016] 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因具体为Bt2，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1935-3362位核苷酸；
[0017] 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因具体为Sh2，其核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1085-2635位核苷酸；
[0018] 所述蔗糖合成酶基因具体为Sh1，其核苷酸序列具体为序列表中序列4自5’末端第592-3000位核苷酸；
[0019] 所述颗粒结合型淀粉合成酶基因具体为GbssIIa，其核苷酸序列具体为序列表中序列5自5’末端第478-2307位核苷酸。
[0020] 上述方法中，所述筛选标记蛋白基因以Bar基因表达盒的形式导入目的植物；所述Bar基因表达盒具体包括Ubi启动子、Bar基因和nos终止子；
[0021] 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因以Bt2基因表达盒的形式导入目的植物；所述Bt2基因表达盒具体包括Gt1启动子、Bt2基因和35S终止子；
[0022] 所述腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因以Sh2基因表达盒的形式导入目的植物；所述Sh2基因表达盒具体包括ISA启动子、Sh2基因和35S终止子；
[0023] 所述蔗糖合成酶基因以Sh1基因表达盒的形式导入目的植物；所述Sh1基因表达盒具体包括B1hordein启动子、Sh1基因和35S终止子；
[0024] 所述颗粒结合型淀粉合成酶基因以GbssIIa基因表达盒的形式导入目的植物；所述GbssIIa基因表达盒具体包括HMW-Glutenin启动子、GbssIIa基因和35S终止子。
[0025] 上述表达盒中的基因的序列均为基因编码区序列。
[0026] 上述方法中，所述Bar基因表达盒通过重组表达载体pTRAuxBar导入目的植物中；
[0027] 所述Bt2基因表达盒通过重组表达载体pGt1-Bt2导入目的植物中；
[0028] 所述Sh2基因表达盒通过重组表达载体pISA-Sh2导入目的植物中；
[0029] 所述Sh1基因表达盒通过重组表达载体pB1hor-Sh1导入目的植物中；
[0030] 所述GbssIIa基因表达盒通过重组表达载体pHMW-GbssIIa导入目的植物中。
[0031] 上述方法中，所述组织为种子的胚乳；所述目的植物是双子叶植物或单子叶植物。在本发明的实施例中采用的单子叶植物为玉米，具体为玉米H99。
[0032] 本发明的另一个目的是提供一种向目的植物中共转入多个目的基因的方法。
[0033] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0034] 1）分别制备混合载体和转基因受体：
[0035] 所述混合载体由等摩尔比的多个重组表达载体组成；
[0036] 每个所述重组表达载体含有对应的一个所述目的基因的载体；
[0037] 所述转基因受体按照如下方法制备：
[0038] A、将目的植物的外植体进行预培养，得到预培养后外植体；
[0039] B、将所述预培养后外植体进行高渗预培养，得到高渗预培养后外植体，即为转基因受体；
[0040] 2）将所述混合载体包被金粉，再通过基因枪导入所述转基因受体中，得到轰击后外植体；
[0041] 3）将所述轰击后外植体依次进行传代培养、筛选培养、分化培养和生根培养，即得到转基因植物，实现向目的植物中共转入多个目的基因。
[0042] 上述方法中，步骤1）中，所述预培养采用的培养基为愈伤组织诱导培养基N6E，所述愈伤组织诱导培养基N6E按照如下方法制备：向N6基本培养基中添加终浓度为2.76g/L脯氨酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为100mg/L水解酪蛋白、终浓度为25uM硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积；
[0043] 所述高渗预培养采用的培养基为N6OSM培养基，所述N6OSM培养基按照如下方法制备：向N6基本培养基中添加终浓度为0.69g/L脯氨酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为100mg/L水解酪蛋白、终浓度为36.4g/L山梨醇、终浓度为36.4g/L甘露醇、终浓度为29mg/L硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积；
[0044] 步骤2）中，所述金粉与所述混合载体的质量比为20：1-500：1；在本发明的实施例中为100：1；
[0045] 基因枪真空度27～28psi，用650psi和1100psi可裂膜各轰击一次，可裂膜至靶点距离：6cm/9cm；
[0046] 步骤3）中，所述传代培养为将所述轰击后外植体进行传代培养，得到传代培养外植体；
[0047] 所述传代培养采用的培养基为所述愈伤组织诱导培养基N6E；
[0048] 所述筛选培养为将所述传代培养外植体进行筛选培养（除草剂筛选），得到愈伤组织（抗除草剂biolaphos）；
[0049] 所述筛选培养采用的培养基为N6S培养基；所述N6S培养基按照如下方法制备：向N6基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为2mg/L Bialaphos（双丙胺膦）、终浓度为6mg/L硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积；
[0050] 所述分化培养为将所述愈伤组织进行分化培养，得到带有幼叶的愈伤组织（包括地上部分幼叶和地下部分的愈伤组织）；
[0051] 所述分化培养采用的培养基为RMI培养基；所述RMI培养基按照如下方法制备：向MS基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为3mg/L Bialaphos（双丙胺膦）、终浓度为60g/L蔗糖和终浓度为3g/L植物凝胶，用水补足体积；
[0052] 所述生根培养为将所述带有幼叶的愈伤组织进行生根培养，即得到转基因植物；
[0053] 所述生根培养采用的培养基为RMII培养基；所述RMII培养基按照如下方法制备：向MS基本培养基中添加终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为60g/L蔗糖和终浓度为3g/L植物凝胶，用水补足体积。
[0054] 上述方法中，步骤1）中，所述预培养的条件为25-28℃、暗培养1-3天；所述预培养的条件具体为28℃、暗培养3天；
[0055] 所述高渗预培养的条件为25-28℃、暗培养4-10h；所述高渗预培养的条件具体为28℃、暗培养8h；
[0056] 步骤3）中，所述传代培养的条件为25-28℃暗培养14-21天；所述传代培养的条件具体为28℃暗培养14天；
[0057] 每一次所述筛选培养的条件为25-28℃暗培养2-3周，所述筛选次数为3-6次；
[0058] 所述分化培养的条件为23-25℃、暗培养1-3周；所述分化培养的条件具体为25℃、暗培养3周；
[0059] 所述生根培养的条件为22-25℃、16h光/8h暗培养15天、光照强度为4000-8000lux；所述生根培养的条件具体为25℃、光照强度为4000lux；
[0060] 在步骤2）和步骤3）之间还包括如下步骤：将所述轰击后外植体经过再次高渗预培养；所述再次高渗预培养采用的培养基为N6SOM培养基，所述再次高渗预培养的条件为25-28℃暗培养12-24h；所述再次高渗预培养的条件具体为28℃再次高渗预培养20h；
[0061] 所述目的植物为授粉后12天植物。
[0062] 上述方法中，所述目的植物为双子叶或单子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米，具体为玉米H99；所述外植体为种子的胚（授粉后12天植物种子的幼胚）；
[0063] 所述多个目的基因为筛选标记蛋白基因Bar、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因Bt2、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因Sh2、蔗糖合成酶基因Sh1和颗粒结合型淀粉合成酶基因GbssIIa共5个基因；
[0064] 所述多个重组表达载体为pTRAuxBar、pGt1-Bt2、pISA-Sh2、pB1hor-Sh1和pHMW-GbssIIa共5个重组表达载体；
[0065] 所述重组表达载体pTRAuxBar为含有Bar基因表达盒的重组载体；
[0066] 所述重组表达载体pGt1-Bt2为含有Bt2基因表达盒的重组载体，为将序列表中序列2自5’末端第34-3362位核苷酸所示的Bt2基因表达盒中的Gt1启动子和Bt2基因插入pB7RWG2载体（attB1和attB2位点间）得到的载体；具体构建方法见实施例1的一的2）得到；
[0067] 所述重组表达载体pISA-Sh2为含有Sh2基因表达盒的重组载体；为将序列表中序列3自5’末端第28-2635位核苷酸所示的Sh2基因表达盒的中的ISA启动子和Sh2基因编码区插入pB7RWG2载体（attB1和attB2位点间）；具体构建方法见实施例1的一的3）得到；
[0068] 所述重组表达载体pB1hor-Sh1为含有Sh1基因表达盒的重组载体；为将序列表中序列4自5’末端第28-3000位核苷酸所示的Sh1基因表达盒中的B1hordein启动子和Sh1基因编码区连入pB7RWG2载体（attB1和attB2位点间）得到的载体；具体构建方法见实施例1的一的4）得到；
[0069] 所述重组表达载体pHMW-GbssIIa为含有GbssIIa基因表达盒的重组载体；为将序列表中序列5自5’末端第28-2307位核苷酸所示GbssIIa基因表达盒中的HMW-Glutenin启动子和GbssIIa基因编码区插入pB7RWG2载体（attB1和attB2位点间）得到的载体；具体构建方法见实施例1的一的5）得到。
[0070] 所述Bar基因表达盒具体包括Ubi启动子、Bar基因和nos终止子；
[0071] 所述Bt2基因表达盒具体包括Gt1启动子、Bt2基因和35S终止子；
[0072] 所述Sh2基因表达盒具体包括ISA启动子、Sh2基因和35S终止子；
[0073] 所述Sh1基因表达盒具体包括B1hordein启动子、Sh1基因和35S终止子；
[0074] 所述GbssIIa基因表达盒具体包括HMW-Glutenin启动子、GbssIIa基因和35S终止子。
[0075] 所述Bar基因表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列1；
[0076] 所述Bt2基因表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列2；
[0077] 所述Sh2基因表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列3；
[0078] 所述Sh1基因表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列4；
[0079] 所述GbssIIa基因表达盒的核苷酸序列为序列表中的序列5。
[0080] 用于多基因转化的表达盒组或用于多基因转化的重组表达载体组也是本发明保护的范围；
[0081] 或所述表达盒组或所述重组表达载体组在提高植物组织总淀粉含量中的应用也是本发明保护的范围；
[0082] 或用于多基因转化的培养基组也是本发明保护的范围；
[0083] 所述表达盒组为如下1）或2）：
[0084] 1）由上述方法中的所述Bt2基因表达盒、所述Sh2基因表达盒、所述Sh1基因表达盒和所述GbssIIa基因表达盒组成；
[0085] 2）由上述方法中的所述Bar基因表达盒、所述Bt2基因表达盒、所述Sh2基因表达盒、所述Sh1基因表达盒和所述GbssIIa基因表达盒组成；
[0086] 所述重组表达载体组为如下a）或b）：
[0087] a）由上述方法中的pGt1-Bt2、pISA-Sh2、pB1hor-Sh1和pHMW-GbssIIa组成；
[0088] b）由上述方法中的pTRAuxBar、pGt1-Bt2、pISA-Sh2、pB1hor-Sh1和pHMW-GbssIIa组成；
[0089] 所述目的植物具体是双子叶植物或单子叶植物；所述组织具体为种子的胚乳；所述单子叶植物具体为玉米，具体为玉米H99。所述用于多基因转化的培养基组由上述方法中所述愈伤组织诱导培养基N6E、所述N6OSM培养基、所述N6S培养基、所述RMI培养基和所述RMII培养基组成。
[0090] 为了克服以上传统单基因或多基因转化方法效率低、可共转化基因少的缺陷，本发明以基因枪法转化技术为基础，采用多种质粒，其中每种质粒含有一个不同的目的基因表达盒，将这些质粒等摩尔比例混合、包被在金粉表面，并用基因枪轰击、转化受体植物材料，采用优化的组织培养体系，经过抗除草剂筛选、植物组织培养和植株再生、外源基因整合检测、外源基因表达检测和种子淀粉含量检测等步骤，建立起了高效的多基因共转化体系，并得到可稳定遗传、表达的多基因共转基因高淀粉植株。
[0091] 本发明的实验证明，一方面，采用本发明的方法，可通过一次基因枪轰击，一次性同时转入多个基因，得到转化率较高的多基因共转化再生植株；另外一方面，由于同时转入4种与淀粉代谢相关的基因和1种筛选标记基因，使得转基因再生植株的总淀粉含量含量高于野生型植物；总之，本发明的方法不仅可以将控制某种生物学性状的多个基因，甚至可以将一个代谢途径中的所有基因，都一次性、高效、稳定地转入到受体材料中，极大地提高了转基因效率；而且可以得到高淀粉含量的转基因植物。
附图说明
附图说明
[0092] 图1为GUS染色结果
[0093] 图2为试纸条检测结果
[0094] 图3为T4代材料的Southern blot检测
[0095] 图4为不同转基因株系中5个基因的表达丰度
[0096] 图5为共转化的T4代种子总淀粉含量和直链淀粉含量测定，
[0097] 其中，a，b，c代表统计学差异显著(P<0.05，Duncan’s test)。
具体实施方式
[0098] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0099] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0100] 实施例1、共同转5个基因的转基因植物的获得
[0101] 一、5个表达载体的获得
[0102] 5个转基因所需要的表达载体分别为pTRAuxBar、pGt1-Bt2、pISA-Sh2、pB1hor-Sh1、pHMW-GbssIIa；上述5个表达载体的具体组成部分见表1所示，构建上述5个表达载体所需的引物如表2所示。
[0103] 表1为多基因共转化使用的表达载体
[0104]
[0105] 表2克隆启动子和基因使用的引物
[0106]
[0107] *引物侧翼位置（下划线部分）加入相应的att重组位点；
[0108] 上述5个表达载体的构建方法具体如下：
[0109] 1）pTRAuxBar
[0110] 载体pTRAuxBar由Zhu提供，记载在如下文献中：Cost-effective production of a vaginal protein microbicide to prevent HIV transmission，Proc Natl Acad Sci USA，March11,2008（105）10：3727–3732；公众可从东北师范大学获得。
[0111] 该载体中含有序列表中序列1所示的Bar基因表达盒；Bar基因表达盒包括序列表中序列1自5’末端第1-949位核苷酸所示的Ubi启动子、第2036-2584位核苷酸所示的Bar基因（编码的蛋白PPT的氨基酸序列为序列表中序列6）、第2585-2808位核苷酸所示的nos终止子。
[0112] 2）pGt1-Bt2
[0113] 以水稻日本晴（Oryza sativa L.var.nipponbare；记载在如下文献中：Zhu,J.,Fine mapping of a major QTL controlling panicle number in rice,Molecular Breeding,Volume 27,Issue2,February2011,Pages171-180；公众可从东北师范大学获得)的基因组DNA为模板，以Gt1promoter引物F和R为引物（序列见表2），进行PCR扩增，得到1883bp的PCR产物即为Gt1启动子；
[0114] 以玉米H99(记载在如下文献中：采用玉米Ubi-1启动子获得低拷贝转基因玉米植株,生物工程学报，2004（20）1：120-126；公众可从东北师范大学获得)胚乳cDNA为模板，以Bt2的F和R引物（序列见表2），进行PCR扩增，得到1428bp的PCR产物即为Bt2基因全长编码区。
[0115] 上述扩增得到的Gt1启动子带有attB1和attB5r重组位点，上述扩增得到的Bt2基因带有attB5和attB2重组位点；将2个带有重组位点的序列在Invitrogen公司提供的Gateway重组试剂盒(Multisite Pro Plus Kit for2-,3-or4-fragment recombination(12537-100),Invitrogen)反应下，通过一次重组直接连接2个目的片段到载体pB7RWG2（购自Plant system biology公司，pB7RWG2，http://www.psb.ugent.be/）中得到pGt1-Bt2。
[0116] 将pGt1-Bt2经过测序，结果为该载体为将序列表中序列2自5’末端第34-3362位核苷酸所示的Bt2基因表达盒中的Gt1启动子和Bt2基因插入pB7RWG2载体（attB1和attB2位点间）得到的载体。Bt2基因表达盒包括序列表中序列2自5’末端第34-1904位核苷酸所示的Gt1启动子、第1935-3362位核苷酸所示的Bt2基因（编码的蛋白腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基的氨基酸序列为序列表中序列7）、第4089-4314位核苷酸所示pB7RWG2载体骨架上的35S终止子。
[0117] 3）pISA-Sh2
[0118] 以大麦（Hordeum vulgare var Bomi，记载在如下文献中：The nutritive value of botanically defined mill fractions of barley.2.The influence of hind-gut microflora in rats on digestibility of protein and energy of endosperm and husk of Bomi and M-1508.Bach Knudsen KE,Wolstrup J,Eggum BO.Z Tierphysiol Tierernahr Futtermittelkd.1982Nov;48(5):276-87.；公众可从东北师范大学获得)的基因组DNA为模板，以ISA promoter 引物F和R为引物（序列见表2），进行PCR扩增，得到1033bp的PCR产物即为ISA启动子；
[0119] 以玉米H99胚乳cDNA为模板，以Sh2的F和R引物（序列见表2），进行PCR扩增，得到1551bp的PCR产物即为Sh2基因编码区。
[0120] 上述扩增得到的ISA启动子带有attB1和attB5r重组位点，上述扩增得到的Sh2基因经过attB5和attB2重组位点；将2个带有重组位点的序列在Invitrogen公司提供的Gateway重组试剂盒(Multisite Pro Plus Kit for2-,3-or4-fragment recombination(12537-100),Invitrogen)反应下，通过一次重组直接连接2个目的片段到载体pB7RWG2中得到pISA-Sh2。
[0121] 将pISA-Sh2经过测序，该载体为该载体为将序列表中序列3自5’末端第28-2635位核苷酸所示的Sh2基因表达盒的中的ISA启动子和Sh2基因编码区插入pB7RWG2载体（attB1和attB2位点间）。Sh2基因表达盒包括序列表中序列3自5’末端第28-1060位核苷酸所示的ISA启动子、第1085-2635位核苷酸所示的Sh2基因编码区（编码的蛋白Sh2的氨基酸序列为序列表中序列8）、第3362-3587位核苷酸所示pB7RWG2载体骨架上的35S终止子。
[0122] 4）pB1hor-Sh1
[0123] 以大麦(Hordeum vulgare var.Bomi)的基因组DNA为模板，以B1hordein promoter引物F和R为引物（序列见表2），进行PCR扩增，得到540bp的PCR产物即为B1hordein启动子；
[0124] 以玉米H99胚乳cDNA为模板，以Sh1的F和R引物（序列见表2），进行PCR扩增，得到2409bp的PCR产物即为Sh1基因编码区。
[0125] 上述扩增得到的B1hordein启动子带有attB1和attB5r重组位点，上述扩增得到的Sh1基因编码区经过attB5和attB2重组位点；将2个带有重组位点的序列
在Invitrogen公司提供的GateWay重组试剂盒(Multisite Pro Plus Kit
for2-,3-or4-fragment recombination (12537-100),Invitrogen)反应下，通过一次重组直接连接2个目的片段到载体pB7RWG2中,得到pB1hor-Sh1。
在Invitrogen公司提供的GateWay重组试剂盒(Multisite Pro Plus Kit
for2-,3-or4-fragment recombination (12537-100),Invitrogen)反应下，通过一次重组直接连接2个目的片段到载体pB7RWG2中,得到pB1hor-Sh1。
[0126] 将pB1hor-Sh1经过测序，结果为该载体为将序列表中序列4自5’末端第28-3000位核苷酸所示的Sh1基因表达盒中的B1hordein启动子和Sh1基因编码区连入pB7RWG2载体（attB1和attB2位点间）得到的载体。其中，Sh1基因表达盒包括序列表中序列4自5’末端第28-567位核苷酸所示的B1hordein启动子、第592-3000位核苷酸所示的Sh1基因编码区（编码的蛋白蔗糖合成酶的氨基酸序列为序列表中序列9）、第3727-3952位核苷酸所示pB7RWG2载体骨架上的35S终止子。
[0127] 5）pHMW-GbssIIa
[0128] 以 小 麦（Triticum astivum var.Chinese spring，记 载 在 如 下 文 献 中：Johnson,J.W.，Adult-plant resistance to powdery mildew in Knox62wheat，Cereal Research Communications，Volume31,Issue3-4,2003,Pages281-288；公众可从东北师范大学获得）的基因组DNA为模板，以HMW-Glutenin promoter引物F和R为引物（序列见表
2），进行PCR扩增，得到426bp的PCR产物即为HMW-Glutenin启动子；
2），进行PCR扩增，得到426bp的PCR产物即为HMW-Glutenin启动子；
[0129] 以玉米幼叶cDNA为模板，以GbssIIa的F和R引物（序列见表2），进行PCR扩增，得到1830bp的PCR产物即为GbssIIa基因编码区。
[0130] 上述扩增得到的HMW-Glutenin启动子带有attB1和attB5r重组位点，上述扩增得到的GbssIIa基因编码区经过attB5和attB2重组位点；将2个带有重组位点的序列在Invitrogen公司提供的GateWay重组试剂盒(Multisite Pro Plus Kitfor2-,3-or4-fragment recombination(12537-100),Invitrogen)反应下，通过一次重组反应直接连接2个目的片段到载体pB7RWG2中,得到pHMW-GbssIIa。
[0131] 将pHMW-GbssIIa经过测序，结果为该载体为将序列表中序列5自5’末端第28-2307位核苷酸所示GbssIIa基因表达盒中的HMW-Glutenin启动子和GbssIIa基因编码区插入pB7RWG2载体（attB1和attB2位点间）得到的载体。GbssIIa基因表达盒包括序列表中序列5自5’末端第28-453位核苷酸所示的HMW-Glutenin启动子、第478-2307位核苷酸所示的GbssIIa基因编码区（编码的蛋白颗粒结合淀粉合成酶GbssIIa的氨基酸序列为序列表中序列10）、第3034-3259位核苷酸所示pB7RWG2载体骨架上的35S终止子。
[0132] 二、转基因植物的获得
[0133] 1、基因枪法获得转基因植物
[0134] 利用PDS-1000台式基因枪进行玉米（H99，以下也称为野生型玉米）幼胚转基因操作，具体步骤如下：
[0135] 1）材料选取：根据授粉时间，取授粉后12天玉米H99种子的幼胚，此时玉米幼胚长约1.8mm；
[0136] 2）冲洗玉米穗：加1滴Tween20，在清水下浸泡、冲洗30min，然后用75%的乙醇泡30min，再用无菌水冲洗三遍；
[0137] 3）预培养：将经过2）处理后的幼胚，胚轴向下，盾面向上，放在铺有滤纸（2x2cm）的含有愈伤组织诱导培养基N6E的培养皿中，30个幼胚/培养皿；缠好封口膜，置于培养箱，28℃，暗培养3天；得到预培养后幼胚；
[0138] 愈伤组织诱导培养基N6E的按照如下方法制备：向N6基本培养基中添加终浓度为2.76g/L脯氨酸、终浓度为100mg/L肌醇、终浓度为2mg/L2，4-D、终浓度为100mg/L水解酪蛋白、终浓度为25uM硝酸银、终浓度为30g/L蔗糖和终浓度为2.5g/L植物凝胶，用水补足体积，调节培养基pH值为5.8。
[0139] N6基本培养基具体组分及各组分的终浓度如下：硫酸铵463mg/L,硼酸1.6mg/L,无水氯化钙125.33mg/L，二水乙二胺四乙酸二钠37.25mg/L,七水硫酸铁27.85mg/L，无水硫酸镁90.37mg/L，一水硫酸锰3.3mg/L，碘化钾0.8mg/L，硝酸钾2830mg/L，磷酸钾400mg/L，七水硫酸锌1.5mg/L，甘氨酸2mg/L,烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L。
[0140] 4）高渗预培养：
[0141] 将预培养后幼胚（即成形并膨大的幼胚，认为开始形成TypeII愈伤组织）转入含有N6OSM培养基的培养皿（直径3.5cm）中，28℃，暗培养，进行高渗处理8h；得到高渗预培养后幼胚；
[0142] N6OSM培养基配方及终浓度具体如下：N6基本培养基、0.69g/L脯氨酸、100mg/L肌醇、2mg/L2，4-D、100mg/L水解酪蛋白、36.4g/L山梨醇、36.4g/L甘露醇、29mg/L硝酸银、30g/L蔗糖、终浓度为2.5g/L植物凝胶；用水补足体积，调节培养基pH值为5.8。
[0143] 5）载体处理
[0144] 在高渗处理期间，灭菌Holder和阻挡网，在金粉子弹中加入5μl已等摩尔比预混好的混合载体DNA，混匀，准备好后放在冰上，得到包裹了质粒的金粉悬液。
[0145] 混合载体DNA的浓度为1μg/μl，载体的加入量为5μg；0.5mg金粉包裹5μg混合载体DNA（金粉与混合载体的质量比为100：1）。混合载体DNA为按照摩尔比1:1:1:1:1混合的5种载体pTRAuxBar、pGt1-Bt2、pISA-Sh2、pB1hor-Sh1和pHMW-GbssIIa。
[0146] 6）将4）得到的高渗预培养后幼胚放入基因枪，在载体膜上滴加5）得到的包裹了质粒的金粉悬液，基因枪真空度27～28psi，用650psi和1100psi可裂膜各轰击一次，可裂膜至靶点距离：6cm/9cm；得到轰击后幼胚；
[0147] 7）将轰击后幼胚（在滤纸上）在N6SOM培养基上28℃再次高渗预培养20h，采用暗培养，得到轰击后高渗处理幼胚；
[0148] 8）将轰击后高渗处理幼胚转移至无滤纸的N6E培养基上进行传代培养，传代培养条件为28℃暗培养14天，得到传代培养幼胚；
[0149] 9）将传代培养幼胚转移至N6S培养基上筛选培养，筛选培养条件为28℃暗培养3周/次，共筛选3次，得到愈伤组织（抗除草剂biolaphos）。
[0150] N6S培养基配方具体如下：N6基本培养基、100mg/L肌醇、2mg/L2，4-D、2mg/L Bialaphos、6mg/L硝酸银、30g/L蔗糖、2.5g/L植物凝胶；用水补足体积，调节培养基pH值为5.8。
[0151] 10）将愈伤组织（选择易碎的TypeII愈伤组织，直径4mm以内）转移到分化诱导培养基RMI上进行分化培养，分化培养的条件为25℃，暗培养3周，得到带有幼叶的愈伤组织（包括地上部分幼叶和地下部分的愈伤组织）；
[0152] 分化诱导培养基RMI具体配方如下：MS基本培养基、6-BA1mg/L、100mg/L肌醇、3mg/L双丙胺膦（Bialaphos）、60g/L蔗糖、终浓度为3g/L植物凝胶；用水补足体积，调节培养基pH值为5.8。
[0153] MS基本培养基具体配方为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，七水硫酸镁370mg/L，二水氯化钙440，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰
[0154] 22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/L，七水硫酸亚铁27.85mg/L，甘氨酸[0155] 2mg/L,盐酸硫胺素0.1mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,烟酸0.5mg/L；用水补足体积。
[0156] 11）将带有幼叶的愈伤组织转移至RMII培养基中生根培养，生根培养条件为25℃16h光/8h暗培养15天，光照强度为4000lux，可长出幼苗（即得到转基因植物）；
[0157] RMII培养基配方为：MS基本培养基、100mg/L肌醇、60g/L蔗糖、终浓度为3g/L植物凝胶；用水补足体积，调节培养基pH值为5.8。
[0158] 12）待幼苗长到3cm以上，根系完整时，将幼苗从RMII培养基移栽到盛有土的纸杯中，25℃，光培养，每天观察土表面，待彻底干燥后浇水；当纸杯中幼苗长到25cm高时即可移栽到大盆中，撕掉纸杯，将土和苗移栽倒花盆或者实验田里，得到250株T0代转基因玉米。
[0159] 将空载体pB7RWG2采用同样的方法转入野生型玉米中，得到转空载体玉米。
[0160] 2、转基因玉米的鉴定
[0161] 1）、Gus染色检测报告基因瞬时表达
[0162] 为了检测基因枪法转基因中的参数设置，微弹轰击幼胚是否均匀，转入了一个带有瞬时表达GUS基因的表达载体。幼胚转化后，在培养箱培养1～2天，进行GUS染色。具体操作步骤如下：
[0163] （1）将上述1的步骤6）得到的轰击后幼胚浸入0.4%甲醛溶液中，室温下45min；
[0164] （2）用0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗植物组织3遍；
[0165] （3）将植物组织放入底物工作液中，37℃状态下3h(可过夜)；
[0166] （4）用75%的乙醇脱去背景颜色；
[0167] （5）观察植物组织的蓝色斑点。
[0168] 准备溶液如下：
[0169] A．0.2M磷酸盐缓冲液，pH7.0：
[0170] 磷酸二氢钾KH2PO4（MW136.09） 22.22g/L
[0171] 磷酸氢二钾K2HPO4（MW174.20） 34.84g/L
[0172] 用10N KOH将pH调至7.0
[0173] B．0.1M磷酸盐缓冲液（P-buffer），pH7.0：
[0174] 将溶液A和蒸馏水等体积混合
[0175] C．10%Triton X-100：
[0176] 将10mL Triton X-100加入到蒸馏水中至终体积100mL。
[0177] D．38.8mM X-Gluc贮存液：
[0178] 将1g X-Gluc溶于49.4mL二甲基亚砜，用离心管分装，20℃存储。
[0179] E．50mM铁氰化钾K3Fe(CN)6（MW329.26）：
[0180] 将16.464g K3Fe(CN)6溶于1L蒸馏水中。
[0181] F．50mM亚铁氰化钾K4Fe(CN)6(MW422.39)：
[0182] 将21.12g K4Fe(CN)6溶于1L蒸馏水中
[0183] G．100mM EDTA(MW380)：
[0184] 将38g EDTA溶于1L蒸馏水中
[0185] H．染色液，见下表3：
[0186] 表3为GUS染色液配方（体积：微升）
[0187]
[0188] 结果如图1所示，染色完成后，在显微镜下观察，结果表明基因枪法转基因微弹分布均匀，转化效果良好。筛选使用的基因枪主要参数为：可裂膜：600psi/1100psi；可裂膜至靶点距离：6cm/9cm。
[0189] 2）转基因植株中bar的检测
[0190] （1）除草剂检测试剂盒
[0191] 为了初步检测转基因是否成功，采用美国envirologix公司试剂盒TM
QuickStix Kit for (bar)Cotton leaf&seed对Basta筛选的250株T0代
转基因玉米进行检测：
QuickStix Kit for (bar)Cotton leaf&seed对Basta筛选的250株T0代
转基因玉米进行检测：
[0192] a.用试剂盒中Disposable Tissue Extractor tube的管盖和管帽夹住T0代转基因玉米的叶片，取下一个或两个圆形的叶片组织，用试剂盒中自带的研杵将叶片组织推入锥形管底部，装有样品的管用防水记号笔标记好；
[0194] c.向管内加入0.5mL Extraction Buffer；
[0195] d.继续用研杵棒捣碎叶片，使捣碎的叶片组织与Extraction Buffer充分混匀；
[0196] e.拿出研杵棒，将试纸条插入混匀的Extraction Buffer和叶片组织中检测，等待一分钟左右，观察反应结果。
[0197] 应用试剂盒对经过Basta筛选的250株T0代转基因植株进行检测，结果如图2所示，试纸条上出现两条带为阳性，只有一条说明是阴性；得到193株bar基因阳性T0代转基因玉米。
[0198] （2）转基因植株的bar基因PCR分析
[0199] 为了进一步检测转基因是否成功，根据除草剂筛选标记bar基因设计了特异引物。引物
[0200] 序列为：上游引物P1：5'-GCACCATCGTCAACCACTACATC-3'
[0201] 下游引物P2：5'-AGCTGCCAGAAACCCACGT-3'
[0202] 以193株bar基因阳性T0代转基因玉米基因组DNA为模板，用P1和P2为引物进行PCR扩增，得到433bp扩增产物为阳性，进一步证明得到193株bar基因阳性T0代转基因玉米。
[0203] 3）Southern杂交分析
[0204] 将上述193株bar基因阳性T0代转基因玉米播种、收种，直到得到T4代转基因玉米，提取基因组DNA。以转空载体玉米和野生型玉米（H99）为对照。
[0205] （1）玉米基因组DNA的酶切
[0206] 用EcoRI限制性内切酶根据说明书酶切基因组DNA（本实验所用的限制性内切酶均购自New England Biolabs公司）：T4代转基因玉米基因组DNA30μg，EcoRI Buffer5μl，EcoRI酶1μl，100×BSA0.5μl，用去离子水补至总体积为50μl。37℃，酶切8小时。
[0207] （2）基因组DNA转膜
[0208] 酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳(电压为1v/cm，24h)分离。在紫外凝胶分析仪上切去样品四周多余的胶，但留有溴酚兰的位置，在胶的右上角切“三角”做正面的标记，记下胶的长、宽。凝胶在0.125M的HCl中预处理振荡恰恰10min，至溴酚蓝指示剂的颜色由蓝变黄，使DNA脱嘌呤，倒掉HCl，用蒸馏水漂洗5次，以免HCl与下步的NaOH中和。以中性转移液（10X SSC：氯化钠1.5M，柠檬酸钠1.5M）用虹吸法将DNA转移到Hybond N+尼龙膜上（Amersham），转移过夜后进行紫外交联，然后将膜用2x SSC浸泡2-5min后再自然干燥，常温保存备用。
[0209] （3）探针制备及标记
[0210] 探针分别为GbssIIa、Sh1、Sh2、Bt2和bar基因CDS的PCR产物，上述每个基因CDS的PCR产物所需的引物与克隆这些基因时用的引物序列相同，详见表2。
[0211] 探针的标记使用Roche公司生产的DIG DNA Labeling Kit试剂盒进行：首先，将加入需要标记的DNA样品（10ng-3μg，一般1μg标记后可分三次使用），用双蒸馏水稀释到15μl，置于沸水中约10分钟使之完全变性，然后迅速取出放于冰上。在装有变性DNA的管中加入以下试剂：
[0212] Hexa nucleotide Mix,10× 2μl
[0213] dNTP Labeling Mix 2μl
[0214] Klenow enzyme labeling grade 1μl
[0215] 混匀后离心，37℃反应1-20h，随反应时间不同，反应产物产量不等，具体参考参数如下：
[0216] 表4探针标记产量与效率
[0217]
[0218]
[0219] 反应完成后，加入0.2M EDTA（pH8.0）2μl终止反应，或65℃加热10min终止反应。最后杂交液中探针的含量为每ml中小于25ng。
[0220] （4）Southern杂交
[0221] 首先进行预杂交，将预杂交液（10g/L BSA）融化，倒入杂交管中，42℃预杂交。新膜最好大于4个小时。将混有探针（探针分别为GbssIIa、Sh1、Sh2、Bt2和bar基因CDS的PCR产物）的杂交液[5×SSC、0.1%(w/v)SDS、5％硫酸葡聚糖、1/20体积的Liquid block（试剂盒提供）]于沸水中变性10min，迅速放在冰上，将预杂交液倒出，把探针加入到预杂交过的管中，42℃杂交过夜。次日洗脱：将探针倒出，加入洗脱液I[1×SSC，0.1%（W/V）SDS]，65℃反应15min，重复此步一次。然后加入洗脱液II（0.5×SSC，0.1%（W/V）SDS），65℃反应两次，每次20min。
[0223] 常温下，将杂交过的尼龙膜放入适量的Washing buffer中，室温振荡1-5分钟。将膜放入适量的Blocking solution中，于杂交管中反应两次，30min/次。将管中的Blocking solution弃去，倒入适量的Antibody solution中,反应0.5-1h。弃去Antibody solution，将膜放入适量的Washing buffer中漂洗2次，每次15min。将膜上的Washing buffer弃去，将膜放入适量的Detection buffer中2-5分钟。将杂交膜置于一干净的保鲜膜上，并使带有DNA的一面朝上，将适量的检测液(一般为1ml CSPD solution)沿膜一侧均匀地滴在保鲜膜上,通过拖拽保鲜膜四边使检测液均匀分布膜正面，然后静置2-5min。回收多余的CSPD solution。将涂完的杂交膜置于37℃反应15分钟，以增强发光反应,要将膜裸露正面向上放置。注意：此反应过程暴露中膜处在湿润的空气中，膜绝对不能干燥。将膜正面朝上，放于暗盒中。在暗室内将X光底片压于膜上，室温曝光30分钟以上进行压片，然后对X光片进行显影、停影和定影。
[0224] 洗去杂交膜上的探针：先在双蒸水中涮一下杂交过的杂交膜，然后用0.1%SDS，0.2M NaOH在37℃中漂洗两次，每次15分钟，再用2×SSC漂洗5分钟，保鲜膜包好，-20℃保存以备下次杂交。
[0225] Southern blot结果如图3所示，A为草丁膦抗性基因（Bar）编码区为探针、B为腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因（Bt2）编码区为探针、C为腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因（Sh2）编码区为探针、D为颗粒结合淀粉合成酶IIa基因（GbssIIa）编码区为探针、E为蔗糖合成酶基因（Sh1）编码区为探针；各图泳道1-4的P31-4-2均为T4代转基因玉米；可以看出，野生型玉米（H99）对bar基因探针无杂交信号，T4代转基因玉米有明显的bar基因探针杂交信号；野生型H99对其它4个基因的检测探针均有明显杂交信号，但是信号的个数少于T4代转基因玉米，说明野生型H99上的探针信号应来自内源基因，而T4代转基因玉米中新增的探针信号即来自转入的外源基因；在抗除草剂和bar基因PCR鉴定为阳性的193株T0代转基因玉米中，通过对其T4代的southern blot鉴定，证实共有87个T4代转基因玉米株系为5个基因均转入，拷贝数较少,转化效率为45.08%，将这87个T4代转基因玉米株系命名为Southern blot鉴定后阳性T4代转基因玉米。可以看出，采用本发明的方法进行5个基因共转化，得到较高转化效率的共表达转基因植物。
[0226] 4）实时荧光定量RT-PCR
[0227] 将上述87个Southern blot鉴定后阳性T4代转基因玉米的胚乳分别提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，用如下引物对分别进行Real-Time PCR，检测5个基因在Southern blot鉴定后阳性T4代转基因玉米中的表达。以转空载体玉米和野生型玉米（H99）为对照。
[0228] GbssIIa 的 RT-PCR 的 引 物 为 5'-AGATAAGGGTGTTGAGTTGGATGG 和5'-TCGAGACGCCCGACGAA；
[0229] Sh1 的 RT-PCR 的 引 物 为 5'-ATGCCTCCTTTCCTCGTCCT 和5'-ATCATCGTCGTGCCCTTGTAG；
[0230] Sh2 的 RT-PCR 的 引 物 为 5'-TTGGCCCTCACTGAGCAGC 和5'-CACGGAGTCCTTGAGTTCACATC；
[0231] Bt2 的 RT-PCR 的 引 物 为 5'-CTGTGCAGCTAAGACTTCAACAAAC 和5'-CTGTGCAGCTAAGACTTCAACAAAC；
[0232] bar 的 RT-PCR 的 引 物 为 5'-GGCACGCAACGCCTACGACT 和5'-AGCCCGATGACAGCGACCAC；
[0233] 内 参 为 玉 米 actin1 基 因， 引 物 为 5'-CCTGAAGATCACCCTGTGCT 和5'-GCAGTCTCCAGCTCCTGTTC。
[0234] 结果如图4所示，A为腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基（Bt2）基因表达水平，B为腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因（Sh2）表达水平，C为颗粒结合淀粉合成酶IIa基因（GbssIIa）表达水平，D为蔗糖合成酶基因（Sh1）表达水平，E为Bar基因表达 水平；1-1-1、1-1-2、1-1-3、1-1-4、1-1-5、1-1-6、1-4-1、1-4-2、1-4-3、1-4-4、1-4-5、1-4-6、2-5-1、2-5-2、2-5-3、2-5-4、2-5-5、2-5-6、2-8-1、2-8-2、2-8-3、2-8-4、2-8-5、2-8-6为Southern鉴定后阳性T4代转基因玉米；与野生型玉米H99相比，87株Southern鉴定后阳性T4代转基因玉米的5个基因的表达量均提高的共28株，占Southern鉴定后阳性的
32.18%。说明共有28株5个基因共表达T4代转基因玉米。
32.18%。说明共有28株5个基因共表达T4代转基因玉米。
[0235] 上述转化效率高的可能原因：（1）使用各种载体均以等摩尔比例混合，使得除草剂抗性植株中同时转入4种其它外源基因的频率显著提高,而Zhu等其它多基因共转化使用3：1的载体比例，Bar基因载体比例比本发明的高；（2）使用较少的质粒载体用于转化，每批金粉制备子弹时使用5μg混合质粒DNA（少于一般实验方案的10-20μg），容易获得低拷贝的转基因植株，使外源基因表达效率较高，避免转基因沉默；（3）使用高渗培养基前处理幼胚时间延长至8小时，使得基因枪轰击幼胚后的转化效率显著提高；（4）使用优化的培养体系，包括各步骤的培养基配方均经过优化，使得植株再生频率、转基因阳性植株频率均比现有技术显著提高。
[0236] 转空载体玉米和野生型玉米（H99）结果无显著差异。
[0237] 5）reverse PCR分析转基因的插入位点
[0238] 使用Reverse PCR法分析转基因的插入位点。用不同的限制性内切酶切割28株5个基因共表达T4代转基因玉米不同株系的基因组DNA，目的是在基因组DNA上产生短片段，但是对于转入的有功能的启动子、基因序列和终止子上没有切割位点。
[0239] 检测pTRAuxBar载体所需的内切酶为EcoRV，所需的扩增引物如下；
[0240] pG-G1-F1：TTCCTAAAACCAAAATCCAGTG，
[0241] pG-G1-R1：AGACATGCAATGCTCATTATCT；
[0242] 检测载体pGt1-Bt2所需的内切酶为内切酶BamHI，所需的扩增引物如下；
[0243] pG-G1-F1：TCTGCTTCCCTCAACCGTCAC，
[0244] pG-G1-R1：CGCCACCACATTCACATCCA；
[0245] 检测载体pISA-Sh2所需的内切酶为XhoI，所需的扩增引物如下；
[0246] 25-G2-F2：GGCGTTCCGGGTTTCTGG，
[0247] 22-G2-R2：TGGAGCATAGACGACA；
[0248] 检测载体pB1hor-Sh1所需的内切酶为AseI，所需的扩增引物如下；
[0249] 28-G9-F1：CCGAGAATGAACGCCAAGAG，
[0250] 28-G9-R1：CGAACCCAGTGGACATAAGC；
[0251] 检测载体pHMW-GbssIIa所需的内切酶为内切酶AseI，所需的扩增引物如下；
[0252] 29-G10-F1：TTACACTTTTCTTATTTCAGCCA，
[0253] 29-G10-R1：CGTCAATTTGTTTACACCACA；
[0254] 具体过程如下：
[0255] （1）从5个基因共表达T4代转基因玉米的不同单株中分别提取基因组DNA，分别用检测不同载体的内切酶切割1μg，酶切体系如下：
[0256]
[0257] 酶切4hr～过夜，得到酶切后DNA。
[0258] 注：如果需要切割更多的基因组DNA，则体系要成比例扩大。
[0259] （2）连接环化：
[0260]
[0261] 室温放置2hr或16℃过夜，得到连接产物。
[0262] （3）纯化连接产物：用乙醇沉淀或过柱纯化，重溶DNA于50μl水中，得到纯化连接产物。
[0263] （4）以上述连接产物为模板，用扩增引物进行扩增；
[0264] PCR体系：
[0265]
[0266] 1X: 95℃ 5min.
[0267] 35X: 95℃ 30 sec.，55℃ 1min.，72℃ 2.5min.
[0268] 1X: 72℃ 10min.
[0269] （5）将不同PCR产物送去测序，确定插入位点。
[0270] 部分结果如表5所示：
[0271] 表5为外源基因在转基因玉米基因组中插入位点
[0272]
[0273] 可以看出，可以鉴定出表达盒的插入位点。
[0274] 三、转基因植物的功能鉴定
[0275] 取5个基因共表达T4代转基因玉米中的两个株系P31-4-2、P31-11-5；将这两个株系经回交，父本分别为这两个5个基因共表达T4代转基因玉米，母本为野生型玉米（H99）；将回交产生的种子进行淀粉含量检测。以野生型玉米（H99）为对照。
[0276] 总淀粉含量测定选用高氯酸法,直链淀粉含量测定选用国标法（GB5006-1985）。
[0277] 高氯酸法具体如下：
[0278] 1）粗淀粉获得
[0279] 从各株玉米种子中随机挑选5粒,沸水煮3分钟脱去种皮,去胚后将胚乳于50℃烘干至恒重；用研钵将烘干的胚乳研磨成粉,过80目筛,即得到粗淀粉。
[0280] 2）脱去可溶性糖
[0281] (1)称取5O mg1）得到的粗淀粉,倒入7.5ml试管中,加入4ml50%乙醇,8O℃水浴40min,其间不断搅拌混匀；
[0282] (2)5000rpm离心l0min,收集上清和沉淀；
[0283] (3)往沉淀中加入2ml80%乙醇,重复抽提2次,合并上清液，收集残渣。
[0284] 3）、粗淀粉含量的测定
[0285] (1)将上述2）的（3）得到的残渣在50℃烘干,再加入3ml ddH2O,混匀，搅拌,沸水浴15min,冷却后加入2ml高氯酸(72%),震荡提取15min,l000Orpm离心5min,取上清液加入1Oml管中，收集沉淀；
[0286] (2)往上述（1）得到的沉淀中加入2ml高氯酸(72%),重复抽提一次,合并上清(此次抽提离心后不溶物为悬浮物,浮在液面上,容易破碎,吸取上清时要非常小心)；
[0287] (3)取0.5ml上清液稀释至10ml,从中吸取0.5ml液体,加5ml蒽酮试剂（0.2g蒽酮，溶于5ml乙醇，以75%硫酸定容于100ml容量瓶）,沸水浴2min,测定OD620nm的光吸收值；
[0288] 淀粉含量计算公式：淀粉含量%=G*O.9/DW*100%
[0289] G代表样品在620nm处的光吸收度；DW代表种子干重。
[0290] 结果如图5所示，野生型玉米H99的总淀粉含量为65.05%，5个基因共表达T4代转基因玉米P31-4-2的总淀粉含量为75.41%，5个基因共表达T4代转基因玉米P31-11-5的总淀粉含量为75.96%；野生型玉米H99的直链淀粉含量为29.27%，5个基因共表达T4代转基因玉米P31-4-2直链淀粉含量为30.17%，5个基因共表达T4代转基因玉米P31-11-5直链淀粉含量为28.35%。
[0291] 可以看出，多基因共转化转基因玉米的总淀粉含量较野生型玉米均有所增加，而直链淀粉含量没有明显改变。
[0292] 转空载体玉米和野生型玉米（H99）结果无显著差异。
[0293] 在本研究中共转化的4个淀粉合成相关基因中，Sh1和GbssIIa在玉米转基因中未见报道，在转基因植株胚乳淀粉含量检测中，它们的淀粉含量显著提高，说明这些基因共同作用使得总淀粉含量比报道的含量高。
[0294] 与现有的方法相比：李宁等（Li,N.,S.Zhang,et al.(2011)."Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenicmaize."Planta 233(2):241-250.）通过RT-PCR的方法从玉米胚乳cDNA中克隆出玉米AGPase的大小亚基基因Sh2和Bt2,选用玉米胚乳特异性启动子启动Sh2和Bt2基因表达,以除草剂抗性基因为选择标记,构建出Sh2、Bt2单基因过表达植物载体和二者串联的过表达植物载体，采用农杆菌介导的玉米芽尖遗传转化方法将三种载体上目标基因分别转入玉米骨干自交系昌7-2和掖478,总淀粉含量达到74%，直链淀粉比例为23%，李宁等研究中使用的亲本与本专利中使用的亲本材料属于不同的血统，它们与其它自交系组配产生的杂种优势是不同的，而且材料本身是高淀粉含量的品种，本发明使用的H99亲本属于低淀粉含量品种，本发明的转基因材料与亲本相比淀粉含量提高约10%。
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