高粱和甘蔗之间的属间杂种植物及其生产方法
阅读：771发布：2022-11-04
专利汇可以提供高粱和甘蔗之间的属间杂种植物及其生产方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且用于生产属间杂种 植物 的方法及由其生产的植物。在某些方面，通过包含突变 高粱 iap等位基因的高粱亲本植物与第二单子叶植物杂交产生属间杂种植物。也提供了使用这样的植物的方法及由此获得的产物。，下面是高粱和甘蔗之间的属间杂种植物及其生产方法专利的具体信息内容。
1.一种通过高粱亲本植物与甘蔗亲本植物杂交产生的属间杂种植物，其中，所述高粱亲本植物对于隐性iap等位基因是纯合的。
2.根据权利要求1的植物，其中，所述高粱亲本植物为二色高粱植物。
3.根据权利要求1的植物，其中，所述高粱亲本植物为雄性不育的。
4.根据权利要求3的植物，其中，所述高粱亲本植物为高粱系Tx3361的植物。
5.根据权利要求1的植物，其中，所述甘蔗亲本植物为甜根子草、甘蔗或甘蔗x甜根子草杂种植物。
6.根据权利要求5的植物，其中，所述甘蔗亲本植物为甘蔗品种L06-024、HoCP05-904或Ho06-562。
7.根据权利要求1的植物，其进一步包含转基因。
8.根据权利要求7的植物，其中，所述转基因赋予抗病性、抗虫性、除草剂抗性、耐旱性、耐盐性、雄性不育性或增强的糖含量。
9.根据权利要求1的植物的植物部分。
10.根据权利要求9的植物部分，进一步定义为原生质体、细胞、配子、分生组织、根、雌蕊、花药、花、种子、胚、茎或叶柄。
11.根据权利要求10的植物部分，进一步定义为2n植物配子。
12.一种产生权利要求1所述的植物的种子。
13.根据权利要求12的种子，进一步定义为用包含杀虫剂、杀真菌剂、营养物质或水或温度敏感的聚合物的试剂或提高种子的机械处理性能、种子萌发、幼苗建立或生长的试剂涂覆。
14.从权利要求1所述的植物获得的商业产品。
15.根据权利要求14的商业产品，其中，所述商业产品是可发酵的生物燃料原料、甘蔗汁、糖蜜、甘蔗渣、乙醇、生物柴油或糖。
16.根据权利要求1的植物的后代植物，其中，所述后代包括高粱亲本植物的至少第一染色体或其片段和甘蔗亲本植物的至少第一染色体或其片段。
17.权利要求1所述的植物的可再生细胞的组织培养物。
18.根据权利要求17的组织培养物，其中，所述可再生细胞来自胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花药、雌蕊、花、种子、圆荚或茎。
19.由权利要求17所述的组织培养物再生的植物。
20.一种生产商业产品的方法，包括获得权利要求1所述的植物或其部分，和由其生产商业产品。
21.根据权利要求20的方法，其中，所述商业产品是可发酵的生物燃料原料、甘蔗汁、糖蜜、甘蔗渣、乙醇、生物柴油或糖。
22.一种包含赋予雄性不育性的等位基因的高粱植物，其中，所述植物对于隐性iap等位基因是纯合的。
23.根据权利要求22的高粱植物，其中，所述等位基因为ms3。
24.一种产生权利要求22所述的高粱植物的种子。
25.一种产生属间杂种胚或种子的方法，所述方法包括高粱亲本植物与甘蔗亲本植物杂交，其中，该高粱植物对于隐性高粱iap等位基因是纯合的，且用作母本。
26.根据权利要求25的方法，包括拯救杂交产生的胚。
27.根据权利要求25的方法，包括培养杂交产生的胚，以产生属间杂种植物。
28.根据权利要求25的方法，其中，所述胚包括在具有功能性胚乳的种子中。
29.一种通过高粱亲本植物与不同属的第二单子叶植物杂交产生的属间杂种植物，其中，所述高粱亲本植物对于隐性iap等位基因是纯合的。
30.根据权利要求29的植物，其中，所述高粱亲本植物为二色高粱植物。
31.根据权利要求29的植物，其中，所述高粱亲本植物包括雄性不育性。
32.根据权利要求31的植物，其中，所述高粱亲本植物为高粱系Tx3361的植物。
33.根据权利要求29的植物，其中，所述第二单子叶植物为禾本科植物。
34.根据权利要求29的植物，其中，所述第二单子叶植物为甘蔗属、芒属、甘蔗属x芒属杂种、蔗茅属、印第安草属、黍属、狼尾草属或玉蜀黍属植物。
35.根据权利要求29的植物，其中，所述第二单子叶植物为柳枝稷、紫狼尾草、绿毛狼尾草、珍珠狼尾草、大须芒草、沙地须芒草、裂稃草、黄假高粱、芦竹、Tripsicum dactyloides、碱地鼠尾粟、五节芒、中国芒、玉米、尼加拉瓜玉米、多年生玉米或大刍草植物。
36.根据权利要求29的植物，其进一步包含转基因。
37.根据权利要求36的植物，其中，所述转基因赋予抗病性、抗虫性、除草剂抗性、耐旱性、耐盐性、雄性不育性或增强的糖含量。
38.根据权利要求29的植物的植物部分。
39.根据权利要求38的植物部分，进一步定义为原生质体、细胞、配子、分生组织、根、雌蕊、花药、花、种子、胚、茎或叶柄。
40.根据权利要求39的植物部分，进一步定义为2n植物配子。
41.一种产生权利要求29所述的植物的种子。
42.根据权利要求41的种子，进一步定义为用包含杀虫剂、杀真菌剂、营养物质或水或温度敏感的聚合物的试剂或提高种子的机械处理性能、种子萌发、幼苗建立或生长的试剂涂覆。
43.从权利要求29所述的植物获得的商业产品。
44.根据权利要求43的商业产品，其中，所述商业产品是可发酵的生物燃料原料、甘蔗汁、糖蜜、甘蔗渣、乙醇、生物柴油或糖。
45.根据权利要求29的植物的后代植物，其中，所述后代包括高粱亲本植物的至少第一染色体或其片段和第二单子叶亲本植物的至少第一染色体或其片段。
46.权利要求29所述的植物的可再生细胞的组织培养物。
47.根据权利要求46的组织培养物，其中，所述可再生细胞来自胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花药、雌蕊、花、种子、圆荚或茎。
48.由权利要求46所述的组织培养物再生的植物。
49.一种生产商业产品的方法，包括获得权利要求29所述的植物或其部分，和由其生产商业产品。
50.根据权利要求49的方法，其中，所述商业产品是可发酵的生物燃料原料、甘蔗汁、糖蜜、甘蔗渣、乙醇、生物柴油或糖。
51.一种产生属间杂种胚或种子的方法，所述方法包括高粱亲本植物与第二单子叶亲本植物杂交，其中，该高粱植物对于隐性高粱iap等位基因是纯合的，且用作母本。
52.根据权利要求51的方法，包括拯救杂交产生的胚
53.根据权利要求51的方法，包括培养杂交产生的胚，以产生属间杂种植物。
54.根据权利要求51的方法，其中，所述胚包括在具有功能性胚乳的种子中。
55.根据权利要求51的方法，进一步包括使属间杂种植物回交，以获得第三单子叶植物。
56.根据权利要求55的方法，进一步包括使第三单子叶植物近交，以产生对于至少一个基因渗入的性状或基因而言为纯合的基因渗入后代。
57.根据权利要求51的方法，其中，所述高粱亲本植物包含赋予遗传或细胞质雄性不育性的基因。
58.根据权利要求57的方法，其中，所述高粱亲本植物为高粱系Tx3361的植物。
59.根据权利要求51的植物，其中，所述单子叶亲本植物选自禾本科。
60.根据权利要求51的方法，其中，所述单子叶亲本植物选自甘蔗属、芒属、蔗茅属、玉蜀黍属、印第安草属、黍属和狼尾草属。
61.根据权利要求51的方法，其中，所述单子叶亲本植物为甘蔗、甜根子草或甘蔗x甜根子草杂种植物。
62.根据权利要求51的方法，其中，所述单子叶植物为柳枝稷、紫狼尾草、绿毛狼尾草、珍珠狼尾草、大须芒草、沙地须芒草、裂稃草、黄假高粱、芦竹、Tripsicum dactyloides、碱地鼠尾粟、五节芒、中国芒、玉米、尼加拉瓜玉米、多年生玉米或大刍草植物。
63.根据权利要求51的方法，其中，高粱亲本植物与第二单子叶亲本植物杂交包括：
(i)从单子叶亲本植物收集花粉；和
(ii)用所述花粉对高粱亲本植物的花授粉。
64.根据权利要求51的方法，其中，所述属间杂种植物或种子用染色体加倍剂处理。
65.根据权利要求64的方法，其中，所述染色体加倍剂为化学染色体加倍剂。
66.根据权利要求51的方法产生的属间杂种种子、植物或其部分。
67.根据权利要求53的植物的后代属间杂种植物，其中，所述后代包括高粱亲本植物的至少第一染色体或其片段和第二单子叶亲本植物的至少第一染色体或其片段。
高粱和甘蔗之间的属间杂种植物及其生产方法
[0001] 发明背景
[0002] 本申请要求于2008年10月6日提交的美国临时申请第61/103,085号和2008年7月24日提交的美国临时申请第61/083,436号的优先权。上述申请通过参考完整引入本文中。
[0003] 本发明是在美国农业部(USDA)提供的CSREES国家研究启动基金(CSREES National Research Initiative grant)第2004-35300-14686号的支持下作出的。美国政府拥有本发明的某些权利。1.发明领域
[0004] 本发明一般地涉及植物遗传学领域。尤其是，它涉及属间杂种植物及其生产和使用方法。
[0005] 2.相关技术的说明
[0006] 到2025年，世界能源消费预计在2002年的水平上增加57％。虽然许多不同的替代能源将用来满足这种需求，但是很明显，从生物质生产能源将是满足2007年能源独立和安全法案(Energy Independence and Security Act of 2007)所描述的目标所必需的，其要求燃料生产者到2022年每年至少使用360亿加仑的替代燃料。仅从淀粉生产替代燃料并不能满足这些目标。这需要在研究和工业实施方面有大量的投资才能达到这些生产目标。这种新的生物燃料产业的发展必须立足于专用生物能原料生产，以确保一致和稳定的生物质供应，从而证明建立生物质转化工厂需要的大量的资本投资是合理的。虽然目前的饲料和粮食作物的作物残余物可以使用并且也将使用，但它们可能只是用来在需要的基础上作为由专用能源作物生产生物质的补充。
[0007] 迄今相对较少侧重于发展和改善专用于生物燃料生产的作物。建议作为专用生物燃料原料的几个最常见的物种包括柳枝稷(Panicum virgatum)、杨树(杨属的种(Populus sp.))、糖/能源甘蔗(sugar/energycane)(甘蔗属的种(Saccharum sp.))、芒草(芒属的种(Miscanthus sp.))和高粱(二色高粱(Sorghum bicolor))。现在有聚焦于增强这些植物物种的纤维素生物能潜力的农艺学、培育和基因组计划。但是，目前还没有表现出专门生物燃料原料所需的所有特性的特定作物品种。
发明内容
[0008] 在第一方面，本发明提供了通过高粱亲本植物与不同属的单子叶植物杂交获得其后代而产生的属间植物。高粱亲本植物可能对于隐性高粱iap等位基因是纯合的。在某些方面，例如，单子叶亲本植物为草，如禾本科(Poaceae)植物。例如，第二单子叶亲本植物可以是甘蔗属、芒属、甘蔗属x芒属杂种、蔗茅属(Erianthus)、印第安草属(Sorghastrum)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)或玉蜀黍属(Zea)植物。在某些特定的实施方式中，第二单子叶植物是紫狼尾草(Pennisetum purpureum)、柳枝稷、绿毛狼尾草(Pennisetum ciliare)、珍珠狼尾草(Pennisetum glaucum)、大须芒草(Andropogon gerardii)、沙地须芒草(Andropogon hallii)、裂稃草(Schizachyrium scoparium)、黄假高粱(Sorghastrum nutans)、芦竹(Arundo donax)、Tripsicum dactyloides、碱地鼠尾 粟(Sporobolus airiodes)、五节芒(Miscanthus floridulus)、中国芒(Miscanthus sinensis)、玉米(Zea mays)、尼加拉瓜玉米(Zea nicaraguensis)、多年生玉米(Zea perennis)或大刍草(Zea diploperennis)植物。在特定的方面，高粱和/或第二亲本植物包含一种或多种转基因。
[0009] 因此，在一种实施方式中，本发明提供了从高粱亲本植物产生的属间杂种植物。在某些方面，高粱亲本植物是二色高粱植物或二色高粱和野生高粱品种之间的杂种，其中该植物对于隐性高粱iap等位基因是纯合的。在另外的实施方式中，亲本高粱植物包括雄性不育性状，诸如细胞质或遗传雄性不育等位基因(例如，高粱ms3)。在一个具体的实施方式中，亲本高粱植物可以被定义为农艺学优良高粱植物。本领域的技术人员理解，农艺学上优良是指对于有益的表型有贡献的可区别的性状的顶点，所述有益的表型使得生产者能够收获商业上有意义的产品。这些性状可以包括产量、活力、抗病性、环境应激耐受性和抗虫性。在另外的具体实施方式中，高粱植物可以是适于生物燃料生产的农艺学上优良的高粱植物。在另外的实施方式中，亲本高粱植物可以是高粱系Tx3361的植物。
[0010] 在另一方面，本发明提供了本文公开的属间杂种植物的一部分。属间杂种植物的部分包括但不限于，原生质体、细胞、配子、分生组织、根、雌蕊、花药、花、种子、胚、茎或叶柄。在某些方面，提供属间植物的种子。在某些情况下，属间植物种子可以被定义为包含功能性胚乳。在另外的方面，植物种子可以包括包含杀虫剂、杀真菌剂(参见，例如，美国专利第3,849,934号)、营养物质或水或温度敏感的聚合物的人工种子涂层。在某些方面，种子涂层包括提高种子的机械处理性能、种子萌发、幼苗建立或生长的试剂。可以用于种子涂层的工艺在以下专利中公开，例如，美国专利第2,799,241、3,089,824、3,177,027、3,196,827、3,207,824、3,241,520和3,253,994号，通过参考引入本文。本领域的技术人员应当认识到，种子涂层可以用于，例如，提高种子的生存力(例如，发芽的种子的百分比)或耐贮性。在另外的方面，提供包含两倍高粱染色体的植物的属间植物部分，诸如包含2n高粱染色体的植物配子。本领域的技术人员应当认识到，在某些方面，这种配子可以通过用微管抑制剂或染色体加倍剂如化学染色体加倍剂(例如，秋水仙素)处理属间植物来生产。
[0011] 在再另一方面，本文提供的属间植物可以被定义为包含一种或多种转基因。例如，属间植物可以包含赋予抗病性、抗虫性、除草剂抗性、抗旱性、耐盐性、雄性不育性、增加的生物质或提高的糖含量的转基因。在具体的实施方式中，转基因可以被直接引入属间杂种植物。在另外的方面，转基因可以从亲本植物遗传。亲本植物可能已被直接转化或可能已经从其祖先遗传了转基因。在某些方面，本发明提供了一种方法，包括亲本高粱植物与第二植物杂交，其中亲本高粱植物和/或第二植物包含转基因，和选择包含转基因的后代植物。在某些方面，涉及培育本发明的转基因植物的方法可以包括通过标记辅助的选择(例如，通过检测转基因或其产物)来选择后代植物。
[0012] 在另外的实施方式中，提供了本文所述的属间杂种植物的后代植物。在具体的实施方式中，后代植物通过无性繁殖或通过嫁接产生。在一些另外的方面，后代植物可以从种子长成。
[0013] 在更另外的实施方式中，提供了本文所述的属间植物的可再生细胞的组织培养物。在某些方面，可再生细胞可以来自属间植物的胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花药、雌蕊、花、种子、圆荚(boll)或茎。因此，在某些方面，提供了由组织培养物可再生细胞再生的属间植物。
[0014] 在再另一实施方式中，提供了一种生产商业产品的方法，包括获得属间杂种植物或其部分，和由其产生商业产品。在某些方面，商业产品被定义为可发酵(如生物燃料)的原料、蔗糖汁、甘蔗渣、乙醇、生物柴油、糖、青贮饲料、谷物面粉或动物饲料。在某些方面，属间杂种植物为Sorcane植物，商业产品为可发酵(如生物燃料)的原料、Sorcane汁、糖蜜、甘蔗渣、乙醇、生物柴油、生物塑料或糖。例如，可发酵的原料可以用于生产生物燃料诸如乙醇(参见，例如，美国专利5,053,231和6,927,048，通过参考引入本文)、生物柴油、化学品(例如，乙酸和氨)，或可以用于气化。在某些方面，属间杂种植物或其部分可以作为纤维素原料。例如，来自属间杂种的纤维素材料可以被酶和或化学地消化为用于乙醇发酵的游离碳水化合物(参见，例如，美国专利第4,355,108号，通过参考引入本文)。因此任何这样的商业产品构成本发明的一个部分。
[0015] 在某些方面，本发明提供了Sorcane汁，诸如由Sorcane植物部分纯化或基本上纯化的糖溶液。在某些方面，Sorcane汁可以被定义为包含高粱多核苷酸或多肽序列。例如，Sorcane汁可以被定义为包含编码隐性高粱iap等位基因的高粱多核苷酸序列。在另外一方面，汁可以被定义为包含高粱和甘蔗DNA。
[0016] 在另外的具体实施方式中，提供了通过高粱亲本植物与甘蔗属(或甘蔗属杂种，诸如甘蔗属x芒属植物)亲本植物杂交而产生的“Sorcane”属间杂种植物，其中高粱亲本植物对于隐性高粱iap等位基因是纯合的。例如，高粱亲本植物可以是二色高粱植物或二色高粱和野生高粱品种之间的杂种。甘蔗亲本植物的一些例子包括但不限于：甜根子草(Saccharum spontaneum)、甘蔗(S.officinarum)或甘蔗(Saccharum officinarum)x甜根子草杂种植物。在某些特定的方面，可以产生作为高粱亲本植物和甘蔗植物的L06-024、HoCP05-904或Ho06-562品种之间的杂种的Sorcane植物。
[0017] 在再另一方面，本发明提供了一种包含雄性不育性状的高粱植物或其部分，其中该植物对于隐性高粱iap等位基因是纯合的。例如，高粱植物可以包括细胞质或遗传雄性不育性。在某些方面，高粱植物包括高粱ms3遗传不育性状。在某些具体方面，植物可以是系Tx3361的植物。
[0018] 在更另一方面，本发明提供了一种生产属间胚的方法，该方法包括以下步骤：(a)高粱植物与第二单子叶植物杂交，该第二单子叶植物是不同于高粱的物种，其中第一高粱植物对于隐性高粱iap等位基因是纯合的，并用作母本；和(b)获得杂交产生的属间杂种胚。在某些情况下，该方法可以进一步包括步骤(c)培育杂种胚以产生属间杂种植物。在某些方面，本文提供的方法可以被定义为生产属间杂种植物的方法。在另外的方面，用于本文所述的方法的高粱亲本植物包括雄性不育性，例如包括遗传雄性不育性或细胞质雄性不育性。
[0019] 在更另一方面，本发明的方法可以包括生产多种属间杂种植物，和选择属间杂种，其中属间杂种包括不同于每个亲本的特性。在一些实施方式中，该方法还包括(d)使属间杂种植物回交以获得单子叶植物。在另外的实施方式中，该方法包括进一步使植物回交以产生对于至少一种基因渗入性状或基因而言为纯合的基因渗入后代植物。
[0020] 在某些方面，根据本发明与高粱植物杂交的第二亲本植物为禾本科植物。例如，第二亲本植物可以是甘蔗属、芒属、甘蔗属x芒属杂种、蔗茅属、印第安草属、黍属、狼尾草属或玉蜀黍属植物。在某些特定的实施方式中，第二单子叶植物是紫狼尾草、绿毛狼尾草、珍珠狼尾草、大须芒草、沙地须芒草、裂稃草、黄假高粱、芦竹、Tripsicum dactyloides、碱地鼠尾粟、五节芒、中国芒、玉米、尼加拉瓜玉米、多年生玉米或大刍草植物。在一些具体方面，第二单子叶植物可以是甘蔗属，例如甘蔗、甜根子草或甘蔗x甜根子草杂种。在一些其他方面，第二单子叶植物可以是芒属植物，诸如中国芒。
[0021] 在某些方面，可以在属间杂种或其后代与非高粱亲本植物(例如，须芒草族(Andropogoneae)亲本植物)、其克隆或与同一物种在生物能产量方面至少90％相同的植物之间进行回交。在一些其他方面，在某些方面，可以在属间杂种或其后代与高粱亲本植物之间进行回交。回交可以是连续回交，例如回交至少2至10次。
[0022] 在某些实施方式中，这种方法可以包括：(i)从第二单子叶植物收集花粉，和(ii)用所述花粉对高粱亲本植物的花授粉。
[0023] 在某些方面，用于生产本文所述的属间胚的方法可以进一步被定义为生产杂种种子，其中种子包括胚和功能性胚乳。在某些其他实施方式中，杂种种子可以包括胚和非功能性胚乳。在本发明的一方面，可以使用组织培养方法拯救(rescue)胚(例如，与非功能性胚乳结合的胚)，以生产属间杂种植物。例如，在某些方面，步骤(b)进一步包括通过胚拯救分离杂交产生的胚。
[0024] 在另外的方面，用于在属间杂种植物中表达的特性可以包括生物质产量、改善的生长性状或某些需要的性状。这些特性可能由为杂交选择的特定亲本系导致的杂种优势产生。特性可以包括，例如，生物质含量、能育性(fertility)、无性繁殖、光周期不敏感性、株高、茎直径、抗旱性、种子大小、发芽、贮存后的种子存活力或任何其他感兴趣的特性。例如，可以通过改变蔗糖含量或纤维素含量提高生物质含量。为了比较或量化生物质产量，可以使用本领域的技术人员公知的标准生物质分析程序。标准生物质分析程序的详细方案也可以自由地从美国国家可再生能源实验室获得。例如，可以通过HPLC或近红外反射光谱仪测量蔗糖或纤维素含量。
[0025] 在某些方面，属间杂种植物或种子或F1后代可以用染色体加倍剂处理，以增加能育性，诸如化学染色体加倍剂(如秋水仙碱或功能等效物)。用染色体加倍剂处理属间杂种植物可以用于生成能育的或部分能育的能够自体繁殖的异源多倍体植物。处理后，可以评估属间杂种植物或种子或F1后代的能育性并选择作为父本和/或母本。
[0026] 在另一方面，由前述方法生产的属间杂种可以为种子或植物的形式。
[0027] 在某些实施方式中，也提供根据前述方法生产的属间杂种种子、植物或其部分。在其他方面，也提供根据前述方法由属间杂种植物或种子无性繁殖的后代属间杂种植物或其部分。在另一方面，也提供了根据前述方法制备的具有基因渗入的性状或基因的单子叶后代。
[0028] 至于本文所述的任何其他方法或组合物，可以采用本发明的方法和/或组合物的上下文中所讨论的实施方式。因此，有关一种方法或组合物的实施方式也可以适用于本发明的其他方法和组合物。
[0029] 本文所用的术语“Sorcane”是指高粱属植物和甘蔗属植物(或其杂种)之间的属间杂种植物。在某些方面，Sorcane植物或植物部分可以被定义为包括高粱属的至少一个染色体或染色体片段和甘蔗属的至少一个染色体或染色体片段。
[0030] 本文用于核酸的术语“编码”用来进行本领域的技术人员容易理解的发明，但这些术语分别可以与“包括”或“包含”互换使用。
[0032] 除非明确表示是指唯一的选择或选择对象是相互排斥的，权利要求中的“或”用来指“和/或”，尽管公开内容只支持涉及唯一的选择与“和/或”的定义。本文所用的“另一个”可指至少第二个或更多个。
[0033] 在本申请中，术语“大约”用来表示一个值包括设备、用来确定该值的方法的误差的固有变化，或研究对象之间存在的变化。
[0034] 本发明的其他目标、特点和优势通过下面的详细说明将变得明显。但是，应该理解，说明本发明优选实施方式的详细说明和具体实施例只是通过举例来说明，因为本领域的技术人员根据此详细说明将会明白本发明的精神和范围内的各种变化和修改。附图说明
[0035] 下面的图构成本说明书的一部分，并包括在说明书中以进一步证明本发明的某些方面。结合本文提出的具体实施方式的详细说明，通过参考这些附图中的一个或多个，可以更好地理解本发明。
[0036] 图1A-B：iap基因对于高粱雌蕊上/中的花粉生长的效应。图1A，显示玉米花粉管生长的Tx3361(iap iap)雌蕊，箭头显示玉米花粉管生长通过花柱基部进入子房。图1B，显示没有玉米花粉管生长的BTx623高粱雌蕊，箭头显示玉米花粉管未进入柱头轴。
[0037] 图2：甘蔗属x高粱属杂种植物，从种植的种子发芽而来。
[0038] 图3：代表属间杂种的直接使用的示意图。命名AA指高粱，而MM是指授粉者(pollinator)属，例如芒属、甘蔗属。
[0039] 图4：代表属间杂种的间接(基因渗入)使用的示意图。命名AA指高粱，而MM是指授粉者属，例如芒属、甘蔗属。
[0040] 图5A-C：在College Station，Texas种植的高粱x甘蔗属间杂种的照片。图5A，两株七个月大的高粱x甘蔗杂种。图5B，高粱x甘蔗杂种的花序。图5C，高粱x甘蔗杂种的有丝分裂染色体涂片。
[0041] 图6：基于植物节间位置的白利糖度测量(如利用折射仪测量的汁中的总可溶物)。节间1位于植物基部，最大数目位于植物顶端。在植物大约为8个月大并且还没有进入到繁殖生长时的8月份测量这些植物中的糖分布。
具体实施方式
[0042] 栽植的高粱(二色高粱)已经难以进行传统的植物育种，因为它甚至不能与野生的Eu高粱品种杂交。本发明通过第一次提供用于生产高粱和其他单子叶植物之间的属间杂种的有效方法克服了本领域中的不足。本文提供的属间杂种植物包括可用于各种农业应用的独特的性状和用于生产生物燃料的特定的有益性状。在某些方面，本文所述的方法允许将来自高粱和大批其他单子叶植物属的农艺学上重要的性状组合进入属间杂种植物。使用本文所述的方法，来自各个亲本的农艺学上有利的性状可以在杂种植物中表达，产生大大改善的性状，如生产力、耐寒性、耐旱性、抗病性等。
[0043] 本文的研究表明，对于隐性iap等位基因纯合的高粱植物可以成功地与包括甘蔗属和芒属的种的单子叶植物杂交。生产的杂种植物包括与亲本植物品种截然不同的性状。例如，高粱x甘蔗“Sorcane”被证明包括新型表型特性，包括茎秆中提高的糖含量。
[0044] 在某些方面，本文提供的属间植物和方法可以用来工程设计用于生物燃料生产的先进原料。例如，由于其高的糖含量和在太阳能转换为生物质方面独特的效率，甘蔗是高度优选的生物燃料原料。然而，甘蔗生产在地理上只限于赤道附近多雨地区。在温带干旱气候下，种植高粱，并设想用其作为生物燃料原料，但高粱显示远远低于甘蔗的糖含量。本文提供的方法第一次允许能够在杂种植物中结合来自多个属的理想性状(包括来自高粱的耐旱性和来自甘蔗的糖产生)的育种计划，以生产优良的生物燃料植物。
[0045] I.用于产生属间杂种的亲本植物
[0046] 本发明的某些实施方式提供了用于生产属间杂种的方法，该属间杂种源自第一单子叶植物与作为不同于第一单子叶植物的物种的第二单子叶植物的杂交，诸如通过甘蔗植物与高粱植物杂交。在这种杂种杂交中，虽然认识到每个亲本可以拥有雄花和雌花，但是存在作为亲本的花粉接受体雌性植物，以及作为另一亲本的花粉供体雄性植物。
[0047] 在某些方面，亲本植物可以是单子叶植物。单子叶植物是传统公认的两组主要开花植物(被子植物)中的一种，另一种是双子叶植物。在另一方面，亲本植物可以为须芒草族植物。须芒草族是在热带和温带地区广泛分布的一族草本植物(禾本科)。它们使用C4碳固定生理学。这个族通常被称为高粱族。属于这个族的属包括：须芒草属(Andropogon)、孔颖草属(Bothriochloa)、金须茅属(Chrysopogon)、薏苡属(Coix)、双花草属(Dicanthium)和菅属(Themeda)。这种草在印度、澳大利亚、非洲和南美洲的热带稀树草原丰富存在。
[0048] 作为专用生物燃料原料的高粱、甘蔗和芒是相关的，是须芒草族的代表性的例子。这些物种的每一个具有作为生物质原料的相对强度和潜在弱点，且在这些作物之间转移性状的能力对于作物改良计划是极其有价值的。结合来自其中两个或三个的有利性状可以通过由两个、三个或更多个物种合成无性杂种优势杂种和/或基于杂交从供体物种向另一个物种有性转移基因和性状来完成。遗传转化也是一种可以用来在属之间转移一个或极少量的基因的方法，但现有方法不适合转移有可能在生物燃料原料中有价值的多基因农艺和组成性状。监管部门批准转基因作物的高成本也鼓励传统的(有性)转移方法。
[0049] 为了通过有性转移方法而不是遗传转化实现这个目标，必需克服这些草物种之间的种间和/或属间生殖障碍。在本发明的某些方面，这些生殖障碍可以通过利用高粱突变iap基因来规避，从而提供了组合来自高粱、甘蔗和/或芒物种的最理想性状成为新型专用生物能源原料的可能，以帮助实现2007年能源独立和安全法案列出的目标。
[0050] A.高粱
[0051] 高粱广泛适应，耐旱并通过种子易于繁殖。在历史上，世界各地已经种植高粱作为饲料谷物、粮食和饲料，但正在开发明显不同于那些用于谷物生产的高粱的能量高粱的品种和杂种。在所有草中，高粱唯一作为生物能源作物，因为可获得或可开发提供高产量的淀粉(谷物杂种)、糖(甜高粱栽培变种和杂种)和/或纤维素生物质(饲料和能量高粱杂种)的高粱杂种(Rooney等人，2007)。因为它已经从种子成长为作物，美国许多地区的生产者熟悉其载培，并且他们具有培育和收获该作物所必需的农业基础设施。虽然它通常作为一年生作物种植，但也可截根培植用于多次收获，且是最抗旱和水资源利用效率最高的种植作物之一(Rooney等人，2007)。
[0052] 高粱谷物在美国以外的地区是同样重要的人类食物。在这些地区，谷粒以面包、粥、糖果形式消耗，并且作为酒精饮料，高粱可以被磨成面粉，或直接使用或与小麦或玉米粉混合用于制备食品。除了谷粒的直接食用，高粱早已在世界许多地区被用于制造啤酒。除了人类消费核仁，高粱的用途包括干磨和湿磨工业的产品。高粱干磨的主要产品是粗磨粉、粗粉和细粉。可以通过湿磨法提供食品用的淀粉及其他提取物。
[0053] 高粱提供了工业原料来源。工业用途主要是来自湿磨工业的高粱淀粉和来自干磨工业的高粱面粉。高粱淀粉和面粉已应用于造纸和纺织工业。其他工业用途包括在粘合剂、建筑材料中的应用和作为油井泥浆的应用。大量的高粱，包括谷粒和植物材料，已用于工业酒精生产。
[0054] 本发明涉及的高粱品种包括但不限于，黑高粱(Sorghum almum)、Sorghum amplum、Sorghum angustum、Sorghum arundinaceum、二色高粱(主要栽培种)、Sorghum brachypodum、Sorghum bulbosum、Sorghum burmahicum、Sorghum controversum、Sorghum drummondii、Sorghum ecarinatum、Sorghum exstans、Sorghum grande、假高粱(Sorghum halepense)、Sorghum interjectum、Sorghum intrans、Sorghum laxiflorum、Sorghum leiocladum、Sorghum macrospermum、Sorghum matarankense、Sorghum miliaceum、Sorghum nigrum、光高粱(Sorghum nitidum)、Sorghum plumosum、拟高粱(Sorghum propinquum)、Sorghum purpureosericeum、Sorghum stipoideum、Sorghum timorense、Sorghum trichocladum、Sorghum versicolor、Sorghum virgatum和Sorghum vulgare。
[0055] 用于本发明的高粱的一个例子是二色高粱。在特别的实施方式中，可以使用iap/iap突变高粱，诸如下面描述的那些。也可以使用雄性不育iap/iap突变体，包括系Tx3361，如实施例1中描述的。
[0056] 在某些方面，本文所述的高粱植物可以包括一个或多个农艺学上有利的性状。这些性状可以被培育为亲本高粱系，然后传递到属间杂种植物，或可以直接培育为属间杂种系。在某些方面，可以通过将一个或多个转基因引入高粱植物或属间杂种植物引入农艺学上有利的性状。一方面，通过直接转化来自这样的高粱植物的细胞可以将转基因引入iap/iap高粱系如Tx3361。在另一方面，可以通过包含转基因的高粱植物与iap/iap高粱系如Tx3361杂交将转基因引入iap/iap高粱植物。然后可以使这种杂交获得的F1后代与iap/iap高粱回交或自交(与其他F1后代)，并且针对转基因和纯合iap等位基因的遗传性的存在筛选第二杂交的产物。因此，包括对于隐性iap等位基因纯合的转基因高粱植物作为本发明的部分，并可以在如本文所述的生产属间杂种植物的方法中使用。
[0057] 在某些方面，本发明的高粱和属间杂种植物包括一个或多个农艺学上有利性的状，包括但不限于增加的谷粒产量、增加的糖含量、减少的倒伏、减少的高度、耐旱性、耐盐性、锈病抗性、抗虫性、炭疽病抗性、丝黑穗病抗性、霜霉病抗性、灰叶斑病抗性、带状斑纹病(zonate)抗性、叶枯病抗性、病毒抗性(例如，玉米矮花叶病毒抗性)、蠓(midge)抗性、高粱长蝽(chinch bug)抗性或绿蝽(green bug)抗性。例如，本文所述的植物可以包括以下性状：对于绿蝽(麦二叉蚜(Schizaphis graminum))生物型C和E的抗性或提高的抗性、炭疽病(禾生刺盘孢(Colletotricum graminicola))抗性、霜霉病变型1和3(高梁指梗霉(Sclerospora sorghi))抗性和/或丝黑穗病(Spaoelotheca reiliana)小种1、2、3和4抗性。
[0058] B.甘蔗
[0059] 根据分类说明，甘蔗(甘蔗属)为包括原产于东半球暖温带至热带地区的高大多年生草(禾本科，须芒草族)的6至37个种的属。它们具有粗壮、有节的纤维茎，其茎富含糖，且经测量一般为2至6米高。所有甘蔗种进行种间杂交，主要商业栽培种是复杂的杂种。
[0060] 甘蔗是一种用于生产晶糖的热带原料。它在世界热带地区也广泛用于糖源乙醇的生产，并存在许多其他的甘蔗登记物，其产生更高的生物质产量，但对于糖生产不是理想的。高生物质甘蔗已被命名为能量甘蔗，它们已用于作为纤维素乙醇生产的生物质来源。甘蔗的生物质产量的潜力未被超过，但它是一种热带物种，且它在美国的适应性受其低温敏感性限制。此外，甘蔗需要大量的水，它比高粱更容易受到干旱影响。这些因素进一步限制其生产范围。最后，建立这种多年生作物依靠无性繁殖，这通常是整个作物的生产周期中最昂贵的成本。
[0061] 本发明涉及的甘蔗属(甘蔗)的种包括但必然不限于斑茅(Saccharum arundinaceum)、Saccharum bengalense、Saccharum brevibarbe、甘蔗属肉质花穗野生种(Saccharum edule)、甘蔗、狭叶斑茅(Saccharum procerum)、Saccharum ravennae、甘蔗属大茎野生种(Saccharum robustum)、竹蔗(Saccharum sinense)和甜根子草。设想根据本公开内容使用的一些甘蔗品种包括但不限于甘蔗品种Ho05-961、HB03-403、Ho01-564、Ho05-961、Ho06-525、Ho06-530、Ho06-543、Ho06-552、Ho06-562、Ho06-563、Ho06-565、Ho07-613、Ho95-988、HoCP01-517、HoCP04-803、HoCP04-810、HoCP04-838、HoCP05-903、HoCP05-904、HoCP05-923、HoCP06-502、HoCP96-540、HoL05-953、L01-283、L06-001、L06-024、L06-38、LCP85-384、US02-840、TCP00-4521、TCP01-4535、TCP02-4622、TCP03-4636、TCP03-4645、MPTH97-209、US07-9014、US079026、US079025、L97-128(美国植物专利PP17,636)、L99-226(美国植物专利第PP18,807号)和L99-233(美国植物专利第PP18,826号)。在某些方面，亲本甘蔗植物可以包括一个或多个转基因。例如，亲本甘蔗植物可能已经从祖先植物遗传了转基因或可能已经直接被编码转基因的DNA转化。
[0062] 在某些方面，本文所述的甘蔗植物可以包括一个或多个农艺学上有利的性状。例如，用于本文的甘蔗植物可以是包含转基因的转基因甘蔗植物，该转基因赋予除草剂耐受性(例如，草甘膦耐受性)或抗虫性(例如，甘蔗螟虫(Diatreae saccharalis)抗性)。
[0063] C.芒属
[0064] 芒属植物具有几个品种，其具有作为栽培的生物能源原料的潜力。芒属是包括大约15个原产于非洲和南亚的亚热带和热带地区的多年生草的种的属，一个种(中国芒(M.sinensis))向北扩展到温暖的东亚。种的例子包括但不一定限于，五节芒、巨芒(Miscanthus giganteus)、获(Miscanthus sacchariflorus)(Amur silver-grass)、中国芒、Miscanthus tinctorius和高山芒(Miscanthus transmorrisonensis)。
[0065] 芒的快速生长、低矿物质含量和高生物质产量使其成为作为生物燃料的特别受欢迎的选择。收获后，它可以被燃烧以产生用于动力涡轮机的热和蒸汽。如果不考虑投入(例如，化肥)或生物燃料向使用地点的运送，产生的二氧化碳排放相当于植物在其成长阶段从大气中收集的二氧化碳的量，因此这个过程是温室气体中性的。当与煤以50/50的混合物混合时，它不经改变就可以用于一些目前的燃煤电厂。
[0066] 这些类型中最丰富的是“巨芒草”，即中国芒(二倍体)和荻(四倍体)的自然种间三倍体不育杂种，它必须无性繁殖，例如，通过根茎扦插或体外培养。特定类型的芒(诸如巨芒草)产生高产量的生物质，是多年生的且适应温带气候(Clifton-Brown等人，2001)。大规模的商业可行性尚未得到证实，或者至少尚未公开。
[0067] 设想根据本公开内容使用的另外的植物种和品种包括：中国芒(芒草(Chinese silver grass)、Eulalia草、细叶芒(Maiden grass)、Zebra草、Porcupine草；syn.Eulalia japonica Trin、Miscanthus sinensis f.glaber Honda、丝芒(Miscanthus sinensis var.gracillimus Hitchc)、花叶芒(Miscanthus sinensis var.variegatus Beal)、斑叶芒(Miscanthus sinensis var.zebrinus Beal)、Saccharum japonicum Thunb)，一种原产于东亚遍及中国、日本和韩国大部分地区的草。它是一种多年生草本植物，一般生长到0.8-2米(很少4米)高，由地下根茎形成密集的团块。叶子是18-75厘米长、0.3-2厘米宽。花为紫色，在叶子上方。
[0068] D.另外的单子叶植物
[0069] 另外的单子叶植物可以用来进行如本文所述的属间杂交。例如，在某些方面，属间杂交为高粱和禾本科(草)第二单子叶之间的杂交。例如，可以在以下的高粱植物之间进行杂交：Anomochlooideae、Pharoideae(例如，Pharus和Leptaspis)、Puelioideae、早熟禾亚科(Pooideae)(例如，小麦、大麦、燕麦、雀麦草、芦苇草)、竹亚科(Bambusoideae)(例如，竹)、稻亚科(Ehrhartoideae)(例如，水稻)、芦竹亚科(Arundinoideae)、假淡竹叶亚科(Centothecoideae)、虎尾草亚科(Chloridoideae)、黍亚科(Panicoideae)(例如玉米)Micrairoideae或扁芒草亚科(Danthonioideae)的亚科植物。在某些方面，属间植物可以用来将需要的性状渗入优势高粱遗传背景。相反，在某些情况下，本文所述的属间杂交可以用于将需要的高粱性状渗入其他远亲植物品种。一些具体的属间杂交和属间植物包括但不限于高粱与蔗茅属的种、印第安草属的种、黍属的种、狼尾草属的种和玉米属的基因型杂交。
[0070] 在某些方面，用于本文所述的杂交的单子叶植物本身可以是属间杂种植物。例如，高粱可以与Sorcane植物或miscane植物(芒属x甘蔗属)杂交。
[0071] II.花粉不亲和性系统的应用
[0072] 为了实现开发高效和高产出的生物燃料原料的目标，本发明的某些方面提供了用于结合相关种如高粱、甘蔗、芒中存在的许多理想性状的方法。在某些方面，利用iap在种间和属间相容性方面的作用产生杂种以规避生殖障碍。
[0073] A.自交不亲和性
[0074] 在某些方面，可以利用自交不亲和性，以尽量减少自交或用来自同一种的花粉授粉。受精作用是花粉与雌蕊之间复杂的相互作用，其成功地以雄核和雌核融合结束(de Nettancourt，1997；Swanson等人，2004；Wheeler等人，2001)。雌蕊组织提供支持花粉管生长通过一些细胞环境的不同信号和必要营养(Swanson等人，2004)。同时，雌蕊提出精细的障碍，保护胚珠不接近不适当的花粉，包括种内或种间授粉。
[0075] 有花植物中的自交不亲和性(SI)研究已发展到了对于S-基因序列、基因产物和基因产物相互作用的详细理解的程度(de Nettancourt，1997；Feng等人，2006；McClure and Franklin-Tong，2006；Rahman等人，2007；Tabah等人，2004)。SI通常由单-多等位基因的基因座S控制，基因座S由至少两个紧密连锁的编码自我识别的花粉和雌蕊决定因素的基因组成。近年来，在鉴定SI的雌性决定因素方面已经取得了很大进展。大多数配子体SI系统具有S-RNase作为雌蕊的S-成分，而独特的配子体系统具有小的分泌肽作为雌蕊的成分(Feng等人，2006；McClure and Franklin-Tong，2006)。在SI的孢子形式中，雌蕊决定因素是S-受体激酶，由保守的激酶结构域、跨膜结构域和可变的细胞外受体组成(Naithani等人，2007；Nasrallah and Nasrallah，1993；Nasrallah，2002)。这些基因在生殖组织中的空间和时间表达已经使得能够详细说明导致自交不亲和花粉的识别和排斥的细胞和分子过程。
[0076] B.杂交不亲和性
[0077] 对于属间杂交，必须解决不同种间的杂交不亲和性的问题。对于理解种间杂交不亲和性，存在两个主要模式：不亲和性与不协调性。不亲和性是一种通过不亲和性基因的抑制作用，生殖关系无功能的机制。不亲和性依赖于被认定为“外来的”花粉的主动排斥，类似于上述的SI系统。此外，不协调性不依赖于花粉的主动排斥，而本质上是被动过程，其中由于缺乏关于一个伴侣的遗传信息，发生非功能性。当雄性伴侣缺乏穿透机制以克服在雌性中存在的某些障碍时，存在不协调的关系。由于进化分歧，在彼此分离方面进化的物种更有可能是不协调的伴侣(Hogenboom，1973)。不管所涉及的机制如何，种间杂交的障碍在农作物种中是常见的，克服它们是在种质开发计划中利用种间或属间杂交的先决条件。
[0078] C.高粱中的Iap基因座
[0079] 在高粱属和获得二色高粱和野生高粱种以及那些更远亲的植物之间的杂种的许多失败的尝试中存在杂交障碍。调节雌性高粱植物中的花粉管生长的等位基因已被鉴定和命名为iap。也已鉴定了该基因的隐性突变体形式(iap等位基因)。
[0080] iap的基因座已被定位于高粱连锁群02(SBI-02)的短臂上，且该基因座与一些AFLP和微卫星标记侧面相接。位于iap基因座侧翼的两个最接近的微卫星标记(Xtxp50和Xtxp63)已经与基于测序的、高密度高粱基因组图谱相互对照(参见，例如，Menz等人于2002年公布的Texas A&M University网站上的sorgblast3.tamu.edu)。已经在整个基因组上评估区域重组频率(kbp每cM；每cM的基因)。据预测，跨越此iap基因座的区域具有～165kb/cM的区域重组频率。因此，推断此iap性状基因座已被限定到一个相对较小的片段，～800kbp-1Mbp。
[0081] III.涉及高粱的属间杂种和基因渗入
[0082] 本发明提供了属间杂交和生产生物燃料的方法，包括向杂种或植物物种引入需要的性状。
[0083] A.属间杂种的产生
[0084] 在物种之间转移复杂性状需要成功产生种间或属间杂种。虽然大量文献报道在高粱属与甘蔗属及甘蔗属与芒属之间的罕见杂交，但以前没有已知的芒属与高粱属之间杂交的报告。这些种的很少杂交的能力有可能与它们的遗传相似性有关，例如，高粱和甘蔗只是在500万年前分开(Paterson等人，2004)。高粱属、甘蔗属和芒属的DNA序列在今天保持非常相似(Matthews等人，2002的图1)。然而，只是很少发现能存活的杂种，在1,000次尝试中不到1次，反映出它们的分类学和遗传差别性。这种极端的困难已经排除了这些努力的任何实际应用。
[0085] 相反，本发明提供了一种允许高效生产属间杂种的方法。一方面，这种方法包括以下步骤：(a)获得对于隐性iap(外来花粉基因的抑制)是纯合的高粱植物；(b)高粱植物与除了高粱之外的须芒草族植物杂交，并获得F1后代，其中高粱植物用作母本，非高粱须芒草族植物用作父本；和(c)从F1后代选择属间杂种，其中属间杂种比任何一个亲本具有更高的生物能产量。
[0086] 在根据本发明进行的杂交中，在某些情况下，可能需要在授粉后使用胚拯救以获得如上面所述的能生育的属间杂种植物，因为在某些情况下发明人已发现由属间杂种杂交产生的成熟种子具有低存活率。也可能需要操纵光周期和/或亲本植物的其他生长条件，以确保在各自的亲本植物上能育的花粉和接收花粉的花的同步性。在这个阶段中，在认为合适的情况下，植物可以有利地经肥料和/或其他农药处理。
[0087] 一旦进行属间杂交，重要的是鉴定产生的后代为杂种且不只是自交或用来自同一物种的另一植物的花粉授粉的结果。一种鉴定方法是形态学评价，前提是属间杂种具有足够的区别特性，如本文的情况。特别地，本文所述的特性允许本领域的技术人员根据每个亲本植物产生的植物的物理特性，鉴定植物为属间杂种。
[0088] 不过，其他技术也可以用于本发明，并可以避免因环境变化可能造成的失误。对于所有可能的F1后代植物，可以确定植物的倍性、染色体组成和变异，以及对于一组来自不同基因组位置的亲本多态性分子标记而言，植物的基因型组成和一致性或变异。例如，在某些方面，可以筛选属间后代，以鉴定产生高比例的功能性2n配子体的后代。特别地，为了特定性状的基因渗入，这些后代可以用于育种和回交。
[0089] 例如，如果亲本的基因组大小不同，可以利用流式细胞分析或其他DNA含量测量在早期发育阶段检测杂种。然而，由于DNA含量的差异可能是由于杂种状态以外的其他原因，可能需要另外的分析方法。一旦根尖发育，就可以进行核型分析，前提是亲本互补体的大小、数量和/或形态不同。其他替代方法包括使用基因组原位杂交(GISH)(Schwarzacher等人，1989)或遗传标记分析。
[0090] 遗传标记代表用于分析和鉴定种间杂种植物特别是来自不同单子叶亲本植物的遗传互补的组合的有效方法。本文所用的短语“遗传互补”是指核苷酸序列的集合体，其定义植物的身份或该植物的细胞。例如，可以对本文提供的属间杂种进行基因分型，以确定它相对于示例性的高粱属、甘蔗属/芒属亲本植物具有的遗传标记的代表性样本。
[0091] 遗传标记是在一个基因座处的等位基因。它们优选以共显性方式遗传，使得两个等位基因在二倍体基因座处的存在很容易检测到，而且它们不受环境变化的影响，即它们的遗传度为1。单一基因座基因型的排列可以表示为标记基因型的分布，每个基因型处有两个。每个基因座的标记等位基因组成可以是纯合的或杂合的。纯合性是这样一种情形，其中一个基因座处的两个等位基因的特征在于相同的核苷酸序列或重复序列大小。杂合性是指在一个基因座处的基因具有不同的情形。
[0092] 一种有用的遗传标记类型是简单重复序列(SSR)，因为它们一般都具有高度多态性，且打分成本低。但是，可以使用任何可能的其他类型的遗传标记，例如，限制性片段长度多态性(AFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)和同功酶，来鉴定本发明的植物。
[0093] 在某些方面，可能需要确定后代的性状，包括部分或全部F1后代的能育性、无性繁殖和生物燃料属性，取决于上面的测定结果：如果所有F1看起来相似，则分析一组代表性的F1植物；如果F1植物不同，则作为克隆单独地分析许多F1植物。在另一方面，可以根据想要的性状，如与每个亲本相比改善的生物能产量，选择这些后代或克隆。
[0094] B.基因渗入
[0095] 基因渗入包括基因(基因流)通过回交从一个物种移动到另一个物种的基因库。在本发明的一个实施方式中，可以将种间杂种与其亲本之一回交。这可以允许一个或多个性状基因渗入亲本，特别是将新性状引入物种。基因渗入是一个长期的过程；它可能在回交发生前持续许多杂种代。基因渗入系(简称：IL)是指包含源自类似物种(例如“野生”亲缘植物)的遗传物质作物种的系。基因渗入系允许研究定量性状基因座，而且还通过引入外来性状创造新品种。
[0096] 在本发明的某些实施方式中，也可能提供用于提高非高粱须芒草族植物的生物能产量的方法，该方法包括以下步骤：(a)获得对于隐性iap是纯合的高粱亲本；(b)高粱植物与除了高粱之外的须芒草族植物杂交，并获得F1后代，其中高粱植物用作母本，非高粱须芒草族植物用作父本；(c)从F1后代选择属间杂种，其中属间杂种比非高粱须芒草族植物具有更高的生物能产量；和(d)属间杂种与非高粱须芒草族植物回交，以获得须芒草族后代，其中该须芒草族后代具有较高的生物能产量。在某些实施方式中，这种方法可以进一步包括：(e)使须芒草族后代近交，以产生对于较高的生物能产量纯合的第二后代。
[0097] C.改良的生物能产量的选择
[0098] 在某些方面，属间杂交或基因渗入可以用于本发明，以提高某些植物的生物能产量。可以使用美国国家可再生能源实验室提供的标准生物质分析程序或美国测试和材料协会和纸浆和造纸工业技术协会提供的类似程序，进行较高的生物能产量的选择。
[0099] 在某些方面，生物质产量还可以包括生物质含量、能育性、无性繁殖、光周期不敏感性、株高、茎直径、抗旱性、种子大小、发芽、贮存后的种子存活力或任何本领域公知的特性。例如，生物质含量可以是蔗糖含量或纤维素含量。特别地，可以通过HPLC或近红外反射光谱仪测量蔗糖或纤维素含量。
[0100] D.除草剂抗性
[0101] 许多除草剂抗性基因是已知的，且可以用于本发明。一个例子是赋予对抑制生长点或分生组织的除草剂如咪唑酮类(imidazalinone)或磺酰脲类(sulfonylurea)的抗性的基因。此类示例性的基因编码突变ALS和AHAS酶，例如，Lee等人，(1988)所述。
[0102] 也可以使用草甘膦(分别由突变5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSP)和aroA基因赋予的抗性)和其他膦化合物如草丁膦(草胺膦(phosphinothricin)乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)草胺膦-乙酰转移酶(bar)基因)抗性基因。参见，例如，属于Shah等人的美国专利第4,940,835号，它公开了可以赋予草甘膦抗性的EPSPS形式的核苷酸序列。可以获得ATCC登记号39256的编码突变aroA基因的DNA分子，而该突变基因的核苷酸序列在属于Comai的美国专利第4,769,061号中公开。Kumada等人的欧洲专利申请第0 333 033号、属于Goodman等人的美国专利第4,975,374号公开了赋予除草剂如L-草胺膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。Leemans等人的欧洲申请第0 242 246号提供了草胺膦-乙酰基转移酶基因的核苷酸序列，DeGreef等人，(1989)描述了表达编码草胺膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的生产。
赋予苯氧丙酸和cycloshexones如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)抗性的示例性的基因是Marshall等人，(1992)所述的Acct-S1、Accl-S2和Acct-S3基因。
赋予苯氧丙酸和cycloshexones如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)抗性的示例性的基因是Marshall等人，(1992)所述的Acct-S1、Accl-S2和Acct-S3基因。
[0103] 赋予抑制光合作用的除草剂如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)抗性的基因也是已知的。Przibilla等人，(1991)描述了用编码突变psbA基因的质粒对衣滴虫(Chlamydomonas)的转化。属于Stalker的美国专利第4,810,648号公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，且含有这些基因的DNA分子可以从ATCC登记号53435、67441和67442获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达由Hayes等人，(1992)描述。
[0104] E.抗病性
[0105] 植物防御往往是由植物中的抗病性基因(R)的产物和病原体中的相应无毒力(Avr)基因的产物之间的特定相互作用激活的。可以用克隆的抗性基因转化植物系，以工程设计抗特定病原体株的植物。参见，例如，Jones等人，(1994)(抗黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)的番茄Cf-9基因的克隆)；Martin等人，(1993)(抗丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)的番茄Pto基因)；和Mindrinos等人，(1994)(抗丁香假单胞菌的拟南芥RPS2基因)。
[0106] 病毒侵入蛋白或由此衍生的复合毒素也可以用于病毒病抗性。例如，转化植物细胞中病毒衣壳蛋白的积聚赋予对病毒感染和/或衍生衣壳蛋白基因的病毒以及相关病毒引起的疾病发展的抗性。参见，Beachy等人，(1990)。对于苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯病毒X、马铃薯病毒Y、烟草蚀刻病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒，转化的植物已被赋予衣壳蛋白介导的抗性。同上。
[0107] 也可以使用病毒特异性抗体。参见，例如，Tavladoraki等人，(1993)，其证明保护表达重组抗体基因的转基因植物免受病毒攻击。
[0108] 例如，Logemann等人，(1992)公开了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的真菌病抗性。
[0109] F.抗虫性
[0110] 抗虫基因的一个例子包括苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白质、其衍生物或模拟它的合成多肽。参见，例如，Geiser等人，(1986)，其公开了Bt δ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia)，例如，ATCC登记号40098、67136、31995和31998。另一个例子是凝集素。参见，例如，Van Damme等人，(1994)，其公开了一些结合君子兰(Clivia miniata)甘露糖的凝集素基因的核苷酸序列。也可以使用结合维生素的蛋白质，诸如抗生物素蛋白。参见PCT申请US93/06487，其内容通过参考引入本文。该申请教导使用抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为对害虫的杀幼虫剂。
[0111] 再另外一种抗虫基因是酶抑制剂，例如，蛋白酶或蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见，例如，Abe等人，(1987)(水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列)，Huub等人，(1993)(编码烟草蛋白酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)，和Sumitani等人，(1993)(硝孢链霉菌(Streptomyces nitrosporeus)α-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)。也可以使用昆虫特异性的激素或信息素。参见，例如，Hammock等人，(1990)对于克隆的保幼激素酯酶(一种保幼激素灭活剂)的杆状病毒表达的公开内容。
[0112] 其他例子包括昆虫特异性抗体、由其衍生的免疫毒素，发育停滞性蛋白质或酶。参见Taylor等人，(1994)，其描述了在转基因烟草中通过产生单链抗体片段导致的酶失活。在另外的例子中，几丁质酶诸如水稻几丁质酶(chi II)可以在植物中表达(参见，例如，Zhu等人，1998和Krishnaveni等人，2001，其公开了高粱中chi II在CaMV 35S启动子控制下的表达)。
[0114] 可以使用赋予修饰的脂肪酸代谢的基因。例如，可以使用硬脂酰-ACP去饱和酶基因。参见Knutzon等人，(1992)。也已经描述了各种脂肪酸去饱和酶，诸如编码Δ9脂肪酸去饱和酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)OLE1基因，所述Δ9脂肪酸去饱和酶为一种由棕榈酰(16:0)或硬脂酰(18:0)CoA形成单不饱和棕榈(16:0)或硬脂(18:0)脂肪酸的酶(McDonough等人，1992)；一种编码来自蓖麻的硬脂酰-乙酰基载体蛋白Δ9去饱和酶的基因(Fox等人，1993)；来自蓝细菌集胞藻属(Synechocystis)的Δ6-和Δ9去饱和酶，其负责转化亚油酸(18:2)为γ-亚麻酸(18:3γ)(Reddy等人，1993)；来自拟南芥的基因，其编码一种ω-3去饱和酶(Arondel等人，1992)；植物Δ9-去饱和酶(PCT申请公布WO91/13972)和大豆和芸苔Δ15去饱和酶(欧洲专利申请公布EP 0616644)。
[0115] 也可以通过引入编码植酸酶的基因改变植酸代谢，以提高植酸分解，向转化植物增加更多的游离磷酸盐。例如，参见Van Hartingsveldt等人，(1993)关于黑曲霉植酸酶基因的核苷酸序列的公开内容。例如，这可以通过克隆然后重新引入与导致以低含量植酸为特征的植物突变体的单等位基因相关的DNA来完成。参见Raboy等人，(1990)。
[0116] 已知许多可以被用于改变碳水化合物代谢的基因。例如，可以用编码改变淀粉的分枝模式的酶的基因转化植物。参见，Shiroza等人，(1988)(链球菌突变果糖转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等人，(1985)(枯草杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因的核苷酸序列)，Pen等人，(1992)(表达地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的生产)，Elliot等人，(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，Sergaard等人，(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)和Fisher等人，(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。编码玉米10kD玉米醇溶贮藏蛋白的Z10基因也可以用于改变细胞中的10kD玉米醇溶蛋白相对于其他成分的量(Kirihara等人，1988)。
[0117] H.另外的农艺学性状
[0118] 可以引入另外的转基因，例如，以提高耐旱性或耐寒性。例如，可以表达蜡合成酶，以增加杂种植物的表面蜡含量和耐旱性。例如，在美国专利申请公布20080092255中，公开了用于赋予耐寒性的转基因，通过参考引入本文。可以在转基因植物中表达或过度表达以提高非生物应激耐受性的其它基因包括甘露醇-1-磷酸脱氢酶(例如，mtlD)、吡咯啉-5-羧酸合酶(例如，p5CSf129A)和/或胆碱氧化酶(例如，codA)。
[0119] 也可以在一个或多个基因中编码商业性状，该基因可以例如，增加用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。转化植物的另一个重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，如美国专利第5,602,321号所描述的，通过参考引入本文。诸如B-酮硫解酶(ketothiolase)、PHBase(聚羟基丁酸(polyhydroxylburyrate)合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因促进聚羟基链烷酸酯(polyhyroxyalkanoates)(PHA)的表达。
[0120] IV.雄性不育性
[0121] 在某些方面，在不同但密切相关的物种之间的杂交涉及使用高粱iap/iap突变体作为母本。由于高粱自然地低频率地远交，一般需要特殊操作以在所需的亲本之间进行控制的杂交(Rooney，2004)。本发明的某些实施方式使用雄性不育高粱突变体例如Tx 3361，以免去手工去雄的需要。雄性不育性的例子如下描述。
[0122] A.手工去雄
[0123] 主要用于控制授粉和繁殖目的的除去或破坏植物的雄性(花粉)部分的发育能力被称为去雄。用于控制高粱的自花授粉的手工去雄和其他方法是公知的。
[0124] 可以在开花前一天对花去雄。这种小花发生在高粱穗(panicle)中的开放小花下面和大约3厘米之内。用剪刀除去所有开放的小穗。在去雄前，尤其是如果去雄发生在室外，应该清洗穗和设备以除去任何花粉。在温室中不太可能出现这样的花粉转移，但应进行清洗穗和设备以避免不必要的异交。
[0125] 除了那些待去雄的，除去所有小花，只留下预计在第二天开放的小花。通过插入削尖的铅笔或类似尖头工具从封闭的外稃和内稃中诱导出三个花药。必须注意不要破坏花药，如果破坏了花药，那么应该除去花并清洗工具以避免污染下一个小花。必须在一组小花“完全去雄”前，除去每个花药。一个花药的存在会导致在由培育员转移花粉前使一个或多个子房授粉。在小花被去雄后，将纸袋置于去雄的穗上，直到小花在1-2天后被授粉。通常是在下午进行田地去雄，以试图避免来自其他植物的漂来的能生育的花粉。
[0126] B.遗传雄性不育性
[0127] 已经表征了高粱中的被称为ms1至ms7的一序列核隐性雄性不育基因。在隐性条件下，这些突变产生可以用于杂交的雄性不育植物(Rooney，2001)。由于这些植物完全是雄性不育的，不需要去雄，所以可以更容易地产生更大数量的种子。然而，无法产生真正的繁殖、一致的遗传不育性使得利用遗传雄性不育性进行杂种种子生产变得复杂。因此，遗传雄性不育性可以用于本发明的高粱育种计划，以促进开发属间杂种植物及其亲本。
[0128] 遗传雄性不育性的使用促进杂交，但它也需要在开花期对群体进行封闭式管理。一旦完成改善，必须产生系，且必须除去隐性等位基因ms，或它们会在后代中产生不育后代。可以通过随机穗的自花授粉或用来自同一排中杂合的和雄性能育植物的花粉对不育的穗大量授粉，维持遗传雄性不育性分离的系。为了使用这个系统，必须在尖端开花时鉴定雄性不育植物。雄性不育植物的花药更小、更薄，且不释放能生育的花粉。鉴定后，应该除去雄性不育穗尖，并包住穗以避免自由授粉。然后可以在3-5天后用从所需的父本收集的花粉对穗授粉。这些杂交的杂种可以用于群体改善或开始另一植物育种计划，诸如用于生产提高的纯系的谱系选择。培育者已经开发了许多优良高粱种质和亲本系中的遗传雄性不育群体(Pedersen和Toy 1997)。
[0129] C.杀配子剂
[0130] 在某些实施方式中，可以使用所述的使花粉绝育的杀配子剂实现去雄。用这种杀配子剂处理的植物变得雄性不育，但通常保持雌性能育。例如，在美国专利第4,936,904号中描述了化学杀配子剂的使用，其公开内容提供完整参考特别引入本文。
[0131] V.植物转化构建体
[0132] 根据本发明，提供了通过遗传转化生产的包含一个或多个转基因的植物。用于植物转化的载体可以包括，例如，质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或任何其他合适的克隆系统以及其DNA片段。因此，当使用术语“载体”或“表达载体”时，包括所有上述类型的载体以及由其分离的核酸序列。设想利用具有大插入容量的克隆系统允许引入包含一个以上选定的基因的大DNA序列。根据本发明，这可以用于将对应于整个生物合成途径的基因引入植物。通过使用细菌或酵母人工染色体(分别为BAC或YAC)或甚至植物人工染色体，可以促进这种序列的引入。例如，Hamilton等人，(1996)公开了使用BAC进行土壤杆菌介导的转化。
[0133] 已经从这些载体中分离的表达盒对于转化特别有用。当然，用于转化植物细胞的DNA片段一般包括人们希望引入宿主细胞并已在宿主细胞中表达的cDNA、一种或多种基因。这些DNA片段在需要时可以进一步包括诸如启动子、增强子、多聚接头或甚至调控基因等结构。为细胞引入而选择的DNA片段或基因常常编码在产生可筛选或可选择的性状的重组细胞中表达的蛋白质和/或赋予产生的转基因植物改进的表型的蛋白质。不过，可能并非总是如此，本发明还包括掺入非表达的转基因的转基因植物。可能包括在本发明使用的载体中的组分的例子如下。
[0134] A.调控元件
[0135] 用于表达核酸序列的示例性的启动子包括植物启动子，诸如CaMV 35S启动子(Odell等人，1985)，或其他启动子，如CaMV 19S(Lawton等人，1987)、nos(Ebert等人，1987)、Adh(Walker等人，1987)、蔗糖合酶(Yang和Russell，1990)、a-微管蛋白、肌动蛋白(Wang等人，1992)、cab(Sullivan等人，1989)、PEPCase(Hudspeth和Grula，1989)或那些与R基因复合体有关的启动子(Chandler等人，1989)。也预期组织特异性启动子诸如根细胞启动子(Conkling等人，1990)和组织特异性增强子(Fromm等人，1986)是有用的，诱导型启动子诸如ABA-和膨胀-可诱导的启动子也是有用的。PAL2启动子也可以用于本发明(美国专利申请公布2004/0049802，其完整公开内容通过参考引入本文)。
[0136] 转录起始位点和编码序列起点之间的DNA序列，即非翻译前导序列，也可以影响基因表达。因此，人们可能希望本发明的转化构建体使用特定的前导序列。考虑的前导序列包括以下序列，其包含预测引导所附基因的最佳表达的序列，即，包括可以增加或维持mRNA稳定性和防止不适当的翻译起始的优选的共有前导序列。本领域的技术人员根据本公开内容将知道这种序列的选择。通常会优选来自于在植物中高度表达的基因的序列。
[0137] 据设想，可以构建根据本发明使用的载体，以包括ocs增强子元件。此元件首次被鉴定为来自土壤杆菌的章鱼氨酸合酶(ocs)基因的16bp回文增强子(Ellis等人，1987)，并在至少10个其他启动子中出现(Bouchez等人，1989)。当在植物转化中应用时，增强子元件诸如ocs元件和尤其是该元件多个拷贝的使用可以用来提高自相邻启动子的转录水平。
[0138] 用于转基因植物中的基因的组织特异性靶向的载体通常包括组织特异性启动子，也可以包括其他组织特异性控制元件诸如增强子序列。本领域的技术人员根据本公开内容将会知道引导在某些特定植物组织中特异性或加强表达的启动子。这些包括，例如，绿色组织特异性的rbcS启动子；在根或创伤叶组织中具有更高活性的ocs、nos和mas启动子。
[0139] B.终止子
[0140] 根据本发明制备的转化构建体通常包括3′端DNA序列，该序列作为终止转录的信号，并允许由可操作地连接至启动子的编码序列产生的mRNA的聚腺苷酸化。认为可用于这方面的终止子的例子包括那些来自根癌土壤杆菌的胭脂碱合酶基因(nos 3′端)的终止子(Bevan等人，1983)、用于来自根癌土壤杆菌的章鱼氨酸合酶基因的T7转录物的终止子和来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因的3′端。在需要时可以进一步包括诸如Adh内含子(Callis等人，1987)、蔗糖合酶内含子(Vasil等人，1989)或TMVΩ元件(Gallie等人，1989)等调控元件。
[0141] C.转运肽或信号肽
[0142] 翻译后从最初的翻译产物上除去、且促进蛋白质转运进入或通过细胞内或细胞外膜的连接至表达基因的编码序列的序列，被称为转运序列(通常进入液泡、囊泡、质体和其他细胞内细胞器)和信号序列(通常到达内质网，高尔基体和细胞膜外)。通过促进蛋白质转运进入细胞内外的区室，这些序列可能会增加保护它们免受蛋白水解降解的基因产物的积累。这些序列也允许来自高表达基因的另外的mRNA序列附加到该基因的编码序列上。由于被核糖体翻译的mRNA比裸露的mRNA更稳定，在基因之前存在可翻译的mRNA可以增加基因的mRNA转录物的总体稳定性，从而增加基因产物的合成。由于转运和信号序列通常在翻译后从最初的翻译产物上除去，这些序列的使用允许增加可能不会出现在最终多肽中的另外的翻译序列。还设想，为了提高蛋白质的稳定性可能需要某些蛋白质的靶向(美国专利第5,545,818号，通过参考全部引入本文)。
[0143] 此外，可以构建载体，并在转基因植物细胞内的特定基因产物的细胞内靶向或引导蛋白质进入细胞外环境中使用。这通常通过将编码转运或信号肽序列的DNA序列连接到特定基因的编码序列上来实现。产生的转运或信号肽分别转运蛋白质到特定的细胞内或细胞外的目的地，然后在翻译后除去。
[0144] D.标记基因
[0145] 通过采用可选择或可筛选的标记蛋白，人们可以提供或加强鉴定转化体的能力。“标记基因”为赋予表达标记蛋白的细胞独特的表型从而使这种转化的细胞与没有该标记的细胞区分开来的基因。这些基因可以编码可选择或可筛选的标记，取决于以下情形：标记是否赋予一种性状，人们可以通过化学方法，即，通过使用选择剂(例如，除草剂、抗生素等)进行“选择”；或者它是否只是一种性状，人们可以通过观察或试验鉴定，即通过“筛查”(例如，绿色荧光蛋白)鉴定。当然，适当的标记蛋白的许多例子是本领域的技术人员公知的，且可以用于实践本发明。
[0146] 编码“可分泌的标记”的基因也包括在术语“可选择的”或“可筛选的”标记之内，所述“可分泌的标记”的分泌可以作为鉴定或选择转化细胞的方法被检测。这些例子包括是可以通过抗体相互作用鉴定的可分泌抗原的标记，甚至是可以通过其催化活性检测的可分泌的酶。可分泌的蛋白质分为许多种类，包括小型、可扩散的、例如通过ELISA可检测的蛋白质；在细胞外液中可检测的小型活性蛋白质(例如，α-淀粉酶、β-内酰胺酶、草胺膦乙酰转移酶)；和插入或嵌入细胞壁的蛋白质(例如，包括前导序列的蛋白质，例如，在伸展蛋白或烟草PR-S的表达单位中发现的前导序列)。
[0147] 许多可选择的标记的编码区是已知的，且可以用于本发明，包括但不限于，neo(Potrykus等人，1985)，其提供卡那霉素抗性，且可以使用卡那霉素、G418、巴龙霉素等筛选；bar，其赋予双丙氨膦(bialaphos)或草胺膦抗性；突变EPSP合酶蛋白(Hinchee等人，1988)，赋予草甘膦抗性；腈水解酶诸如来自臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的bxn，其赋予溴苯腈抗性(Stalker等人，1988)；突变乙酰乳酸合酶(ALS)，其赋予对咪唑啉酮、磺脲类或其他ALS抑制化学品的抗性(欧洲专利申请154,204，1985)；抗甲氨蝶呤的DHFR(Thillet等人，1988)，一种茅草枯(dalapon)脱卤素酶，其赋予对除草剂茅草枯的抗性；或突变的邻氨基苯甲酸合酶，其赋予对5-甲基色氨酸的抗性。
[0148] 能够用于系统中以选择转化体的可选择标记的示例性实施方式是那些编码草胺膦乙酰转移酶的基因，诸如来自吸水链霉菌的bar基因或来自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的pat基因。草胺膦乙酰转移酶(PAT)使除草剂双丙氨膦、草胺膦(PPT)中的活性成分失活。PPT抑制谷氨酰胺合成酶(Murakami等人，1986；Twell等人，1989)，导致氨的快速积累和细胞死亡。
[0149] 可以使用的可筛选的标记包括β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或编码其各种发色底物均已知的酶的uidA基因；R-基因座基因，其编码调节植物组织中花青素色素(红色)产生的产物(Dellaporta等人，1988)；β-内酰胺酶(Sutcliffe，1978)，其编码其各种发色底物均已知的酶(例如PADAC，发色头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky等人，1983)，其编码可以转化发色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta等人，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)，其编码一种酶，该酶能够氧化酪氨酸为DOPA和多巴醌，然后它们缩合形成易于检测的化合物黑色素；β-半乳糖苷酶基因，其编码具有发色底物的酶；萤光素酶(lux)基因(Ow等人，1986)，其允许生物发光检测；水母发光蛋白基因(Prasher等人，1985)，其可以用于钙敏感的生物发光检测；或编码绿色荧光蛋白的基因(Sheen等人，1995；Haseloff等人，1997；Reichel等人，1996；Tian等人，1997；WO 97/41228)。也考虑编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因作为特别有用的报告基因(Sheen等人，1995；Haseloff等人，1997；Reichel等人，1996；Tian等人，1997；WO 97/41228)。绿色荧光蛋白的表达可以在特定波长的光照射后在细胞或植物中可视化为荧光。
[0150] V.保藏信息
[0151] 本文所公开的高粱系Tx3361保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209。保藏日期是2009年6月25日，那些保藏的高粱品种Tx3361的种子的登记号为ATCC登记号PTA-10149。对于保藏的所有限制已被取消，保藏是为了满足37 C.F.R.§1.801-1.809的所有要求。保藏将在保藏机构保持30年，或最后请求之后5年，或专利的有效期，以较长者为准，如有必要，将在此期间更换。申请人不放弃对于保藏材料的任何专利权。
[0152] VI.实施例
[0153] 包括下面的实施例以证明本发明的优选的实施方式。本领域的技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实践本发明中良好发挥功能的技术，从而可以被视为构成用于其实践的优选方式。然而，本领域的技术人员根据本公开内容应该理解，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方式中作出许多变化，而仍然获得相同或类似的结果。
[0154] 实施例1
[0155] 改良的具有iap iap基因型的高粱系的开发
[0156] 在栽培的高粱和其他野生高粱种之间产生杂种存在生殖障碍(Hodnett等人，2005)。该障碍在合子形成前(prezygotic)，因为高粱雌蕊中的野生高粱种的花粉管在到达和对卵细胞受精之前停止生长(Price等人，2006)。
[0157] 称为Iap(外来花粉的抑制)的单基因基因座是栽培的高粱(二色高粱L.Moench)和Eu-高梁部分以外的野生高粱种之间生殖隔离的一个原因。在纯合隐性条件下，iap iap基因型消除这种生殖隔离，并允许回收二色高粱和野生高粱亲缘植物之间的杂种高粱(Hodnett等人，2005；Price等人，2006)。首先在二色高粱登记‘NR481’中鉴定了基因型(Laurie和Bennett，1989)，但这种登记物具有非常不理想的农艺特性如高的高度、有色种皮和对倒伏的极端敏感性。它用于基因渗入程序的潜力有限，因为基因渗入后代中恢复的任何野生种的遗传变异处于较差的遗传背景中。
[0158] 开发具有显著改善的农艺性能以及ms3遗传雄性不育系统分离的具有iap iap基因型的改良的二色高粱种质。从遗传雄性不育BTx623(包含遗传雄性不育性ms3等位基因的BTx623的衍生物)与NR481(一种对于iap等位基因纯合的系)之间的杂交开发该系。该杂种与BTx623ms3亲本回交一次。能育的BC1F1后代进行自花授粉，且在College Station，TX 2005根据3-矮化高度、白色果皮、无芒、没有种皮色素和减少的倒伏选择。在温室中培育BC1F2后代，手工去雄并测试玉米花粉管的生长(Laurie和Bennett，1989)。Iap基因座的基因型基于授粉后24小时定性测量的玉米花粉管向高粱雌蕊中花柱基部的生长。显示玉米花粉管向花柱基部生长的个体被认为是iap iap(图1)。选择的iap iap个体进行自花授粉，且在下一季节在College Station，TX中培育后代排。评价系的倒伏、高度、芒以及ms3等位基因的分离。亲缘配对ms3分离排中的选择的雄性能育和不育植物(BC1F3)。在Weslaco，TX培育各个亲缘杂交体，并评估ms3的稳定的回交分离、倒伏、高度、成熟度，且玉米花粉管的生长被用来确认其Iap基因座基因型(表1和2)。在雄性能育和不育植物之间对选择的系大量进行亲缘配对，以产生提出的遗传原种的培育者的种子。选定的系是A1细胞质雄性不育系统中不育性的维持者。
[0159] 观察到的iap iap基因型的表达、玉米花粉管向花柱基部的生长处于比以前报道的(Laurie和Bennett，1989)更低的频率，并有可能受到环境影响。在所有测试环境中，Tx3361具有类似于NR481的表达。这种遗传原种可以用作母本，以获得与外来高粱种和可能与该属外的种的种间杂交。任何回收的基因渗入处于对于进一步的评价和育种更有利的遗传背景中。
[0160] 表1：在Wesalco，TX 2006评估的两个亲本和提出的遗传原种的农艺性状[0161]1
[0162] 矮化基因座：代表每个矮化基因座的纯合等位基因；NR481具有2个纯合隐性2 3
的基因座，但只有在Dw2的基因型是已知的；果皮颜色：R为红色，W为白色；芒、有色种
4
皮和ms3回交分离：Y＝是，N＝不是；具有向花柱基部生长的玉米花粉管的高粱雌蕊的频
5
率。数值为平均值，行内的不同字母表示显著不同的平均值，α＝0.05；倒伏：0-9级，0＝
0-10％，9％＝90-100倒伏。
TM
的基因座，但只有在Dw2的基因型是已知的；果皮颜色：R为红色，W为白色；芒、有色种
4
皮和ms3回交分离：Y＝是，N＝不是；具有向花柱基部生长的玉米花粉管的高粱雌蕊的频
5
率。数值为平均值，行内的不同字母表示显著不同的平均值，α＝0.05；倒伏：0-9级，0＝
0-10％，9％＝90-100倒伏。
TM
[0163] 在College Station，TX的Texas AGRILIFE 研究高粱育种计划中，选择、评价和TM增加Tx3361系。使用AGRILIFE 高粱改良计划的编号系统，这种遗传原种被命名为Tx3361。
Tx3361系是表型评价的对象，其结果如下面表2所示。
Tx3361系是表型评价的对象，其结果如下面表2所示。
[0164] 表2：高粱系Tx3361的生理和形态性状
[0165]特性 Tx3361
1. 一般
种类 高粱
类型 对于ms3的种质分离
细胞质和恢复状态 在A1、A2和A3中的维持者
使用类型 谷粒
2. 成熟度
从种植到开花中期的天数 63
比TX430早的天数 7
3. 植物
胚芽鞘 绿色
植物色素 紫色
4. 茎
直径 中等粗壮
5. 茎高
从土壤至植物顶部的厘米数 112
高于RTx437的厘米数 25
隐性高度基因的数量 3
植物高度基因型 dw1 Dw2 dw3 dw4
蜡状花 存在
分蘖 中等
甜度 平淡
多汁性 干(多髓)
穗突出 中等
衰老程度 中级
6. 叶
宽度(相对于类型) 中等
颜色 深绿色
边缘 光滑
偏位角 水平
叶舌 存在
中脉颜色 白色
7. 穗
花药颜色(开花时) 淡黄色
穗长厘米 30
长于5RTx437的厘米 5
密度 半开放
形状 椭圆形
中央穗轴长度(穗轴长度％) 75％
穗轴分支(颗粒成熟时) 水平
穗轴分支平均值 中级
颖
长度 中级
颖覆盖的颗粒的％ 25％
纹理 中级
颜色(颗粒成熟时) 浅棕黄色
多毛性 光滑
脉络 存在
横向皱纹 不存在
芒 不存在
8. 根
根 纤维性
9. 谷粒
外种皮 不存在
中果皮厚度 厚
外果皮颜色(遗传) 白色
谷粒颜色(外观) 白垩色(不透明)
胚乳颜色 白色
胚乳类型 含淀粉的
胚乳质地 中级
种子形状 椭圆形
10. 抗虫
高粱蠓 易感
1. 一般
种类 高粱
类型 对于ms3的种质分离
细胞质和恢复状态 在A1、A2和A3中的维持者
使用类型 谷粒
2. 成熟度
从种植到开花中期的天数 63
比TX430早的天数 7
3. 植物
胚芽鞘 绿色
植物色素 紫色
4. 茎
直径 中等粗壮
5. 茎高
从土壤至植物顶部的厘米数 112
高于RTx437的厘米数 25
隐性高度基因的数量 3
植物高度基因型 dw1 Dw2 dw3 dw4
蜡状花 存在
分蘖 中等
甜度 平淡
多汁性 干(多髓)
穗突出 中等
衰老程度 中级
6. 叶
宽度(相对于类型) 中等
颜色 深绿色
边缘 光滑
偏位角 水平
叶舌 存在
中脉颜色 白色
7. 穗
花药颜色(开花时) 淡黄色
穗长厘米 30
长于5RTx437的厘米 5
密度 半开放
形状 椭圆形
中央穗轴长度(穗轴长度％) 75％
穗轴分支(颗粒成熟时) 水平
穗轴分支平均值 中级
颖
长度 中级
颖覆盖的颗粒的％ 25％
纹理 中级
颜色(颗粒成熟时) 浅棕黄色
多毛性 光滑
脉络 存在
横向皱纹 不存在
芒 不存在
8. 根
根 纤维性
9. 谷粒
外种皮 不存在
中果皮厚度 厚
外果皮颜色(遗传) 白色
谷粒颜色(外观) 白垩色(不透明)
胚乳颜色 白色
胚乳类型 含淀粉的
胚乳质地 中级
种子形状 椭圆形
10. 抗虫
高粱蠓 易感
[0166]*
[0167] 这些是典型值。值可能会随环境变化。
[0168] 实施例2
[0169] 与高粱亲本系Tx3361ms3的属间杂种的产生
[0170] 在2007年秋季，用甜根子草、商业甘蔗(甘蔗×甜根子草)和miscane(芒属x甘蔗属)的花粉对Tx3361ms3植物授粉。
[0171] Tx3361ms3×甘蔗杂交取得成功，并收获超过1500个推测的F1种子(由授粉的总共17株植物结出)。种植26个推定的F1杂种苗(由75个种子产生)，示例性的植物如图2所示。
[0172] Tx3361ms3×甜根子草和Tx3361ms3×中国芒的授粉取得成功，因为受精发生并且胚形成，但发育一般受阻于胚乳损坏。在Tx3361ms3×miscane杂种中，胚拯救取得成功，且已经回收16个假定的杂种。因此，在胚乳损坏发生的情况下，发现体外胚培养对于回收F1杂种是有效的。
[0173] 在所有这些杂种中，Tx3361ms3中的突变iap的利用是关键的，因为用正常的(纯合的Iap)Tx623ms3的授粉从来没有表现出受精、胚或胚乳发育的证据。
[0174] 2008年，产生高粱×甘蔗和高粱×miscane的许多杂种，并在温室中种植。也产生了许多高粱×中国芒胚。这些植物并没有表现出类似于Tx3361(种子亲本)的表型。属间杂种具有作为种子或无性繁殖的生物燃料作物或作为从一个种到另一个种渗入基因和性状的方法直接使用的潜力。用于基因渗入的示例性的方案如图3和4所示。
[0175] 实施例3
[0176] 高粱x甘蔗杂种的产生和分析
[0177] 在温室中从7月中旬至9月中旬在盆中种植系Tx3361的种子，使得开花期与甘蔗开花期匹配。在开花期开始时，根据花药表型鉴定和袋装Tx3361的雄性不育植物。在2007年和2008年的9月下旬11月上旬，在Houma，Louisiana的USDA-ARS Sugarcane Research Unit进行高粱x甘蔗授粉。在1月和2月，在College Station进行额外的授粉。共67个基础和商业甘蔗育种系被用作父本。
[0178] 通过用甘蔗花粉喷洒高粱穗和通过甘蔗穗摩擦高粱穗在Houma中进行授粉。在下一年中，通过向一个甘蔗亲本放置1至3个高粱穗并轻敲甘蔗穗接着摩擦高粱穗进入甘蔗穗来进行杂交。这个过程重复连续3或4天。在完成这些杂交后，将授粉的高粱植物返回College Station进行种子发育和成熟。对于在College Station进行的高粱x甘蔗杂交，每次对每个高粱穗授粉；使用前一年在Houma实施的相同的方法进行授粉。
[0179] 种子制备
[0180] 在三年中分别在授粉后平均46、41和27天从母本取出种子。将第一年的种子在发芽前存放30至90天，而接下来的年份的种子在收获后立即进行发芽。由于种子的高频率胎萌，缩短收获和发芽的时间。收获后和发芽前，通过首先用克菌丹(Captan)和Apron的液体悬浮剂涂覆种子至少半小时，然后浸泡于30％的漂白溶液中20分钟来对种子进行表面消毒。表面消毒后，用无菌水冲洗种子，并将胚侧面朝上放置在含有补充有10mg L-1甘氨酸、10mg L-1盐酸L-精氨酸、10mg L-1 L-酪氨酸、100mg L-1肌醇和30g L-1蔗糖、用0.7％琼脂(植物组织培养级，Phytotechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS)固化的Murashige-Skoog(Murashige和Skoog，1962)基本盐和维生素培养基的培养皿中(Sharma，1999)。所有培养皿用Parafilm密封，并置于设置为14个小时白天和27至30℃恒温的生长灯下。将根和芽都表现出良好发育的所有种子种植在4”盆中。一旦建立起来，将它们转移到温室中。
[0181] 属间杂种植物的证实
[0182] 最初通过形态对属间杂种分类。随着它们发育，除了具有父本未传递的性状，所有的杂种表现出母本不具备的甘蔗的许多特性(高度、分蘖、成熟度)。根据体细胞染色体数目将这些植物确认为属间杂种。采用Jewell和Islam-Faridi(1994)描述的并且具有以下修改的方法，由根尖制备染色体涂片。在室温下，用饱和的α-溴代萘水溶液预处理早期活跃生长的根尖2.75小时，并在3∶1的95％乙醇/冰醋酸(3∶1 v/v)中固定过夜。然后用蒸馏水冲洗根尖数次，在0.2M盐酸中水解10分钟，在蒸馏水中冲洗10分钟。在37℃下，用pH 4.5的5％纤维素(Onozuka R-10，Yakult Honsha Co.Ltd.，Tokyo)和1.0％果胶酶Y-23(Seishin Corporation，Tokyo)的水溶液消化细胞壁35至60分钟，并用蒸馏水冲洗3次。将分生组织放置在乙醇/冰醋酸(3∶1)溶液中的清洁的玻片上，浸泡，用细尖镊子伸展，在室温下风干2天，并用天青蓝(Azure Blue)染色。使用具有63X和100X复消色差透镜物镜的Zeiss Universal II显微镜(Carl Zeiss Inc.，Gottingen，Germany)检查根尖涂片。用Optronics VI-470系统(Optronics Inc.，Goleta，CA)记录图像，数字化存储并用Optimas(v.6.1)图像分析软件(Optimas Corp.，Bothell，WA)处理。
[0183] 甘蔗授粉者对于杂种结实的效应
[0184] 对于第二年在Houma进行的每个杂交，记录甘蔗亲本、授粉日期、授粉位置、花粉载量、小花/穗、种子/穗和产生的苗。甘蔗花粉载量是在收获杂种种子时通过评估解剖范围下的干燥柱头和将它们分级为轻度、中度或重度而确定的主观测量值；轻度意味着很少或没有观察到的花粉；如果在许多柱头上观察到花粉，则定为中度级别；如果观察到完全覆盖，则定为重度级别。对于第三年在College Staion进行的每个杂交，记录甘蔗亲本、授粉日期、种子/穗和产生的苗。
[0185] 为了确定位置、授粉日期和甘蔗授粉对于结实和花粉载量的相对效应，使用SAS v9.1中的PROC GLM。分析中只包括那些至少在三次授粉中使用的雄性甘蔗。所有的效果被认为是固定的，且只有涉及授粉者的相互作用被包括在方差分析中。
[0186] 2007年杂种种子的产生、证实和生长
[0187] 在2007年(第一年)秋季，使用17个不同的授粉者(表3)进行总共24次授粉。根据柱头反应，很显然，受精已在授粉后发生。种子开始发育，但规模和生长速度比正常的高粱自花授粉或异花授粉减少。当制备种子用于发芽(在收获和储存后)时，显然在种子发育过程中的胚损失和发育后的胎萌是常见的；进一步分析显示，32％是胎萌的，39％没有胎。相当比例的剩余种子发芽和产生植物。所有这些植物为属间杂种，且它们反映了从生长非常差到高度活力的广泛的表型。
[0188] 将这些授粉中23个最好的杂种移植到温室中的盆中。所有这些植物都具有类似于甘蔗的形态性状(图5)。这些杂种的体细胞染色体数介于56至64之间；10个染色体来自高粱，其余染色体来自甘蔗。杂种相比Tx3361具有许多狭长的叶，而Tx3361具有较少的较短和较宽的叶。发育后，23个杂种显示广泛的活力和生长习性；这些杂种中的两个显示良好的生长和发育。这些杂种象甘蔗一样充满活力和分蘖多，虽然每个具有高粱独特的形态性状，如节点支撑根和/或叶鞘上的过多的蜡状花。在7个月后，杂种L07-11的茎为3.1米，而杂种L07-9的茎为2.7米(图5A)。这两个杂种都像甘蔗一样对光敏感，在College Station从12月中旬至1月开花，而Tx3361无论种植日期如何均在大约65天开花。这些杂种的穗比甘蔗的略紧密；测交的尝试证实了这两个特定杂种的雄性和雌性不育性。在8月，切下两个杂种的一些茎，以测试无性繁殖和糖的分布。无性繁殖取得成功，在这些杂种中的糖浓度类似于甘蔗中发现的模式，在更成熟的节间具有增加的糖浓度(图6)(Whittaker和Botha，1997)。
[0189] 进一步的杂种种子产生及工艺强化(2008/2009)
[0190] 在2008年，对总共155个高粱穗(共74,300个小花)授粉。从这些授粉中回收10,347个种子，导致平均14％的结实率。在2009年授粉中没有测量结实的百分比，但似乎类似于在2008年观察到的值。然而，在2008年和2009年授粉之间，发芽率大幅提高，因为较早收获种子，并且避免了胎萌造成的损失。2009年，从2008至2009年发芽增加，因为较早收获种子(授粉后28天相对于授粉后40天)，以避免胎萌造成的损失。此外，胚不能通过种皮生长进一步降低了2008年的发芽，因此，在2009年的所有种子中，在培养基上种植前除去果皮。随着技术的改进，发芽率从2007年的2.5％提高到2008年的5.7％、2009年的33％。
[0191] 表3：高粱x甘蔗杂交中使用的甘蔗亲本
[0192]
[0193]
[0194] 从组合的2008/2009年授粉看，共盆栽1348个苗，并转移到温室。在这些杂种中存在的表型变异是广泛的，但在形态上相比高粱更像甘蔗。在2009年春天，选择485个杂种(基于活力)，并移植到CollegeStation附近的空间植物苗圃(表3)。预期这些杂种遵循从2007年杂交评估的有限杂种集合中观察的生长和发育模式。
[0195] 授粉者亲本对结实和发芽的效应
[0196] 方差分析发现由于授粉者亲本对于结实的显著的效应(表4)。由于授粉者导致的变异范围清楚地表明，对于属间杂种的产生，某些甘蔗品种是Tx3361的更好的授粉者。甘蔗授粉者诸如L06-024、HoCP05-904和Ho06-562证明具有最有效的杂种种子生产(表5)。
[0197] 表4：对于2008年秋季在Houma，La用来对Tx3361授粉的17个甘蔗授粉者的结实和花粉载量的方差分析
[0198]
[0199] 表5：2008年秋季在Houma，La，对于17个不同甘蔗栽培种和/或育种系的授粉数、Tx3361的结实百分比和授粉者花粉载量
[0200]
[0201] *本分析中只包括那些在至少三次授粉中使用的授粉者；**花粉载量等级为1(轻度)、2(中度)和3(重度)。
[0202] 已知甘蔗中的花粉散落受基因型和环境影响(Moore和Nuss，1987)，方差分析证实，花粉载量受授粉者亲本以及授粉日期影响(表4)。具有低花粉载量的系一贯产生具有低结实率的杂交，但高花粉载量并不一定意味着高结实率。前7个甘蔗授粉者中的6个(由结实率定义)具有平均或高于平均水平的花粉载量，而具有低于平均结实率的雄性的花粉载量变化(表5)。这些结果意味着，雄性必须不仅产生良好的花粉，而且它们还必须具有有利的与Tx3361的遗传和/或基因组相容性。
[0203] 对2009年数据的方差分析表明，无论是授粉环境还是甘蔗授粉者都不影响发芽百分率。根据用于控制种子产生和发芽的现有技术，无论使用哪种授粉者和在哪里进行授粉，均合理地预期25-40％的种子发芽和产生植物。
[0204] 实施例4
[0205] 高粱远缘杂种中的花粉管生长
[0206] 由于本文证明的成功的杂交，进一步用来自另一属的植物的花粉对Tx3361高粱植物授粉。授粉后，观察并记录花粉管生长(表6)。标题为花柱的列中的值说明花粉管生长的量，较高的值显示最大的生长。
[0207]
[0208]
[0209]
[0210] 根据本申请的公开内容，无需过多实验，可以进行和实施本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据优选的实施方式描述了本发明的方法和组合物，但本领域的技术人员应当明白，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法及方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地说，应当明白：化学和生理学相关的某些试剂可以替代本文所述的试剂，而获得相同或相似的结果。本领域技术人员清楚的所有这些类似的替代和修改将被视为在附加权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
[0211] 参考文献
[0212] 下面的参考文献通过参考具体引入本文中，以提供补充本文阐述的内容的示例性的程序细节或其他细节。
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