本发明涉及葱属植物，其对霜霉病(Pd)(Peronospora destructor(Berk.) Cas.)菌引起的洋葱霜霉病具有抗性，特别是洋葱(Allium cepa)种或大葱 (Allium fistulosum)种植物。根据本发明，抗性由抗性位点提供，所述的抗位 点以纯合地或杂合地存在于植物基因组上，并且足以向具有该位点的植物提供 抗性。本发明也提供了获得对洋葱霜霉病有抗性的所述植物的方法，所述的方 法适于获得栽培的洋葱(onions)和葱(shallots)。

本发明的背景技术

由霜霉病(Pd)菌引起的霜霉病实际上在世界范围内广泛分布。病原体侵 害多种不同种类的洋葱，特别是对普通的洋葱(Allium cepa.)危害更大。这种 由真菌引起的破坏在Mukerji中已有描述(参考文献5)。在适于病害发生的条 件下，田间可发生自发传染。症状为叶色变黄并有灰色孢子形成。

从经济的角度看，霜霉病是威胁洋葱和葱(Allium cepa L.)栽培的主要真 菌病害之一，差不多在世界上所有的洋葱种植地区。

有人认为，洋葱(Allium cepa)和大葱(Allium fistulosum)对霜霉病不具有完 全天然抗性。然而，在野生的野葱(Allium roylei Stearn)中找到对霜霉病的完 全抗性。受A.roylei和洋葱(A.cepa)在形态学上有一定相似性的鼓舞，因而有 人提议用A.roylei作为A.cepa的基因渗入者。在van der Meer和de Vries的文 献(参考文献1)中报道了A.roylei和A.cepa杂交的初步结果，也报道了用A.cepa 对种间杂种的回交结果。已经观察到所述的种间杂种是雄性可育的和雌性可育 的(kofoet等，参考文献2)。也报道了霜霉病抗性在这种洋葱杂种的BC1(第 一次回交)后代中能被显性遗传。

cepa基因组上对该抗性起作用的渗入序列的位点已被发现，其所在的位 点已被命名为“Pd抗性位点”。扩展地，″Pd抗性位点″也表示该序列本身。

然而，在来源于A.roylei和A.cepa之间的F1的BC1和F2代中观察到了 霜霉病抗性的分离(de Vries等，参考文献3)，并且在获得第一个抗性杂种后 的10年多时间里没有选育育成的对霜霉病有抗性的洋葱品种。

从园艺学和经济上的考虑，对霜霉病有抗性并且其自花授粉后代仍然有 100％的抗性(即抗性性状没有分离)的洋葱(Allium cepa)种和大葱(Allium fistulosum)种的植物也因此有着更大的利益。这些植物的价值在于他们可以真 正地与易感染品系杂交，也赋予杂交种对葱霜霉病的抗性。

本发明第一次观察到，所有可用的洋葱(Allium cepa)种和大葱(Allium fistulosum)种的抗性材料的Pd抗性序列事实上是杂合的，并且到目前为止没有 获得或公开过可再生的纯合抗性植物。

本发明人阐明了不能获得纯合抗性植物的原因并随后成功获得了这样的 葱属植物，该葱属植物的自花授粉后代仍然具有100％的抗性(即一种纯合抗 性植物)。

几个假说可能解释这样的惊人发现(没有可用的纯合植物)：易位，重组， 优选杂交(hybrid preference selection)，基因沉默和多效性，连接拖拉(linkage drag)，等等...

本发明人已经确定存在于cepa杂种中并赋予其霜霉病抗性的Allium royei 渗入片段也包含一个命名为″致死因子″的序列，存在于cepa染色体上的所有 同源物对植物都是致命的。为了抗性cepa植物的生存和生长，赋予抗性并且 包含致死因子的渗入片段因此需要存在于单独的同源染色体上，也解释了前人 不能获得纯合抗性植物的原因。致死相关的序列存在于Pd抗性位点附近。

已经确定赋予抗性的序列与致命序列连锁，本发明人第一次成功地将同时 存在于染色体上的赋予抗性的序列从致死相关的序列上物理分离。

能够产生重组结果的分离步骤是本发明的关键点。实际上，赋予抗性的序 列能够从致死因子中分离是不可预见的。首先，不知道所述的因子是否本身是 致死的序列或者用渗入片段上的序列替换内源的主要序列的结果是否是致死 的。实际上，可能是敲除了相应cepa片段上的主要基因(多个基因)，其不 能由从A.roylei.中导入的片段得到补偿而导致致死。因此，用以下可能的情形 来解释致死性：

-抗性序列可能事实上包括致死因子，因为它们替换了内源的关键序列。 它们可能从来不以不引起致死的方式而存在于两个染色体上。

-抗性序列和致死序列可能在染色体上彼此极其接近，或者甚至重叠。在 这种情况下，让其彼此分离获得重组结果的可能性很小。

-构成致死因子的序列可能对于抗性的功能是必需的。在这种情况下，二 者彼此分离将会导致抗性能力的丧失。

在本文中，本发明人出人意料地从纯合存在时就会致死的序列中成功地分 离出赋予抗性表型的序列。

本发明人也发现在同一渗入片段上同时具有抗性位点(其是显性的)和致 死因子(其是隐性遗传的)的A.cepa也已经表现出抗性。因为Pd抗性位点是 显性的，植物的表型是″抗性的″并且没有观察到隐性致死因子。然而，这样植 物与易感染的植物杂交的后代会发生分离而不能被商业使用。实际上，商用洋 葱(onions)和葱(shallots)通常是这样的植物品种的变种，无论该植物品种是 品系或者是杂种，其表型应是均匀一致的；有价值的分离特性不能被设计用于 商用植物。

因此本发明也提供洋葱(Allium cepa)和大葱(Allium fistulosum)种的植物， 由于它们的基因组中存在Pd抗性位点，所以赋予了对霜霉病菌病原体(Pd) 引起的霜霉病具有抗性，并且所述的植物是纯合的抗性植物，即其自花授粉后 代仍具有100％抗性。

本发明也提供抗性植物，所述的植物是通过将上所述的洋葱(Allium cepa) 或大葱(Allium fistulosum)种抗性植物与易感染霜霉病的洋葱(Allium cepa)或大 葱(Allium fistulosum)种的植物杂交获得的。

本发明也提供了获得所述植物的方法。

定义

在本申请的文本中，以下述的方式定义以下术语：

基因渗入：通过种间杂交的方法将一个种的基因自然导入另一个种中，进 而用轮回亲本进行连续回交。每个种也因此具有更多的变异并表现出其它种的 一定的性状。

Pd抗性位点：染色体上对霜霉病抗性相关的序列所占据的位置，所述的 序列足以赋予植物抗性。Pd抗性位点可以包含一个基因或几个基因，也可能 被不相关的序列或基因分开。进一步，在本发明的文本中，序列本身也叫作 Pd抗性位点。

可能的Pd抗性位点是位于3591-1品系(NCIMB保藏编号为41249)的 基因组上的A.roylei的基因渗入片段。

易感染的/易感染性：根据国际种子联盟(International Seed Federation)， 蔬菜部分，2004年5月的意见书，其中“蔬菜种子工业上描述植物对害虫或病 原体反应的术语的定义”，易感染性是指植物品种不能抑制某种特定的害虫或 病原体的生长发育。然而必须要说明的是在过去几十年间术语″易感染的″已广 泛地用于描述相同性质。

相反，在一定程度上并且与易感染的植物品种在相似的环境条件和害虫或 病原体压力下相比较，能够抑制某种特定害虫或病原体生长发育的植物是对特 定的害虫或病原体具有抗性。抗性植物包括耐受性植物(即被感染仍能存活) 和完全抗性植物。尽管对害虫或病原体是抗性的，被所述的害虫或病原体侵 染的抗性植物也可以表现被侵染的症状，像减缓生长、早期死亡、失去叶片...

自花授粉系：通过连续自花授粉和选择产生的接近纯合的品系(对于所有 的性状)。

对病原体纯合的抗性植物：所述植物产生的自交(自花授粉)后代对所述 的病原体也具有100％抗性。其中抗性源于植物染色体上具有DNA序列，所 述的序列存在于该染色体的所有同源物上。

致死因子：因子(如遗传因子)，当植物暴露于该因子时其阻碍该植物存 活。致死因子的存在可能从头开始阻止植物存活或在后期引起植物死亡。

洋葱(Allium cepa)：葱属的种，包括世界范围内栽培的具有空心叶片的 鳞茎植物，用于获得圆形的可食用的鳞茎。洋葱和葱的栽培种属于洋葱(Allium cepa)种。

重组：在减数分裂期染色体发生互换。

本发明提供的第一种类型的植物，即洋葱(Allium cepa)或大葱(Allium fistulosum)种的植物，其对霜霉病菌引起的洋葱霜霉病具有抗性。根据本发明， 霜霉病的抗性源于植物基因组上存在Pd抗性位点，该抗性位点以在基因组上 纯合的存在为特征，也就是说根据本发明抗性相关的序列存在于植物基因组的 两个拷贝中(即存在于两个同源染色体上)。

实际上，本发明人已经成功地从致死序列(已被本发明人证实同时存在于 同源染色体上是致死的)中分离得到霜霉病抗性相关序列。通过分离这两种类 型的序列，发明人已因此能够获得有价值的(Pd抗性位点)序列纯合的植物， 有害的序列(致死因子)不是纯合的。本发明涉及这些具有纯合序列(赋予抗 性)的能活的植物。这些植物必需是致死序列不是纯合的，可是其是可以存在 的，但只能以单拷贝存在。

根据本发明由于这些植物中赋予抗性的有价值的序列是纯合的，本发明的 植物的任何后代也会产生具有霜霉病抗性的植物，没有该性状的分离。实际上， 后代中的任何植物在其基因组中都有Pd抗性位点，已知其对于易感染表型是 显性的。

如果一个植物能够限制霜霉病菌的生长发育(通过阻碍侵染或者拮抗感染 后的菌生长)就可认为其是抗性的。相反，一种植物如果不能限制霜霉病菌的 生长发育就认为该植物对霜霉病菌是易感染的。根据本发明所述抗性包括抗霜 霉病菌自然侵染的抗性也包括对霜霉病菌的人工接种抗性。人工试验可以在 温室中或人工气候室中在更多可控环境条件下进行。秧苗和芽鳞茎均可用于试 验。

de Vries等的论文(参考文献3)中报道了植物对霜霉病是抗性的还是易 感染的试验程序。

抗性也可用分子标记进行试验，通过分析植物基因组上是否存在Pd抗性 位点。使用本领域普通技术人员公知的技术并且通常基于遗传因子的扩增 (genic amplification)。

可使用的分子定型技术包括限制性片段长度多态性(RFLP)，多位点酶电 泳和随机扩增多态性DNA(RAPD)。另一特别适用于检测植物基因组上Pd 抗性位点是否存在的技术是AFLPTM(扩增片段长度多态性)；Vos等以实例描 述了该技术(参考文献4)。该技术在于第一步用合适的限制性内切酶消化基 因组DNA，同时用特别设计的寡聚核苷酸接头连接。该接头含有与限制性位 点相应的序列，与另外的限定序列相连。在第二步骤，用引物进行PCR扩增 获得的标签限制性片断，其序列包含该接头的互补序列和可以区别标签限制性 片断的1，2或3个另外的核苷酸。该PCR扩增用于检测限制性片段长度多态 性。

在下述的实施例4中给出了4对特殊引物，仅当Pd抗性位点存在时可扩 增出限定长度的片段。如果植物产生出了一种或多种预期的扩增片段，以此可 推导出该植物具有全部Pd抗性位点并且因此对霜霉病具有抗性。在本发明的 文本中特别适合使用分子标记。

优选的，根据本发明抗性植物对霜霉病菌感染具有抗性。

根据本发明的第一类型，来自于品系3591-1(其已保藏在NCIMB，保 藏编号41249)的植物是实例植物。本发明人已经获得了这种植物，该方法已 经报道在实施例1中。

本发明也涉及第二种类型的植物，其具有所述的杂合的(即仅仅存在于其 中一个同源染色体上)Pd抗性位点。根据本发明，所述植物可通过以上所述 的纯合的植物与第二种洋葱(Allium cepa)或大葱(Allium fistulosum)种植物杂交 获得，所述的第二种植物是易被洋葱霜霉病菌感染。

取决于杂交的植物种类，本发明因此包括洋葱(Allium cepa)和大葱(Allium fistulosum)之间的杂交种，也包括大葱(Allium fistulosum)种植物和洋葱(Allium cepa)种植物之间的杂交。

由于Pd抗性位点杂合地存在于本发明的第二种类型植物中，当进一步自 花受粉或用其它植物与之杂交时抗性性状性发生分离。

根据本发明的该种具体实施方式，植物可以用源于3591-1品系(其已保 藏在NCIMB，保藏编号41249)的植物与易感霜霉病菌的洋葱(Allium cepa)亲 本品系杂交获得。该亲本品系优选是细胞质雄性不育洋葱(Allium cepa)自交系。

根据本发明第二种类型的植物当然可以通过其它的方法获得。例如，尽管 如以上所述，这样的植物自花授粉后代对霜霉病不具有100％抗性，它们仍可 以通过已获得的这种类型的植物自花授粉获得。

根据本发明，Pd抗性位点优选的(纯合地或杂合地)存在于本发明的第 一或第二种类型植物的基因组第3染色体上。洋葱(Allium cepa)种和大葱 (Allium fistulosum)种的植物实际上具有2n＝16条染色体，其被认为是同源 染色体(特别参见参考文献8)。

本发明的植物也包括洋葱(Allium cepa)种和大葱(Allium fistulosum)种的植 物，因其含有Pd抗性位点而对霜霉病菌引起的洋葱霜霉病具有抗性，其中含 有Pd抗性位点的任何染色体片段都能在后代中纯合地存在而不引起致死。

如上所述，在Pd抗性序列或位点附近，引起致死的序列通常可以被发现。 包含Pd抗性位点和所述致死序列的染色体部分可能通常不存在于两个同源染 色体上，因为它会阻止植物的存活。通过将Pd抗性位点从致死序列中分开， 发明人已能够获得包含Pd抗性位点的植物，并且所述的含有Pd抗性位点的 染色体任何部分存在于或可能存在于两个同源染色体上，因为致死序列是不存 在的。

根据本发明，大葱(Allium fistulosum)种的植物可通过第一种植物的3591 -1品系(保藏于NCIMB，保藏编号41249)与Allum roylei种的植物杂交， 然后用大葱(Allium fistulosum)种的植物回交一次或多次(也就是说用Allium roylei作为桥梁种)，以此获得的杂交种。

本发明也涉及洋葱(Allium cepa)种和大葱(Allium fistulosum)种的植物，所 述的植物对霜霉病(Pd)菌引起的洋葱霜霉病具有抗性，其中第3染色体的至 少一条同源染色体含有Pd抗性位点，并且含有Pd抗性位点的所述染色体的 任何片段都能纯合地在后代中存在而不引起致死。

应当注意，Pd抗性位点纯合的并且致死序列杂合的植物(也就是说致死 序列仅仅存在于第3染色体的一条同源染色体上)也是本发明的一部分。  实 际上，第3染色体的至少一条同源染色体(该同源染色体包含Pd抗性位点但 没有致死序列)的任何片段可能纯合地存在于后代中没有引起致死。

这样的示例性植物3591-3、3591-4、3591-5、3591-6或3591-8在 本申请实施例部分的实施例3举例说明。

通过抗性植物自花授粉，分析其后代可以推导出该植物是否符合上述的定 义。实施例5给出了用于这种判断而进行分析的详细步骤。用于评价的主要指 标是后代中抗性植株的百分比。如果植物后代的至少75％(由于测量误差+/ -5％)仍然是抗性的，这样的任何抗性植物均是根据本发明的植物。图1在 基因组水平上示例了这种不同的情形，产生了这样的百分率。

必须注意到，在仅仅一条同源染色体上具有与致死序列连锁的Pd抗性的 植物不是本发明的部分。这样植物经自花授粉后会产生(根据遗传规律)66.7％ (即少于75％)的抗性后代。这样植物也因此能与根据本发明的植物区别开。

这样的示例性植物品系2348在本申请的实施例部分的实施例2中举例说 明。

优选的，Pd抗性位点纯合地存在于根据本发明的植物中。

根据本发明优选的实施方式，赋予霜霉病菌侵染抗性的Pd抗性位点存在 于基因渗入片段上，所述片段来自于对洋葱霜霉病有天然抗性的植物并且优选 来自于具有抗性的野生葱亲本，更优选来自于Allium roylei。在基因组上具 有渗入片段的洋葱(Allium cepa)种或大葱(Allium fistulosum)种的植物可通过用 所述的植物与基因渗入者杂交获得，这样获得杂交种。所述的杂交种优选用洋 葱(Allium cepa)种或大葱(Allium fistulosum)种的植物回交，其目的是为了尽量 减少渗入片段的数量，然后选择对霜霉病的抗性能力。

实际上，根据本发明洋葱(Allium cepa)种或大葱(Allium fistulosum)种的植 物中的渗入片段数量优选是被限制的，目的是为使该植物具有亲本所具有的除 抗性性状以外的所有有益性状。

优选的，根据本发明植物基因组上的渗入片段仅仅存在于第3染色体的一 条或两条同源染色体上，并且优选的存在于第3染色体的长臂上。优选的，含 有Pd位点的渗入片段小于第3染色体长臂长度的50％，优选小于44％，更优 选小于第3染色体长臂长度的35，30，25或20％。如上面提到的，渗入片段优 选来自于Allium roylei基因组。

根据这种类型的植物是来自于品系3591-1(已保藏于NCIMB，保藏编 号41249)的植物。

应该注意到，一个、两个或更多的基因渗入片段是可能存在的，例如在第 3染色体长臂上，然而每个片段是不同的并且彼此分开的。优选的是仅仅有一 个渗入片段。

根据最有利的情形，根据本发明存在于植物中的渗入片段仅仅是对霜霉病 抗性所必需的序列。

根据本发明的植物能被用于向其它的具有农艺价值的植物中转移Pd抗 性，提供能被一起杂交的植物。这可以通过获得杂交种并且用第二个植物回交， 随后自花授粉所得到的植物来完成；在每一步，选择抗性的后代。

优选的，根据本发明的植物的有益性状(即对洋葱霜霉病抗性)是稳定的， 可是对于其它性状就是不必要的。

根据本发明的植物可通过具有洋葱霜霉病抗性的野生葱亲本与洋葱 (Allium cepa)的初始种间杂交来获得。根据这种情况，渗入片段来自于野生的 葱亲本。

为了获得根据本发明的植物(也就是洋葱(Allium cepa)种或大葱(Allium fistulosum)种的植物)，必需从杂交(其大多表型性与洋葱(Allium cepa)种或大 葱(Allium fistulosum)种亲本相似但对霜霉病具有抗性)中选择杂种植物。优 选的，在上面提到的初始种间杂交后，随后用亲本种植物回交几次，并且可选 择进行一次或几次自花授粉获得根据本发明的植物。

回交步骤和自花授粉步骤可以减少所获得的植物中渗入片段的比例。推荐 的回交次数至少2次，优选的3、4、5或6、7、8至10的连续回交也可以被 想像到。要完成的自花授粉次数在1到8次之间，优选为2、3、4或5次。

根据本发明的优选实施例，初始种间杂交是对洋葱霜霉病有抗性的野生葱 亲本与洋葱(Allium cepa)杂交，并且提到的回交是用洋葱(Allium cepa)种的植物 回交。

野生葱亲本是对由霜霉病菌(Peronospora destructor)引起的洋葱霜霉病 有抗性的葱属植物，优选的是天然抗性植物，并且优选的葱亲本是Allium roylei种的植物。

如上面所提及的，可根据公知的程序检测对霜霉病菌感染的抗性来检测 Pd抗性存在与否。然而这些程序是费时的。也可以用其它的本领域技术人员 熟知的基于基因组扩增的遗传技术来检测Pd抗性位点存在与否。

可被用于分子定型的技术包括限制片段长度多态性(RFLP)，多位点酶电 泳和随机扩增多态DNA(RAPD)。另一项特别适于检测植物基因组中Pd抗 性位点存在与否的技术是AFLPTM(扩增片段长度多态性)；这样的技术被示 例性地描述在参考文献4中。该项技术特别适合于本发明。

根据本发明，所谓的AFLPTM技术是用于分析葱属植物的基因组上是否存 在Pd抗性位点。植物基因组DNA优选用限制性内切酶Pstl和Msel进行切 割；并且以下接头完成连接：

α    5′-CTCGTAGACTGCGTACATGCA

CATCTGACGCATGT-5′和

β    5′-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5′.

然后用以下的引物PCR扩增连接有接头的限制性片段：

(A)5′-GACTGCGTACATGCAGAAC和

5′-GATGAGTCCTGAGTAACTT。

根据这样的程序，被检测植物中Pd抗性位点的存在与否可从61个核苷酸 的扩增片段存在与否推导出。实际上，如果这样片段来自于先前的步骤中，根 据本发明则暗示着存在Pd抗性位点，这可从实施例4报道的结果推导出。

另外，该方法可根据以下的另一个程序来完成：

-植物基因组DNAA的限制性切割用限制性内切酶Pstl和Msel进行；和

-用以下接头完成连接：

α    5′-CTCGTAGACTGCGTACATGCA

CATCTGACGCATGT-5′，和

β    5′-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5′；

-用以下的引物PCR扩增已连接接头的限制性片断：

(B)5′-GACTGCGTACATGCAGAAG和

5′-GATGAGTCCTGAGTAAAAC。

当进行这样的操作时，151个核苷酸的特异片段代表被检测植物的基因组 中存在Pd抗性位点，这能够从实施例4所报道的结果推导出。

根据第三种选择，该方法可根据以下的程序进行：

-植物的基因组DNA用限制性内切酶Pstl和Msel限制性切割；和

-用以下接头进行连接：

α    5′-CTCGTAGACTGCGTACATGCA

CATCTGACGCATGT-5′，和

β    5′-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5′；

-用以下的引物PCR扩增已连接接头的限制性片断：

(C)5′-GACTGCGTACATGCAGACA和

5′GATGAGTCCTGAGTAACCA。

当进行这样的操作时，330个核苷酸的特异片段代表被检测植物的基因组 中存在Pd抗性位点，这能够从实施例4所报道的结果推导出。

本发明的实施例4描述了这样方法的应用。

本发明也直接提供一种洋葱(Allium cepa)种的植物，对洋葱霜霉病具有 纯合抗性，即所述的植物的自花授粉后代对霜霉病具有100％抗性，以用以下 的方法获得：

a)Allium roylei和洋葱(Allium cepa)种间杂交；

b)选择种间杂种，其对霜霉病菌(Pd)引起的霜霉病具有抗性；

C)用洋葱(Allium cepa)植物回交所述杂种；

d)选择洋葱霜霉病的抗性植物；

e)获得的植物自花受粉；

f)选择对洋葱霜霉病具有纯合抗性的植物。

步骤a)已经证明提供了能活的种间杂种，其是雄性和雌性可育的。可用 Allium roylei作为父本、洋葱(Allium cepa)作为母本进行种间杂交或者正好 相反，用Allium roylei作为母本、洋葱(Allium cepa)作为父本。

步骤b)选择对霜霉病菌引起的霜霉病具有抗性的植物。如前面所提到的， 抗性检测可用文献中或者本申请的试验部分描述的已知程序进行自然接种或 人工接种。这种选择也可以用以上描述的AFLPTM来完成。有用的限制性内切 酶、接头和PCR引物为以上所描述的，根据预期扩增片段的长度表明存在Pd 抗性位点。

根据本发明，在步骤b)选择的植物不仅对洋葱霜霉病具有抗性而且它们 也具有洋葱(Allium cepa)亲本尽可能多的有利形态学性状。

步骤C)涉及的是步骤b)中所选择的种间杂种的回交，目的是为了使洋 葱(Allium cepa)种的植物具有洋葱霜霉病抗性。回交步骤所使用的洋葱(Allium cepa)植物可以来自于步骤a)中用作种间杂种亲本植物的同一个亚种、种或 形式，但不是必需的。

在回交后的植物中，选择对洋葱霜霉病具有抗性的植物。如步骤b)中提 到的，这种选择可通过检测对霜霉病菌(PD)的抗感染能力或者分子定型 (molecular typing)如AFLPTM技术来完成。

在本发明的优选的实施方式中，C)步骤，紧接步骤d)优选至少重复一 次，也就是说至少两次连续回交。回交的次数可以在2至10之间变化，优选 为3、4、5或6次。

步骤e)是一个自花受粉或自交的步骤，这是本领域技术人员熟知的。

自花受粉步骤后是抗洋葱霜霉病植物的选择，所述的植物应具有洋葱 (Allium cepa)种植物的所有特征。

优选的，自花授粉步骤和选择步骤重复至少一次，即至少完成两次系列自 花授粉和选择。这些步骤优选进行2、3、4、5或8次，即它们重复1、2、3、 4或7次。

该方法的最后步骤涉及对霜霉病菌(PD)引起的洋葱霜霉病具有纯合抗性 植物的选择。纯合性可通过步骤e)检测完成并且验证其100％的后代对霜霉 病具有抗性。

根据本发明，最后的选择步骤优选采用分子定型技术来完成，如前面部分 描述的AFLPTM技术，并且使用前面述及的优选限制性内切酶、接头和引物。

本发明也涉及生产洋葱植物的方法，所述植物对霜霉病菌(Pd)引起的洋 葱霜霉病具有抗性，包括以下步骤：

a)获得一个抗洋葱霜霉病的Allium roylei植物；

b)所述的Allium roylei和洋葱(Allium cepa)种间杂交；

c)选择对洋葱霜霉病具有抗性的种间杂种；

d)用洋葱(Allium cepa)植物回交所述杂种；

e)选择对洋葱霜霉病具有抗性植物；

f)步骤e)获得的抗性植物自花受粉；

g)选择对洋葱霜霉病具有纯合抗性的植物。

根据本发明分子标记用于步骤c)、e)和/或g)来选择对洋葱霜霉病的具 有抗性的植株。

该方法的不同步骤如前面段落所述的一样。该方法优选的实施方式前面也 已提及，特别是步骤d)和e)以及步骤f)和g)的重复。选择步骤也可以同 前面述及的一样来完成。优选的是利用分子标记使用分子定型的方法来完成。 一种特别优选的方法是AFLPTM，其已描述在前面的部分中。根据本发明， 分子标记仅仅可以用于步骤c)，或者仅仅用于步骤e)，或者仅仅用于步骤g)， 或者用于这些步骤中的每一步中，或者用于三个步骤中的两个步骤。

在每个选择步骤中，所选的植株优选是具有最多数量的洋葱(Allium cepa) 特征特性的植株。根据这种方法，来自于第一Allium roylei亲本的基因渗入片 段数在每个步骤中得到最小化。洋葱(Allium cepa)的特征特性已经公开在用 于特殊性、均匀性和稳定性检测的实施指南中(参考文献TG/46/6)，与UPOV 公约有关。

根据本发明，该方法也可以包括另外的杂交步骤，最后的步骤g)获得的 植物与易感洋葱霜霉病的洋葱(Allium cepa)种植物杂交。得到的植物抗霜霉 病，因为最后步骤g)得到的植物对霜霉病抗性是纯合的。

如已经提到的，选择步骤c)、e)和/或g)可以用AFLPTM技术来完成。 如本申请举例说明的那样，用于该技术的限制性内切酶优选是pstl酶和Msel 酶。连接步骤的合适接头是：

α  5′-CTCGTAGACTGCGTACATGCA

CATCTGACGCATGT-5′，和

β  5′-GACGATGAGTCCTGAG

TACTCAGGACTCAT-5′。

在PCR扩增步骤，可使用的一对合适引物：

(A)5′-GACTGCGTACATGCAGAAC和

5′-GATGAGTCCTGAGTAACTT；

(B)5′-GACTGCGTACATGCAGAAG和

5′-GATGAGTCCTGAGTAAAAC；和

(C)5′-GACTGCGTACATGCAGACA和

5′-GATGAGTCCTGAGTAACCA。

扩增得到几个片段并且在该PCR扩增后可在琼脂凝胶上进行检测。然而， 当用(A)的一对引物扩增得到具有61核苷酸的片段时，表明被检测植物的 基因组中存在Pd抗性位点。另外，当使用(B)的一对引物时，显示的扩增片 段长度是151个核苷酸，和当使用(C)的一对引物时为330。

在本发明的一个优选实施方式中，当使用AFLPTM技术时，也可进行辅助 PCR扩增，以检测假阳性。依据这种方法，扩增至少使用选自下述引物中的 一对：

(A′)5′-GACTGCGTACATGCAGAAG和

5′-GATGAGTCCTGAGTAAAAC；

(B′)5′-GACTGCGTACATGCAGAAC和

5′-GATGAGTCCTGAGTAACTT；和

(C′)5′-GACTGCGTACATGCAGAAA和

5′GATGAGTCCTGAGTAACAC。

这些辅助扩增得到的扩增片段用作阴性对照。当使用(A)、(B)或(C) 的一对引物没有得到预期长度的片段时必须用(A′)、(B′)或(C′)的一对引 物进行检测。

本发明也包括通过所述的方法获得的葱属植物，特别是根据优选实施方式 的方法。

本发明也涉及利用易感霜霉病的洋葱(Allium cepa)亲本品系与根据本发 明的纯合抗洋葱霜霉病的植物杂交所获得的洋葱(Allium cepa)杂交种植物。 所述植物例如通过实施本发明以上公开的方法得到。

洋葱(Allium cepa)亲本品系可以是任何洋葱(Allium cepa)种，优选的 是有利性状已被很好描述并公知的品系。例如它是味道、生长迅速或其它重要 的农艺性状已知的栽培品种。

根据一个优选的实施方式，该亲本品系是一个细胞质雄性不育洋葱自交 系。

根据本发明优选的实施方式，本发明已经描述的任何植物是一种栽培洋葱 (onion)或葱(shallot)。

附图说明

图1：本图示意性的说明Pd抗性位点和致死序列在4种不同抗性葱属植 物的自花授粉后代的潜在传递方式。右栏给出了后代抗性的百分比并说明亲本 植物是否有至少一个第3染色体(具有抗性位点没有致死序列)的同源染色体。

图2：本图表明从2348群体中得到的14个霜霉病抗性植株的GISH染色 体组型，所述的2348群体已经根据实施例2中描述的操作程序进行了分析。 2348-1、2348-3、2348-4、2348-5、2348-6、2348-7、2348-8、2348 -11、2348-13、2348-14、2348-15、2348-16、2348-18、和2348-19 是来自于同一亲本品系2348的不同植株。

图3：本图表明从3591群体中得到的6个霜霉病抗性植株的GISH染色体 组型，所述的3591群体已经根据实施例2中描述的操作程序进行了分析。 3591-1(图.3A)，3591-3(图.3B)，3591-4(图.3C)，3591-5(图.3D)，3591-6(图. 3E)and 3591-8(图.3F)是来自相同亲本品系3591的不同植株。

实施例：

实施例1：洋葱(Allium cepa)纯合抗性品系的获得

引言：

洋葱霜霉病是由霜霉病(Pd)菌引起的(Mukerji，参考文献5)。它是专性病 原体，其只能保存在植物组织上，不能离体存在琼脂或液体培养基上。

抗病性试验可以多种方式进行，参见de Vries等的实例(参考文献3)。在 适于病害发生的条件下，田间可发生自发传染。人工试验可以在温室中或人工 气候室中在更多可控环境条件下进行。秧苗和芽鳞茎均可用于试验。症状为叶 色变黄并有灰色孢子形成。

在随后本发明人实施的育种计划中，为了获得纯合品系在回交和自交过程 中已经采用了不同的方法。

本报告描述了试验，通过该实验得出结论，抗性遗传不是如预料的那样简 单：显性单基因，并且由此获得了本发明的3591品系，其对霜霉病具有完全 抗性。

材料与方法

本发明的起点是de Vries等(参考文献3)公开的所谓的F1BC2植物。

这样的植物已经通过洋葱(Allium cepa)和Allium roylei的首次种间杂交 (F1)，并随后用洋葱(Allium cepa)进行连续回交(BC2)获得。为了获得纯 合的品系，本发明人继续用他们的育成品系与所述的植物材料进行回交，并且 在BC5代进行自交。S1、S2、和S3各自表示已经进行了1、2或3次连续自 交(自花受粉)步骤。

第一个田间试验用F3品系进行(F1BC5S2)，其来源于不同的F2群体 (F1BC5S1)的自交抗性植株。植物播种在外面的发明人的主要育种田上。

在温室中已接种的种子鳞茎(Spreader bulbs)播种在田间(Hildebrand等， 参考文献7)。

分生孢子悬浮在demi-water中制备接种菌液。带孢子叶片用demi-water 冲洗并经两层粗棉布过滤。悬浮液稀释至5.0×104个孢子/ml。孢子接种入鳞 茎，从鳞茎大圆到根盘，用针注射。在10℃下鳞茎置于有潮湿纸张的塑料袋 中24h。然后温度调升至15℃以刺激菌丝体生长。然后鳞茎种植在室外的田间。

流行传染开始并在八月的下半月计数被感染的植物。在生长季期间并且直 至叶子落光和鳞茎成熟的阶段，计数未被感染的鳞茎以评估抗性级别和不同品 系的分离比率。抗性植物根本不表现症状。如果记得任意枯斑，该植物被认为 是感病的。

在第二个田间试验中，在育种田上排列353个小区，在四月的第一周，田 间被鳞茎围绕，为了刺激霜霉病流行的发生。发生严重感染，结果是对照小区 的易感染品种Staccato被100％感染。计数感染和未被感染植物。采集相关的 品系的鳞茎并且用于进一步的研究和来年的种子繁殖。

结果

第一个田间试验发生了洋葱植物的严重感染，只要症状能够被可靠地记 得，就计数易感染的植物的组成。一些早期的品系在早期就已倒伏并且不能区 分叶片的死亡和霜霉病症状。对于这些品系仅仅记为易感染的植株并不记为抗 性植株，因为这些早代品系中的抗性级植物包含许多遗漏(many escapes)。在 全部的品系中有20个品系。34个品系记为既有对易感染的也有抗性的植物， 并且这些品系在很后期才倒伏，可以可靠地记为有抗性。数据列于表1。

第二个田间试验重新提供严重的霜霉病感染。特殊对照小区的感病品种 Staccato被100％感染。这项田间试验的353个不同繁育品系，仅仅一个品系 没有发现感病植株。该育成品系4018282种植于3591区，提供了140个未被 感染的植株。其它的21个F4品系(F1BC5S3)，来源于相同的F3品系3997284 的自交，表现出抗性分离，表2。

表1：霜霉病田间试验n°1

 育成品系  F3S2   抗性   百分比   易感染   植株     抗性     植株     育成品系     F3S2   抗性   百分比   易感染   植株   抗性   植株  3977304  3977305  3977307  3977311  3977313  3977319  3977322  3977326  3977328  3977333  3977334  3977336  3977337  3977338  3977343  3977344  3977350  3977351   72.6   67.5   90.7   52.9   57.7   55.6   51.7   50.9   59.1   57.1   62.5   66.7   56.2   70.3   74.0   68.4   58.3   53.1   63   124   26   177   224   248   357   82   56   275   48   25   312   33   20   24   43   38     167     258     254     199     305     311     382     85     81     366     80     50     401     78     57     52     60     43     3977357     3977358     3977367     3977375     3977377     3977378     3977379     3977380     3977381     3977382     3977385     3977387     3977392     3977394     3977395     3977396       Total   73.2   92.5   68.3   60.9   71.0   57.4   56.0   61.7   66.5   58.9   66.3   60.2   55.9   72.1   55.0   47.6     60.7   56   7   33   88   54   103   80   75   56   304   31   37   152   39   45   66     3401   153   86   71   137   132   139   102   121   111   436   61   56   193   101   55   60     5243

表2：霜霉病田间试验n°2：

  育成品系   F3S2   抗性   百分比   易感染   植株     抗性     植株   育成品系   F3S2     抗性     百分比   易感染   植株     抗性     植株  4018268  4018269  4018270  4018272  4018273  4018274  4018275  4018276  4018278  4018279  4018280   58.3   61.5   69.2   61.7   64.5   75.1   71   68.5   63.7   56.9   66.9   63   82   66   57   60   46   67   78   85   97   46     88     131     148     92     109     139     164     170     149     128     93   4018281   4018282   4018283   4018284   4018287   4018288   4018289   4018290   4018291   4018292   4018293     60.5     100     62.2     66.7     54.8     71.4     71.5     53.8     67.8     65.2     72.2   90   0   56   47   84   46   55   55   38   64   80     138     140     92     94     102     115     138     64     80     120     208

讨论

田间试验n°1提供了首个清楚的显示，选育抗霜霉病的洋葱不是像期望的 那样简单。假如抗性是单基因的、显性的遗传，人们通常会期望经F2抗性植 物自交后找到至少1/3的完全抗性品系。仅仅RR植株提供完全抗病的后代， Rr植物会发生分离，并且在F2中进行抗性选择后，RR植物包括群体的1/3 (其中″R″代表显性抗性基因的等位基因，″r″代表隐性易感染基因)。

试验了54个品系并且其中34个能被可靠地分为抗性的和易感染的，但所 有的54个品系均是分离的。这意味着比率显著不同于1/3。整个品系的抗性植 株的全部比率低于预期值(60，65％)如果杂合植物自交，假如单个显性基因其 期望的抗性比率为75％。

个别品系，像3977307和3977358给出了不同的比率。这可能是由遗漏 (escapes)引起的。来源于3977303的自交系已被检测，并且所有均分离，比 率在52％和73％之间变化(数据没有示出)。没有被感染的植株被分作抗病者， 而且没有表现症状，也许是由于叶的过早脱落、小的群体，导致低湿的小气候 或其它病害或流行感染(trips infections)。

田间试验n°2发现了3591小区，包含品系4018282。这个品系在严重感 染的田间没有表现出易感染的植株。田间包含了被证实遗传复杂性的353个品 系。另外发现了非常高频率的纯合品系并且不仅仅是品系4018282/3591。

将3591小区的植物移入温室用于开展A.roylei渗入片段的研究(见实施例 3)和种子繁殖。实施例3的结果表明3591包含一个较小的渗入片段。一些植 株对于小的和大的渗入片段是杂合的并且3591-1植株对于小的渗入片段是纯 合的。

这个品系的独特之处用表2列出的姊妹系的结果加以说明。这些品系均来 自于相同的F3品系的自交，并且其中没有品系表现纯合性。

实施例2：育成品系2348，F1BC5S3代(育成品系2348来自于2348小区 的4008191样本，田间表现66％的抗性)的基因组原位杂交(GISH)。

基因组原位杂交(GISH)技术已经被Khrustaleva和Kik用于洋葱(参考 文献和10)并且已经用于本发明目的用来从洋葱(Allium cepa)染色体中区分 Allium roylei基因组的插入/片段。这项技术也因此能够形象化地表征洋葱 (Allium cepa)植物基因组中的来自于Allium roylei的渗入片段。

第一个系列实验由Plant Research International BV，Wageningen(NL)开展， 关于抗性植物、然而是分离的，相应于14个F1BC5S3的洋葱植物，其中F1 是Allium roylei和洋葱(Allium cepa)的种间杂种，BC5意味着连续回交5次， 和S3意味着连续自花授粉3次。

引言：

GISH是检测染色质物质从一个种渗入到另一个种的有力技术。GISH的 优势在于通过“被渗入基因组的图片”的方式直观地反映基因渗入的过程。利用 该技术，由于使用的分子细胞生成标记是共显性的，也可以验证基因组的具体 区域是纯合的还是杂合的.通过该项技术，确定感兴趣的渗入基因位于哪条染 色体上也是可能的。

植物材料：

原始材料是育成品系2348，F1BC5S3代植物。收集幼根的根尖并制备多达 100个载片用于细胞分裂中期的扩散分析(metaphase spread analysis)(方法说 明，参见Khrustaleva和Kik，(参考文献9和10))。选择具有良好扩散的分裂 中期并且其包含整套染色体(2n＝2x＝16)的载片用于GISH试验。

方法：

用Rogers和Bendich的CTAB法(参考文献13)从洋葱(A.cepa)和A. roylei的幼嫩叶片中提取基因组DNA。

A.roylei的基因组DNA通过标准的切口平移法(Boehringer，Manheim， 德国)用Dig-11-dUTP(地高辛配基-11-2′-脱氧-尿苷-5′三磷酸盐)标记。

洋葱(A.cepa)基因组DNA用作阻断DNA。Khrustaleva和Kik早期描 述了原位杂交、免疫学检测和显微学方法(参考文献9和10)。核型分析按照 Kalkman提议(参考文献12)的并已在第四次欧洲葱属研讨会上被de Vries 证实的标准命名系统进行。使用科罗拉多州立大学(Colorado State University) 针对Windows设计的免费软件程序来测量3-5分裂中期的染色体。

(http://www.colostate.edu/Depts/biolog/MicroMeasure)

结果：

来自于育成品系2348、F1BC5S3代植物的14个抗病植物的GISH分析表 明，所有的植物均含有具有霜霉病抗性基因的A.roylei片段(图2A，2B和2C)。 核型分析显示，携带A.roylei片段的重组染色体是第3染色体(着丝粒指 数：41.7；相对染色体长度：13.8)。13个植株在第3染色体上仅仅具有一个 A.roylei片段，其它的同源梁色体被证明仅仅包含洋葱(A.cepa)染色质。毫 无疑问，这些结果证明了对于含有霜霉病抗性基因的片段，育成品系2348的 所有13个植株均是杂合的。保藏编号2348-5具有两个A.roylei片段：一个 位于携带霜霉病抗性基因的第3染色体的长臂上，和另一个位于第4染色体的 长臂上(着丝粒指数：39.3；相对染色体长度：12.6)。两个片段在基因组中均 是杂合的。

GISH分析也可判断位于第3染色体长臂上的从A.roylei渗入到洋葱(A. cepa)染色体的渗入片段的大小。平均片断长度是整个染色体长度的25.2％， 是长臂长度的43.9％。

讨论：

通过该方法，已经成功的检测到携带有霜霉病抗性基因的A.roylei染色质 物质渗入到洋葱基因组。本数据证明了育成品系2348、F1BC5S3代植物中霜霉 病抗性基因的杂合性。在田间抗病的所有14个个体中，发现了A.roylei片段 仅存在于第3染色体的一个同源染色体上。上述的结果能用以下的假设解释， 洋葱(A.cepa)发育(例如种子发育)所必需的且位于霜霉病抗性基因附近的 基因(或致命性因子)，导致纯合植物的缺少。实际上也可推测，在渗入期间 洋葱(A.cepa)的主要基因被A.roylei的相应基因替换并置于洋葱细胞质背景 下而导致了植物发育的严重干扰，例如种子发育。只有当霜霉病抗性基因和 致命性因子间发生重组时才能获得能活的纯合抗性洋葱，这应该是可能。

在用洋葱(A.cepa)回交和对霜霉病抗性选择期间，只有含有A.roylei 片段(具有霜霉病抗性基因)的植物会保留下来。这样最终产生的植物仅仅 含有洋葱染色质和A.roylei.片段。然而根据上述的假设，这样的片段已经替换 了洋葱(A.cepa)发育所必需的基因。在杂合的状态，种子发育并会得到植 物，但在纯合的状态下不能形成植物。

实施例3：用育成品系3591，F1BC5S3代植物基因组原位杂交

引言：

随后分析来自于育成品系2348，F1BC5S3代的14个抗霜霉病植物，表明 所有的植物中Pd抗性位点均是杂合的。检测仅仅位于第3染色体的一条染色 体上的A.roylei片段(携带有霜霉病抗性基因)，其它的同源染色体全部由洋 葱(A.cepa)染色质组成。进一步的分析涉及育成品系3591，其在田间的霜 霉病抗性没有发生分离。从这一点考虑，期望通过GISH在群体中找到这样的 植物，所述植物的第3染色体上携带有霜霉病抗性位点的区域是纯合的。

植物材料：

取6个单株、育成品系3591、F1BC5S3代植物的幼嫩根尖并制备多达50 个载片用于有丝分裂中期的扩散分析(metaphase spread analysis)(方法说 明，参见Khrustaleva和Kik，参考文献9)。有着良好扩散的有丝分裂中期并 且包含一整套染色体(2n＝2x＝16)的载片用于GISH试验。

方法：

上述实施例中的″方法″部分给出了详细的步骤。

结果：

Plant Research International BV，Wageningen，NL对来自于育成品系3591、 F1BC5S3代(其表现为所有植株中携带有霜霉病抗性位点的A.roylei区域均是 纯合的)的6个抗性植株进行了GISH分析(参见图3A至3F)。核型分析显 示A.roylei部分存在于第3染色体的两个同源染色体上(着丝粒指数：41.7； 相对染色体长度：13.8)。在6个被分析的植株中，编号3591-1在第3染色体 的两个同源染色体上均具有2个小的片段。A.roylei渗入片段的大小在两个同 源染色体上是相同的并且平均为长臂长度的17.9±0.78％。五个植株，即编号 3591-3、3591-4、3591-5、3591-6和3591-8具有两个A.roylei渗入片段， 其大小是不同的，(图3B、3C、3D、3E、和3F)。较大片段的平均大小为 长臂长度的42.8±1.09％，和较小的平均为17.9±0.78％。

讨论：

本结果证实了用于解释育成品系2348中霜霉病抗性位点的杂合属性所提 出的假设。实际上可以猜测，致命性因子(其对植物发育是有害的并且其位于 霜霉病抗性基因附近)造成纯合抗性植株的缺乏，或者可以猜测，对植物发育 所必需的主要洋葱(A.cepa)基因被基因渗入敲除并且造成纯合抗性植株的缺 乏。

认为A.roylei渗入片段也包含了在排外的洋葱(A.cepa)细胞质(即质核 互作)中不起功能的相应基因。在纯合的A.roylei条件下，主要的洋葱(A.cepa) 基因被相应的A.roylei基因完全地替代，因此不能提供可种的种子。只有当 霜霉病抗性基因(多个)与主要的基因(或致命性因子)发生重组时，才能获 得能存活的纯合抗性植物。对育成品系3591的GISH分析表明，由于抗性基 因和致命性因子发生了重组，纯合的抗性植物(3591-1)可以得到。五个其 它的编号的品系均具有两个小的和大的A.roylei基因渗入片段，这意味着这些 植株的抗性基因(多个)是纯合的并且A.roylei致死因子是杂合的。

必须注意到，如上述的假设所预期的一样，没有发现具有两个大的A.roylei 基因渗入片段的植株，因为这样的遗传组成导致不会形成种子。

实施例4：与霜霉病(Pd)抗性位点连锁的标记的鉴定(来自A.roylei)。

植物材料(个体数量)：

1x Allium roylei(纯合抗性)

4x(称作AcA至AcD)和24x(称作Ac01至Ac24)洋葱(Allium cepa) (纯合易感染)

1X 3591-1(纯合抗性；小的基因渗入片段)

1x 3591-3(纯合抗性，小的和大的基因渗入片段)

14x 2348-*(杂合抗性；大的片段)。

引言：

为了获得AFLPTM技术的完整信息，可参考n°4的参考文献。

本实施例的目的是鉴定与洋葱中霜霉病(Pd)抗性位点连锁的AFLPTM标 记。源自于Allium roylei的抗性位点如实施例2所示，已经在一些个体(个体 2348-*)中鉴定到大的基因渗入片段。  除这些个体外，也获得了两个具有较 小基因渗入片段的个体(3591-1；小的片段，和3591-3；小的和大的片段)。 为鉴定与抗性位点相关的标记，并且特别是为了获得位于较小基因渗入片段上 的标记，采用改良的分离群体分析(BSA，参见Michelmore，参考文献11) 策略对4个个体/池进行分析：

I：个体2348-6；杂合抗性；大的基因渗入片段，

II：个体3591-1；纯合抗性；小的基因渗入片段，

III：个体Allium roylei；纯合抗性，

IV：四个洋葱(A.cepa)个体(AcA至AcD)组成的池；纯合易感染的。

四个分离的洋葱(Allium cepa)个体，13个保留的′2348′个体和个体3591 -3被用于验证连锁的标记。发现的与感兴趣的性状连锁的标记最后在一组24 个洋葱(Allium cepa)的个体(Ac01至Ac24)上进行验证以鉴定出假阳性标 记。

结果：

生物材料：

用31个个体(28X洋葱和3591-1，3591-3和Allium roylei个体)以及 14x′2348′个体的叶片提取DNA，而且对于所有个体，产生Pstl/Msel模板。 对于2348-4、2348-5、2348-11和3591-3个体没有产生可靠的AFLPTM指 纹，因此这些个体在进一步分析中被剔除。

标记的鉴定与验证：

适合的BSA方法用于上述的四个个体或池I、II、III、IV。

BSA使用PstI+3/Msel+3矩阵中的96个引物组合，引物组合概述在表3 中并且表6给出了AFLPTM引物酶组合的名称。

BSA分析鉴定得到了34个候选标记，其中有8个候选标记可能与小的基 因渗入片段连锁。从34个候选标记中，选择了13个标记(包括这8个标记) 可能与小的基因渗入片段连锁。选择的13个标记用于在更多的个体上进一步 验证。为了进一步验证，使用了四个洋葱(Allium cepa)个体，13个保留的′2348 ′个体和个体3591-3。

表3：用于BSA方法的引物组合。

 M32  M34  M35  M37  M47   M48   M50   M51   M54   M59   M60   M62  P31  ×  ×  ×  ×  ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×  P32  ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×  P33  ×  ×  ×  ×  P38  ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×  P39  ×  ×  ×  ×  ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×  P35  ×  ×  ×  ×  ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×  P42  ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×  P43  ×  ×  ×  ×  ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×  P44  ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×  P45  ×  ×  ×  ×  ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×   ×

在验证的基础上，三个候选标记(其中两个可能与小的基因渗入片段连锁) 没有显现与感兴趣的性状明显连锁。然而六个候选标记中的共四个标记各自表 现出最大程度地与小的基因渗入片段明显连锁。可是这些与小的基因渗入片段 连锁的标记中有两个标记在洋葱(Allium cepa)的4个个体中也有。因此，这 些标记不能用于更进一步的分析。验证的结果列于表4。

标记P32/M62-061、P33/M32-151、P35/M51-330和P43/M35-190 被发现与小的基因渗入片段连锁。

在24个洋葱个体上进行另外的验证试验：

为了去除假阳性标记，与小的基因渗入片段连锁的四个候选标记(P32/ M62-061、P33/M32-151、P35/M51-330和P43/M35-190)在24个额外 的洋葱(Allium cepa)个体(Ac01至Ac24)上进行验证。获得的标记记数与 预期的记数相一致(见表5)。

表4：单个植株的标记记数的概述

    与大的渗入片段连锁的     标记     与小的渗入片段连锁的标记     P31/M48-186     P32/M62-322     P32/M62-079     P33/M32-115     P33/M32-155     P45/M35-062     P32/M62-061     P33/M32-151     P35/M51-330     P43/M35-190 2348-1     +     +     +     +     +     +     +     +     +     + 2348-3     +     +     +     +     +     +     +     +     +     + 2348-4     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     × 2348-5     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     × 2348-6     +     +     +     +     +     +     +     +     +     + 2348-7     +     +     +     +     +     +     +     +     +     + 2348-8     +     +     +     +     +     +     +     +     +     + 2348-11     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     × 2348-13     +     +     +     +     +     +     +     +     +     + 2348-14     +     +     +     +     +     +     +     ？     +     + 2348-15     +     +     ？     +     +     +     +     +     +     + 2348-16     +     +     +     +     +     +     +     +     +     + 2348-18     +     +     +     +     +     +     +     +     +     + 2348-19     -     +     +     +     +     ×     +     -     +     + 3591-3     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     ×     × 3591-1     -     -     -     -     +     +     +     +     +     + A.roylel     +     +     +     +     +     +     +     +     +     + A.cepa A     -     -     -     -     -     -     -     -     -     - A.cepa B     -     -     -     -     -     -     -     -     -     - A.cepa C     -     -     -     -     -     -     -     -     -     - A.cepa D     -     -     -     -     +     +     -     -     -     -

+＝有AFLPTM片段，-＝无AFLPTM片段

×＝无好的产物产生，？＝不可记数

讨论和结论：

为了鉴定洋葱中与霜霉病Pd抗性位点相关的标记，并且特别是为了获得 位于较小基因渗入片段上的标记，采用改良的分离群体分析(BSA)策略对4 个个体／池进行分析。共用了96个Pstl/Msel引物组合进行BSA分析(在四个 个体/池上进行筛选)。

表5：单个植株的标记记数的概述

    与大的渗入片段连锁的     标记     与小的渗入片段连锁的标记     P31/M48-186     P32/M62-322     P32/M62-079     P33/M32-115     P33/M32-155     P45/M35-062     P32/M62-061     P33/M32-151     P35/M51-330     P43/M35-190  A.cepa 1     -     -     -     -  A.cepa 2     -     -     -     -  A.cepa 3     -     -     -     -  A.cepa 4     -     -     -     -  A.cepa 5     -     -     -     -  A.cepa 6     -     -     -     -  A.cepa 7     -     -     -     -  A.cepa 8     -     -     -     -  A.cepa 9     -     -     -     -  A.cepa 10     -     -     -     -  A.cope 11     -     -     -     -  A.cope 12     -     -     -     -  A.cepa 13     -     -     -     -  A.cepa 14     -     -     -     -  A.cepa 15     -     -     -     -  A.cepa 16     -     -     -     -  A.cepa 17     -     -     -     -  A.cepa 18     -     -     -     -  A.cepe 19     -     -     -     -  A.cepa 20     -     -     -     -  A.cepa 27     -     -     -     -  A.cepa 22     -     -     -     -  A.cepa 23     ×     -     ×     -  A.cepa 24     -     -     -     -

+＝有AFLPTM片段，-＝无AFLPTM片段

×＝无好的产物产生，?＝不可记数

BSA分析鉴定得到了34个候选标记，其中有8个候选标记可能位于小的 基因渗入片段上。验证后，共鉴定到四个标记位于小的基因渗入片段上(霜霉 病抗性位点也定位在上面)。

为了去除假阳性标记，与小的基因渗入片段连锁的四个候选标记(P32/ M62-061、P33/M32-151、P35/M51-330和P43/M35-190)在24个另外 的洋葱(Allium cepa)个体(Ac01至Ac24)上进行验证。获得的标记记数与 预期记数相一致。因此，发现这些标记与感兴趣的小的基因渗入片段连锁并且 可进一步用于选择过程。

表6：AFLPTM引物酶组合的命名法

    扩充   引物编号     扩充   引物编号   扩充   引物编号     AAA     AAC     AAG     AAT     ACA     ACC     ACG     ACT     AGA     AGC     AGG     AGT     ATA     ATC     ATG     ATT     CAA     CAC     CAG     CAT     CCA   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51     CCC     CCG     CCT     CGA     CGC     CGG     CGT     CTA     CTC     CTG     CTT     GAA     GAC     GAG     GAT     GCA     GCC     GCG     GCT     GGA     GGC     GGG   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   GGG   GGT   GTA   GTC   GTG   GTT   TAA   TAC   TAG   TAT   TCA   TCC   TCG   TCT   TGA   TGC   TGG   TGT   TTA   TTC   TTG   TTT   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94

实施例5：葱属植物中，赋予洋葱霜霉病抗性的A.roylei的基因渗入片段 (能纯合存在但不能引起致死)存在与否的判断。

在第一步骤中，分析被检植物中是否存在洋葱霜霉病Pd抗性位点。可采 用AFLPTM技术分析所述位点是否存在，如上述实施例说明的那样或者通过分 析植物对自然接种或人工接种的霜霉病的抗性。

如果植物基因组中具有Pd抗性位点，所述植物第3染色体的同源染色体 必定相应于图1所示的4种可能性(与致死序列连锁或非连锁)的一种。为了 将前三个基因组(其是本发明的部分)与第四个基因组区别开，将被检植物自花 授粉。检测自花受粉后代是否具有Pd抗性位点。从图1中可以看出，仅仅前 三个基因组提供的后代理论上有至少75％的抗性个体，而描述的第四个基因组 (不是本发明的部分)提供的后代中对洋葱霜霉病抗性的个体小于67％。

知道了自花受粉后代抗性个体的百分比，因此就可能推导出被检测的植物 是否属于所描述的前三种中的一种或者属于第四种，即是否属于本发明的范 围。

实施例6：

来自于3591品系(在纯合的抗性个体方面与3591-1相似)并且具有两 个携带有抗性位点的小的基因渗入片段的植物，与三种育种计划(其中这三种 方式的杂交是以单交种作为母本，来自于3591品系的植物作为父本)的杂交 种杂交。

这样杂交后的杂交种，37-1001已用于田间试验。该杂种是一个极端长日 照型洋葱的中早熟品种，适于中长期贮存。它表现为中等强度的叶子活力、很 一致的脱落、均匀的扁圆形鳞茎(3.8units/he.)、良好的产量潜力、良好的黄 棕色表皮、良好的硬度(3.4mm)。田间试验数据列于表7，将37-1001与来 自Nickerson Zwaan的两个商业化的洋葱杂种Tascot Drago比较。从该表可以 看出，在所有植物中感兴趣的农艺性状是相似的。

对于本发明最重要的是，病害田间试验以2次重复连续进行2年，所有被 测的植物37-1001均是抗病的，而用作对照的易感染品种Staccato(Nickerson zwaan杂种)的100％植株被霜霉病感染。

表7

   切割去鳞茎时计数的    环的数量 4.96 5.24 5.32 4.08 5 5.16 4.42 4.63 4.68 5 4.20 4.36 4.46 4.92 4.54    硬度    (＝当挤压时变形的mm数，    因此越低越好) 3.61 3.62 3.51 3.60 4 3.38 2.93 3.08 3.26 3 3.57 3.17 3.19 3.22 3.28    表皮质量    (1＝鳞茎周围无纸质表皮     ，9＝大量的纸质表皮) 6 6 7 6 6 7 6 7 6 6 5 6 6 6 6    保持鳞茎的表皮相对％ 92.9 97.7 98.8 91.1 95 99.2 98.3 100.5 96.9 98 89.8 97.4 95.3 91.7 94.4    无表皮鳞茎的％ 10.6 6.0 4.9 12.3 8 4.5 5.4 3.3 6.8 6 13.6 6.3 8.3 11.8 9.1    鳞茎的平均重量(g) 130 122 128 124 126 119 111 118 125 120 129 124 117 122 122    相对产量    (100＝试验的平均值) 106.6 103.4 101.6 96.4 102 91.7 95.7 92.4 97.6 96 103.9 103.5 97.4 106.3 101.4    产量(每平方米) 8.883 8.610 8.467 8.028 8.50 7.640 7.971 7.694 8.126 7.99 8.657 8.622 8.114 8.852 8.446    相对早衰    (测定叶片脱落时期) 131.8 115.5 113.7 113.6 124 97.5 113.7 79.4 115.5 106 115.5 97.5 113.7 115.5 109.6    发花茎(bolters)的％    (相对于总量的植株) 1.0 1.8 2.8 0.6 2 0.3 0.8 0.8 1.9 1 0.0 0.3 0.5 0.0 0.4    发花茎(bolters)的    数量(＝发出了花茎的    植株数) 4 7 10 2 2 1 3 3 7 4   1 2 2    叶尖    (1＝黄或棕色的叶尖，    5＝深绿色的叶尖) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3    叶活力    (1＝弱生长的叶片，    5＝有活力的叶片) 5 5 5 4 5 4 3 4 5 5 4 4 4 5 5    叶片的直立性    (1＝水平，    5＝直立) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3    叶片颜色    (1＝浅绿色，    5＝深绿色) 3 3 3 3 3 4 3 5 4 3 3 3 3 3 3    名称 Tasco Tasco Tasco Tasco Tasco 平均值 Drago Drago Drago Drago Drago 平均值 37-1001 37-1001 37-1001 37-1001 37-1001 平均值

实施例7：

在下文中，品系3591或植物3591是具有小的基因渗入片段的纯合抗性植 物，它们均与3591-1相似，因为它们也以纯合的状态包含小的基因渗入片段 并且属于相同的育成品系。

3591植物也已成功地作为原始材料用于培育新的商用洋葱杂种(对霜霉 病具有抗性)的亲本。3591植物第一次与洋葱自交品系杂交生产F1杂种。

实际上，通过用其它的授粉品系回交，可以将霜霉病抗性基因导入到许多 其它不同类型的授粉品系中。

第一次杂交是在具有两个小的基因渗入片段(携带有抗性位点)的抗性植 物与易感染品系间完成。这样的杂交生产杂种(F1s)，所述杂种以杂合状态含 有小的基因渗入片段。这些杂合抗性F1植物被用于随后与易感染品系回交或 者与用于生产F1抗性植物的易感染品系回交。这样的会回交步骤产生含有 50％抗性植物和50％易感染植物的群体。由于Pd抗性位点显性遗传，每个回 交世代都会发生1∶1分离。所有的易感染植物都显现对霜霉病易感染性而被去 除。用作亲本材料生产F1杂种的新的洋葱自交品系通过本领域技术人员熟知 的几个回交步骤后自花授粉来获得。

这样的遗传通过田间试验得到证实；通过杂交sy108a*3591获得的9种植 物中，该9种植物是抗性的。类似地，通过杂交fra*3591生产的四种植物中， 所有的四种植物均是抗性的。也类似地，通过杂交syt*3591生产的3种植物 对葱霜霉病均是抗性的。这些植物然后按照以下所述的进行回交。

实施例8：

也可以用本发明中所公开的标记来确定所有植物的遗传型；当用具有两个 小的基因渗入片段(携带有抗性位点)的3591植物与其它不同的自交亲本品 种杂交而产生的16个F1杂种中，当使用引物(A)的那一对引物(标记P32/ M62-061与小的渗入片段连锁)时显示出了预期的61个核苷酸的片段，并且 当应用标记p32/M62-079(该对引物是引物(B′))时不显示79个核苷酸的 片段，这样的片段通常突出大的基因渗入片段的存在。

参考文献

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10.Khrustaleva，L.I.and Kik，C.将Allium fistulosum渗入A.roylei媒介 的A.cepa(lntrogression of Allium fistulosum into A.cepa mediated by A.roylei.) Theor.Appl.Genet.100：17-26，2000.

11.Michelmore，R.W.等人.通过分离群体分析来鉴定与病害抗性基因相 连锁的标记：一种通过使用分离群体来快速检测在特定基因组区域中的标记的 方法(Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis：A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations.)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88：9828-9832， 1991.

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13.Rogers and Bendich.In：Gelvin SB，Schilperoort RA(eds)植物分子生物 学手册A6(Plant Molecular Biology manual A6，)Kluwer Academic Publ.， Dordrecht，the Netherlands；1-10，1998.

微生物材料样品的保藏证明

I、微生物的说明

名称：Allium cepa3591-1

国际保藏单位的保藏号：NCIMB 41249

II、I中的微生物结合分类学命名提出

III、保藏日期：2004年10月13日

V、保藏单位名称：NCIMB公司

           地址：Ferguson Building，Craibstone Estate

                 Bucksburn，Aberdeen，

                 AB219YA

                 苏格兰

                                               2004年11月2日

微生物材料样品的存活证明

I、保藏者：Nickerson Zwaan b.v.

II、国际保藏单位的保藏号：NCIMB 41249

保藏日期：2004年10月13日

III、存活证明：上述II中的微生物在2004年10月15日被检测，在该 日，该微生物是存活的。

V、保藏单位名称：NCIMB公司

地址：Ferguson Building，Craibstone Estate

      Bucksburn，Aberdeen，

      AB219YA

      苏格兰

                                       2004年11月2日

序  列  表

<110>NICKERSON ZWAAN B.V.

<120>对霜霉病菌引起的霜霉病的抗性

<130>B5982A CS/SA

<150>EP 04078320.1

<151>2004-12-08

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>接头α

<400>1

ctcgtagact  gcgtacatgc a                            21

<210>2

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>接头α

<400>2

tgtacgcagt  ctac                                    14   

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>接头β

<400>3

gacgatgagt  cctgag                                 16

<210>4

<211>14

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>接头β

<400>4

tactcaggac tcat                                14

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物A

<400>5

gactgcgtac  atgcagaac                          19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物A

<400>6

gatgagtcct gagtaactt                           19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物B

<400>7

gactgcgtac  atgcagaag                          19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物B

<400>8

gatgagtcct  gagtaaaac                          19

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物C

<400>9

gactcgcgtac  atgcagaca                         19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物C

<400>10

gatgagtcct gagtaacca                                19

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物C’

<400>11

gactgcgtac  atgcagaaa                               19

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物C’

<400>12

gatgagtcct  gagtaacac                               19