增强蛋白表达和纯化的方法和组合物
阅读：678发布：2020-06-23
专利汇可以提供增强蛋白表达和纯化的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了用于在宿主细胞中增强异源融合蛋白的表达 水 平、分泌和纯化的方法。，下面是增强蛋白表达和纯化的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.编码工程SUMO的分离的核酸分子，其中所述的工程SUMO 是其中SUMO蛋白酶相互作用结构域中的至少一个精氨酸残基已经 被改变为非碱性氨基酸的SUMO蛋白。
2.根据权利要求1的核酸，其中所述的SUMO蛋白酶相互作用 结构域包括氨基酸序列
X1FX2X3X4GX5X6(SEQ ID NO：2)，
其中X1和X6是非碱性氨基酸，并且X2、X3、X4和X5是任何氨 基酸。
3.根据权利要求2的核酸分子，其中X1是苏氨酸，并且X6是 谷氨酸。
4.根据权利要求1的核酸，其中所述的SUMO蛋白酶相互作用 结构域包括氨基酸序列
X1FX2F(SEQ ID NO：65)，
其中X1和X2是除了精氨酸之外的任何氨基酸。
5.根据权利要求2的核酸分子，其中X1是苏氨酸，并且X2是 谷氨酸。
6.根据权利要求1的核酸分子，其中所述的工程SUMO是SEQ ID NO：1。
7.根据权利要求1的核酸，其中所述的工程SUMO选自人 SUMO1、人SUMO2、人SUMO3、非洲爪蟾(Xenopus laevis)Smt3、 酵母Smt3、黑腹果蝇(Drosophila Melanogaster)Smt3、拟南芥 (Arabidopsis Thaliana)SUMO1和拟南芥SUMO2。
8.根据权利要求1的核酸，其中所述的工程SUMO选自：
a)人SUMO1，其中63位的精氨酸和70位的精氨酸中至少之一 已被改变为非碱性氨基酸；
b)人SUMO2，其中59位的精氨酸和61位的精氨酸中至少之一 已被改变为非碱性氨基酸；
c)人SUMO3，其中58位的精氨酸和60位的精氨酸中至少之一 已被改变为非碱性氨基酸；
d)非洲爪蟾Smt3，其中59位的精氨酸和61位的精氨酸中至少 之一已被改变为非碱性氨基酸；
e)酵母Smt3，其中64位的精氨酸和71位的精氨酸中至少之一 已被改变为非碱性氨基酸。
f)黑腹果蝇Smt3，其中54位的精氨酸和56位的精氨酸中至少 之一已被改变为非碱性氨基酸；
g)拟南芥SUMO1，其中65位的精氨酸和66位的精氨酸中至少 之一已被改变为非碱性氨基酸；和
h)拟南芥SUMO2，其中64位的精氨酸和65位的精氨酸中至少 之一已被改变为非碱性氨基酸。
9.分离的工程SUMO蛋白，由权利要求1的核酸分子所编码。
10.根据权利要求1的核酸分子，该分子可操作地连接于多克隆 位点；其中所述的多克隆位点允许符合读框并且直接地将编码所关心 的蛋白的核酸克隆到编码工程SUMO的Gly-Gly切割位点的核酸序列 的3’。
11.根据权利要求1的核酸分子，进一步包括编码亲和标签的核 酸序列；其中所述的编码亲和标签的核酸序列符合读框并可操作地连 接于编码所述的工程SUMO的核酸序列的5’。
12.包含权利要求1的核酸分子的表达载体。
13.编码工程SUMO蛋白酶的分离的核酸分子，其中所述的工程 SUMO蛋白酶包括SUMO相互作用结构域，该结构域包括氨基酸序列
WLNX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：6)，
其中X1和X5是任何非酸性氨基酸，X2、X3和X4是任何氨基酸。
14.根据权利要求13的分离的核酸分子，其中X1是丝氨酸，并 且X5选自丝氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸。
15.根据权利要求13的分离的核酸分子，其中X1是丝氨酸；X2 是甘氨酸；并且X5是丝氨酸。
16.根据权利要求13的分离的核酸分子，其中X2选自甘氨酸和 苏氨酸；X3是异亮氨酸或缬氨酸；并且X4是异亮氨酸或苏氨酸。
17.根据权利要求13的分离的核酸分子，其中所述的工程SUMO 蛋白酶选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
18.权利要求13的核酸分子所编码的分离的工程SUMO蛋白酶。
19.增强在宿主细胞中所关心的蛋白表达水平的方法，包括：
i)可操作地连接权利要求1的核酸至编码所述所关心的蛋白的核 酸序列上，从而生成编码融合蛋白的构建体，和
ii)将所述的核酸导入所述的宿主细胞，
由此在所述融合蛋白中SUMO的存在增加所述所关心的蛋白在 所述宿主细胞中的表达水平。
20.根据权利要求19的方法，其中所述的宿主细胞选自原核细 胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、大肠杆菌、昆虫细胞和真核细胞。
21.根据权利要求19的方法，进一步包括所述的融合蛋白的分 离。
22.根据权利要求21的方法，进一步包括所述融合蛋白的切割以 释放所述所关心的蛋白。
23.在宿主细胞中产生所关心的蛋白中改变的氨基末端的方法， 包括：
a)提供编码所述所关心的蛋白的核酸序列；
b)在所述的核酸中改变N末端氨基酸编码序列；
c)可操作地连接权利要求1的核酸至编码所述所关心的蛋白的 所述核酸序列上；
d)在宿主细胞中表达所述的核酸；和
e)在所述的宿主细胞中表达能够切割工程SUMO的工程SUMO 蛋白酶，
由此该工程SUMO蛋白酶切割工程SUMO，从而生产具有改变的 氨基末端的所关心的蛋白。
24.根据权利要求23的方法，进一步包括具有改变的氨基末端的 所关心的蛋白的分离。
25.增强所关心的蛋白从宿主细胞分泌的水平的方法，包括：
i)可操作地连接权利要求1的核酸分子至编码所述所关心的蛋白 的核酸序列上，从而生成编码融合蛋白的构建体，和
ii)将所述的核酸导入所述的宿主细胞，
由此在所述融合蛋白中工程SUMO的存在增加了所述所关心的 蛋白从所述宿主细胞的分泌。
26.试剂盒，包括重组载体，所述重组载体含有可操作地连接于 启动子和多克隆位点的权利要求1的核酸分子；其中所述的多克隆位 点允许符合读框并且直接地将编码所关心的蛋白的核酸克隆到编码 工程SUMO的Gly-Gly切割位点的核酸序列的3’。
27.根据权利要求26的试剂盒，其中所述的试剂盒进一步包括宿 主细胞。
28.根据权利要求27的试剂盒，其中所述的宿主细胞选自原核细 胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、大肠杆菌、昆虫细胞和真核细胞。
29.根据权利要求26的试剂盒，其中所述的的试剂盒进一步包括 用于基于寡核苷酸的位点定向诱变的试剂，所述诱变用于改变编码所 述所关心的蛋白的核酸而产生不同于天然的所关心的蛋白的氨基末 端。
30.用于从宿主细胞中纯化蛋白的试剂盒，包括：
i)重组载体，包括：
a)权利要求1的核酸分子；
b)启动子；
c)多克隆位点；和任选，
d)编码亲和标签的核酸序列；并且其中所述的启动子可操作 地连接于权利要求1的所述核酸分子上，其中所述的编码亲和标签的 核酸序列，如果有的话，符合读框并可操作地连接于权利要求1的核 酸分子，并且其中所述的多克隆位点允许符合读框并且直接地将编码 所关心的蛋白的核酸克隆到编码工程SUMO的Gly-Gly切割位点的核 酸序列的3’，和
ii)组合物，包括在Gly-Gly切割位点之后特异切割工程SUMO 的蛋白酶。
31.根据权利要求30的试剂盒，其中所述的试剂盒进一步包括宿 主细胞。
32.根据权利要求30的试剂盒，其中所述的宿主细胞选自原核细 胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、大肠杆菌、昆虫细胞以及真核细胞。
33.根据权利要求30的试剂盒，进一步包括至少一种以下物质：
i)用于结合亲和标签的固体支持物，
ii)裂解缓冲剂，
iii)洗涤缓冲剂，
iv)洗脱缓冲剂，
v)切割缓冲剂，和
vi)指导材料。
34.根据权利要求26的试剂盒，进一步包括编码切割工程SUMO 的工程SUMO蛋白酶的表达载体。
35.根据权利要求30的试剂盒，进一步包括编码切割工程SUMO 的工程SUMO蛋白酶的表达载体。
36.表达载体，包括权利要求13的核酸分子。
37.分离的细胞，包括权利要求12的表达载体。
38.分离的细胞，包括权利要求36的表达载体。
39.微阵列，包括融合蛋白，所述融合蛋白包括与所关心的蛋白 连接的权利要求9的工程SUMO蛋白。
40.根据权利要求19的方法，其中所述所关心的蛋白是有毒蛋 白。
发明领域
本发明涉及重组cDNA的表达和表达蛋白的纯化领域。更具体地 说，本发明提供了增强异源蛋白质从多种不同宿主物种中表达并利于 其纯化的材料和方法。
发明背景
贯穿本说明书引用了几种出版物和专利文献以描述本发明所属 技术领域状况。这些参考资料的全部引用可以在整个说明书中找到。 每个引用通过援引并入本文，如同全部阐述了一样。
在异种的表达系统中不能统一的表达和纯化具有生物学活性的蛋白已 经妨碍了功能基因组研究(Ryan和Patterson(2002)Trends Biotechnol， 20：S45-51)。尽管在特定表达载体中使用了相同的转录和翻译信号，仍观察 到表达蛋白水平的变化显著(Weickert等(1996)Curr.Opin.Biotechnol.， 7：494-9)。因此，人们已经开发了几种策略，使用在细菌、酵母以及哺 乳动物和昆虫的细胞中将异源蛋白质作为基因融合物表达(Ecker等 (1989)J.Biol.Chem.，264：7715-9；Butt等(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.，86：2540-4；Kapust和Waugh(1999)Protein Sci.，8：1668-74；Ikonomou 等(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.，62：1-20)。
到目前为止，对于研究和商业目的来说，在细菌中表达异源基因 是最简单和最便宜的方法。然而，在大肠杆菌中某些异源基因产物不 能获得他们正确的三维构象，而其他异源基因产物过量生产时汇集 (sequestered)为大的不溶解的集合物或“包含体”(Jonasson等 (2002)Biotechnol.Appl.Biochem.，35：91-105；Georgiou和Valax(1999) Methods Enzymol.，309：48-58.)。为了获得合理的重组蛋白得率，经常 需要大量变性剂诱导的增溶方法之后再在适宜再折叠的条件下除去 变性剂。
对于结构基因组项目，开放阅读框(ORFs)的选择也表明只有大约 20％在大肠杆菌中表达的基因可以产生可溶的或正确折叠的蛋白质 (Waldo等(1999)Nat.Biotechnol.，17：691-5)。这些数字是非常令人失望 的，尤其是现在大多数的科学家依靠大肠杆菌来初始尝试表达基因产 物。几种通过连接标签如NUS A、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽 S转移酶(GST)和硫氧还蛋白(TRX)的蛋白表达系统已经开发出来 (Jonasson等(2002)Biotechnol.Appl.Biochem.，35：91-105)。所有的这些 系统都具有某些缺点，包括表达低效以及对期望结构切割不一致。
在文献(Jentsch和Pyrowolakis(2000)Trends Cell Biol.，10：335-42； Yeh等(2000)Gene，248：1-14；Larsen和Wang(2002)J.Proteome Res.， 1：411-9)中已经描述了泛素(Ub)和泛素类蛋白(Ubls)。SUMO系统也被 描述(Muller等(2001)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，2：202-10.)。SUMO(小 泛素相关修饰物)是一种Ubl，在公开文献中又被称作Sentrin、SMT3、 PIC1、GMP1和UBL1。在整个真核生物王国中都存在SUMO途径， 从酵母到人类SUMO蛋白都高度保守(Kim等(2002)J.Cell.Physiol.， 191：257-68)。虽然泛素和SUMO之间的全序列同源性仅有18％，但通 过核磁共振(NMR)进行的结构测定显示这两种蛋白拥有共同的三维结 构，特征为严密包裹的球状折叠，由β-片层包围α-螺旋(Bayer等 (1998)J.Mol.Biol.，280：275-86；Kim等(2000)J.Biol.Chem.，275： 14102-6)。SUMO陪伴性质的实验显示它附着在不稳定蛋白的N端， 能作为折叠的核，并保护蛋白免于聚集。
所有的SUMO基因都编码前体蛋白，前体蛋白具有短C末端序 列，该序列超出保守C末端Gly-Gly基序而延伸(Muller等(2001)Nat. Rev.Mol.Cell.Biol.，2：202-10)。该延伸序列长度有所变化并通常为 2-12氨基酸。在细胞内SUMO化(sumoylation)之前，SUMO蛋白 酶(也称为水解酶)除去C末端延伸(Coloma等(1992)J.Immunol. Methods，152：89-104)。将SUMO的C未端连接到目标蛋白赖氨酸残 基的ε-氨基叫做SUMO化。细胞蛋白的SUMO化被认为调节核转运、 信号转导、应力反应以及细胞周期进程(Kretz-Remy和Tanguay(1999) Biochem.Cell.Biol.Biol.，77：299-309)。很可能SUMO传导将蛋白易位 于不同细胞区室的信号，然而SUMO这种功能的准确的作用机制细节 不清楚。如果容许这两种蛋白修饰造成的不同作用，SUMO途径和泛 素途径之间的相似性是很显著的(Goettsch和Bayer(2002)Front. Biosci.，7：a148-62)。
NusA是另一种融合标签，可能由于它分子量大，能促进伙伴蛋 白的溶解(Davis等(1999)Biotecnol.Bioeng.，65：382-8)。谷胱甘肽S- 转移酶(GST)(Smith和Johnson(1988)Gene，67：31-40)和麦芽糖结合蛋 白(MBP)(diGuan等(1988)Gene，67：21-30)融合标签也被认为可增加融 合伙伴的表达和得率。然而使用GST时并非总会观察到增强表达，因 为它可形成二聚体并妨碍蛋白溶解。所有的这些融合系统的另一问题 是期望的蛋白可能必须从融合体中移除。为了规避这个问题，经常在 融合标签下游设计蛋白酶位点，如因子Xa、凝血酶、肠激酶或Tev 蛋白酶位点。然而因为蛋白酶识别的短的特异的氨基酸序列可能出现 在融合物/目标蛋白内，所以经常觉察到不恰当的切割(Jonasson等 (2002)Biotechnol.Appl.Biochem.，35：91-105)。本发明规避了这些问 题。而且，不像SUMO蛋白酶，Tev蛋白酶是一种序列特异的蛋白酶， 它在切割融合蛋白后会在所关心的蛋白的N未端留下不期望的序列。 相反，SUMO蛋白酶从SUMO C末端切割任何序列，从而在融合蛋白 中产生期望的N未端(除了脯氨酸)。
发明概述
依照本发明，提供工程SUMO蛋白，这种SUMO蛋白不能被野 生型SUMO蛋白酶切割。也提供编码该工程SUMO蛋白的核酸分子。 在一种特定方案中，工程SUMO是其中在SUMO蛋白酶相互作用结 构域中的至少一个精氨酸残基已被改变为另一种氨基酸，优选非碱性 氨基酸，的SUMO蛋白。在另一个实施方案中，工程SUMO蛋白包 含氨基酸序列X1FX2X3X4GX5X6(SEQ ID NO：2)，其中X1和X6是除了 精氨酸的任何氨基酸，X2、X3、X4和X5是任何氨基酸。在另一个实 施方案中，X1从谷氨酰胺、苏氨酸和苯丙氨酸中挑选，X6从亮氨酸 和谷氨酸中挑选。在又一个实施方案中，工程SUMO与SEQ ID NO：1 之间具有至少90％的同一性。
依照本发明，提供工程SUMO蛋白酶，该蛋白酶可以切割工程 SUMO蛋白。也提供编码该工程SUMO蛋白酶的核酸分子。在一种特 定实施方案中，工程SUMO蛋白酶是其中SUMO相互作用结构域已 被改变的SUMO蛋白酶。在一种更具体的实施方案中，工程SUMO 蛋白酶包含氨基酸序列WLNX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：6)，其中X1和 X5是任何非酸性氨基酸，X2、X3、X4和X5是任何氨基酸。在另一个 实施方案中，X1是丝氨酸；X2从甘氨酸和苏氨酸中挑选；X5从丝氨 酸、丙氨酸和甲硫氨酸中挑选。在又一个实施方案中，工程SUMO蛋 白酶与从SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中选出的氨 基酸序列具有至少90％的同源性。
依照本发明的另一个方面，提供在宿主细胞中增强所关心的蛋白 表达水平的方法。在一种特定实施方案中，这些方法包括i)将编码工 程SUMO的核酸可操作地连接到编码所关心的蛋白的核酸序列上，由 此产生编码融合蛋白的构建体，ii)将该核酸导入宿主细胞，从而在融 合蛋白中工程SUMO的存在增加了宿主细胞中所关心的蛋白的表达 水平。在一种特定实施方案中，该方法进一步包括分离融合蛋白并任 选地切割融合蛋白以释放所关心的蛋白。
依照本发明的另一个方面，提供了在宿主细胞中产生所关心的蛋 白中改变的氨基末端的方法。在一个特定实施方案中，这些方法包括 a)提供编码所关心的蛋白的核酸序列；b)在核酸中改变编码N末端氨 基酸的序列；c)将编码工程SUMO的核酸可操作地连接到编码所关心 的蛋白的核酸序列上；d)在宿主细胞中表达该核酸；和e)在宿主细胞 中表达能够切割工程SUMO的工程SUMO蛋白酶，由此该工程SUMO 蛋白酶切割工程SUMO，从而在细胞中生产具有改变的氨基末端的所 关心的蛋白。在一个特定实施方案中，该方法进一步包括具有改变的 氨基末端的所关心的蛋白的分离。
依照本发明的又一个的方面，提供了增强所关心的蛋白从宿主细 胞中分泌的水平的方法。在一个特定实施方案中，这些方法包括i)将 编码工程SUMO的核酸分子可操作地连接到编码所关心的蛋白的核 酸序列上，从而生成编码融合蛋白的构建体，和ii)将该核酸导入宿 主细胞，由此融合蛋白中工程SUMO的存在增强了所关心的蛋白从宿 主细胞的分泌。
也提供重组载体，包括编码工程SUMO的核酸分子，该核酸分子 可操作地连接于启动子和多克隆位点。在一种优选实施方案中，多克 隆位点允许克隆编码所关心的蛋白的核酸至编码工程SUMO的 Gly-Gly切割位点的核酸序列的3’。在一种特定实施方案中，重组载 体包含在试剂盒内，该试剂盒可进一步包括宿主细胞和用于基于寡核 苷酸位点定向诱变的试剂，所述诱变用于改变编码所关心的蛋白的核 酸以产生不同于天然所关心的蛋白的氨基末端。
在另一个实施方案中，提供了用于从宿主细胞中纯化蛋白的试剂 盒，包括i)重组载体，含有a)编码工程SUMO的核酸分子；b)启动子； c)多克隆位点；和任选地d)编码亲和标签的核酸序列；其中启动子可 操作地连接至编码工程SUMO的核酸分子上，其中如果有编码亲和标 签的核酸序列，则其是符合读框并可操作地连接至编码工程SUMO的 核酸分子上，并且其中多克隆位点允许克隆编码所关心的蛋白的核酸 至编码工程SUMO的Gly-Gly切割位点的核酸序列的3’；和ii)组合 物，包括工程SUMO蛋白酶或编码工程SUMO蛋白酶的载体，其中 工程SUMO蛋白酶在Gly-Gly切割位点之后特异地切割工程SUMO。 在一个特定实施方案中，该试剂盒可进一步地包括至少一种宿主细 胞、结合亲和标签的固体支持物、裂解缓冲剂、洗涤缓冲剂、洗脱缓 冲剂、切割缓冲剂和指导材料。
依照本发明的另一个方面，提供了包括融合蛋白的微阵列，该融 合蛋白包括与所关心的蛋白连接的工程SUMO蛋白。
附图说明
图1是示意图，说明与野生型SUMO和野生型SUMO蛋白酶相 比，工程SUMO标签(例如SUMO*)和相应的工程SUMO蛋白酶在 从原核和真核细胞中生产和纯化蛋白的潜在应用。
图2是考马斯染色的SDS-PAGE凝胶照片，显示了在细菌细胞中， 与未加标签的GFP相比SUMO*强烈地增加了它的融合伙伴(本实验中 为GFP)的表达量和溶解性，与野生型SUMO一样。U＝未诱导培养； I＝诱导培养；S＝可溶组分；IB＝不溶包含体。
图3A和3B是蛋白质印迹照片，显示SUMO*融合标签不会被酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的SUMO蛋白酶或昆虫细胞SUMO 蛋白酶所切割。图3A中，用表达GFP(泳道1和2)，SUMO-GFP(泳 道3和4)或SUMO*-GFP(泳道5和6)的构建体转化酵母。图3B中， 将SUMO*-GFP或SUMO-GFP在22℃孵育3小时，有(泳道1和2) 或无(泳道3和4)昆虫Sf9细胞提取物。蛋白用15％SDS-PAGE凝胶 分离，用抗GFP抗体检测。*＝GFP降解产物。
图4A和4B是Smt 3和ULP 1的晶体结构以及它们潜在的相互作 用。特别描述了SUMO中的两个残基(精氨酸64和精氨酸71)和ULP1 中的两个残基(谷氨酸455和天冬氨酸451)，这些残基是SUMO-ULP 1 的相互作用的部分。图4A和4B中显示了不同角度的视角。
图5是SUMO的区域图解，预测该区域与ULP 1相邻。在R64 和R71位的精氨酸是加亮的。提供了SEQ ID NO：66。
图6提供了相同凝胶的考马斯染色的SDS-PAGE(上栏)以及抗 Smt3的蛋白印迹(下栏)照片，显示了在体外野生型SUMO(Smt 3)被 ULP 1和SENP2(SUMO蛋白酶1和2)切割，但SUMO*(突变Smt3) 在体外不能被这些蛋白酶切割。
图7是一种实验系统的示意图，这种实验系统应用于可切割工程 SUMO的工程SUMO蛋白酶的筛选。在大肠杆菌中，只有当β-内酰 胺酶外排进入周质间隙时，才可赋予对氨苄青霉素的抗性。如图7A 所示，当β-内酰胺酶在N未端与SUMO和不溶蛋白连接时，它被捕 获在细胞内，细菌不能在含氨苄青霉素的平板上生长。除了β内酰胺 酶复合物之外，如果在细胞中再引入SUMO蛋白酶，SUMO蛋白酶可 将β-内酰胺酶释放出来并随后外泌进入周质，在那里它赋予对氨苄青 霉素的抗性(图7B)。如果在β-内酰胺酶上SUMO标签以某种方式突 变以至于它不能被野生型SUMO蛋白酶切割(例如，该SUMO为 SUMO*)，细胞变得对氨苄青霉素敏感(图7C)。只有当SUMO蛋白酶 以某一方式突变/改变而可以切割突变的SUMO*(图7D)，细菌细胞恢 复对氨苄青霉素的抗性。Insol.蛋白＝不溶蛋白；WT SUMO蛋白酶＝ 野生型SUMO蛋白酶；BLA＝β-内酰胺酶；SUMO*＝工程SUMO。
图8是体内β-内酰胺酶筛选的培养照片，显示当蛋白酶不能切割 包含SUMO的底物时大肠杆菌不能在氨苄青霉素上生长。为了诱导蛋 白酶，平板含有0.02％阿拉伯糖。
图9提供在野生型SUMO蛋白酶ULP1中区域的示意图以及某些 在突变时恢复针对SUMO*的酶活性的特异残基。提供了SEQ ID NO：24。
图10A-10D是考马斯染色的SDS-PAGE凝胶照片，显示SUMO* 蛋白酶有效地从具有GFP的融合蛋白上切割SUMO*，但ULP1不能 切割该SUMO*标签。斜面显示了蛋白酶滴定，其中每个连续的泳道 含有的蛋白酶是前一个泳道的二分之一。图10A表明ULP1切割SMT3 标签。图10B表明SUMO*蛋白酶1切割SUMO*标签。图10C表明 ULP1不能切割SUMO*标签。图10D显示SUMO*蛋白酶1切割野生 型SUMO，但是比切割SUMO*的效率低。U＝未切割的SUMO或 SUMO*-GFP(无蛋白酶存在)；P＝仅有蛋白酶的泳道，相同量蛋白酶被 用于第一次的切割反应。
图11A-11C提供了不同物种来源的SUMO蛋白序列。下划线区 域为与SUMO蛋白酶相互作用的区域。
图12A和12B提供不同物种来源的SUMO蛋白酶序列。下划线 区域为与SUMO蛋白相互作用的区域。
图13为考马斯染色SDS-PAGE凝胶的照片，显示在昆虫细胞中 加SUMO*标签的类胰蛋白酶与加6 x His标签的类胰蛋白酶相比被以 较高水平表达并不被切割。
图14为蛋白质印迹照片，显示在毕赤酵母细胞中，与加6 x His 标签的GzmB相比，加SUMO*标签的GzmB被以较高水平表达并分 泌并不被切割。
图15A为考马斯染色SDS-PAGE凝胶照片，显示在昆虫Sf9细胞 中SUMO*融合大大增加了异源表达的UBP43蛋白。箭头指示了未融 合或SUMO*融合的UBP43的大小。图15B提供蛋白质印迹的照片， 显示了在HEK 293T细胞中小鼠组X磷脂酶2A(mX PLA2；左栏)和 去泛素酶JOSD2(右栏)的表达。只有PLA2与SUMO*融合物被分泌 至培养基，而6xHis与野生型SUMO的融合物不被分泌。6xHis-PLA2 和彻底切割的SUMO-PLA2在细胞抽提物中刚刚能被检测到。箭头指 出了PLA2、切割后野生型SUMO和SUMO*-PLA2的预期大小。JOSD2 在细胞内表达并且SUMO*大大地增强它的表达。H＝6xHis； S＝SUMO；S*＝SUMO*。
图16提供了来自初始的小鼠sPLA2-X构建体(包括活性的(图16A) 和非活性的(图16B)形式)转染(HEK-293T)后48小时时的培养基 (15μl)蛋白质印迹的照片。以下五种N末端融合标签被测定：6xHis、 6xHis-CTHS、6xHis-SUMOmut、6xHis-SUMO和6xHis-hSUMO3。全 部构建载体也都包含了小鼠IgGκ分泌信号。结果代表了至少3次独 立实验。
图17提供来自修饰(revised)后的小鼠sPLA2-X构建体(包括非活 性(图17A)和活性(图17B)形式)在转染(HEK-293T)后48小时时的 培养基(15μl)蛋白质印迹的照片。以下7种N末端融合标签被测 定：6xHis、6xHis-SUMO、6xHis-SUMO mut、6xHis-hSUMO1、 6xHis-hSUMO1 mut、6xHis-hSUMO3和6xHis-hSUMO3 mut。全部构 建体包含小鼠IgGκ分泌信号。结果代表至少3次独立实验。
图18提供了sPLA2-IIC(图18A，细胞内组分)、IIE(图18B，培养 基(15μl))、III(培养基(15μl))和V(培养基(15μl))构建体转染(HEK -293T)后48小时时的蛋白质印迹照片。对每种sPLA2，通过使用突 变和野生型形式的三种SUMOs而进行比较，6xHis标签作为对照。全 部构建体包含小鼠IgGκ分泌信号。结果代表2-3次独立实验。
发明详述
本发明提供新型的工程SUMO蛋白，该蛋白不能被真核生物系统 中的野生型SUMO蛋白酶切割，以及其使用方法。实际上，为了利用 SUMO的表达增强性质，已经开发了新型的工程SUMO标签(例如， SUMO*)，这种标签在真核细胞中不会被切割。SUMO蛋白酶存在于 所有真核细胞。因此与本发明的工程SUMO蛋白相反，野生型SUMO 的融合物在真核细胞中表达时会被切割。值得注意的是，原核生物没 有SUMO途径或SUMO蛋白酶。因此，SUMO融合物(野生型或工程 的)在原核生物中表达时不会被切割。
同时提供可切割工程SUMO蛋白的新型工程SUMO蛋白酶。工 程SUMO蛋白和SUMO蛋白酶能完成融合至工程SUMO的所关心的 蛋白的表达和纯化，无论是在真核生物还是原核生物系统中(参见例如 图1)。该系统也允许产生具有期望的N末端的天然蛋白质。
人们可以生产重组蛋白，例如通过将生物的核酸序列插入进外源 的宿主生物中。该外源宿主从插入的核酸分子来合成重组蛋白质(所 关心的蛋白)。然后生产的蛋白一般在随后的纯化步骤中从该细胞中 分离。原核的、真核的、细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞都能够应 用于重组蛋白质的表达。人们已经开发出了蛋白“标签”，其中将DNA 序列插入到编码所关心的蛋白的区域之前或之后。产生的融合蛋白包 含了该标签和所关心的重组蛋白质。蛋白标签可以增强所关心的蛋白 的溶解性、正确折叠、表达水平和纯化能力。
在过去数年里已经开发了许多不同的蛋白标签来增强在细菌大 肠杆菌(E.coli)中的蛋白表达和溶解性。这些蛋白标签包括，不限于， GST(谷胱甘肽S-转移酶)、MBP(麦芽糖结合蛋白)、Thx(硫氧还蛋白)、 NusA、Ub(泛素)和SUMO。虽然这些标签在细菌中的使用成功，但 由于各种局限性，如异源蛋白的低表达量或在Ub或SUMO标签的情 况下由于内源性蛋白酶使得不能保持为融合蛋白，因而它们不能转移 至真核细胞。
SUMO蛋白作为融合伙伴无论在细菌和真核细胞中都可以大大地 增强重组蛋白质的表达水平和质量(参见例如美国专利7060461；美国 专利申请公开Nos.20040018591和20060040335；以及PCT/US 04/20778)。SUMO家族的蛋白在真核生物蛋白上可以作为细胞调控的 一部分天然地加入和除去。SUMO的结构和SUMO蛋白加上和除去的 过程在真核细胞中高度保守。SUMO蛋白中高度的的结构保守性引起 SUMO融合标签与外源宿主的内源性SUMO修饰酶类的物种间交叉 反应。真核细胞因此能切割SUMO标签并在很多情况里这导致了标签 和重组蛋白质的分离。从真核细胞中表达并纯化“未切割的”或未加工 的野生型SUMO融合蛋白经常是不可能的。为了在真核细胞中克服这 种“成熟前”标签切割的障碍而实现增加蛋白产量，新型的SUMO蛋白 被设计出来以抵抗内源性SUMO蛋白酶。
当前的发现解决了蛋白表达领域的至少四个主要问题。第一，如 在上文所述，由于真核细胞中天然存在的水解酶瞬时切割融合键而使 在真核细胞中使用SUMO、Ub和其它类泛素蛋白融合物受到限制。 因为这种切割作用，亲和标签需放于SUMO-水解酶的切割位点之后 或在过客蛋白的C末端以帮助纯化所关心的蛋白。如果为了融合蛋白 的后续应用而需除去该亲和标签，那必须设计蛋白酶位点。在此提出 的系统解决了SUMO标签仅使用于原核系统的局限，因此允许在所有 系统包括真核生物系统中使用本发明的突变SUMO蛋白或附着于突 变SUMO蛋白氨基端的亲和标签来用于亲和纯化融合蛋白。在此提供 的工程SUMO蛋白酶在体外或体内都可有效地除去该标签。
第二，许多蛋白在真核和原核细胞中不稳定或弱表达。与未融合 的蛋白对应物比较(例如见图3A)，甚至与融合于野生型SUMO的蛋 白比较(例如见实施例4)，与工程SUMO蛋白融合可使蛋白表达明显 升高。另外，如下文所述，与工程SUMO蛋白融合可以有利于所关心 的蛋白相对于未融合的蛋白或甚至与野生型SUMO融合的蛋白更高 水平地分泌。附着SUMOP分子到所关心的蛋白也可以使蛋白稳定。
第三，某些蛋白对细胞来说有毒性，特别是在异源表达时。附着 SUMO到这些毒性蛋白可以降低或除去该蛋白的毒性并允许更大地 和持续地表达以前难于表达的毒性蛋白。例如，在蛋白的氨基未端存 在SUMO分子可以抑制定位于该蛋白区域的该蛋白的任何毒性。实际 上，如下文实施例4所示，当与工程SUMO融合时，蛋白PLA2，其 对细胞是有毒/致死的并且需要游离的N未端以表现活性，可以在真 核细胞中高水平表达。在表达和纯化时，SUMO分子可从有毒蛋白上 切割下来，从而回复其毒性和/或活性。
第四，在原核细胞中表达的各种融合物可以在体外或体内被切割 而产生新的N未端，这是至今不能产生的，因为自然开始的蛋白质合 成只能从甲硫氨酸开始。该系统的这个特征对于那些需要特殊N末端 来维持生理和生化活性的蛋白(例如RNA-聚合酶，蛋白酶和细胞因子) 是特别有用的。
I.定义
提供以下定义以利于对本发明的理解：
在此使用的“核酸”或“核酸分子”指任何DNA或RNA分子，包括 单链或双链，如果是单链，其互补序列分子可以是线型或环型。在讨 论核酸分子时，在此可能根据从5′至3′方向提供序列的正常习惯描述 特定核酸分子的序列或结构。关于本发明的核酸，有时使用术语″分 离的核酸″。该术语当用于DNA时，指与在它来源生物的天然存在基 因组中与之直接相邻的序列分离的DNA分子。例如，“分离的核酸” 可以包括插入载体，比如质粒或病毒载体，或整合进入原核或真核细 胞或宿主生物体的基因组DNA中的DNA分子。
当应用于RNA，术语“分离的核酸”可以指由上文定义的分离的 DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语也可以指已经充分地与其 它核酸分离的RNA分子，所述其它核酸是所述RNA分子在它的自然 状态下(细胞或组织中)与其联合在一起的。分离的核酸(无论DNA或 RNA)可以进一步代表直接用生物学或合成方法生产并与其它在它的 生产过程中出现的组分分离的分子。
关于单链核酸，特别是寡核苷酸，术语“特异杂交”指两条具有充 分互补序列的单链核苷酸分子之间的结合，这种充分互补序列允许在 本领域常规使用的预定条件下实现杂交(有时又叫做“基本互补”)。特 别地，该术语指寡核苷酸与包含在本发明单链DNA分子中的基本互 补序列之间的杂交，以基本排除该寡核苷酸与非互补序列的单链核酸 的杂交。能进行不同互补性单链核酸分子特异杂交的适当条件为本领 域人员所熟知。
例如，一种计算具有特定序列同源性的核酸分子之间杂交所需的 严格条件的通用方程式列在下面(Sambrook等，1989)：
Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/双链体中的#bp
如以上方程式所述，使用[Na+]＝[0.368]和50％甲酰胺，42％GC 含量以及平均探针大小200碱基，Tm是57℃。同源性每减少1％， DNA双链体的Tm降低1-1.5℃。因此，使用42℃杂交温度时具有大 于约75％序列同一性的靶标将被观察到。例如，按照Sambrook等的 方法，使用含5 X SSC，5 X Denhardt’s试剂，1.0％SDS，100μg/ml 变性的鲑精DNA片段，0.05％焦磷酸钠和最高至50％甲酰胺的杂交液 可以完成杂交。杂交在37-42℃下进行至少6小时。杂交后，按以下 步骤洗涤滤器：(1)室温下，在2 X SSC和1％SDS中5分钟；(2)室温下， 在2 X SSC和0.1％SDS中15分钟；(3)37℃下，在1 X SSC和1％SDS 中30分钟-1小时；(4)42-65℃下，在1XSSC和1％SDS中2小时， 每30分钟更换溶液。
杂交和洗涤的严格性主要依赖于溶液的盐浓度和温度。通常为了 使探针与它的靶标退火率最大，杂交通常在盐和低于计算的杂合体 Tm值20-25℃的温度条件下进行。洗涤条件应该尽可能严格以达到 探针对靶标的同一性程度。通常，洗涤条件选择低于杂合体Tm值大 约12-20℃。至于本发明的核酸，中度严格性的杂交被确定为在 6XSSC，5XDenhardt’s溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中 42℃杂交并在2XSSC和0.5％SDS，55℃洗涤15分钟。高严格性的 杂交被确定为在6XSSC，5X Denhardt’s溶液，0.5％SDS和100μg/ml 变性鲑精DNA中42℃杂交并在1X SSC和0.5％SDS中65℃洗涤15 分钟。很高严格性的杂交被确定为在6X SSC，5XDenhardt’s溶液， 0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中42℃杂交并在0.1XSSC和 0.5％SDS中于65℃洗涤15分钟。
在此使用的术语“探针”指寡核苷酸、多核苷酸或DNA分子，不 论是天然存在的，如用纯化的限制性酶消化获得，或人工生产的，这 种探针能和与之序列互补的核酸退火或特异杂交。探针可以是单链也 可以是双链。探针的准确长度将依赖许多因素，包括温度、探针的来 源和使用的方法。例如，虽然核苷酸探针可以包含更少的核苷酸，但 对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸探针一般包含15-25 或更多的核苷酸。在此选取的探针是为了与特定靶核酸序列的不同链 互补。意思是探针必须有充分的互补性以致于能在一套预先确定的条 件下“特异地杂交”它们相应的靶链或与它们相应的靶链退火。因此探 针序列无须反映靶的准确互补序列。例如非互补的核苷酸片段可以连 于探针的5’或3’末端，而探针序列的其余部分是与靶链互补的。或者， 假如探针序列与靶核酸序列有足够的互补性以至于能与之特异性地 退火，非互补碱基或更长的序列可以散布于探针中。
在此使用的术语“引物”指DNA寡核苷酸，单链或者双链，来源 于生物系统，用限制性酶消化产生，或人工生产，当引物被置于合适 的情况中时，能作为模板依赖的核酸合成作用的功能性启动物。当与 适当的核酸模板，适当的核酸的三磷酸核苷前体、聚合酶、适当的辅 因子和条件如适当的温度和pH值共存时，引物可以通过聚合酶或类 似活性的作用下在它的3’未端加上核苷酸而延伸以得到引物延伸产 物。根据本申请的特定条件和要求，引物可以有不同的长度。例如， 在诊断应用中，寡核苷酸引物长度一般为15-25或更多的核苷酸。引 物必须与期望模板有足够的互补性以启动期望延伸产物的合成，亦即 能与期望模板链以足以在适当的毗邻位置提供引物的3’羟基部分的 方式退火，以用于通过聚合酶或类似酶的合成的启动。并不需要引物 序列为期望模板的准确互补序列。例如，非互补的核苷酸序列可以连 接于其他方面互补的引物的5’末端。或者，假如引物序列与期望模板 链序列具有足够的互补性以能功能性地提供用于合成延伸产物的模 板-引物复合物，非-互补碱基可以散布于寡核苷酸引物序列之中。
“互补DNA(cDNA)”是单链DNA分子，通过逆转录酶从mRNA 模板形成。一般来说，用与mRNA的部分互补的引物来启动逆转录。 术语“cDNA”也可以指双链DNA分子，其由这种单链DNA分子和它 的互补DNA链组成。术语“cDNA”也可以指从RNA模板合成的 cDNA分子的克隆。
聚合酶链式反应(PCR)在美国专利Nos：4683195，4800195和 4965188中已有描述，它们全文通过援引并入本文。
术语“相似性百分比”、“同一性百分比”和“同源性百分比”当指特 定序列时，按威斯康星大学GCG软件程序的阐述进行使用。
在此使用的术语“功能性的”意思是核酸或氨基酸序列对于所述的 检验或目的是功能性的。
核酸特定序列的“天然等位变异体”，“突变体”和“衍生体”指与特 定序列紧密相关的核酸序列但可能在序列或结构中具有天然地或人 为设计的变化。通过紧密相关，表示至少大约75％，但通常超过90％ 的序列的核苷酸与用特定SEQ ID NO指代的核酸序列的限定长度相 匹配。紧密相关核酸序列之间的核苷酸序列变化或差异可代表在特定 核酸序列天然的正常复制(replication)或倍增(duplication)过程中 出现的序列中的核苷酸改变。其它的变化可以被特异设计并为了达到 特定的目的引入序列，以致在核酸的调控区域改变氨基酸密码子或序 列。这种特异改变可以在体外用多种的突变技术产生或者将宿主生物 体放在诱导或选择该变化的特定选择条件下而产生。这种特异产生的 序列变异体可以被称为原始序列的“突变体”或“衍生体”。
短语“基本由......组成”当指特定核苷酸或氨基酸时，意思是具有 指定SEQ ID NO性质的序列。当用于指氨基酸序列时，该短语包括序 列本身和分子修饰，这种分子修饰不会影响该序列基本的和新的特 征。
在此使用的术语“复数的启动子”或“启动子”指DNA序列，这种 DNA序列的位置邻接于编码重组产物的DNA序列。启动子优选可操 作地连接于相邻的DNA序列。与没有启动子存在时表达的重组产物 的量相比，启动子一般能增加DNA序列表达的重组产物的量。来自 生物体的启动子可被用于增加来源于另一种生物体的DNA序列的重 组产物表达。例如，脊椎动物启动子可以用于水母GFP在脊椎动物中 的表达。此外，对于多重串接的DNA序列，启动子元件可提高重组 表达产物的量。因此，启动子元件可增强一种或更多种重组产物的表 达。多种启动子元件已为本领域普通的技术人员所熟知。
在此使用的术语“复数的增强子”或“增强子”指DNA序列，该DNA 序列的位置与编码重组产物的DNA序列毗连。增强子元件一般定位 于启动子元件的上游或定位于编码DNA序列的下游或之内(例如，转 录或翻译成为重组产物的DNA序列)。因此，增强子元件可位于编码 重组产物DNA序列上游或下游100碱基对、200碱基对或300或更多 碱基对处。增强子元件可将从DNA序列表达的重组产物量升高到超 过启动子元件带来的升高的表达。本领域普通技术人员可容易地利用 多种增强子元件。
在此使用的术语“转染的”和“转染”是指将外源性DNA导入细胞 的方法。这些方法涉及多种技术，如用高浓度盐、电场、脂质体、多 聚阳离子微团或去污剂处理细胞，以使得宿主细胞外膜或壁对于所关 心的核酸分子是可渗透的。这些特定方法并不受限制，并且本发明涉 及本领域普通技术人员熟知的任何转化技术。
“复制子”是指任何遗传元件，例如，质粒、粘粒、杆粒、噬菌体 或病毒，其能在自身控制下大量复制。复制子可以是RNA或DNA， 可以是单链或双链。
“载体”是复制子，如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒，另外的 基因序列或元件(DNA或RNA)可以连接于载体上，而使连接序列或 元件得到复制。
“表达操纵子”指核酸片段，该核酸片段可能具有转录和翻译控制 序列，如启动子、增强子、翻译起始信号(例如ATG或AUG密码子)、 聚腺苷酸化信号、终止子等等，这些表达操纵子有利于多肽编码序列 在宿主细胞或生物体中的表达。
在此使用的术语“寡核苷酸”指本发明中的序列、引物和探针，并 定义为由两个或更多核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成，优选超过三 个。寡核苷酸的确切大小将取决于多种因素以及寡核苷酸的特定应用 和用途。
术语“基本纯”指包括按重量计算至少50-60％给定物质的制剂(例 如，核酸、寡核苷酸、蛋白等等)。更优选地，该制剂包括至少75％ 以及最优选90-95％比重的给定化合物。纯度用适合于给定化合物的方 法进行测定(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析 等等)。
术语“基因”指包括编码多肽的开放阅读框的核酸，包括外显子以 及(任选)内含子序列。该核酸也可任选包括非编码序列如启动子或增 强子序列。术语″内含子″指存在于给定基因的DNA序列，该序列不 会被翻译成蛋白并通常的发现在外显子之间。
在此使用的短语“可操作连接的”，可以指与另一段核酸序列形成 功能关系的核酸序列。可操作连接的核酸序列实例包括，但不局限于， 启动子、切割位点、纯化标签、转录终止子、增强子或活化子以及异 源基因，当转录并如果适合的话翻译时，其可生产功能性产物如蛋白、 核糖酶或RNA分子。短语“可操作连接的”也可以指例如编码所关心 的蛋白的核酸序列，这种核酸序列与编码Ubl羧基末端结构域的核酸 形成功能关系，这样在蛋白质形成中Ubl羧基末端结构域的催化切割 活性能使所关心的蛋白释放出来。
短语“固体支持物”指任何固体表面包括，但不局限，任何芯片(例 如基于硅石的、玻璃的或金的芯片)、玻片、膜、珠、固体颗粒(例如 琼脂糖、sepharose、聚苯乙烯或磁珠)、柱子(或柱材料)、试管或微量 滴定盘。
短语“亲和标签”、“纯化标签”以及“表位标签”都可以指可用于影 响所关心的蛋白纯化的标签。纯化/亲合/表位标签为该领域人员所熟 知(见Sambrook等，2001，分子克隆，冷泉港实验室)，包括但不局限 于：多组氨酸标签(例如6xHis)、多精氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、S标签、流感病毒HA标签、硫氧还 蛋白、葡萄球菌蛋白A标签、FLAGTM表位，AviTag表位(用于随后 的生物素化)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、抗体表位(例如被抗体识别并 结合的氨基酸序列)、C-myc表位以及血红素结合肽。
在此使用的术语“有毒蛋白”指在宿主细胞中表达时引起细胞死亡 或抑制细胞生长的蛋白。
在此使用的“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何表达介质， 指导材料可用于传达本发明组合物用于实施本发明的方法的有用性。 例如，本发明试剂盒的指导材料可附加于包含本发明试剂盒的容器上 以便与包含试剂盒的容器一起运输。或者，为了指导材料与试剂盒可 为使用者协作使用，指导材料可与容器分开运输。
在此使用的术语“修饰的”“工程的”或“突变的”指改变的多核苷酸 或氨基酸序列。在一种实施方案中，编码SUMO或SUMO蛋白酶的 多核苷酸序列通过导入一个或更多个突变，特别是位点定向突变，而 被修饰/工程化/突变。另外，包括至少一个突变的突变多聚核苷酸库 也可以利用随机诱变或DNA改组(shuffling)技术来制备。在一种特 定实施方案中，随机诱变被限制于多核苷酸的期望区域，特别是被认 为是编码负责SUMO和SUMO蛋白酶相互作用的氨基酸的区域。常 规的诱变技术在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.等 eds.，John Wiley(2006)和美国专利5605793；5811238；5830721； 5834252和5837458中进行了描述。在此使用的“突变”或“改变”指与 天然存在或正常核苷酸或氨基酸序列相比，在基因的核苷酸或氨基酸 序列中的变化。突变可以是由于至少一个核苷酸或氨基酸的缺失、插 入或取代引起。在一种优选实施方案中，突变是取代，即用不同的核 苷酸或氨基酸残基替代至少一个核苷酸或氨基酸。
在此使用的术语“结构域”意思是蛋白或多肽的功能部分、节段或 区域。“相互作用结构域”专门指蛋白、多肽或蛋白片段的部分、节段 或区域，它是造成该蛋白、蛋白片段或分离的结构域对于另一种蛋白、 蛋白片段或分离的结构域的物理亲合力的原因。在蛋白的一级序列 中，相互作用结构域可以是连续的氨基酸残基，也可以由在一级序列 互相不接近，但是会通过肽链三级折叠聚在一起的肽链部分的氨基酸 残基组成。
在此使用的术语“多克隆位点”或“多接头”指人为生成的核苷酸序 列，该核苷酸序列包括至少一个限制性位点以将核酸片段克隆入另一 核酸，如载体之中。
II.工程SUMO蛋白
本发明包括了不能被SUMO蛋白酶(例如Ulp 1)切割的SUMO蛋 白。该SUMO可来自于任何真核生物物种或为任何SUMO分子的突 变形式。在一种特定实施方案中，SUMO来源于酵母或人。与酵母相 对，在脊椎动物中，迄今已描述了SUMO的四个成员：SUMO-1和接 近的同系物SUMO-2、SUMO-3和SUMO-4。本发明包括了所有的这 些脊椎动物SUMO蛋白。SUMO蛋白的实施例在图11A-11C中提供。 编码人SUMO蛋白的核酸序列的实施例也在GenBank登录号NM_ 003352.4(SUMO1)、NM_001005781.1(SUMO1)、NM_001005782.1 (SUMO1)、NM_006937.3(SUMO2)、NM_001005849.1(SUMO2)、 NM_006936.2(SUMO3)和NM_001002255.1(SUMO4)中提供。
在一种特定实施方案中，本发明的工程SUMO蛋白仅能被SUMO 蛋白酶切割小于10％，而该酶在相同的的反应条件(例如标准体外切割 实验或在真核细胞中表达)下可切割至少90％，优选至少95％，更优 选至少99％以及更优选100％的野生型SUMO。在一种更优选实施方 案中，工程SUMO会被切割小于5％，优选小于1％，更优选小于0.1％， 甚至0％或低于检测水平。如下文所讨论，工程SUMO蛋白可以被工 程SUMO蛋白酶切割。
工程SUMO蛋白可以通过改变或转变至少一个与SUMO蛋白酶 相互接触或互相作用的残基而产生。该残基可以被改变为任何其它的 20种天然氨基酸或改变为合成或修饰的氨基酸(参见例如MPEP §2422表4)。该变化可以为保守的或非保守的。保守的变化是用拥 有类似性质的氨基酸替代。例如天冬氨酸和谷氨酸都是酸性氨基酸； 赖氨酸、精氨酸和组氨酸是碱性氨基酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨 酸、苏氨酸和酪氨酸具有无电荷的极性侧链；丙氨酸、甘氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半 胱氨酸具有无极性的侧链；丙氨酸、甘氨酸和亮氨酸是小氨基酸；苯 丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有大的芳香族侧链；苯丙氨酸、酪氨酸、 色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸基和苏氨酸具有大的无电荷侧链。因此， 用谷氨酸替代天冬氨酸可以被认为是保守的变化，用组氨酸替代天冬 氨酸则不能认为是保守改变。
在一种特定实施方案中，造成的改变在与SUMO蛋白酶互相作用 的区域之内。如图11所示，与SUMO蛋白酶相互作用的SUMO区域 通常在从大约残基53到大约残基72的区域之内。例如对于酵母 SUMO(Smt3)该区域为从大约残基63到残基72。在一种特定实施方案 中，改变至少一个精氨酸残基，优选两个精氨酸残基(或更多，如果有 的话)(例如在Smt 3中，在SUMO蛋白酶相互作用结构域中的精氨 酸残基位于64和71位)。在一种优选实施方案中，精氨酸残基被改 变为非碱性氨基酸。在一种特定实施方案中，在64位的精氨酸被改 变为苏氨酸以及在7 1位的精氨酸被改变为谷氨酸。该构建体是 SUMO*，具有以下的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：
Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro
1 5 10 15
Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser
20 25 30
Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu
35 40 45
Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr
50 55 60
Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp
65 70 75 80
Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile
85 90 95
Gly Gly
在另一个实施方案中，本发明的工程SUMO与SEQ ID NO：1具 有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性， 特别是至少90％或95％同源性。在一种特定实施方案中，64和71位 的残基都不是精氨酸。
在另一个实施方案中，本发明的工程SUMO是SUMO蛋白(例如 酵母SUMO(Smt 3)或人SUMO1)，这种蛋白被改变以包括序列(SUMO 蛋白酶相互作用结构域)：
X1FX2X3X4GX5X6 (SEQ ID NO：2)
其中X1和X6是除了精氨酸的任何氨基酸，X2、X3、X4和X5是任何 氨基酸并可以是野生型(即未突变的)。在一种特定实施方案中，X1 和X6是任何非碱性氨基酸。在一种优选实施方案中，X2是L或R； X3是F、W或Y，X4是D或E；X5是I、Q或R。在一种特定实施方 案中，X1是在谷氨酰胺、苏氨酸和苯丙氨酸之中选择，和/或X6是在 71位的亮氨基酸和谷氨酸之中选择。
在另一个实施方案中，本发明的工程SUMO是SUMO蛋白(例如 人SUMO2，SUMO3和SUMO4)，这种蛋白被改变以包括序列(SUMO 蛋白酶相互作用结构域)：
X1FX2F (SEQ ID NO：65)
其中X1和X2是除了精氨酸的任何氨基酸。在一种特定实施方案中， X1和X2是任何非-碱性氨基酸。在一种特别的实施方案中，X1是具 有无电荷侧链的氨基酸，特别是苏氨酸，X2是酸性氨基酸，特别是谷 氨酸。
优选地，工程SUMO蛋白保留了至少一种野生型SUMO的性质。 例如，优选地该工程SUMO与野生型SUMO一样或更好地增加融合 的所关心的蛋白的表达量。该工程SUMO也可以提高所关心的蛋白的 分泌和/或溶解性，和/或改变融合的所关心的蛋白的细胞定位。
本发明也包括了编码不能被切割的SUMO蛋白的核酸分子。编码 本发明工程SUMO的核酸分子可以通过任何该领域已知的方法制备。 该核酸分子可以在任何方便的载体中保存，特别是表达载体。根据表 达核酸的宿主细胞，可应用不同的启动子以驱动该核酸序列的表达。 这些载体也包含抗生素抗性标识物以能够选择转化细胞。本发明编码 工程SUMO的核酸分子包括cDNA、DNA、RNA和其片段，这些分 子可以是单链或双链。本发明也包括引物、寡核苷酸、探针、反义分 子和siRNA分子，其定向于(directed to)编码工程SUMO蛋白的核酸 分子或与之杂交，优选定向于从野生型序列突变的区域，这样相对于 野生型SUMO它们能优先或排他地与突变SUMO杂交。
本发明也包含能够免疫特异地结合工程SUMO蛋白的抗体。定向 于工程SUMO的多克隆和单克隆抗体可以按照标准方法制备。在一种 优选实施方案中，相对于野生型SUMO，该抗体与突变的不可切割的 SUMO的改变区域进行免疫特异性地反应。与突变的不可切割的 SUMO蛋白进行免疫特异性作用的多克隆或单克隆抗体能被应用于 鉴定和纯化这些蛋白。抗体可以是对工程SUMO具有免疫特异性而排 除了野生型SUMO或者可以具有对两者的交叉反应性。
本发明的工程SUMO蛋白也可以被翻译后修饰。工程SUMO蛋 白可以在细胞中或体外进行翻译后修饰。氨基酸的翻译后修饰(PTM) 可改变蛋白的结构、活性、功能和稳定性。PTMs通常包括添加生化 官能团如，但不局限于，乙酸酯、磷酸酯、脂类和糖类到蛋白的氨基 酸上。蛋白的翻译后修饰方法可以通过变更蛋白氨基酸序列而改变。 例如变更蛋白的氨基酸序列而使之含有Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列 可以使天冬酰胺被糖基化。
PTMs包括，但不局限于，乙酰化(添加乙酰基，通常在蛋白的N 末端)、烷化(添加烷基(例如甲基、乙基))、甲基化(添加甲基，通常加 在赖氨酸或精氨酸残基上)、生物素化(保守的赖氨酸残基与生物素附 加物的酰化)、谷氨酰化(共价连接谷氨酸残基到微管蛋白或其它蛋 白)、甘氨酰化(共价连接至少一个甘氨酸残基到微管蛋白C末端的尾 部)，糖基化(添加糖基基团至天冬酰胺、羟基赖氨酸、丝氨酸或苏氨 酸上，从而产生糖蛋白)、异戊二烯化(添加类异戊二烯基团(例如金合 欢醇和牻牛儿基牻牛儿醇(geranylgeraniol)))、脂化(添加脂类)、 硫辛酰化(lipoylation)(连接硫辛酸酯(lipoate)官能团)、磷酸泛 酰巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)(添加源于辅酶A的4′-磷酸 泛酰巯基乙胺(phosphopantetheinyl)部分，如在脂肪酸、聚酮化合物、 非核醣体多肽和亮氨基酸生物合成中)、磷酸化(添加磷酸酯基，通常 到丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸上)，硫酸化(添加硫酸酯基到酪 氨酸)、硒酸化和C末端酰胺化。翻译后修饰为本领域技术人员所熟 知(见例如Creighton，T.E.，蛋白-结构和分子性质.第二版，W.H. Freeman和Company，纽约，1993；Wold，F.，蛋白的翻译后共价修 饰，Academic Press，纽约.1983；Seifter等，“蛋白质修饰和非蛋白质 辅因子的分析”(1990)Meth.Enymol.，182：626-646；以及Rattan等“蛋 白质合成：翻译后修饰和老化”(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.，663：48-62)。
本发明的工程SUMO蛋白可以包括至少一个亲和标签，优选在氨 基未端。在一个特定实施方案中，亲和标签是血红素结合肽。全长细 胞色素C(CYC7，Gen Bank登录号AAA34940)一旦与血红素辅因子结 合就具有过氧化物酶活性(Sander C.C型细胞色素的转运和成熟。Ph.D. 学位论文。2001.Osnabrueck大学，德国)。包含细胞色素C，如CYC7， 的血红素结合基序的肽可作为本发明工程SUMO蛋白或任何所关心 的蛋白的亲和标签。示范性的血红素结合肽包括血红素结合基序 CQQCH(SEQ ID NO：63)。血红素结合肽的特定实施例是 GSAKKGATLFKTRCQQCH(SEQ ID NO：64)。血红素结合肽可以为大 约5至大约50个氨基酸的长度，优选大约5至大约25个氨基酸长度， 更优选大约5至大约20个氨基酸长度，以及更优选大约5至大约15 个氨基酸。血红素结合肽具有过氧化物酶活性。值得注意的是，将该 肽进行变性SDS-PAGE分析以及印迹到膜时，其活性不会被破坏。因 此，该亲和标签可以不用抗体检测而仅使用过氧化物酶底物。另外， 血红素结合肽引起共价结合的所关心的蛋白变红，使之在纯化过程中 容易检测和跟踪。血红素结合肽对于细胞色素裂解酶(CYC3，例如， GenBank登录号AAC 04992.1)具有很高的结合亲合力。CYC3可以固 定在固体表面并用作纯化包含血红素结合肽的蛋白的亲合树脂。
III工程SUMO蛋白酶
本发明也包含工程SUMO蛋白酶，该蛋白酶可切割不能被野生型 SUMO蛋白酶切割的工程SUMO蛋白。SUMO蛋白酶可来自于任何 真核生物物种。在一种特定实施方案中，SUMO蛋白酶与期望被切割 的工程SUMO来自相同的物种。SUMO蛋白酶的实例包括ULP 1和 SENP1至5以及图12A-12B中提供的某些氨基酸序列。
在一种特定实施方案中，本发明的工程SUMO蛋白酶可切割至少 50％，优选至少75％，90％，或95％，更优选至少99％以及更优选100％ 的工程SUMO。
工程SUMO蛋白酶可以通过变更或转变至少一个与野生型 SUMO或工程SUMO接触或互相作用的残基而产生。该残基可以被改 变至任何另外的20个天然氨基酸或改变为合成或修饰的氨基酸。该 变化可以是保守的或非保守的。
在一种特定实施方案中，是在SUMO蛋白酶的SUMO相互作用 结构域之内进行改变(参见例如图12)。例如，酵母ULP1的SUMO相 互作用结构域大约对应于残基446至460，更优选大约451至455。 在一种特定实施方案中，残基451、452以及455中的至少一个被改 变。优选地，至少残基451和455被改变，更优选所有的三个氨基酸 都被改变。特别地，451位天冬氨酸被改变为丝氨酸，452位的苏氨 酸残基被改变成甘氨酸以及455位的谷氨酸残基被改变为丝氨酸。该 构建体具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：
1 MSVEVDKHRN TLQYHKKNPY SPLFSPISTY RCYPRVLNNP SESRRSASFS GIYKKRTNTS
61 RFNYLNDRRV LSMEESMKDG SDRASKAGFI GGIRETLWNS GKYLWHTFVK NEPRNFDGSE
121 VEASGNSDVE SRSSGSRSSD VPYGLRENYS SDTRKHKFDT STWALPNKRR RIESEGVGTP
181 STSPISSLAS QKSNCDSDNS ITFSRDPFGW NKWKTSAIGS NSENNTSDQK NSYDRRQYGT
241 AFIRKKKVAK QNINNTKLVS RAQSEEVTYL RQIFNGEYKV PKILKEERER QLKLMDMDKE
301 KDTGLKKSII DLTEKIKTIL IENNKNRLQT RNENDDDLVF VKEKKISSLE RKHKDYLNQK
361 LKFDRSILEF EKDFKRYNEI LNERKKIQED LKKKKEQLAK KKLVPELNEK DDDQVQKALA
421 SRENTQLMNR DNIEITVRDF KTLAPRRWLN SGIISFFMKY IEKSTPNTVA FNSFFYTNLS
481 ERGYQGVRRW MKRKKTQIDK LDKIFTPINL NQSHWALGII DLKKKTIGYV DSLSNGPNAM
541 SFAILTDLQK YVMEESKHTI GEDFDLIHLD CPQQPNGYDC GIYVCMNTLY GSADAPLDFD
601 YKDAIRMRRF IAHLILTDAL K
在一种特定实施方案中，SUMO蛋白酶可能具有氨基未端或在其之内 的缺失(例如，最多至并包括残基402)。截短的SUMO蛋白酶的氨基 酸序列例子是(SEQ ID NO：4)：
401 MGLVPELNEK DDDQVQKALA
421 SRENTQLMNR DNIEITVRDF KTLAPRRWLN SGIISFFMKY IEKSTPNTVA FNSFFYTNLS
481 ERGYQGVRRW MKRKKTQIDK LDKIFTPINL NQSHWALGII DLKKKTIGYV DSLSNGPNAM
541 SFAILTDLQK YVMEESKHTI GEDFDLIHLD CPQQPNGYDC GIYVCMNTLY GSADAPLDFD
601 YKDAIRMRRF IAHLILTDAL K
SUMO*蛋白酶1是具有6x组氨酸标签的截短的SUMO蛋白酶，具有 氨基酸序列(SEQ ID NO：5)：
401 MGLVPELNEK DDDQVQKALA
421 SRENTQLMNR DNIEITVRDF KTLAPRRWLN SGIISFFMKY IEKSTPNTVA FNSFFYTNLS
481 ERGYQGVRRW MKRKKTQIDK LDKIFTPINL NQSHWALGII DLKKKTIGYV DSLSNGPNAM
541 SFAILTDLQK YVMEESKHTI GEDFDLIHLD CPQQPNGYDC GIYVCMNTLY GSADAPLDFD
601 YKDAIRMRRF IAHLILTDAL KLEHHHHHH
在另一个实施方案中，本发明的工程SUMO蛋白酶与SEQ ID NO：3、4或5具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或 100％的同源性，特别至少有90％或95％的同源性。在一种特定实施 方案中，451位的残基不是天冬氨酸，更优选不是酸性氨基酸；455 位的残基不是谷氨酸，更优选不是酸性氨基酸；并且任选地，452位 的残基不是苏氨酸。
在另一个实施方案中，本发明的工程SUMO蛋白酶是已经被工程 化而包括以下序列的SUMO蛋白酶：
WLNX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：6)
其中X1和X5是任何非酸性氨基酸，X2、X3和X4被任何氨基酸并可 以是野生型(即未突变的)。在一种特定实施方案中，X1是无电荷的 极性侧链氨基酸、非极性侧链氨基酸或小氨基酸。X5可以是无电荷极 性侧链氨基酸、非极性侧链氨基酸或小氨基酸。在另一个实施方案中， X3是I或V，X4是I或T。在一种特定实施方案中，X1是丝氨酸；X2 选自甘氨酸和苏氨酸；和/或X5从丝氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸中选择。
本发明也包括了编码工程SUMO蛋白酶的核酸分子。编码本发明 工程SUMO蛋白酶的核酸分子可以通过任何该领域已知的方法制备。 该核酸分子可以在任何方便的载体中保存，特别是表达载体。根据表 达核酸的宿主细胞，可应用不同的启动子以驱动该核酸序列的表达。 这些载体中也包含抗生素抗性标识物以能够选择转化细胞。本发明编 码工程SUMO蛋白酶的核酸分子包括cDNA、DNA、RNA和其片段， 这些核酸可以是单链或双链的。本发明也包括定向于编码工程SUMO 蛋白酶的核酸分子或与之杂交的引物、寡核苷酸、探针、反义分子和 siRNA分子，优选定向于从野生型序列突变的区域，这样该核酸分子 与野生型SUMO蛋白酶相比优先或排他地结合工程SUMO蛋白酶。
本发明也包含能够免疫特异结合工程SUMO蛋白酶的抗体。定向 于工程SUMO蛋白酶的多克隆和单克隆抗体可以按照标准方法制备。 在一种优选实施方案中，相对于野生型SUMO蛋白酶，该抗体能与工 程SUMO蛋白酶的改变区域进行免疫特异性反应。能与工程SUMO 蛋白酶进行免疫特异性反应的多克隆或单克隆抗体能被应用于鉴定 和纯化这些蛋白。抗体可以是对工程SUMO蛋白酶具有免疫特异性而 排除了野生型SUMO蛋白酶或者可以对两者都具有交叉反应性。
本发明的工程SUMO蛋白酶也可以被如上文所述的翻译后修饰。 工程SUMO蛋白酶可以在细胞内或体外进行翻译后修饰。
本发明的工程SUMO蛋白酶可以包括至少一个亲和标签，优选在 氨基末端。在一种特定方案中，亲和标签是血红素结合肽，如上文描 述。
IV.使用方法.
本发明的融合蛋白工艺在蛋白和肽的生产和纯化上有若干应用。 使用该工艺的示例方法包括但不局限于：
(1)通过将C-末端融合至工程SUMO蛋白以增强蛋白和肽(所关 心的蛋白)的表达，特别是那些弱表达的蛋白和肽。无论在原核生物(例 如大肠杆菌；参见图2)或真核细胞(酵母和昆虫细胞；参见图3)中， SUMO-融合蛋白结构在表达过程中不会被切割，除非工程SUMO蛋 白酶也被转化进入该细胞。作为例子的所关心的蛋白包括，但不局限 于多聚蛋白、细胞因子、疫苗、酶、生长因子、受体、干扰素、造血 剂(hematopoeitic agents)、白蛋白、胰岛素和激素。
(2)工程SUMO蛋白可与亲和标签融合。优选地，亲和标签置于 工程SUMO的氨基末端而所关心的蛋白加至工程SUMO蛋白的羧基 末端。亲和标签允许融合蛋白的纯化，再通过用本发明的工程SUMO 蛋白酶切割该工程SUMO而获得所关心的蛋白。
(3)该工程SUMO可用于纯化所关心的蛋白，即，没有亲和标签。 工程SUMO可连接于所关心的蛋白的N末端。融合蛋白被表达后可 通过特异结合工程SUMO的试剂，如免疫特异性抗体加以纯化。然后 所关心的蛋白可用本发明的工程SUMO蛋白酶而从融合蛋白中切割 出来。
(4)工程SUMO蛋白酶可以用于在体外切割包含工程SUMO的融 合蛋白。例如，当融合蛋白通过与SUMO或亲和标签(如果有的话) 的相互作用而被结合到固体支持物上时，切割可以在溶液中发生。
(5)可通过用带有特异结合工程SUMO和/或SUMO蛋白酶的试 剂，如免疫特异性抗体的固体支持物与反应混合物接触而将工程 SUMO和SUMO蛋白酶从含工程SUMO的融合蛋白的切割后混合物， 其还可能含有亲和标签，中除去。
(6)带亲合标签的工程SUMO和带亲合标签的工程SUMO蛋白酶 可通过用带有亲和配体的固体支持物与反应混合物接触而从切割后 的混合物中除去(例如带六个组氨酸标签的工程SUMO或SUMO蛋白 酶可使用金属螯合亲和层析除去)。
(7)本发明可产生在氨基末端带有任何氨基酸的所关心的蛋白。 例如，可以产生所关心的蛋白连接至工程SUMO的羧基末端的融合蛋 白。编码所关心的蛋白氨基末端残基的密码子可通过定向诱变加以变 更以编码期望氨基酸或产生包括超过一种的突变密码子编码的氨基 酸的库。在连接至工程SUMO的前后都可诱变。在融合蛋白，任选包 含亲和标签，表达之后，可在体内或体外使用工程SUMO蛋白酶来从 融合蛋白上切割工程SUMO而释出具有改变的氨基末端的所关心的 蛋白。
(8)包括工程SUMO的融合蛋白可在原核和/或真核细胞中表达 以产生肽文库。
(9)包含连接至所关心的蛋白和任选亲和标签的工程SUMO的融 合蛋白可以在原核和/或真核细胞中表达以产生肽文库。表达蛋白库可 通过工程SUMO或亲和标签得以纯化。任选地，工程SUMO和亲和 标签(如果有)可以用工程SUMO蛋白酶从融合蛋白上切割下，以通 过将库与切割下的标签相分离以产生纯蛋白或肽库。
(10)可以制备包括工程SUMO和任选亲和标签的融合蛋白cDNA 文库。这些cDNA文库可以用于在任何宿主中表达融合蛋白。
(11)包括工程SUMO和任选亲和标签的表达的融合蛋白也可以 固定于固体支持物上。在一种特定实施方案中，融合蛋白包括了所关 心的蛋白库并在固体支持物上排成阵列。融合蛋白可以通过SUMO标 签或亲和标签而固定至固体支持物上。产生的阵列可以用于，例如检 测和/或定量蛋白与固定的所关心的蛋白质的相互作用。
V试剂盒
本发明也包括用于增强所关心的蛋白的表达、分泌、纯化、定位 和氨基末端变更的试剂盒。这些试剂盒包括至少一种重组载体，该重 组载体包含编码工程SUMO的核酸序列，这段核酸序列可操作地连接 适于在期望宿主细胞中表达的启动子以及适合克隆与编码工程 SUMO核酸序列符合读框的编码所关心的蛋白的核酸的多克隆位点。 启动子优选强启动子并可以是构成型的或调节的。这种启动子为本领 域人员所熟知，包括但不局限于CMV、RSV、SV40、ADH1、T7和 CUP1启动子。
重组载体也可以包含与编码工程SUMO的序列符合读框的编码 至少一种亲和标签的核酸序列。优选地，编码亲和标签的核酸序列是 可操作地连接于编码工程SUMO的序列的5’末端。试剂包括但不限 于至少一种固体支持物(例如，能够结合至少一种亲和标签的固体支持 物)，裂解缓冲剂、洗涤缓冲剂和洗脱缓冲剂也可以包括在试剂盒中 以辅助表达的融合蛋白的纯化。
试剂盒可以进一步包括至少一种工程SUMO蛋白酶，用于切割工 程SUMO。该工程SUMO蛋白酶可以按编码该工程SUMO的核酸分 子(例如表达载体)的形式和/或已表达蛋白的溶液的形式来提供。工程 SUMO蛋白酶也可任选地带有亲和标签，该亲和标签可以与附着于工 程SUMO的亲和标签相同或不同。该试剂盒也可以进一步包括至少一 种切割缓冲剂、冷存的宿主细胞和/或指导手册。
试剂盒也可以进一步包括用于改变编码所关心的蛋白的核酸以 产生不同于天然野生型蛋白的氨基末端的试剂。用于改变核酸的方法 为本领域人员所熟知，包括但不局限于位点定向突变和基于寡核苷酸 的位点定向突变(例如见Ausubel等，eds.，2006，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.)。示范性试剂包括但不局 限于DNA聚合酶、PCR缓冲剂和dNTPs溶液。
提供以下实施例来举例说明本发明的各种实施方案。这些实施例 是为例示性的而不是以任何方式限制本发明。
实施例I
材料和方法
为了在同一个大肠杆菌细胞中共表达SMT 3-GFP和ULP1蛋白 酶，使用引物23(5’- GGCGCTCGAGTCCCGCGAAATTAATACGACTCA-3’；SEQ ID NO：7)和46 (5’-CGCAAAGCTTGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3’；SEQ ID NO：8)，
从pET24d-Smt3-GFP载体中扩增T7-SMT3-GFP盒(Malakhov等 (2004)J.Struct.Funct.Genomics，5：75-86)，用XhoI和HindIII消化后插 入用XhoI和HindIII切割的pACYC177载体(GenBank登录No.X06402) 中。该操作用SMT3-GFP表达盒置换了pACYC177中的Kan抗性基 因，生成pACYC-SMT3-GFP载体。将pACYC-SMT3-GFP转化进入 BL21(DE 3)感受态细胞中。带有pACYC-SMT3-GFP的细胞在含氨苄 青霉素的培养基上培养并使用标准氯化钙方法制成感受态。用另一个 携带在可诱导T7启动子之下的ULP1蛋白酶的载体，pET24-ULP1， 如之前所述(Malakhov等(2004)J.Struct.Funct.Genomics，5：75-86)， 转化这些感受态细胞。转化子在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB培 养基上筛选。当用IPTG诱导时，在共表达ULP1蛋白酶的细胞中的 SMT3-GFP融合物被处理成为SMT3(20kD)和GFP(28kD)。而不共表 达ULP1的细胞产生全长SMT3-GFP融合物，大小为48kD。
为了随机化位置R64和R71，使用pACYC-SMT3-GFP作为模板产 生两个重叠的PCR产物。用引物23和
80(5’-AATACCGTCGTACAAGAANNNTAAGGAGTCCA-3’；SEQ ID NO：9)进行第一个PCR，用引物
79(5’-TCTTGTACGACGGTATTNNNATTCAAGCTGATCAGA-3’；SEQ ID NO：10)和46进行第二个PCR。两个PCR片段进行凝胶分离，混合 并作为使用引物23和46进行第二轮PCR的模板。结果产生的突变 SUMO-GFP片段库被克隆进入用XhoI-HindIII消化的pACYC177载体。 连接混合物被转化进入带有pET 24-ULP1质粒的BL 21(DE3)感受态细 胞。
为了选择工程SUMOs，转化的菌落在补充有氨苄青霉素和卡那 霉素的LB培养基中培养至OD值为0.5，然后用1mM IPTG诱导。 诱导在20℃持续12小时。收获以后，冷冻细胞并存储于-80℃。使用 pH 8.0含1mM EDTA和1单位/ml溶菌酶的10mM TRIS缓冲液重悬 沉淀。在室温下孵育10分钟后，加入MgCl2至终浓度10mM，并加 入DNaseI至10单位/ml的浓度。10分钟孵育之后，在样品中加入1μl 染料并加在无十二烷基硫酸钠(SDS)的12％天然聚丙烯酰胺凝胶上。 凝胶在15V/cm下电泳1小时并在365nM紫外匣中观察。
图7中展示的β内酰胺酶构建体用下列方式产生。使用寡聚引物对 65(5’-
CGCGACATATGAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTGCTGTGGCTCTCGCAGT-3’； SEQ IDNO：11)/61(5’-
CGCGAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTGAGCCT-3’；SEQ ID NO：12) 和66(5’-
CGCGCAGGTCTCTAGGTAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTGCTGTGGCT-
CTCGCAGT-3’；SEQ ID NO：13)/61或67(5’-
CGCGCAGGTCTCTAGGTCCTAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTGCTGTGGCTC TCGCAGT-3’；SEQ ID NO：14)/61
进行两个连续的PCR反应扩增β-内酰胺酶基因，使β-内酰胺酶使用 脯氨酸作为开端。产生的β-内酰胺酶具有15个氨基酸的分泌信号与β- 内酰胺酶开放阅读框(ORF)融合。使用寡核苷酸26(5’
TGTACAGAGCTCACGCGTGCATGCTCGGACTCAGAAGTCAATCA-3’；SEQ ID NO：15)
和61扩增突变的SUMO。产生的SUMO和β-内酰胺酶PCR产物用 Eco31I限制性核酸内切酶进行消化并连接在一起。连接产物作为用引 物26和59(5’-
CGCGAGTCGACTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCA-3’；SEQ ID NO：16)
进行PCR反应的模板，产生融合产物(突变SUMO)-(分泌信号)-(β- 内酰胺酶)。为了加入不溶蛋白MMP 13至突变SUMO的N末端，表 达盒内的MMP13的ORF连同T7启动子用寡核苷酸60(5’-
GGCGAAGCTTTCCCGCGAAATTAATACGACTCA-3’；SEQ ID NO：17)和35 (5’-CGCAGCATGCGGGGTCTTCATCTCCTGGACCA-3’；SEQ ID NO：18).
从p24d-MMP 13载体中扩增。产生的产物T7-MMP 13用HindIII和SphI 消化，在三段连接中连同用SphI-SalI消化的(突变SUMO)-(分泌信号)- (β内酰胺酶)一起克隆进入用HindIII-SalI消化的pACYC184中。这 样就产生pACYC-mutSUMO-Lac质粒。
为了产生在阿拉伯糖可诱导启动子P-BAD下的ULP1表达载体， 在pET24d-ULP1中的LacI基因与T7启动子用AraC基因和P-BAD 启动子加以置换。特别地，将pBAD/His/A载体(Invitrogen)用NcoI和 AccI消化，并将带有araC基因和P-BAD启动子的片段进行凝胶分 离。该片段连接进入用NcoI-AccI消化的pET24d-ULP1载体中，产生 pARA-6His-ULP质粒。
为了诱变ULP1，该基因的5’端用寡核苷酸88(5’-
GGAATTAACCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGAGGT-3’；SEQ ID NO： 19)和91(5’-TTAGCCATCTTCGTGGTGCCAAGGTCT-3’；SEQ ID NO：20)， 进行扩增，而3’部分用寡核苷酸191(5’-
AAGACCTTGGCACCACGAAGATGGCTAAATNNNNNNATCATTNNNTTTTT TATGA-3’；SEQ ID NO：21)和89(5’-
GTGGTGCTCGAGTCATTTTAAAGCGTCGGTTA-3’；SEQ ID NO：22)，或192 (5’-
AAGACCTTGGCACCACGAAGATGGCTAAATNNNNNNNNNNNNNNNTTTTT TATGA-3’；SEQ ID NO：23)
和89进行扩增导入突变。5’和3’部分进行凝胶分离并在第二轮PCR 中作为模板，用引物88和89来扩增诱变的ULP1(即突变SUMO蛋白 酶)。PCR产物用NcoI和XhoI消化并克隆进入pARA-6His载体。
突变SUMO蛋白酶库被转化进入带有pACYC-mutSUMO-Lac质 粒的感受态TOP 10大肠杆菌中。在42℃热激之后，细胞在2x YT培 养基中37℃复活1小时。然后加入四体积的LB培养基并在37℃搅 拌2小时。将细胞平板接种于补充了34mg/L氯霉素、50mg/L卡那 霉素、50mg/L氨苄青霉素和0.02％阿拉伯糖的LB平板上。带有未 突变的Ulp1基因的质粒不支持在氨苄青霉素上生长。将生长起来的 阳性突变克隆测序并用于蛋白酶纯化以用于体外切割。突变SUMO蛋 白酶用标准Ni-sepharose法纯化并在前述的标准切割反应(Marblestone 等(2006)Protein Sci.，15：182-9)中使用。(突变SUMO)-GFP作为切割反 应的底物。
结果
当SUMO蛋白作为融合伙伴与所关心的蛋白连接时，无论在细菌 和真核细胞中，它都可以大大增强重组蛋白质的表达水平和质量(参见 图2和图3A；Malakhov等(2004)J.Struct.Funct.Genom.，5：75-86)。 SUMO家族蛋白作为细胞调控的部分在天然状况下能加在真核生物 蛋白上并能从上面除去。SUMO的结构和SUMO蛋白添加和除去的过 程在真核细胞中高度保守。SUMO蛋白在结构上的高度保守使SUMO 融合标签与外源宿主的内源性SUMO修饰酶类有交叉物种反应。因 此，真核细胞能切割SUMO标签并且这种切割通常引起标签从重组蛋 白上分离。从真核细胞表达并纯化“未切割的“或未加工的野生型 SUMO融合蛋白因此是不轻易可能的。
为了在真核细胞中提高蛋白产量，克服“成熟前”标签被切割的障 碍，新的SUMO蛋白，叫SUMO*，被设计出来以抵抗内源性的SUMO 蛋白酶。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因SMT 3被用作遗 传基础以开发这种SUMO标签。
在评估Smt3的晶体结构以及它相应的蛋白酶Ulp1(蛋白数据库 #1EUV)(图4)之后，诱变处理Smt 3蛋白可能与Ulp1进行相互作用的 区域(图5)。首先，使用常规PCR突变技术随机化编码氨基酸64-71 的区域。然后，因为在位置64和71的精氨酸(R64和R71)直接面对 Ulp1(图4A和4B)，使用PCR突变法特异地突变这些残基。产物 SUMO-GFP突变体用新的体内切割检验，即用Ulp1转化大肠杆菌， 进行筛选。
在大肠杆菌内存在ULP1时也不体内切割的突变体包括在64位用 苏氨酸(theronine)代替精氨酸以及在71位用谷氨酸代替精氨酸。在 此涉及的这个特别的突变体为SUMO*。在下面的表1中提供了某些 SUMO突变体。
表1-某些SUMO突变体在R64和R71位上的氨基酸变化以及它们能 被ULP1切割的能力。
如图3A和3B所示，分别使用酵母和昆虫SUMO蛋白酶都能几 乎完全地切割SUMO-GFP，而SUMO*-GFP则不被切割。另外，与未 加标签的GFP相比(比较泳道1和2与5和6)，SUMO*融合物大大的 增强了GFP的表达。
纯化SUMO*-GFP并用于体外的切割反应。测定了SUMO蛋白酶 1(Ulp1)和SUMO蛋白酶2(SENP2)(图6)。两种蛋白酶均不能切割 SUMO*(图6)。实际上，有SUMO*标签的融合物用最高至完全切割 SUMO所需酶浓度1000倍的增加量的Ulp1进行孵育，仍没有检出切 割(图10)。另外，当SUMO*-GFP在酵母或昆虫细胞中表达时，该突 变标签，不像野生型Smt3标签，是不会被这些生物的天然SUMO蛋 白酶所切割的(图3)。
最理想的融合标签，必须能在随后的纯化步骤中被除去，而只剩 下所关心的蛋白。为了设计能切割SUMO*标签的蛋白酶，筛选了水 解酶的在大肠杆菌中从它们的融合伙伴中切割突变SUMOs的能力 (图7)。如果在细胞中表达氨苄青霉素抗性蛋白，β-内酰胺酶，筛选基 于大肠杆菌在含有抗生素氨苄青霉素的培养基上的生长能力来进行。 已经证明只有未融合的β-内酰胺酶可以赋予氨苄青霉素抗性。因此， 如果SUMO标签被融合至β-内酰胺酶上，它不会赋予氨苄青霉素抗 性。β-内酰胺酶被融合至SUMO*的C-末端并与不同的水解酶进行共 表达。只有当标签被切割，β-内酰胺酶才能以其活性形式释放，从而 通过赋予氨苄青霉素抗性而使细胞生存。已知道如果蛋白以脯氨酸开 端，那么Ulp1不能切割该SUMO-蛋白融合体。因此Smt3-pro-BLA融 合蛋白，在Smt 3标签之后的第一个氨基酸是脯氨酸的融合物，被构 建起来作为构思证据用于筛选(图8)。
分析Ulp1的结构，与SUMO氨基酸R64和R71相互作用的氨基 酸残基被确定位于残基450和456之间的区域。与R64和R71相互作 用的潜在氨基酸分别是位于451和455位的天冬氨酸和谷氨酸，以及 在452位的苏氨酸(图4和9)。使用PCR饱和诱变技术随机突变在Ulp 1中的这三个残基。诱变之后，突变体用体内β-内酰胺酶检定在含有 氨苄青霉素的平板进行选择。使用切割效率的不同程度在筛选中鉴定 Ulp1突变体。选择最有效率的突变体2.2，并命名为“SUMO*蛋白酶 1”(图10)。突变体范例在下面表2中提供。
表2在野生型ULP1和某些突变体的451和455位之间的氨基酸序列 以及它们切割SUMO*的能力。
实施例II
如同野生型SUMO一样，工程SUMOs能够增加异源蛋白质的表 达。实际上，图3A表明，同未加标签的GFP比较，当蛋白与SUMO* 融合时，在酿酒酵母中GFP以更高的水平表达。另外，图13提供 SUMO*增强异源蛋白质在昆虫细胞中表达的证据。特别地，将类胰蛋 白酶与6xHis标签或SUMO*标签一起克隆进入pFastBac载体。该融 合蛋白在昆虫Sf9细胞中表达。用考马斯染色的细胞内蛋白 SDS-PAGE凝胶清楚地表明与带6xHis标签的类胰蛋白酶相比 SUMO*-类胰蛋白酶表达提高。值得注意的是，SUMO*-类胰蛋白酶 融合物在昆虫细胞中不被切割。
另外，与野生型SUMO类似，本发明的工程SUMOs提高了异源 蛋白质的分泌。图14是表达带6xHis标签或融合SUMO*的粒酶 B(GzmB)的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)培养基蛋白的蛋白质印 迹。该培养基与细胞分离并用SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析，蛋 白质印迹分析使用抗GzmB抗体以显现SUMO*-GzmB以及 6xHis-GzmB。值得注意的是，SUMO*-GzmB融合物在毕赤酵母细胞 中不被切割。
实施例III
昆虫表达载体基于pFastBac(Invitrogen，Carlsbad，CA)并以两步 进行构建，类似于毕赤酵母。首先，6xHis、SUMO以及SUMO*融合 标签被克隆在P-polh启动子之后。然后与融合标签符合读框地将 UBP43，一种泛素蛋白酶(Liu等(1999)Mol.Cell.Biol.，19：3029-3038)， 插入用BsmBI-XbaI预先消化的载体。小鼠UBP43用引物：
#265(CGCGACCTGCATCGAGGTATGGGCAAGGGGTTTGGGCTCCTGAGG； SEQ ID NO：29)
和#266
(CGCGACCTGCATGTCTAGATTAGGATCCAGTCTTCGTGTAAACCAAG； SEQ ID NO：30)，
进行扩增，再用BfuAI消化。杆粒在DH 10bac大肠杆菌细胞中产生。 获得并滴定病毒之后，转染Sf9细胞，72小时之后分析样品检测蛋白 质产量。
pCDNA3.1载体被用于哺乳动物表达。将小鼠IgGκ分泌信号和三 个蛋白标签，6xHis、6xHis-SUMO、和6xHis-SUMO*，克隆进CMV 启动子后的HindIII-BamHI位点。用引物576
(ATCACGTCTCGAGGTGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGAC；SEQ ID NO：31) 和285(GCATCGTCTCACTAGTCAATTGCACTTGGGAGAGT；SEQ ID NO： 32)，
扩增小鼠分泌组X PLA2后，用BsmBI限制性核酸内切酶消化并克隆 在6xHis、SUMO或SUMO*融合标签之后。无κ分泌标签的JOSD2 在细胞内表达。JOSD2开放阅读框用寡聚DNA 344(ATGATGGGTCTCAAGGTATGTCCCAGGCCCCGGGAGCA；SEQ ID NO： 33)和345(ATGATGGGTCTCTCTAGATCAGTCTGTCCGCAGCCA；SEQ ID NO：34)
扩增并克隆进基于pCDNA3.1的载体中，在6xHis或SUMO*标签之 后。
用2.5微克的各种纯化质粒来转染包含2ml培养基中的HEK293T 细胞的6孔平板的各孔。48小时之后，收集细胞和培养基样品并用蛋 白质印迹法分析。
如图15A和15B所示，SUMO*融合标签增强了融合伙伴蛋白的 表达，并在昆虫和哺乳动物细胞中不被切割。
实施例IV
sPLA2酶以它们催化磷脂sn-2酯键的反应，一种水解反应，受到 人们关注。在水解后，得到溶血磷脂和游离脂肪酸。这些脂肪酸可以 作为信号转导的第二信使，而值得注意的是溶血磷脂有助于磷脂重 塑。
PLA2首先于1890年在眼镜蛇毒中被发现(Six和Dennis (2000)Biochim.Biophys.Acta，1488：1-19)。目前，已有11种不同的 sPLA2组在小鼠中得到鉴定，根据氨基酸序列同源和结构相似性进行 分类。在已知的11组中，组IIC、IIE、III、V和X被用于这些研 究。(字母指特定组中不同的同系物。)组IIC，有8个二硫键，在啮 齿动物睾丸、脑和胰腺中都发现，但在人类中不表达(Six和Dennis (2000)Biochim.Biophys.Acta.，1488：1-19)。组IIE，在体内有炎性反 应，在人(肺组织)和小鼠(脑、心脏和肝组织)中被发现。有趣的是，组 III，原来从蜂毒分离，在人体中诱导树突成熟，在病理性的人内皮细 胞中高度表达并似乎在肿瘤细胞中增加血管生成(Murakami等(2005)J. Biol.Chem.，280：24987-24998)。组V PLA2，一种具有6个二硫键的 14kDa蛋白，在它的结构中并无独特的环并在有炎性刺激的情况下在 大鼠和人心脏中表达(Six和Dennis(2000)Biochim.Biophys.Acta.， 1488：1-19)。组X，最近解析出的PLA2s，包含123个氨基酸并与组I、 II和V有27-35％序列同一性。它在人的脾、白细胞、肺泡组织和胸 腺以及小鼠的胃中有发现。与大多数PLA2s一样，组X PLA2s在炎性 刺激下出现并也参与信号转导。
为了正确折叠和活性许多真核生物蛋白需要复杂的翻译和翻译 后环境。这些条件在像大肠杆菌或酵母类的生物中并不存在，在这些 宿主中尝试重组表达时这可能导致不正确的加工和/或较差的得率。分 泌的磷脂酶A2s是一类在大肠杆菌中难于生产的蛋白家族，经常被表 达于包含体中。此外，由于相对多的二硫键数目，通常在5至8之间， PLA2s在增溶之后难以重折叠。表达通常比较低并且随后的重折叠步 骤经常导致较差的产量。尽管有精致的方案和艰苦的努力，但重折叠 的蛋白活性与它的天然形式仍然不同，而不能正确表征。之先尝试在 哺乳动物细胞中表达sPLA2s，通常会得到较低的表达水平。然而，如 在此所述，通过与小的类泛素修饰物(SUMO)家族的成员融合，在大 肠杆菌、巴斯德毕赤酵母和杆状病毒/昆虫细胞系统中都可以提高异源 蛋白质的表达。因此，通过类似于以前使用的方法可能在哺乳动物细 胞中使sPLA2生产量提高，特别是小鼠PLA2组。
另外，PLA2的游离N末端对PLA家族蛋白的生物活性必不可少。 生产活性的PLA2对细胞有害，过量生产活性PLA2将杀死细胞。在 PLA2的N末端包含有工程SUMO的融合蛋白在细胞中不被切割，这 样可使休眠的/非活性的PLA2在细胞内积累或被分泌至培养基中(细 胞外)。工程SUMO-PLA2融合物可以在体外纯化后用工程SUMO蛋 白酶切割以生产活性的PLA2蛋白。因此，工程SUMO融合物提供了 更好的工具来表达活性的有毒蛋白，特别是当该蛋白的毒性与蛋白的 N末端有关时。值得注意的是，其它蛋白如胰蛋白酶、因子X、凝血 酶和粒酶B当过表达时可能对细胞有毒，并且这些蛋白表现活性都需 要游离N末端。像PLA2那样，这些蛋白可以以工程SUMO融合物的 形式表达，然后用工程SUMO蛋白酶除去SUMO标签。
材料与方法
构建融合标签载体
对于所有载体构建体，pCDNA3.1/V5-His(Invitrogen)都被用作主 链。所有的PCR反应都使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶 (Invitrogen)，而所有限制性酶和T4 DNA连接酶来源于 Fermentas(Burlington，Ontario，加拿大)。克隆按照标准技术进行。 所有克隆以测序法进行鉴定。最初，通过具有两者之间同源区域的重 叠引物产生κS.S.和6xHis标签(分别使用引物1+2和3+4；见引物序 列表3)。将κS.S和His标签用引物1+4在第二轮PCR反应中连接在 一起。κ-6xHis融合体通过HindIII和BamHI限制性位点插入pCDNA3.1 中，生成pCDNA3.1-κ-6xHis。设计引物3和4使His标签之后接上两 个甘氨酸以及产生在相反链BamHI位点上游区的Esp3I/BsmBI限制 性位点。用Esp3I消化，从双甘氨酸ggaggt编码序列产生非编码链上 的由tcca组成的四碱基突出。用引物5+6，7+6，7+6和8+9分别扩增 CTHS、SUMO、SUMOmut和hSUMO3。当下游使用第二个Esp 3I识 别位点时，所有反向引物再次在不同的SUMO末端双甘氨酸密码子下 游产生Esp 3I识别位点。通过Eco31I和BamHI限制性位点将SUMO 标签插入pCDNA3.1-κ-6xHis，以生成以下载 体：pCDNA3.1-κ-6xHis-CTHS、pCDNA3.1-κ-6xHis-SUMO、 pCDNA3.1-κ-6xHis-SUMOmut、pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO3。
初始的小鼠sPLA2-X构建体产生
使用引物10+11 PCR扩增活性的sPLA2-X。使用引物12+11从相 同的克隆中PCR扩增非活性的sPLA2-X。通过用Esp 3I消化PCR产 物和载体产生活性的和非活性的sPLA2-X质粒。
融合标签载体的扩增
使用引物13+14从cDNA中PCR扩增人SUMO-1并通过Esp 3I 和XbaI限制性位点克隆进入pcDNA3.1-κ-6xHis中产生 pcDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO1。通过使用PCR位点-定向诱变法产生突 变的人SUMO-1和3，其中N末端和C末端的半段在单独的反应中产 生，凝胶分离，并在后续的PCR反应中连接。人SUMO-1的第一步 PCR分别使用引物13+15和16+14进行N和C-末端反应。人SUMO-3 的第一步PCR分别使用引物8+17和18+9进行N和C末端反应。在 第二步PCR中，对于每种人SUMO将纯化的的第一步产物混合起来， 使用引物13+14产生hSUMO1 mut，而用引物8+9产生hSUMO3 mut。 产物被被插入pCDNA3.1-κ-6xHis中生成 pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO1mut和pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO3mut。
小鼠sPLA2构建体的扩增
小鼠sPLA2-IIC、IIE、III和V的cDNAs购买于Open Biosystems(Huntsville，AL)。设计PLA2引物以能在纯化和除去标签后 生成成熟蛋白质。因此基于参考文献综述和SignalP分析在引物设计 中省略分泌信号和前肽。用引物19+20从cDNA克隆小鼠sPLA2-IIC， 对应于GenBank登录号BC 029347。用引物21+22从cDNA中克隆小 鼠sPLA2-IIE，对应于GenBank登录号BC 027524。用引物23+24从 cDNA中克隆全长的小鼠sPLA2-III，对应于GenBank登录号BC 079556。用引物25+26从cDNA中克隆小鼠sPLA2-V，对应于GenBank 登录号BC 030899。用引物27+28从cDNA中克隆小鼠sPLA2-III活性 结构域(Murakami等(2005)J.Biol.Chem.，280：24987-24998)，对应于 GenBank登录号BC 079556。所有的sPLA2基因包括活性和非活性 sPLA2-X被亚克隆进入pCDNA3.1-κ-6xHis，
pCDNA3.1-κ-6xHis-SUMO，pCDNA3.1-κ-6xHis-SUMOmut，
pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO1，pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO1mut，
pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO3和pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO3mut中。
在HEK-293细胞中的瞬时转染
HEK-293T细胞以含有10％胎牛血清培养基的DMEM中500,000 细胞每孔的密度被接种于6孔板中(BectonDickinson；Sparks，MD) 并在37℃、95％空气/CO2中孵育过夜。按制造商(Invitrogen)所述使用 Lipofectamine-LTX将在pCDNA3.1载体中的不同的PLA2 cDNA构建 体(2.5μg/孔)瞬时转染细胞。转染之后，细胞在37℃下再孵育48小 时以分析PLA2表达。
表达分析
转染并孵育48小时之后，收集培养基和细胞进行分析。从各孔 中移出培养基(～1.5ml)并离心分离碎片。100μl的培养基与6xSDS上 样缓冲液混合并煮沸5分钟以用于SDS-PAGE/蛋白质印迹。剩余培养 基存储于-80℃以用于随后检验。从平板中的每孔洗涤细胞、离心分 离、再悬浮于180μl的冷RIPA缓冲液中，短暂超声破碎，混合于6xSDS 上样缓冲液并煮沸5分钟。所有样品用带有4％丙烯酰胺叠加层的15％ 变性丙烯酰胺凝胶解析。凝胶用Trans-SD半干式转移槽 (BioRad；Hercules，CA)转移至ImmoblinTM硝化纤维素(Millipore； Billerica，MA)上。转移之后，印迹使用pH 7.5含0.05％Tween-20 的PBS(PBST)中的5％脱脂奶封闭1小时。封闭之后，印迹在PBST+ 奶中的1∶1000单克隆抗-His抗体(Sigma)中孵育1小时。用PBST洗 涤印迹三次，用PBST+奶中的1∶2500抗-小鼠的HRP缀合抗体(Sigma； 圣路易斯，MO)孵育1小时。印迹再用PBST洗涤三次。用 West Pico化学发光底物(Pierce；Rockford，IL)检测HRP 缀合物。印迹用LAS-3000(Fujifilm Life Science；Stamford，CT)成像。
基因 序列 酶 SEQ ID NO Dir. 1 kappa GCGCAAGCTTGCTATGGAGACAGAC ACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGC TCT HindIII 35 F 2 kappa GATGATGGTGATGACCGTCACCAGT GGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGT ACCCA 36 R 3 6xHis CCAGGTTCCACTGGTGACGGTCATC ACCATCATCATCACGGAGGT 37 F 4 6xHis CGCGTCTAGAGAGACGGCATGCCGT CTCAACCTCCGTGATGATGATGGTG ATG XbaII，Esp3I 38 R 5 CTHS CGCAGGTCTCTAGGTGAAAGACAGG GTAAGGAAATGGA Eco31I 39 F 6 SUMO CGCGTCTAGAGAGACGGCATGCCGT CTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG A XbaI，Esp3I 40 R 7 SUMO CGCAGGTCTCTAGGTTCGGACTCAG AAGTCAATCAAGA ECo31I 41 F 8 hSUMO3 CGCAGGTCTCTAGGTTCCGAGGAGA AGCCCAAGGA Eco31I 42 F 9 hSUMO3 CGCGTCTAGAGAGACGGCATGCCGT CTCAACCTCCCGTCTGCTGCTGGAA XbaI，Esp3I 43 R 10 sPLA2-X ATCACGTCTCGAGGTGGACTCCTGG AGCTGGCAGGGAC Esp3I 44 F 11 sPLA2-X GCATCGTCTCACTAGATCAATTGCA CTTGGGAGAGT Esp3I 45 R 12 sPLA2- Xmut ATCACGTCTCGAGGTCTCCTGGAGC TGGCAGGGAC Esp3I 46 F
13 hSUMO1 CGCAGGTCTCTAGGTTCTGACCAGG AGGCAAAACCT Eco31I 47 F 14 hSUMO1 CGCGTCTAGAGAGACGGCATGCCGT CTCAACCTCCCGTTTGTTCCTGATA A XbaI，Esp3I 48 R 15 hSUMO1 mut ATGATTATCAGCAATTTCCTGACCC TCAAAGAGAAACGTGAGTGAATTCA TTGGAA 49 R 16 hSUMO1 mut CCAATGAATTCACTCACGTTTCTCT TTGAGGGTCAGGAAATTGCTGATAA TCATAC 50 F 17 hSUMO3 mut TGGCTGCCCGTCGAACTCGAATGTG ATCTGCCTCATTGACA 51 R 18 hSUMO3 mut TCAATGAGGCAGATCACATTCGAGT TCGACGGGCAGCCAAT 52 F 19 sPLA2- IIC GCGCCGTCTCTAGGTAGTTTCTGGC AGTTCCAGAGGA Esp3I 53 F 20 sPLA2- IIC GCGCCGTCTCTCTAGATTAGCACTG GAGTTTGTCCCTGC Esp3I 54 R 21 sPLA2- IIE GCGCGGTCTCTAGGTAACCTGGTCC AGTTTGGAGTGA Eco31I 55 F 22 sPLA2- IIE GCGCGGTCTCTCTAGATTAGCAGGG TGGGGTGGGC Eco31I 56 R 23 sPLA2-III GCGCGAAGACATAGGTCGTCACTGG GACAGTACCTCCTG BpiI 57 F 24 sPLA2-III GCGCGAAGACATCTAGATTATGAGC TCCAGAATTTCTTCTGTCC BpiI 58 R 25 sPLA2-V GCGCCGTCTCTAGGTGGCTTGCTAG AACTCAAGTCCATG Esp3I 59 F 26 sPLA2-V GCGCCGTCTCTCTAGATTAGCAGAG GAAGTTGGGGTAATAC Esp3I 60 R 27 sPLA2- IIIcore GCGCCGTCTCTAGGTGGCTGGACCA TTCCTGGCACG Esp3I 61 F 28 sPLA2- IIIcore GCGCCGTCTCTCTAGATTAATATGA GGTGGCCTCAGCCTTCCAG Esp3I 62 R
表3：引物
结果
为了评价在哺乳动物分泌途径中表达SUMO-融合蛋白的潜在作 用，小鼠sPLA2-X被用作模型蛋白。首先测定以下四个N末端融合 物：Smt 3(SUMO)，包括AA45-99的Smt3C末端的一半(CTHS)，双重 突变体Smt3 R64T R71E(SUMOmut(SUMO*))，该突变体不能被SUMO 蛋白酶和人SUMO-3(hSUMO)所切割。所有标签产生为具有6个组氨 酸(6xHis)的N-末端并定向于利用IgGκ分泌信号从小鼠分泌。用于对 照目的，建立了只有信号序列和6xHis标签的载体，一共建立了五种 载体，仅在它们基于SUMO的标签上不同。与Smt 3的融合已经显出 在大肠杆菌中的异源蛋白表达增强，而当与人SUMO-3融合则导致在 大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中的表达提高。在表4中提供了某些表达 数据。
表4
开发的CTHS最初用于杆状病毒/昆虫细胞表达，因为观察到全长 的SUMO融合物可被内源性的去SUMO酶(desumoylase)所切割(如 见PCT/US 04/20778和US专利申请No.10/504,785)。基于分离的泛 素(split-ubiquitin)的开发(Johnsson和Varshavsky(1994) PNAS91：10340-10344)，CTHS仅在存在它的N端一半序列(NTHS)的 情况下才会被切割。已经发现当避免了内源性切割时，CTHS融合可 以增加融合伙伴的产量。
如在此所描述，开发突变体Smt 3以产生SUMO融合物，该融合 物在真核生物宿主体内不被切割，而维持了在原核生物中所显示的 Smt3融合的所有正向增强。在对结合于它的天然蛋白酶Ulp1的Smt3 进行广泛的晶体结构分析之后，合理的诱变筛选产生了两个相邻的 (interfacial)氨基酸的修饰。这些修饰，R64T和R71E，产生了在各 种酶浓度下都不能被Ulp1切割的SUMO。在筛选中，新的SUMO显 示出与野生型Smt3相当的融合伙伴表达的增强程度。在产生突变 Smt3之后，也将Ulp1进行合理的诱变筛选并开发出了能够在体外切 割突变Smt 3融合物的突变酶。
如图16A所示，在HEK-293 T细胞中表达sPLA2-X。与其它标签 相比，SUMOmut清楚地显示了sPLA2-X在产量上的增强；然而Smt 3 和hSUMO3培养物在48小时的最后显得融合性较差。重复若干次转 染都得到相同的结果。sPLA2-X是天然产生的酶原，其成熟形式克隆 在各种标签之后。在它可能从它的融合伙伴上释放出来的情形中过量 表达sPLA2-X可能对细胞有毒。为了评价所述sPLA2-X毒性是否是由 于切割造成的，我们通过去除sPLA2-X的N末端甘氨酸来产生一系列 非活性的sPLA2-X融合物。在HEK-293T细胞中表达那些非活性 sPLA2-X的融合物见图16B。结果证明虽然没有可见的裂解产物， sPLA2-X活性和它N末端前肽对切割的敏感度显然在过表达中起有重 要作用。
比较人SUMO-1、2、3和Smt 3的晶体结构，显示出在各SUMO 结构之间具有很强的保守性，两个相邻精氨酸残基位于几乎相同的位 置。值得注意的是，SUMO-2和3具有97％的同一性。因此，研究 hSUMO-1和3希望SUMO-2表现与SUMO-3相同的情况。在hSUMO1 中，在63位的精氨酸被改变为苏氨酸(R63T)，而70位精氨酸被改变 为谷氨酸(R70E)。对于hSUMO3，58位的精氨酸被改变为苏氨酸(R58T) 以及60位的精氨酸被改变为谷氨酸(R60E)。用突变型和野生型Smt 3、 hSUMO1和3制备出活性的和非活性的sPLA2-X融合物。图17A和B 分别显示了表达非活性的和活性的融合物48小时的结果。表达野生 型Smt3、hSUMO1和hSUMO3的培养物也没生长，同时也不表达 sPLA2-X。这种情况可能由于融合蛋白被切割后释放了有毒的PLA2。 有趣的是，某些带His标签的hSUMO1在17A中可见，而在其它的 具有活性sPLA2-X的野生型SUMO融合物中则不可见。
给出的表达数据使用的是小鼠sPLA2-X，测定了其它的sPLA2组。 基于在以前报道中重组表达的不同水平(Rouault等(2007) Biochemistry 46：1647-1662)测定了四个额外的小鼠sPLA2基因。以前， 小鼠sPLA2-IIC和III在昆虫细胞中的生产分别具有150和70ng/L的 产量。对于每种sPLA2目前没有重折叠方案而且两种酶都是天然糖基 化的，这使得真核生物生产成为必需。小鼠sPLA2-IIE代表了报道的 在细菌中的最低产量，为800ng/L，而sPLA2-V代表了最高产量，为 20mg/L。小鼠sPLA2-X在大肠杆菌中表达量为10mg/L。
活性形式的小鼠sPLA 2-IIC、IIE、III和V被测定。图18A展示 了sPLA2-IIC 48小时之后的细胞内表达。带His标签的蛋白在培养基 中不能被检测出。尽管带上所有的SUMO标签的表达都明显地增加 了，但分泌在某种程度上被抑制了。sPLA2-IIE的表达和分泌见图18B。 48小时之后，明显更多的sPLA2-IIE在大多数的SUMO融合物中可 以被看到了，密度法分析显示，比起单独的His标签，SUMOmut是 140倍而hSUMO3mut是190倍。小鼠和人sPLA2-III都作为55kD的 蛋白表达，但经过翻译后和细胞特异性的蛋白水解加工，成熟为28kD 的活性结构域(Murakami等(2003)J.Biol.Chem.，278：10657-10667； Murakami等(2005)J.Biol.Chem.，280：24987-24998.)。活性的或S结 构域之前是N结构域，之后是C结构域。最初，制备了具有全长 sPLA2-III的融合物，仅仅使用SUMO和κ信号更换了天然分泌信号。 在HEK-293细胞中，所有sPLA2-III融合物在它们的第一个切割位点 上被切割，而分开了N和S结构域，如图18C所示，这时带His标签 的蛋白只有12kD或具有不同的SUMOs时大约32kD。胞内印迹显示 了55kD蛋白的产生而无其它的形式可见。sPLA2-V的表达和分泌见 于图18D。类似于组X，在表达sPLA2-V时对突变SUMO融合物有强 的偏好性。虽然野生型SUMO融合物的表达明显缺少，但在sPLA2-V 例子中，没有看到类似的细胞培养问题。
虽然本发明的某些优选方案已经进行了如上描述和特别例证，但 并不意图将本发明限于这些方案。在不偏离本发明的范围和精神的前 提下可以进行各种的修改，如以下权利要求所阐述的。
Tauseef R.Butt
Tadas Panavas
Amolkumar Karwa
Raymond J.Peroutka
Jeffrey G.Marblestone
本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求2006年12月29日提交的美 国临时专利申请No.60/877914的优先权。上述申请通过援引并入本 文。
在异种的表达系统中不能统一的表达和纯化具有生物学活性的蛋白已 经妨碍了功能基因组研究(Ryan和Patterson(2002)Trends Biotechnol， 20：S45-51)。尽管在特定表达载体中使用了相同的转录和翻译信号，仍观察 到表达蛋白水平的变化显著(Weickert等(1996)Curr.Opin.Biotechnol.， 7：494-9)。因此，人们已经开发了几种策略，使用在细菌、酵母以及哺 乳动物和昆虫的细胞中将异源蛋白质作为基因融合物表达(Ecker等 (1989)J.Biol.Chem.，264：7715-9；Butt等(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.，86：2540-4；Kapust和Waugh(1999)Protein Sci.，8：1668-74；Ikonomou 等(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.，62：1-20)。
到目前为止，对于研究和商业目的来说，在细菌中表达异源基因 是最简单和最便宜的方法。然而，在大肠杆菌中某些异源基因产物不 能获得他们正确的三维构象，而其他异源基因产物过量生产时汇集 (sequestered)为大的不溶解的集合物或“包含体”(Jonasson等 (2002)Biotechnol.Appl.Biochem.，35：91-105；Georgiou和Valax(1999) Methods Enzymol.，309：48-58.)。为了获得合理的重组蛋白得率，经常 需要大量变性剂诱导的增溶方法之后再在适宜再折叠的条件下除去 变性剂。
对于结构基因组项目，开放阅读框(ORFs)的选择也表明只有大约 20％在大肠杆菌中表达的基因可以产生可溶的或正确折叠的蛋白质 (Waldo等(1999)Nat.Biotechnol.，17：691-5)。这些数字是非常令人失望 的，尤其是现在大多数的科学家依靠大肠杆菌来初始尝试表达基因产 物。几种通过连接标签如NUS A、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽 S转移酶(GST)和硫氧还蛋白(TRX)的蛋白表达系统已经开发出来 (Jonasson等(2002)Biotechnol.Appl.Biochem.，35：91-105)。所有的这些 系统都具有某些缺点，包括表达低效以及对期望结构切割不一致。
在文献(Jentsch和Pyrowolakis(2000)Trends Cell Biol.，10：335-42； Yeh等(2000)Gene，248：1-14；Larsen和Wang(2002)J.Proteome Res.， 1：411-9)中已经描述了泛素(Ub)和泛素类蛋白(Ubls)。SUMO系统也被 描述(Muller等(2001)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，2：202-10.)。SUMO(小 泛素相关修饰物)是一种Ubl，在公开文献中又被称作Sentrin、SMT3、 PIC1、GMP1和UBL1。在整个真核生物王国中都存在SUMO途径， 从酵母到人类SUMO蛋白都高度保守(Kim等(2002)J.Cell.Physiol.， 191：257-68)。虽然泛素和SUMO之间的全序列同源性仅有18％，但通 过核磁共振(NMR)进行的结构测定显示这两种蛋白拥有共同的三维结 构，特征为严密包裹的球状折叠，由β-片层包围α-螺旋(Bayer等 (1998)J.Mol.Biol.，280：275-86；Kim等(2000)J.Biol.Chem.，275： 14102-6)。SUMO陪伴性质的实验显示它附着在不稳定蛋白的N端， 能作为折叠的核，并保护蛋白免于聚集。
所有的SUMO基因都编码前体蛋白，前体蛋白具有短C末端序 列，该序列超出保守C末端Gly-Gly基序而延伸(Muller等(2001)Nat. Rev.Mol.Cell.Biol.，2：202-10)。该延伸序列长度有所变化并通常为 2-12氨基酸。在细胞内SUMO化(sumoylation)之前，SUMO蛋白 酶(也称为水解酶)除去C末端延伸(Coloma等(1992)J.Immunol. Methods，152：89-104)。将SUMO的C未端连接到目标蛋白赖氨酸残 基的ε-氨基叫做SUMO化。细胞蛋白的SUMO化被认为调节核转运、 信号转导、应力反应以及细胞周期进程(Kretz-Remy和Tanguay(1999) Biochem.Cell.Biol.Biol.，77：299-309)。很可能SUMO传导将蛋白易位 于不同细胞区室的信号，然而SUMO这种功能的准确的作用机制细节 不清楚。如果容许这两种蛋白修饰造成的不同作用，SUMO途径和泛 素途径之间的相似性是很显著的(Goettsch和Bayer(2002)Front. Biosci.，7：a148-62)。
NusA是另一种融合标签，可能由于它分子量大，能促进伙伴蛋 白的溶解(Davis等(1999)Biotecnol.Bioeng.，65：382-8)。谷胱甘肽S- 转移酶(GST)(Smith和Johnson(1988)Gene，67：31-40)和麦芽糖结合蛋 白(MBP)(diGuan等(1988)Gene，67：21-30)融合标签也被认为可增加融 合伙伴的表达和得率。然而使用GST时并非总会观察到增强表达，因 为它可形成二聚体并妨碍蛋白溶解。所有的这些融合系统的另一问题 是期望的蛋白可能必须从融合体中移除。为了规避这个问题，经常在 融合标签下游设计蛋白酶位点，如因子Xa、凝血酶、肠激酶或Tev 蛋白酶位点。然而因为蛋白酶识别的短的特异的氨基酸序列可能出现 在融合物/目标蛋白内，所以经常觉察到不恰当的切割(Jonasson等 (2002)Biotechnol.Appl.Biochem.，35：91-105)。本发明规避了这些问 题。而且，不像SUMO蛋白酶，Tev蛋白酶是一种序列特异的蛋白酶， 它在切割融合蛋白后会在所关心的蛋白的N未端留下不期望的序列。 相反，SUMO蛋白酶从SUMO C末端切割任何序列，从而在融合蛋白 中产生期望的N未端(除了脯氨酸)。
发明概述
依照本发明，提供工程SUMO蛋白，这种SUMO蛋白不能被野 生型SUMO蛋白酶切割。也提供编码该工程SUMO蛋白的核酸分子。 在一种特定方案中，工程SUMO是其中在SUMO蛋白酶相互作用结 构域中的至少一个精氨酸残基已被改变为另一种氨基酸，优选非碱性 氨基酸，的SUMO蛋白。在另一个实施方案中，工程SUMO蛋白包 含氨基酸序列X1FX2X3X4GX5X6(SEQ ID NO：2)，其中X1和X6是除了 精氨酸的任何氨基酸，X2、X3、X4和X5是任何氨基酸。在另一个实 施方案中，X1从谷氨酰胺、苏氨酸和苯丙氨酸中挑选，X6从亮氨酸 和谷氨酸中挑选。在又一个实施方案中，工程SUMO与SEQ ID NO：1 之间具有至少90％的同一性。
依照本发明，提供工程SUMO蛋白酶，该蛋白酶可以切割工程 SUMO蛋白。也提供编码该工程SUMO蛋白酶的核酸分子。在一种特 定实施方案中，工程SUMO蛋白酶是其中SUMO相互作用结构域已 被改变的SUMO蛋白酶。在一种更具体的实施方案中，工程SUMO 蛋白酶包含氨基酸序列WLNX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：6)，其中X1和 X5是任何非酸性氨基酸，X2、X3、X4和X5是任何氨基酸。在另一个 实施方案中，X1是丝氨酸；X2从甘氨酸和苏氨酸中挑选；X5从丝氨 酸、丙氨酸和甲硫氨酸中挑选。在又一个实施方案中，工程SUMO蛋 白酶与从SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中选出的氨 基酸序列具有至少90％的同源性。
依照本发明的另一个方面，提供在宿主细胞中增强所关心的蛋白 表达水平的方法。在一种特定实施方案中，这些方法包括i)将编码工 程SUMO的核酸可操作地连接到编码所关心的蛋白的核酸序列上，由 此产生编码融合蛋白的构建体，ii)将该核酸导入宿主细胞，从而在融 合蛋白中工程SUMO的存在增加了宿主细胞中所关心的蛋白的表达 水平。在一种特定实施方案中，该方法进一步包括分离融合蛋白并任 选地切割融合蛋白以释放所关心的蛋白。
依照本发明的另一个方面，提供了在宿主细胞中产生所关心的蛋 白中改变的氨基末端的方法。在一个特定实施方案中，这些方法包括 a)提供编码所关心的蛋白的核酸序列；b)在核酸中改变编码N末端氨 基酸的序列；c)将编码工程SUMO的核酸可操作地连接到编码所关心 的蛋白的核酸序列上；d)在宿主细胞中表达该核酸；和e)在宿主细胞 中表达能够切割工程SUMO的工程SUMO蛋白酶，由此该工程SUMO 蛋白酶切割工程SUMO，从而在细胞中生产具有改变的氨基末端的所 关心的蛋白。在一个特定实施方案中，该方法进一步包括具有改变的 氨基末端的所关心的蛋白的分离。
依照本发明的又一个的方面，提供了增强所关心的蛋白从宿主细 胞中分泌的水平的方法。在一个特定实施方案中，这些方法包括i)将 编码工程SUMO的核酸分子可操作地连接到编码所关心的蛋白的核 酸序列上，从而生成编码融合蛋白的构建体，和ii)将该核酸导入宿 主细胞，由此融合蛋白中工程SUMO的存在增强了所关心的蛋白从宿 主细胞的分泌。
也提供重组载体，包括编码工程SUMO的核酸分子，该核酸分子 可操作地连接于启动子和多克隆位点。在一种优选实施方案中，多克 隆位点允许克隆编码所关心的蛋白的核酸至编码工程SUMO的 Gly-Gly切割位点的核酸序列的3’。在一种特定实施方案中，重组载 体包含在试剂盒内，该试剂盒可进一步包括宿主细胞和用于基于寡核 苷酸位点定向诱变的试剂，所述诱变用于改变编码所关心的蛋白的核 酸以产生不同于天然所关心的蛋白的氨基末端。
在另一个实施方案中，提供了用于从宿主细胞中纯化蛋白的试剂 盒，包括i)重组载体，含有a)编码工程SUMO的核酸分子；b)启动子； c)多克隆位点；和任选地d)编码亲和标签的核酸序列；其中启动子可 操作地连接至编码工程SUMO的核酸分子上，其中如果有编码亲和标 签的核酸序列，则其是符合读框并可操作地连接至编码工程SUMO的 核酸分子上，并且其中多克隆位点允许克隆编码所关心的蛋白的核酸 至编码工程SUMO的Gly-Gly切割位点的核酸序列的3’；和ii)组合 物，包括工程SUMO蛋白酶或编码工程SUMO蛋白酶的载体，其中 工程SUMO蛋白酶在Gly-Gly切割位点之后特异地切割工程SUMO。 在一个特定实施方案中，该试剂盒可进一步地包括至少一种宿主细 胞、结合亲和标签的固体支持物、裂解缓冲剂、洗涤缓冲剂、洗脱缓 冲剂、切割缓冲剂和指导材料。
依照本发明的另一个方面，提供了包括融合蛋白的微阵列，该融 合蛋白包括与所关心的蛋白连接的工程SUMO蛋白。
附图说明
图1是示意图，说明与野生型SUMO和野生型SUMO蛋白酶相 比，工程SUMO标签(例如SUMO*)和相应的工程SUMO蛋白酶在 从原核和真核细胞中生产和纯化蛋白的潜在应用。
图2是考马斯染色的SDS-PAGE凝胶照片，显示了在细菌细胞中， 与未加标签的GFP相比SUMO*强烈地增加了它的融合伙伴(本实验中 为GFP)的表达量和溶解性，与野生型SUMO一样。U＝未诱导培养； I＝诱导培养；S＝可溶组分；IB＝不溶包含体。
图3A和3B是蛋白质印迹照片，显示SUMO*融合标签不会被酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的SUMO蛋白酶或昆虫细胞SUMO 蛋白酶所切割。图3A中，用表达GFP(泳道1和2)，SUMO-GFP(泳 道3和4)或SUMO*-GFP(泳道5和6)的构建体转化酵母。图3B中， 将SUMO*-GFP或SUMO-GFP在22℃孵育3小时，有(泳道1和2) 或无(泳道3和4)昆虫Sf9细胞提取物。蛋白用15％SDS-PAGE凝胶 分离，用抗GFP抗体检测。*＝GFP降解产物。
图4A和4B是Smt 3和ULP 1的晶体结构以及它们潜在的相互作 用。特别描述了SUMO中的两个残基(精氨酸64和精氨酸71)和ULP1 中的两个残基(谷氨酸455和天冬氨酸451)，这些残基是SUMO-ULP 1 的相互作用的部分。图4A和4B中显示了不同角度的视角。
图5是SUMO的区域图解，预测该区域与ULP 1相邻。在R64 和R71位的精氨酸是加亮的。提供了SEQ ID NO：66。
图6提供了相同凝胶的考马斯染色的SDS-PAGE(上栏)以及抗 Smt3的蛋白印迹(下栏)照片，显示了在体外野生型SUMO(Smt 3)被 ULP 1和SENP2(SUMO蛋白酶1和2)切割，但SUMO*(突变Smt3) 在体外不能被这些蛋白酶切割。
图7是一种实验系统的示意图，这种实验系统应用于可切割工程 SUMO的工程SUMO蛋白酶的筛选。在大肠杆菌中，只有当β-内酰 胺酶外排进入周质间隙时，才可赋予对氨苄青霉素的抗性。如图7A 所示，当β-内酰胺酶在N未端与SUMO和不溶蛋白连接时，它被捕 获在细胞内，细菌不能在含氨苄青霉素的平板上生长。除了β内酰胺 酶复合物之外，如果在细胞中再引入SUMO蛋白酶，SUMO蛋白酶可 将β-内酰胺酶释放出来并随后外泌进入周质，在那里它赋予对氨苄青 霉素的抗性(图7B)。如果在β-内酰胺酶上SUMO标签以某种方式突 变以至于它不能被野生型SUMO蛋白酶切割(例如，该SUMO为 SUMO*)，细胞变得对氨苄青霉素敏感(图7C)。只有当SUMO蛋白酶 以某一方式突变/改变而可以切割突变的SUMO*(图7D)，细菌细胞恢 复对氨苄青霉素的抗性。Insol.蛋白＝不溶蛋白；WT SUMO蛋白酶＝ 野生型SUMO蛋白酶；BLA＝β-内酰胺酶；SUMO*＝工程SUMO。
图8是体内β-内酰胺酶筛选的培养照片，显示当蛋白酶不能切割 包含SUMO的底物时大肠杆菌不能在氨苄青霉素上生长。为了诱导蛋 白酶，平板含有0.02％阿拉伯糖。
图9提供在野生型SUMO蛋白酶ULP1中区域的示意图以及某些 在突变时恢复针对SUMO*的酶活性的特异残基。提供了SEQ ID NO：24。
图10A-10D是考马斯染色的SDS-PAGE凝胶照片，显示SUMO* 蛋白酶有效地从具有GFP的融合蛋白上切割SUMO*，但ULP1不能 切割该SUMO*标签。斜面显示了蛋白酶滴定，其中每个连续的泳道 含有的蛋白酶是前一个泳道的二分之一。图10A表明ULP1切割SMT3 标签。图10B表明SUMO*蛋白酶1切割SUMO*标签。图10C表明 ULP1不能切割SUMO*标签。图10D显示SUMO*蛋白酶1切割野生 型SUMO，但是比切割SUMO*的效率低。U＝未切割的SUMO或 SUMO*-GFP(无蛋白酶存在)；P＝仅有蛋白酶的泳道，相同量蛋白酶被 用于第一次的切割反应。
图11A-11C提供了不同物种来源的SUMO蛋白序列。下划线区 域为与SUMO蛋白酶相互作用的区域。
图12A和12B提供不同物种来源的SUMO蛋白酶序列。下划线 区域为与SUMO蛋白相互作用的区域。
图13为考马斯染色SDS-PAGE凝胶的照片，显示在昆虫细胞中 加SUMO*标签的类胰蛋白酶与加6 x His标签的类胰蛋白酶相比被以 较高水平表达并不被切割。
图14为蛋白质印迹照片，显示在毕赤酵母细胞中，与加6 x His 标签的GzmB相比，加SUMO*标签的GzmB被以较高水平表达并分 泌并不被切割。
图15A为考马斯染色SDS-PAGE凝胶照片，显示在昆虫Sf9细胞 中SUMO*融合大大增加了异源表达的UBP43蛋白。箭头指示了未融 合或SUMO*融合的UBP43的大小。图15B提供蛋白质印迹的照片， 显示了在HEK 293T细胞中小鼠组X磷脂酶2A(mX PLA2；左栏)和 去泛素酶JOSD2(右栏)的表达。只有PLA2与SUMO*融合物被分泌 至培养基，而6xHis与野生型SUMO的融合物不被分泌。6xHis-PLA2 和彻底切割的SUMO-PLA2在细胞抽提物中刚刚能被检测到。箭头指 出了PLA2、切割后野生型SUMO和SUMO*-PLA2的预期大小。JOSD2 在细胞内表达并且SUMO*大大地增强它的表达。H＝6xHis； S＝SUMO；S*＝SUMO*。
图16提供了来自初始的小鼠sPLA2-X构建体(包括活性的(图16A) 和非活性的(图16B)形式)转染(HEK-293T)后48小时时的培养基 (15μl)蛋白质印迹的照片。以下五种N末端融合标签被测定：6xHis、 6xHis-CTHS、6xHis-SUMOmut、6xHis-SUMO和6xHis-hSUMO3。全 部构建载体也都包含了小鼠IgGκ分泌信号。结果代表了至少3次独 立实验。
图17提供来自修饰(revised)后的小鼠sPLA2-X构建体(包括非活 性(图17A)和活性(图17B)形式)在转染(HEK-293T)后48小时时的 培养基(15μl)蛋白质印迹的照片。以下7种N末端融合标签被测 定：6xHis、6xHis-SUMO、6xHis-SUMO mut、6xHis-hSUMO1、 6xHis-hSUMO1 mut、6xHis-hSUMO3和6xHis-hSUMO3 mut。全部构 建体包含小鼠IgGκ分泌信号。结果代表至少3次独立实验。
图18提供了sPLA2-IIC(图18A，细胞内组分)、IIE(图18B，培养 基(15μl))、III(培养基(15μl))和V(培养基(15μl))构建体转染(HEK -293T)后48小时时的蛋白质印迹照片。对每种sPLA2，通过使用突 变和野生型形式的三种SUMOs而进行比较，6xHis标签作为对照。全 部构建体包含小鼠IgGκ分泌信号。结果代表2-3次独立实验。
发明详述
本发明提供新型的工程SUMO蛋白，该蛋白不能被真核生物系统 中的野生型SUMO蛋白酶切割，以及其使用方法。实际上，为了利用 SUMO的表达增强性质，已经开发了新型的工程SUMO标签(例如， SUMO*)，这种标签在真核细胞中不会被切割。SUMO蛋白酶存在于 所有真核细胞。因此与本发明的工程SUMO蛋白相反，野生型SUMO 的融合物在真核细胞中表达时会被切割。值得注意的是，原核生物没 有SUMO途径或SUMO蛋白酶。因此，SUMO融合物(野生型或工程 的)在原核生物中表达时不会被切割。
同时提供可切割工程SUMO蛋白的新型工程SUMO蛋白酶。工 程SUMO蛋白和SUMO蛋白酶能完成融合至工程SUMO的所关心的 蛋白的表达和纯化，无论是在真核生物还是原核生物系统中(参见例如 图1)。该系统也允许产生具有期望的N末端的天然蛋白质。
人们可以生产重组蛋白，例如通过将生物的核酸序列插入进外源 的宿主生物中。该外源宿主从插入的核酸分子来合成重组蛋白质(所 关心的蛋白)。然后生产的蛋白一般在随后的纯化步骤中从该细胞中 分离。原核的、真核的、细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞都能够应 用于重组蛋白质的表达。人们已经开发出了蛋白“标签”，其中将DNA 序列插入到编码所关心的蛋白的区域之前或之后。产生的融合蛋白包 含了该标签和所关心的重组蛋白质。蛋白标签可以增强所关心的蛋白 的溶解性、正确折叠、表达水平和纯化能力。
在过去数年里已经开发了许多不同的蛋白标签来增强在细菌大 肠杆菌(E.coli)中的蛋白表达和溶解性。这些蛋白标签包括，不限于， GST(谷胱甘肽S-转移酶)、MBP(麦芽糖结合蛋白)、Thx(硫氧还蛋白)、 NusA、Ub(泛素)和SUMO。虽然这些标签在细菌中的使用成功，但 由于各种局限性，如异源蛋白的低表达量或在Ub或SUMO标签的情 况下由于内源性蛋白酶使得不能保持为融合蛋白，因而它们不能转移 至真核细胞。
SUMO蛋白作为融合伙伴无论在细菌和真核细胞中都可以大大地 增强重组蛋白质的表达水平和质量(参见例如美国专利7060461；美国 专利申请公开Nos.20040018591和20060040335；以及PCT/US 04/20778)。SUMO家族的蛋白在真核生物蛋白上可以作为细胞调控的 一部分天然地加入和除去。SUMO的结构和SUMO蛋白加上和除去的 过程在真核细胞中高度保守。SUMO蛋白中高度的的结构保守性引起 SUMO融合标签与外源宿主的内源性SUMO修饰酶类的物种间交叉 反应。真核细胞因此能切割SUMO标签并在很多情况里这导致了标签 和重组蛋白质的分离。从真核细胞中表达并纯化“未切割的”或未加工 的野生型SUMO融合蛋白经常是不可能的。为了在真核细胞中克服这 种“成熟前”标签切割的障碍而实现增加蛋白产量，新型的SUMO蛋白 被设计出来以抵抗内源性SUMO蛋白酶。
当前的发现解决了蛋白表达领域的至少四个主要问题。第一，如 在上文所述，由于真核细胞中天然存在的水解酶瞬时切割融合键而使 在真核细胞中使用SUMO、Ub和其它类泛素蛋白融合物受到限制。 因为这种切割作用，亲和标签需放于SUMO-水解酶的切割位点之后 或在过客蛋白的C末端以帮助纯化所关心的蛋白。如果为了融合蛋白 的后续应用而需除去该亲和标签，那必须设计蛋白酶位点。在此提出 的系统解决了SUMO标签仅使用于原核系统的局限，因此允许在所有 系统包括真核生物系统中使用本发明的突变SUMO蛋白或附着于突 变SUMO蛋白氨基端的亲和标签来用于亲和纯化融合蛋白。在此提供 的工程SUMO蛋白酶在体外或体内都可有效地除去该标签。
第二，许多蛋白在真核和原核细胞中不稳定或弱表达。与未融合 的蛋白对应物比较(例如见图3A)，甚至与融合于野生型SUMO的蛋 白比较(例如见实施例4)，与工程SUMO蛋白融合可使蛋白表达明显 升高。另外，如下文所述，与工程SUMO蛋白融合可以有利于所关心 的蛋白相对于未融合的蛋白或甚至与野生型SUMO融合的蛋白更高 水平地分泌。附着SUMOP分子到所关心的蛋白也可以使蛋白稳定。
第三，某些蛋白对细胞来说有毒性，特别是在异源表达时。附着 SUMO到这些毒性蛋白可以降低或除去该蛋白的毒性并允许更大地 和持续地表达以前难于表达的毒性蛋白。例如，在蛋白的氨基未端存 在SUMO分子可以抑制定位于该蛋白区域的该蛋白的任何毒性。实际 上，如下文实施例4所示，当与工程SUMO融合时，蛋白PLA2，其 对细胞是有毒/致死的并且需要游离的N未端以表现活性，可以在真 核细胞中高水平表达。在表达和纯化时，SUMO分子可从有毒蛋白上 切割下来，从而回复其毒性和/或活性。
第四，在原核细胞中表达的各种融合物可以在体外或体内被切割 而产生新的N未端，这是至今不能产生的，因为自然开始的蛋白质合 成只能从甲硫氨酸开始。该系统的这个特征对于那些需要特殊N末端 来维持生理和生化活性的蛋白(例如RNA-聚合酶，蛋白酶和细胞因子) 是特别有用的。
I.定义
提供以下定义以利于对本发明的理解：
在此使用的“核酸”或“核酸分子”指任何DNA或RNA分子，包括 单链或双链，如果是单链，其互补序列分子可以是线型或环型。在讨 论核酸分子时，在此可能根据从5′至3′方向提供序列的正常习惯描述 特定核酸分子的序列或结构。关于本发明的核酸，有时使用术语″分 离的核酸″。该术语当用于DNA时，指与在它来源生物的天然存在基 因组中与之直接相邻的序列分离的DNA分子。例如，“分离的核酸” 可以包括插入载体，比如质粒或病毒载体，或整合进入原核或真核细 胞或宿主生物体的基因组DNA中的DNA分子。
当应用于RNA，术语“分离的核酸”可以指由上文定义的分离的 DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语也可以指已经充分地与其 它核酸分离的RNA分子，所述其它核酸是所述RNA分子在它的自然 状态下(细胞或组织中)与其联合在一起的。分离的核酸(无论DNA或 RNA)可以进一步代表直接用生物学或合成方法生产并与其它在它的 生产过程中出现的组分分离的分子。
关于单链核酸，特别是寡核苷酸，术语“特异杂交”指两条具有充 分互补序列的单链核苷酸分子之间的结合，这种充分互补序列允许在 本领域常规使用的预定条件下实现杂交(有时又叫做“基本互补”)。特 别地，该术语指寡核苷酸与包含在本发明单链DNA分子中的基本互 补序列之间的杂交，以基本排除该寡核苷酸与非互补序列的单链核酸 的杂交。能进行不同互补性单链核酸分子特异杂交的适当条件为本领 域人员所熟知。
例如，一种计算具有特定序列同源性的核酸分子之间杂交所需的 严格条件的通用方程式列在下面(Sambrook等，1989)：
Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/双链体中的#bp
如以上方程式所述，使用[Na+]＝[0.368]和50％甲酰胺，42％GC 含量以及平均探针大小200碱基，Tm是57℃。同源性每减少1％， DNA双链体的Tm降低1-1.5℃。因此，使用42℃杂交温度时具有大 于约75％序列同一性的靶标将被观察到。例如，按照Sambrook等的 方法，使用含5 X SSC，5 X Denhardt’s试剂，1.0％SDS，100μg/ml 变性的鲑精DNA片段，0.05％焦磷酸钠和最高至50％甲酰胺的杂交液 可以完成杂交。杂交在37-42℃下进行至少6小时。杂交后，按以下 步骤洗涤滤器：(1)室温下，在2 X SSC和1％SDS中5分钟；(2)室温下， 在2 X SSC和0.1％SDS中15分钟；(3)37℃下，在1 X SSC和1％SDS 中30分钟-1小时；(4)42-65℃下，在1XSSC和1％SDS中2小时， 每30分钟更换溶液。
杂交和洗涤的严格性主要依赖于溶液的盐浓度和温度。通常为了 使探针与它的靶标退火率最大，杂交通常在盐和低于计算的杂合体 Tm值20-25℃的温度条件下进行。洗涤条件应该尽可能严格以达到 探针对靶标的同一性程度。通常，洗涤条件选择低于杂合体Tm值大 约12-20℃。至于本发明的核酸，中度严格性的杂交被确定为在 6XSSC，5XDenhardt’s溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中 42℃杂交并在2XSSC和0.5％SDS，55℃洗涤15分钟。高严格性的 杂交被确定为在6XSSC，5X Denhardt’s溶液，0.5％SDS和100μg/ml 变性鲑精DNA中42℃杂交并在1X SSC和0.5％SDS中65℃洗涤15 分钟。很高严格性的杂交被确定为在6X SSC，5XDenhardt’s溶液， 0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中42℃杂交并在0.1XSSC和 0.5％SDS中于65℃洗涤15分钟。
在此使用的术语“探针”指寡核苷酸、多核苷酸或DNA分子，不 论是天然存在的，如用纯化的限制性酶消化获得，或人工生产的，这 种探针能和与之序列互补的核酸退火或特异杂交。探针可以是单链也 可以是双链。探针的准确长度将依赖许多因素，包括温度、探针的来 源和使用的方法。例如，虽然核苷酸探针可以包含更少的核苷酸，但 对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸探针一般包含15-25 或更多的核苷酸。在此选取的探针是为了与特定靶核酸序列的不同链 互补。意思是探针必须有充分的互补性以致于能在一套预先确定的条 件下“特异地杂交”它们相应的靶链或与它们相应的靶链退火。因此探 针序列无须反映靶的准确互补序列。例如非互补的核苷酸片段可以连 于探针的5’或3’末端，而探针序列的其余部分是与靶链互补的。或者， 假如探针序列与靶核酸序列有足够的互补性以至于能与之特异性地 退火，非互补碱基或更长的序列可以散布于探针中。
在此使用的术语“引物”指DNA寡核苷酸，单链或者双链，来源 于生物系统，用限制性酶消化产生，或人工生产，当引物被置于合适 的情况中时，能作为模板依赖的核酸合成作用的功能性启动物。当与 适当的核酸模板，适当的核酸的三磷酸核苷前体、聚合酶、适当的辅 因子和条件如适当的温度和pH值共存时，引物可以通过聚合酶或类 似活性的作用下在它的3’未端加上核苷酸而延伸以得到引物延伸产 物。根据本申请的特定条件和要求，引物可以有不同的长度。例如， 在诊断应用中，寡核苷酸引物长度一般为15-25或更多的核苷酸。引 物必须与期望模板有足够的互补性以启动期望延伸产物的合成，亦即 能与期望模板链以足以在适当的毗邻位置提供引物的3’羟基部分的 方式退火，以用于通过聚合酶或类似酶的合成的启动。并不需要引物 序列为期望模板的准确互补序列。例如，非互补的核苷酸序列可以连 接于其他方面互补的引物的5’末端。或者，假如引物序列与期望模板 链序列具有足够的互补性以能功能性地提供用于合成延伸产物的模 板-引物复合物，非-互补碱基可以散布于寡核苷酸引物序列之中。
“互补DNA(cDNA)”是单链DNA分子，通过逆转录酶从mRNA 模板形成。一般来说，用与mRNA的部分互补的引物来启动逆转录。 术语“cDNA”也可以指双链DNA分子，其由这种单链DNA分子和它 的互补DNA链组成。术语“cDNA”也可以指从RNA模板合成的 cDNA分子的克隆。
聚合酶链式反应(PCR)在美国专利Nos：4683195，4800195和 4965188中已有描述，它们全文通过援引并入本文。
术语“相似性百分比”、“同一性百分比”和“同源性百分比”当指特 定序列时，按威斯康星大学GCG软件程序的阐述进行使用。
在此使用的术语“功能性的”意思是核酸或氨基酸序列对于所述的 检验或目的是功能性的。
核酸特定序列的“天然等位变异体”，“突变体”和“衍生体”指与特 定序列紧密相关的核酸序列但可能在序列或结构中具有天然地或人 为设计的变化。通过紧密相关，表示至少大约75％，但通常超过90％ 的序列的核苷酸与用特定SEQ ID NO指代的核酸序列的限定长度相 匹配。紧密相关核酸序列之间的核苷酸序列变化或差异可代表在特定 核酸序列天然的正常复制(replication)或倍增(duplication)过程中 出现的序列中的核苷酸改变。其它的变化可以被特异设计并为了达到 特定的目的引入序列，以致在核酸的调控区域改变氨基酸密码子或序 列。这种特异改变可以在体外用多种的突变技术产生或者将宿主生物 体放在诱导或选择该变化的特定选择条件下而产生。这种特异产生的 序列变异体可以被称为原始序列的“突变体”或“衍生体”。
短语“基本由......组成”当指特定核苷酸或氨基酸时，意思是具有 指定SEQ ID NO性质的序列。当用于指氨基酸序列时，该短语包括序 列本身和分子修饰，这种分子修饰不会影响该序列基本的和新的特 征。
在此使用的术语“复数的启动子”或“启动子”指DNA序列，这种 DNA序列的位置邻接于编码重组产物的DNA序列。启动子优选可操 作地连接于相邻的DNA序列。与没有启动子存在时表达的重组产物 的量相比，启动子一般能增加DNA序列表达的重组产物的量。来自 生物体的启动子可被用于增加来源于另一种生物体的DNA序列的重 组产物表达。例如，脊椎动物启动子可以用于水母GFP在脊椎动物中 的表达。此外，对于多重串接的DNA序列，启动子元件可提高重组 表达产物的量。因此，启动子元件可增强一种或更多种重组产物的表 达。多种启动子元件已为本领域普通的技术人员所熟知。
在此使用的术语“复数的增强子”或“增强子”指DNA序列，该DNA 序列的位置与编码重组产物的DNA序列毗连。增强子元件一般定位 于启动子元件的上游或定位于编码DNA序列的下游或之内(例如，转 录或翻译成为重组产物的DNA序列)。因此，增强子元件可位于编码 重组产物DNA序列上游或下游100碱基对、200碱基对或300或更多 碱基对处。增强子元件可将从DNA序列表达的重组产物量升高到超 过启动子元件带来的升高的表达。本领域普通技术人员可容易地利用 多种增强子元件。
在此使用的术语“转染的”和“转染”是指将外源性DNA导入细胞 的方法。这些方法涉及多种技术，如用高浓度盐、电场、脂质体、多 聚阳离子微团或去污剂处理细胞，以使得宿主细胞外膜或壁对于所关 心的核酸分子是可渗透的。这些特定方法并不受限制，并且本发明涉 及本领域普通技术人员熟知的任何转化技术。
“复制子”是指任何遗传元件，例如，质粒、粘粒、杆粒、噬菌体 或病毒，其能在自身控制下大量复制。复制子可以是RNA或DNA， 可以是单链或双链。
“载体”是复制子，如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒，另外的 基因序列或元件(DNA或RNA)可以连接于载体上，而使连接序列或 元件得到复制。
“表达操纵子”指核酸片段，该核酸片段可能具有转录和翻译控制 序列，如启动子、增强子、翻译起始信号(例如ATG或AUG密码子)、 聚腺苷酸化信号、终止子等等，这些表达操纵子有利于多肽编码序列 在宿主细胞或生物体中的表达。
在此使用的术语“寡核苷酸”指本发明中的序列、引物和探针，并 定义为由两个或更多核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成，优选超过三 个。寡核苷酸的确切大小将取决于多种因素以及寡核苷酸的特定应用 和用途。
术语“基本纯”指包括按重量计算至少50-60％给定物质的制剂(例 如，核酸、寡核苷酸、蛋白等等)。更优选地，该制剂包括至少75％ 以及最优选90-95％比重的给定化合物。纯度用适合于给定化合物的方 法进行测定(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析 等等)。
术语“基因”指包括编码多肽的开放阅读框的核酸，包括外显子以 及(任选)内含子序列。该核酸也可任选包括非编码序列如启动子或增 强子序列。术语″内含子″指存在于给定基因的DNA序列，该序列不 会被翻译成蛋白并通常的发现在外显子之间。
在此使用的短语“可操作连接的”，可以指与另一段核酸序列形成 功能关系的核酸序列。可操作连接的核酸序列实例包括，但不局限于， 启动子、切割位点、纯化标签、转录终止子、增强子或活化子以及异 源基因，当转录并如果适合的话翻译时，其可生产功能性产物如蛋白、 核糖酶或RNA分子。短语“可操作连接的”也可以指例如编码所关心 的蛋白的核酸序列，这种核酸序列与编码Ubl羧基末端结构域的核酸 形成功能关系，这样在蛋白质形成中Ubl羧基末端结构域的催化切割 活性能使所关心的蛋白释放出来。
短语“固体支持物”指任何固体表面包括，但不局限，任何芯片(例 如基于硅石的、玻璃的或金的芯片)、玻片、膜、珠、固体颗粒(例如 琼脂糖、sepharose、聚苯乙烯或磁珠)、柱子(或柱材料)、试管或微量 滴定盘。
短语“亲和标签”、“纯化标签”以及“表位标签”都可以指可用于影 响所关心的蛋白纯化的标签。纯化/亲合/表位标签为该领域人员所熟 知(见Sambrook等，2001，分子克隆，冷泉港实验室)，包括但不局限 于：多组氨酸标签(例如6xHis)、多精氨酸标签、谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、S标签、流感病毒HA标签、硫氧还 蛋白、葡萄球菌蛋白A标签、FLAGTM表位，AviTag表位(用于随后 的生物素化)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、抗体表位(例如被抗体识别并 结合的氨基酸序列)、C-myc表位以及血红素结合肽。
在此使用的术语“有毒蛋白”指在宿主细胞中表达时引起细胞死亡 或抑制细胞生长的蛋白。
在此使用的“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何表达介质， 指导材料可用于传达本发明组合物用于实施本发明的方法的有用性。 例如，本发明试剂盒的指导材料可附加于包含本发明试剂盒的容器上 以便与包含试剂盒的容器一起运输。或者，为了指导材料与试剂盒可 为使用者协作使用，指导材料可与容器分开运输。
在此使用的术语“修饰的”“工程的”或“突变的”指改变的多核苷酸 或氨基酸序列。在一种实施方案中，编码SUMO或SUMO蛋白酶的 多核苷酸序列通过导入一个或更多个突变，特别是位点定向突变，而 被修饰/工程化/突变。另外，包括至少一个突变的突变多聚核苷酸库 也可以利用随机诱变或DNA改组(shuffling)技术来制备。在一种特 定实施方案中，随机诱变被限制于多核苷酸的期望区域，特别是被认 为是编码负责SUMO和SUMO蛋白酶相互作用的氨基酸的区域。常 规的诱变技术在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.等 eds.，John Wiley(2006)和美国专利5605793；5811238；5830721； 5834252和5837458中进行了描述。在此使用的“突变”或“改变”指与 天然存在或正常核苷酸或氨基酸序列相比，在基因的核苷酸或氨基酸 序列中的变化。突变可以是由于至少一个核苷酸或氨基酸的缺失、插 入或取代引起。在一种优选实施方案中，突变是取代，即用不同的核 苷酸或氨基酸残基替代至少一个核苷酸或氨基酸。
在此使用的术语“结构域”意思是蛋白或多肽的功能部分、节段或 区域。“相互作用结构域”专门指蛋白、多肽或蛋白片段的部分、节段 或区域，它是造成该蛋白、蛋白片段或分离的结构域对于另一种蛋白、 蛋白片段或分离的结构域的物理亲合力的原因。在蛋白的一级序列 中，相互作用结构域可以是连续的氨基酸残基，也可以由在一级序列 互相不接近，但是会通过肽链三级折叠聚在一起的肽链部分的氨基酸 残基组成。
在此使用的术语“多克隆位点”或“多接头”指人为生成的核苷酸序 列，该核苷酸序列包括至少一个限制性位点以将核酸片段克隆入另一 核酸，如载体之中。
II.工程SUMO蛋白
本发明包括了不能被SUMO蛋白酶(例如Ulp 1)切割的SUMO蛋 白。该SUMO可来自于任何真核生物物种或为任何SUMO分子的突 变形式。在一种特定实施方案中，SUMO来源于酵母或人。与酵母相 对，在脊椎动物中，迄今已描述了SUMO的四个成员：SUMO-1和接 近的同系物SUMO-2、SUMO-3和SUMO-4。本发明包括了所有的这 些脊椎动物SUMO蛋白。SUMO蛋白的实施例在图11A-11C中提供。 编码人SUMO蛋白的核酸序列的实施例也在GenBank登录号NM_ 003352.4(SUMO1)、NM_001005781.1(SUMO1)、NM_001005782.1 (SUMO1)、NM_006937.3(SUMO2)、NM_001005849.1(SUMO2)、 NM_006936.2(SUMO3)和NM_001002255.1(SUMO4)中提供。
在一种特定实施方案中，本发明的工程SUMO蛋白仅能被SUMO 蛋白酶切割小于10％，而该酶在相同的的反应条件(例如标准体外切割 实验或在真核细胞中表达)下可切割至少90％，优选至少95％，更优 选至少99％以及更优选100％的野生型SUMO。在一种更优选实施方 案中，工程SUMO会被切割小于5％，优选小于1％，更优选小于0.1％， 甚至0％或低于检测水平。如下文所讨论，工程SUMO蛋白可以被工 程SUMO蛋白酶切割。
工程SUMO蛋白可以通过改变或转变至少一个与SUMO蛋白酶 相互接触或互相作用的残基而产生。该残基可以被改变为任何其它的 20种天然氨基酸或改变为合成或修饰的氨基酸(参见例如MPEP §2422表4)。该变化可以为保守的或非保守的。保守的变化是用拥 有类似性质的氨基酸替代。例如天冬氨酸和谷氨酸都是酸性氨基酸； 赖氨酸、精氨酸和组氨酸是碱性氨基酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨 酸、苏氨酸和酪氨酸具有无电荷的极性侧链；丙氨酸、甘氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半 胱氨酸具有无极性的侧链；丙氨酸、甘氨酸和亮氨酸是小氨基酸；苯 丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有大的芳香族侧链；苯丙氨酸、酪氨酸、 色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸基和苏氨酸具有大的无电荷侧链。因此， 用谷氨酸替代天冬氨酸可以被认为是保守的变化，用组氨酸替代天冬 氨酸则不能认为是保守改变。
在一种特定实施方案中，造成的改变在与SUMO蛋白酶互相作用 的区域之内。如图11所示，与SUMO蛋白酶相互作用的SUMO区域 通常在从大约残基53到大约残基72的区域之内。例如对于酵母 SUMO(Smt3)该区域为从大约残基63到残基72。在一种特定实施方案 中，改变至少一个精氨酸残基，优选两个精氨酸残基(或更多，如果有 的话)(例如在Smt 3中，在SUMO蛋白酶相互作用结构域中的精氨 酸残基位于64和71位)。在一种优选实施方案中，精氨酸残基被改 变为非碱性氨基酸。在一种特定实施方案中，在64位的精氨酸被改 变为苏氨酸以及在7 1位的精氨酸被改变为谷氨酸。该构建体是 SUMO*，具有以下的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：
Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro
1 5 10 15
Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser
20 25 30
Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu
35 40 45
Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr
50 55 60
Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp
65 70 75 80
Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile
85 90 95
Gly Gly
在另一个实施方案中，本发明的工程SUMO与SEQ ID NO：1具 有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性， 特别是至少90％或95％同源性。在一种特定实施方案中，64和71位 的残基都不是精氨酸。
在另一个实施方案中，本发明的工程SUMO是SUMO蛋白(例如 酵母SUMO(Smt 3)或人SUMO1)，这种蛋白被改变以包括序列(SUMO 蛋白酶相互作用结构域)：
X1FX2X3X4GX5X6 (SEQ ID NO：2)
其中X1和X6是除了精氨酸的任何氨基酸，X2、X3、X4和X5是任何 氨基酸并可以是野生型(即未突变的)。在一种特定实施方案中，X1 和X6是任何非碱性氨基酸。在一种优选实施方案中，X2是L或R； X3是F、W或Y，X4是D或E；X5是I、Q或R。在一种特定实施方 案中，X1是在谷氨酰胺、苏氨酸和苯丙氨酸之中选择，和/或X6是在 71位的亮氨基酸和谷氨酸之中选择。
在另一个实施方案中，本发明的工程SUMO是SUMO蛋白(例如 人SUMO2，SUMO3和SUMO4)，这种蛋白被改变以包括序列(SUMO 蛋白酶相互作用结构域)：
X1FX2F (SEQ ID NO：65)
其中X1和X2是除了精氨酸的任何氨基酸。在一种特定实施方案中， X1和X2是任何非-碱性氨基酸。在一种特别的实施方案中，X1是具 有无电荷侧链的氨基酸，特别是苏氨酸，X2是酸性氨基酸，特别是谷 氨酸。
优选地，工程SUMO蛋白保留了至少一种野生型SUMO的性质。 例如，优选地该工程SUMO与野生型SUMO一样或更好地增加融合 的所关心的蛋白的表达量。该工程SUMO也可以提高所关心的蛋白的 分泌和/或溶解性，和/或改变融合的所关心的蛋白的细胞定位。
本发明也包括了编码不能被切割的SUMO蛋白的核酸分子。编码 本发明工程SUMO的核酸分子可以通过任何该领域已知的方法制备。 该核酸分子可以在任何方便的载体中保存，特别是表达载体。根据表 达核酸的宿主细胞，可应用不同的启动子以驱动该核酸序列的表达。 这些载体也包含抗生素抗性标识物以能够选择转化细胞。本发明编码 工程SUMO的核酸分子包括cDNA、DNA、RNA和其片段，这些分 子可以是单链或双链。本发明也包括引物、寡核苷酸、探针、反义分 子和siRNA分子，其定向于(directed to)编码工程SUMO蛋白的核酸 分子或与之杂交，优选定向于从野生型序列突变的区域，这样相对于 野生型SUMO它们能优先或排他地与突变SUMO杂交。
本发明也包含能够免疫特异地结合工程SUMO蛋白的抗体。定向 于工程SUMO的多克隆和单克隆抗体可以按照标准方法制备。在一种 优选实施方案中，相对于野生型SUMO，该抗体与突变的不可切割的 SUMO的改变区域进行免疫特异性地反应。与突变的不可切割的 SUMO蛋白进行免疫特异性作用的多克隆或单克隆抗体能被应用于 鉴定和纯化这些蛋白。抗体可以是对工程SUMO具有免疫特异性而排 除了野生型SUMO或者可以具有对两者的交叉反应性。
本发明的工程SUMO蛋白也可以被翻译后修饰。工程SUMO蛋 白可以在细胞中或体外进行翻译后修饰。氨基酸的翻译后修饰(PTM) 可改变蛋白的结构、活性、功能和稳定性。PTMs通常包括添加生化 官能团如，但不局限于，乙酸酯、磷酸酯、脂类和糖类到蛋白的氨基 酸上。蛋白的翻译后修饰方法可以通过变更蛋白氨基酸序列而改变。 例如变更蛋白的氨基酸序列而使之含有Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列 可以使天冬酰胺被糖基化。
PTMs包括，但不局限于，乙酰化(添加乙酰基，通常在蛋白的N 末端)、烷化(添加烷基(例如甲基、乙基))、甲基化(添加甲基，通常加 在赖氨酸或精氨酸残基上)、生物素化(保守的赖氨酸残基与生物素附 加物的酰化)、谷氨酰化(共价连接谷氨酸残基到微管蛋白或其它蛋 白)、甘氨酰化(共价连接至少一个甘氨酸残基到微管蛋白C末端的尾 部)，糖基化(添加糖基基团至天冬酰胺、羟基赖氨酸、丝氨酸或苏氨 酸上，从而产生糖蛋白)、异戊二烯化(添加类异戊二烯基团(例如金合 欢醇和牻牛儿基牻牛儿醇(geranylgeraniol)))、脂化(添加脂类)、 硫辛酰化(lipoylation)(连接硫辛酸酯(lipoate)官能团)、磷酸泛 酰巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)(添加源于辅酶A的4′-磷酸 泛酰巯基乙胺(phosphopantetheinyl)部分，如在脂肪酸、聚酮化合物、 非核醣体多肽和亮氨基酸生物合成中)、磷酸化(添加磷酸酯基，通常 到丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸上)，硫酸化(添加硫酸酯基到酪 氨酸)、硒酸化和C末端酰胺化。翻译后修饰为本领域技术人员所熟 知(见例如Creighton，T.E.，蛋白-结构和分子性质.第二版，W.H. Freeman和Company，纽约，1993；Wold，F.，蛋白的翻译后共价修 饰，Academic Press，纽约.1983；Seifter等，“蛋白质修饰和非蛋白质 辅因子的分析”(1990)Meth.Enymol.，182：626-646；以及Rattan等“蛋 白质合成：翻译后修饰和老化”(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.，663：48-62)。
本发明的工程SUMO蛋白可以包括至少一个亲和标签，优选在氨 基未端。在一个特定实施方案中，亲和标签是血红素结合肽。全长细 胞色素C(CYC7，Gen Bank登录号AAA34940)一旦与血红素辅因子结 合就具有过氧化物酶活性(Sander C.C型细胞色素的转运和成熟。Ph.D. 学位论文。2001.Osnabrueck大学，德国)。包含细胞色素C，如CYC7， 的血红素结合基序的肽可作为本发明工程SUMO蛋白或任何所关心 的蛋白的亲和标签。示范性的血红素结合肽包括血红素结合基序 CQQCH(SEQ ID NO：63)。血红素结合肽的特定实施例是 GSAKKGATLFKTRCQQCH(SEQ ID NO：64)。血红素结合肽可以为大 约5至大约50个氨基酸的长度，优选大约5至大约25个氨基酸长度， 更优选大约5至大约20个氨基酸长度，以及更优选大约5至大约15 个氨基酸。血红素结合肽具有过氧化物酶活性。值得注意的是，将该 肽进行变性SDS-PAGE分析以及印迹到膜时，其活性不会被破坏。因 此，该亲和标签可以不用抗体检测而仅使用过氧化物酶底物。另外， 血红素结合肽引起共价结合的所关心的蛋白变红，使之在纯化过程中 容易检测和跟踪。血红素结合肽对于细胞色素裂解酶(CYC3，例如， GenBank登录号AAC 04992.1)具有很高的结合亲合力。CYC3可以固 定在固体表面并用作纯化包含血红素结合肽的蛋白的亲合树脂。
III工程SUMO蛋白酶
本发明也包含工程SUMO蛋白酶，该蛋白酶可切割不能被野生型 SUMO蛋白酶切割的工程SUMO蛋白。SUMO蛋白酶可来自于任何 真核生物物种。在一种特定实施方案中，SUMO蛋白酶与期望被切割 的工程SUMO来自相同的物种。SUMO蛋白酶的实例包括ULP 1和 SENP1至5以及图12A-12B中提供的某些氨基酸序列。
在一种特定实施方案中，本发明的工程SUMO蛋白酶可切割至少 50％，优选至少75％，90％，或95％，更优选至少99％以及更优选100％ 的工程SUMO。
工程SUMO蛋白酶可以通过变更或转变至少一个与野生型 SUMO或工程SUMO接触或互相作用的残基而产生。该残基可以被改 变至任何另外的20个天然氨基酸或改变为合成或修饰的氨基酸。该 变化可以是保守的或非保守的。
在一种特定实施方案中，是在SUMO蛋白酶的SUMO相互作用 结构域之内进行改变(参见例如图12)。例如，酵母ULP1的SUMO相 互作用结构域大约对应于残基446至460，更优选大约451至455。 在一种特定实施方案中，残基451、452以及455中的至少一个被改 变。优选地，至少残基451和455被改变，更优选所有的三个氨基酸 都被改变。特别地，451位天冬氨酸被改变为丝氨酸，452位的苏氨 酸残基被改变成甘氨酸以及455位的谷氨酸残基被改变为丝氨酸。该 构建体具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：
1 MSVEVDKHRN TLQYHKKNPY SPLFSPISTY RCYPRVLNNP SESRRSASFS GIYKKRTNTS
61 RFNYLNDRRV LSMEESMKDG SDRASKAGFI GGIRETLWNS GKYLWHTFVK NEPRNFDGSE
121 VEASGNSDVE SRSSGSRSSD VPYGLRENYS SDTRKHKFDT STWALPNKRR RIESEGVGTP
181 STSPISSLAS QKSNCDSDNS ITFSRDPFGW NKWKTSAIGS NSENNTSDQK NSYDRRQYGT
241 AFIRKKKVAK QNINNTKLVS RAQSEEVTYL RQIFNGEYKV PKILKEERER QLKLMDMDKE
301 KDTGLKKSII DLTEKIKTIL IENNKNRLQT RNENDDDLVF VKEKKISSLE RKHKDYLNQK
361 LKFDRSILEF EKDFKRYNEI LNERKKIQED LKKKKEQLAK KKLVPELNEK DDDQVQKALA
421 SRENTQLMNR DNIEITVRDF KTLAPRRWLN SGIISFFMKY IEKSTPNTVA FNSFFYTNLS
481 ERGYQGVRRW MKRKKTQIDK LDKIFTPINL NQSHWALGII DLKKKTIGYV DSLSNGPNAM
541 SFAILTDLQK YVMEESKHTI GEDFDLIHLD CPQQPNGYDC GIYVCMNTLY GSADAPLDFD
601 YKDAIRMRRF IAHLILTDAL K
在一种特定实施方案中，SUMO蛋白酶可能具有氨基未端或在其之内 的缺失(例如，最多至并包括残基402)。截短的SUMO蛋白酶的氨基 酸序列例子是(SEQ ID NO：4)：
401 MGLVPELNEK DDDQVQKALA
421 SRENTQLMNR DNIEITVRDF KTLAPRRWLN SGIISFFMKY IEKSTPNTVA FNSFFYTNLS
481 ERGYQGVRRW MKRKKTQIDK LDKIFTPINL NQSHWALGII DLKKKTIGYV DSLSNGPNAM
541 SFAILTDLQK YVMEESKHTI GEDFDLIHLD CPQQPNGYDC GIYVCMNTLY GSADAPLDFD
601 YKDAIRMRRF IAHLILTDAL K
SUMO*蛋白酶1是具有6x组氨酸标签的截短的SUMO蛋白酶，具有 氨基酸序列(SEQ ID NO：5)：
401 MGLVPELNEK DDDQVQKALA
421 SRENTQLMNR DNIEITVRDF KTLAPRRWLN SGIISFFMKY IEKSTPNTVA FNSFFYTNLS
481 ERGYQGVRRW MKRKKTQIDK LDKIFTPINL NQSHWALGII DLKKKTIGYV DSLSNGPNAM
541 SFAILTDLQK YVMEESKHTI GEDFDLIHLD CPQQPNGYDC GIYVCMNTLY GSADAPLDFD
601 YKDAIRMRRF IAHLILTDAL KLEHHHHHH
在另一个实施方案中，本发明的工程SUMO蛋白酶与SEQ ID NO：3、4或5具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或 100％的同源性，特别至少有90％或95％的同源性。在一种特定实施 方案中，451位的残基不是天冬氨酸，更优选不是酸性氨基酸；455 位的残基不是谷氨酸，更优选不是酸性氨基酸；并且任选地，452位 的残基不是苏氨酸。
在另一个实施方案中，本发明的工程SUMO蛋白酶是已经被工程 化而包括以下序列的SUMO蛋白酶：
WLNX1X2X3X4X5(SEQ ID NO：6)
其中X1和X5是任何非酸性氨基酸，X2、X3和X4被任何氨基酸并可 以是野生型(即未突变的)。在一种特定实施方案中，X1是无电荷的 极性侧链氨基酸、非极性侧链氨基酸或小氨基酸。X5可以是无电荷极 性侧链氨基酸、非极性侧链氨基酸或小氨基酸。在另一个实施方案中， X3是I或V，X4是I或T。在一种特定实施方案中，X1是丝氨酸；X2 选自甘氨酸和苏氨酸；和/或X5从丝氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸中选择。
本发明也包括了编码工程SUMO蛋白酶的核酸分子。编码本发明 工程SUMO蛋白酶的核酸分子可以通过任何该领域已知的方法制备。 该核酸分子可以在任何方便的载体中保存，特别是表达载体。根据表 达核酸的宿主细胞，可应用不同的启动子以驱动该核酸序列的表达。 这些载体中也包含抗生素抗性标识物以能够选择转化细胞。本发明编 码工程SUMO蛋白酶的核酸分子包括cDNA、DNA、RNA和其片段， 这些核酸可以是单链或双链的。本发明也包括定向于编码工程SUMO 蛋白酶的核酸分子或与之杂交的引物、寡核苷酸、探针、反义分子和 siRNA分子，优选定向于从野生型序列突变的区域，这样该核酸分子 与野生型SUMO蛋白酶相比优先或排他地结合工程SUMO蛋白酶。
本发明也包含能够免疫特异结合工程SUMO蛋白酶的抗体。定向 于工程SUMO蛋白酶的多克隆和单克隆抗体可以按照标准方法制备。 在一种优选实施方案中，相对于野生型SUMO蛋白酶，该抗体能与工 程SUMO蛋白酶的改变区域进行免疫特异性反应。能与工程SUMO 蛋白酶进行免疫特异性反应的多克隆或单克隆抗体能被应用于鉴定 和纯化这些蛋白。抗体可以是对工程SUMO蛋白酶具有免疫特异性而 排除了野生型SUMO蛋白酶或者可以对两者都具有交叉反应性。
本发明的工程SUMO蛋白酶也可以被如上文所述的翻译后修饰。 工程SUMO蛋白酶可以在细胞内或体外进行翻译后修饰。
本发明的工程SUMO蛋白酶可以包括至少一个亲和标签，优选在 氨基末端。在一种特定方案中，亲和标签是血红素结合肽，如上文描 述。
IV.使用方法.
本发明的融合蛋白工艺在蛋白和肽的生产和纯化上有若干应用。 使用该工艺的示例方法包括但不局限于：
(1)通过将C-末端融合至工程SUMO蛋白以增强蛋白和肽(所关 心的蛋白)的表达，特别是那些弱表达的蛋白和肽。无论在原核生物(例 如大肠杆菌；参见图2)或真核细胞(酵母和昆虫细胞；参见图3)中， SUMO-融合蛋白结构在表达过程中不会被切割，除非工程SUMO蛋 白酶也被转化进入该细胞。作为例子的所关心的蛋白包括，但不局限 于多聚蛋白、细胞因子、疫苗、酶、生长因子、受体、干扰素、造血 剂(hematopoeitic agents)、白蛋白、胰岛素和激素。
(2)工程SUMO蛋白可与亲和标签融合。优选地，亲和标签置于 工程SUMO的氨基末端而所关心的蛋白加至工程SUMO蛋白的羧基 末端。亲和标签允许融合蛋白的纯化，再通过用本发明的工程SUMO 蛋白酶切割该工程SUMO而获得所关心的蛋白。
(3)该工程SUMO可用于纯化所关心的蛋白，即，没有亲和标签。 工程SUMO可连接于所关心的蛋白的N末端。融合蛋白被表达后可 通过特异结合工程SUMO的试剂，如免疫特异性抗体加以纯化。然后 所关心的蛋白可用本发明的工程SUMO蛋白酶而从融合蛋白中切割 出来。
(4)工程SUMO蛋白酶可以用于在体外切割包含工程SUMO的融 合蛋白。例如，当融合蛋白通过与SUMO或亲和标签(如果有的话) 的相互作用而被结合到固体支持物上时，切割可以在溶液中发生。
(5)可通过用带有特异结合工程SUMO和/或SUMO蛋白酶的试 剂，如免疫特异性抗体的固体支持物与反应混合物接触而将工程 SUMO和SUMO蛋白酶从含工程SUMO的融合蛋白的切割后混合物， 其还可能含有亲和标签，中除去。
(6)带亲合标签的工程SUMO和带亲合标签的工程SUMO蛋白酶 可通过用带有亲和配体的固体支持物与反应混合物接触而从切割后 的混合物中除去(例如带六个组氨酸标签的工程SUMO或SUMO蛋白 酶可使用金属螯合亲和层析除去)。
(7)本发明可产生在氨基末端带有任何氨基酸的所关心的蛋白。 例如，可以产生所关心的蛋白连接至工程SUMO的羧基末端的融合蛋 白。编码所关心的蛋白氨基末端残基的密码子可通过定向诱变加以变 更以编码期望氨基酸或产生包括超过一种的突变密码子编码的氨基 酸的库。在连接至工程SUMO的前后都可诱变。在融合蛋白，任选包 含亲和标签，表达之后，可在体内或体外使用工程SUMO蛋白酶来从 融合蛋白上切割工程SUMO而释出具有改变的氨基末端的所关心的 蛋白。
(8)包括工程SUMO的融合蛋白可在原核和/或真核细胞中表达 以产生肽文库。
(9)包含连接至所关心的蛋白和任选亲和标签的工程SUMO的融 合蛋白可以在原核和/或真核细胞中表达以产生肽文库。表达蛋白库可 通过工程SUMO或亲和标签得以纯化。任选地，工程SUMO和亲和 标签(如果有)可以用工程SUMO蛋白酶从融合蛋白上切割下，以通 过将库与切割下的标签相分离以产生纯蛋白或肽库。
(10)可以制备包括工程SUMO和任选亲和标签的融合蛋白cDNA 文库。这些cDNA文库可以用于在任何宿主中表达融合蛋白。
(11)包括工程SUMO和任选亲和标签的表达的融合蛋白也可以 固定于固体支持物上。在一种特定实施方案中，融合蛋白包括了所关 心的蛋白库并在固体支持物上排成阵列。融合蛋白可以通过SUMO标 签或亲和标签而固定至固体支持物上。产生的阵列可以用于，例如检 测和/或定量蛋白与固定的所关心的蛋白质的相互作用。
V试剂盒
本发明也包括用于增强所关心的蛋白的表达、分泌、纯化、定位 和氨基末端变更的试剂盒。这些试剂盒包括至少一种重组载体，该重 组载体包含编码工程SUMO的核酸序列，这段核酸序列可操作地连接 适于在期望宿主细胞中表达的启动子以及适合克隆与编码工程 SUMO核酸序列符合读框的编码所关心的蛋白的核酸的多克隆位点。 启动子优选强启动子并可以是构成型的或调节的。这种启动子为本领 域人员所熟知，包括但不局限于CMV、RSV、SV40、ADH1、T7和 CUP1启动子。
重组载体也可以包含与编码工程SUMO的序列符合读框的编码 至少一种亲和标签的核酸序列。优选地，编码亲和标签的核酸序列是 可操作地连接于编码工程SUMO的序列的5’末端。试剂包括但不限 于至少一种固体支持物(例如，能够结合至少一种亲和标签的固体支持 物)，裂解缓冲剂、洗涤缓冲剂和洗脱缓冲剂也可以包括在试剂盒中 以辅助表达的融合蛋白的纯化。
试剂盒可以进一步包括至少一种工程SUMO蛋白酶，用于切割工 程SUMO。该工程SUMO蛋白酶可以按编码该工程SUMO的核酸分 子(例如表达载体)的形式和/或已表达蛋白的溶液的形式来提供。工程 SUMO蛋白酶也可任选地带有亲和标签，该亲和标签可以与附着于工 程SUMO的亲和标签相同或不同。该试剂盒也可以进一步包括至少一 种切割缓冲剂、冷存的宿主细胞和/或指导手册。
试剂盒也可以进一步包括用于改变编码所关心的蛋白的核酸以 产生不同于天然野生型蛋白的氨基末端的试剂。用于改变核酸的方法 为本领域人员所熟知，包括但不局限于位点定向突变和基于寡核苷酸 的位点定向突变(例如见Ausubel等，eds.，2006，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.)。示范性试剂包括但不局 限于DNA聚合酶、PCR缓冲剂和dNTPs溶液。
提供以下实施例来举例说明本发明的各种实施方案。这些实施例 是为例示性的而不是以任何方式限制本发明。
实施例I
材料和方法
为了在同一个大肠杆菌细胞中共表达SMT 3-GFP和ULP1蛋白 酶，使用引物23(5’- GGCGCTCGAGTCCCGCGAAATTAATACGACTCA-3’；SEQ ID NO：7)和46 (5’-CGCAAAGCTTGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3’；SEQ ID NO：8)，
从pET24d-Smt3-GFP载体中扩增T7-SMT3-GFP盒(Malakhov等 (2004)J.Struct.Funct.Genomics，5：75-86)，用XhoI和HindIII消化后插 入用XhoI和HindIII切割的pACYC177载体(GenBank登录No.X06402) 中。该操作用SMT3-GFP表达盒置换了pACYC177中的Kan抗性基 因，生成pACYC-SMT3-GFP载体。将pACYC-SMT3-GFP转化进入 BL21(DE 3)感受态细胞中。带有pACYC-SMT3-GFP的细胞在含氨苄 青霉素的培养基上培养并使用标准氯化钙方法制成感受态。用另一个 携带在可诱导T7启动子之下的ULP1蛋白酶的载体，pET24-ULP1， 如之前所述(Malakhov等(2004)J.Struct.Funct.Genomics，5：75-86)， 转化这些感受态细胞。转化子在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB培 养基上筛选。当用IPTG诱导时，在共表达ULP1蛋白酶的细胞中的 SMT3-GFP融合物被处理成为SMT3(20kD)和GFP(28kD)。而不共表 达ULP1的细胞产生全长SMT3-GFP融合物，大小为48kD。
为了随机化位置R64和R71，使用pACYC-SMT3-GFP作为模板产 生两个重叠的PCR产物。用引物23和
80(5’-AATACCGTCGTACAAGAANNNTAAGGAGTCCA-3’；SEQ ID NO：9)进行第一个PCR，用引物
79(5’-TCTTGTACGACGGTATTNNNATTCAAGCTGATCAGA-3’；SEQ ID NO：10)和46进行第二个PCR。两个PCR片段进行凝胶分离，混合 并作为使用引物23和46进行第二轮PCR的模板。结果产生的突变 SUMO-GFP片段库被克隆进入用XhoI-HindIII消化的pACYC177载体。 连接混合物被转化进入带有pET 24-ULP1质粒的BL 21(DE3)感受态细 胞。
为了选择工程SUMOs，转化的菌落在补充有氨苄青霉素和卡那 霉素的LB培养基中培养至OD值为0.5，然后用1mM IPTG诱导。 诱导在20℃持续12小时。收获以后，冷冻细胞并存储于-80℃。使用 pH 8.0含1mM EDTA和1单位/ml溶菌酶的10mM TRIS缓冲液重悬 沉淀。在室温下孵育10分钟后，加入MgCl2至终浓度10mM，并加 入DNaseI至10单位/ml的浓度。10分钟孵育之后，在样品中加入1μl 染料并加在无十二烷基硫酸钠(SDS)的12％天然聚丙烯酰胺凝胶上。 凝胶在15V/cm下电泳1小时并在365nM紫外匣中观察。
图7中展示的β内酰胺酶构建体用下列方式产生。使用寡聚引物对 65(5’-
CGCGACATATGAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTGCTGTGGCTCTCGCAGT-3’； SEQ IDNO：11)/61(5’-
CGCGAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTGAGCCT-3’；SEQ ID NO：12) 和66(5’-
CGCGCAGGTCTCTAGGTAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTGCTGTGGCT-
CTCGCAGT-3’；SEQ ID NO：13)/61或67(5’-
CGCGCAGGTCTCTAGGTCCTAGGGTGCTTGTACTAGCTCTTGCTGTGGCTC TCGCAGT-3’；SEQ ID NO：14)/61
进行两个连续的PCR反应扩增β-内酰胺酶基因，使β-内酰胺酶使用 脯氨酸作为开端。产生的β-内酰胺酶具有15个氨基酸的分泌信号与β- 内酰胺酶开放阅读框(ORF)融合。使用寡核苷酸26(5’
TGTACAGAGCTCACGCGTGCATGCTCGGACTCAGAAGTCAATCA-3’；SEQ ID NO：15)
和61扩增突变的SUMO。产生的SUMO和β-内酰胺酶PCR产物用 Eco31I限制性核酸内切酶进行消化并连接在一起。连接产物作为用引 物26和59(5’-
CGCGAGTCGACTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCA-3’；SEQ ID NO：16)
进行PCR反应的模板，产生融合产物(突变SUMO)-(分泌信号)-(β- 内酰胺酶)。为了加入不溶蛋白MMP 13至突变SUMO的N末端，表 达盒内的MMP13的ORF连同T7启动子用寡核苷酸60(5’-
GGCGAAGCTTTCCCGCGAAATTAATACGACTCA-3’；SEQ ID NO：17)和35 (5’-CGCAGCATGCGGGGTCTTCATCTCCTGGACCA-3’；SEQ ID NO：18).
从p24d-MMP 13载体中扩增。产生的产物T7-MMP 13用HindIII和SphI 消化，在三段连接中连同用SphI-SalI消化的(突变SUMO)-(分泌信号)- (β内酰胺酶)一起克隆进入用HindIII-SalI消化的pACYC184中。这 样就产生pACYC-mutSUMO-Lac质粒。
为了产生在阿拉伯糖可诱导启动子P-BAD下的ULP1表达载体， 在pET24d-ULP1中的LacI基因与T7启动子用AraC基因和P-BAD 启动子加以置换。特别地，将pBAD/His/A载体(Invitrogen)用NcoI和 AccI消化，并将带有araC基因和P-BAD启动子的片段进行凝胶分 离。该片段连接进入用NcoI-AccI消化的pET24d-ULP1载体中，产生 pARA-6His-ULP质粒。
为了诱变ULP1，该基因的5’端用寡核苷酸88(5’-
GGAATTAACCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGAGGT-3’；SEQ ID NO： 19)和91(5’-TTAGCCATCTTCGTGGTGCCAAGGTCT-3’；SEQ ID NO：20)， 进行扩增，而3’部分用寡核苷酸191(5’-
AAGACCTTGGCACCACGAAGATGGCTAAATNNNNNNATCATTNNNTTTTT TATGA-3’；SEQ ID NO：21)和89(5’-
GTGGTGCTCGAGTCATTTTAAAGCGTCGGTTA-3’；SEQ ID NO：22)，或192 (5’-
AAGACCTTGGCACCACGAAGATGGCTAAATNNNNNNNNNNNNNNNTTTTT TATGA-3’；SEQ ID NO：23)
和89进行扩增导入突变。5’和3’部分进行凝胶分离并在第二轮PCR 中作为模板，用引物88和89来扩增诱变的ULP1(即突变SUMO蛋白 酶)。PCR产物用NcoI和XhoI消化并克隆进入pARA-6His载体。
突变SUMO蛋白酶库被转化进入带有pACYC-mutSUMO-Lac质 粒的感受态TOP 10大肠杆菌中。在42℃热激之后，细胞在2x YT培 养基中37℃复活1小时。然后加入四体积的LB培养基并在37℃搅 拌2小时。将细胞平板接种于补充了34mg/L氯霉素、50mg/L卡那 霉素、50mg/L氨苄青霉素和0.02％阿拉伯糖的LB平板上。带有未 突变的Ulp1基因的质粒不支持在氨苄青霉素上生长。将生长起来的 阳性突变克隆测序并用于蛋白酶纯化以用于体外切割。突变SUMO蛋 白酶用标准Ni-sepharose法纯化并在前述的标准切割反应(Marblestone 等(2006)Protein Sci.，15：182-9)中使用。(突变SUMO)-GFP作为切割反 应的底物。
结果
当SUMO蛋白作为融合伙伴与所关心的蛋白连接时，无论在细菌 和真核细胞中，它都可以大大增强重组蛋白质的表达水平和质量(参见 图2和图3A；Malakhov等(2004)J.Struct.Funct.Genom.，5：75-86)。 SUMO家族蛋白作为细胞调控的部分在天然状况下能加在真核生物 蛋白上并能从上面除去。SUMO的结构和SUMO蛋白添加和除去的过 程在真核细胞中高度保守。SUMO蛋白在结构上的高度保守使SUMO 融合标签与外源宿主的内源性SUMO修饰酶类有交叉物种反应。因 此，真核细胞能切割SUMO标签并且这种切割通常引起标签从重组蛋 白上分离。从真核细胞表达并纯化“未切割的“或未加工的野生型 SUMO融合蛋白因此是不轻易可能的。
为了在真核细胞中提高蛋白产量，克服“成熟前”标签被切割的障 碍，新的SUMO蛋白，叫SUMO*，被设计出来以抵抗内源性的SUMO 蛋白酶。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因SMT 3被用作遗 传基础以开发这种SUMO标签。
在评估Smt3的晶体结构以及它相应的蛋白酶Ulp1(蛋白数据库 #1EUV)(图4)之后，诱变处理Smt 3蛋白可能与Ulp1进行相互作用的 区域(图5)。首先，使用常规PCR突变技术随机化编码氨基酸64-71 的区域。然后，因为在位置64和71的精氨酸(R64和R71)直接面对 Ulp1(图4A和4B)，使用PCR突变法特异地突变这些残基。产物 SUMO-GFP突变体用新的体内切割检验，即用Ulp1转化大肠杆菌， 进行筛选。
在大肠杆菌内存在ULP1时也不体内切割的突变体包括在64位用 苏氨酸(theronine)代替精氨酸以及在71位用谷氨酸代替精氨酸。在 此涉及的这个特别的突变体为SUMO*。在下面的表1中提供了某些 SUMO突变体。
表1-某些SUMO突变体在R64和R71位上的氨基酸变化以及它们能 被ULP1切割的能力。
如图3A和3B所示，分别使用酵母和昆虫SUMO蛋白酶都能几 乎完全地切割SUMO-GFP，而SUMO*-GFP则不被切割。另外，与未 加标签的GFP相比(比较泳道1和2与5和6)，SUMO*融合物大大的 增强了GFP的表达。
纯化SUMO*-GFP并用于体外的切割反应。测定了SUMO蛋白酶 1(Ulp1)和SUMO蛋白酶2(SENP2)(图6)。两种蛋白酶均不能切割 SUMO*(图6)。实际上，有SUMO*标签的融合物用最高至完全切割 SUMO所需酶浓度1000倍的增加量的Ulp1进行孵育，仍没有检出切 割(图10)。另外，当SUMO*-GFP在酵母或昆虫细胞中表达时，该突 变标签，不像野生型Smt3标签，是不会被这些生物的天然SUMO蛋 白酶所切割的(图3)。
最理想的融合标签，必须能在随后的纯化步骤中被除去，而只剩 下所关心的蛋白。为了设计能切割SUMO*标签的蛋白酶，筛选了水 解酶的在大肠杆菌中从它们的融合伙伴中切割突变SUMOs的能力 (图7)。如果在细胞中表达氨苄青霉素抗性蛋白，β-内酰胺酶，筛选基 于大肠杆菌在含有抗生素氨苄青霉素的培养基上的生长能力来进行。 已经证明只有未融合的β-内酰胺酶可以赋予氨苄青霉素抗性。因此， 如果SUMO标签被融合至β-内酰胺酶上，它不会赋予氨苄青霉素抗 性。β-内酰胺酶被融合至SUMO*的C-末端并与不同的水解酶进行共 表达。只有当标签被切割，β-内酰胺酶才能以其活性形式释放，从而 通过赋予氨苄青霉素抗性而使细胞生存。已知道如果蛋白以脯氨酸开 端，那么Ulp1不能切割该SUMO-蛋白融合体。因此Smt3-pro-BLA融 合蛋白，在Smt 3标签之后的第一个氨基酸是脯氨酸的融合物，被构 建起来作为构思证据用于筛选(图8)。
分析Ulp1的结构，与SUMO氨基酸R64和R71相互作用的氨基 酸残基被确定位于残基450和456之间的区域。与R64和R71相互作 用的潜在氨基酸分别是位于451和455位的天冬氨酸和谷氨酸，以及 在452位的苏氨酸(图4和9)。使用PCR饱和诱变技术随机突变在Ulp 1中的这三个残基。诱变之后，突变体用体内β-内酰胺酶检定在含有 氨苄青霉素的平板进行选择。使用切割效率的不同程度在筛选中鉴定 Ulp1突变体。选择最有效率的突变体2.2，并命名为“SUMO*蛋白酶 1”(图10)。突变体范例在下面表2中提供。
表2在野生型ULP1和某些突变体的451和455位之间的氨基酸序列 以及它们切割SUMO*的能力。
实施例II
如同野生型SUMO一样，工程SUMOs能够增加异源蛋白质的表 达。实际上，图3A表明，同未加标签的GFP比较，当蛋白与SUMO* 融合时，在酿酒酵母中GFP以更高的水平表达。另外，图13提供 SUMO*增强异源蛋白质在昆虫细胞中表达的证据。特别地，将类胰蛋 白酶与6xHis标签或SUMO*标签一起克隆进入pFastBac载体。该融 合蛋白在昆虫Sf9细胞中表达。用考马斯染色的细胞内蛋白 SDS-PAGE凝胶清楚地表明与带6xHis标签的类胰蛋白酶相比 SUMO*-类胰蛋白酶表达提高。值得注意的是，SUMO*-类胰蛋白酶 融合物在昆虫细胞中不被切割。
另外，与野生型SUMO类似，本发明的工程SUMOs提高了异源 蛋白质的分泌。图14是表达带6xHis标签或融合SUMO*的粒酶 B(GzmB)的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)培养基蛋白的蛋白质印 迹。该培养基与细胞分离并用SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析，蛋 白质印迹分析使用抗GzmB抗体以显现SUMO*-GzmB以及 6xHis-GzmB。值得注意的是，SUMO*-GzmB融合物在毕赤酵母细胞 中不被切割。
实施例III
昆虫表达载体基于pFastBac(Invitrogen，Carlsbad，CA)并以两步 进行构建，类似于毕赤酵母。首先，6xHis、SUMO以及SUMO*融合 标签被克隆在P-polh启动子之后。然后与融合标签符合读框地将 UBP43，一种泛素蛋白酶(Liu等(1999)Mol.Cell.Biol.，19：3029-3038)， 插入用BsmBI-XbaI预先消化的载体。小鼠UBP43用引物：
#265(CGCGACCTGCATCGAGGTATGGGCAAGGGGTTTGGGCTCCTGAGG； SEQ ID NO：29)
和#266
(CGCGACCTGCATGTCTAGATTAGGATCCAGTCTTCGTGTAAACCAAG； SEQ ID NO：30)，
进行扩增，再用BfuAI消化。杆粒在DH 10bac大肠杆菌细胞中产生。 获得并滴定病毒之后，转染Sf9细胞，72小时之后分析样品检测蛋白 质产量。
pCDNA3.1载体被用于哺乳动物表达。将小鼠IgGκ分泌信号和三 个蛋白标签，6xHis、6xHis-SUMO、和6xHis-SUMO*，克隆进CMV 启动子后的HindIII-BamHI位点。用引物576
(ATCACGTCTCGAGGTGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGAC；SEQ ID NO：31) 和285(GCATCGTCTCACTAGTCAATTGCACTTGGGAGAGT；SEQ ID NO： 32)，
扩增小鼠分泌组X PLA2后，用BsmBI限制性核酸内切酶消化并克隆 在6xHis、SUMO或SUMO*融合标签之后。无κ分泌标签的JOSD2 在细胞内表达。JOSD2开放阅读框用寡聚DNA 344(ATGATGGGTCTCAAGGTATGTCCCAGGCCCCGGGAGCA；SEQ ID NO： 33)和345(ATGATGGGTCTCTCTAGATCAGTCTGTCCGCAGCCA；SEQ ID NO：34)
扩增并克隆进基于pCDNA3.1的载体中，在6xHis或SUMO*标签之 后。
用2.5微克的各种纯化质粒来转染包含2ml培养基中的HEK293T 细胞的6孔平板的各孔。48小时之后，收集细胞和培养基样品并用蛋 白质印迹法分析。
如图15A和15B所示，SUMO*融合标签增强了融合伙伴蛋白的 表达，并在昆虫和哺乳动物细胞中不被切割。
实施例IV
sPLA2酶以它们催化磷脂sn-2酯键的反应，一种水解反应，受到 人们关注。在水解后，得到溶血磷脂和游离脂肪酸。这些脂肪酸可以 作为信号转导的第二信使，而值得注意的是溶血磷脂有助于磷脂重 塑。
PLA2首先于1890年在眼镜蛇毒中被发现(Six和Dennis (2000)Biochim.Biophys.Acta，1488：1-19)。目前，已有11种不同的 sPLA2组在小鼠中得到鉴定，根据氨基酸序列同源和结构相似性进行 分类。在已知的11组中，组IIC、IIE、III、V和X被用于这些研 究。(字母指特定组中不同的同系物。)组IIC，有8个二硫键，在啮 齿动物睾丸、脑和胰腺中都发现，但在人类中不表达(Six和Dennis (2000)Biochim.Biophys.Acta.，1488：1-19)。组IIE，在体内有炎性反 应，在人(肺组织)和小鼠(脑、心脏和肝组织)中被发现。有趣的是，组 III，原来从蜂毒分离，在人体中诱导树突成熟，在病理性的人内皮细 胞中高度表达并似乎在肿瘤细胞中增加血管生成(Murakami等(2005)J. Biol.Chem.，280：24987-24998)。组V PLA2，一种具有6个二硫键的 14kDa蛋白，在它的结构中并无独特的环并在有炎性刺激的情况下在 大鼠和人心脏中表达(Six和Dennis(2000)Biochim.Biophys.Acta.， 1488：1-19)。组X，最近解析出的PLA2s，包含123个氨基酸并与组I、 II和V有27-35％序列同一性。它在人的脾、白细胞、肺泡组织和胸 腺以及小鼠的胃中有发现。与大多数PLA2s一样，组X PLA2s在炎性 刺激下出现并也参与信号转导。
为了正确折叠和活性许多真核生物蛋白需要复杂的翻译和翻译 后环境。这些条件在像大肠杆菌或酵母类的生物中并不存在，在这些 宿主中尝试重组表达时这可能导致不正确的加工和/或较差的得率。分 泌的磷脂酶A2s是一类在大肠杆菌中难于生产的蛋白家族，经常被表 达于包含体中。此外，由于相对多的二硫键数目，通常在5至8之间， PLA2s在增溶之后难以重折叠。表达通常比较低并且随后的重折叠步 骤经常导致较差的产量。尽管有精致的方案和艰苦的努力，但重折叠 的蛋白活性与它的天然形式仍然不同，而不能正确表征。之先尝试在 哺乳动物细胞中表达sPLA2s，通常会得到较低的表达水平。然而，如 在此所述，通过与小的类泛素修饰物(SUMO)家族的成员融合，在大 肠杆菌、巴斯德毕赤酵母和杆状病毒/昆虫细胞系统中都可以提高异源 蛋白质的表达。因此，通过类似于以前使用的方法可能在哺乳动物细 胞中使sPLA2生产量提高，特别是小鼠PLA2组。
另外，PLA2的游离N末端对PLA家族蛋白的生物活性必不可少。 生产活性的PLA2对细胞有害，过量生产活性PLA2将杀死细胞。在 PLA2的N末端包含有工程SUMO的融合蛋白在细胞中不被切割，这 样可使休眠的/非活性的PLA2在细胞内积累或被分泌至培养基中(细 胞外)。工程SUMO-PLA2融合物可以在体外纯化后用工程SUMO蛋 白酶切割以生产活性的PLA2蛋白。因此，工程SUMO融合物提供了 更好的工具来表达活性的有毒蛋白，特别是当该蛋白的毒性与蛋白的 N末端有关时。值得注意的是，其它蛋白如胰蛋白酶、因子X、凝血 酶和粒酶B当过表达时可能对细胞有毒，并且这些蛋白表现活性都需 要游离N末端。像PLA2那样，这些蛋白可以以工程SUMO融合物的 形式表达，然后用工程SUMO蛋白酶除去SUMO标签。
材料与方法
构建融合标签载体
对于所有载体构建体，pCDNA3.1/V5-His(Invitrogen)都被用作主 链。所有的PCR反应都使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶 (Invitrogen)，而所有限制性酶和T4 DNA连接酶来源于 Fermentas(Burlington，Ontario，加拿大)。克隆按照标准技术进行。 所有克隆以测序法进行鉴定。最初，通过具有两者之间同源区域的重 叠引物产生κS.S.和6xHis标签(分别使用引物1+2和3+4；见引物序 列表3)。将κS.S和His标签用引物1+4在第二轮PCR反应中连接在 一起。κ-6xHis融合体通过HindIII和BamHI限制性位点插入pCDNA3.1 中，生成pCDNA3.1-κ-6xHis。设计引物3和4使His标签之后接上两 个甘氨酸以及产生在相反链BamHI位点上游区的Esp3I/BsmBI限制 性位点。用Esp3I消化，从双甘氨酸ggaggt编码序列产生非编码链上 的由tcca组成的四碱基突出。用引物5+6，7+6，7+6和8+9分别扩增 CTHS、SUMO、SUMOmut和hSUMO3。当下游使用第二个Esp 3I识 别位点时，所有反向引物再次在不同的SUMO末端双甘氨酸密码子下 游产生Esp 3I识别位点。通过Eco31I和BamHI限制性位点将SUMO 标签插入pCDNA3.1-κ-6xHis，以生成以下载 体：pCDNA3.1-κ-6xHis-CTHS、pCDNA3.1-κ-6xHis-SUMO、 pCDNA3.1-κ-6xHis-SUMOmut、pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO3。
初始的小鼠sPLA2-X构建体产生
使用引物10+11 PCR扩增活性的sPLA2-X。使用引物12+11从相 同的克隆中PCR扩增非活性的sPLA2-X。通过用Esp 3I消化PCR产 物和载体产生活性的和非活性的sPLA2-X质粒。
融合标签载体的扩增
使用引物13+14从cDNA中PCR扩增人SUMO-1并通过Esp 3I 和XbaI限制性位点克隆进入pcDNA3.1-κ-6xHis中产生 pcDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO1。通过使用PCR位点-定向诱变法产生突 变的人SUMO-1和3，其中N末端和C末端的半段在单独的反应中产 生，凝胶分离，并在后续的PCR反应中连接。人SUMO-1的第一步 PCR分别使用引物13+15和16+14进行N和C-末端反应。人SUMO-3 的第一步PCR分别使用引物8+17和18+9进行N和C末端反应。在 第二步PCR中，对于每种人SUMO将纯化的的第一步产物混合起来， 使用引物13+14产生hSUMO1 mut，而用引物8+9产生hSUMO3 mut。 产物被被插入pCDNA3.1-κ-6xHis中生成 pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO1mut和pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO3mut。
小鼠sPLA2构建体的扩增
小鼠sPLA2-IIC、IIE、III和V的cDNAs购买于Open Biosystems(Huntsville，AL)。设计PLA2引物以能在纯化和除去标签后 生成成熟蛋白质。因此基于参考文献综述和SignalP分析在引物设计 中省略分泌信号和前肽。用引物19+20从cDNA克隆小鼠sPLA2-IIC， 对应于GenBank登录号BC 029347。用引物21+22从cDNA中克隆小 鼠sPLA2-IIE，对应于GenBank登录号BC 027524。用引物23+24从 cDNA中克隆全长的小鼠sPLA2-III，对应于GenBank登录号BC 079556。用引物25+26从cDNA中克隆小鼠sPLA2-V，对应于GenBank 登录号BC 030899。用引物27+28从cDNA中克隆小鼠sPLA2-III活性 结构域(Murakami等(2005)J.Biol.Chem.，280：24987-24998)，对应于 GenBank登录号BC 079556。所有的sPLA2基因包括活性和非活性 sPLA2-X被亚克隆进入pCDNA3.1-κ-6xHis，
pCDNA3.1-κ-6xHis-SUMO，pCDNA3.1-κ-6xHis-SUMOmut，
pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO1，pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO1mut，
pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO3和pCDNA3.1-κ-6xHis-hSUMO3mut中。
在HEK-293细胞中的瞬时转染
HEK-293T细胞以含有10％胎牛血清培养基的DMEM中500,000 细胞每孔的密度被接种于6孔板中(BectonDickinson；Sparks，MD) 并在37℃、95％空气/CO2中孵育过夜。按制造商(Invitrogen)所述使用 Lipofectamine-LTX将在pCDNA3.1载体中的不同的PLA2 cDNA构建 体(2.5μg/孔)瞬时转染细胞。转染之后，细胞在37℃下再孵育48小 时以分析PLA2表达。
表达分析
转染并孵育48小时之后，收集培养基和细胞进行分析。从各孔 中移出培养基(～1.5ml)并离心分离碎片。100μl的培养基与6xSDS上 样缓冲液混合并煮沸5分钟以用于SDS-PAGE/蛋白质印迹。剩余培养 基存储于-80℃以用于随后检验。从平板中的每孔洗涤细胞、离心分 离、再悬浮于180μl的冷RIPA缓冲液中，短暂超声破碎，混合于6xSDS 上样缓冲液并煮沸5分钟。所有样品用带有4％丙烯酰胺叠加层的15％ 变性丙烯酰胺凝胶解析。凝胶用Trans-SD半干式转移槽 (BioRad；Hercules，CA)转移至ImmoblinTM硝化纤维素(Millipore； Billerica，MA)上。转移之后，印迹使用pH 7.5含0.05％Tween-20 的PBS(PBST)中的5％脱脂奶封闭1小时。封闭之后，印迹在PBST+ 奶中的1∶1000单克隆抗-His抗体(Sigma)中孵育1小时。用PBST洗 涤印迹三次，用PBST+奶中的1∶2500抗-小鼠的HRP缀合抗体(Sigma； 圣路易斯，MO)孵育1小时。印迹再用PBST洗涤三次。用 West Pico化学发光底物(Pierce；Rockford，IL)检测HRP 缀合物。印迹用LAS-3000(Fujifilm Life Science；Stamford，CT)成像。
基因 序列 酶 SEQ ID NO Dir. 1 kappa GCGCAAGCTTGCTATGGAGACAGAC ACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGC TCT HindIII 35 F 2 kappa GATGATGGTGATGACCGTCACCAGT GGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGT ACCCA 36 R 3 6xHis CCAGGTTCCACTGGTGACGGTCATC ACCATCATCATCACGGAGGT 37 F 4 6xHis CGCGTCTAGAGAGACGGCATGCCGT CTCAACCTCCGTGATGATGATGGTG ATG XbaII，Esp3I 38 R 5 CTHS CGCAGGTCTCTAGGTGAAAGACAGG GTAAGGAAATGGA Eco31I 39 F 6 SUMO CGCGTCTAGAGAGACGGCATGCCGT CTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG A XbaI，Esp3I 40 R 7 SUMO CGCAGGTCTCTAGGTTCGGACTCAG AAGTCAATCAAGA ECo31I 41 F 8 hSUMO3 CGCAGGTCTCTAGGTTCCGAGGAGA AGCCCAAGGA Eco31I 42 F 9 hSUMO3 CGCGTCTAGAGAGACGGCATGCCGT CTCAACCTCCCGTCTGCTGCTGGAA XbaI，Esp3I 43 R 10 sPLA2-X ATCACGTCTCGAGGTGGACTCCTGG AGCTGGCAGGGAC Esp3I 44 F 11 sPLA2-X GCATCGTCTCACTAGATCAATTGCA CTTGGGAGAGT Esp3I 45 R 12 sPLA2- Xmut ATCACGTCTCGAGGTCTCCTGGAGC TGGCAGGGAC Esp3I 46 F
13 hSUMO1 CGCAGGTCTCTAGGTTCTGACCAGG AGGCAAAACCT Eco31I 47 F 14 hSUMO1 CGCGTCTAGAGAGACGGCATGCCGT CTCAACCTCCCGTTTGTTCCTGATA A XbaI，Esp3I 48 R 15 hSUMO1 mut ATGATTATCAGCAATTTCCTGACCC TCAAAGAGAAACGTGAGTGAATTCA TTGGAA 49 R 16 hSUMO1 mut CCAATGAATTCACTCACGTTTCTCT TTGAGGGTCAGGAAATTGCTGATAA TCATAC 50 F 17 hSUMO3 mut TGGCTGCCCGTCGAACTCGAATGTG ATCTGCCTCATTGACA 51 R 18 hSUMO3 mut TCAATGAGGCAGATCACATTCGAGT TCGACGGGCAGCCAAT 52 F 19 sPLA2- IIC GCGCCGTCTCTAGGTAGTTTCTGGC AGTTCCAGAGGA Esp3I 53 F 20 sPLA2- IIC GCGCCGTCTCTCTAGATTAGCACTG GAGTTTGTCCCTGC Esp3I 54 R 21 sPLA2- IIE GCGCGGTCTCTAGGTAACCTGGTCC AGTTTGGAGTGA Eco31I 55 F 22 sPLA2- IIE GCGCGGTCTCTCTAGATTAGCAGGG TGGGGTGGGC Eco31I 56 R 23 sPLA2-III GCGCGAAGACATAGGTCGTCACTGG GACAGTACCTCCTG BpiI 57 F 24 sPLA2-III GCGCGAAGACATCTAGATTATGAGC TCCAGAATTTCTTCTGTCC BpiI 58 R 25 sPLA2-V GCGCCGTCTCTAGGTGGCTTGCTAG AACTCAAGTCCATG Esp3I 59 F 26 sPLA2-V GCGCCGTCTCTCTAGATTAGCAGAG GAAGTTGGGGTAATAC Esp3I 60 R 27 sPLA2- IIIcore GCGCCGTCTCTAGGTGGCTGGACCA TTCCTGGCACG Esp3I 61 F 28 sPLA2- IIIcore GCGCCGTCTCTCTAGATTAATATGA GGTGGCCTCAGCCTTCCAG Esp3I 62 R
表3：引物
结果
为了评价在哺乳动物分泌途径中表达SUMO-融合蛋白的潜在作 用，小鼠sPLA2-X被用作模型蛋白。首先测定以下四个N末端融合 物：Smt 3(SUMO)，包括AA45-99的Smt3C末端的一半(CTHS)，双重 突变体Smt3 R64T R71E(SUMOmut(SUMO*))，该突变体不能被SUMO 蛋白酶和人SUMO-3(hSUMO)所切割。所有标签产生为具有6个组氨 酸(6xHis)的N-末端并定向于利用IgGκ分泌信号从小鼠分泌。用于对 照目的，建立了只有信号序列和6xHis标签的载体，一共建立了五种 载体，仅在它们基于SUMO的标签上不同。与Smt 3的融合已经显出 在大肠杆菌中的异源蛋白表达增强，而当与人SUMO-3融合则导致在 大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中的表达提高。在表4中提供了某些表达 数据。
表4
开发的CTHS最初用于杆状病毒/昆虫细胞表达，因为观察到全长 的SUMO融合物可被内源性的去SUMO酶(desumoylase)所切割(如 见PCT/US 04/20778和US专利申请No.10/504,785)。基于分离的泛 素(split-ubiquitin)的开发(Johnsson和Varshavsky(1994) PNAS91：10340-10344)，CTHS仅在存在它的N端一半序列(NTHS)的 情况下才会被切割。已经发现当避免了内源性切割时，CTHS融合可 以增加融合伙伴的产量。
如在此所描述，开发突变体Smt 3以产生SUMO融合物，该融合 物在真核生物宿主体内不被切割，而维持了在原核生物中所显示的 Smt3融合的所有正向增强。在对结合于它的天然蛋白酶Ulp1的Smt3 进行广泛的晶体结构分析之后，合理的诱变筛选产生了两个相邻的 (interfacial)氨基酸的修饰。这些修饰，R64T和R71E，产生了在各 种酶浓度下都不能被Ulp1切割的SUMO。在筛选中，新的SUMO显 示出与野生型Smt3相当的融合伙伴表达的增强程度。在产生突变 Smt3之后，也将Ulp1进行合理的诱变筛选并开发出了能够在体外切 割突变Smt 3融合物的突变酶。
如图16A所示，在HEK-293 T细胞中表达sPLA2-X。与其它标签 相比，SUMOmut清楚地显示了sPLA2-X在产量上的增强；然而Smt 3 和hSUMO3培养物在48小时的最后显得融合性较差。重复若干次转 染都得到相同的结果。sPLA2-X是天然产生的酶原，其成熟形式克隆 在各种标签之后。在它可能从它的融合伙伴上释放出来的情形中过量 表达sPLA2-X可能对细胞有毒。为了评价所述sPLA2-X毒性是否是由 于切割造成的，我们通过去除sPLA2-X的N末端甘氨酸来产生一系列 非活性的sPLA2-X融合物。在HEK-293T细胞中表达那些非活性 sPLA2-X的融合物见图16B。结果证明虽然没有可见的裂解产物， sPLA2-X活性和它N末端前肽对切割的敏感度显然在过表达中起有重 要作用。
比较人SUMO-1、2、3和Smt 3的晶体结构，显示出在各SUMO 结构之间具有很强的保守性，两个相邻精氨酸残基位于几乎相同的位 置。值得注意的是，SUMO-2和3具有97％的同一性。因此，研究 hSUMO-1和3希望SUMO-2表现与SUMO-3相同的情况。在hSUMO1 中，在63位的精氨酸被改变为苏氨酸(R63T)，而70位精氨酸被改变 为谷氨酸(R70E)。对于hSUMO3，58位的精氨酸被改变为苏氨酸(R58T) 以及60位的精氨酸被改变为谷氨酸(R60E)。用突变型和野生型Smt 3、 hSUMO1和3制备出活性的和非活性的sPLA2-X融合物。图17A和B 分别显示了表达非活性的和活性的融合物48小时的结果。表达野生 型Smt3、hSUMO1和hSUMO3的培养物也没生长，同时也不表达 sPLA2-X。这种情况可能由于融合蛋白被切割后释放了有毒的PLA2。 有趣的是，某些带His标签的hSUMO1在17A中可见，而在其它的 具有活性sPLA2-X的野生型SUMO融合物中则不可见。
给出的表达数据使用的是小鼠sPLA2-X，测定了其它的sPLA2组。 基于在以前报道中重组表达的不同水平(Rouault等(2007) Biochemistry 46：1647-1662)测定了四个额外的小鼠sPLA2基因。以前， 小鼠sPLA2-IIC和III在昆虫细胞中的生产分别具有150和70ng/L的 产量。对于每种sPLA2目前没有重折叠方案而且两种酶都是天然糖基 化的，这使得真核生物生产成为必需。小鼠sPLA2-IIE代表了报道的 在细菌中的最低产量，为800ng/L，而sPLA2-V代表了最高产量，为 20mg/L。小鼠sPLA2-X在大肠杆菌中表达量为10mg/L。
活性形式的小鼠sPLA 2-IIC、IIE、III和V被测定。图18A展示 了sPLA2-IIC 48小时之后的细胞内表达。带His标签的蛋白在培养基 中不能被检测出。尽管带上所有的SUMO标签的表达都明显地增加 了，但分泌在某种程度上被抑制了。sPLA2-IIE的表达和分泌见图18B。 48小时之后，明显更多的sPLA2-IIE在大多数的SUMO融合物中可 以被看到了，密度法分析显示，比起单独的His标签，SUMOmut是 140倍而hSUMO3mut是190倍。小鼠和人sPLA2-III都作为55kD的 蛋白表达，但经过翻译后和细胞特异性的蛋白水解加工，成熟为28kD 的活性结构域(Murakami等(2003)J.Biol.Chem.，278：10657-10667； Murakami等(2005)J.Biol.Chem.，280：24987-24998.)。活性的或S结 构域之前是N结构域，之后是C结构域。最初，制备了具有全长 sPLA2-III的融合物，仅仅使用SUMO和κ信号更换了天然分泌信号。 在HEK-293细胞中，所有sPLA2-III融合物在它们的第一个切割位点 上被切割，而分开了N和S结构域，如图18C所示，这时带His标签 的蛋白只有12kD或具有不同的SUMOs时大约32kD。胞内印迹显示 了55kD蛋白的产生而无其它的形式可见。sPLA2-V的表达和分泌见 于图18D。类似于组X，在表达sPLA2-V时对突变SUMO融合物有强 的偏好性。虽然野生型SUMO融合物的表达明显缺少，但在sPLA2-V 例子中，没有看到类似的细胞培养问题。
虽然本发明的某些优选方案已经进行了如上描述和特别例证，但 并不意图将本发明限于这些方案。在不偏离本发明的范围和精神的前 提下可以进行各种的修改，如以下权利要求所阐述的。
Tauseef R.Butt
Tadas Panavas
Amolkumar Karwa
Raymond J.Peroutka
Jeffrey G.Marblestone
本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求2006年12月29日提交的美 国临时专利申请No.60/877914的优先权。上述申请通过援引并入本 文。
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