疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的应用
阅读：670发布：2020-05-26
专利汇可以提供疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，公开了 疥螨 几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的应用。本发明以疥螨几丁质酶样蛋白(SsCLP)作为抗疥螨 疫苗 蛋白进行免疫实验，结果显示疥螨几丁质酶样蛋白具有强 反应性 和良好的免疫原性，并表现出对动物明显的免疫保护作用，成为疥疮的防控新措施，特别是在疥螨引发的兔疥疮中。，下面是疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的应用专利的具体信息内容。
1.疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述疥螨几丁质酶样蛋白基因如SEQ ID NO:
1所示或如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述疥螨几丁质酶样蛋白基因表达的蛋白如SEQ ID NO:3所示，或为由SEQ ID NO:1所示基因序列表达的蛋白。
4.含疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述重组载体为含疥螨几丁质酶样蛋白基因的pET-32a(+)表达载体。
6.根据权利要求4或5所述应用，其特征在于，所述疥螨几丁质酶样蛋白基因如SEQ ID NO:1所示或如SEQ ID NO:2所示。
7.一种疥疮疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述应用中的疥螨几丁质酶样蛋白基因表达的蛋白和免疫佐剂；或者包括权利要求4所述应用中的含疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体表达的蛋白和免疫佐剂。
8.根据权利要求7所述疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为皂苷溶液。
9.根据权利要求8所述疫苗，其特征在于，所述皂苷的浓度为1mg/mL。
10.根据权利要求7所述疫苗，其特征在于，所述疥螨几丁质酶样蛋白基因表达的蛋白浓度或含疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体表达的蛋白浓度为100-200μg/mL。
疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的应用
技术领域
背景技术
[0002] 疥疮是一种由疥螨(Sarcoptes scabiei)引起的高度接触性传染的寄生虫病，对全球人类和动物的健康构成巨大威胁，临床症状包括皮肤炎症，皮疹，瘙痒和皮肤痂皮增厚，在病程后期动物会发生消瘦。疥螨宿主广泛，感染发生在100多种哺乳动物中。疥疮在社会弱势群体广泛存在，如土着居民和发展中国家贫困的地区。疥螨病不受控制的传播引发了严重的死亡率，这对动物福利和经济损失具有重大影响。此外，在热带气候下，经常发生化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌感染，导致严重的皮肤脓皮病。
[0003] 目前，杀螨剂是用于控制螨虫的有效途径。然而，杀螨剂的耐药性及其毒性可能会阻碍其发展。此外，杀螨剂残留物对健康有害并对环境构成威胁。相比之下，有效的抗螨疫苗在安全性，环境友好性和经济成本方面都将会更有优势，能更有效地保护人和动物。
[0004] 疥螨入侵可诱导宿主的先天性和适应性免疫反应。据报道，疥螨感染动物后可诱发宿主产生保护性免疫。这些发现表明将来有可能开发一种控制疥螨的疫苗。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的新应用，使得所述基因表达的疥螨几丁质酶样蛋白具有强反应性和良好的免疫原性，可对动物表现出免疫保护作用，应用到相关疫苗的制备中；
[0006] 本发明的另外一个目的在于提供含上述疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用；
[0007] 本发明的另外一个目的在于提供利用上述蛋白制备的防治疥疮的疫苗。
[0008] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0009] 疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用。
[0010] 本发明根据疥螨基因组学数据(基因登录号：JXLN01012673.1)与疥螨蛋白组学数据(基因登录号：KPM08736.1)，确定了疥螨一个疥螨几丁质酶样蛋白(SsCLP)基因，序列如SEQ ID NO:1所示，DNA全长序列长1701bp，包含一个1251bp的开放阅读框(ORF)，编码416个氨基酸残基的蛋白。本发明选取SsCLP核苷酸457位至1251位作为目标蛋白的表达基因，其包含一个795bp的ORF(SEQ ID NO:2所示)，编码一个264个氨基酸残基的蛋白(30.9kDa，序列如SEQ ID NO:3所示)，pI为8.92，该蛋白无信号肽和跨膜结构域，且具有较强的亲水性。系统发育分析表明，该SsCLP基因被归为第五分支，该序列与埋内欧尘螨(Euroglyphus maynei)CLP具有较高的同源性(图1)。
[0011] 本发明通过体外重组技术获得了含SEQ ID NO:2所示序列的重组载体(SEQ ID NO:2所示序列+基础载体序列)，并进一步获得了重组蛋白rSsCLP(49kDa，SEQ ID NO:3所示氨基酸+基础载体表达的氨基酸)，自然感染S.scabiei的兔血清样品和抗rSsCLP兔血清样品都能识别抗原rSsCLP蛋白，显示大小49kDa蛋白信号条带，表明SsCLP重组蛋白具有强反应性和良好的免疫原性。健康兔血清样品无法识别抗原蛋白信号。以自然感染S.scabiei的兔血清样品识别疥螨粗提取物作为内参，结果显示大小45kDa(416个氨基酸残基)蛋白质信号。
[0012] 同时，使用纯化后的rSsCLP蛋白在三个实验组中进行疫苗免疫实验，设置对照组分别免疫PBS，QuilA皂苷或空基础载体蛋白。结果显示rSsCLP具有强反应性和良好的免疫原性。使用rSsCLP免疫后，实验组中有74.3％(26/35)的兔表现出免疫保护作用，并且与无疥螨感染兔相比没有显着差异；炎症反应和病变区域的等级显示，感染4周后三个实验组和三个对照组之间存在显着差异，随着感染时间的延长差异更加明显；在体重方面，实验组体重增加，而对照组体重减轻；感染4周后，与三个对照组相比，三个免疫rSsCLP蛋白的实验组中的病变面积显著减少。结果表明，rSsCLP是一个良好的抗螨疫苗候选蛋白分子。
[0013] 此外，在抗体反应实验中，QuilA皂苷和PBS对照组的IgG水平没有明显变化，并且在免疫前后维持相对稳定的低水平。空基础载体蛋白组在第二次免疫后2周时抗体水平达到峰值。然而，抗体水平在短时间后迅速下降，没有保护作用，表明基础载体蛋白对rSsCLP的免疫作用和特异性抗体的产生没有影响。在三个免疫rSsCLP组中，用rSsCLP进行第二次免疫后2周抗体水平达到最高值，并且抗体水平可持续较长时间。
[0014] 上述各种试验结果是本发明提出疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用的依据，这是本发明提出的第一个应用。同样根据试验可知，含疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体和/或其表达的蛋白同样可应用在制备防治疥疮的疫苗中，这是本发明提出的另一个应用。两个应用中，所述疥螨几丁质酶样蛋白基因如SEQ ID NO:1所示或如SEQ ID NO:2所示，所述疥螨几丁质酶样蛋白基因表达的蛋白如SEQ ID NO:3所示，或为由SEQ ID NO:1所示基因序列表达的蛋白。
[0015] 在本发明具体实施方式中，所述重组载体为含疥螨几丁质酶样蛋白基因的pET-32a(+)表达载体。
[0016] 本发明还提供了一种疥疮疫苗，其包括本发明第一个应用中的疥螨几丁质酶样蛋白基因表达的蛋白和免疫佐剂；或者包括本发明第二个应用中的含疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体表达的蛋白和免疫佐剂。
[0017] 在本发明具体实施方式中，所述免疫佐剂为皂苷溶液，所述皂苷的浓度为1mg/mL；更具体地，皂苷为QuilA皂苷，皂苷溶液为皂苷的PBS溶液。
[0018] 作为优选，疫苗中所述疥螨几丁质酶样蛋白基因表达的蛋白浓度或含疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体表达的蛋白浓度为100-200μg/mL。
[0019] 由以上技术方案可知，本发明以疥螨几丁质酶样蛋白(SsCLP)作为抗疥螨疫苗蛋白进行免疫实验，结果显示疥螨几丁质酶样蛋白具有强反应性和良好的免疫原性，并表现出对动物明显的免疫保护作用，成为疥疮的防控新措施，特别是在疥螨引发的兔疥疮中。附图说明
[0020] 图1所示为SsCLPs和其他物种CLPs之间的无根系统发育树；
[0021] 图2所示为重组SsCLP(rSsCLP)的SDS-PAGE和免疫印迹；其中，M，蛋白质分子量标记(kDa)；1，Pet-32a(+)空载体蛋白；2，未纯化的重组SsCLP蛋白；3，纯化后重组SsCLP蛋白；4，疥螨粗提取物；5，自然感染疥螨兔血清(用0.01M PBS 1:100稀释)特异结合纯化后重组SsCLP蛋白(实验组)；6，抗SsCLP蛋白兔血清(用0.01M PBS 1:100稀释)特异性结合重组SsCLP蛋白(阳性对照)；7，未感染疥螨兔血清(用0.01M PBS 1:100稀释)识别纯化后重组SsCLP蛋白(阴性对照)；8，抗SsCLP蛋白兔血清(用0.01M PBS 1:100稀释)特异性结合疥螨粗提取物；实验中，所有蛋白样品来源相同，凝胶/印迹的样品进行了平行处理，同时进行了剪切；
[0022] 图3所示为攻虫前与攻虫4周后兔后肢临床症状；A排显示兔正常的后肢；B排显示疥螨感染4周后兔后肢临床症状；PBS：两次分别用1mL 0.01M PBS免疫；Quil A：两次分别用1mL浓度为1mg/mL的QuilA皂苷(溶于PBS)免疫；vector protein：分别用100μg(第一次)和
200μg(第二次)纯化的pET-32a(+)载体蛋白与1mL QuilA皂苷(浓度为1mg/mL，溶于PBS)混合免疫；rSsCLP1，rSsCLP2和rSsCLP3是指在第一和第二次免疫时，分别用1mL QuilA皂苷(浓度为1mg/mL，溶于PBS)与100μg(第一次)和200μg(第二次)纯化的rSsCLP蛋白混合免疫；
200μg(第二次)纯化的pET-32a(+)载体蛋白与1mL QuilA皂苷(浓度为1mg/mL，溶于PBS)混合免疫；rSsCLP1，rSsCLP2和rSsCLP3是指在第一和第二次免疫时，分别用1mL QuilA皂苷(浓度为1mg/mL，溶于PBS)与100μg(第一次)和200μg(第二次)纯化的rSsCLP蛋白混合免疫；
[0023] 图4所示为疥螨感染后2周(a)和4周(b)兔后肢炎症反应与病变评分；图中横线表示各组平均值；PBS：两次分别用1mL 0.01M PBS免疫；Quil A：两次分别用1mL浓度为1mg/mL的QuilA皂苷(溶于PBS)免疫；vector protein：分别用100μg(第一次)和200μg(第二次)纯化的pET-32a(+)载体蛋白与1mL QuilA皂苷(浓度为1mg/mL，溶于PBS)混合免疫；rSsCLP1，rSsCLP2和rSsCLP3是指在第一和第二次免疫时，分别用1mL QuilA皂苷(浓度为1mg/mL，溶于PBS)与100μg(第一次)和200μg(第二次)纯化的rSsCLP蛋白混合免疫；rSsCLP免疫组(rSsCLP1，rSsCLP2和rSsCLP3)的炎症反应和病变面积显着低于PBS对照组(*P<0.01)，显着低于Quil A对照组(#P<0.01)和显著低于载体蛋白对照组(+P<0.01)；
[0024] 图5所示为疥螨感染后4周兔后肢痂皮面积；图中横线表示各组平均值；PBS：两次分别用1mL 0.01M PBS免疫；Quil A：两次分别用1mL浓度为1mg/mL的QuilA皂苷(溶于PBS)免疫；vector protein：分别用100μg(第一次)和200μg(第二次)纯化的pET-32a(+)载体蛋白与1mL QuilA皂苷(浓度为1mg/mL，溶于PBS)混合免疫；rSsCLP1，rSsCLP2和rSsCLP3是指在第一和第二次免疫时，分别用1mL QuilA皂苷(浓度为1mg/mL，溶于PBS)与100μg(第一次)和200μg(第二次)纯化的rSsCLP蛋白混合免疫；rSsCLP免疫组(rSsCLP1，rSsCLP2和rSsCLP3)的痂皮面积显着低于PBS对照组(*P<0.01)，显著低于Quil A对照组(#P<0.01)和显著低于载体蛋白对照组(+P<0.01)；
[0025] 图6所示为疥螨感染前后兔特异性抗体IgG水平；PBS：两次分别用1mL0.01M PBS免疫；Quil A：两次分别用1mL浓度为1mg/mL的QuilA皂苷(溶于PBS)免疫；vector protein：分别用100μg(第一次)和200μg(第二次)纯化的pET-32a(+)载体蛋白与1mL QuilA皂苷(浓度为1mg/mL，溶于PBS)混合免疫；rSsCLP1，rSsCLP2和rSsCLP3是指在第一和第二次免疫时，分别用1mL QuilA皂苷(浓度为1mg/mL，溶于PBS)与100μg(第一次)和200μg(第二次)纯化的rSsCLP蛋白混合免疫；rSsCLP免疫组(rSsCLP1，rSsCLP2和rSsCLP3)的IgG水平显着高于PBS对照组(*P<0.01)，显著高于Quil A对照组(#P<0.01)和显著高于载体蛋白对照组(+P<0.01)；横坐标箭头分别表示第一次免疫时间、第二免疫时间以及攻虫时间。
具体实施方式
[0026] 本发明公开了疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的新应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0027] 在本发明具体实施例的相关实验中，所有新西兰兔严格按照“中华人民共和国动物保护法”(2009年9月18日发布的草案)进行处理。所有程序严格按照“四川农业大学动物伦理委员会实验动物护理指南”(批准号：2013-028；中国雅安)实施。包括任何相关细节在内的的所有方法均按照相关准则和规定进行。
[0028] 1、实验动物和相关材料
[0029] 实验中，20只新西兰兔购自成都达硕生物科技有限公司(中国成都)，饲养1周后进行疥螨感染。疥螨由四川农业大学动物医学院动物寄生虫病研究中心提供。感染4周后，收取患部痂皮，收集螨虫(成虫，若虫和幼虫混合物)，进行RNA抽提、虫体粗蛋白提取以及攻虫实验。在抽提RNA与虫体粗蛋白之前将适量的螨储存在液氮中备用。使用RNA抽提试剂盒(Waston，中国上海)从螨中提取RNA，并使用cDNA合成试剂盒(Thermo，中国上海)将RNA反转录成cDNA。将cDNA保存于-70℃备用。使用总蛋白提取试剂盒(BestBio，中国上海)从螨中提取粗蛋白。将虫体粗蛋白保存于-70℃备用。疫苗实验中，72只(雌雄各半)3月龄新西兰兔购自成都达硕生物科技有限公司(中国成都)，用于疫苗免疫实验。收集螨虫并计数后，螨虫具有较强的活性，立即进行攻虫实验。所有的血清样品储存在-20℃备用。
[0030] 2、重组SsCLP蛋白的克隆、表达与纯化
[0031] 使用Primer 5.0软件设计相应引物，由公司(Invitrogen，北京)合成，引物如下：上游引物，5'-CGG GAT CCA TGC AAG AGC TTCGTAA-3'，BamHI作为限制性酶切位点(下划线)；下游引物，5'-CCC TCGAGA TCA TAG AAG ATC ATA GAA AT-3'，SacI作为限制性酶切位点(下划线)。通过以下PCR体系扩增SsCLP 457-1251bp序列，94℃预变性5min，94℃变性
45s，55℃退火45s，72℃扩增45s，30个循环，72℃延伸10min。将扩增的片段克隆到pET-32a(+)表达载体(Invitrogen，北京)中，将构建的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)(TIANGEN，北京)中，用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导6h。根据说明书，使用Ni-NTA His标签亲和层析柱(Bio-Rad，美国)从表达出的可溶蛋白中分离纯化重组SsCLP蛋白。
45s，55℃退火45s，72℃扩增45s，30个循环，72℃延伸10min。将扩增的片段克隆到pET-32a(+)表达载体(Invitrogen，北京)中，将构建的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)(TIANGEN，北京)中，用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导6h。根据说明书，使用Ni-NTA His标签亲和层析柱(Bio-Rad，美国)从表达出的可溶蛋白中分离纯化重组SsCLP蛋白。
[0032] 3、病灶评分与螨虫计数
[0033] 攻虫后，从第1周至4周，每一周对由疥螨引起的皮肤损伤进行评分。炎症反应和皮肤病变分级如下：0分—无炎症反应；1分—轻微的炎症反应；2分—严重的炎症反应；3分—2 2
在四肢上观察到有疥疮病灶(病变≤7.75cm )；4分—病灶面积为7.75-15.5cm (包括
15.5cm2)；5分—病灶面积为15.5-31cm2。攻虫4周后，兔子安乐死，收取每只家兔足部的痂皮计数螨虫的数量。
在四肢上观察到有疥疮病灶(病变≤7.75cm )；4分—病灶面积为7.75-15.5cm (包括
15.5cm2)；5分—病灶面积为15.5-31cm2。攻虫4周后，兔子安乐死，收取每只家兔足部的痂皮计数螨虫的数量。
[0034] 4、抗体反应
[0035] 采用棋盘式滴定法确定rSsCLP蛋白和血清的最佳反应浓度。间接ELISA方法步骤参照本研究小组已报道文章。使用基于rSsCLP建立的间接ELISA方法检测免疫前和免疫后的血清样品中的抗体IgG水平。
[0036] 5、数据分析
[0037] 本发明数据分析均在R统计环境中进行，置信区间95％(α＝0.050)。所有图形均使用GraphPad Prism(5.0版)制作。使用IBM SPASS statistics(2.0版)进行数据统计学差异分析。同时对每个因变量(IgG水平，病变等级，损伤评分和体重)进行重复测量的方差分析。将免疫组和时间作为固定变量分析数据，并将兔子作为随机变量来解释重复测量变异性。
[0038] 以下就本发明所提供的一种免疫保护组合蛋白及其免疫疫苗做进一步说明。
[0039] 实施例1：SsCLPs和其他物种CLPs之间的系统进化发生关系
[0040] 使用完整的SsCLP序列，用DNAStar软件(版本7.0)将其翻译成氨基酸序列，用DNAMAN(版本7.0)比较该基因与其他物种同源基因之间的相似性。使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，Transmembrane Prediction(http://www.sbc.su.se/～miklos/DAS/)，TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和ExPasy(http://web.expasy.org/protparam/)对该蛋白的信号肽，跨膜区和亚细胞定位分别进行预测，并计算预测蛋白分子量和pI值。根据NCBI数据库中其他物种同源蛋白质序列，使用在线软件Clustal W2(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/)进行比较分析。最后，使用MEGA 5.05软件以最大似然法(ML)构建各物种CLP的进化树。
[0041] 结果见图1，使用MEGA软件，对疥螨CLPs和近40种物种的几丁质酶及同源基因序列采用最大似然法(ML)构建无根系统发育树。在树中使用的CLP序列或几丁质酶序列，以物种名以及其GenBank或SwissProt登录号展示。蛋白质缩写词后面的数字(例如Chi1，CLP2，CLP3等)来自NCBI数据库，代表该物种具有多种这类蛋白质。其中，注释如下：gb：GenBank或SwissProt登录号；Chi：几丁质酶；CLP：几丁质酶样蛋白质；CDCP：含几丁质酶结构域的蛋白质。
[0042] 系统发育分析表明，该SsCLP基因被归为第五分支，该序列与埋内欧尘螨(Euroglyphus maynei)CLP具有较高的同源性。
[0043] 实施例2：重组SsCLP(rSsCLP)的表达及识别
[0044] 成功克隆出795bp的ORF序列，然后构建目标序列的pET-32a(+)表达载体(Invitrogen)质粒并将重组质粒克隆到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达。用1mM IPTG诱导6小时后，CLP的蛋白表达水平达到峰值。重组SsCLP表达蛋白是分子量约为49kDa的可溶性蛋白(包括载体编码的氨基酸；图2，泳道2)。根据说明书，在适宜条件下通过亲和层析完成可溶蛋白的分离纯化。纯化和浓缩后，通过12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白，纯化的rSsCLP约49kDa(图2，泳道3)。
[0045] 通过免疫印迹检测rSsCLP的抗原反应性。自然感染S.scabiei的兔血清样品(实验组)和抗rSsCLP兔血清样品都能识别抗原rSsCLP蛋白，显示大小 蛋白信号条带，表明SsCLP重组蛋白具有强反应性和良好的免疫原性(图2，泳道5、6)。健康兔血清样品(阴性对照)无法识别抗原蛋白信号(图2，泳道7)。以实验组兔血清样品识别疥螨粗提取物作为内参，结果显示大小 (416个氨基酸残基)蛋白质信号(图2，泳道8)。
[0046] 实施例3：rSsCLP疫苗免疫实验
[0047] 实验中，共72只3月龄新西兰兔(36只雌性和36只雄性)用于免疫实验。兔重量为2.3±0.2kg，将兔随机分成六组，每组12只，并通过颈部皮下注射方法免疫两次(两次免疫间隔14天)。第一组两次免疫相同的1mL0.01MPBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，
2mM KH2PO4，pH 7.4)，作为空白对照组；第二组两次免疫相同的1mL浓度为1mg/mL(溶于PBS)的Quil-A皂苷佐剂(Sigma，USA)，作为佐剂对照组；第三组免疫纯化后的pET-32a(+)空载体表达的蛋白，蛋白与1ml Quil-A皂苷混合后注射，蛋白剂量为100μg(初次注射)和200μg(第二次注射)，Quil-A皂苷浓度为1mg/mL(溶于PBS)，作为空载体蛋白对照组；第四组两次免疫分别用100μg和200μg纯化的rSsCLP蛋白与1mL Quil-A皂苷混合物，Quil-A皂苷浓度为
1mg/mL(溶于PBS)，作为实验组。第五组和第六组免疫方法与第四组完全相同，作为生物学重复组。第二次免疫两周后，使用大约2000只活螨对每只实验用兔进行人工攻虫，攻虫部位选择兔的后肢足部。在免疫前和免疫后过程中的每周收集血清样品直到攻虫后第4周。攻虫后每周拍照记录兔后肢的皮肤损伤情况，每周测量疥疮病灶面积和实验兔体重。
2mM KH2PO4，pH 7.4)，作为空白对照组；第二组两次免疫相同的1mL浓度为1mg/mL(溶于PBS)的Quil-A皂苷佐剂(Sigma，USA)，作为佐剂对照组；第三组免疫纯化后的pET-32a(+)空载体表达的蛋白，蛋白与1ml Quil-A皂苷混合后注射，蛋白剂量为100μg(初次注射)和200μg(第二次注射)，Quil-A皂苷浓度为1mg/mL(溶于PBS)，作为空载体蛋白对照组；第四组两次免疫分别用100μg和200μg纯化的rSsCLP蛋白与1mL Quil-A皂苷混合物，Quil-A皂苷浓度为
1mg/mL(溶于PBS)，作为实验组。第五组和第六组免疫方法与第四组完全相同，作为生物学重复组。第二次免疫两周后，使用大约2000只活螨对每只实验用兔进行人工攻虫，攻虫部位选择兔的后肢足部。在免疫前和免疫后过程中的每周收集血清样品直到攻虫后第4周。攻虫后每周拍照记录兔后肢的皮肤损伤情况，每周测量疥疮病灶面积和实验兔体重。
[0048] 免疫rSsCLP后，其保护效果通过炎症反应分级和攻虫后测量病灶面积来评估。攻虫5天后，可观察到所有实验兔受感染的后肢发生炎症和瘙痒症状。在感染10天后，三个实验组中的74.3％(26/35；一例死亡)兔子的临床症状已经缓解，并且与无疥螨感染兔相比没有显着差异。炎症反应和病变区域的等级显示，感染4周后三个实验组(一例死亡)和三个对照组(两例死亡)之间存在显着差异(P<0.01；图3，4，5)，随着感染时间的延长差异更加明显。在实验结束时，与感染前相比，在攻虫4周后，实验组69只兔子中的近80％表现出不同程度的体重增加，从0.1kg至0.35kg不等。来自三个对照组的一些兔子(13只兔子，69只兔子中接近20％)表现出从0.05kg至0.25kg的体重减轻。在攻虫的第四周，实验组疥疮没有扩散到前肢。感染4周后，与三个对照组相比，三个免疫rSsCLP蛋白组中的病变面积显著减少(P<0.01；图5)。
[0049] 实施例4：抗体反应
[0050] 基于rSsCLP蛋白建立的间接ELISA方法，其最佳条件为：蛋白包被浓度为4μg/mL，血清稀释度为1:120，二抗稀释度为1:3000。通过rSsCLP间接ELISA方法检测血清样品中特异性IgG抗体。首次免疫后，在免疫rSsCLP蛋白组中，特异性IgG抗体增加，并且抗体水平显着高于QuilA皂苷和PBS对照组的抗体水平(P<0.01；图6)。载体蛋白组的IgG抗体水平也增加，但比免疫rSsCLP组低(P<0.01；图6)。第二次免疫两周后，在三个实验组中，特异性IgG抗体水平增加到最高值(OD450nm～1.4)并在攻虫后保持稳定的抗体水平(P<0.01；图6)。在整个实验过程中，QuilA皂苷和PBS对照组特异性IgG一直处于较低的抗体水平(图6)。另外，载体蛋白组的抗体水平在实验期间迅速降低(图6)，不稳定，没有保护作用，表明载体蛋白对rSsCLP的免疫作用和特异性抗体的产生没有影响。
[0051] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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