疥螨蛋白酪氨酸激酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒
阅读：895发布：2020-05-11
专利汇可以提供疥螨蛋白酪氨酸激酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，本发明提供了 疥螨 蛋白酪 氨 酸激酶作为 疥螨病 诊断 抗原 的应用，相关实验结果显示，疥螨蛋白酪氨酸激酶能够被自然感染疥螨的兔阳性血清以及抗PTK的兔血清识别，具有较强的反应原性，同时SsPTK‑ELISA方法表现出极高敏感性和特异性，对早期疥螨病具备百分百的检出率，种种结果证明疥螨蛋白酪氨酸激酶可以作为疥螨病的诊断抗原，特别是在对早期疥螨病的诊断中。，下面是疥螨蛋白酪氨酸激酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒专利的具体信息内容。
1.疥螨蛋白酪氨酸激酶在制备诊断疥螨病的试剂盒中的应用，所述试剂盒以疥螨蛋白酪氨酸激酶为诊断抗原，且用于检测血清抗体。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述疥螨病为早期疥螨病。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述ELISA试剂盒为基于ELISA间接法的试剂盒。
5.一种诊断早期疥螨病的ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被有疥螨蛋白酪氨酸激酶的固相载体，所述试剂盒用于检测血清抗体。
6.根据权利要求5所述ELISA试剂盒，其特征在于，还包括酶标二抗、洗涤液、显色液、封闭液中的一种或两种以上。
7.根据权利要求6所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶抗体。
8.根据权利要求6所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBS-T洗涤液。
9.根据权利要求6所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述显色液为3,3,5,5-四甲基联苯胺。
10.根据权利要求6所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述封闭液为脱脂牛奶。
疥螨蛋白酪氨酸激酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 疥螨病是一种严重威胁人类和动物健康的高度传染性的寄生虫病。疥螨(Sarcoptes scabiei)破坏宿主皮肤，引起皮肤炎症，皮肤瘙痒和皮肤病变等症状，从而引发一系列健康问题，特别是在社会弱势群体如土著人口以及一些发展中国家贫困地区的人群。世界各地，每年有3亿人患有疥螨病，有100多种动物感染疥螨，导致严重的健康问题和经济损失。感染疥螨病后，如果不能及时治疗，很容易继发感染细菌，从而发生脓皮病。由于贫困和生活条件差，发展中国家铲除疥螨病是一项艰巨的任务。
[0003] 目前，有关疥螨的部分功能基因，过敏原分子以及疫苗的研究日新月异，所有研究目的在于了解疥螨的生物特性，从而更好预防和治疗疥螨病。例如，发现灭活的丝氨酸蛋白酶与疥螨的免疫逃避有关，天冬氨酸蛋白酶在宿主皮肤和血清分子的消化中起作用，可能是降低疥螨存活率的杀螨药物的靶点。此外，重组疥螨载脂蛋白抗原Sar s 14.3是一个有希望的免疫诊断抗原，可引起高水平的IgE和IgG，但只有在严重感染疥螨病例中可以检测到较高水平的IgE，因此，重组Sar s 14.3不适合作为疥螨早期感染的诊断抗原。而疥螨总蛋白作为诊断抗原也存在一些弊端，例如不易获得抗原或者获得量较低。
[0004] 因此，人类和动物疥螨病的诊断仍然很困难，并且没有商业免疫诊断方法可用于疥螨病的诊断。目前，疥螨感染的诊断通常采用观察临床症状，并在感染后产生的痂皮中检测到疥螨进行确认。然而，研究发现在感染疥螨后的猪的痂皮中只有45％动物能够观察到疥螨，所以刮片检查方法有极大的漏检率，使得准确的诊断变得困难。
[0005] 特别是在感染的早期阶段，疥螨病症状一般是亚临床型，不能轻易地将疥螨病与虱子，螃蟹虱，湿疹和无毛癣区分开。迄今为止，没有有效的医学诊断技术可用于早期疥螨病的确认诊断。因此，探索发现有效的诊断方法是很有现实意义的。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供疥螨蛋白酪氨酸激酶(SsPTK)作为疥螨病，特别是早期疥螨病的诊断抗原的应用，以及在制备诊断疥螨病试剂盒中的应用，使得疥螨蛋白酪氨酸激酶能够被自然感染疥螨的兔阳性血清以及抗PTK的兔血清识别，具有较强的反应原性，应用于ELISA检测具备高敏感性、特异性和检出率；
[0007] 本发明的另外一个发明目的在于提供一种诊断疥螨病，特别是早期疥螨病的ELISA试剂盒，使其具备较高的敏感性和特异性，并对早期疥螨病具备百分百的检出率。
[0008] 在本文中，疥螨蛋白酪氨酸激酶可以是非天然的，例如是合成的或者由人工载体表达的。术语“非天然的”是指目标物质不是自然界天然存在的，这并不排除所述非天然物质与天然存在的物质具有相同的结构和/或组成。
[0010] 本发明通过原核表达得到重组SsPTK，对其进行免疫印迹，ELISA以及早期诊断方法的建立。SsPTK蛋白大约30kDa,无信号肽，该基因与兔痒螨(Psoroptes ovis cuniculi)PTK基因具有高同源性。免疫印迹结果显示，该蛋白质能够被自然感染疥螨的兔阳性血清以及抗PTK的兔血清识别，具有较强的反应原性；ELISA分析显示，重组SsPTK建立的ELISA方法具有一定的诊断价值，其敏感性为95.2％(40/42)，特异性为94.1％(48/51)，优于使用重组切丝蛋白建立的ELISA方法(83.3％敏感性，87.9％特异性，数据来源于Zheng,Y.et al.Characterization of Sarcoptes scabiei cofilin gene and assessment of recombinant cofilin protein as an antigen in indirect-ELISA for diagnosis.BMC infectious diseases.16,1-7(2015))，提示该重组蛋白质可以作为潜在的诊断候选分子。根据建立的SsPTK-ELISA方法，早期诊断结果显示，重组SsPTK对人工感染疥螨1周的兔血清检出率为100％(24/24)，表明该蛋白具有早期诊断的潜力。
[0011] 基于上述内容，本发明提供了疥螨蛋白酪氨酸激酶作为疥螨病的诊断抗原的应用，特别是作为早期疥螨病的诊断抗原。同时，本发明还提供了疥螨蛋白酪氨酸激酶在制备诊断疥螨病的试剂盒中的应用，特别是在制备诊断早期疥螨病的试剂盒中的应用；其中，所述试剂盒优选为ELISA试剂盒，更具体地，该ELISA试剂盒为基于ELISA间接法的试剂盒。
[0012] 根据上述SsPTK建立的ELISA方法的试验数据可以得知，ELISA试剂盒具备极高的敏感性、特异性和对早期疥螨病检出率。基于上述应用，本发明对应提供了一种诊断早期疥螨病的ELISA试剂盒，包括包被有疥螨蛋白酪氨酸激酶的固相载体。在本发明具体实施方式中，所述固相载体可选择为96孔培养板或与其相似的固相载体，所述疥螨蛋白酪氨酸激酶包被浓度为4μg/mL，可采用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释进行包被。
[0013] 在确定了试剂盒核心组分后，所述ELISA试剂盒还可包括酶标二抗、洗涤液、显色液、封闭液中的一种或两种以上。
[0015] 所述洗涤液优选为PBS-T洗涤液，在本发明具体实施方式中，所述PBS-T洗涤液组成为：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.1％v/v tween-20，pH 7.4；
[0016] 所述显色液优选为3,3,5,5-四甲基联苯胺，在本发明具体实施方式中，该显色底物采用购自于北京TIANGEN；
[0018] 由以上技术方案可知，本发明提供了疥螨蛋白酪氨酸激酶作为疥螨病诊断抗原的应用，相关实验结果显示，疥螨蛋白酪氨酸激酶能够被自然感染疥螨的兔阳性血清以及抗PTK的兔血清识别，具有较强的反应原性，同时SsPTK-ELISA方法表现出极高敏感性和特异性，对早期疥螨病具备百分百的检出率，种种结果证明疥螨蛋白酪氨酸激酶可以作为疥螨病的诊断抗原，特别是在对早期疥螨病的诊断中。附图说明
[0019] 图1所示为24个物种PTK的进化树；
[0020] 图2所示为重组SsPTK蛋白SDS-PAGE试验结果；其中，1表示未纯化重组SsPTK蛋白，2表示分离纯化后重组SsPTK蛋白，3表示疥螨虫体总蛋白，4表示纯化后重组SsPTK蛋白与自然感染疥螨兔的血清进行免疫印迹反应，5表示纯化后重组SsPTK蛋白与抗重组SsPTK兔的血清进行免疫印迹反应，6表示阴性血清，7表示纯化后重组SsPTK与总蛋白反应；
[0021] 图3所示为24份阴性血清和42份感染疥螨兔的血清的OD450值，其中Serum Samples表示血清样品，S.scabiei infected rabbits表示感染疥螨兔的血清，rabbits表示阴性血清；
[0022] 图4所示为未感染疥螨的兔血清、感染球虫的兔血清、感染痒螨的兔血清以及感染豆状囊尾蚴的兔血清的OD450值，其中，Serum Samples表示血清样品， rabbits表示阴性血清，P.ovis cuniculi表示感染痒螨的兔血清，Eimeria spp.表示感染球虫的兔血清，C.pisiformis表示感染豆状囊尾蚴的兔血清；
[0023] 图5所示为未感染疥螨兔血清和人工感染疥螨后1周兔血清的OD450值，其中Serum Samples表示血清样品，before infestation表示未感染疥螨兔血清，infestation 1week表示人工感染疥螨后1周兔血清。
具体实施方式
[0024] 本发明公开了疥螨蛋白酪氨酸激酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用及试剂盒已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的组合物和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0025] 在具体实施方式中，本发明记载了SsPTK的克隆，表达与纯化。通过免疫印迹，探索了重组SsPTK蛋白的反应性。本发明还评估了重组SsPTK作为诊断抗原的潜力，建立了SsPTK间接ELISA方法，并对早期感染疥螨的兔进行了血清学诊断。
[0026] 本发明克隆表达了SsPTK基因，系统发育树分析显示SsPTK归为节肢动物分支。氨基酸序列比较显示不同物种之间具有相似的高度保守区域，物种之间该基因位点的突变会改变功能与生理上的作用。
[0027] 本发明建立的基于重组SsPTK的ELISA，具有良好的诊断效果，敏感性为95.2％，特异性为94.1％，优于使用重组切丝蛋白建立的ELISA方法(83.3％敏感性，87.9％特异性)。在本发明的早期诊断实验(感染1周)中，通过建立的重组SsPTK-ELISA，可以100％检测到24份阳性血清样品中的特异性抗体IgG，并且与人工感染前血清样品抗体水平差异极显著(p<
0.01)。这表明在疥螨感染的早期阶段，抗PTK抗体显着增加。值得注意的是，当使用人工感染兔子2周的血清样品时，我们也检测到抗PTK抗体，但结果与感染1周的样品抗体水平没有显著差异(p>0.05；数据未显示)。因此，重组SsPTK在疥螨感染的早期阶段具有潜在的血清诊断价值。
0.01)。这表明在疥螨感染的早期阶段，抗PTK抗体显着增加。值得注意的是，当使用人工感染兔子2周的血清样品时，我们也检测到抗PTK抗体，但结果与感染1周的样品抗体水平没有显著差异(p>0.05；数据未显示)。因此，重组SsPTK在疥螨感染的早期阶段具有潜在的血清诊断价值。
[0028] 本发明建立的重组SsPTK-ELISA方法表现出极高敏感性和特异性。42份严重感染疥螨兔血清样品抗体水平与24份未感染疥螨兔血清样品抗体水平呈现极显著差异(p<0.01)。在交叉反应实验中，9份感染痒螨兔血清样品中有3份显示为阳性反应，可能是因为兔疥螨PTK与兔痒螨PTK存在较高的同源性有关。然而，交叉反应实验说明本发明可以区分开兔螨虫病的感染与兔其他寄生虫的感染。在不同寄生虫感染前后过程中，总IgG水平变现为明显的差异，未感染寄生虫兔血清抗体水平与感染艾美球虫，豆状囊尾蚴，兔痒螨的兔血清抗体水平呈现极显著差异(p<0.01)。种种实验结果说明，重组SsPTK在疥螨感染早期阶段具有诊断潜力。
[0029] 在具体实施方的实验中，所有实验兔子严格按照“中华人民共和国动物保护法”(2009年9月18日发布的草案)进行处理。所有程序严格按照“四川农业大学动物伦理委员会实验动物护理指南”(中国，雅安；批准号：2013-028)实施。所有方法均按照相关准则和规定进行，包括任何相关细节。
[0030] 此外，实验所涉及的虫体和血清按如下方式进行：
[0031] 实验中，42只自然感染疥螨两个月的新西兰白兔，由四川农业大学动物医学院寄生虫病研究中心提供。从感染的兔子收集疥螨后，螨虫储存在液氮中。使用RNA提取试剂盒(Waston，上海)进行螨虫的RNA分离，使用cDNA合成试剂盒(Thermo，上海)反转录成cDNA，并储存在-70℃备用。使用总蛋白提取试剂盒(BestBio，上海)从疥螨中提取总蛋白。收集上述42只感染疥螨的兔血清样品(42)进行敏感性测试。收集24只无疥螨症状的新西兰白兔的血样，作为阴性对照，以确定临界值并进行交叉反应性测试。同时收集感染艾美尔球虫(Eimeria spp.)兔血清样品(9份)，感染兔痒螨(P.ovis cuniculi)兔血清样品(9份)以及感染豆状囊尾蚴(C.pisiformis)兔血清样品(9份)，3种样品来自于四川省三家不同养兔场。选其他24只新西兰白兔进行早期诊断实验，分别对其进行血清样品收集，收集时间为人工感染疥螨前，人工感染疥螨1周以及人工感染疥螨2周。所有血液样品储存在-20℃备用。
所有实验用兔均来自中国四川省的兔养殖场。
所有实验用兔均来自中国四川省的兔养殖场。
[0032] 数据分析按照如下方式进行：
[0033] 根据实验结果，使用GraphPad Prism版本5.0(GraphPad Software)对数据进行分析。使用IBM SPASS统计2.0(SPASS软件)分析组间差异的显著性。临界值计算(具体可见实施例5)：阴性血清样品的OD450值的算术平均值加上三个标准偏差。敏感性百分比用下式计算：ELISA阳性/疥螨病阳性×100；特异性百分比用下式计算：ELISA阴性/疥螨病阴性×100。
[0034] 以下就本发明所提供的疥螨蛋白酪氨酸激酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒做进一步说明。
[0035] 实施例1：重组SsPTK蛋白的克隆、表达与纯化
[0036] 根据疥螨转录组数据(基因登录号：KY080515)的全长PTKcDNA，扩增编码SsPTK的ORF。使用Primer 5.0软件设计相应引物，由公司(Invitrogen，北京)合成，引物如下：正向，5'-CGG GAT CCATGC TCAAAAGTT ACG CTG TTC-3'，BamHI作为限制性酶切位点(下划线)；反向，5'-CGA GCT CTT ATG TTA TCG TAG ATG TTG TTG CT-3'，SacI作为限制性酶切位点(下划线)。通过PCR体系扩增SsPTK，94℃预变性5分钟，然后94℃变性45秒，62℃退火45秒，72℃
45秒扩增，35个循环，72℃10分钟。将得到的片段克隆到pET32a(+)表达载体(Invitrogen，北京)中，将构建的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)(TIANGEN，北京)中，用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导10小时。根据说明书，使用Ni-NTAHis标签亲和层析柱(Bio-Rad，美国)通过色谱法在变性条件(8M尿素)中从包涵体中分离纯化重组SsPTK蛋白。
45秒扩增，35个循环，72℃10分钟。将得到的片段克隆到pET32a(+)表达载体(Invitrogen，北京)中，将构建的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)(TIANGEN，北京)中，用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导10小时。根据说明书，使用Ni-NTAHis标签亲和层析柱(Bio-Rad，美国)通过色谱法在变性条件(8M尿素)中从包涵体中分离纯化重组SsPTK蛋白。
[0037] 实施例2：PTK基因的生物信息学分析
[0038] 使用完整的SsPTK序列，用DNAStar软件(版本7.0)将其翻译成氨基酸序列，用DNAMAN(7.0版)比较同源基因之间的相似性，结果见图1。使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，Transmembrane Prediction(http://www.sbc.su.se/～miklos/DAS/)，TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和ExPasy(http://web.expasy.org/protparam/)分别对其潜在的信号肽，跨膜区和亚细胞定位进行预测，并计算预测分子量和pI值。根据NCBI数据库中其他物种同源蛋白质，使用在线软件ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/)进行比较分析。最后，我们使用MEGA5.05软件以邻近连接(NJ)方法构建24个物种PTK的进化树，结果见图2。
[0039] SsPTK基因序列开放阅读框(ORF)为825个碱基,编码274个氨基酸，与其他物种PTK氨基酸序列之间的保守性较高，与兔痒螨相似性达到85.53％，与二斑叶螨和转基因捕食螨相似性分别为69.07％、57.81％，然而与扁形动物与脊椎动物相似性在50％左右。经氨基酸序列预测，SsPTK蛋白没有信号肽和跨膜区，其相对分子量约为31.1kDa，等电点为8.56，分布于细胞周质之中。SsPTK二级结构具有典型的ATP结合位点和多肽结合位点，其在蛋白氨基酸残基磷酸化中起到关键作用。基于动物界PTK基因氨基酸序列的进化分析显示，所有序列主要归为四大分支，即脊椎动物分支、线虫分支、节肢动物分支以及脊椎动物分支，SsPTK归为节肢动物分支(图1)。
[0040] 实施例3：重组SsPTK的表达及识别
[0041] 免疫印迹试验：将样品(40μL蛋白质和10μL上样缓冲液)煮沸10分钟，通过12％SDS-PAGE分离，并使用半干式转印槽(Bio-Rad)将目的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，转膜时间为35min。转膜后，用TBST(20mM TRIS-HCl，150mM NaCl，0.05％v/v tween-20，pH 7.4)洗涤膜3次，每次5min，然后于5％脱脂牛奶中封闭2h，2h后加入一抗4℃孵育过夜(用0.01M PBS稀释1:100)。接下来，用TBST洗涤膜四次，每次5min，然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔抗体(Earthox，美国)(1:100稀释)孵育2小时。最后，TBST洗涤膜多次，使用二氨基联苯胺试剂(TIANGEN，北京)显色，观察结果。
[0042] 经凝胶电泳显示，由特异性引物PCR扩增的产物为一条825bp左右的条带，与转录组数据中的SsPTK基因大小一致。经测序得到的序列与转录组中的序列相似性达到100％，即表明该片段为SsPTK基因的全序列。
[0043] 经亲和层析后的重组蛋白质在SDS-PAGE下显示为单一条带，大约为48kDa(加上载体蛋白约为17kDa)。该蛋白在1mM IPTG 37度诱导8h后达到较高的表达量，表达产物为包涵体形式(图2中1泳道)。12％SDS-PAGE成功分离纯化后重组SsPTK蛋白(图2中2泳道)与疥螨虫体总蛋白(图2中3泳道)。纯化后重组SsPTK蛋白与自然感染疥螨兔的血清以及抗重组SsPTK兔的血清进行免疫印迹反应，发现其能够同时被两种血清特异性识别(图2中4、5泳道)；当用阴性血清反应时，无条带显示(图2中6泳道)；纯化后重组SsPTK与总蛋白反应时，可识别大约为30kDa的蛋白(图2中7泳道)，说明SsPTK具有较好的反应原性。
[0044] 实施例4：SsPTK多克隆抗体的制备
[0045] 本实验包括两只雄性新西兰白兔。免疫前收集兔阴性血清。兔免疫三次，第一次和第二次免疫之间间隔7天，第二次和第三次之间间隔14天。第一次免疫使用等体积的弗氏完全佐剂(Sigma，美国)乳化的200μg纯化的重组SsPTK，第二次与第三次免疫使用100μg纯化的重组蛋白和相同体积的弗氏不完全佐剂(Sigma，美国)免疫。免疫2周后，收集抗重组SsPTK蛋白血清样品，用于测试抗体滴度。根据说明书，使用Protein G-Sepharose柱(Bio-Rad，美国)纯化抗血清，从血清成分中分离免疫球蛋白G(IgG；特异性兔抗重组SsPTK抗体)[0046] 实施例5：SsPTK间接ELISA方法的建立及血清样品特异性抗体IgG的测定[0047] 实验采用棋盘滴定法，以确定重组SsPTK蛋白和血清的最佳反应条件。ELISA方法如下：首先，用稀释在0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的蛋白包被96孔培养板，每孔100μL，并在4℃孵育过夜。然后，用PBS-T(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.1％v/v tween-20，pH 7.4)洗涤板三次，每次5min，然后用封闭缓冲液(5％脱脂牛奶，PBS稀释)封闭，37℃，90分钟。第三，用PBS-T洗涤板三次，每次5min，血清样品用PBS稀释1:80，每孔加入100μL，平板在37℃孵育1小时。洗板3次，每次5min，然后向每个孔中加入二抗(100μL用PBS稀释1:5000的山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶抗体(Earthox，美国))，并在37℃下孵育1小时。如前所述洗涤板，并向每个孔(100μL)中加入底物3,3,5,5-四甲基联苯胺(TIANGEN，北京)进行显色，显色时间为15min。最后，终止反应，向每个孔中加入100μL的2M H2SO4，并使用ELISA板读数器在450nm测定光密度(OD)读数。
[0048] 在最佳条件下，测试24只来自未感染疥螨兔的血清样品(阴性血清)，以确定间接ELISA的临界值。临界值作为阴性和阳性血清的分隔标准，计算方式为阴性血清样品的OD450值的平均值加上三个标准偏差值。同时检测42份感染疥螨兔的血清样品中的特异性抗体。交叉反应中，使用未感染疥螨兔(n＝24)的血清样品和感染三种其他常见寄生虫的血清样品，包括：兔艾美球虫(Eimeria spp.)(n＝9)，兔痒螨(P.ovis cuniculi)(n＝9)和兔豆状囊尾蚴(C.Pisiformis)(n＝9)。早期诊断实验中，以人工感染前24只健康兔子的血清样品作为对照，并测定人工感染疥螨1周和2周后的兔子血清样品中的特异性抗体，以评估早期诊断试验中SsPTK的效果。每个板上包括阴性，阳性和空白对照。
[0049] 根据棋盘滴定法，间接ELISA方法最佳的反应条件为，重组SsPTK蛋白包被浓度为4μg/mL，血清稀释比例为1:80，酶标二抗稀释比例为1:5000。通过测定24份阴性血清OD450，计算得出临界值为0.2356(mean＝0.1351,SD＝0.0335)，因此，OD450≥0.2356的样品定为阳性，OD450＜0.2356定为阴性(图3)。
[0050] 实施例6：SsPTK间接ELISA的重复性
[0051] 为了评估SsPTK-ELISA的重复性和再现性，使用了六种阳性血清样品。每个样品同时测试以评估测定板内变异性(重复性)，然后连续测试以评估测定板间变异性(重现性)。进行三次重复性和再现性试验，计算其相应的平均OD 450值，标准偏差(SD)和变异系数(CV)。
[0052] 在ELISA方法中，实验板内重复性的变异系数(CVs)在2.80％到5.96％之间变化，在板与板间重复性的变异系数(CVs)在2.55％到6.80％之间变化，所有数据的变异系数皆小于10％，表明重组SsPTK-ELISA方法是稳定以及可以重复再现的。
[0053] 实施例7：SsPTK间接ELISA方法的敏感性与特异性
[0054] 根据间接ELISA的最佳反应条件，分别对未感染疥螨的兔血清、感染疥螨的兔血清、感染球虫的兔血清、感染痒螨的兔血清以及感染豆状囊尾蚴的兔血清进行特异性抗体IgG的检测。该方法敏感性为95.2％(40/42；图3)。在感染球虫和豆状囊尾蚴的兔血清中不存在交叉反应，但检测感染痒螨的兔血清中，有3份血清出现了阳性反应，该方法特异性为94.1％(48/51；图4)。
[0055] 实施例8：SsPTK间接ELISA的早期诊断
[0056] 本实施例为了评估重组SsPTK-ELISA的早期血清诊断潜力，以24只健康兔子的血清样品作为对照，并对人工感染疥螨后1周和2周的兔血清样品特异性抗体进行检测，评估其早期诊断价值。参照临界值计算阳性诊断率。每个样品测试三次。
[0057] 对24只兔子在感染疥螨前、感染疥螨1周及感染疥螨2周的血清特异性抗体IgG分别进行检测，结果显示，在感染疥螨1周后，可以检测到较高水平的特异性抗体IgG，且检出率为100％(24/24)(图5)；感染疥螨2周后，可以检测出与感染疥螨1周相似的血清抗体水平。
[0058] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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