作为C-KIT和PDGFR激酶抑制剂的化合物和组合物
阅读：489发布：2020-07-22
专利汇可以提供作为C-KIT和PDGFR激酶抑制剂的化合物和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一类新型化合物、包含这类化合物的药物组合物以及用该化合物来 治疗 或 预防 与激酶活性异常或失调有关的 疾病 或病症、特别是涉及c-kit、PDGFRα和PDGFRβ激酶异常激活的疾病或病症的方法。，下面是作为C-KIT和PDGFR激酶抑制剂的化合物和组合物专利的具体信息内容。
1.式I的化合物：
及其可药用盐，其中：
L选自于-NC(O)-、-NC(O)N-和-C(O)N-；
R1、R2a和R2b独立的选自于氢、羟基、C3-8杂环烷基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷基、-NR10R11、-OX1R8；其中X1选自于键和C1-4亚烷基；R8是C3-12环烷基；或者R1和R2a或R1和R2b与R1、R2a或R2b连接的碳原子一起形成苯基；R10和R11独立的选自于氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷基、C3-8杂环烷基、C1-10杂芳基；或R10和R11与两者连接的氮原子一起形成C3-8杂环烷基或C1-10杂芳基；
R3、R4、R5、R6和R7独立的选自于氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、C3-8杂环烷基、-OX2R9、-S(O)0-2R9和-NR12R13；其中X2选自于键和C1-4亚烷基；各R9独立的选自于氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-12环烷基、C3-8杂环烷基和-NR12R13；其中所述的R9的环烷基或杂环烷基任选被1至3个独立的选自于C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷基和-NR12R13的取代基取代；其中R12和R13独立的选自于氢和C1-6烷基；或R4和R5与两者共同连接的碳原子一起形成C3-8杂芳基；
条件是R3、R4、R5、R6或R7中至少有一个含有与苯环直接连接的硫。
2.权利要求1的化合物，其中
L选自于-NC(O)-和-C(O)N-；
R1、R2a和R2b独立的选自于氢、羟基、C3-8杂环烷基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷基、-NR10R11、-OX1R8；其中X1选自于键和C1-4亚烷基；R8是C3-12环烷基；或R1和R2a与两者连接的碳原子一起形成苯基；R10和R11独立的选自于氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷基、C3-8杂环烷基、C1-10杂芳基；或R10和R11与两者连接的氮原子一起形成C3-8杂环烷基或C1-10杂芳基；
R3和R7独立的选自于氢和卤素；
R4和R6独立的选自于氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、-S(O)0-2R9；且R5选自于卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、C3-8杂环烷基、-OX2R9和-S(O)0-2R9；其中X2选自于键和C1-4亚烷基；各R9独立的选自于氢、C1-6烷基、C3-12环烷基和C3-8杂环烷基；其中所述的R9的环烷基或杂环烷基任选被1至3个独立的选自于C1-6烷基和卤代-C1-6烷基的基团取代；或R4和R5与两者共同连接的碳原子一起形成C3-8杂芳基；
条件是R3、R4、R5、R6或R7中至少有一个含有与苯环直接连接的硫。
3.权利要求2的化合物，其中R1选自于氢、羟基、吡咯烷基、吗啉基、甲氧基、二氟甲氧基、2-氟-乙氧基和甲基；或者R1和R2a与两者连接的碳原子一起形成苯基。
4.权利要求3的化合物，其中R4和R6独立的选自于氢、甲基-磺酰基、甲基、2-氟-乙氧基、甲基-哌嗪基-磺酰基、丙氧基、异丁氧基、2，2，2-三氟乙氧基、2，3-二氟-2-(氟甲基)丙氧基、丁氧基和环丙基-甲氧基；R5选自于氢、卤素、甲基-磺酰基、甲基、甲氧基、乙氧基和吗啉基；或R4和R5与二者共同连接的碳原子一起形成噻唑基。
5.权利要求1的化合物，其选自于：N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-氯-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)苯并[d]噻唑-6-甲酰胺；2-氯-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-甲基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)
嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-甲基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-乙氧基-N-(4-甲
基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(5-吗啉-4-基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；
N-(4-甲基-3-(4-(5-(吡咯烷-1-基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)-4-吗啉-4-基苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-(2-氟乙氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-(环丙基甲氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(5-甲基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-(2-氟乙氧
基)-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)-3-丙氧基苯甲酰胺；3-甲氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-丁氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-(环丙基甲氧基)-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(异喹啉-4-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-甲氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(4-甲基哌嗪-1-基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-羟基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-异丁氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)-3-(2，2，2-三氟乙氧基)苯甲酰胺；3-(2，3-二氟-2-(氟甲基)丙氧基)-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。
6.一种药物组合物，其含有治疗有效量的权利要求1的化合物和可药用赋形剂。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述可药用赋形剂适合于非胃肠道给药。
8.权利要求6的药物组合物，其中所述可药用赋形剂适合于口服给药。
9.一种调节激酶活性的方法，其包括向有需要的系统或个体施用治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用盐或药物组合物，从而调节所述激酶活性。
10.权利要求9的方法，其中所述激酶选自于c-kit、PDGFRα和PDGFRβ。
11.权利要求9的方法，其中所述激酶选自于c-kit、Abl、Lyn、MAPK14、PDGFRα、PDGFRβ、ARG、BCR-Abl、BRK、EphB、Fms、Fyn、KDR、LCK、PDGF-R、b-Raf、c-Raf、SAPK2、Src、Tie2和TrkB或其组合。
12.权利要求11的方法，其中所述权利要求1的化合物直接接触c-kit、PDGFRα和/或PDGFRβ激酶受体。
13.权利要求12的方法，其中所述接触在体外或体内发生。
14.一种治疗疾病或病症的方法，其中调节激酶活性可预防、抑制或减轻所述疾病或病症的病理学和/或症状，该方法包括向个体施用治疗有效量的权利要求1的化合物或其可药用盐或药物组合物和任选的治疗有效量的第二种治疗剂。
15.权利要求14的方法，其中所述激酶选自于c-kit、PDGFRα和PDGFRβ激酶受体。
16.权利要求14的方法，其中所述第二种治疗剂是支气管扩张剂、抗炎剂、白三烯拮抗剂或IgE阻断剂。
17.权利要求14的方法，其中所述的权利要求1的化合物在第二种治疗剂之前、与其同时或在其之后给药。
18.权利要求14的方法，其中所述疾病或病症选自于肿瘤性病症、过敏性病症、炎性病症、自身免疫性病症、疟原虫相关疾病、与肥大细胞有关的疾病、移植物抗宿主病、代谢综合征、CNS相关病症、神经变性病症、疼痛情况、物质滥用、朊病毒病、癌症、心脏病、纤维变性疾病、特发性动脉压过高、硬皮病和原发性肺动脉高压。
19.权利要求18的方法，其中所述肿瘤性病症选自于肥大细胞增多症、胃肠道间质瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、脊髓发育不良综合征、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、胃癌、睾丸癌、成胶质细胞瘤和星形细胞瘤。
20.权利要求18的方法，其中所述过敏性病症选自于哮喘、过敏性鼻炎、过敏性鼻窦炎、过敏性综合征、荨麻疹、血管性水肿、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、结节性红斑、多形性红斑、皮肤坏死性静脉炎、昆虫叮咬皮肤炎症和吸血性寄生虫感染。
21.权利要求18的方法，其中所述炎性病症选自于类风湿性关节炎、结膜炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎。
22.权利要求18的方法，其中所述自身免疫性病症选自于多发性硬化、牛皮癣、肠的炎性疾病、肠易激综合征和肠易激疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、多关节炎、局部或全身性硬皮病、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、皮肤红斑、皮肌炎、多发性肌炎、斯耶格伦氏综合征、结节性全动脉炎、自身免疫性肠病和增生性肾小球肾炎。
23.权利要求18的方法，其中所述移植物抗宿主疾病是器官移植物排斥。
24.权利要求18的方法，其中所述器官移植选自于肾移植、胰腺移植、肝移植、心脏移植、肺移植和骨髓移植。
25.权利要求18的方法，其中所述代谢综合征选自于I型糖尿病、II型糖尿病和肥胖。
26.权利要求18的方法，其中所述CNS相关病症选自于抑郁、心境恶劣障碍、循环型情感障碍、厌食症、易饿病、月经前期综合征、绝经后综合征、智力迟缓、集中力缺失、悲观烦恼、精神激动、自嘲和性欲降低、焦虑症、精神病学病症和精神分裂症。
27.权利要求18的方法，其中所述神经变性病症选自于阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、朊病毒病、运动神经元病和肌萎缩性侧索硬化。
28.权利要求18的方法，其中所述疼痛情况选自于急性痛、术后痛、慢性痛、伤害性疼痛、癌症痛、神经性疼痛和心理性疼痛综合征。
29.权利要求18的方法，其中所述物质使用障碍选自于药物成瘾、药物滥用、药物习惯性、药物依赖性、戒断综合征和超剂量用药。
30.权利要求18的方法，其中所述癌症选自于黑素瘤、胃肠道间质瘤、结肠直肠癌、小细胞肺癌和其它实体肿瘤。
31.权利要求18的方法，其中所述纤维变性疾病选自于丙型肝炎、肝纤维化、心脏纤维化、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肺纤维化和骨髓纤维化。
作为C-KIT和PDGFR激酶抑制剂的化合物和组合物
[0001] 相关申请的交叉参考
技术领域
[0003] 本发明提供一类新型化合物、包含这类化合物的药物组合物以及用该化合物来治疗或预防与激酶活性异常或失调有关的疾病或病症、特别是涉及c-kit、PDGFRα和PDGFRβ激酶异常激活的疾病或病症的方法。
背景技术
[0004] 蛋白激酶代表一大族蛋白质，它们在调节各种细胞过程和保持对细胞功能的控制中扮演重要角色。这些激酶包括但不限于：受体酪氨酸激酶例如血小板衍生生长因子受体激酶(PDGFR)、神经生长因子受体(trkB)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR3、B-RAF)；非受体酪氨酸激酶如Abl、融合激酶BCR-Abl、Lck、Bmx和c-src；和丝氨酸/苏氨酸激酶如c-RAF、sgk、MAP激酶(例如，MKK4、MKK6等)和SAPK2α、SAPK2β。在许多疾病状态中都观察到激酶活性异常，所述疾病状态包括良性和恶性的增殖性疾病以及由免疫和神经系统不合适的激活所导致的疾病。
[0005] 本发明的新型化合物可抑制一种或多种蛋白激酶活性，因此期望其可用于治疗激酶相关疾病。
发明内容
[0006] 本发明一方面提供了式I的化合物：
[0007]
[0009] L选自于-NC(O)-、-NC(O)N-和-C(O)N-；
[0010] R1、R2a和R2b独立的选自于氢、羟基、C3-8杂环烷基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷基、-NR10R11、-OX1R8；其中X1选自于键和C1-4亚烷基；R8是C3-12环烷基；或者R1和R2a或R1和R2b与R1、R2a或R2b连接的碳原子一起形成苯基；R10和R11独立的选自于氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷基、C3-8杂环烷基、C1-10杂芳基；
或R10和R11与两者连接的氮原子一起形成C3-8杂环烷基或C1-10杂芳基；
或R10和R11与两者连接的氮原子一起形成C3-8杂环烷基或C1-10杂芳基；
[0011] R3、R4、R5、R6和R7独立的选自于氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、C3-8杂环烷基、-OX2R9、-S(O)0-2R9和-NR12R13；其中X2选自于键和C1-4亚烷基；各R9独立的选自于氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C3-12环烷基、C3-8杂环烷基和-NR12R13；其中所述的R9的环烷基或杂环烷基任选被1至3个独立的选自于C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷基和-NR12R13的取代基取代；其中R12和R13独立的选自于氢和C1-6烷基；或R4和R5与两者共同连接的碳原子一起形成C3-8杂芳基；
[0012] 条件是R3、R4、R5、R6或R7中至少有一个含有与式I中R3、R4、R5、R6和R7相接的苯环直接连接的硫。
[0013] 本发明的第二方面提供了含有式I化合物或其N-氧化物衍生物、单个异构体或异构体的混合物、或其可药用盐与一种或多种合适的赋形剂的混合物的药物组合物。
[0014] 本发明的第三方面提供了在动物中治疗疾病的方法，其中抑制激酶活性、特别是c-kit、PDGFRα和/或PDGFRβ活性可预防、抑制或减轻所述疾病的病理学和/或症状，该方法包括向所述动物施用治疗有效量的式I化合物或其N-氧化物衍生物、单个异构体或异构体的混合物、或其可药用盐。
[0015] 本发明的第四方面提供了式I化合物在制备用于在动物中治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病的病理学和/或症状与激酶活性、特别是c-kit、PDGFRα和/或PDGFRβ活性有关。
[0016] 本发明的第五方面提供了式I化合物及其N-氧化物衍生物、前药衍生物、被保护的衍生物、单个异构体及异构体的混合物、及其可药用盐的制备方法。
[0017] 发明详述
[0018] 定义
[0019] “烷基”作为一种基团和其它基团例如卤代烷基和烷氧基的结构元素，可以是直链或支链的。C1-4烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。卤代烷基包括三氟甲基、五氟乙基等。
[0020] “芳基”是指包含6至10个环碳原子的单环或稠合的二环芳环结构。例如，本申请中使用的C6-10芳基包括但不限于苯基或萘基，优选苯基。“亚芳基”是指由芳基衍生的二价基团。
[0021] “杂芳基”是指含有1至3个独立的选自于-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-的杂原子的5至15元不饱和环系统，其中R是氢、C1-4烷基或氮保护基团。例如，本申请中使用的C1-10杂芳基(“C1-10”是指环系统中存在1至10个碳原子)包括但不限于吡唑基、吡啶基、吲哚基、噻唑基、3-氧代-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-6-基、呋喃基、苯并[b]呋喃基、吡咯基、1H-吲唑基、咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基、噁唑基、苯并[d]噻唑-6-基、1H-苯并[d][1，2，3]三唑-5-基、喹啉基、1H-吲哚基、3，4-二氢-2H-吡喃并[2，3-b]吡啶基和2，3-二氢呋喃并[2，3-b]吡啶基、3-氧代-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-7-基等。
[0022] “环烷基”是指包含所示数目环碳原子的饱和或部分不饱和的单环、稠合二环或多元桥环结构。例如，C3-10环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
[0023] “杂环烷基”是指含有1至3个独立的选自于-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-的杂原子的3至8元饱和或部分不饱和的环系统，其中R是氢、C1-4烷基或氮保护基团。例如，本文用于描述本发明化合物的C3-8杂环烷基包括但不限于吗啉基、吡咯烷基、氮杂环庚烷基、哌啶基、异喹啉基、四氢呋喃基、吡咯烷基、吡咯烷基-2-酮、哌嗪基、哌啶酮基、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺环[4.5]癸-8-基等。
[0024] “卤素”优选是氯或氟，但也可以是溴或碘。
[0025] “激酶列表”是指激酶的清单列表，其包括Abl(人)、Abl(T315I)、JAK2、JAK3、ALK、JNK1α1、ALK4、KDR、Aurora-A、Lck、Blk、MAPK1、Bmx、MAPKAP-K2、BRK、MEK1、CaMKII(大鼠)、Met、CDK1/细胞周期蛋白B、p70S6K、CHK2、PAK2、CK1、PDGFRα、CK2、PDK1、c-kit、Pim-2、c-RAF、PKA(h)、CSK、PKBα、cSrc、PKCα、DYRK2、Plk3、EGFR、ROCK-I、Fes、Ron、FGFR3、Ros、Flt3、SAPK2α、Fms、SGK、Fyn、SIK、GSK3β、Syk、IGF-1R、Tie-2、IKKβ、TrKB、IR、WNK3、IRAK4、ZAP-70、ITK、AMPK(大鼠)、LIMK1、Rsk2、Axl、LKB1、SAPK2β、BrSK2、Lyn(h)、SAPK3、BTK、MAPKAP-K3、SAPK4、CaMKIV、MARK1、Snk、CDK2/细胞周期蛋白A、MINK、SRPK1、CDK3/细胞周期蛋白E、MKK4(m)、TAK1、CDK5/p25、MKK6(h)、TBK1、CDK6/细胞周期蛋白D3、MLCK、TrkA、CDK7/细胞周期蛋白H/MAT1、MRCKβ、TSSK1、CHK1、MSK1、Yes、CK1d、MST2、ZIPK、c-Kit(D816V)、MuSK、DAPK2、NEK2、DDR2、NEK6、DMPK、PAK4、DRAK1、PAR-1Bα、EphA1、PDGFRβ、EphA2、Pim-1、EphA5、PKBβ、EphB2、PKCβI、EphB4、PKCδ、FGFR1、PKCη、FGFR2、PKCθ、FGFR4、PKD2、Fgr、PKG1β、Flt1、PRK2、Hck、PYK2、HIPK2、Ret、IKKα、RIPK2、IRR、ROCK-II(人)、JNK2α2、Rse、JNK3、Rsk1(h)、PI3 Kγ、PI3 Kδ和PI3-Kβ。针对这个激酶列表(野生型和/或突变型)对本发明化合物进行筛选，本发明化合物对上述列表中至少一种激酶的活性有抑制作用。
[0026] “治疗”是指减轻或缓解疾病和/或其伴随症状的方法。
[0027] 优选实施方案
[0028] c-kit基因编码受体酪氨酸激酶，c-kit受体的配体被称为干细胞因子(SCF)，是肥大细胞生存所必需的主要生长因子。c-kit受体蛋白酪氨酸激酶的活性在正常细胞中是受调节的，c-kit基因产物的正常功能活性对于维持正常的造血作用、黑素生成、配子形成(genetogenesis)和肥大细胞的生长和分化是必需的。在缺乏SCF结合的状态下引起c-kit激酶活性的组成性激活的突变与从肥大细胞增生症到人类恶性癌症的多种疾病有关。
[0029] 在一个实施方案中，参考式I化合物，L选自于-NC(O)-和-C(O)N-；
[0030] R1、R2a和R2b独立的选自于氢、羟基、C3-8杂环烷基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷基、-NR10R11、-OX1R8；其中X1选自于键和C1-4亚烷基；R8是C3-12环烷基；或R1和R2a与两者连接的碳原子一起形成苯基；R10和R11独立的选自于氢、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷氧基、卤代-C1-4烷基、C3-8杂环烷基、C1-10杂芳基；或R10和R11与两者连接的氮原子一起形成C3-8杂环烷基或C1-10杂芳基；R3和R7独立的选自于氢和卤素；R4和R6独立的选自于氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、-S(O)0-2R9；R5选自于卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷氧基、C3-8杂环烷基、-OX2R9和-S(O)0-2R9；其中X2选自于键和C1-4亚烷基；各R9独立的选自于氢、C1-6烷基、C3-12环烷基和C3-8杂环烷基；其中所述的R9的环烷基或杂环烷基任选被1至3个独立的选自于C1-6烷基和卤代-C1-6烷基的基团取代；或R4和R5与两者共同连接的碳原子一起形成C3-8杂芳基；条件是R3、R4、R5、R6或R7中至少有一个含有与苯环直接连接的硫。
[0031] 在另一实施方案中，R1选自于氢、羟基、吡咯烷基、吗啉基、甲氧基、二氟甲氧基、2-氟-乙氧基和甲基；或者R1和R2a与两者连接的碳原子一起形成苯基(即马库什结构的吡啶基环与R1和R2a形成的苯环稠合形成异喹啉基环系统)。
[0032] 在另一实施方案中，R4和R6独立的选自于氢、甲基-磺酰基、甲基、2-氟-乙氧基、甲基-哌嗪基-磺酰基、丙氧基、异丁氧基、2，2，2-三氟乙氧基、2，3-二氟-2-(氟甲基)丙氧基、丁氧基和环丙基-甲氧基；R5选自于氢、卤素、甲基-磺酰基、甲基、甲氧基、乙氧基和吗啉基；或R4和R5与二者共同连接的碳原子一起形成噻唑基。
[0033] 另一实施方案中的化合物选自于：N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-氯-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)苯并[d]噻唑-6-甲酰胺；2-氯-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基
氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-甲基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)
嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-甲基-N-(4-甲基-3-(4-(吡
啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-乙氧基-N-(4-甲
基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲
基-3-(4-(5-吗啉-4-基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；
N-(4-甲基-3-(4-(5-(吡咯烷-1-基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺
酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)-4-吗啉-4-基苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-(2-氟乙氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-(环丙基甲氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(5-甲基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-(2-氟乙氧
基)-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰
胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)-3-丙氧基苯甲酰胺；3-甲氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-丁氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯
基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-(环丙基甲氧基)-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(异喹啉-4-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-甲氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡
啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(4-甲基哌嗪-1-基磺酰基)苯甲酰
胺；N-(3-(4-(5-羟基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-异丁氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)-3-(2，2，2-三氟乙氧基)苯甲酰胺；3-(2，3-二氟-2-(氟甲基)丙氧基)-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。
氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-甲基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)
嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-甲基-N-(4-甲基-3-(4-(吡
啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-乙氧基-N-(4-甲
基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲
基-3-(4-(5-吗啉-4-基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；
N-(4-甲基-3-(4-(5-(吡咯烷-1-基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺
酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)-4-吗啉-4-基苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-(2-氟乙氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-(环丙基甲氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(5-甲基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-(2-氟乙氧
基)-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰
胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)-3-丙氧基苯甲酰胺；3-甲氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-丁氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯
基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-(环丙基甲氧基)-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(异喹啉-4-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；4-甲氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡
啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(3-(4-(5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-3-(4-甲基哌嗪-1-基磺酰基)苯甲酰
胺；N-(3-(4-(5-羟基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；3-异丁氧基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺；N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)-3-(2，2，2-三氟乙氧基)苯甲酰胺；3-(2，3-二氟-2-(氟甲基)丙氧基)-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-4-(甲基磺酰基)苯甲酰胺。
[0034] 在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗由c-kit和PDGFRα/β激酶受体调节的疾病或病症的方法，包括施用式I化合物或其可药用盐或其药物组合物。
[0035] 可以用本发明化合物和组合物调节的由c-kit和/或PDGFRα/β介导的疾病或病症的实例包括但不限于肿瘤性病症、过敏性病症、炎性病症、自身免疫性病症、移植物抗宿主疾病、疟原虫相关疾病、与肥大细胞有关的疾病、代谢综合征、CNS相关病症、神经变性病症、疼痛情况、物质滥用、朊病毒病、癌症、心脏病、纤维变性疾病、特发性动脉压过高(IPAH)、原发性肺动脉高压(PPH)。
[0036] 可以用本发明化合物和组合物治疗的与肥大细胞有关的疾病的实例包括但不限于痤疮和痤疮丙酸杆菌、进行性骨化性纤维发育不良(FOP)、炎症和由于接触化学或生物武器(如炭疽和硫-芥子气)引起的组织破坏、囊性纤维化病；肾病、炎性肌肉病症、HIV、II型糖尿病、脑局部缺血、肥大细胞增多症、药物依赖和戒断症状、CNS病症、预防和最小化脱发、细菌感染、间质性膀胱炎、炎性肠道综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、肿瘤血管生成、自身免疫性疾病、炎性疾病、多发性硬化(MS)、过敏性病症(包括哮喘)和骨损失。
[0037] 可以用本发明化合物和组合物治疗的肿瘤性病症的实例包括但不限于肥大细胞增多症、胃肠道间质瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、脊髓发育不良综合征、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、胃癌、睾丸癌、成胶质细胞瘤或星形细胞瘤。
[0038] 可以用本发明化合物和组合物治疗的过敏性病症的实例包括但不限于哮喘、过敏性鼻炎、过敏性鼻窦炎、过敏性综合征、荨麻疹、血管性水肿、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、结节性红斑、多形性红斑、皮肤坏死性静脉炎(cutaneous necrotizing venulitis)、昆虫叮咬皮肤炎症或吸血性寄生虫感染。
[0040] 可以用本发明化合物和组合物治疗的自身免疫性病症的实例包括但不限于多发性硬化、牛皮癣、肠的炎性疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、多关节炎、局部或全身性硬皮病、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、皮肤红斑、皮肌炎、多发性肌炎、斯耶格伦氏综合征、结节性全动脉炎、自身免疫性肠病或增生性肾小球肾炎。
[0041] 可以用本发明化合物和组合物治疗的移植物抗宿主疾病的实例包括但不限于器官移植，如肾移植、胰腺移植、肝移植、心脏移植、肺移植或骨髓移植的移植物排斥。
[0042] 可以用本发明化合物和组合物治疗的代谢综合征的实例包括但不限于I型糖尿病、II型糖尿病或肥胖。
[0043] 可以用本发明化合物和组合物治疗的CNS相关病症的实例包括但不限于抑郁、心境恶劣障碍、循环型情感障碍、厌食症、易饿病、月经前期综合征、绝经后综合征、智力迟缓(mental slowing)、集中力缺失、悲观烦恼、精神激动、自嘲和性欲降低、焦虑症、精神病学病症或精神分裂症。
[0044] 可以用本发明化合物和组合物治疗的抑郁情况的实例包括但不限于双相性抑郁、严重或忧郁性抑郁、非典型抑郁、难治性抑郁或季节性抑郁。可以用本发明化合物和组合物治疗的焦虑症的实例包括但不限于与换气过度和心律失常有关的焦虑、恐怖症、强迫症、创伤后应激障碍、急性应激障碍和泛化性焦虑症。可以用本发明化合物和组合物治疗的精神病学病症的实例包括但不限于恐慌发作，包括精神病、妄想性障碍、转换障碍、恐怖症、躁狂症、谵妄、分离性发作(dissociative episode)，包括分离性遗忘症、分离性漫游和分离性自杀行为、自我忽视、暴力性或攻击性行为、创伤、边缘型人格、和急性精神病如精神分裂症，包括偏执型精神分裂症、错乱型精神分裂症、紧张型精神分裂症和未分化型精神分裂症。
[0046] 可以用本发明化合物和组合物治疗的疼痛情况的实例包括但不限于急性痛、术后痛、慢性痛、伤害性疼痛、癌症痛、神经性疼痛或心理性疼痛综合征。
[0048] 可以用本发明化合物和组合物治疗的癌症的实例包括但不限于黑素瘤、结肠癌、胃肠道间质瘤(GIST)、小细胞肺癌和其它实体肿瘤。
[0049] 可以用本发明化合物和组合物治疗的纤维变性疾病的实例包括但不限于丙型肝炎(HCV)、肝纤维化、非酒精性脂肪肝(NASH)、硬皮病、肝硬化、肺纤维化或骨髓纤维化。
[0050] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗由c-kit和/或PDGFRα/β激酶受体调节的疾病或病症的方法，包括施用式I化合物或其可药用盐或其药物组合物。
[0051] 药理和用途
[0052] 本发明的化合物可调节激酶的活性并因此可用于治疗其中激酶与疾病的病理和/或症状有关的疾病或病症。本文所述化合物和组合物可以抑制的激酶以及本文所述的方法适合使用的激酶的实例包括但不限于c-kit、PDGFRα、PDGFRβ、Lyn、MAPK14(p38δ)、PDGFRα、PDGFRβ、ARG、BCR-Abl、BRK、EphB、Fms、Fyn、KDR、LCK、b-Raf、c-Raf、SAPK2、Src、Tie2和TrkB激酶。
[0053] 肥大细胞(MC)是来自于可产生多种不同的调节因子的造血干细胞的一个特定子集的组织成分，所述调节因子的大部分具有很强的促炎活性。由于MC几乎分布在全身各处，因此活化的成分分泌调节因子过多时可导致多种器官衰竭。因此，肥大细胞在许多疾病中起重要作用。本发明涉及一种治疗与肥大细胞有关的疾病的方法，其包括向需要这种治疗的人类施用能够耗竭肥大细胞的化合物或抑制肥大细胞脱粒的化合物。这种化合物可选自于c-kit抑制剂，更具体而言，选自无毒而具有效力的选择性c-kit抑制剂。优选所述抑制剂在IL-3存在下，在细胞培养物中不能促进IL-3依赖性细胞的死亡。
[0054] 与肥大细胞有关的疾病包括但不限于痤疮和痤疮丙酸杆菌(痤疮包括所有形式的慢性皮肤炎症，包括由痤疮丙酸杆菌诱发的炎症)；被称为进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的一种非常罕见的可导致残疾的遗传性结缔组织病症；炎症的有害作用和由于接触化学或生物武器(如炭疽和硫-芥子气)引起的组织破坏；囊性纤维化病(一种肺部、消化系统和生殖系统的遗传疾病)；肾病例如急性肾病综合征、肾小球肾炎、肾淀粉样变性、肾间质纤维化(各种肾病中导致晚期肾病的最终共同路径)；炎性肌肉病症，包括肌炎和肌肉萎缩；HIV(例如耗竭HIV感染的肥大细胞可以作为治疗HIV感染及相关疾病的新途径)；治疗II型糖尿病、肥胖症及相关疾病(肥大细胞调节导致动脉粥样硬化进展的多种过程，包括高血糖、高胆固醇血症、高血压、内皮功能障碍、胰岛素耐受和血管重构)；脑局部缺血；肥大细胞增多症(一组高度异质性病症，其特征为不同组织中肥大细胞的异常累积，主要发生在皮肤和骨髓中，但也可发生在脾脏、肝脏、淋巴结和胃肠道中)；药物依赖和戒断症状(特别是药物成瘾、药物滥用、药物习惯性、药物依赖、戒断综合征和超剂量用药)；CNS病症(特别是抑郁症、精神分裂症、焦虑症、偏头痛、记忆力丧失、疼痛和神经变性疾病)；促进毛发生长(包括预防和最小化脱发)；细菌感染(特别是由表达FimH的细菌引起的感染)；
间质性膀胱炎(由组织损伤、特别是膀胱内膜细胞间隙中的组织损伤导致的膀胱壁慢性炎症)；炎性肠病(通常适用于四种肠病，即克罗恩病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和感染性结肠炎)；肿瘤血管生成；自身免疫性疾病(特别是多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎和多关节炎、硬皮病、红斑狼疮、皮肌炎、天庖疮、多发性肌炎、血管炎和移植物抗宿主疾病)；炎性疾病例如类风湿性关节炎(RA)；多发性硬化症(MS)；过敏性病症(特别是哮喘、过敏性鼻炎、过敏性鼻窦炎、过敏综合征、荨麻疹、血管性水肿、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、结节性红斑、多形红斑、皮肤坏死性静脉炎和昆虫叮咬导致的皮肤发炎、支气管哮喘)；鼻息肉；炎性肠疾病(IBD)和炎性肠综合征(IBS)；和骨损失。
间质性膀胱炎(由组织损伤、特别是膀胱内膜细胞间隙中的组织损伤导致的膀胱壁慢性炎症)；炎性肠病(通常适用于四种肠病，即克罗恩病、溃疡性结肠炎、未定型结肠炎和感染性结肠炎)；肿瘤血管生成；自身免疫性疾病(特别是多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎和多关节炎、硬皮病、红斑狼疮、皮肌炎、天庖疮、多发性肌炎、血管炎和移植物抗宿主疾病)；炎性疾病例如类风湿性关节炎(RA)；多发性硬化症(MS)；过敏性病症(特别是哮喘、过敏性鼻炎、过敏性鼻窦炎、过敏综合征、荨麻疹、血管性水肿、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、结节性红斑、多形红斑、皮肤坏死性静脉炎和昆虫叮咬导致的皮肤发炎、支气管哮喘)；鼻息肉；炎性肠疾病(IBD)和炎性肠综合征(IBS)；和骨损失。
[0055] PDGF(血小板衍生生长因子)是一种普遍存在的生长因子，其在正常生长中起重要作用，并且如在癌生成和血管平滑肌细胞的疾病例如动脉粥样硬化和血栓形成中看到的那样，其在病理学细胞增殖中也起重要作用。本发明的化合物可抑制PDGF受体(PDGFR)活性，并且因此适于治疗肿瘤疾病，如神经胶质瘤、肉瘤、前列腺肿瘤、以及结肠、乳房和卵巢的肿瘤；嗜酸粒细胞增多症；纤维化例如肺纤维化、肝纤维化和硬皮病；肺高血压；和心血管疾病。
[0056] Ras-Raf-MEK-ERK信号转导途径介导对生长信号的细胞响应。在约15％的人类癌症中，Ras突变成致癌形式。Raf族属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶并且包括三个成员——A-Raf、B-Raf和c-Raf(或Raf-1)。Raf作为药物靶点的研究集中在Raf作为Ras的下游效应蛋白的关系上。但是最近的数据表明B-Raf在不需要活化的Ras等位基因的某些肿瘤的形成中有重要作用(Nature 417：949-954，2002年7月1日)。具体而言，在很大部分的恶性黑素瘤中已经检测到B-Raf突变。
[0057] 现有的黑素瘤的医学治疗的效果有限，对于晚期黑素瘤而言尤其如此。本发明的化合物还可抑制一些涉及b-Raf激酶的细胞过程，从而提供治疗人类癌症，尤其是黑素瘤的治疗新机遇。
[0058] 本发明的化合物还可抑制涉及c-Raf激酶的细胞过程。c-Raf被Ras肿瘤基因活化，在多种人类癌症中都发生突变。因此抑制c-Raf激酶活性可提供预防ras介导的肿瘤生长的方法(Campbell，S.L.，Oncogene，17，1395(1998))。
[0059] 本发明的化合物还可用于治疗非恶性增殖性病症，如动脉粥样硬化、血栓形成、牛皮癣、硬皮病和纤维化；用于保护干细胞，例如对抗化疗剂如5-氟尿嘧啶的血液毒性作用；并且还可用于治疗哮喘。
[0060] 本发明的化合物可在由移植例如同种异体移植导致的病症尤其是组织排斥的治疗中表现出有用的作用，如闭塞性细支气管炎(OB)，即同种异体肺移植物的慢性排斥。与未患OB的患者相反，那些患有OB的患者常常表现出支气管肺泡灌洗液中的PDGF浓度升高。
[0061] 本发明的化合物还可有效对抗与血管平滑肌细胞迁移和增殖有关的疾病(在这些疾病中，PDGF和PDGFR也常常起一定作用)，如再狭窄和动脉粥样硬化。可以通过给予本发明的化合物在体外和体内证实对于血管平滑肌细胞增殖或迁移的这些作用及其后果，并且还可以通过研究其对体内机械损伤后血管内膜增厚的作用来证明这一点。
[0062] 神经营养因子受体的trk族(trkA、trkB、trkC)可促进神经元组织和非神经元组织的存活、生长和分化。trkB蛋白表达于小肠和结肠的神经内分泌型细胞中、胰腺的α细胞中、淋巴结和脾脏的单核细胞和巨噬细胞中、表皮的颗粒层中(Shibayama and Koizumi，1996)。TrkB蛋白的表达与Wilms肿瘤和神经母细胞瘤的不良进展有关。此外，trkB在前列腺癌细胞中表达，而在正常前列腺细胞中没有表达。Trk受体的信号转导路径下游包括通过Shc、活化的Ras、ERK-1和ERK-2基因的MAPK活化级联和PLC-γ转导途径(Sugimoto等，2001)。
[0063] 激酶c-Src传递许多受体的致癌信号。例如，EGFR或HER2/neu在肿瘤中的过表达导致了c-src的组成活化，这是恶性细胞的特征，正常细胞并不具有该特征。另一方面，c-src表达不足的小鼠表现出一种骨硬化表型，表明c-src在破骨细胞功能中起关键作用并且可能与相关病症有关。
[0065] 已证实成纤维细胞生长因子受体3对骨生长发挥负调节作用并对软骨细胞增殖发挥抑制作用。致死性骨发育不全是由成纤维细胞生长因子受体3的不同突变造成的。一种TDII FGFR3突变具有激活转录因子Stat1的组成酪氨酸激酶活性，导致细胞周期抑制剂的表达、生长停滞和骨发育异常(Su等，Nature 1997，386：288-292)。在多发性骨髓瘤型癌症中也常常表达FGFR3。FGFR3活性的抑制剂可用于治疗T细胞介导的炎性疾病或自身免疫疾病，包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、II型胶原性关节炎、多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、牛皮癣、青少年发病型糖尿病、干燥症(Sjogren′s disease)、甲状腺病、结节病、自身免疫性葡萄膜炎、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、乳糜泻和重症肌无力。
[0067] Lin 等 (1997)J.Clin.Invest.100，8：2072-2078 和 P.Lin(1998)PNAS95，8829-8834已经证实，在腺病毒感染期间或者在乳腺肿瘤和黑素瘤异体移植模型中注射Tie-2(Tek)胞外域时，肿瘤生长和血管生成被抑制，同时肺部转移减少。Tie-2抑制剂可用于发生了不适当的新血管发生的情况(例如在糖尿病性视网膜病、慢性炎症、牛皮癣、卡波济瘤、黄斑变性引起的慢性新血管发生、类风湿性关节炎、婴儿血管瘤和癌症)。
[0068] Lck在T-细胞信号转导中起作用。缺乏Lck基因的小鼠形成胸腺细胞的能力差。Lck作为T-细胞信号转导的正性活化剂的功能表明Lck抑制剂可以用于治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎。
[0069] 已证明JNK与其它MAPK在介导对癌症、凝血酶诱导的血小板凝集、免疫缺陷病症、自身免疫病、细胞死亡、过敏、骨质疏松和心脏病的细胞应答中发挥一定作用。与JNK路径激活有关的治疗目标包括慢性粒细胞白血病(CML)、类风湿性关节炎、哮喘、骨关节炎、局部缺血、癌症和神经变性疾病。鉴于JNK活化与肝病或肝脏局部缺血发作密切相关，本发明的化合物还可用于治疗各种肝脏病症。已报道JNK在心血管疾病例如心肌梗塞或充血性心力衰竭中发挥一定作用，已经证实JNK介导针对各种形式心脏压力所产生的肥大应答。已证实JNK级联在T细胞活化包括IL-2启动子活化中也发挥一定作用。因此JNK抑制剂可能在改变病理性免疫应答中具有治疗价值。还证实JNK活化与各种癌症有关，表明JNK抑制剂在癌症治疗中有潜在的用途。例如组成激活的JNK与HTLV-1介导的肿瘤发生有关(Oncogene 13：135-42(1996))。JNK可能与卡波济瘤(KS)有关。与KS增殖有关的其它细胞因子例如血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6和TNFα的增殖作用也可能是JNK介导的。此外，在p210BCR-ABL转化的细胞中调节c-jun基因对应于JNK活性，表明JNK抑制剂在治疗慢性粒细胞白血病(CML)中可发挥一定作用(Blood 92：2450-60(1998))。
[0070] 据信某些异常增殖性病症与raf表达有关，因此据信这些病症对于抑制raf表达会产生响应。Raf蛋白表达水平过高还与细胞转化和细胞异常增殖有关。据信这些异常增殖性病症也会对抑制raf表达产生响应。例如，据信c-raf蛋白的表达与细胞异常增殖有关，因为已报道60％的肺癌细胞系表达的c-raf mRNA水平和蛋白水平异常增高。异常增殖性病症的其它实例有高增殖性病症例如癌症、肿瘤、增生病、肺纤维化、血管生成、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管平滑肌细胞增殖例如血管成形术后的狭窄和再狭窄。其中包含raf的细胞信号转导路径与以T细胞增殖(T细胞活化和生长)为特征的炎性病症有关，这些病症有例如组织移植物排斥、内毒素休克、肾小球肾炎。
[0071] 应激活化蛋白激酶(SAPK)是蛋白激酶的一个家族，它代表了导致c-Jun转录因子活化和c-Jun所调控基因的表达的信号转导路径的倒数第二步。具体而言，c-Jun涉及编码参与由于基因毒性损伤而受损的DNA修复的蛋白的基因转录。所以，在细胞中抑制SAPK活性的药物能够阻止DNA修复并使细胞对导致DNA损伤或抑制DNA合成以及诱导细胞凋亡或抑制细胞增殖的药物敏感。
[0072] 细胞分裂素-活化蛋白激酶(MAPK)是活化转录因子、翻译因子和对许多细胞外信号发生响应的其它目标分子的保守信号转导路径的成员。MAPK通过细胞分裂素-活化蛋白激酶激酶(MKK)在具有Thr-X-Tyr序列的双重磷酸化基序上磷酸化而被活化。在高级真核生物中，已经证实MAPK信号转导的生理学作用与一些细胞事件如增殖、肿瘤生成、发展和分化有关。因此，调节通过这些途径(特别是通过MKK4和MKK6)的信号转导的能力使得可以开发出用于与MAPK信号转导有关的人类疾病如炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症的治疗和预防性疗法。
[0073] 人核蛋白体S6蛋白激酶族由至少8个成员(RSK1、RSK2、RSK3、RSK4、MSK1、MSK2、p70S6K和p70S6Kb)组成。核蛋白体蛋白S6蛋白激酶发挥重要的多效性功能，其中一种关键作用是在蛋白生物合成期间调节mRNA翻译(Eur.J.Biochem 2000 November；267(21)：6321-30，ExpCell Res.Nov.25，1999；253(1)：100-9，Mol Cell Endocrinol.May 25，1999；
151(1-2)：65-77)。已经表明在细胞活力的调节(Immunol.Cell Biol.2000 August；78(4)：
447-51)和细胞生长(Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.，2000；65：101-27)中涉及p70S6对S6核蛋白体蛋白的磷酸化，因此，其在肿瘤转移、免疫应答和组织修复以及其它一些疾病情况中可能很重要。
151(1-2)：65-77)。已经表明在细胞活力的调节(Immunol.Cell Biol.2000 August；78(4)：
447-51)和细胞生长(Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.，2000；65：101-27)中涉及p70S6对S6核蛋白体蛋白的磷酸化，因此，其在肿瘤转移、免疫应答和组织修复以及其它一些疾病情况中可能很重要。
[0074] SAPK′s(也被称为“jun N-末端激酶”或“JNK′s”)是蛋白激酶的一个家族，它代表了导致c-Jun转录因子活化和c-Jun所调控基因的表达的信号转导路径的倒数第二步。具体而言，c-Jun涉及编码参与由于基因毒性损伤而受损的DNA修复的蛋白的基因转录。在细胞中抑制SAPK活性的药物能够阻止DNA修复并使细胞对通过诱导DNA损伤而起作用的癌症治疗药物变得敏感。
[0075] BTK在自身免疫和/或炎性疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、多血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、重症肌无力和哮喘中发挥一定作用。由于BTK在B细胞活化中的作用，BTK抑制剂可用作B细胞介导的病理活动例如自身抗体生成的抑制剂，可用于治疗B细胞淋巴瘤和白血病。
[0076] CHK2是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶检验点激酶家族的成员，与DNA损伤监测机制有关，例如由环境中致突变原和内源性活性氧导致的DNA损伤。所以CHK2可作为肿瘤抑制子，可作为癌症治疗的靶点。
[0077] CSK影响癌细胞特别是结肠癌细胞的转移潜力。
[0078] Fes是一种非受体蛋白酪氨酸激酶，与各种细胞因子信号转导路径有关，也与骨髓细胞分化有关。Fes也是骨髓粒细胞的分化机制的关键组成成分。
[0079] Flt3受体酪氨酸激酶活性与白血病和骨髓增生异常综合征有关。在约25％的AML中，在白血病细胞表面上表达一种组成活性形式的自身磷酸化的(p)FLT3酪氨酸激酶。p-Flt3活性使白血病细胞获得生长和存活优势。白血病细胞表达p-Flt3激酶活性的急性白血病患者总体临床后果较差。抑制p-Flt3激酶活性可诱导白血病细胞凋亡(程序性细胞死亡)。
[0080] IKKα和IKKβ(1&2)抑制剂可治疗疾病，所述疾病包括类风湿性关节炎、移植物排斥、炎性肠病、骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、牛皮癣、多发性硬化症、中风、系统性红斑狼疮、阿尔茨海默病、脑局部缺血、创伤性脑损伤、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、蛛网膜下出血或与脑内或中枢神经系统内炎性介质生成过多有关的疾病或病症。
[0081] Met与多数主要类型的人类癌症有关，其表达通常与预后不良和转移有关。Met抑制剂可治疗疾病，所述疾病包括肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤黑素瘤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌症、胃癌、结肠癌、乳腺癌、妇科肿瘤(例如子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌)、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症(例如甲状腺癌、副甲状腺癌或肾上腺癌)、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌(例如肾细胞癌、肾盂癌)、儿童恶性肿瘤、中枢神经系统肿瘤(例如原发性CNS淋巴瘤、枢椎肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤)、血癌例如急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病等、巴雷特食管(恶变前综合征)、肿瘤性皮肤病、牛皮癣、蕈样真菌病、良性前列腺增生、糖尿病相关疾病例如糖尿病性视网膜病、视网膜缺血、视网膜新血管发生、肝硬化、心血管疾病例如动脉粥样硬化、免疫疾病例如自身免疫病和肾病。优选所述疾病是癌症例如急性髓细胞性白血病和结肠直肠癌。
[0082] Nima相关激酶2(Nek2)是一种细胞周期调节的蛋白激酶，在减数分裂开始时活性最高，位于中心体上。功能研究表明Nek2参与调节中心体分离和纺锤体形成。多种人类肿瘤衍生的细胞系中Nek2蛋白水平升高2至5倍，包括宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌，特别是乳腺癌。
[0083] p70S6K介导的疾病或病症包括但不限于增殖性病症例如癌症和结节性硬化症。
[0084] 根据前述，本发明进一步提供一种在有需要的个体中预防或治疗上述任何疾病或病症的方法，该方法包括给所述个体施用治疗有效量(参见下文“给药和药物组合物”)的式I化合物或其可药用盐。对于任何上面的用途而言，所需剂量将根据给药方式、所治疗的特定病症和所期望的效果而变化。
[0085] 给药和药物组合物
[0086] 一般而言，本发明的化合物通常通过本领域已知的任何常规和可接受的方式、单独地或与一种或多种治疗药物组合来以治疗有效量进行给药。治疗有效量可随疾病的严重程度、个体的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力和其它因素而在宽范围内进行变化。一般以每日每公斤体重约0.03至2.5mg的日剂量系统给药通常可获得满意结果。对于大型哺乳动物例如人而言，每日推荐剂量为约0.5mg至约100mg，例如方便地以每日最多4次的分次剂量或以缓释剂型进行给药。口服给药的适宜单位剂型包含大约1至50mg活性成分。
[0087] 本发明化合物可通过任何常规途径以药物组合物的形式给药，特别是可以被经肠给药，例如，口服给药，例如以片剂或胶囊剂的形式进行给药；或胃肠外给药，例如，以可注射的溶液或混悬液的形式进行给药；局部给药，例如，以洗剂、凝胶剂、软膏剂或霜剂的形式进行给药；或以鼻腔制剂吸入给药或以栓剂的形式进行给药。包含游离形式或可药用盐形式的本发明化合物和至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可按照常规方式，通过混合、制粒或包衣方法来进行制备。例如，口服组合物可以是片剂或明胶胶囊，它含有活性组分和a)稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂来说还可以含有c)粘合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要还可以含有d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐，或泡腾混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。可注射的组合物可以是等渗水溶液或混悬液、并且栓剂可以由脂肪乳剂或混悬液来进行制备。组合物可以被灭菌和/或含有辅助剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们还可以含有其它有治疗价值的物质。适宜的经皮用制剂包含有效量本发明的化合物和载体。载体包括有助于通过宿主皮肤的可吸收的药理学上可接受的溶剂。例如，经皮吸收装置是一种含有背衬膜、含有所述化合物并任选地含有载体和使所述化合物在较长的一段时间内以受控和预定速度释放到宿主皮肤的控速屏障的贮药库、以及确保所述装置附着在皮肤上的部件的绷带形式。也可以使用基质经皮制剂。适用于局部用于例如皮肤和眼睛的制剂优选为本领域众所周知的水溶液、软膏剂、霜剂或凝胶。所述制剂可包含增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
[0088] 本发明化合物可以与一种或多种治疗剂一起以治疗有效量进行给药(药物组合形式)。例如可以与其它哮喘治疗剂例如类固醇和白三烯拮抗剂一起获得协同作用。
[0089] 例如，可以与其它免疫调节或抗炎物质一起产生协同作用，例如，当与环孢菌素、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制剂类似物，例如环孢菌素A(CsA)、环孢菌素G、FK-506、雷帕霉素或相当的化合物、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、麦考酚酸、麦考酚酸莫酯、支气管扩张剂、15-脱氧精胍菌素、免疫抑制剂抗体，尤其是白细胞受体的单克隆抗体例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或它们的配体，或其它免疫调节化合物，如CTLA41g联用时。当本发明化合物与其它治疗剂一同给药时，共同给药的化合物的剂量当然将根据一起使用的药物类型、所使用的特定药物、被治疗的情况等来进行调节。
[0090] 本发明也提供了一种药物组合形式，例如药盒，其包含a)游离形式或可药用盐形式的第一种药物，它是本文所公开的本发明化合物，和b)至少一种联用的药物。该药盒可包含用于指导给药的使用说明。
[0091] 本文使用的术语“共同给药”或“联合给药”等意在包括将所选择的治疗剂给药于单个患者，意在包括其中活性剂不一定经相同给药途径或不同时给药的治疗方案。
[0092] 本文使用的术语“药物组合形式”是指将多于一种活性成分混合或组合所得的产物，包括活性成分的固定组合和非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分例如式I化合物和联用药物同时以一个实体或剂量的形式给药于患者。术语“非固定组合”是指活性成分例如式I化合物和联用药物作为分开的实体同时、并行或没有固定时间限制的先后给药于患者，其中这种给药方式在患者体内提供了两种化合物的治疗有效水平。后者还适用于鸡尾酒疗法，例如给药三种或多种活性成分。
[0093] 制备本发明化合物的方法
[0094] 本发明还包括本发明化合物的制备方法。在所述反应中，可能有必要保护在终产物中所需的反应性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、巯基或羧基，以避免它们不必要地参与反应。可按照标准操作使用常规的保护基团，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“有机化学中的保护基团(Protective Groups in Organic Chemistry)”，John Wiley和Sons，1991。
[0095] 可通过以下反应方案I制备其中L是-NHC(O)-的式I化合物：
[0096] 反应方案I
[0097]
[0098] 其中R1、R2a、R2b、R3、R4、R5、R6和R7如发明内容所述。可以在适当溶剂(例如DMF等)、适当的偶联剂(例如HATU等)和适当的碱(例如DIEA等)的存在下，使式2化合物与式3化合物反应制备式I化合物。反应温度范围为约0℃至约60℃，可在最多24小时内完成。
[0099] 可通过以下反应方案II制备其中L是-C(O)NH-的式I化合物：
[0100] 反应方案II
[0101]
[0102] 其中R1、R2a、R2b、R3、R4、R5、R6和R7如发明内容所述。可以在适当溶剂(例如DMF等)、适当的偶联剂(例如HATU等)和适当的碱(例如DIEA等)的存在下，使式4化合物与式5化合物反应制备式I化合物。反应温度范围为约0℃至约60℃，可在最多24小时内完成。
[0103] 式I化合物合成的详细实例见以下实施例。
[0104] 制备本发明化合物的其它步骤
[0105] 可通过将游离碱形式的化合物与可药用的无机或有机酸反应来将本发明化合物制备为可药用酸加成盐的形式。或者，可通过将游离酸形式的化合物与可药用的无机或有机碱反应来制备本发明化合物的可药用的碱加成盐。或者，盐形式的本发明化合物可利用起始材料或中间体的盐来进行制备。
[0106] 游离酸或游离碱形式的本发明化合物可分别从相应的碱加成盐或酸加成盐制备。例如可通过用合适的碱(例如，氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)进行处理来将酸加成盐形式的本发明化合物转化为相应的游离碱。可通过用合适的酸(例如，盐酸等)进行处理来将碱加成盐形式的本发明化合物转化为相应的游离酸。
[0107] 非氧化形式的本发明化合物可通过在适宜的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二噁烷水溶液等)中，于0至80℃下，用还原剂(例如，硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化磷等)处理本发明化合物的N-氧化物而制备。
[0108] 本发明化合物的前药衍生物可用本领域普通技术人员已知的方法(例如，详情见Saulnier等人(1994)，Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters，第4卷，第1985页)来进行制备。例如，合适的前药可通过将未衍生化的本发明化合物与适宜的氨基甲酰化试剂(例如，1，1-酰氧基烷基氨基碳酰氯、对硝基苯基碳酸酯等)反应来制备。
[0109] 本发明化合物的被保护衍生物可用本领域普通技术人员已知的方法进行制备。用于产生保护基团和除去保护基团的技术的详细描述可见于T.W.Greene，“有机化学中的保护基团(Protecting Groups in OrganicChemistry)”，第3版，John Wiley和Sons，Inc.，1999。
[0110] 在本发明化合物的制备过程中，本发明化合物可方便地被制备为或形成溶剂化物(例如水合物)。本发明化合物的水合物可通过采用有机溶剂如二噁英、四氢呋喃或甲醇，在水/有机溶剂混合物中重结晶来方便地制备。
[0111] 本发明化合物可通过将化合物的外消旋混合物与光学活性的拆分剂反应以形成一对非对映异构体化合物、分离非对映异构体并回收光学纯的对映异构体来制备其单个的立体异构体。尽管对映异构体的拆分可利用本发明化合物的共价非对映异构体衍生物来进行，但优选可解离的复合物(例如，结晶的非对映异构体盐)。非对映异构体具有不同的物理性质(例如，熔点、沸点、溶解度、反应性等)并且可以很容易地利用这些差异进行分离。非对映异构体可以通过色谱法分离，或者优选地，可以通过基于溶解度差异的分离/拆分技术进行分离。然后通过任何不会导致消旋化的操作方法回收光学纯的对映异构体与拆分剂。用于从外消旋混合物中拆分化合物的立体异构体的技术的更详细描述可见于Jean Jacques，Andre Collet，SamuelH.Wilen，“对映异构体，外消旋体和拆分(Enantiomers，Racemates andResolutions)”，John Wiley和Sons，Inc.，1981。
[0112] 总之，式I的化合物可通过下述方法制备，其包括：
[0113] (a)反应方案I和II中的步骤；和
[0114] (b)任选地将本发明化合物转化为可药用盐；
[0115] (c)任选地将盐形式的本发明化合物转化为非盐形式；
[0116] (d)任选地将非氧化形式的本发明化合物转化为可药用的N-氧化物；
[0117] (e)任选地将N-氧化物形式的本发明化合物转化为其非氧化物形式；
[0118] (f)任选地从异构体混合物拆分本发明化合物的单个的异构体；
[0119] (g)任选地将未衍生化的本发明化合物转化为可药用的前药衍生物；和
[0120] (h)任选地将本发明化合物的前药衍生物转化为其未衍生化的形式。
[0121] 在文中，当没有具体描述原料的制备时，这些化合物是已知的或可通过与本领域已知方法类似的方法制备或按下文实施例中所公开的方法制备。
[0122] 本领域技术人员应理解的是，以上转化仅是用于制备本发明化合物的方法中的代表，并且可类似地使用其它公知的方法。实施例
[0123] 以下实施例进一步举例说明本发明式I化合物的制备但不限制本发明。
[0124] 中间体的实验制备
[0125] 6-甲基-N1-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)苯-1，3-二胺5的合成
[0126]
[0127] 向2-氨基-4-硝基甲苯1(0.033mol)在正丁醇(29mL)中的溶液中加入硝酸(2.1g，65％水溶液)，然后加入氨腈水溶液(2mL，0.047mmol)。将所得混合物回流加热25小时。冷却至0℃后过滤并用1∶1＝乙醇∶二乙醚(30mL)洗涤得到2-甲基-5-硝基苯基胍硝酸盐2。
[0128] 向2-甲基-5-硝基苯基胍2(0.0074mol)在异丙醇(15mL)中的溶液中加入3(0.0074mol)和氢氧化钠片(0.008mol)。将所得混合物回流加热12小时。冷却至0℃后，过滤收集产物，用异丙醇(6mL)和甲醇(3mL)洗涤得到4。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ9.31(s，
1H)，9.24(s，1H)，8.78(m，1H)，8.70(m，1H)，8.61(m，1H)，8.47(m，1H)，7.88(m，1H)，7.55(m，
3H)，2.39(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+：278.2。
1H)，9.24(s，1H)，8.78(m，1H)，8.70(m，1H)，8.61(m，1H)，8.47(m，1H)，7.88(m，1H)，7.55(m，
3H)，2.39(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+：278.2。
[0129] 可以通过以下方法获得反应物3。将3-乙酰基吡啶(2.47mol)和N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(240mL)回流加热16小时。真空除去溶剂，残余物中加入己烷(100mL)，有固体结晶析出。将固体在二氯甲烷-己烷中重结晶得到3-二甲基氨基-1-(3-吡啶基)-2-丙烯-1-酮3。1H NMR(400MHz，d-氯仿)δ9.08(d，J＝2.4Hz，1H)，8.66(m，1H)，8.20(m，1H)，7.87(m，1H)，7.37(m，1H)，5.68(d，J＝16.4Hz，1H)，3.18(s，3H)，2.97(s，3H)。
[0130] 向反应器中加入浓盐酸(17mL)，然后加入氯化亚锡二水合物(0.03mol)。将混合物搅拌10分钟，然后降温至0-5℃。然后缓缓加入化合物4(5.6mmol)在乙酸乙酯(3mL)中的溶液(在3-4分钟内加入)，同时使温度保持在0-5℃。将反应混合物温至室温搅拌1.5小时。向其中加入水(50mL)，然后缓缓加入50％氢氧化钠溶液(40mL)。所得混合物用氯仿(2x25mL)萃取。有机层用水彻底洗涤，然后蒸发。将残余物溶于乙酸乙酯(2mL)，然后冷却至0-10℃并在该温度下保持1小时。过滤收集所得沉淀物，用乙酸乙酯洗涤(1mL)得到1.0g的5。1H NMR(400MHz，d-氯仿)δ9.26(d，J＝2.0Hz，1H)，8.71(m，1H)，8.48(d，J＝6.8Hz，1H)，8.34(m，1H)，7.59(d，J＝4.0Hz，1H)，7.41(m，1H)，7.12(m，1H)，7.04(m，1H)，6.42(m，1H)，3.50(bs，2H)，2.24(s，3H)。
[0131] 4-(5-溴吡啶-3-基)-N-(2-甲基-5-硝基苯基)嘧啶-2-胺8的合成
[0132]
[0133] 根据3的合成方案从1-(5-溴-吡啶-3-基)-乙酮制备1-(5-溴-吡啶-3-基)-3-二甲基氨基-丙酮7。LC/MS(m/z)(M+1)+：386.1，388.1。
[0134] 根据与制备4相类似的方案与N-(2-甲基-5-硝基-苯基)-胍硝酸盐缩合得到[4-(5-溴-吡啶-3-基)-嘧啶-2-基]-(2-甲基-5-硝基-苯基)-胺8。1H NMR(400MHz，d-CDCl3)δ9.33(d，J ＝ 2.4Hz，1H)，9.09(d，J ＝ 1.6Hz，1H)，8.74(d，J ＝ 2.4Hz，1H)，8.61(t，J＝2.0Hz，1H)，8.53(d，J＝4.8Hz，1H)，8.01(s，1H)，7.82(dd，J＝8.4，2.4Hz，
1H)，7.29(d，J＝8.0Hz，1H)，7.22(d，J＝4.8Hz，1H)，7.10(s，1H)，2.41(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1)+：255.0，257.0。
1H)，7.29(d，J＝8.0Hz，1H)，7.22(d，J＝4.8Hz，1H)，7.10(s，1H)，2.41(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1)+：255.0，257.0。
[0135] 6-甲基-N1-(4-(5-(吡咯烷-1-基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基)苯-1，3-二胺10的合成
[0136]
[0137] 将 8(0.40g，1.04mmol)、 吡 咯 烷 (3.12mmol)、K3PO4(0.44g，2.08mmol)、CuI(38.5mg，0.10mmol)和L-脯氨酸(48.1mg，0.21mmol)在DMSO(8ml)中混合并在微波炉中在160℃下加热20分钟制得(2-甲基-5-硝基-苯基)-[4-(5-吡咯烷-1-基-吡啶-3-基)-嘧啶-2-基]-胺9。将混合物冷却后在水与乙酸乙酯之间分配。分离有机层，用乙酸乙酯萃取水层。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。将残余物溶解
1
于DMSO(4mL)并经HPLC纯化得到纯产物9。H NMR(400MHz，d-CDCl3)δ9.23(d，J＝2.4Hz，
1H)，8.63(d，J ＝ 5.2Hz，1H)，8.58(s，1H)，8.10(s，1H)，8.04(s，1H)，7.90(dd，J ＝ 8.4，
2.4Hz，1H)，7.44(s，1H)，7.39(d，J ＝ 8.4Hz，1H)，7.30(d，J ＝ 5.2Hz，1H)，3.43-3.48(m，+
4H)，2.49(s，3H)，2.12-2.16(m，4H)。LC/MS(m/z)(M+I) ：377.2。
1
于DMSO(4mL)并经HPLC纯化得到纯产物9。H NMR(400MHz，d-CDCl3)δ9.23(d，J＝2.4Hz，
1H)，8.63(d，J ＝ 5.2Hz，1H)，8.58(s，1H)，8.10(s，1H)，8.04(s，1H)，7.90(dd，J ＝ 8.4，
2.4Hz，1H)，7.44(s，1H)，7.39(d，J ＝ 8.4Hz，1H)，7.30(d，J ＝ 5.2Hz，1H)，3.43-3.48(m，+
4H)，2.49(s，3H)，2.12-2.16(m，4H)。LC/MS(m/z)(M+I) ：377.2。
[0138] 在10％Pd/C存在下和1atm氢气压力下、在室温下将9在EtOH中氢化制备4-甲基-N3-[4-(5-吡咯烷-1-基-吡啶-3-基)-嘧啶-2-基]-苯-1，3-二胺10(30％)。用+
硅藻土过滤后除去溶剂，产物不经进一步纯化即用于下一步骤。LC/MS(m/z)(M+1) ：347.2。
硅藻土过滤后除去溶剂，产物不经进一步纯化即用于下一步骤。LC/MS(m/z)(M+1) ：347.2。
[0139] 用其它胺(例如吗啉)代替吡咯烷可合成与9和10相似的不同中间体。
[0140] N1-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基)-6-甲基苯-1，3-二胺14的合成
[0141]
[0142] 将3-溴-5-甲氧基吡啶(3.0g，16mmol)和Pd(PPh3)4的混合物脱气若干次，通入氮气。向混合物中加入三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡(7.04mL，20.8mmol)和甲苯(15mL)。将所得反应混合物在微波炉中在150℃下加热30分钟。反应完全后，将反应混合物用硅藻土垫过滤，用甲醇洗涤，浓缩得到残余物。向残余物中加入HCl(1N，25mL)和THF(25mL)，将混合物在室温下搅拌2小时。真空除去溶剂，将残余物溶于EtOAc。用Na2CO3溶液洗涤有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩后得到残余物，经硅胶柱色谱法纯化(EtOAc∶己烷＝1∶1)
1
得到11，为淡黄色固体。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.75(d，J＝1.6Hz，1H)，8.52(d，J＝+
3.2Hz，1H)，7.74(dd，J＝1.6，3.2Hz，1H)，3.91(s，3H)，2.64(s，3H)。MS(m/z)(M+I) ：152.1。
1
得到11，为淡黄色固体。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.75(d，J＝1.6Hz，1H)，8.52(d，J＝+
3.2Hz，1H)，7.74(dd，J＝1.6，3.2Hz，1H)，3.91(s，3H)，2.64(s，3H)。MS(m/z)(M+I) ：152.1。
[0143] 采用与制备3类似的方法与二乙氧基-N，N-二甲基甲胺反应制备3-(二甲基氨1
基)-1-(5-甲氧基吡啶-3-基)丙-2-烯-1-酮12。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.69(d，J＝2.0Hz，1H)，8.37(d，J＝2.8Hz，1H)，7.76(d，J＝12.0Hz，1H)，7.70(dd，J＝1.6，2.8Hz，+
1H)，5.86(d，J＝12.0Hz，1H)，3.89(s，3H)，3.17(s，3H)，2.95(s，3H)。MS(m/z)(M+1) ：207.1[0144] 采用与制备4类似的方法使12与N-(2-甲基-5-硝基-苯基)-胍硝酸盐2缩合
1
得到4-(5-甲氧基吡啶-3-基)-N-(2-甲基-5-硝基苯基)嘧啶-2-胺13。HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ9.23(s，1H)，8.93(d，J ＝ 1.2Hz，1H)，8.80(d，J ＝ 2.0Hz，1H)，8.63(d，J ＝
5.2Hz，1H)，8.44(d，J＝2.8Hz，1H)，8.00(s，1H)，7.91(dd，J＝2.0，8.4Hz，1H)，7.62(d，J+
＝5.2Hz，1H)，7.52(d，J＝8.4Hz，1H)，3.90(s，3H)，2.44(s，3H)。MS(m/z)(M+1) ：338.1[0145] 采用与制备10类似的方法将13氢化来制备N3-[4-(5-甲氧基-吡啶-3-基)-嘧
1
啶-2-基]-4-甲基-苯-1，3-二胺14。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.90(d，J＝1.6Hz，1H)，
8.71(s，1H)，8.51(d，J＝5.2Hz，1H)，8.45(d，J＝2.8Hz，1H)，8.01(dd，J＝2.0，3.2Hz，
1H)，7.43(d，J＝5.2Hz，1H)，6.91(d，J＝8.0Hz，1H)，6.87(d，J＝2.4Hz，1H)，6.38(dd，J+
＝2.4，8.0Hz，1H)，4.87(s，2H)，3.95(s，3H)，2.12(s，3H)。MS(m/z)(M+1) ：308.1[0146] N1-(4-(5-(2-氟乙氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基)-6-甲基苯-1，3-二胺17的合成
基)-1-(5-甲氧基吡啶-3-基)丙-2-烯-1-酮12。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.69(d，J＝2.0Hz，1H)，8.37(d，J＝2.8Hz，1H)，7.76(d，J＝12.0Hz，1H)，7.70(dd，J＝1.6，2.8Hz，+
1H)，5.86(d，J＝12.0Hz，1H)，3.89(s，3H)，3.17(s，3H)，2.95(s，3H)。MS(m/z)(M+1) ：207.1[0144] 采用与制备4类似的方法使12与N-(2-甲基-5-硝基-苯基)-胍硝酸盐2缩合
1
得到4-(5-甲氧基吡啶-3-基)-N-(2-甲基-5-硝基苯基)嘧啶-2-胺13。HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ9.23(s，1H)，8.93(d，J ＝ 1.2Hz，1H)，8.80(d，J ＝ 2.0Hz，1H)，8.63(d，J ＝
5.2Hz，1H)，8.44(d，J＝2.8Hz，1H)，8.00(s，1H)，7.91(dd，J＝2.0，8.4Hz，1H)，7.62(d，J+
＝5.2Hz，1H)，7.52(d，J＝8.4Hz，1H)，3.90(s，3H)，2.44(s，3H)。MS(m/z)(M+1) ：338.1[0145] 采用与制备10类似的方法将13氢化来制备N3-[4-(5-甲氧基-吡啶-3-基)-嘧
1
啶-2-基]-4-甲基-苯-1，3-二胺14。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.90(d，J＝1.6Hz，1H)，
8.71(s，1H)，8.51(d，J＝5.2Hz，1H)，8.45(d，J＝2.8Hz，1H)，8.01(dd，J＝2.0，3.2Hz，
1H)，7.43(d，J＝5.2Hz，1H)，6.91(d，J＝8.0Hz，1H)，6.87(d，J＝2.4Hz，1H)，6.38(dd，J+
＝2.4，8.0Hz，1H)，4.87(s，2H)，3.95(s，3H)，2.12(s，3H)。MS(m/z)(M+1) ：308.1[0146] N1-(4-(5-(2-氟乙氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基)-6-甲基苯-1，3-二胺17的合成
[0147]
[0148] 将化合物13(220mg，0.65mmol)溶解于DCM，用BBr3(3.25mmol)在-78℃下处理过夜。用DCM稀释混合物，用1N NaOH水溶液洗涤。用过量的1N HCl将所得水相酸化，然后用+DCM萃取。浓缩后得到15，其不经进一步纯化即用于下一步骤。LC/MS(m/z)(M+1) ：324.2。
[0149] 将化合物15(87.0mg，0.27mmol)与CsHCO3(103.6mg，0.54mmol)和1-溴-2-氟-乙烷(102.0mg，0.80mmol)在乙腈(2.0mL)中回流过夜。混合物经制备型LC/MS纯化得到16。+
LC/MS(m/z)(M+1) ：370.1。
LC/MS(m/z)(M+1) ：370.1。
[0150] 将化合物16(50.0mg，0.14mmol)与SnCl2·H2O(77.2mg，0.41mmol)在EtOH(2.0mL)中回流加热1小时。将混合物溶解于NaOH(1N，50mL)中并用DCM萃取。分离有机层，用硫酸+钠干燥，过滤并浓缩得到粗产物，其不经进一步纯化即用于下一步骤。LC/MS(m/z)(M+1) ：
340.1。
340.1。
[0151] 用其它卤代烷烃(例如溴甲基环丙烷)代替1-溴-2-氟-乙烷可合成与16和17相似的不同中间体。
[0152] N-(2-甲基-5-硝基苯基)-4-(5-甲基吡啶-3-基)嘧啶-2-胺21的合成
[0153]
[0154] 将5-甲基-烟腈(2.08g，17.6mmol)在干燥THF(20mL)中与MgMeBr(3M Et2O溶液，10mL，30mmol)回流加热2小时。冷却后，缓缓加入碳酸钠水溶液终止反应。用DCM萃取得到粗产物。经硅胶柱色谱法纯化得到1-(5-甲基-吡啶-3-基)-乙酮18(0.7g，30％)。+
LC/MS(m/z)(M+1) ：136.1。
LC/MS(m/z)(M+1) ：136.1。
[0155] 采用与制备3类似的方法，使18与二乙氧基-N，N-二甲基甲胺反应制备1-(5-甲1
基-吡啶-3-基)-乙酮19。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.87(d，J＝1.2Hz，1H)，8.49(d，J ＝ 1.2Hz，1H)，8.02-8.04(m，1H)，7.75(d，J ＝ 12.0Hz，1H)，5.85(d，J ＝ 12.0Hz，1H)，+
3.16(s，3H)，2.94(s，3H)，2.35(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：191.2。
基-吡啶-3-基)-乙酮19。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ8.87(d，J＝1.2Hz，1H)，8.49(d，J ＝ 1.2Hz，1H)，8.02-8.04(m，1H)，7.75(d，J ＝ 12.0Hz，1H)，5.85(d，J ＝ 12.0Hz，1H)，+
3.16(s，3H)，2.94(s，3H)，2.35(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：191.2。
[0156] 向2-甲基-5-硝基苯基胍2(2.0mmol)在正丁醇(15mL)中的溶液中加入19(2.0mmol)和氢氧化钠片(2.0mmol)。将所得混合物在微波炉中在180℃下加热40分钟。
1
冷却至0℃后，过滤收集产物，用乙醚(20mL)和甲醇(10mL)洗涤得到20。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ9.19(s，1H)，9.13(d，J ＝ 1.6Hz，1H)，8.91(d，J ＝ 2.0Hz，1H)，8.63(d，J ＝
5.2Hz，1H)，8.57(d，J＝1.2Hz，1H)，8.37(s，1H)，7.90(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，7.59(d，J＝+
5.2Hz，1H)，7.52(d，J＝8.4Hz，1H)，2.45(s，3H)，2.41(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：322.2。
1
冷却至0℃后，过滤收集产物，用乙醚(20mL)和甲醇(10mL)洗涤得到20。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ9.19(s，1H)，9.13(d，J ＝ 1.6Hz，1H)，8.91(d，J ＝ 2.0Hz，1H)，8.63(d，J ＝
5.2Hz，1H)，8.57(d，J＝1.2Hz，1H)，8.37(s，1H)，7.90(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，7.59(d，J＝+
5.2Hz，1H)，7.52(d，J＝8.4Hz，1H)，2.45(s，3H)，2.41(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：322.2。
[0157] 通过在10％Pd/C的存在下用氢气囊在室温下将20在甲醇中氢化制备化合物21。用硅藻土过滤后除去溶剂，产物不经进一步纯化即用于下一步骤(95％)。LC/MS(m/z)+
(M+1) ：292.1。
(M+1) ：292.1。
[0158] 3-羟基-4-甲磺酰基-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺23的合成
[0159]
[0160] 在室温下，将6-甲基-N1-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)苯-1，3-二胺5(578mg，2.09mmol)、4-碘-3-羟基-苯甲酸(587mg，2.22mmol)和HATU(960mg，2.52mmol)溶解于干燥DMF(5mL)中。向溶液中滴入二异丙基乙基胺(0.732mL，4.2mmol)。30分钟后，将混合物缓缓加至饱和碳酸氢钠水溶液中。滤出固体，用水洗涤，真空下干燥过夜得到产物22，为黄褐色固体(630mg，60％)。LC/MS(M+1)：524.1。
[0161] 将 化 合 物 22(580mg，1.11mmol)、CuI(42mg，0.272mmol)、L- 脯 氨 酸 (61mg，0.444mmol)、1N NaOH(0.5mL)和NaSO2Me(267mg，2.22mmol)混悬于DMSO(3mL)中，在微波炉中在180℃下加热25分钟。将混合物用浓氨水稀释，用乙酸乙酯洗涤。向水相中加入1N HCl水溶液至pH＝7，过滤收集固体沉淀得到产物23(80％)。LC/MS(M+1)：476.1。
[0162] 终化合物的合成
[0163] A型
[0164] N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺A1
[0165]
[0166] 在室温下，将6-甲基-N1-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)苯-1，3-二胺5(5mmol)、3-(甲基磺酰基)苯甲酸(6mmol)和HATU(6mmol)溶解于干燥DMF(5mL)。向溶液中滴入二异丙基乙基胺(6mmol)。30分钟后，将混合物缓缓加至饱和碳酸氢钠水溶液中。滤出固体，
1
用水洗涤，真空干燥过夜得到产物A1，为淡黄色固体。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.5(s，
1H)，9.33(s，1H)，9.04(s，1H)，8.75(d，J＝1.7Hz，1H)，8.63(d，J＝7.5Hz，1H)，8.55(d，J＝
5.0Hz，1H)，8.47(s，1H)，8.29(d，J＝8Hz，1H)，8.13(d，J＝8.6Hz，1H)，8.11(s，H)，7.83(t，J＝8Hz，1H)，7.66(dd，J＝7.3，5.3Hz，1H)，7.47(m，2H)，7.25(d，J＝8.4Hz，1H)，3.29(s，+
3H)，2.55(s，6H，2Me-HOAc)，2.24(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：460.2。
1
用水洗涤，真空干燥过夜得到产物A1，为淡黄色固体。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.5(s，
1H)，9.33(s，1H)，9.04(s，1H)，8.75(d，J＝1.7Hz，1H)，8.63(d，J＝7.5Hz，1H)，8.55(d，J＝
5.0Hz，1H)，8.47(s，1H)，8.29(d，J＝8Hz，1H)，8.13(d，J＝8.6Hz，1H)，8.11(s，H)，7.83(t，J＝8Hz，1H)，7.66(dd，J＝7.3，5.3Hz，1H)，7.47(m，2H)，7.25(d，J＝8.4Hz，1H)，3.29(s，+
3H)，2.55(s，6H，2Me-HOAc)，2.24(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：460.2。
[0167] 根据相似方法制备化合物A2-A5，用LC/MS纯化。
[0168] N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-(甲基磺酰基)1
苯 甲 酰 胺 A2：H NMR(400MHz，DMSO)δ10.52(s，1H)，9.26(s，1H)，8.90(s，1H)，8.69(s，
1H)，8.61(d，J ＝ 8.0Hz，1H)，8.50(d，J ＝ 4.8Hz，1H)，8.08-8.14(m，3H)，8.00-8.07(m，+
2H)，7.65(m，1H)，7.40(m，1H)，7.23(m，1H)，3.22(s，3H)，2.21(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：
460.2。
苯 甲 酰 胺 A2：H NMR(400MHz，DMSO)δ10.52(s，1H)，9.26(s，1H)，8.90(s，1H)，8.69(s，
1H)，8.61(d，J ＝ 8.0Hz，1H)，8.50(d，J ＝ 4.8Hz，1H)，8.08-8.14(m，3H)，8.00-8.07(m，+
2H)，7.65(m，1H)，7.40(m，1H)，7.23(m，1H)，3.22(s，3H)，2.21(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：
460.2。
[0169] 4-氯-3-甲磺酰基-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯1
甲酰胺A3：H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.6(s，1H)，9.3(s，1H)，9.04(s，1H)，8.72(d，J＝
3.8Hz，1H)，8.55(m，3H)，8.3(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，8.08(d，J＝1.5Hz，1H)，7.94(d，J＝
8.3Hz，1H)，7.6(dd，J＝7.9，4.8Hz，1H)，7.48(m，2H)，7.24(d，J＝8.3Hz，1H)，3.44(s，3H)，+
2.24(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：494.1。
甲酰胺A3：H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.6(s，1H)，9.3(s，1H)，9.04(s，1H)，8.72(d，J＝
3.8Hz，1H)，8.55(m，3H)，8.3(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，8.08(d，J＝1.5Hz，1H)，7.94(d，J＝
8.3Hz，1H)，7.6(dd，J＝7.9，4.8Hz，1H)，7.48(m，2H)，7.24(d，J＝8.3Hz，1H)，3.44(s，3H)，+
2.24(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：494.1。
[0170] N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)苯并[d]噻唑-6-甲酰1
胺 A4：H NMR(400MHz，DMSO)δ10.20(s，1H)，9.31(s，1H)，9.02(s，1H)，8.74(d，J＝3.2Hz，
1H)，8.58(m，1H)，8.53(d，J ＝ 4.8Hz，1H)，8.06(s，1H)，7.62(m，1H)，7.45(d，J ＝ 5.2Hz，
1H)，7.41(d，J＝7.2Hz，1H)，7.15-7.22(m，3H)，7.09-7.13(m，1H)，2.22(s，3H)。LC/MS(m/+
z)(M+1) ：439.2。
胺 A4：H NMR(400MHz，DMSO)δ10.20(s，1H)，9.31(s，1H)，9.02(s，1H)，8.74(d，J＝3.2Hz，
1H)，8.58(m，1H)，8.53(d，J ＝ 4.8Hz，1H)，8.06(s，1H)，7.62(m，1H)，7.45(d，J ＝ 5.2Hz，
1H)，7.41(d，J＝7.2Hz，1H)，7.15-7.22(m，3H)，7.09-7.13(m，1H)，2.22(s，3H)。LC/MS(m/+
z)(M+1) ：439.2。
[0171] N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-2-氯-4-(甲基磺酰基)1
苯甲酰胺A5：H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.65(s，1H)，9.29(s，1H)，9.03(s，1H)，8.72(d，J＝4.4Hz，1H)，8.55(m，2H)，8.06(s，1H)，8.00(d，J＝9.2，1H)，7.87(d，J＝8.0Hz，1H)，
7.60(m，1H)，7.45(d，J ＝ 4.8Hz，1H)，7.37(d，J ＝ 8.0Hz，1H)，7.24(d，J ＝ 8.4Hz，1H)，+
3.34(s，3H)，2.24(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：494.1。
苯甲酰胺A5：H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.65(s，1H)，9.29(s，1H)，9.03(s，1H)，8.72(d，J＝4.4Hz，1H)，8.55(m，2H)，8.06(s，1H)，8.00(d，J＝9.2，1H)，7.87(d，J＝8.0Hz，1H)，
7.60(m，1H)，7.45(d，J ＝ 4.8Hz，1H)，7.37(d，J ＝ 8.0Hz，1H)，7.24(d，J ＝ 8.4Hz，1H)，+
3.34(s，3H)，2.24(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：494.1。
[0172] 4-甲磺酰基-3-甲基-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺A6：
[0173]
[0174] 中间体6的制备与A1相似。将化合物6(0.1mmol)、CuI(0.075mmol)、L-脯氨酸(0.1mmol)、1N NaOH(0.1mL)和NaSO2Me(0.15mmol)混悬于DMSO(0.5mL)中并在微波炉中在180℃下加热5分钟。将混合物经制备型LC/MS纯化得到A6。1H NMR(400MHz，DMSO)δ10.45(s，1H)，9.24(s，1H)，8.89(s，1H)，8.67(d，J ＝ 2.0Hz，1H)，8.49(m，2H)，8.09(s，1H)，8.01(d，J＝8.4，1H)，7.90-7.93(m，2H)，7.56(m，1H)，7.39(d，J＝5.6Hz，2H)，7.23(d，J＝8.4Hz，1H)，3.32(s，3H)，2.70(s，3H)，2.21(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1)+：474.2。
[0175] 根据相似方法制备化合物A7、A8
[0176] N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-甲基-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺A7：1H NMR(400MHz，DMSO)δ10.46(s，1H)，9.23(s，1H)，8.87(d，J＝7.2Hz，1H)，8.67(m，1H)，8.50(m，2H)，8.05(d，J＝12.8Hz，1H)，7.58(m，2H)，7.39(m，2H)，7.29(m，
1H)，7.22(m，2H)，3.23(s，3H)，2.69(s，3H)，2.21(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1)+：474.2。
1H)，7.22(m，2H)，3.23(s，3H)，2.69(s，3H)，2.21(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1)+：474.2。
[0177] N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-乙氧基-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺A8：1H NMR(400MHz，DMSO)δ10.37(s，1H)，9.23(s，1H)，8.89(s，1H)，8.66(d，J＝3.6Hz，1H)，8.48(m，2H)，8.37(d，J＝2.0Hz，1H)，8.25(d，J＝8.8Hz，1H)，8.05(s，1H)，7.55(m，1H)，7.39(m，3H)，7.22(d，J ＝ 8.0Hz，1H)，4.30(m，2H)，3.27(s，3H)，2.20(s，3H)，
1.41(t，J＝6.4Hz，3H)。LC/MS(m/z)(M+1)+：504.2。
1.41(t，J＝6.4Hz，3H)。LC/MS(m/z)(M+1)+：504.2。
[0178] B型
[0179] 4-甲磺酰基-N-{4-甲基-3-[4-(5-吡咯烷-1-基-吡啶-3-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-苯甲酰胺B1
[0180]1
[0181] 采用与制备A1类似的方法从10制备终化合物B1。H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.5(s，1H)，9.12(s，1H)，8.6(s，1H)，8.59(s，1H)，8.18(m，3H)，8.09(m，3H)，7.89(s，1H)，7.54(d，J＝5.1Hz，1H)，7.5(dd，J＝8.2，2.1Hz，1H)，7.23(d，J＝8.5Hz，1H)，3.3(m，+
4H)，3.29(s，3H)，2.24(s，3H)，1.86(m，4H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：530.1。
4H)，3.29(s，3H)，2.24(s，3H)，1.86(m，4H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：530.1。
[0182] C型
[0183] 3-甲磺酰基-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-4-吗啉-4-基-苯甲酰胺C1：
[0184]
[0185] 将A3(20mg，0.04mmol)和吗啉(0.07mL，0.8mmol)在微波炉中在130℃下加热30分钟。经制备型LC/MS纯化得到C1。LC/MS(m/z)(M+1)+：545.3。
[0186] D型
[0187] 4-甲磺酰基-N-{3-[4-(5-甲氧基-吡啶-3-基)-嘧啶-2-基氨基]-4-甲基-苯基}-苯甲酰胺D1：
[0188]
[0189] 采用与制备A1类似的方法从14制备终化合物D1。1H NMR(400MHz，d4-MeOH)δ9.29(s，1H)，8.82(m，1H)，8.7(d，J ＝ 2.2Hz，1H)，8.6(d，J ＝ 5.6Hz，1H)，8.36(s，1H)，8.17(m，2H)，8.11(m，2H)，7.66(d，J ＝ 5.6Hz，1H)，7.35(m，2H)，4.09(s，3H)，3.19(s，3H)，+
2.35(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：490.2。
2.35(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：490.2。
[0190] N-(3-{4-[5-(2-氟-乙氧基)-吡啶-3-基]-嘧啶-2-基氨基}-4-甲基-苯基)-4-甲磺酰基-苯甲酰胺D2：
[0191]
[0192] 采用与制备A1类似的方法从17制备终化合物D2。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.5(s，1H)，9.04(s，1H)，8.93(d，J ＝ 1.6Hz，1H)，8.54(d，J ＝ 5.2Hz，1H)，8.46(d，J＝ 2.8Hz，1H)，8.16(m，3H)，8.07(m，3H)，7.5(m，2H)，7.24(d，J ＝ 8.5Hz，1H)，4.7(d，J ＝+47.8Hz，2H)，4.37(d，J＝30Hz，2H)，3.29(s，3H)，2.24(s，3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：522.2。
[0193] E型
[0194] 4-甲磺酰基-N-{4-甲基-3-[4-(5-甲基-吡啶-3-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-苯甲酰胺E1
[0195]
[0196] 采用与制备A1类似的方法从21制备终化合物E1。LC/MS(m/z)(M+1)+：474.2。
[0197] F型
[0198] 3-(2-氟-乙氧基)-4-甲磺酰基-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-苯甲酰胺F1：
[0199]
[0200] 将化合物23(0.04mmol)、CsHCO3(0.1mmol)和1-溴-2-氟-乙烷(0.04mmol)在干燥乙腈(0.5mL)中在微波炉中在150℃下加热10分钟。经制备型LC/MS纯化得到终化合物1
F1。H NMR(400MHz，DMSO)δ10.41(s，1H)，9.31(s，1H)，9.01(s，1H)，8.73(s，1H)，8.55(m，
2H)，8.10(s，1H)，7.95(m，1H)，7.76(s，1H)，7.71(m，1H)，7.60(m，1H)，7.46(m，2H)，7.25(d，J ＝ 8.0Hz，1H)，4.92(m，1H)，4.80(m，1H)，4.62(m，1H)，4.55(m，1H)，3.32(s，3H)，2.25(s，+
3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：522.2。
F1。H NMR(400MHz，DMSO)δ10.41(s，1H)，9.31(s，1H)，9.01(s，1H)，8.73(s，1H)，8.55(m，
2H)，8.10(s，1H)，7.95(m，1H)，7.76(s，1H)，7.71(m，1H)，7.60(m，1H)，7.46(m，2H)，7.25(d，J ＝ 8.0Hz，1H)，4.92(m，1H)，4.80(m，1H)，4.62(m，1H)，4.55(m，1H)，3.32(s，3H)，2.25(s，+
3H)。LC/MS(m/z)(M+1) ：522.2。
[0201] 根据相似方法制备化合物F2-F8
[0202] G型
[0203] N-(3-(4-(异喹啉-4-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-3-(甲基磺酰基)苯甲酰胺G1：
[0204]
[0205] 采用与制备A1类似的方法从27制备终化合物G1。LC/MS(m/z)(M+1)+：510.2。
[0206] 重复上述实施例中的方法(中间体和终化合物)，使用适当的原料可获得以下表1中的式I化合物。
[0207] 表1
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213] 试验
[0214] 测定本发明化合物选择性抑制野生型Ba/F3细胞和用Tel c-kit激酶和Tel PDGFR融合的酪氨酸激酶转化的Ba/F3细胞增殖的能力和选择性抑制Mo7e细胞的SCF依赖性增殖的能力。此外还测定本发明化合物抑制Abl、ARG、BCR-Abl、BRK、EphB、Fms、Fyn、KDR、c-kit、LCK、PDGFR、b-Raf、c-Raf、SAPK2、Src、Tie2和TrkB激酶的能力。
[0215] 增殖试验：BaF3文库-Bright glo读数方案
[0216] 对化合物抑制野生型Ba/F3细胞和用Tel融合的酪氨酸激酶转化的Ba/F3细胞增殖的能力进行分析。将未被转化的Ba/F3细胞维持在包含重组IL3的培养基中。将细胞以每孔50μL培养基中5,000个细胞的密度涂到384-孔TC板中，并以0.06nM至10μM的浓度向其中加入试验化合物。然后，将这些细胞在37℃、5％CO2下培养48小时。在对细胞进行培养后，按照制造商的说明向各孔中加入25μL BRIGHT (Promega)，并用Analyst GT-Luminescence Mode-50000积分时间在RLU中对这些板进行读数。由剂量响应曲线确定IC50值(50％抑制所需的化合物浓度)。
[0217] Mo7e试验
[0218] 用内源性表达c-kit的Mo7e细胞在96-孔板中对本文所述化合物抑制SCF依赖性增殖的作用进行试验。简单地说，对两倍系列稀释的试验化合物(Cmax＝10μM)对用人重组SCF刺激的Mo7e细胞的抗增殖活性进行评估。将其在37℃下培养48小时后，用得自Promega的MTT比色测定测量细胞活力。
[0219] c-kit HTRF试验方案
[0220] 将等份(5μL)的2倍浓度的c-kit酶混合物25ng c-kit(5ng/μL)和2μM生物素-EEEPQYEEIPIYLELLP-NH2肽在激酶缓冲液(20mM Tris pH 7.5，10mM MgCl2，0.01％ BSA，0.1％ Brij35，1mM DTT，5％甘油，0.05mMNa3VO4)中的溶液加至384孔Proxiplate板(Packard)的各孔中。Proxiplate板最后一行的每个孔中含有5μL不合c-kit的c-kit酶混合物以确定背景水平。向每孔中加入本发明化合物，将板在室温下培养30分钟。向每孔中加入2x ATP(40μM)在激酶缓冲液(5μL)中的溶液，将板在室温下培养3小时。向每孔中加入检测混合物(50％ KF，40％激酶缓冲液，10％ EDTA，1∶100稀释的Mab PT66-K(cat#61T66KLB)和1∶100稀释的链霉抗生物素-XL(cat#611SAXLB)0(10μL)，将板继续在室温下培养1至2小时，然后在检测器中读取HTRF信号强度。
[0221] 人TG-HA-VSMC增殖试验
[0222] 使人TG-HA-VSMC细胞(ATCC)在补加了10％FBS的DMEM中生长至80-90％融合，然后将其以6e4个细胞/mL的数量重新混悬于补加了1％FBS和30ng/mL重组人PDGF-BB的DMEM中。然后，将这些细胞以50μL/孔的数量等分至384-孔板中，将其在37℃下培养20小时，然后用0.5μL 100x化合物将其在37℃下处理48小时。在处理后，向各孔中加入
25μL CellTiter-Glo处理15分钟，然后在CLIPR(Molecular Devices)上对这些板进行读数。
25μL CellTiter-Glo处理15分钟，然后在CLIPR(Molecular Devices)上对这些板进行读数。
[0223] PDGFRα&βLance试验方案
[0224] 将 等 份 的 (2.5μL)2x 浓 度 的 PDGFRβ肽 和ATP 混 合 物 (4lμM生 物素-βA-βA-βA-AEEEEYVFIEAKKK肽，20μM ATP在分析缓冲液(20mMHepes，54mM MgCl2，0.01％ BSA，0.05％吐温-20，1mM DTT，10％甘油，50μM Na3VO4)中的溶液)加至384孔Proxiplate板(Packard)中。将板离心，用针式加样器(pintool dispenser)向每孔中加入本发明的化合物(50nL)。向各孔中加入(2.5μL)2x浓度的酶混合物(PDGFRα，浓度为4.5ng/μL(cat#PV4117)或PDGFRβ，浓度为1.5ng/μL(cat# PV3591)，均为在分析缓冲液中的溶液)或不含PDGFRα/β酶的分析缓冲液。将板在室温下培养1.5小时。向每孔中加入检测混合物(5μL；50％ 1M KF，40％激酶缓冲液，10％ EDTA，1∶100稀释的Mab PT66-K(cat# 61T66KLB)和1∶100稀释的链霉抗生物素-XL(cat# 611SAXLB)，将Proxiplate板在室温下培育1小时，然后在检测器上读取HTRF信号。
[0225] Ba/F3 FL FLT3增殖试验
[0226] 所用鼠科动物细胞系是过表达全长FLT3构建体的Ba/F3鼠科动物pro-B细胞系。将这些细胞维持在补加了青霉素50μg/mL、链霉素50μg/mL和L-谷酰胺200mM的RPMI
1640/10％胎牛血清(RPMI/FBS)中，同时加入鼠科动物重组IL3。Ba/F3全长FLT3细胞经历16小时的IL3饥饿，然后以每孔25μL培养基中5,000个细胞的密度将其涂到384-孔TC板中；并以0.06nM至10μM的浓度向其中加入试验化合物。在加入化合物后，以适宜的浓度向各孔25μL的培养基中加入FLT3配体或IL3作为细胞毒性对照。然后，将这些细胞在37℃、5％CO2下培养48小时。在对细胞进行培养后，按照制造商的说明向各孔中加入
25μL BRIGHT (Promega)并用Analyst GT-Luminescence Mode-50000积分时间
在RLU中对这些板进行读数。
1640/10％胎牛血清(RPMI/FBS)中，同时加入鼠科动物重组IL3。Ba/F3全长FLT3细胞经历16小时的IL3饥饿，然后以每孔25μL培养基中5,000个细胞的密度将其涂到384-孔TC板中；并以0.06nM至10μM的浓度向其中加入试验化合物。在加入化合物后，以适宜的浓度向各孔25μL的培养基中加入FLT3配体或IL3作为细胞毒性对照。然后，将这些细胞在37℃、5％CO2下培养48小时。在对细胞进行培养后，按照制造商的说明向各孔中加入
25μL BRIGHT (Promega)并用Analyst GT-Luminescence Mode-50000积分时间
在RLU中对这些板进行读数。
[0227] 对细胞BCR-Abl依赖性增殖的抑制(高通量方法)
[0228] 所用的鼠细胞系是用Bcr-Abl cDNA转化的32D造血祖细胞系(32D-p210)。将这些细胞保持在补充有青霉素(50μg/mL)、链霉素(50μg/mL)和L-谷酰胺(200mM)的RPMI/10％胎牛血清(RPMI/FCS)中。将未转化的32D细胞保持在类似条件下并添加15％ WEHI条件培养基作为IL3源。
[0229] 将50μl 32D或32D-p210细胞混悬液以每孔5000个细胞的密度接种于Greiner384孔微孔板(黑色)中。向各孔中加入50nl测试化合物(1mM的DMSO储备液)(包含
STI571作为阳性对照)。在37℃、5％CO2下将细胞培养72小时。向各孔中加入10μl TM TM
60％的Alamar Blue 溶液(Tek诊断试剂)并将细胞再培养24小时。使用Acquest 系统(Molecular Devices)测定荧光强度(530nm激发，580nm发射)。
STI571作为阳性对照)。在37℃、5％CO2下将细胞培养72小时。向各孔中加入10μl TM TM
60％的Alamar Blue 溶液(Tek诊断试剂)并将细胞再培养24小时。使用Acquest 系统(Molecular Devices)测定荧光强度(530nm激发，580nm发射)。
[0230] 对细胞BCR-Abl依赖性增殖的抑制
[0231] 将32D-p210细胞以每孔15,000个细胞/孔的密度接种于96孔TC板中。向各孔中加入50μL测试化合物的两倍系列稀释液(Cmax为40μM)(包含STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％CO2下培养48小时后，向各孔中加入15μL MTT(Promega)并将细胞再培养5小时。通过分光光度法定量测定570nm处的光密度并通过量效曲线确定50％抑制所需的化合物浓度。
[0232] 对细胞周期分布的影响
[0233] 将32D和32D-p210细胞以每孔5mL培养基中2.5x106个细胞的数量接种于6孔TC板中并加入1或10μM的测试化合物(包含STI571作为对照)。然后，将细胞在37℃、5％ CO2下培养24或48小时。用PBS洗涤2ml细胞混悬液，在70％ EtOH中固定1小时并用PBS/EDTA/RNase A处理30分钟。加入碘化丙锭(Cf＝10μg/ml)并用流式细胞仪TM
在FACScalibur 系统(BD Biosciences)上测定荧光强度。本发明的测试化合物显示对
32D-p210细胞具有细胞凋亡作用但不在32D母本细胞中诱导细胞凋亡。
在FACScalibur 系统(BD Biosciences)上测定荧光强度。本发明的测试化合物显示对
32D-p210细胞具有细胞凋亡作用但不在32D母本细胞中诱导细胞凋亡。
[0234] 对细胞BCR-Abl自身磷酸化的影响
[0235] 使用c-abl特异性捕获抗体和抗磷酸酪氨酸抗体通过捕获Elisa测定BCR-Abl的5
自身磷酸化作用。将32D-p210细胞以每孔50μL培养基中2x10 个细胞的数量加入96孔TC板中。每孔加入50μL测试化合物的两倍系列稀释液(Cmax为10μM)(包含STI571作为阳性对照)。在37℃、5％ CO2下培养细胞90分钟。然后，将细胞在冰上用150μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.4、150mM NaCl、5mM EDTA、1mM EGTA和1％NP-40)处理1小时。将50μL细胞溶胞产物加到96孔光学板中，该板预先用抗-abl特异性抗体涂覆和封闭。在4℃下培养该板4小时。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入
50μL结合有碱性磷酸酶的抗-磷酸酪氨酸抗体并将该板在4℃下培养过夜。用TBS-吐温TM
20缓冲液洗涤后，加入90μL发光底物并用Acquest 体系(Molecular Devices)定量测定发光情况。本发明受试化合物中抑制表达BCR-Ab1的细胞增殖的化合物以剂量依赖的方式抑制细胞的BCR-Ab1自身磷酸化作用。
自身磷酸化作用。将32D-p210细胞以每孔50μL培养基中2x10 个细胞的数量加入96孔TC板中。每孔加入50μL测试化合物的两倍系列稀释液(Cmax为10μM)(包含STI571作为阳性对照)。在37℃、5％ CO2下培养细胞90分钟。然后，将细胞在冰上用150μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.4、150mM NaCl、5mM EDTA、1mM EGTA和1％NP-40)处理1小时。将50μL细胞溶胞产物加到96孔光学板中，该板预先用抗-abl特异性抗体涂覆和封闭。在4℃下培养该板4小时。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入
50μL结合有碱性磷酸酶的抗-磷酸酪氨酸抗体并将该板在4℃下培养过夜。用TBS-吐温TM
20缓冲液洗涤后，加入90μL发光底物并用Acquest 体系(Molecular Devices)定量测定发光情况。本发明受试化合物中抑制表达BCR-Ab1的细胞增殖的化合物以剂量依赖的方式抑制细胞的BCR-Ab1自身磷酸化作用。
[0236] 对表达突变型BCR-Abl的细胞增殖的影响
[0237] 测试本发明化合物对表达野生型或突变型BCR-Abl(G250E、E255V、T315I、F317L、M351T)的Ba/F3细胞的抗增殖作用，所述BCR-Abl可以引起对STI571耐受或对其敏感性降低。以10、3.3、1.1和0.37μM的浓度如上所述(在不含IL3的培养基中)测试这些化合物对表达突变型-BCR-Abl的细胞和未转化的细胞的抗增殖作用。如上所述由获得的量效曲线确定对未转化的细胞没有毒性的化合物的IC50值。
[0238] FGFR3(酶试验)
[0239] 利用纯化的FGFR-3(Upstate)进行激酶活性测定，最终体积为10μL，其中含有0.25μg/mL酶的激酶缓冲溶液(30mM Tris-HCl pH7.5，15mMMgCl2，4.5mM MnCl2，15μM Na3VO4和50μg/mL BSA)和底物(5μg/mL生物素-聚-EY(Glu，Tyr)(CIS-US公司)和3μM ATP)。制备两种溶液：将5μL第一种溶液(含有在激酶缓冲液中的FGFR-3酶)首先分配在384-孔 (珀金埃尔默公司(PerkinElmer))中，然后加入50nL化合物的
DMSO溶液，然后向每孔加入5μL第二种溶液，其中含有在激酶缓冲液中的底物(聚-EY)和ATP。将反应物于室温温育1小时，加入10μL HTRF检测混合物终止反应，所述混合物含有30mM Tris-HCl pH7.5、0.5M KF、50mM ETDA、0.2mg/mL BSA、15μg/mL链霉抗生物素-XL665(CIS-US公司)和150ng/mL偶联了抗-磷酸酪氨酸抗体的穴状化合物(CIS-US公司)。于室温温育1小时以使链霉抗生物素-生物素相互作用后，在Analyst GT(分子装置公司(Molecular Devices Corp.))上读取时间解析荧光信号。通过对每种化合物在12种浓度(从50μM按1∶3稀释至0.28nM)下的抑制百分比进行线性回归分析，计算得到IC50值。在该试验中，本发明化合物的IC50范围为10nM至2μM。
DMSO溶液，然后向每孔加入5μL第二种溶液，其中含有在激酶缓冲液中的底物(聚-EY)和ATP。将反应物于室温温育1小时，加入10μL HTRF检测混合物终止反应，所述混合物含有30mM Tris-HCl pH7.5、0.5M KF、50mM ETDA、0.2mg/mL BSA、15μg/mL链霉抗生物素-XL665(CIS-US公司)和150ng/mL偶联了抗-磷酸酪氨酸抗体的穴状化合物(CIS-US公司)。于室温温育1小时以使链霉抗生物素-生物素相互作用后，在Analyst GT(分子装置公司(Molecular Devices Corp.))上读取时间解析荧光信号。通过对每种化合物在12种浓度(从50μM按1∶3稀释至0.28nM)下的抑制百分比进行线性回归分析，计算得到IC50值。在该试验中，本发明化合物的IC50范围为10nM至2μM。
[0240] FGFR3(细胞试验)
[0241] 测试本发明化合物抑制转化的Ba/F3-TEL-FGFR-3细胞增殖的能力，这种增殖依赖于FGFR-3细胞激酶活性。将Ba/F3-TEL-FGFR-3在用作培养基的补充有10％胎牛血清的RPMI 1640中培养至800,000细胞/mL混悬液。将50μL细胞培养基混悬液分配在384-孔板中，密度为5000个细胞/孔。将本发明化合物溶解和稀释在二甲基亚砜(DMSO)中。在DMSO中制备12个1∶3系列稀释液以产生范围通常从10mM到0.05μM的浓度梯度。向细胞加入50nL稀释的化合物并在细胞培养箱中温育48小时。向细胞中加入最终浓度为10％的 (特克诊断系统公司(TREKDiagnostic Systems))，其可用于监测由增殖细胞所产生的还原性环境。在37℃的细胞培养箱中再温育4小时后，在Analyst GT(分子装置公司(Molecular Devices Corp.))上测定来自还原的 (在530nm
激发，在580nm发射)的荧光信号。通过对每种化合物在12种浓度下的抑制百分比进行线性回归分析，计算得到IC50值。
激发，在580nm发射)的荧光信号。通过对每种化合物在12种浓度下的抑制百分比进行线性回归分析，计算得到IC50值。
[0242] b-Raf(酶试验)
[0243] 测试本发明化合物抑制b-Raf活性的能力。在黑色壁和透明底的384孔MaxiSorp板(NUNC)中进行测定。在DPBS中稀释底物IκBα(1∶750)并在各孔中加入15μL。在4℃下将板培养过夜并用EMBLA板洗涤器、用TBST(25mM Tris，pH8.0，150mM NaCl和0.05％吐温-20)洗涤3次。在室温下，将板用Superblock(15μL/孔)封闭3小时，用TBST洗涤3次并拍干。将含有20μM ATP的测定缓冲液(10μL)加到各孔中，然后加入100nL或500nL化合物。将b-Raf在测定缓冲液中稀释(1μL稀释至25μl)并将10μl稀释的b-Raf加到各孔中(0.4μg/孔)。在室温下将该板培养2.5小时。通过用TBST洗涤该板6次来终止激酶反应。在Superblock中稀释Phosph-IκBα(Ser32/36)抗体(1∶10,000)并将15μL加到各孔中。将板在4℃下培养过夜并用TBST洗涤6次。在Superblock中稀释AP-结合的山羊-抗-鼠IgG(1∶1,500)并将15μL加到各孔中。在室温下培养该板1小时并用TBST洗涤6次。在各孔中加入15μLAttophos AP荧光底物(普洛麦格(Promega)公司)并在室温下培养15分钟。在Acquest或Analyst GT上采用荧光强度程序读板(激发波长
455nm，发射波长580nm)。
455nm，发射波长580nm)。
[0244] b-Raf(细胞试验)
[0245] 在A375细胞中测试本发明化合物抑制MEK磷酸化的能力。A375细胞系(ATCC)得自人黑素瘤患者，它在B-Raf基因上具有V599E突变。由于B-Raf突变，磷酸化MEK的水平上升。在没有血清的介质中，于37℃将亚汇合到汇合的A375细胞与化合物一起培养
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