相关申请的交叉参考

本申请要求2006年11月3日提交的美国临时专利申请60/864,378的 优先权利益。在该申请中公开的所有内容整体引入本文作为参考并用于所 有目的。

发明背景

发明领域

本发明提供了一类新的化合物、包含这类化合物的药物组合物和使用 这类化合物来治疗或预防与激酶活性异常或失调有关的疾病或病症、特别 是与c-kit、PDGFRα和PDGFRβ激酶的异常激活有关的疾病或病症的方 法。

背景

蛋白激酶代表一大族蛋白质，它们在调节各种各样的细胞过程和保持 对细胞功能的控制中起重要的作用。这些激酶的部分非限定性的列表包括： 受体酪氨酸激酶，如血小板衍生生长因子受体激酶(PDGF-R)、神经生长因 子受体、trkB和成纤维细胞生长因子受体FGFR3、B-RAF；非-受体酪氨 酸激酶，如Abl和融合激酶BCR-Abl、Lck、Bmx和c-src；以及丝氨酸/ 苏氨酸激酶，如c-RAF、sgk、MAP激酶(例如MKK4、MKK6等)和SAPK2α 和SAPK2β。已经在很多疾病状态中观察到了异常的激酶活性，所述疾病 状态包括良性和恶性增殖性病症以及由免疫和神经系统的不适当激活所导 致的疾病。

本发明的新化合物抑制一种或多种蛋白激酶活性，因此预期可用于治 疗激酶相关的疾病。

发明概述

在一个方面中，本发明提供式I化合物及其N-氧化物衍生物、前药衍 生物、受保护的衍生物、单个异构体和异构体混合物；和这些化合物的药 学上可接受的盐和溶剂化物(例如水合物)：

其中：

X选自键和NH；

Y选自键和NH；

R1选自环己基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基和苯基；其中所述R1的 环己基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基或苯基可任选被1至3个独立地选自 卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷基、卤代-C1-6烷氧基、-NR5aR5b、 -OX1NR5aR5b和杂环基的基团取代；其中X1独立地选自键和C1-4亚烷基； 且R5a和R5b独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷基和卤代 -C1-6烷氧基；

R2选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷基和卤代-C1-6烷氧 基；

R3选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷基和卤代-C1-6烷氧 基；

R4是杂芳基，其被1至3个独立地选自卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6 烷氧基、卤代-C1-6烷基、卤代-C1-6烷氧基、C6-10芳基-C0-4烷基、杂芳基、 杂环基、-X1NR5R5、-X1NR5OR5、-X1NR5X1OR5、-X1NR5X1C(O)NR5R5、 -X1S(O)2NR5R5、-X1S(O)2R5、-X1NR5R5、-X1NR5OR5、-X1C(O)R5、 -X1OX2OR5、-OX1R5、-X1R5、-X1C(O)OR5、-X1OR5和-X1OX1OR5的 基团取代；其中每个X1独立地选自键和C1-4亚烷基；X2是C1-4亚烷基； 且每个R5独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6链烯基、C3-12环烷基、C6-10芳基 -C0-4烷基、杂芳基-C0-4烷基和杂环基；

其中R4的所述芳基、环烷基、杂芳基或杂环基取代基可任选地进一步 被1至3个独立地选自卤素、羟基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6 烷基、卤代-C1-6烷氧基、-L-OR6、-L-C(O)OR6、-L-C(O)NR6R6和-L-R6 的基团取代；其中L选自键和C1-4亚烷基；且R6选自氢、C1-6烷基和杂环 基；条件是R4不是被三氟甲基取代的吡啶-3-基。

在第二个方面中，本发明提供了包含式I化合物或其N-氧化物衍生物、 单个异构体和异构体混合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种合适的 赋形剂的药物组合物。

在第三个方面中，本发明提供了治疗动物疾病的方法，其中抑制激酶 活性、特别是c-kit、PDGFRα和/或PDGFRβ活性可预防、抑制或改善疾 病的病理和/或症状，该方法包括给动物施用治疗有效量的式I化合物或其 N-氧化物衍生物、单个异构体和异构体混合物、或其药学上可接受的盐。

在第四个方面中，本发明提供了式I化合物在制备治疗动物疾病的药 物中的用途，其中在所述疾病中激酶活性、特别是c-kit、PDGFRα和/或 PDGFRβ活性对该疾病的病理和/或症状起作用。

在第五个方面中，本发明提供了制备式I化合物及其N-氧化物衍生物、 前体药物衍生物、受保护的衍生物、单个异构体和异构体混合物以及药学 上可接受的盐的方法。

发明详述

定义

“烷基”作为基团或作为其他基团例如卤代-烷基和烷氧基的结构元素， 可以是直链或支链的。C1-4烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。卤代-烷基包括 三氟甲基、五氟乙基、三氟乙氧基(及其异构体)等。

“芳基”是指含有6至10个环碳原子的单环或稠合双环的芳香环集合。 例如，芳基可以是苯基或萘基，优选苯基。“亚芳基”是指由芳基衍生的二 价基团。

“杂芳基”是含有1至3个独立地选自-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、 -S(O)-或-S(O)2-的杂原子的5至10元不饱和环系统，其中R是氢、C1-4烷 基或氮保护基。用于本申请的实例包括但不限于吡唑基、吡啶基、吲哚基、 噻唑基、3-氧代-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-6-基、呋喃基、苯并[b]呋喃 基、吡咯基、1H-吲唑基、咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基、噁唑基、苯并[d]噻唑 -6-基、1H-苯并[d][1，2，3]三唑-5-基、喹啉基、1H-吲哚基、3，4-二氢-2H-吡 喃并[2，3-b]吡啶基和2，3-二氢呋喃并[2，3-b]吡啶基、3-氧代-3，4-二氢-2H-苯 并[b][1，4]噁嗪-7-基等。

“环烷基”是指包含指定环原子数的饱和或部分饱和的单环、稠合双环 或桥接的多环的集合。例如，C3-10环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、 环己基等。

“杂环基”是指含有1至3个独立地选自-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、 -S(O)-或-S(O)2-的杂原子的5至10元饱和或部分不饱和环系统，其中R是 氢、C1-4烷基或氮保护基。例如，本申请中用于描述本发明化合物的杂环 基包括吗啉代、吡咯烷基、氮杂环庚烷基、哌啶基、异喹啉基、四氢呋喃 基、吡咯烷基、吡咯烷基-2-酮、哌嗪基、哌啶酮基、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺 [4.5]癸-8-基、3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基等。

“卤素”(或卤代基)优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。

“激酶组”是包括如下激酶的列表：Abl(人)、Abl(T315I)、JAK2、JAK3、 ALK、JNK1α1、ALK4、KDR、Aurora-A、Lck、Blk、MAPK1、Bmx、 MAPKAP-K2、BRK、MEK1、CaMKII(大鼠)、Met、CDK1/细胞周期蛋 白B、p70S6K、CHK2、PAK2、CK1、PDGFRα、CK2、PDK1、c-kit、 Pim-2、c-RAF、PKA(h)、CSK、PKBα、cSrc、PKCα、DYRK2、Plk3、 EGFR、ROCK-I、Fes、Ron、FGFR3、Ros、Flt3、SAPK2α、Fms、SGK、 Fyn、SIK、GSK3β、Syk、IGF-1R、Tie-2、IKKβ、TrKB、IR、WNK3、 IRAK4、ZAP-70、ITK、AMPK(大鼠)、LIMK1、Rsk2、Axl、LKB1、SAPK2β、 BrSK2、Lyn(h)、SAPK3、BTK、MAPKAP-K3、SAPK4、CaMKIV、 MARK1、Snk、CDK2/细胞周期蛋白A、MINK、SRPK1、CDK3/细胞周 期蛋白E、MKK4(m)、TAK1、CDK5/p25、MKK6(h)、TBK1、CDK6/ 细胞周期蛋白D3、MLCK、TrkA、CDK7/细胞周期蛋白H/MAT1、MRCKβ、 TSSK1、CHK1、MSK1、Yes、CK1d、MST2、ZIPK、c-Kit(D816V)、 MuSK、DAPK2、NEK2、DDR2、NEK6、DMPK、PAK4、DRAK1、PAR-1Bα、 EphA1、PDGFRβ、EphA2、Pim-1、EphA5、PKBβ、EphB2、PKCβI、 EphB4、PKCδ、FGFR1、PKCη、FGFR2、PKCθ、FGFR4、PKD2、Fgr、 PKG1β、Flt1、PRK2、Hck、PYK2、HIPK2、Ret、IKKα、RIPK2、IRR、 ROCK-II(人)、JNK2α2、Rse、JNK3、Rsk1(h)、PI3Kγ、PI3Kδ和PI3-Kβ。 根据该激酶组(野生型和/或其突变体)筛选出本发明化合物，其抑制至少一 种所述组的成员的活性。

“BCR-Abl突变体形式”是指野生型序列的单个或多个氨基酸改变。 BCR-ABL的突变通过破坏蛋白质与抑制剂(例如格列卫等)之间的关键接 触点而发挥作用，更经常是通过诱导从无活性状态向活性状态、也就是向 BCR-ABL和格列卫不能结合的构象转变而发挥作用。根据对临床样品的 分析，发现与抗性表型有关的突变总数已经随时间推移而出现缓慢但不可 抗拒地增加。突变似乎聚集在四个主要的区域。一组突变(G250E、Q252R、 Y253F/H、E255K/V包括构成对ATP的磷酸酯-结合袢(也称为P-袢)的氨 基酸。第二组(V289A、F311L、T315I、F317L)可在格列卫结合位点处发 现，经由氢键或范德华力而直接与抑制剂相互作用。第三组突变(M351T、 E355G)聚集在催化结构域附近。第四组突变(H396R/P)位于活化袢中，它 的构象是控制激酶活化/失活的分子开关。在CML和ALL患者中检测到 的与格列卫抗性有关的BCR-ABL点突变包括：M224V、L248V、G250E、 G250R、Q252R、Q252H、Y253H、Y253F、E255K、E255V、D276G、 T277A、V289A、F311L、T315I、T315N、F317L、M343T、M315T、E355G、 F359V、F359A、V379I、F382L、L387M、L387F、H396P、H396R、A397P、 S417Y、E459K和F486S(由单字母密码所示的氨基酸位置是对于GenBank 序列、登录号AAB60394的那些，并且对应于ABL 1a型；Martiuelli等人， Haematologica/The Hematology Journal，2005年4月；90-4)。除非本发 明另有陈述，否则Bcr-Abl是指酶的野生型和突变形式。

“治疗”是指缓解或减轻疾病和/或其伴随症状的方法。

优选实施方案的描述

c-kit基因编码受体酪氨酸激酶，且c-kit受体的配体被称为干细胞因 子(SCF)，SCF是主要的肥大细胞生长因子。c-kit受体蛋白酪氨酸激酶的 活性在正常细胞中是受控的，且c-kit基因产物的正常功能活性对维持正常 的造血作用、黑素生成、配子发生(genetogenesis)以及肥大细胞的生长和分 化是必需的。造成c-kit激酶活性在没有结合SCF的条件下发生组成型活 化的突变涉及多种疾病，其范围包括从哮喘到恶性的人类癌症。

在一个实施方案中，提及的式I化合物为式Ia化合物：

其中：

X选自键和NH；

Y选自键和NH；其中X或Y中的一个是键，但不都是键；

R3选自卤素、甲基、甲氧基、三氟甲基和三氟甲氧基；

R4是杂芳基，其被1至3个独立地选自卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6 烷氧基、卤代-C1-6烷基、卤代-C1-6烷氧基、C6-10芳基-C0-4烷基、杂芳基、 杂环基、-X1NR5R5、-X1NR5OR5、-X1NR5X1OR5、-X1NR5X1C(O)NR5R5、 -X1S(O)2NR5R5、-X1S(O)2R5、-X1NR5R5、-X1NR5OR5、-X1C(O)R5、 -X1OX2OR5、-OX1R5、-X1R5、-X1C(O)OR5、-X1OR5和-X1OX1OR5的 基团取代；其中每个X1独立地选自键和C1-4亚烷基；X2是C1-4亚烷基； 且每个R5独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6链烯基、C3-12环烷基、C6-10芳基 -C0-4烷基、杂芳基-C0-4烷基和杂环基；

其中R4的所述芳基、环烷基、杂芳基或杂环基取代基可任选地被1 至3个独立地选自卤素、羟基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6 烷基、卤代-C1-6烷氧基、-L-OR6、-L-C(O)OR6、-L-C(O)NR6R6和-L-R6 的基团进一步取代；其中L选自键和C1-4亚烷基；且R6选自氢、C1-6烷基 和杂环基；

R7是氢；

R8选自氢、卤素、甲氧基、氨基、二氟甲氧基、三氟甲基、吡咯烷基、 吗啉代、2-甲基-吗啉代、2，6-二甲基-吗啉代、氰基、-NR5aR5b和甲基；或 R7和R8与R7和R8所连接的碳原子一起形成苯基；其中R5a和R5b独立地 选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷基和卤代-C1-6烷氧基；

R9选自氢、吗啉代、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷基、 卤代-C1-6烷氧基、-NR5aR5b、-OX1NR5aR5b和杂环基；其中X1独立地选 自键和C1-4亚烷基；且R5a和R5b独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、 卤代-C1-6烷基和卤代-C1-6烷氧基。

在另一个实施方案中：R3是甲基；且R4是吡唑基、吡啶基、吲哚基、 二氢吲哚-2-基、噻吩基、噻唑基、3-氧代-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-6- 基、呋喃基、苯并[b]呋喃基、1，3，4-噻二唑基、苯并[b]噻吩基、吡咯基、 1H-吲唑基、咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基、噁唑基、苯并[d]噻唑-6-基、1H-苯 并[d][1，2，3]三唑-5-基、喹啉基、1H-吲哚基、3，4-二氢-2H-吡喃并[2，3-b]吡 啶基、3-氧代-3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-7-基和2，3-二氢呋喃并[2，3-b] 吡啶基；

其中所述R4的杂芳基被1至3个独立地选自如下的基团取代：卤素、 羟基、氰基、甲基、氨基、苯基、羟基乙基(甲基)氨基、哌啶基、三氟甲 基、2-甲基烯丙氧基、环丙基-甲基(丙基)氨基-甲基、三氟甲氧基、3，4-二 氢异喹啉-2(1H)-基、氨基-羰基-甲基(乙基)氨基-甲基、吡啶基-甲基(乙基)- 氨基-甲基、异丙基(乙基)-氨基-甲基、丙基(乙基)-氨基-甲基、吗啉代、丁 基(甲基)氨基-甲基、异丁基(甲基)氨基-甲基、苄基(乙基)氨基-甲基、吡啶 基、吡咯烷基、氮杂环庚烷基、羟基-丙氧基、乙基、甲氧基、甲基-羰基、 乙氧基、丙氧基、叔丁基、苄基、丙基、异丙氧基、异丙基、二乙氨基- 磺酰基、甲基-磺酰基、异丙基-磺酰基、二乙氨基-甲基、三氟乙氧基、哌 啶基、异喹啉基、(羟乙基)(甲基)氨基、二氟乙氧基、环丙基、环丙基-甲 氧基和四氢呋喃基-氧基；

其中R4的所述芳基、环烷基、杂芳基或杂环基取代基可任选地被1 至3个独立地选自卤素、甲基、吡咯烷基-甲基、三氟甲基、羟基-甲基、 羟基和氰基的基团进一步取代。

在另一个实施方案中，R9选自氢和二甲基-氨基-丙氧基。

在另一个实施方案中，化合物选自：N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨 基)-4-甲基苯基)-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺；N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨 基)-4-甲基苯基)-1-乙基-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺；N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶 -2-基氨基)-4-甲基苯基)-1，3-二甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺；N-(3-(4-(吡啶-3-基) 嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-5-(三氟甲基)-2-甲基噁唑-4-甲酰胺； N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-2-吗啉代吡啶-4-甲酰胺； N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-6-甲氧基吡啶-3-甲酰胺； N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-6-甲氧基吡啶-3-甲酰胺； N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-1，5-二甲基-1H-吡唑-3-甲 酰胺；N-(3-(4-(5-甲基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-1，5-二甲基 -1H-吡唑-3-甲酰胺；N-(3-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯 基)-1，5-二甲基-1H-吡唑-3-甲酰胺；2-(2，2-二氟乙氧基)-N-(3-(4-(吡啶-3-基) 嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)吡啶-4-甲酰胺；6-(2，2，2-三氟乙氧 基)-N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)吡啶-3-甲酰胺；3-(4-(吡 啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N-(3，4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-6-基)-4- 甲基苯甲酰胺；和N-(3-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯 基)-1，5-二甲基-1H-吡唑-3-甲酰胺。

代表性的很多本发明化合物在下文实施例和表I中详述。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗由c-kit和PDGFRα/β激酶受 体调节的疾病或病症的方法，其包括施用式I化合物或其药学上可接受的 盐或药物组合物。

可使用本发明的化合物和组合物调节的c-kit介导的疾病或病症的实 例包括但不限于肿瘤性病症、过敏性病症、炎症性病症、自身免疫性病症、 移植物抗宿主病、疟原虫(Plasmodium)相关疾病、肥大细胞相关疾病、代 谢综合征、CNS相关病症、神经变性病症、疼痛病症、物质滥用病症、朊 病毒病、癌症、心脏病、纤维化疾病、特发性动脉高血压(IPAH)或原发性 肺动脉高血压(PPH)。

可使用本发明化合物和组合物治疗的疟原虫相关疾病的实例包括但不 限于疟疾。

可使用本发明化合物和组合物治疗的肥大细胞相关疾病的实例包括但 不限于痤疮和痤疮丙酸杆菌、进行性骨化性纤维发育不良(FOP)、由于接 触化学或生物武器(如炭疽和硫芥子气)而诱导的炎症和组织破坏、囊性纤 维化；肾病、炎症性肌肉病症、HIV、II型糖尿病、脑缺血、肥大细胞增 生症、药物依赖和戒断症状、CNS病症、预防和减少脱发、细菌感染、间 质性膀胱炎、炎性肠病、肿瘤血管生成、自身免疫性疾病、炎症性疾病、 多发性硬化症(MS)、过敏性病症(包括哮喘)、肠应激综合征(IBS)、鼻息肉 病和骨丢失。

可使用本发明化合物和组合物治疗的肿瘤性病症的实例包括但不限于 肥大细胞增生症、胃肠道间质瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、急性髓细 胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性髓细胞 性白血病、结肠直肠癌、胃癌、睾丸癌、成胶质细胞瘤或星形细胞瘤。

可使用本发明化合物和组合物治疗的过敏性病症的实例包括但不限于 哮喘、变应性鼻炎、变应性鼻窦炎、过敏性综合征(anaphylactic syndrome)、 荨麻疹、血管性水肿、异位性皮炎、变应性接触性皮炎、结节性红斑、多 形红斑、表皮坏死性静脉炎、昆虫叮咬性皮肤炎症或吸血性寄生虫感染。

可使用本发明化合物和组合物治疗的炎症性病症的实例包括但不限于 类风湿性关节炎、结膜炎、类风湿性脊柱炎、骨关节炎或痛风性关节炎。

可使用本发明化合物和组合物治疗的自身免疫性病症的实例包括但不 限于多发性硬化症、牛皮癣、肠炎症性疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、 类风湿性关节炎、多关节炎、局部或全身性硬皮病、系统性红斑狼疮、盘 状红斑狼疮、表皮狼疮、皮肌炎、多发性肌炎、干燥综合征、结节性全身 动脉炎、自身免疫性肠病变或增生性肾小球肾炎。

可使用本发明化合物和组合物治疗的移植物抗宿主病的实例包括但不 限于器官移植的移植物排斥，如肾移植、胰腺移植、肝移植、心脏移植、 肺移植或骨髓移植。

可使用本发明化合物和组合物治疗的代谢性综合征的实例包括但不限 于I型糖尿病、II型糖尿病或肥胖症。

可使用本发明化合物和组合物治疗的CNS相关病症的实例包括但不 限于抑郁、心境恶劣障碍、循环型情感障碍、厌食症、贪食症、经前期综 合征、绝经后综合征、智力衰退(mental slowing)、集中力缺失、悲观忧虑、 激动、自我贬低和性欲降低、焦虑症、精神疾病或精神分裂症。

可使用本发明化合物和组合物治疗的抑郁病症的实例包括但不限于双 相抑郁、重度或忧郁型抑郁症、非典型性抑郁症、顽固性抑郁症或季节性 抑郁症。可使用本发明化合物和组合物治疗的焦虑症的实例包括但不限于 伴有换气过度和心律失常的焦虑症、恐怖性障碍、强迫症、创伤后应激障 碍、急性应激障碍和广泛性焦虑症。可使用本发明化合物和组合物治疗的 精神疾病的实例包括但不限于恐慌发作、包括精神病、妄想性障碍、转换 障碍、恐怖症、躁狂症、谵妄、分离性发作(包括分离性遗忘、分离性漫游 和分离性自杀行为)、自身忽视、暴力或攻击性行为、创伤、边缘型人格和 急性精神病如精神分裂症(包括偏执型精神分裂症、错乱型精神分裂症、紧 张型精神分裂症和未分化型精神分裂症)。

可使用本发明化合物和组合物治疗的神经变性病症的实例包括但不限 于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、朊病毒病、运动神经元疾病(MND) 或肌萎缩性侧索硬化(ALS)。

可使用本发明化合物和组合物治疗的疼痛病症的实例包括但不限于急 性疼痛、术后痛、慢性痛、伤害性疼痛、癌痛、神经性疼痛或精神性疼痛 综合征。

可使用本发明化合物和组合物治疗的物质滥用病症的实例包括但不限 于药物成瘾、药物滥用、药物习惯性、药物依赖、戒断综合征或过量。

可使用本发明化合物和组合物治疗的癌症的实例包括但不限于黑素 瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、小细胞肺癌、结肠直肠癌或其他实体瘤。

可使用本发明化合物和组合物治疗的纤维化疾病的实例包括但不限于 丙型肝炎(HCV)、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肺纤 维化、心脏纤维化或骨髓纤维化。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗由c-kit激酶受体调节的疾病 或病症的方法，其包括施用式I化合物或其药学上可接受的盐或药物组合 物。

药理学和用途

本发明的化合物调节激酶活性，并因此可用于治疗其中激酶对病理和/ 或症状有贡献的疾病或病症。被本文所述的化合物和组合物抑制并且可用 本文所述方法抵抗的激酶实例包括但不限于c-kit、Abl、Lyn、MAPK14 (p38δ)、PDGFRα、PDGFRβ、ARG、BCR-Abl、BRK、EphB、Fms、Fyn、 KDR、LCK、b-Raf、c-Raf、SAPK2、Src、Tie2和TrkB激酶。

疟疾是由疟原虫属的原生动物寄生虫引起的。四种疟原虫可以以其不 同的形式产生疾病：恶性疟原虫；间日疟原虫；卵形疟原虫；和三日疟原 虫。恶性疟原虫是分布最广并且最危险的，如果不治疗的话就可导致致死 性的脑型疟疾。蛋白酪氨酸激酶活性分布于恶性疟原虫寄生虫成熟的所有 阶段中，并且本发明的激酶抑制剂可用于治疗疟原虫相关疾病。本发明的 酪氨酸激酶抑制剂、特别是c-kit抑制剂可以是用于通过抑制恶性疟原虫的 生长来治疗疟原虫相关疾病的途径。下文的体外试验用作确定本发明化合 物对抗各种疟原虫株系的活性的方法。

肥大细胞(MC)是衍生自特定亚组的造血干细胞的组织成分，其产生大 量的介质，其中大多数介质具有很强的促炎症活性。由于MC分布于几乎 所有的身体部位，所以由活化成分引起的介质分泌过多可导致多个器官衰 竭。因此，肥大细胞是涉及很多疾病的重要参与者。本发明涉及用于治疗 肥大细胞相关疾病的方法，其包括向需要该治疗的人施用能够减少肥大细 胞的化合物或抑制肥大细胞脱颗粒的化合物。这些化合物可选自c-kit抑制 剂，更特别是无毒、有选择性的和有效的c-kit抑制剂。优选地，所述抑制 剂不能促进在IL-3存在下培养的IL-3依赖性细胞的死亡。

肥大细胞相关疾病包括但不限于：痤疮和痤疮丙酸杆菌(痤疮涵盖皮肤 的所有慢性炎症形式，包括由痤疮丙酸杆菌诱导的那些；结缔组织的极其 少见且致残的遗传性病症(称为进行性骨化性纤维发育不良(FOP))；由于接 触化学或生物武器(如炭疽、硫芥子气等)而诱导的炎症和组织破坏的有害 作用；囊性纤维化(肺、消化系统和生殖系统遗传性疾病)；肾病，如急性 肾炎综合征、肾小球肾炎、肾淀粉样变性、肾间质性纤维变性(导致各种肾 病变的终末期肾病的最后共同通路)；包括肌炎和肌营养不良症的炎症性肌 肉病症；HIV(例如，减少HIV感染的肥大细胞可以是用于治疗HIV感染 和相关疾病的新途径)；治疗II型糖尿病、肥胖症和相关病症(肥大细胞调 节对动脉粥样硬化的发展有贡献的多种过程，包括高血糖症、高胆固醇血 症、高血压、内皮功能障碍、胰岛素抵抗和血管重构；脑缺血；肥大细胞 增生症(一组不同种类的病症，特征为肥大细胞在不同组织中、主要是皮肤 和骨髓以及脾、肝、淋巴结和胃肠道中的异常蓄积)；药物依赖和戒断症状 (特别是药物成瘾、药物滥用、药物习惯性、药物依赖、戒断综合征和过量)； CNS病症(特别是抑郁、精神分裂症、焦虑症、偏头痛、记忆丧失、疼痛和 神经变性疾病)；促进毛发生长(包括预防和减少脱发)；细菌感染(特别是由 表达FimH的细菌引起的感染)；间质性膀胱炎(膀胱壁的慢性炎症，其导 致尤其是在膀胱内层中细胞之间的空隙处的组织损伤)；炎性肠病(通常用 于四种肠疾病，即克罗恩病、溃疡性结肠炎、未确定型结肠炎和传染性结 肠炎)；肿瘤血管生成；自身免疫性疾病(特别是多发性硬化症、溃疡性结 肠炎、克罗恩病、类风湿性关节炎和多关节炎、硬皮症、红斑狼疮、皮肌 炎、天疱疮、多发性肌炎、血管炎和移植物抗宿主病)；炎症疾病如类风湿 性关节炎(RA)；多发性硬化症(MS)；过敏性病症(特别是变应性鼻炎、变 应性鼻窦炎、过敏性综合征、荨麻疹、血管性水肿、异位性皮炎、变应性 接触性皮炎、结节性红斑、多形红斑、表皮坏死性静脉炎和昆虫叮咬性皮 肤炎症、支气管哮喘)；以及骨丢失。

Abelson酪氨酸激酶(即Abl、c-Abl)参与细胞周期的调节、细胞对遗传 毒性应激的应答和通过整联蛋白信号转导来传递有关细胞环境的信息。总 之，看起来Abl蛋白质作为细胞组件起复合的作用，其整合来自各种胞外 和胞内来源的信号并影响有关细胞周期和细胞凋亡的结果。Abelson酪氨 酸激酶包括亚型衍生物，例如具有失控的酪氨酸激酶活性的嵌合融合的(癌 蛋白)BCR-Abl或v-Abl。BCR-Abl在95％的慢性髓细胞性白血病(CML) 和10％的急性淋巴细胞性白血病的发病机制中是关键的。STI-571(格列卫) 是致癌的BCR-Abl酪氨酸激酶的抑制剂，并用于治疗慢性髓细胞性白血病 (CML)。然而，某些在CML原始细胞危象阶段中的患者因BCR-Abl激酶 的突变而对STI-571耐药。迄今为止已经报道了超过22种突变，最常见的 是G250E、E255V、T315I、F317L和M351T。

本发明的一些化合物抑制abl激酶，尤其是v-abl激酶。本发明的一些 化合物还抑制野生型BCR-Abl激酶和BCR-Abl激酶的突变，因此适合于 治疗Bcr-abl-阳性的癌和肿瘤疾病，如白血病(尤其是慢性髓细胞性白血病 和急性淋巴细胞性白血病，尤其是其中发现了细胞凋亡作用机制的)，并且 还表现出对白血病干细胞亚群的作用，以及用于在取出所述细胞(例如取出 骨髓)后体外纯化这些细胞并且一旦从它们中清除癌细胞后再植入这些细 胞(例如再植入纯化的骨髓细胞)的能力。

Ras-Raf-MEK-ERK信号传导途径介导细胞对生长信号的应答。Ras 在约15％的人类癌症中突变成致癌形式。Raf家族属于丝氨酸/苏氨酸蛋白 激酶，它包括三个成员A-Raf、B-Raf和c-Raf(或Raf-1)。有关Raf作为药 物靶点的关注已经集中在Raf作为Ras的下游效应物方面。然而，近期 数据提示B-Raf可能在某些肿瘤的形成中具有突出的作用，而且不需要活 化的Ras等位基因(Nature 417，949-954，2002年7月1日)。特别地，在 较大百分比的恶性黑素瘤中检测到了B-Raf突变。

黑素瘤的现有医学疗法受限于其效能，尤其是对晚期黑素瘤而言。本 发明化合物还抑制涉及b-Raf激酶的细胞过程，从而提供了用于治疗人类 癌症、尤其是黑素瘤的新的治疗机会。

本发明的化合物还抑制涉及c-Raf激酶的细胞过程。c-Raf被ras癌基 因活化，其在多种人类癌症中发生突变。因此，抑制c-Raf的激酶活性可 以提供预防ras介导的肿瘤生长的方法[Campbell，S.L.，Oncogene，17， 1395(1998)]。

PDGF(血小板衍生生长因子)是非常普遍存在的生长因子，它在正常生 长和病理性细胞增殖中起重要作用，例如在癌发生和血管平滑肌细胞疾病、 例如在动脉粥样硬化和血栓形成中可见到它。本发明化合物可抑制PDGF 受体(PDGFR)活性并由此适合于治疗：肿瘤疾病，如神经胶质瘤、肉瘤、 前列腺肿瘤和结肠、乳腺和卵巢的肿瘤；嗜酸性粒细胞增多症；纤维化； 肺动脉高血压；和心血管疾病。

本发明的化合物不仅可用作抑制肿瘤的物质，例如用于小细胞肺癌中， 而且可用作治疗非恶性增殖性病症如动脉粥样硬化、血栓形成、牛皮癣、 硬皮病和纤维化的药物，以及用于保护干细胞、例如对抗化疗药如5-氟尿 嘧啶的血毒素作用和治疗哮喘的药物。本发明化合物尤其可用于治疗对抑 制PDGF受体激酶有响应的疾病。

本发明的化合物在治疗因移植引起的病症中表现出有用的作用，例如 同种异体移植、尤其是组织排斥，诸如尤其是闭塞性细支气管炎(OB)，即 同种异体肺移植物的慢性排斥反应。与不具有OB的患者相反，那些具有 OB的患者通常显示在支气管肺泡灌洗液中PDGF浓度升高。

本发明的化合物对与血管平滑肌细胞迁移和增殖有关的疾病(其中 PDGF和PDGF-R经常也起作用)如再狭窄和动脉粥样硬化也有效。对血管 平滑肌细胞的体内和体外增殖或迁移的这些作用及其后果，可通过施用本 发明的化合物来证实，并且也可以通过研究其对体内机械性损伤后血管内 膜增厚的作用来证实。

神经营养素受体的trk家族(trkA、trkB、rkC)促进神经元和非神经元 组织的存活、生长和分化。TrkB蛋白在小肠和结肠的神经内分泌类细胞、 胰腺α细胞、淋巴结和脾脏的单核细胞和巨噬细胞、表皮的颗粒层中表达 (Shibayama和Koizumi，1996)。TrkB蛋白的表达与Wilms肿瘤和神经 母细胞瘤的不利进展有关。此外，TkrB在癌性前列腺细胞中表达，但不在 正常细胞中表达。trk受体的信号传导途径下游包括通过Shc、活化的Ras、 ERK-1和ERK-2基因的MAPK活化级联和PLC-gammal传导途径 (Sugimoto等人，2001)。

激酶c-Src传递许多受体的致癌信号。例如，EGFR或HER2/neu在 肿瘤中的过表达导致c-src的组成型活化，这是恶性细胞而非正常细胞的特 征。另一方面，小鼠在表达c-src中的缺陷表现出骨硬化性表型，表明c-src 在破骨细胞功能中的关键作用和可能参与了相关病症。

Tec家族激酶Bmx是一种非受体蛋白酪氨酸激酶，其控制乳腺上皮癌 细胞的增殖。

成纤维细胞生长因子受体3显示出发挥对骨生长的负调节作用和对软 骨细胞增殖的抑制。致死性发育不全是由成纤维细胞生长因子受体3中的 不同突变导致，并且一种突变TDII FGFR3具有组成型的酪氨酸激酶活性， 它活化转录因子Stat1，导致细胞周期抑制物的表达、生长停止和异常的骨 发育(Su等人，Nature，1997，386，288-292)。FGFR3通常还在多发性骨 髓瘤型癌症中表达。FGFR3活性的抑制剂用于治疗T-细胞介导的炎性或 自身免疫性疾病，包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、胶原蛋白II关节炎、 多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、牛皮癣、青少年型糖尿病、干 燥综合征、甲状腺疾病、结节病、自身免疫性眼色素层炎、炎性肠病(克罗 恩病和溃疡性结肠炎)、乳糜泻和重症肌无力。

血清和糖皮质激素-调节的激酶(SGK)的活性与紊乱的离子通道活性 相关，特别是与钠和/或钾通道的活性相关，并且本发明的化合物可以用于 治疗高血压。

Lin等人(1997)J.Clin.Invest.100，8：2072-2078和P.Lin(1998)PNAS 95，8829-8834已显示在腺病毒感染过程中或在乳腺肿瘤和黑素瘤异种移植 物模型中注射Tie-2(Tek)的胞外结构域的过程中抑制肿瘤生长和血管化以 及减少肺转移。Tie2抑制剂可以用于不适当地出现新生血管形成的情况(即 糖尿病视网膜病变、慢性炎症、牛皮癣、卡波西肉瘤、因黄斑变性导致的 慢性新生血管形成、类风湿性关节炎、婴儿血管瘤和癌症)。

Lck在T-细胞信号传导中起作用。缺乏Lck基因的小鼠发育胸腺细胞 的能力差。Lck作为T-细胞信号传导的正向活化剂的功能表明，Lck抑制 剂可以用于治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎。

JNK与其他MAPK一起参与在介导对癌症、凝血酶-诱导的血小板聚 集、免疫缺陷病、自身免疫性疾病、细胞死亡、变态反应、骨质疏松症和 心脏病的细胞应答中起作用。与JNK途径的活化相关的治疗靶标包括慢性 髓细胞性白血病(CML)、类风湿性关节炎、哮喘、骨关节炎、局部缺血、 癌症和神经变性疾病。由于与肝病或肝缺血发作相关的JNK活化的重要 性，本发明的化合物还可以用于治疗各种肝病。还报导了JNK在心血管病 如心肌梗死或充血性心力衰竭中的作用，因为已显示JNK介导了对不同形 式心脏负荷的肥大性响应。已经证实JNK级联还在T-细胞活化中起作用， 包括激活IL-2启动子。因此，JNK抑制剂可以在改变病理性免疫应答中 具有治疗价值。JNK活化在各种癌症中的作用也已确立，表明JNK抑制 剂在癌症中的潜在用途。例如，组成型活化的JNK与HTLV-1介导的肿 瘤发生相关[Oncogene 13：135-42(1996)]。JNK可以在卡波西肉瘤(KS)中起 作用。牵涉KS增殖的其他细胞因子如血管内皮生长因子(VEGF)、IL-6和 TNFα的其他增殖作用也可由JNK介导。此外，在p210 BCR-ABL转化 细胞中的c-jun基因的调控与JNK活性相关，从而表明JNK抑制剂在治 疗慢性髓细胞性白血病(CML)中的作用[Blood 92：2450-60(1998)]。

认为某些异常增殖性病症与raf表达相关，因此认为其对抑制raf表达 有响应。Raf蛋白的异常高水平的表达还牵涉转化和异常的细胞增殖。还 认为这些异常增殖性病症易对raf表达的抑制作出响应。例如，认为c-raf 蛋白的表达在异常的细胞增殖中起作用，因为据报道在所有肺癌细胞系中 有60％表达异常高水平的c-raf mRNA和蛋白质。异常增殖性病症的其他 实例是过度增殖性病症，如癌症、肿瘤、增生、肺纤维化、血管发生、牛 皮癣、动脉粥样硬化和血管平滑肌细胞增殖，例如狭窄或血管成形术后的 再狭窄。其中raf为组成部分的细胞信号传导途径也涉及炎性病症，其特 征在于T-细胞增殖(T-细胞活化和生长)，例如组织移植物排斥、内毒素性 休克和肾小球肾炎。

应激活化蛋白激酶(SAPK)是表示信号转导途径(其导致c-jun转录因 子活化和c-jun所调节的基因表达)中倒数第二步的蛋白激酶家族。特别地， c-jun涉及编码参与因遗传毒性危害而被损伤的DNA修复的蛋白质的基因 转录。因此，抑制细胞中SAPK活性的药物阻止DNA修复，并且使细胞 对诱导DNA损伤或抑制DNA合成以及诱导细胞凋亡或抑制细胞增殖的药 物敏感。

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是保守的信号转导途径中的成员，所 述途径可响应于各种胞外信号而激活转录因子、翻译因子和其它靶分子。 MAPK在具有序列Thr-X-Tyr的双磷酸化模体上被促分裂原活化蛋白激酶 激酶(MKK)磷酸化而活化。在高等真核生物中，MAPK信号传导的生理作 用与细胞事件如增殖、癌发生、发育和分化相关。因此，通过这些途径(特 别是通过MKK4和MKK6)来调节信号转导的能力可导致开发与MAPK 信号传导相关的人类疾病，例如炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症的治疗 方法和预防疗法。

人核糖体S6蛋白激酶家族由至少8个成员组成(RSK1、RSK2、RSK3、 RSK4、MSK1、MSK2、p70S6K和p70S6Kb)。核糖体蛋白S6蛋白激酶 具有重要的多效性功能，其中在蛋白质生物合成过程中调节mRNA的翻译 是一种关键作用(Eur.J.Biochem 2000年11月；267(21)：6321-30，Exp Cell Res.11月25日，1999；253(1)：100-9，Mol Cell Endocrinol.5月25日，1999； 151(1-2)：65-77)。p70S6对S6核糖体蛋白的磷酸化还涉及细胞运动性的调 控(Immunol.Cell Biol.2000年8月；78(4)：447-51)和细胞生长的调控(Prog. Nucleic Acid Res.Mol.Biol.，2000；65：101-27)，因此它可能在肿瘤转移、 免疫应答和组织修复以及其它疾病状况中是重要的。

SAPK′s(也称作“jun N-末端激酶”或“JNK′s”)表示信号转导途径(其导 致c-jun转录因子活化和c-jun所调节的基因表达)中倒数第二步的蛋白激 酶家族。特别地，c-jun涉及编码参与因遗传毒性危害而被损伤的DNA修 复的蛋白质的基因转录。抑制细胞中SAPK活性的药物阻止DNA修复， 并且使细胞对诱导DNA损伤或抑制DNA合成以及诱导细胞凋亡或抑制细 胞增殖的药物敏感。

BTK在自身免疫性和/或炎性疾病中起作用，诸如系统性红斑狼疮 (SLE)、类风湿性关节炎、多发性血管炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、 重症肌无力和哮喘。由于BTK在B-细胞活化中的作用，所以BTK抑制剂 可用作B-细胞介导的致病活性如自身抗体产生的抑制剂，并且可用于治疗 B-细胞淋巴瘤和白血病。

CHK2为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的检查点激酶家族中的成员，参与用 于监视DNA损伤、例如由于环境诱变剂和内源性活性氧所导致的损伤的 机制。因此，它用作肿瘤抑制物和癌症治疗的靶标。

CSK影响癌细胞、特别是结肠癌的转移潜力。

Fes是涉及多种细胞因子信号转导途径和骨髓细胞分化的非-受体蛋白 酪氨酸激酶。Fes也是粒细胞分化机制中的关键组分。

Flt3受体酪氨酸激酶活性涉及白血病和骨髓增生异常综合征.在约 25％的AML中，白血病细胞表达在细胞表面上组成型活化形式的自磷酸 化(p)FLT3酪氨酸激酶。p-FLT3的活性提供了白血病细胞的生长和存活优 势。患有急性白血病的患者，其白血病细胞表达p-FLT3激酶活性，具有 较差的总体临床结果。抑制p-FLT3激酶活性可诱导白血病细胞的凋亡(程 序性细胞死亡)。

IKKα和IKKβ(1和2)的抑制剂是下述疾病的治疗剂，所述疾病包括 类风湿性关节炎、移植排斥、炎性肠病、骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺 病、动脉粥样硬化、牛皮癣、多发性硬化症、中风、系统性红斑狼疮、阿 尔茨海默病、脑缺血、外伤性脑损伤、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、蛛 网膜下腔出血或其他与脑和中枢神经系统中炎性介质的过度产生有关的疾 病或病症。

Met与大部分类型的主要人类癌症相关，并且其表达通常与预后不良 和转移有关。Met抑制剂是下述疾病的治疗剂，所述疾病包括：癌症，如 肺癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或 眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、乳腺 癌、妇科肿瘤(例如子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌或 外阴癌)、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌(例如甲状腺、甲状 旁腺或肾上腺的癌症)、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或 急性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌(例 如肾细胞癌、肾盂癌)、儿科恶性肿瘤、中枢神经系统肿瘤(例如原发性CNS 淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤)；血液癌，如急性髓细胞 性白血病、慢性髓细胞性白血病等；巴雷特食管(恶化前综合征)瘤形成皮 肤病、牛皮癣、蕈样真菌病和良性前列腺肥大；糖尿病相关疾病，如糖尿 病视网膜病变、视网膜缺血和视网膜新血管形成；肝硬化；心血管病，如 动脉粥样硬化；免疫性疾病，如自身免疫性疾病和肾病。优选地，所述疾 病为癌症，如急性髓细胞性白血病和结肠直肠癌。

Nima-相关激酶2(Nek2)是受细胞周期调控的蛋白激酶，它定位于中心 体，在有丝分裂开始时具有最大活性。功能研究已经揭示Nek2参与调控 中心体分离和纺锤体形成。Nek2蛋白在来源于人类肿瘤(包括颈部、卵巢、 前列腺、特别是乳腺的那些肿瘤)的细胞系中升高2至5倍。

p70S6K-介导的疾病或病症包括但不限于增殖性病症，如癌症和结节 性硬化症。

根据上述内容，本发明进一步提供了用于在需要这类治疗的个体中预 防或治疗任何上述疾病或病症的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有 效量(参见下文的“给药和药物组合物”)的式I化合物或其药学上可接受的 盐。就任何上述用途而言，所需的剂量根据施用方式、待治疗的具体病症 和所需效果而变化。

给药和药物组合物

一般而言，本发明的化合物将通过本领域中已知的任何一种常用和可 接受的方式，以治疗有效量单独地或与一种或多种治疗剂联合施用。治疗 有效量可以根据疾病的严重性、个体的年龄和相对健康状况、所用化合物 的功效和其它因素而广泛改变.一般而言，推荐以约0.03-2.5mg/kg体重的 日剂量进行全身施用可获得令人满意的效果。在大型哺乳动物例如人中， 所述的每日剂量为约0.5mg到约100mg，可方便地例如以最多每天四次 的分次剂量或以缓释形式施用。用于口服施用的合适的单位剂型包含约 1-50mg活性成分。

本发明的化合物可以作为药物组合物通过任何常规途径施用，特别是 通过胃肠内，例如口服，例如以片剂或胶囊形式施用；或通过胃肠外，例 如以可注射溶液或混悬液的形式施用；通过局部，例如以洗剂、凝胶、软 膏剂或霜剂的形式施用；或经鼻吸入，或以栓剂形式施用。可以以常规方 式通过混合、制粒或包衣方法来制备包含游离形式或药学上可接受的盐形 式的本发明化合物与至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合 物。例如，口服组合物可以为片剂或明胶胶囊，其包含所述活性成分以及 a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘 氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁或钙盐和/或聚乙 二醇；就片剂而言，还有c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄 蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要，还 有d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或泡腾混合物；和/或e)吸 收剂、着色剂、调味剂和增甜剂。可注射的组合物可以为水性等渗溶液或 混悬液，并且可以由脂肪乳液或混悬液制备栓剂。所述组合物可以是灭菌 的和/或包含佐剂，如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶解促进剂、调 节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以包含其它治疗上有价值的物 质。用于透皮应用的合适的制剂包含有效量的本发明化合物与载体。载体 可以包括有助于通过宿主皮肤的可吸收的药理学可接受的溶剂。例如，透 皮装置为绷带形式，其包含衬背部件(backing member)、含有所述化合物 和任选的载体的贮器、在延长的时段内以受控和预定的速率将所述化合物 递送至宿主皮肤的任选的速率控制屏障、以及使所述装置固定至皮肤的工 具。还可以使用基质型透皮制剂。用于局部施用、例如施用至皮肤和眼的 合适的制剂优选为本领域众所周知的水溶液、软膏剂、霜剂或凝胶。这类 制剂可包含增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。

本发明的化合物可以以治疗有效量与一种或多种治疗剂组合施用(药 物组合)。例如，可与其他哮喘疗法如类固醇和白三烯拮抗剂产生协同效应。

例如，可与其他免疫调节或抗炎物质一起产生协同效应，例如当与环 孢菌素、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制的类似物组合使用时，所述免 疫抑制的类似物例如环孢菌素A(CsA)、环孢菌素G、FK-506、雷帕霉素 或相当的化合物、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、布喹那、 来氟米特、咪唑立宾、麦考酚酸、麦考酚酸吗乙酯、15-脱氧精胍菌素；免 疫抑制的抗体，尤其是白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、 CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或其配体的抗体，或其他 免疫调节化合物，如CTLA41g。如果将本发明的化合物与其他疗法结合施 用，那么共同施用的化合物的剂量当然会根据所用共同药物的类型、所用 的特定药物、所治疗的病症等而改变。

本发明还提供了药物组合，例如药盒，其包含：a)第一活性剂，其为 本文所公开的游离形式或药学上可接受的盐形式的本发明化合物；和b)至 少一种共同药物。所述药盒可包含针对其施用的说明书。

本文所用的术语“共同施用”或“组合施用”等旨在包括将所选的治疗药 物施用于单个患者，并且旨在包括其中不必通过相同的给药途径或同时施 用的药物的治疗方案。

本文所用的术语“药物组合”是指由混合或组合一种以上的活性成分而 得到的并且包括所述活性成分的固定和非固定组合的产品。术语“固定组 合”是指将所述活性成分、例如式I的化合物和共同药物以单一实体或剂量 的形式同时施用于患者。术语“非-固定组合”是指将所述活性成分、例如式 I的化合物和共同药物以分开的实体，同时、共同或先后施用于患者，并 且没有特定的时间限制，其中这类给药在所述患者体内提供了治疗有效水 平的两种化合物。后者还应用于鸡尾酒疗法，例如施用3种或3种以上的 活性成分。

制备本发明化合物的方法

本发明还包括制备本发明化合物的方法。在所述反应中，当终产物需 要它们时，可能有必要保护反应性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、巯 基或羧基，以避免它们参与不需要的反应。可按照标准实践使用常规的保 护基团，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts的“有机化学的保护基”， John Wiley and Sons，1991。

可按照下列反应方案I中的过程制备式I化合物，其中Y是键且X是 NH，

反应方案I

其中R1、R2、R3和R4如发明概述中所定义。可通过将式2化合物与 式3的化合物在适合的溶剂(例如DMF等)、适合的偶联剂(例如HATU等) 和适合的碱(例如DIEA等)的存在下反应来制备式I化合物。该反应在约 0℃至约60℃的温度范围内进行并且可能耗费最多24小时来完成。

可按照下列反应方案II中的过程制备式I化合物，其中X是键且Y 是NH，

反应方案II

其中R1、R2、R3和R4如发明概述中所定义。可通过将式4化合物与 式5的化合物在适合的溶剂(例如DMF等)、适合的偶联剂(例如HATU等) 和适合的碱(例如DIEA等)的存在下反应来制备式I化合物。该反应在约 0℃至约60℃的温度范围内进行并且可能耗费最多24小时来完成。

可以在下文实施例中找到合成式I的化合物的详细实施例。

制备本发明化合物的另外方法

可以通过将本发明化合物的游离碱形式与药学上可接受的无机酸或有 机酸反应而将本发明化合物制备成药学上可接受的酸加成盐。或者，可以 通过将该化合物的游离酸形式与药学上可接受的无机碱或有机碱反应而制 备本发明化合物的药学上可接受的碱加成盐。或者，可以使用原料或中间 体的盐来制备本发明化合物的盐形式。

可以由相应的碱加成盐或酸加成盐分别制备本发明化合物的游离酸或 游离碱形式。例如，可以通过用合适的碱(例如氢氧化铵溶液、氢氧化钠等) 处理而将酸加成盐形式的本发明化合物转化成相应的游离碱。可以通过用 合适的酸(例如盐酸等)处理将碱加成盐形式的本发明化合物转化成相应的 游离酸。

可以在0℃至80℃下在合适的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二噁烷 水溶液等)中用还原剂(例如硫、二氧化硫、三苯膦、硼氢化锂、硼氢化钠、 三氯化磷、三溴化磷等)处理，从本发明化合物的N-氧化物制备未氧化形 式的本发明化合物。

可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备本发明化合物的前体药 物衍生物(例如，关于更多的细节参见Saulnier等人，(1994)，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，第4卷，第1985页)。例如，可以使非衍生 的本发明化合物与合适的氨基甲酰化试剂(例如1，1-酰氧基烷基羰基氯 (carbanochloridate)、对-硝基苯基碳酸酯等)反应而制备合适的前体药物。

可以通过本领域技术人员已知的方式制备本发明化合物的受保护的衍 生物。适用于生成保护基团及其除去的技术的详细描述可在T.W.Greene， “有机化学的保护基”，第3版，John Wiley and Sons，Inc.，1999中找到。

本发明的化合物可以在本发明的方法过程中方便地制成或形成溶剂化 物(例如水合物)。可以通过使用有机溶剂(如二噁英、四氢呋喃或甲醇)从水 /有机溶剂混合物中重结晶而方便地制备本发明化合物的水合物。

可通过下列步骤将本发明化合物制备成其单一的立体异构体：使所述 化合物的外消旋混合物与旋光拆分试剂反应而生成一对非对映异构体化合 物，分离非对映异构体并回收光学纯的对映体。尽管可以使用本发明化合 物的共价非对映异构体衍生物来进行对映体的拆分，但是优选可离解的复 合物(例如结晶的非对映异构体盐)。非对映异构体具有不同的物理特性(例 如熔点、沸点、溶解度、反应性等)，可利用这些不同性质而容易地分离。 可以通过色谱法或优选通过基于溶解度差异的分离/拆分技术来分离非对 映异构体。然后通过不会导致外消旋化的任何实用方式回收光学纯的对映 体和拆分试剂。适用于从化合物的外消旋混合物中拆分其立体异构体的技 术的更详细描述可以在Jean Jacques，Andre Collet，Samuel H.Wilen，“对 映体、外消旋物与拆分”，John Wiley And Sons，Inc.，1981中找到。

概括地说，可以通过以下方法制备式I的化合物，其包括：

(a)反应方案I和II的方法；和

(b)任选地将本发明的化合物转化成药学上可接受的盐；

(c)任选地将本发明化合物的盐形式转化成非-盐形式；

(d)任选地将本发明化合物的未氧化形式转化成药学上可接受的N-氧 化物；

(e)任选地将本发明化合物的N-氧化物形式转化成其未氧化形式；

(f)任选地从异构体混合物中拆分本发明化合物的单一异构体；

(g)任选地将本发明的非-衍生的化合物转化成药学上可接受的前体药 物衍生物；和

(h)任选地将本发明化合物的前体药物衍生物转化成其非-衍生形式。

对于原料的制备未进行特别的描述，这些化合物是已知的或者可以按 照类似于本领域公知的方法或下文实施例中公开的方法来制备。

本领域技术人员应当理解，上述转化仅仅是制备本发明化合物的方法 的代表，并且可以类似地使用其它众所周知的方法。

实施例

通过诠释本发明的式I化合物的制备的以下实施例来进一步举例说明 本发明，但并不限制本发明的范围。

中间体的制备

6-甲基-N1-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)苯-1，3-二胺5的合成

向在正丁醇(29mL)中的2-氨基-4-硝基甲苯1(0.033mol)中加入2.1g 65％硝酸水溶液以形成硝酸盐，然后与在水(2mL)中的氰胺(0.047mmol) 缩合。将所得混合物加热回流25小时。冷却至0℃后，通过过滤收集沉淀 并用乙醇/乙醚(1∶1v/v，30mL)洗涤以提供2-甲基-5-硝基苯基胍硝酸盐2。

向在正丁醇(15mL)中的2-甲基-5-硝基苯基胍2(0.0074mol)加入3 (0.0074mol)和氢氧化钠小片(0.008mol)。将所得混合物加热回流12小时。 冷却至0℃后，通过过滤收集沉淀并用异丙醇(6mL)和甲醇(3mL)洗涤以提 供4。1HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ9.31(s，1H)，9.24(s，1H)，8.78(m，1H)， 8.70(m，1H)，8.61(m，1H)，8.47(m，1H)，7.88(m，1H)，7.55(m，3H)，2.39(s， 3H)。

反应物3通过下列操作获得。将3-乙酰吡啶(2.47mol)和N，N-二甲基 甲酰胺二甲基缩醛(240mL)的混合物加热回流16小时。真空除去溶剂并将 己烷(100mL)加至残渣中以使固体结晶。该固体从二氯甲烷-己烷中重结晶 以得到3-二甲氨基-1-(3-吡啶基)-2-丙烯-1-酮。1H NMR(400MHz，d-氯仿)δ 9.08(d，J＝2.4Hz，1H)，8.66(m，1H)，8.20(m，1H)，7.87(m，1H)，7.37(m， 1H)，5.68(d，J＝16.4Hz，1H)，3.18(s，3H)，2.97(s，3H)。

向反应器装入浓盐酸(17mL)，随后加入氯化亚锡脱水物(0.03mol)。 将混合物搅拌10分钟，然后冷却至0-5℃。历经3-4分钟缓慢地将化合物 4(5.6mmol)在乙酸乙酯(3mL)中的溶液加入，同时将温度保持在0-5℃。 使反应混合物回到室温并搅拌1.5小时。向此中加入水(50mL)，随后缓慢 加入50％氢氧化钠溶液(40mL)。所得混合物用氯仿萃取(2×25mL)。有 机层用水充分洗涤并蒸发。将残渣溶解于乙酸乙酯(2mL)，冷却至0-10℃ 并保持此温度1小时。过滤收集所得沉淀并用乙酸乙酯(1mL)洗涤以提供 1.0g的5。1H NMR(400MHz，d-氯仿)δ9.26(d，J＝2.0Hz，1H)，8.71(m， 1H)，8.48(d，J＝6.8Hz，1H)，8.34(m，1H)，7.59(d，J＝4.0Hz，1H)，7.41(m， 1H)，7.12(m，1H)，7.04(m，1H)，6.42(m，1H)，3.50(bs，2H)，2.24(s，3H)。

3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯甲酸9的合成

向3-氨基-4-甲基-苯甲酸甲酯(0.6mol)在nBuOH(50mL)中的溶液中 加入70％硝酸(2.7mL)以形成硝酸盐，然后与氰胺水溶液(50％重量，7 mL，0.09mol)缩合。将所得混合物加热回流16小时，冷却至室温，然后 加入乙醚(100mL)。在0℃冷却30分钟后，过滤，用甲醇/乙醚(1∶1v/v， 120mL)洗涤，提供3-胍基-4-甲基-苯甲酸甲酯硝酸盐7。

向在nBuOH(40mL)中的3-胍基-4-甲基-苯甲酸甲酯硝酸盐7(0.02mol) 加入3(0.02mol)和氢氧化钠薄片(0.02mol)。将所得混合物加热回流12小 时以收获8。将1N NaOH水溶液(20mL)加入8的nBuOH溶液中并加热 回流30分钟。冷却至室温后，在剧烈搅拌下将1N HCl水溶液(20mL)缓 慢加至混合物。通过过滤收集产物，用水洗涤以提供9。1H NMR(400MHz， d6-DMSO)δ9.28(d，J＝1.8Hz，1H)，9.08(s，1H)，8.7(dd，J＝4.7，1.5Hz， 1H)，8.55(d，J＝5.1Hz，1H)，8.46(dt，J＝8.0，1.8Hz，1H)，8.31(s，1H)，7.65 (dd，J＝7.8，1.5Hz，1H)，7.54(dd，J＝7.7，4.7Hz，1H)，7.49(d，J＝5.2Hz， 1H)，7.37(d，J＝7.9Hz，1H)，3.08(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+：307.2。

使用与制备3-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯甲酸43 相同的方案，制备在吡啶环上有取代基的类型9的化合物。

N1-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基)-6-甲基苯-1，3-二胺14的合成

将3-溴-5-甲氧基吡啶(3g，16mmol)、三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡烷(7 mL，21mmol)和Pd(PPh3)4(0.92g，0.8mmol)在无水甲苯(15mL)中的溶 液在150℃微波加热30分钟。冷却后，用MeOH将混合物滤过硅藻土并 浓缩以得到残渣，其通过硅胶色谱法(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1v/v)纯化以获得 1-(5-甲氧基吡啶-3-基)乙酮11(1.6g，66％)。MS(m/z)(M+1)+：152.1，

使用与3的合成类似的操作制备(E)-3-(二甲氨基)-1-(5-甲氧基吡啶-3- 基)丙-2-烯-1-酮12。使用与4的合成类似的操作制备N-(2-甲基-5-硝基苯 基)-4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-胺13。

向N-(2-甲基-5-硝基苯基)-4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-胺13(5.0 mmol)在MeOH(20mL)中的溶液加入Pd(5％碳载，50％湿式，10％重量)。 在氢气下将悬浮液搅拌2小时。将反应滤过硅藻土并用MeOH洗涤硅藻土 饼。在减压下除去溶剂以提供14，其不经进一步纯化就使用。MS(m/z) (M+1)+：308.2。

苯胺14可用于制备用苯胺5制备的相同种类的化合物。

N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-2-氯吡啶-4-甲酰胺 A-1的合成

室温下将6-甲基-N1-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)苯-1，3-二胺5(5mmol)、 2-氯-异烟酸(6mmol)和HATU(6mmol)溶解于无水DMF(5mL)。将二异丙 基乙胺(6mmol)逐滴加至溶液中。30分钟后，将混合物缓慢加至饱和 NaHCO3水溶液中。过滤固体，用水洗涤并在真空下干燥过夜以提供产物 A1，为浅黄色固体。1H NMR(400MHz，d4-甲醇)δ9.3(s，1H)，8.65(m，1H)， 8.6(m，1H)，8.55(d，J＝5.1Hz，1H)，8.48(d，J＝5.2Hz，1H)，8.28(s，1H)， 7.95(s，1H)，7.84(d，J＝5.1Hz，1H)，7.56(m，1H)，7.4(dd，J＝8.2，2.1Hz， 1H)，7.37(d，J＝5.2Hz，1H)，7.28(d，J＝8.2Hz，1H)，2.33(s，3H)。MS(m/z) (M+1)+：417.1。

可使用类似的操作来制备中间体6-氯-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶 -2-基氨基)苯基)烟酰胺15、5-甲酰基-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基 氨基)苯基)呋喃-2-甲酰胺16和5-溴-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨 基)苯基)烟酰胺17。

N-(3-(4-氯嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-1H-吲唑-3-甲酰胺22的合成

在氮气下向2-氯-4-甲氧基嘧啶18(10.0mmol)、2-甲基-5-硝基苯胺(15.0 mmol)、Pd(OAc)2(1mmol)、DPE-Phos(1.5mmol)和NaO-tBu(20.0mmol) 的混合物加入1，4-二噁烷(15mL)。在微波条件下将所得混合物在150℃加 热20分钟。将反应混合物滤过硅藻土层并在乙酸乙酯(100ml)中稀释滤液， 用水洗涤，经NaSO4干燥并浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯∶己 烷＝1∶4v/v)纯化以提供4-甲氧基-N-(2-甲基-5-硝基苯基)嘧啶-2-胺19，为浅 黄色固体。MS(m/z)(M+1)+：261.1。

向4-甲氧基-N-(2-甲基-5-硝基苯基)嘧啶-2-胺19(5.0mmol)在 MeOH(20mL)中的溶液加入Pd(5％碳载，50％湿式，10％重量)。将悬浮 液在氢气下搅拌2小时。将反应滤过硅藻土并用MeOH洗涤硅藻土饼。在 减压下除去溶剂以提供粗产物20，其通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯∶己烷 ＝1∶2v/v)进一步纯化。MS(m/z)(M+1)+：231.1。

在室温将N1-(4-甲氧基嘧啶-2-基)-6-甲基苯-1，3-二胺20(0.65mmol)、 1H-吲唑-3-甲酸(0.68mmol)和HATU(0.79mmol)溶解于无水DMF(4.0mL) 中。将二异丙基乙胺(4mmol)加至溶液中。1小时后，用水(100mL)稀释混 合物。过滤沉淀，用水洗涤并在真空下干燥以提供21，为浅黄色固体。 MS(m/z)(M+1)+：375.1。

在微波条件下将N-(3-(4-甲氧基嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-1H-吲唑 -3-甲酰胺21(0.53mmoL)、TMSCl(2M于THF中，2.12mmol)和NaI(2.12 mmol)在ACN(2mL)中的混合物于140℃加热20分钟。向反应混合物加入 2M Na2CO3水溶液(50mL)并用乙酸乙酯(100mL×2)萃取。有机层用水洗 涤，经Na2SO4干燥并浓缩以提供残渣。向此残渣中加入POCl3(5ml)并将 所得混合物回流15分钟。真空除去过量POCl3。将残渣溶解于乙酸乙酯(100 mL)中，用Na2CO3溶液洗涤，经Na2SO4干燥并过滤。真空蒸发溶剂以提 供粗产物22，其通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯∶己烷＝1∶2v/v)纯化。1H NMR (400MHz，d-氯仿)δ8.9(s，1H)，8.43(d，J＝8.2Hz，1H)，8.22-8.29(m，3H)， 7.43-7.58(m，3H)，7.33(t，J＝7.2Hz，1H)，7.21(d，J＝8.4Hz，1H)，2.31(s， 3H)。MS(m/z)(M+1)+：379.1。

类似于22的化合物可通过将化合物20与不同的羧酸按照制备25的方 法进行偶联而制备。

N-(3-(4-氯嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-1-乙基-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酰 胺25的合成

在室温将N1-(4-甲氧基嘧啶-2-基)-6-甲基苯-1，3-二胺23(0.65mmol)、 1-乙基-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酸(0.68mmol)和HATU(0.79mmol)溶解于无 水DMF(4.0mL)。将二异丙基乙胺(4mmol)加至溶液中。1小时后，用水 (100mL)稀释混合物。过滤沉淀，用水洗涤并在真空下干燥以提供24，为 浅黄色固体。1H NMR(400MHz，d-氯仿)δ8.49(s，1H)，8.12(d，J＝5.8Hz， 1H)，7.69(s，1H)，7.14-7.20(m，2H)，6.94(bs，1H)，6.38(s，1H)，6.21(d，J＝ 5.8Hz，1H)，4.50-4.56(m，2H)，3.98(s，3H)，2.31(s，3H)，2.29(s，3H)，1.43(t， J＝7.2Hz，3H)。MS(m/z)(M+1)+：367.2

在微波条件下将N-(3-(4-甲氧基嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-1-乙基-3- 甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺24(0.53mmol)、TMSCl(2M于THF中，2.12mmol) 和NaI(2.12mmol)在ACN(2mL)中的混合物于140℃加热20分钟。向反应 混合物加入2M Na2CO3水溶液(50mL)并用乙酸乙酯(100mL×2)萃取。有 机层用水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩以提供残渣。向此残渣中加入 POCl3(5ml)并将所得混合物回流15分钟。真空除去过量POCl3。将残渣 溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用Na2CO3溶液洗涤，经Na2SO4干燥并过滤。 真空蒸发溶剂以提供粗产物25，其通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯∶己烷＝1∶2 v/v)进一步纯化。MS(m/z)(M+1)+：371.1。

1-(4-氰基苯基)-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酸28的合成

于0℃向4-肼基苄腈盐酸盐26(2.06mmol)在二氯甲烷中的溶液加入碳 酸钾(1.59mmol)，之后加入2，4-二氧代戊酸乙酯(3.16mmol)。将反应混合 物于室温搅拌过夜。用二氯甲烷稀释反应混合物，用水和盐水洗涤，经硫 酸钠干燥并除去溶剂以提供粗产物27，其不经进一步纯化而使用。

1-(4-氰基苯基)-3-甲基-1H-吡唑-5-甲酸乙酯27溶于THF/MeOH/H2O (3∶2∶1v/v)的溶液中并加入6N氢氧化锂(3当量)。将混合物搅拌过夜。真 空除去溶剂并在H2O中稀释残渣，用二氯甲烷萃取3次，并将水层的pH 调节至pH 5。过滤沉淀并干燥以获得1-(4-氰基苯基)-3-甲基-1H-吡唑-5-甲 酸28，其用于制备化合物A-71-A-73。MS(m/z)(M+1)+：228.1。

6-甲基-N1-(4-(5-吗啉代吡啶-3-基)嘧啶-2-基)苯-1，3-二胺33的合成

(E)-1-(5-溴吡啶-3-基)-3-(二甲氨基)丙-2-烯-1-酮30使用与合成3类似 的操作从29制备。4-(5-溴吡啶-3-基)-N-(2-甲基-5-硝基苯基)嘧啶-2-胺31 使用与合成4类似的操作从30制备。

在90℃、在氮气下将化合物31(152mg，0.4mmol)、吗啉(1.2mmol)、 K3PO4(168mg，0.8mmol)、CuI(15mg，0.04mmol)和L-脯氨酸(19mg， 0.08mmol)在无水DMSO中加热16小时。用EtOAc稀释混合物并用水洗 涤。真空除去溶剂后，主要含有32的残渣不经进一步纯化而用于下一步。 MS(m/z)(M+1)+：393.2。

将粗的N-(2-甲基-5-硝基苯基)-4-(5-吗啉代吡啶-3-基)嘧啶-2-胺32与在 EtOH(5mL)中的SnCl2(0.78g，4mmol)加热回流2小时。添加1N NaOH 水溶液直至pH＞14。过滤混合物并用二氯甲烷洗涤。浓缩合并的有机相并 通过制备型HPLC纯化以得到33。MS(m/z)(M+1)+：363.2。

类似于33的化合物可通过将化合物31与不同的胺偶联而制备。

N1-(4-(5-(二氟甲氧基)吡啶-3-基)嘧啶-2-基)-6-甲基苯-1，3-二胺36的合 成

将4-(5-甲氧基吡啶-3-基)-N-(2-甲基-5-硝基苯基)嘧啶-2-胺13(3g，10 mmol)悬浮于无水二氯甲烷中。在室温缓慢加入BBr3(3mL，32mmol)。将 混合物搅拌3天并通过缓慢添加到冰水中淬灭。加入固体NaOH直到 pH＞14。用二氯甲烷萃取混合物。将浓HCl水溶液缓慢加至水相中直到 pH＝7。过滤固体并真空干燥以得到34，其不经进一步纯化而使用。

将5-(2-(2-甲基-5-硝基苯氨基)嘧啶-4-基)吡啶-3-醇34(97mg，0.3 mmol)与在无水DMF(1mL)中的NaOH(24mg，0.6mmol)和 ClCF2CO2Na(92mg，0.6mmol)于180℃的微波炉中加热45分钟。将残渣 溶解于乙酸乙酯并用水洗涤。浓缩后，粗混合物通过硅胶柱色谱法(乙酸乙 酯∶己烷＝1∶1v/v)纯化以得到35。MS(m/z)(M+1)+：374.1。

将35(50mg，0.13mmol)与在EtOH(2mL)中的SnCl2(0.39g，2mmol) 加热回流2小时。添加1N NaOH直到pH＞14。过滤混合物并用二氯甲烷 洗涤。浓缩合并的有机相以得到36，其不经进一步纯化而使用。MS(m/z) (M+1)+：344.2。

N1-(4-(异喹啉-4-基)嘧啶-2-基)-6-甲基苯-1，3-二胺40的合成

在微波条件下将19(1g，3.8mmol)、TMSCl(1M于二氯甲烷中，6.7mL， 6.7mmol)和NaI(1.45g，7.7mmol)在ACN(10mL)中的混合物于120℃加 热20分钟。向反应混合物加入2M Na2CO3水溶液(50mL)和二氯甲烷(2X 100mL)。分离有机层，用水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩以提供粗2-(2- 甲基-5-硝基苯氨基)嘧啶-4-醇37的残渣。向此残渣中加入POCl3(5ml)并 将所得混合物回流2小时。真空除去过量POCl3。将残渣溶解于二氯甲烷 (100mL)中，用Na2CO3溶液洗涤，经Na2SO4干燥并过滤。真空蒸发溶剂 以提供粗产物38，其不经进一步纯化而使用。MS(m/z)(M+1)+：265.2、 267.2。

将4-氯-N-(2-甲基-5-硝基苯基)嘧啶-2-胺38(1g，4mmol)、异喹啉-4- 基硼酸(1g，4mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(140mg，0.2mmol)加至装有搅拌棒 的40-mL小瓶中。将小瓶排气并用氮气再填充五次。通过注射器添加1，4- 二噁烷(20mL)和3M Na2CO3水溶液(8mL，24mmol)。密封小瓶并在微波 条件下于150℃加热10分钟。过滤混合物并用二氯甲烷稀释。用1N NaOH (50mL)洗涤后，用1N HCl(20mL)洗涤有机相。将水相贮藏在冰箱中过夜 以得到固体沉淀的产物39，将其过滤并干燥。MS(m/z)(M+1)+：358.2。

4-(异喹啉-4-基)-N-(2-甲基-5-硝基苯基)嘧啶-2-胺39(200mg，0.55 mmol)溶解于MeOH(10mL)中并在5％Pd/C(140mg)的存在下于室温在1 atm的氢气下搅拌3小时。过滤后，除去溶剂以获得N-1-(4-(异喹啉-4-基) 嘧啶-2-基)-6-甲基苯-1，3-二胺40，其不经进一步纯化而使用。MS(m/z) (M+1)+：328.2。

N-(3-(4-(5-溴吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-2-甲基-5-(三氟甲 基)噁唑-4-甲酰胺42的合成

将4-(5-溴吡啶-3-基)-N-(2-甲基-5-硝基苯基)嘧啶-2-胺31(210mg，0.55 mmol)与在EtOH(5mL)中的SnCl2(311mg，1.64mmol)加热回流2小时。 添加1N NaOH水溶液直到pH＞14。过滤混合物并用二氯甲烷洗涤。将合 并的有机相浓缩以得到41，其不经进一步纯化而使用。MS(m/z)(M+1)+： 356.2、358.2。

将粗N-1-(4-(5-溴吡啶-3-基)嘧啶-2-基)-6-甲基苯-1，3-二胺41(0.5mmol) 与在无水DMF(2mL)中的2-甲基-5-(三氟甲基)噁唑-4-甲酸(107mg，0.55 mol)、HATU(251mg，0.66mmol)和DIPEA(0.35mL，2mmol)于室温搅拌 30分钟。混合物通过制备型HPLC纯化以获得N-(3-(4-(5-溴吡啶-3-基)嘧 啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-2-甲基-5-(三氟甲基)噁唑-4-甲酰胺42。MS(m/z) (M+1)+：533.3、535.3。

实施例1

N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰 胺A-6

在室温将6-甲基-N1-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基)苯-1，3-二胺5(0.27 mmol)、5-氯吲哚-2-甲酸(0.30mmol)和HATU(0.32mmol)溶解于无水 DMF(1.5mL)中。将二异丙基乙胺(6mmol)加至溶液中。12小时后，用甲 醇(5mL)稀释混合物。过滤沉淀，用甲醇洗涤并在真空下干燥以提供浅黄 色固体，然后将其悬浮于甲醇中并用HCl(0.2mL，2.0M于1，4-二噁烷中) 处理。1小时后，将混合物浓缩至干并在真空下干燥以提供为亮橙色固体 的产物A6。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ11.96(s，1H)，10.30(s，1H)， 9.43(bs，1H)，9.14(s，1H)，8.85(m，2H)，8.60(d，J＝4.8Hz，1H)，8.16(bs， 1H)，7.85(bs，1H)，7.77(d，J＝2.0Hz，1H)，7.52(m，2H)，7.48(d，J＝8.5Hz， 1H)7.43(bs，1H)，7.25(d，J＝6.0Hz，1H)，7.23(dd，J＝8.5，2.0Hz，1H)， 2.25(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+：455.1。

以类似方式制备的苯胺14、33、36、40或其他化合物用于使用与从中 间体5制备A-6类似的操作来制备其他的A型最终化合物。

实施例2

N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-2-吗啉代吡啶-4-甲酰 胺B-1

将N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-2-氯吡啶-4甲酰胺 A-1(2mmol)、吗啉(10mmol)和二异丙基乙胺(4mmol)于250℃在微波炉中 加热8分钟。混合物通过制备型HPLC(ACN/水，梯度10-70％)纯化。将 产物的合并溶液浓缩并添加固体Na2CO3直到pH＝10。用二氯甲烷萃取并 经无水K2CO3干燥提供固体和油的混合物，浓缩后将混合物在 MeOH/Et2O中进一步研磨。过滤后，获得为灰白色固体的产物B1。1H NMR (400MHz，d6-丙酮)δ9.47(s，1H)，9.22(s，1H)，8.56(dd，J＝4.7，1.6Hz，1H)， 8.45(m，1H)，8.41(m，1H)，8.4(m，1H)，8.15(d，J＝5.1Hz，1H)，7.87(s，1H)， 7.37(m，2H)，7.3(d，J＝5.1Hz，1H)，7.17(s，1H)，7.11(d，J＝8.2Hz，1H)， 7.03(dd，J＝5.1，1.2Hz，1H)，3.63(t，J＝4.7Hz，4H)，3.44(t，J＝4.7Hz， 1H)，2.24(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+：468.1。

利用6-氯-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)烟酰胺15作 为中间体的类似操作来制备实施例B-12和B-13、B-16和B-17。

实施例3

2-(3-羟基丙氧基)-N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)吡啶 -4-甲酰胺C-2

将N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-2-氯吡啶-4-甲酰胺 A1(0.048mmol)加至丙烷-1，3-二醇(0.48mmol)和NaH(0.24mmol)在 DMSO(1mL)中的混合物中，并将反应混合物于150℃加热2小时。混合 物通过制备型HPLC(ACN/水，梯度10-70％)纯化以提供相应的产物C2， 其为TFA盐。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.40(s，1H)，9.41(d，J＝ 1.44Hz，1H)，9.14(s，1H)，8.83-8.88(m，2H)，8.60(d，J＝5.2Hz，1H)，8.15(s， 1H)，7.83-7.88(m，1H)，7.53(d，J＝5.2Hz，1H)，7.41-7.49(m，2H)，7.32(s， 1H)，7.23(d，J＝8.3Hz，1H)，4.38(t，J＝6.5Hz，2H)，3.57(t，J＝6.2Hz，2H)， 2.24(s，3H)，1.85-1.93(m，2H)。MS(m/z)(M+1)+：457.1。

利用6-氯-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)烟酰胺15作 为中间体的类似操作来制备实施例C-9至C-12。

实施例4

3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N-(3，4-二氢-3-氧代-2H-苯并[b][1，4]噁 嗪-6-基)-4-甲基苯甲酰胺D-2

在室温将3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯甲酸9(0.1mmol)、 6-氨基-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-3(4H)-酮(0.1mmol)和HATU(0.15mmol)溶解 于无水DMF(0.5mL)。将二异丙基乙胺(0.50mmol)加至溶液中。将反应混 合物在室温搅拌1小时。HPLC纯化提供目标化合物D2，其为TFA盐。 1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.78(s，1H)，10.15(s，1H)，9.29(d，J＝1.7 Hz，1H)，9.18(s，1H)，8.74(dd，J＝1.4，4.9Hz，1H)，8.52-8.58(m，2H)，8.23 (d，J＝1.3Hz，1H)，7.71(dd，J＝1.7，7.9Hz，1H)，7.59-7.64(m，1H)，7.54(d， J＝2.4Hz，1H)，7.49(d，J＝5.2Hz，1H)，7.40(d，J＝8.1Hz，1H)，7.23(dd，J ＝2.4，8.7Hz，1H)，6.92(d，J＝8.7Hz，1H)，4.54(s，2H)，2.34(s，3H)。MS (m/z)(M+1)+：453.2。

利用3-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯甲酸43作为中 间体的类似操作来制备实施例D-5至D-12。

实施例5

N-(3-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-1-乙基-3-甲 基-1H-吡唑-5-甲酰胺E-4

将N-(3-(4-氯嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-1-乙基-3-甲基-1H-吡唑-5-甲 酰胺25(0.021mmol)、3-甲氧基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷 -2-基)吡啶(0.025mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(0.0014mmol)加至装有搅拌棒的 10-mL Schlenk烧瓶。将烧瓶抽成真空并用氮气再填充五次。通过注射器 加入1，4-二噁烷(0.8mL)和Na2CO3水溶液(3.1M，0.12mmol)。将Schlenk 烧瓶密封并在微波条件下于150℃加热10分钟。HPLC纯化得到产物E4， 其为TFA盐。1H NMR(400MHz，d4-甲醇)δ9.12(s，1H)，8.64(s，1H)， 8.59-8.62(m，1H)，8.55(d，J＝5.4Hz，1H)，8.23(s，1H)，7.54(d，J＝5.4Hz， 1H)，7.27-7.35(m，2H)，6.70(s，1H)，4.45-4.52(m，2H)，4.03(s，3H)，2.33(s， 3H)，2.28(s，3H)，1.36(t，J＝7.1Hz，3H)。MS(m/z)(M+1)+：444.2。

利用N-(3-(4-氯嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-1H-吲唑-3-甲酰胺22作为 中间体的类似操作来制备实施例E-1至E-3。

实施例6

5-((二乙氨基)甲基)-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)呋 喃-2-甲酰胺F-1

将N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-4-甲酰基环戊-1，3- 二烯甲酰胺16(0.03mmol)、二乙胺(0.09mmol)和过量Na2SO4在二氯甲烷 (0.5mL)中的混合物在室温搅拌1小时。然后加入NaBH(OAc)3(0.15mmol) 并搅拌过夜。混合物通过制备型HPLC(ACN/水梯度10-70％)纯化以提供 相应的产物F1，其为TFA盐。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.14(s，1H)， 9.28(s，1H)，9.01(s，1H)，8.70(d，J＝3.6Hz，1H)，8.52(m，2H)，7.99(s，1H)， 7.57(m，1H)，7.44(m，1H)，7.23(m，1H)，6.94(m，1H)，4.50(s，2H)，3.13(m， 4H)，2.55(s，3H)，1.25(t，J＝7.2Hz，6H)。MS(m/z)(M+1)+：479.2。

实施例7

N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)-5-吗啉代烟酰胺G-1

向烘干的小瓶装入Pd2(dba)3(0.011mmol)、2′-(二环己基膦基)-N，N-二 甲基联苯-2-胺(0.013mmol)和N-(3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯 基)-5-溴吡啶-3-甲酰胺(0.216mmol)。将小瓶抽成真空并用N2再注满。然 后通过注射器加入LiN(TMS)2溶液(1M于THF中，1.0mL)、1，4-二噁烷 (1mL)和吗啉(0.26mmol)。在微波条件下将混合物于140℃加热45分钟。 所得混合物通过制备型HPLC(ACN/水梯度10-70％)纯化以提供相应的产 物G1，其为TFA盐。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.5(s，1H)，9.35(s， 1H)，9.07(s，1H)，8.76(d，J＝4.0Hz，1H)，8.62(m，3H)，8.10(m，1H)，8.02(s， 1H)，7.67(m，1H)，7.48(m，1H)，7.23(m，1H)，3.79(t，J＝4.8Hz，4H)，3.35 (t，J＝4.8Hz，4H)，2.25(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+：468.2。

实施例8

1-(3-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲基苯基)-3-(吡啶-2-基) 脲H-6

在室温下将吡啶-2-胺(5mg，0.05mmol)与三光气(4.9mg，0.017mmol) 在无水THF中混合20分钟。加入N-1-(4-(5-甲氧基吡啶-3-基)嘧啶-2-基)-6- 甲基苯-1，3-二胺14(15mg，0.05mmol)，20分钟后通过加入MeOH淬灭反 应。除去溶剂并通过制备型HPLC纯化残渣以得到脲H-6。1H NMR (400MHz，d6-DMSO)δ10.46(s，1H)，8.98(s，1H)，8.91(s，1H)，8.54(d，J＝5 Hz，1H)，8.44(d，J＝2.4Hz，1H)，8.05(s，1H)，7.9(s，1H)，7.78(t，J＝6.8 Hz，1H)，7.48(m，2H)，7.2(m，2H)，7.03(1H，J＝5.7Hz，1H)，3.86(s，3H)， 2.55(s，1H)，2.21(s，3H)。MS(m/z)(M+1)+：434.2。

以类似方式制备的苯胺14、33、36、40或其他化合物用于采用与从中 间体14制备H-6类似的操作来制备其他的H型最终化合物。

实施例9

N-(3-(4-(5-((2S，6R)-2，6-二甲基吗啉代)吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)-4-甲 基苯基)-2-甲基-5-(三氟甲基)噁唑-4-甲酰胺I-1

于90℃在氮气下将化合物42(30mg，0.056mmol)、二甲基吗啉(13mg， 0.12mmol)、K3PO4(24mg，0.11mmol)、CuI(2.2mg，0.006mmol)和L- 脯氨酸(2.7mg，0.012mmol)在无水DMSO中加热16小时。过滤混合物并 通过制备型HPLC纯化以得到I-1。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ10.52 (s，1H)，9.04(s，1H)，8.7(dd，J＝5.5，3.4Hz，1H)，8.5(m，2H)，8.06(s，1H)， 8.02(s，1H)，7.53(d，J＝6.8Hz，1H)，7.48(d，J＝3.6Hz，1H)，7.21(d，J＝8.3 Hz，1H)，3.68(m，2H)，2.6(s，3H)，2.34(m，4H)，2.21(s，3H)，1.13(d，J＝5.3 Hz，6H)。MS(m/z)(M+1)+：568.3。

通过重复在上述实施例中所述的操作，使用合适的原料，获得了如表 1中所确定的下列式I化合物。

表1

实施例11

3-(2-甲氧基-苯基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-丙 酰胺

在20分钟内将在N，N-二甲基甲酰胺(0.77mL，～1.2mmol)中含有约 50％丙基膦酸酐的溶液分三部分加至搅拌的4-甲基-N3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧 啶基)]-1，3-苯二胺(221.9mg，0.8mmol)、3-(2-甲氧基-苯基)-丙酸(144.2mg， 0.8mmol)和三乙胺(0.887mL，6.4mmol)在2mL N，N-二甲基乙酰胺中的 混合物中。在室温搅拌24小时后，用半饱和的碳酸氢钠水溶液处理混合物 并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机萃取液干燥(Na2SO4)并在减压下蒸 去溶剂。粗产物通过从丙酮中结晶而纯化，获得为褐色固体的标题化合物： MS：440.2[M+H]+；tR(HPLC，Nucleosil C18；5-100％CH3CN+0.1％ TFA/H2O+0.1％TFA 5分钟，流速1.5ml/分钟)：3.91分钟；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6，δ：2.16(s，3H)；2.55(t，2H)；2.84(t，2H)；3.78(s；3H)； 6.83(t，1H)；6.93(d，1H)；7.09-7.19(m，3H)；7.26(m，1H)；7.41(d，1H)； 7.49(dd，1H)；7.87(m，1H)；8.45(m，1H)；8.49(d，1H)；8.67(dd，1H)； 8.91(s，1H)；9.24(m，1H)；9.80(s，1H)。

实施例12

1-乙基-7-甲基-4-氧代-1，4-二氢-[1，8]萘啶-3-甲酸[4-甲基-3-(4-吡啶-3- 基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-酰胺

在20分钟内将在N，N-二甲基甲酰胺(0.77mL，～1.2mmol)中含有约 50％丙基膦酸酐的溶液分三部分加至搅拌的4-甲基-N3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧 啶基)]-1，3-苯二胺(221.9mg，0.8mmol)、1-乙基-7-甲基-4-氧代-1，4-二氢-[1，8] 萘啶-3-甲酸(185.8mg，0.8mmol)和三乙胺(0.887mL，6.4mmol)在2mL N，N-二甲基乙酰胺中的混合物中。在室温搅拌24小时后，将混合物在半饱 和的碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯之间分配。滤去沉淀，用H2O、甲醇和乙 醚洗涤，真空干燥以获得为褐色固体的标题化合物：MS：492.1[M+H]+； tR(HPLC，Nucleosil C18；5-100％CH3CN+0.1％TFA/H2O+0.1％TFA 5分 钟，流速1.5ml/分钟)：4.23分钟；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，δ：1.41(t， 3H)；2.22(s，3H)；2.67(s，3H)；4.61(q，2H)；7.21(d，1H)；7.41(m，1H)； 7.45(d，1H)；7.50-7.58(m，2H)；8.07(d，1H)；8.47-8.55(m，2H)；8.63(d， 1H)；8.68(dd，1H)；8.96(s，1H)；9.10(s，1H)；9.28(m，1H)；12.19(s，1H)。

实施例13

1-甲基-1H-吲哚-2-甲酸[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]- 酰胺

使用1-甲基-1H-吲哚-2-甲酸代替3-(2-甲氧基-苯基)-丙酸，按实施例 11中所述的类似地制备此标题化合物：褐色固体；MS：435.1[M+H]+；tR (HPLC，Nucleosil C18；5-100％CH3CN+0.1％TFA/H2O+0.1％TFA 5分 钟，流速1.5ml/分钟)：4.15分钟；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，δ：2.22(s， 3H)；4.00(s，3H)；7.11(t，1H)；7.20(d，1H)；7.29(m，2H)；7.41-7.58(m，4H)； 7.68(d，1H)；8.06(d，1H)；8.14(dd，1H)；8.46-8.52(m，2H)；8.68(dd，1H)； 8.99(s，1H)；9.30(m，1H)；10.28(s，1H)。

实施例14

5-硝基-呋喃-2-甲酸[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-酰胺

使用5-硝基-呋喃-2-甲酸代替3-(2-甲氧基-苯基)-丙酸，按实施例11中 所述的类似地制备此标题化合物：褐色固体；MS：417.1[M+H]+；tR(HPLC， Nucleosil C18；5-100％CH3CN+0.1％TFA/H2O+0.1％TFA 5分钟，流速 1.5ml/分钟)：3.65分钟；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，δ：2.22(s，3H)；7.22 (d，1H)；7.41-7.54(m，3H)；7.63(d，1H)；7.80(d，1H)；8.02(m，1H)；8.44 (dt，1H)；8.51(d，1H)；8.67(dd，1H)；9.02(s，1H)；9.25(d，1H)；10.59(s，1H)。

实施例15

{2-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯甲酰基氨基]-噻唑-4-基}- 乙酸乙酯

在20分钟内将在N，N-二甲基甲酰胺(0.674mL，～1.05mmol)中含有约 50％丙基膦酸酐的溶液分三部分加至搅拌的4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2- 基氨基)-苯甲酸(214.4mg，0.7mmol)、(2-氨基-噻唑-4-基)-乙酸乙酯(130.4 mg，0.7mmol)和三乙胺(0.776mL，5.6mmol)在2mL N，N-二甲基甲酰胺 中的混合物中。在室温搅拌24小时后，将混合物在半饱和的碳酸氢钠水溶 液和乙酸乙酯之间分配。滤去沉淀，用H2O和乙酸乙酯洗涤，真空干燥以 获得为米色固体的标题化合物：MS：475.1[M+H]+；1H-NMR(400MHz， DMSO-d6，δ：1.16(t，3H)；2.32(s，3H)；3.71(s，2H)；4.06(q，2H)；7.02(s， 1H)；7.38(d，1H)；7.47-7.55(m，2H)；7.85(dd，1H)；8.38-8.46(m，2H)； 8.54(m，1H)；8.68(dd，1H)；9.11(s，1H)；9.26(m，1H)；12.58(br.s，1H)。

实施例16

5-甲基-2-苯基-2H-[1，2，3]三唑-4-甲酸[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基 氨基)-苯基]-酰胺

在20分钟内将在N，N-二甲基甲酰胺(0.70mL，～1.08mmol)中含有约 50％丙基膦酸酐的溶液分三部分加至搅拌的4-甲基-N3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧 啶基]-1，3-苯二胺(200mg，0.72mmol)、5-甲基-2-苯基-2H-[1，2，3]三唑-4-甲 酸(146.3mg，0.72mmol)和三乙胺(0.798mL，5.76mmol)在2mL N，N-二 甲基甲酰胺中的混合物中。在室温搅拌72小时后，真空除去溶剂并将残余 物在半饱和的碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯之间分配。滤去沉淀，用H2O和 乙酸乙酯洗涤，真空干燥以获得为米色固体的标题化合物：MS：463.1 [M+H]+；tR(HPLC，Nucleosil C18；5-100％CH3CN+0.1％TFA/H2O+0.1％ TFA 5分钟，流速1.5ml/分钟)：4.49分钟；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6， δ：2.23(s，3H)；2.57(s，3H)；7.22(d，1H)；7.41-7.63(m，6H)；8.12(m，2H)； 8.17(m，1H)；8.46-8.54(m，2H)；8.68(dd，1H)；8.98(s，1H)；9.27(d，1H)； 10.32(s，1H)。

实施例17

6-羟基-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-烟酰胺

使用6-羟基-烟酸代替5-甲基-2-苯基-2H-[1，2，3]三唑-4-甲酸，按实施例 16中所述的类似地制备此标题化合物。过滤的沉淀用H2O、甲醇、CH2Cl2 和乙醚洗涤，真空干燥获得米色粉末的标题化合物：MS：399.2[M+H]+； tR(HPLC，Nucleosil C18；5-100％CH3CN+0.1％TFA/H2O+0.1％TFA 5 分钟，流速1.5ml/分钟)：2.99分钟；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，δ：2.21 (s，3H)；6.40(d，1H)；7.19(d，1H)；7.37-7.54(m，3H)；7.93-8.02(m，2H)； 8.18(m，1H)；8.43-8.53(m，2H)；8.68(dd，1H)；8.90(s，1H)；9.27(d，1H)； 9.90(s，1H)；(12.02(br.s，1H)。

实施例18

2-羟基-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-烟酰胺

使用2-羟基-烟酸代替5-甲基-2-苯基-2H-[1，2，3]三唑-4-甲酸，按实施例 16中所述的类似地制备此标题化合物：褐色固体；MS：399.2[M+H]+； tR(HPLC，Nucleosil C18；5-100％CH3CN+0.1％TFA/H2O+0.1％TFA 5 分钟，流速1.5ml/分钟)：3.29分钟；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，δ：2.22 (s，3H)；6.57(m，1H)；7.19(d，1H)；7.30-7.60(m，3H)；7.77(m，1H)；8.07 (m，1H)；8.39-8.55(m，3H)；8.67(m，1H)；8.92(s，1H)；9.26(m，1H)；12.17 (s，1H)；12.72(br.S，1H)。

实施例19

3-羟基-吡啶-2-甲酸[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-酰胺

使用3-羟基-吡啶-2-甲酸代替5-甲基-2-苯基-2H-[1，2，3]三唑-4-甲酸， 按实施例16中所述的类似地制备此标题化合物。用CH2Cl2/甲醇(9∶1)稀释 乙酸乙酯层，经Na2SO4干燥并真空蒸发。所得残渣用甲醇结晶以获得米 色固体的标题化合物：MS：399.2[M+H]+；tR(HPLC，Nucleosil C18；5-100％ CH3CN+0.1％TFA/H2O+0.1％TFA 5分钟，流速1.5ml/分钟)：3.89分钟； 1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，δ：2.24(s，3H)；7.23(d，1H)；7.41-7.61(m， 5H)；8.25(m，2H)；8.45-8.55(m，2H)；8.68(dd，1H)；8.97(s，1H)；9.31(d， 1H)；10.82(s，1H)；12.17(s，1H)。

实施例20

2-甲基-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-烟酰胺

在20分钟内将在N，N-二甲基甲酰胺(0.77mL，～1.2mmol)中含有约 50％丙基膦酸酐的溶液分三部分加至搅拌的4-甲基-N3-[4-(3-吡啶基)-2-嘧 啶基]-1，3-苯二胺(221.9mg，0.8mmol)、2-甲基-烟酸(109.7mg，0.8mmol) 和三乙胺(0.887mL，6.4mmol)在2mL N，N-二甲基甲酰胺中的混合物中。 在室温搅拌24小时后，用半饱和的碳酸氢钠水溶液处理混合物并用乙酸乙 酯萃取3次。将合并的有机萃取液干燥(Na2SO4)并在减压下蒸去溶剂。粗 产物通过从CH2Cl2/乙醚中结晶而纯化，获得为褐色固体的标题化合物： MS：397.2[M+H]+；tR(HPLC，Nucleosil C18；5-100％CH3CN+0.1％ TFA/H2O+0.1％TFA 5分钟，然后100％CH3CN+0.1％TFA 2分钟，流速 1.5ml/分钟)：2.91分钟；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，δ：2.21(s，3H)；2.57 (s，3H)；(q，4H)；7.20(d，1H)；7.30-7.54(m，4H)；7.84(m，1H)；8.06(m，1H)； 8.42-8.57(m，3H)；8.68(dd，1H)；9.00(s，1H)；9.26(d，1H)；10.40(s，1H)。

试验

对本发明化合物进行试验以测定它们选择性地抑制野生型Ba/F3细胞 和用Tel c-kit激酶和Tel PDGFR融合的酪氨酸激酶转化的Ba/F3细胞的 增殖的能力。另外，本发明的化合物在Mo7e细胞中选择性抑制SCF依赖 性的增殖。另外，对化合物进行了试验以测定其抑制Abl、ARG、BCR-Abl、 BRK、EphB、Fms、Fyn、KDR、c-Kit、LCK、PDGF-R、b-Raf、c-Raf、 SAPK2、Src、Tie2和TrkB激酶的能力。

Ba/F3FL FLT3增殖试验

所用鼠细胞系为过表达全长FLT3构建体的Ba/F3鼠原B细胞系。将 这些细胞保持在补充有青霉素50μg/mL、链霉素50μg/mL和L-谷氨酰胺 200mM并加入鼠重组IL3的RPMI 1640/10％胎牛血清(RPMI/FBS)中。 Ba/F3全长FLT3细胞经受IL3饥饿16小时，然后以每孔在25μL培养基 中5,000个细胞的量接种到384孔TC板中并加入0.06nM至10μM的测 试化合物。添加化合物后，每孔加入在25μL培养基中的合适浓度的FLT3 配体或IL3，用于细胞毒性对照。然后将细胞在37℃、5％CO2下温育48 小时。温育细胞后，按生产商的说明书每孔加入25μL BRIGHT GLO (Promega公司)，并使用Analyst GT-发光模式-50000积分时间(以RLU 为单位)读板。

人TG-HA-VSMC增殖试验

人TG-HA-VSMC细胞(ATCC)在补充有10％FBS的DMEM中生长 至80-90％汇合，随后以6e4个细胞/mL再悬浮于补充有1％FBS和30 ng/mL重组人PDGF-BB的DMEM中。然后将细胞以50μL/孔等分至384 孔板，在37℃温育20小时，然后在37℃用0.5μL的100x化合物处理48 小时。处理之后，将25μL CellTiter-Glo加至每孔中15分钟，然后在 CLIPR(Molecular Devices)上读板。

增殖试验：BaF3文库-Bright glo读数方法

测试化合物抑制野生型Ba/F3细胞和用Tel融合型酪氨酸激酶转化的 Ba/F3细胞的增殖的能力。将未转化的Ba/F3细胞保持在含有重组IL3的 培养基中。将细胞以每孔在50μL培养基中5,000个细胞的量接种到384 孔TC板中并加入0.06nM至10μM的测试化合物。然后将细胞在37℃、 5％CO2下温育48小时。温育细胞后，按照生产商的说明书将25μL的 BRIGHT GLO(Promega)加至每孔中，并使用Analyst GT-发光模式- 50000积分时间(以RLU为单位)读板。根据剂量响应曲线确定50％抑制所 需的化合物浓度，即IC50值。

Mo7e试验

在96孔板中使用内源性表达c-kit的Mo7e细胞来测试本文所述的化 合物对SCF依赖性增殖的抑制。简短地说，评价两倍系列稀释的测试化合 物(Cmax＝10μM)对于用人重组SCF刺激的Mo7e细胞的抗增殖活性。在 37℃温育48小时后，通过使用Promega的MTT比色测定试剂盒来测定 细胞活力。

抑制细胞的BCR-Abl依赖性增殖(高通量方法)

所使用的鼠细胞系是用BCR-Abl cDNA转化的32D造血祖细胞系 (32D-p210)。这些细胞保持在补充有青霉素50μg/mL、链霉素50μg/mL 和L-谷氨酰胺200mM的RPMI/10％胎牛血清(RPMI/FCS)中。未转化的 32D细胞保持在类似条件下并加入15％WEHI条件培养基作为IL3来源。

将50μL 32D或32D-p210细胞悬浮液以每孔5000个细胞的密度涂覆 在Greiner 384孔微孔板(黑色)中。向各孔(包括STl571作为阳性对照)中加 入50nL的测试化合物(1mM在DMSO中的储备液)。在37℃、5％CO2下 将细胞温育72小时。在各孔中加入10μL 60％Alamar Blue溶液(Tek diagnostics)并将细胞再温育24小时。使用AcquestTM系统(Molecular Devices)来对荧光强度进行定量(激发波长530nm，发射波长580nm)。

抑制细胞BCR-Abl依赖性增殖

将32D-p210细胞以每孔15000个细胞的密度涂覆到96孔TC板中。 将50μL的测试化合物的两倍系列稀释液(Cmax为40μM)加至各孔中(包含 STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％CO2下温育48小时后，向各 孔中加入15μL的MTT(Promega)并将细胞再温育5小时。通过分光光度 法定量在570nm处的光密度，并通过剂量响应曲线确定50％抑制作用所 需的化合物浓度，即IC50值。

对细胞周期分布的影响

将32D和32D-p210细胞以每孔在5mL培养基中2.5×106个细胞的量 接种到6孔TC板中，并加入1或10μM的浓度的测试化合物(包含STl571 作为对照)。然后，在37℃、5％CO2下温育细胞24或48小时。用PBS洗 涤2mL细胞悬浮液，在70％EtOH中固定1小时并用PBS/EDT/RNase A 处理30分钟。加入碘化丙啶(Cf＝10μg/ml)并在FACScaliburTM系统(BD Biosciences)上通过流式细胞计数法定量荧光强度。本发明的测试化合物显 示对32D-p210细胞具有凋亡作用，但不诱导32D亲本细胞凋亡。

对细胞BCR-Abl自磷酸化的作用

使用c-abl特异性捕获抗体和抗磷酸酪氨酸抗体，通过捕获Elisa来定 量BCR-Abl的自磷酸化作用。将32D-p210细胞以每孔2×105个细胞在50 μL培养基中的形式涂覆在96孔TC板中。将50μL试验化合物的两倍系 列稀释液(Cmax为10μM)加至各孔(包含STI571作为阳性对照)。在37℃、 5％CO2下温育细胞90分钟。然后，所述细胞在冰上用150μL含有蛋白酶 和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(50mM Tris HCl，pH 7.4、150mM NaCl、5 mM EDTA、1mM EGTA和1％NP 40)处理1小时。将50μL细胞溶胞产 物加到96孔光学板中，该板事先用抗-abl的特异性抗体涂布并封闭。在4℃ 将该板温育4小时。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入50μL带有碱性 磷酸酶的抗磷酸酪氨酸抗体并将在4℃将该板温育过夜。用TBS-吐温20 缓冲液洗涤后，加入90μL发光底物并用AcquestTM system(Molecular Devices)对发光值进行定量。抑制表达BCR-Abl的细胞增殖的本发明的测 试化合物以剂量依赖性方式抑制细胞的BCR-Abl自磷酸化。

对表达突变型Bcr-abl的细胞增殖的作用

测试本发明化合物对表达野生型或突变型的BCR-Abl(G250E、 E255V、T315I、F317L、M351T)的Ba/F3细胞的抗增殖作用，这些细胞 具有STl571的抗性或对其敏感性降低。以上述的10、3.3、1.1和0.37μM 的浓度(在不含IL3的培养基中)，测试这些化合物对表达突变型BCR-Abl 的细胞和未转化的细胞的抗增殖作用。如上所述，从获得的剂量响应曲线 确定化合物对未转化的细胞的无毒性的IC50值。

FGFR3(酶试验)

在终体积为10μL、含有在激酶缓冲液(30mM Tris-HCl pH7.5、15mM MgCl2、4.5mM MnCl2、15μM Na3VO4和50μg/mL BSA)中的0.25μg/mL 酶和底物(5μg/mL生物素-poly-EY(Glu、Tyr)(CIS-US，Inc.)和3μM ATP 的溶液中，用纯化的FGFR3(Upstate)进行激酶活性分析。制备两种溶液： 将5μL的含有FGFR3酶在激酶缓冲液中的第一种溶液首先分配到384- 型ProxiPlate(Perkin-Elmer)板中，随后加入50nL的溶于DMSO的化 合物；然后，将5μL的含有底物(poly-EY)和ATP在激酶缓冲液中的第二 种溶液加入各孔中。将反应于室温温育1小时，通过加入10μL HTRF检 测混合物而终止，该HTRF检测混合物含有30mM Tris-HCl pH7.5、0.5M KF、50mM ETDA、0.2mg/mL BSA、15μg/mL链霉抗生物素-XL665 (CIS-US，Inc.)和150ng/mL螯合了抗-磷酸酪氨酸抗体的穴状化合物 (CIS-US，Inc.)。于室温温育1小时以使链霉抗生物素-生物素相互作用， 随后在Analyst GT(Molecular Devices公司)上读取时间解析荧光信号。通 过每个化合物在12个浓度(从50μM至0.28nM的1∶3稀释)下的抑制百分 比的线性回归分析来计算IC50值。在该试验中，本发明化合物的IC50的范 围为10nM至2μM。

FGFR3(细胞试验)

测试本发明化合物抑制转化的Ba/F3-TEL-FGFR3细胞增殖的能力， 其取决于FGFR3细胞激酶的活性。采用补充有10％胎牛血清的RPMI 1640作为培养基，将Ba/F3-TEL-FGFR3在悬浮液中培养至多达800,000 个细胞/mL。将细胞以每孔5000个细胞在50μL培养基中的形式分配到 384-孔板中。本发明化合物在二甲基亚砜(DMSO)中溶解和稀释。配制12 个点的在DMSO中的1∶3系列稀释液，所产生的浓度梯度的范围通常在10 mM至0.05μM。将细胞加到50nL稀释的化合物中，并在细胞培养箱中温 育48小时。将AlamarBlue(TREK Diagnostic System)(其可用于监测由 增殖细胞产生的还原性环境)加入细胞，终浓度为10％。在37℃的细胞培 养箱中再培养4小时后，在Analyst GT(Molecular Devices公司)上定量测 定还原的AlamarBlue的荧光信号(于530nm激发，于580nm发射)。通 过每个化合物在12个浓度的抑制百分比的线性回归分析计算IC50值。

FLT3和PDGFRβ(细胞试验)

使用上述对于FGFR3细胞活性所述的同样方法，但分别使用 Ba/F3-FLT3-ITD和Ba/F3-Tel-PDGFRβ代替Ba/F3-TEL-FGFR3，分析本 发明化合物对FLT3和PDGFRβ的细胞活性的作用。

b-Raf-酶试验

测试本发明化合物抑制b-RAF活性的能力。在黑色壁和透明底的384 孔MaxiSorp板(NuNc)中进行测定。在DPBS中稀释底物IκBα(1∶750)并 向各孔中加入15μL。将板在4℃温育过夜并用EMBLA板洗涤器以 TBST(25mM Tris，pH 8.0、150mM NaCl和0.05％吐温-20)洗涤3次。将 板用Superblock(15μL/孔)在室温封闭3小时，用TBST洗涤3次并轻拍 干燥。将含有20μM ATP(10μL)的测定缓冲液加至各孔中，之后加入 100nL或500nL化合物。将B-Raf在测定缓冲液中稀释(1μL稀释至25μL) 并将10μL稀释的b-Raf加入到各孔中(0.4μg/孔)。在室温将该板温育2.5 小时。通过用TBST洗涤该板6次来终止激酶反应。在Superblock中稀释 Phosph-IκBα(Ser32/36)抗体(1∶10,000)并将15μL加入到各孔中。将板在 4℃温育过夜并用TBST洗涤6次。在Superblock中稀释结合了AP的山 羊-抗-小鼠IgG(1∶1,500)并将15μL加到各孔中。将板在室温温育1小时并 用TBST洗涤6次。在各孔中加入15μL荧光Attophos AP底物(Promega) 并在室温温育15分钟。在Acquest或Analyst GT上使用荧光强度程序(于 455nm激发，于580nm发射)读板。

b-Raf-细胞试验

在A375细胞中测试本发明化合物抑制MEK磷酸化的能力。A375细 胞系(ATCC)来源于人黑素瘤患者，它在B-Raf基因上具有V599E突变。 由于B-Raf突变使得磷酸化的MEK的水平上升。在无血清培养基中，在 37℃将亚汇合到汇合的A375细胞与化合物一起温育2小时。然后用冷PBS 洗涤细胞一次，用含有1％Triton X100的裂解缓冲液裂解细胞。离心后， 上清液进行SDS-PAGE，然后转移到硝基纤维素膜上。然后将膜用抗-磷酸 -MEK抗体(ser217/221)(Cell Signaling)进行蛋白质印迹。根据磷酸化MEK 在硝基纤维素膜上的带密度来监测磷酸化MEK的量。

Upstate KinaseProfilerTM-放射酶促过滤结合试验

评价本发明化合物抑制激酶组的各成员的能力。根据通用方法，检测 10μM的终浓度的测试化合物，一式两份。需要注意的是激酶缓冲液的组 成和底物随“UpstateKinaseProfilerTM”组中所包括的激酶不同而变化。在 置于冰上的eppendorf管中混合激酶缓冲液(2.5μL，10x，在需要时含有 MnCl2)、活性激酶(0.001-0.01单位；2.5μL)、在激酶缓冲液中的特异性或 聚(Glu4-Tyr)肽(5-500μM或0.01mg/ml)以及激酶缓冲液(50μM；5μL)。 加入Mg/ATP混合物(10μL；67.5(或33.75)mM MgCl2、450(或225)μM ATP和1μCi/μl[γ-32P]-ATP(3000Ci/mmol))并将反应在约30℃温育约10 分钟。将反应混合物(20μL)点在2cm×2cm P81(磷酸纤维素，用于带正电 的肽底物)或Whatman 1号(用于聚(Glu4-Tyr)肽底物)方形纸上。用0.75％ 磷酸洗涤该方形纸4次，每次5分钟，然后用丙酮洗涤一次，洗涤5分钟。 将该方形纸转移到闪烁小瓶中，加入5ml闪烁混合物并用Beckman闪烁 计数器定量掺入肽底物的32P(cpm)。计算每个反应的抑制百分数。

使用SYBR Green I的抗疟试验

可对本发明的化合物进行试验来测量它们在受感染的红细胞中抑制寄 生虫增殖的能力。通过加入对双链DNA具有高亲和力的SYBR Green I (Invitrogen)染料来对增殖进行定量。

对于药物筛选，将不含人血清的20μL筛选培养基分配到3个测定板 中。然后将50nL的每个本发明化合物，包括抗疟药对照(氯喹和Artimesinin) 转移到测定板中。将50nL DMSO转移到基线和背景对照板中。然后将30μL 被恶性疟原虫感染的人红细胞在筛选培养基中的悬浮液分配到测定板和基 线对照板中，以使最终的血细胞比容为2.5％，并且最终的血寄生虫为3％。 将未感染的红细胞分配到背景对照板中，以使最终的血细胞比容为2.5％。 将板在93％N2、4％CO2和3％O2的气体混合物下在37℃培养箱中放置72 小时。将10μL SYBR Green I的10X溶液分配到板中。将板密封并放置 在-80℃冰箱中过夜以裂解红细胞。将板解冻后在室温放置过夜，以使染色 效果最佳。使用Acquest system(Molecular Devices)测量荧光强度(于497 nm激发，于520nm发射)。计算每个化合物的抑制百分比。

游离形式或或药学上可接受的盐形式的式I化合物显示出有价值的药 理特性，例如，如本申请中所述的体外试验所示。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且提示 本领域技术人员可根据它们进行各种变更或改变，这类变更和改变包括在 本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引述的所有公开物、 专利和专利申请都引入本文作为参考，用于所有目的。