核酸复合物
阅读：888发布：2022-05-31
专利汇可以提供核酸复合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及转录因子诱饵的复合物、其向细菌的递送和其制剂。具体地，本发明在于一种抗细菌复合物，该抗细菌复合物包含核酸序列和选自以下的一种或多种递送部分：季胺化合物；双 氨 基烷 烃 类和其不饱和衍 生物 ，其中所述氨基烷烃的氨基组分是形成杂环的一部分的氨基基团；和抗细菌肽。，下面是核酸复合物专利的具体信息内容。
1.一种抗细菌复合物，包含：核酸序列和至少一种递送部分，其中所述递送部分选自季胺化合物；双氨基烷烃类和其不饱和衍生物，其中所述氨基烷烃的氨基组分是形成杂环的一部分的氨基基团；和抗细菌肽。
2.根据权利要求1所述的抗细菌复合物，其中所述递送部分选自喹啉或吖啶的四价衍生物和抗细菌肽。
3.根据权利要求2所述的复合物，其中所述递送部分是双喹啉鎓。
4.根据权利要求3所述的复合物，其中所述递送部分是地喹胺或其类似物。
5.根据权利要求4所述的复合物，其中所述地喹胺类似物的烷基链具有8至14个甲基基团。
6.根据权利要求5所述的复合物，其中所述烷基链具有10或12个甲基基团。
7.根据权利要求1所述的复合物，其中所述季胺化合物是10，10’-(癸烷-1，10-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二氯化物。
8.根据权利要求1所述的复合物，其中所述季胺化合物是10，10’-(十二烷-1，12-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二氯化物。
9.根据权利要求1所述的复合物，其中所述季胺化合物和双氨基烷烃类和其不饱和衍生物选自式(I)的化合物：
其中Q选自：
1
(a)具有下式的基团Q ：
和
2 2 2 2 2
(b)基团Q、Q-NH-、Q-O-或Q-S-，其中Q 选自具有5至14个环元的单环、双环和三环杂芳族基团，其中1、2或3个是选自N、O和S的杂原子环元，条件是存在至少一个氮环
4a
元，其中所述杂芳族基团任选地被一个或两个取代基R 取代，且其中所述一个氮环元可形成N-氧化物或可被C1-4烷基、苯基-C1-4烷基或二-苯基-C1-4烷基取代以形成四价基团，其中在所有情况下所述苯基部分任选地被一个或两个卤素、甲基或甲氧基基团取代；
m是0或1；
n是0或1；
p和q是相同的或不同的，且各自是1至12的整数；
A是键或选自萘、联苯基、萜苯基、菲、芴、芪、基团C6H4(CH2)rC6H4、基团C6H4-C≡C-C6H4、吡啶-2，6-二基-双(苯-1，4-二基)基团、基团CH＝CH-(CH2)s-(CH＝CH)t；和基团C≡C-(CH2)u-(C≡C)v-；其中r是0-4，s是0至4，t是0或1；u是0-4且v是0或1；
0 1 2 1 2
当n是1时，R、R 和R 各自选自C1-4烷基；且当n是0时，则N、R 和R 一起形成具有
5至14个环元的单环、双环或三环杂芳族基团，其中一个是氮原子N，且0、1或2个也是选
4b
自N、O和S的杂原子环元，并且其中所述杂芳族基团任选地被一个或两个取代基R 取代；
3 4c
且R 选自氢、C1-4烷基、卤素、具有各自任选地被一个或两个取代基R 取代的3至7个环元
2 2 2 4a 4b 4c
的单环碳环基团、基团Q；基团-NH-Q、基团-O-Q 和基团-S-Q ；且R 、R 和R 是相同的或不同的，且各自选自任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；卤素；苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取代；脲基和胍基。
10.根据权利要求9所述的复合物，其中所述式(I)的化合物由式(II)表示：
1 2 3
其中R、R、m、p、A、q和R 如权利要求9中所定义。
3 1
11.根据权利要求10所述的复合物，其中R 是Q 且n在所有情形下是0，且其中式(II)的化合物由式(III)表示：
12.根据权利要求9所述的复合物，其中所述式(I)的化合物由式(IV)表示：
其中：
p和q是相同的或不同的，且各自是1至12的整数；
A是键或选自萘、联苯基、萜苯基、菲、芴、芪、基团C6H4(CH2)rC6H4、基团C6H4-C≡C-C6H4、吡啶-2，6-二基-双(苯-1，4-二基)基团、基团CH＝CH-(CH2)s-(CH＝CH)t；和基团C≡C-(CH2)u-(C≡C)v-；其中r是0-4，s是0至4，t是0或1；u是0-4且v是0或1；
8 9 10
R、R 和R 是相同的或不同的，且各自选自氢；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基：任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二C1-4烷基氨基；
卤素、苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取
9 10 8a 9a
代；脲基和胍基；或R 和R 连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5；且R 、R
10a
和R 是相同的或不同的，且各自选自氢；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基：任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；卤素、苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取代；脲
9a 10a
基和胍基；或R 和R 连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5。
13.根据权利要求12所述的复合物，其中所述式(IV)的化合物由式(V)表示：
其中：
r是2至24的整数；
8 9 10
R、R 和R 是相同的或不同的，且各自选自氢；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；
卤素、苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取
9 10 8a 9a
代；脲基和胍基；或R 和R 连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5；且R 、R
10a
和R 是相同的或不同的，且各自选自氢；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基：任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；卤素、苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取代；脲
9a 10a
基和胍基；或R 和R 连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5；
条件是：
10 10a 9 9a 8 8a
(i)当R 和R 均是氢或均是甲基，且R 和R 均是氢时，则R 和R 中的至少一个不是氢、氨基或二甲基氨基；且
9 10 9a 10a
(ii)当R 和R 连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是4，且R 和R 连接在一
8 8a
起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是4时，则R 和R 中的至少一个不是氨基。
14.根据权利要求1至13中的任一项所述的复合物，其中所述抗细菌肽是天然存在的肽。
15.根据权利要求1至13中的任一项所述的复合物，其中所述抗细菌肽是天然存在的肽的肽模拟物或合成变体。
16.根据权利要求1至15中的任一项所述的复合物，其中所述抗细菌肽透化细菌细胞膜。
17.根据权利要求15所述的复合物，其中所述抗细菌肽选自包括以下的组：防御素、鱼类抗菌肽、爪蟾抗菌肽、蛙皮抗菌肽、蜜蜂抗菌肽、天蚕抗菌肽、小菌素和片球菌素。
18.根据权利要求17所述的复合物，其中所述抗细菌肽选自包括以下的组：短杆菌肽和多粘菌素。
19.根据权利要求1至15中的任一项所述的复合物，其中所述抗细菌肽具有细胞内靶标。
20.根据权利要求19所述的复合物，其中所述复合物还包含连接子。
21.根据权利要求20所述的复合物，其中所述连接子是羧基基团-至-伯胺交联剂。
22.根据权利要求21或权利要求22所述的复合物，其中所述连接子是EDC。
23.根据权利要求19至22中的任一项所述的复合物，其中所述抗细菌肽选自包括以下的组：抗生素、糖肽抗生素、阳离子多肽诸如聚赖氨酸和聚精氨酸。
24.根据权利要求23所述的复合物，其中所述抗细菌肽是Buforin或其衍生物。
25.根据权利要求1至24中的任一项所述的复合物，其中所述核酸序列包含转录因子的天然细胞结合位点的序列。
26.根据权利要求25所述的复合物，其中所述天然细胞结合位点包含细菌Sig结合位点的序列。
27.根据权利要求26所述的复合物，其中所述核酸序列具有SEQ ID NO：9、10、30和31、
39、40或41所列的序列。
28.根据权利要求25所述的复合物，其中所述天然细胞结合位点包含细菌Fur结合位点的序列。
29.根据权利要求28所述的复合物，其中所述核酸序列具有SEQ ID NO：11、12或13所列的序列。
30.一种抗细菌复合物，包含：
a)包含转录因子的天然细胞结合位点的序列的核酸序列，
b)10，10’-(十二烷-1，12-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二氯化物；和任选地
c)抗细菌肽。
31.根据权利要求30所述的复合物，其中所述核酸序列具有SEQ ID NO：30和31所列的序列。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的复合物用于治疗细菌感染的用途。
33.一种药物组合物或药物，包含根据权利要求1至32中的任一项所述的复合物和生理上可接受的载体或赋形剂。
34.根据权利要求33所述的药物组合物或药物，用于治疗细菌感染。
核酸复合物
[0001] 本发明涉及核酸序列的复合物。具体地，本发明涉及转录因子诱饵的复合物、其向细菌的递送和其制剂。
[0002] 细菌生长和毒性的控制形成了日益增加的问题，尤其是在医学和兽医学应用中，并可成为公共健康的重大挑战。用于抵抗病原性细菌的抗生素是本领域熟知的。然而，此类抗生素的广泛使用已导致对至少一种、以及在一些情形下多种抗生素具有抗性的细菌(所谓的多药抗性菌株)的出现。已发现的传统抗生素和开发中的抗生素数量的下降加剧了这一形势。事实上，抗生素抗性是抗细菌研究的重大挑战，并危及市售抗生素以及那些仍处于开发中的抗生素的效力。因此，存在对可用于阻碍细菌传播和感染的新的抗细菌剂的需要。
[0003] 基于DNA的治疗具有克服现有抗细菌治疗的限制的潜能，因为它们可以被设计为通过以下方式治疗潜在的任何病原体：阻止编码抗生素抗性机制的基因的表达，或通过改变关键或适应性基因或操纵子的表达抑制生长，或类似地阻止毒性或致病性的发作。另外，细菌不可能发展出针对这些剂的抗性，因为这将需要影响转录因子和其关联结合位点二者的同时突变。这对于控制多个关键基因的剂尤其如此。可选地，可通过突变使得基因组成型表达而使基因逃避转录因子诱饵介导的控制。然而，在转录因子诱饵同时作用于许多基因的情形下，将需要这些基因中的许多基因获得突变以使它们转换为组成型表达，这是被视为不可能的事件。
[0004] 转录因子诱饵(TFD)是一种此类基于DNA的治疗剂。诱饵寡核苷酸被设计为模拟转录因子的结合位点并阻止后者与它们的关联基因组靶标结合，从而改变基因表达(Mann和Dzau(2000)J.Clin.
[0005] TFD具有超过其他基于DNA的治疗剂的显著优点。其作用机制是简单且可预测的-它们通过掩蔽转录因子来控制基因表达，通过使细胞充满足量拷贝的特异结合序列而阻止后者与启动子结合(因此，术语”诱饵”)。这与其中由于mRNA的复杂二级结构而难以限定靶标的反义策略相反。与反义方法相比，TFD具有作用迅速、阻止基因表达的另外的优点，而反义方法涉及表达的结果。因此，TFD在极低的浓度下有效，因为单一TFD-转录因子相互作用可阻断单一基因的转录，而单一基因可以产生成千上万拷贝的mRNA，而mRNA构成反义方法的靶标。
[0006] 其他基于DNA的治疗剂包括含有用于基因治疗的质粒、用于反义和反基因应用的寡核苷酸(Crooke ST.(1998)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.8：115-122)、核酶、DNA酶、适体和小干扰RNA(siRNA)(Stull R.A.等(1995)Pharm Res.12：465-483；Patil S.D.和Burgess D.J.(2003)AAPS Newsmagazine6：27)。尽管大多数基于DNA的药物处于临床前开发或临床试验的早期阶段，但是近年来已出现了这一类化合物以产生针对包括以下的广泛范围的疾病的药物治疗的极有希望的候选物：癌症、AIDS、神经疾患诸如帕金森病和阿尔茨海默病以及心血管疾患。
[0007] 然而，包括TFD在内的基于DNA的治疗剂的递送仍是重大的挑战。当递送大的亲水性治疗剂诸如蛋白质或核酸时，细胞膜是遇到的主要障碍之一。解决此问题的大多数努力集中于递送至真核细胞，以开发用于人类癌症等的有效治疗。在真核细胞中，不同的细胞区室(包括核)受到生物膜的保护，生物膜隔离不同的细胞区室并阻止溶质从细胞和细胞器的流入和流出。尽管这些屏障对于细胞的维持是必要的，但是当试图向细胞或细胞内的特定细胞器递送治疗剂时，这些屏障是实质的问题。
[0008] 由于细胞膜的疏水性内部产生的大的自由能障碍，大多数阳离子在没有特异性载体系统下不能通过细胞膜。为了被细胞选择性积累和保留，阳离子化合物需要足够的亲脂性和其正电荷的离域以降低当从水环境移至疏水环境时的自由能变化。这允许该化合物被动穿过质膜和线粒体膜并响应于膜电位而积累。
[0009] 蛋白质进入真核细胞的转运主要通过内吞介导。这是高度组织化的转运系统，其中大的极性分子通过被吞食到细胞膜内而被吸附。吞噬作用和胞饮作用是非受体介导的形式的内吞，而受体介导的内吞是更加特异的主动事件，其中细胞质膜向内折叠以形成有被小窝。在这种情形下，蛋白质或其他触发颗粒受困于细胞质膜中的受体/配体或受困于与细胞表面的非特异性相互作用，例如由于电荷相互作用。仅到那时颗粒才被吞食。这些向内出芽的小泡出芽形成细胞质小泡。
[0010] 已开发了多种技术来体内和体外将生物活性分子易位跨过这些屏障。电穿孔和显微注射对于体内使用是苛刻且不实际的，因为这些方法在可以将物质引入细胞之前必须破坏细胞膜，并且因此它们限于有限量的细胞。
[0011] 虽然使用内吞途径是有吸引力的，但是一个重要的缺点是确保在溶酶体活性发生之前的内体逃脱。脂质体包囊和受体介导的内吞也受到其缺乏靶向和低递送效率的限制。迄今进行的大多数探索工作集中于向真核细胞递送siRNA分子。通常采用的方法是与共价连接的靶向肽形成脂质体或复合物，靶向肽指导治疗剂到达细胞内的合适靶标。
[0012] 当选择用于此类递送机制的脂质组分时有许多考虑因素。脂质样组分通常是阳离子并具有三种功能：
[0013] 1.压缩核酸以使递送更易实现；
[0014] 2.保护核酸不被核酸酶降解或不被质膜蛋白等非特异性吸附，和
[0015] 3.遮蔽磷酸主链的负电荷。
[0016] 第三点可通过使用具有减少的电荷或没有电荷的合成主链来克服。
[0017] 另外，脂质体或复合物需要某些理想的物理性质：
[0018] 1.良好的稳定性，不论是在盐溶液或生物液中。这可用测量颗粒之间的吸引或排斥的ξ-电位来定量；
[0019] 2.窄的大小分布，对于细菌理想地在介于50和100nm之间；
[0020] 3.较低的毒性，尽管大多数转染剂(脂质、亲脂性阳离子)显示中等水平的毒性；
[0021] 4.能够实际生产，考虑诸如货物成本的问题。
[0022] 通常已知用于真核递送的肽透化膜，经由靶细胞上的特异性受体穿透细胞，或简单地是阳离子(如聚精氨酸)。使用具有细胞穿透性质的肽具有几种优点，这主要是由于可以对肽序列进行各种修饰。这允许工程化定位不同细胞亚域和/或能够转运不同类型的货物的载体。
[0023] 一类膜易位剂是细胞穿透肽(CPP)。除了是体外进入不同细胞器的温和且有效的工具之外，CPP已用于几种剂的体内细胞递送，具有有希望的结果。
[0024] CPP通常由少于30个氨基酸组成，具有净正电荷，且能够易位穿过质膜和以看似能量依赖的方式转运几种货物进入细胞质和核。易位经由不受各种内吞抑制剂或低温影响的目前未知的机制发生(Langel， 编(2002)Cell-Penetrating Peptides，Processes and Applications，CRC Press)。
[0025] 术语CPP包括合成的细胞穿透肽、蛋白转导结构域和膜易位序列，其全部具有易位穿过细胞膜和进入细胞内部的能力。
[0026] 具有实现递送至尤其是细菌的潜能的其他类别的肽是具有抗细菌性质的那些肽。这些肽包括抗微生物肽(AMP)、细胞穿透肽(CPP)、非核糖体合成的那些肽和糖肽。所有这些类型的肽在本文被称为抗细菌蛋白(ABP)。
[0027] AMP可来源于细菌来源，此时它们被称为细菌素，或来自高等真核来源，包括人、两栖类、昆虫等。特别感兴趣的AMP是能够增加生物膜的穿透性或者具有易位穿过膜以到达其细胞内靶标的能力的那些。AMP基于结构相似性一般分为五个不互相排斥的亚组(Brogden，2005 Nat.Rev.Microbiol.3：238-250)：
[0028] 1.阴离子肽是通常与锌复合的小肽，并针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌具有活性；
[0029] 2.通常长度少于40个氨基酸、缺乏半胱氨酸并以两个α-螺旋区之间的中央铰链区为特征的线性阳离子α-螺旋肽(诸如buforin)；
[0030] 3.富集特定氨基酸的阳离子肽，诸如富含脯氨酸和富含精氨酸的蜜蜂抗菌肽(apidaecin)；
[0031] 4.由于在半胱氨酸基团之间形成二硫键而形成β-折叠的阴离子和阳离子肽；
[0032] 5.为较大蛋白质的片段的阴离子和阳离子肽。
[0033] AMP实现微生物杀伤的机制是不同的，并且不局限于某些亚组。绝大多数通过在细菌的膜上形成孔、导致细胞被透化来杀伤细菌。认为存在三种截然不同的透化机制，其可以是肽的特定性质或是所用的肽的浓度的作用：
[0034] 1.形成环形孔，例如，爪蟾抗菌肽(magainin)、蜂毒肽；
[0035] 2.毯状物形成(Carpet formation)，例如，dermaseptin S、杀菌肽或蜂毒肽；
[0036] 3.桶板形成(Barrel stave formation)，例如，丙甲菌素。
[0037] 已描述了几种其中最终靶标不是膜而是细胞内性质的AMP，使得AMP必须易位穿过膜。此易位能力是特别值得关注的，因为这些肽、或基于其建模的合成肽可用于递送可选的货物诸如治疗剂。因此这些AMP可根据其胞内杀伤模式来分类：
[0038] 1.结合核酸，例如，buforin、buforin II和类似物以及速普肽(tachyplesin)；
[0039] 2.胞内内容物的絮凝，例如，阴离子肽；
[0040] 3.隔膜形成，例如，小菌素(microcin)25；
[0041] 4.细胞壁合成，例如，mersacidin；
[0042] 5.抑制核酸合成，例如，pleurocidin和蛙皮抗菌肽(dermaseptin)；
[0043] 6.抑制蛋白质合成，例如，pleurocidin和蛙皮抗菌肽；
[0044] 7.抑制酶活性，例如，蜜蜂抗菌肽。
[0045] 非核糖体合成的肽可以是结构上多样的。它们经常是环化的或分支的，含有非标准氨基酸或已被修饰以产生羟基丙氨酸或羟基丝氨酸的氨基酸，并可进行羟基化、卤化或糖基化(Walsh等(2004)Science303：1805-1810)。这些肽的绝大多数通过透化细菌的膜来抑制细菌生长。
[0046] 向细菌递送肽和核酸的挑战与对真核细胞遇到的那些相似，但是细胞组分是不同的。具体地，细菌不具有内吞机制来帮助将治疗剂移到细胞内。然而，一个明显的优点是细菌不具有核区室，所以将治疗剂递送到细胞质足以使其接近细菌基因组。因此，需要开发真核递送系统的替代系统。这包括发现通过透化膜进入细胞的途径。在实验室环境下，向细胞递送DNA(转染)通过用阴离子缓冲液、最常见的是含有钙离子的缓冲液处理细胞来实现，阴离子缓冲液通过干扰电荷分布破坏细胞膜。可选地，使用电穿孔，其中在具有低电导的缓冲液中制备细胞，并使用高电压来在一些尽管并不是全部细胞的细菌膜上产生瞬时的孔，导致少量细胞的转染。
[0047] 显然在动物模型或临床环境下使用任一种方法向细菌递送DNA治疗剂都是不切实际的。体内转染可通过将治疗剂缀合到已知破坏膜并导致通过随后的孔或挤压进入的合成的阳离子肽或ABP实现。另外，一些ABP易位通过膜的能力是开发可信赖的递送策略的另一替代方案。
[0048] 从使用递送肽的真核模型出发，细菌递送肽的理想特征包括：
[0049] 1.细菌特异性/偏好性，优化用于原核生物而不是真核生物；
[0050] 2.诱发抗性的低可能性。例如，改变其外膜电荷密度的MRSA可抵抗阳离子肽；
[0051] 3.广谱活性，迄今为止用作至细菌的通用递送系统；和
[0052] 4.低或无宿主毒性。
[0053] 相似地，使用脂质样转运分子需要针对细菌膜的特定结构量身定制。例如，革兰氏阴性细菌具有外膜和内膜，在将治疗剂递送至细菌内之前需要克服这两种膜。
[0054] 在这一背景下，本发明提供了核酸序列诸如TFD的制剂和其向细菌的递送的解决方案。
[0055] 具体地，本发明在于一种抗细菌复合物，该抗细菌复合物包含核酸序列和一种或多种递送部分。本发明人已发现自身具有一些抗细菌活性的递送部分是理想的。具体地，一种或多种递送部分当与核酸序列组合时应显示协同的抗细菌作用。换言之，递送部分和核酸序列的组合当与核酸序列或递送部分单独的作用相比时应显示增强的抗细菌作用。
[0056] 递送部分可选自季胺化合物和双氨基烷烃类和其不饱和衍生物，其中如本文所用的术语”氨基烷烃类”指形成杂环的一部分的氨基基团(优选地三价氨基基团)。
[0057] 此类化合物的示例是式(I)的化合物：
[0058]
[0059] 其中Q选自：
[0060] (a)具有下式的基团Q1：
[0061]
[0062] 和
[0063] (b)基团Q2、Q2-NH-、Q2-O-或Q2-S-，其中Q2选自具有5至14个环元的单环、双环和三环杂芳族基团，其中1、2或3个是选自N、O和S的杂原子环元，条件是存在至少一个氮4a
环元，其中所述杂芳族基团任选地被一个或两个取代基R 取代，且其中所述一个氮环元可形成N-氧化物或可被C1-4烷基、苯基-C1-4烷基或二-苯基-C1-4烷基取代以形成四价基团，其中在所有情况下所述苯基部分任选地被一个或两个卤素、甲基或甲氧基基团取代；
环元，其中所述杂芳族基团任选地被一个或两个取代基R 取代，且其中所述一个氮环元可形成N-氧化物或可被C1-4烷基、苯基-C1-4烷基或二-苯基-C1-4烷基取代以形成四价基团，其中在所有情况下所述苯基部分任选地被一个或两个卤素、甲基或甲氧基基团取代；
[0064] m是0或1；
[0065] n是0或1；
[0066] p和q是相同的或不同的，且每一个均是1至12的整数；
[0067] A是键或选自萘、联苯基、萜苯基、菲、芴、芪、基团C6H4(CH2)rC6H4、基团C6H4-C≡C-C6H4、吡啶-2，6-二基-双(苯-1，4-二基)基团、基团CH＝CH-(CH2)s-(CH＝CH)t-；和基团C≡C-(CH2)u-(C≡C)v-；其中r是0-4，s是0至4，t是0或1；u是0-4和v是0或1；
[0068] 当n是1时，R0、R1和R2各自选自C1-4烷基；且当n是0时，则N、R1和R2一起形成具有5至14个环元的单环、双环或三环杂芳族基团，其中一个是氮原子N，且0、1或2个也4b
是选自N、O和S的杂原子环元，并且其中所述杂芳族基团任选地被一个或两个取代基R 取
3 4c
代；且R 选自氢、C1-4烷基、卤素、具有各自任选地被一个或两个取代基R 取代的3至7个
2 2 2 4a 4b 4c
环元的单环碳环基团、基团Q；基团-NH-Q、基团-O-Q 和基团-S-Q ；且R 、R 和R 是相同的或不同的，且各自选自任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基：任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；卤素；苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取代；脲基和胍基。
是选自N、O和S的杂原子环元，并且其中所述杂芳族基团任选地被一个或两个取代基R 取
3 4c
代；且R 选自氢、C1-4烷基、卤素、具有各自任选地被一个或两个取代基R 取代的3至7个
2 2 2 4a 4b 4c
环元的单环碳环基团、基团Q；基团-NH-Q、基团-O-Q 和基团-S-Q ；且R 、R 和R 是相同的或不同的，且各自选自任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基：任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；卤素；苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取代；脲基和胍基。
[0069] 在一个优选的实施方案中，Q是基团Q1：
[0070]
[0071] 因此，式(I)内的一个优选的化合物亚组由式(II)表示：
[0072]
[0073] 其中R1、R2、m、p、A、q和R3如关于式(I)所定义的。
[0074] 其中R3是Q1且n在所有情形下是0的式(II)内的一个优选的化合物亚组可由式(III)表示：
[0075]
[0076] 其中R1、R2、m、p、A和q如关于式(I)所定义的。
[0077] 在式(I)、(II)和(III)的化合物中，当m是1时，氮原子N必须是四价氮。因此，其中m是1的式(I)、(II)和(III)的化合物将包含一种或多种阴离子作为反荷离子，例如来自矿物酸、磺酸和羧酸的阴离子。
[0078] 当N、R1和R2一起形成具有5至14个环元的单环、双环或三环杂芳族基团时，该基团通常含有氮原子N作为唯一的杂原子环元或含有选自N、O和S的第二杂原子环元。
[0079] 当N、R1和R2一起形成单环、双环或三环杂芳族基团时，氮原子N形成芳族环的一部分。优选的杂芳族基团是单环芳族环；其中两个环均是芳族环的双环杂环；其中一个含氮环是芳族环而另一个环是非芳族环的双环杂环；和其中包括含氮环在内两个环是芳族环而另一个环是非芳族环的三环。
[0080] 当N、R1和R2一起形成具有5至14个环元的单环、双环或三环杂环基团时，该杂环基团优选地选自喹啉；异喹啉；吖啶；四氢吖啶和其环同系物；吡啶；苯并咪唑；苯并噁唑和苯并噻唑。所谓四氢吖啶的环同系物意指含有以下核心结构的化合物：
[0081]
[0082] 其中y是1或3。所述四氢吖啶意指具有其中y是2的以上核心结构的化合物。
[0083] 在优选的实施方案中，递送部分是喹啉或吖啶的四价衍生物，特别是1，2，3，4-四氢-9-氨基-吖啶。1，2，3，4-四氢-9-氨基-吖啶的合适衍生物描述于US 3519631，其内容通过引用并入本文。尤其感兴趣的是US 3519631的实施例17至25中示例的化合物和式以及其类似物。合适的喹啉衍生物是双喹啉鎓(bis-quinolinium)化合物，诸如地喹胺(dequalinium)及其类似物。
[0084] 地喹胺(图1)是双喹啉鎓化合物，具有温和的抗微生物性质，并已作为抗微生物剂在非处方漱口水、局部软膏剂、口腔和阴道涂剂和咽喉痛锭剂中使用30年。它是局部抑菌剂并还作为钙通道抑制剂、抗真菌剂(Ng等(2007)Bioorg.Medicinal Chem.15：3422-3429)、结核病抑制剂(Guiterrez-Lugo等(2009)J.Biomol.Screen.14：643-652)和作为蛋白激酶C抑制剂(PKC；Abeywickrama等(2006)Bioorg.Medicinal Chem.14：
7796-7803)进行了测试。
7796-7803)进行了测试。
[0085] 地喹胺还已在体外实验中用于递送基于DNA的治疗剂和传统药物诸如paxcitol至线粒体。在这些实验中，地喹胺通过干膜法制备为bolasome。即，将地喹胺溶解在有机溶剂诸如甲醇中，在真空中完全干燥，然后重悬于水溶液中，由此进行声处理以形成bolasome，随后将其与DNA混合以形成复合物。已显示这些复合物能够通过被认为涉及复合物与线粒体外膜融合的机制递送DNA到线粒体(Weissig和Torchilin 2001 Adv.Drug Delivery Rev.49：127-149；Weissig等2001 J.Control.Release 75：401-408)。虽然线粒体的膜结构与细菌中发生的膜结构不同，但是其是相似的。这增加了在体内环境中地喹胺可适于递送治疗剂至细菌的可能性。然而，与地喹胺形成的复合物在生理缓冲液和生物液以及稀释存在下是随时间不稳定的。
[0086] 因此，在特别优选的实施方案中，复合物包含地喹胺类似物。以这种方式，可能设计具有增强的稳定性(对稀释和盐的存在)但又具有与地喹胺相似或改进的毒性特征的地喹胺化合物。已描述这种类似物形成更稳定的复合物(化合物7，Galanakis等[J.Med.Chem.(1995)35：3536-3546])，如通过诸如以下的各种物理化学参数所测试的：结合DNA以排除荧光染料SYBR-green的能力、通过动态光散射(Dynamic Light Scattering)测量和用电子显微术观察的所形成的粒径和它们在高浓度盐以及稀释和长期储存下的稳定性(Weissig等(2001)S.T.P.Pharma Sciences 11：91-96)。
[0087] 地喹胺和其类似物的实例是式(IV)的化合物：
[0088]
[0089] 其中：
[0090] p和q是相同的或不同的，且各自是是1至12的整数；
[0091] A是键或选自萘、联苯基、萜苯基、菲、芴、芪、基团C6H4(CH2)rC6H4、基团C6H4-C≡C-C6H4、吡啶-2，6-二基-双(苯-1，4-二基)基团、基团CH＝CH-(CH2)s-(CH＝CH)t-；和基团C≡C-(CH2)u-(C≡C)v-；其中r是0-4，s是0至4，t是0或1；u是0-4且v是0或1；
[0092] R8、R9和R10是相同的或不同的，且各自选自氢；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；卤素、苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取代；脲基和胍基；或R9和R10连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5；且R8a、R9a和R10a是相同的或不同的，且各自选自氢；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基：任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；卤素、苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取代；脲基和胍基；或R9a和R10a连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5。
[0093] 在式(IV)内，一个化合物子集是其中A是键、基团CH＝CH-(CH2)s-(CH＝CH)t-；或基团C≡C-(CH2)u-(C≡C)v-的子集。在该子集内，优选地A是键，即两个喹啉环的氮原子之间伸展有饱和亚烷基链。
[0094] 当A是键时，通常p和q的和在3至22的范围内，优选地在6至20的范围内，且更优选地在8至18的范围内。具体的实例是其中p+q＝8、或p+q＝9、或p+q＝10、或p+q＝11、或p+q＝12、或p+q＝13、或p+q＝14、或p+q＝15、或p+q＝16、或p+q＝7或p+q＝18的化合物。
[0095] 在每个前述实施方案和化合物子集中，R8和R8a优选地各自选自氢；C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；和胍基。
[0096] 更优选地，R8和R8a各自选自氢；C1-4烷氧基；氨基和胍基。
[0097] 又更优选地、R8和R8a各自选自甲氧基和氨基。
[0098] 在一个实施方案中，R8和R8a均是氨基。
[0099] 在另一实施方案中，R8和R8a均是甲氧基。
[0100] 在另一实施方案中，R8和R8a均是胍基。
[0101] 在每个前述实施方案和化合物子集中，优选地：
[0102] R9是氢；
[0103] R9a是氢；
[0104] R10选自氢；氨基；和任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；
[0105] R10a选自氢；氨基；和任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；
[0106] 或R9和R10连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5；和/或[0107] R9a和R10a连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5。
[0108] 更优选地：
[0109] R9是氢；
[0110] R9a是氢；
[0111] R10选自氢；氨基；甲基和三氟甲基；
[0112] R10a选自氢；氨基；甲基和三氟甲基；
[0113] 或R9和R10连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5：和/或[0114] R9a和R10a连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5。
[0115] 在式(IV)内一个特别优选的化合物组中：
[0116] A是键；
[0117] p和q的和在8至18范围内；
[0118] R8和R8a各自选自氢；C1-4烷氧基；氨基和胍基；
[0119] R9是氢；
[0120] R9a是氢；
[0121] R10选自氢；氨基；和任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；
[0122] R10a选自氢；氨基；和任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；
[0123] 或R9和R10连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5：和/或[0124] R9a和R10a连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5。
[0125] 在式(IV)内另一个特别优选的化合物组中：
[0126] A是键；
[0127] p和q的和在8至18范围内；
[0128] R8和R8a各自为胍基；
[0129] R9是氢；
[0130] R9a是氢；
[0131] R10选自氢；氨基；和任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；
[0132] R10a选自氢；氨基；和任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；
[0133] 或R9和R10连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5：和/或[0134] R9a和R10a连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5。
[0135] 在式(IV)内另一个特别优选的化合物组中：
[0136] A是键；
[0137] p和q的和在8至18范围内；
[0138] R8和R8a各自选自氢；C1-4烷氧基和氨基；
[0139] R9是氢；
[0140] R9a是氢；
[0141] R10选自氢；氨基；和任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；
[0142] R10a选自氢；氨基；和任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；
[0143] 或R9和R10连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5：和/或[0144] R9a和R10a连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5。
[0145] 在该组内，更优选的化合物是其中以下的那些：
[0146] A是键；
[0147] p和q的和在8至18范围内；
[0148] R8和R8a各自选自氢；甲氧基和氨基；
[0149] R9是氢；
[0150] R9a是氢；
[0151] R10选自氢；氨基；甲基；和三氟甲基；
[0152] R10a选自氢；氨基；甲基；和三氟甲基；
[0153] 或R9和R10连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5：和/或[0154] R9a和R10a连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5。
[0155] 在式(IV)内，一个优选的化合物组可由式(V)表示：
[0156]
[0157] 其中：
[0158] r是2至24的整数；
[0159] R8、R9和R10是相同的或不同的，且各自选自氢；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；卤素、苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取9 10
代基取代；脲基和胍基；或R 和R 连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5；且
8a 9a 10a
R 、R 和R 是相同的或不同的，且各自选自氢；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基：任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；
卤素、苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取
9a 10a
代；脲基和胍基；或R 和R 连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5；
代基取代；脲基和胍基；或R 和R 连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5；且
8a 9a 10a
R 、R 和R 是相同的或不同的，且各自选自氢；任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷基：任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基；硝基；氨基；单-和二-C1-4烷基氨基；
卤素、苯基-C1-2烷基，其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、甲基或卤素取代基取
9a 10a
代；脲基和胍基；或R 和R 连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是3至5；
[0160] 条件是：
[0161] (i)当R10和R10a均是氢或均是甲基，且R9和R9a均是氢时，则R8和R8a中的至少一个不是氢、氨基或二甲基氨基；和
[0162] (ii)当R9和R10连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是4，和R9a和R10a连接8 8a
在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是4时，则R 和R 中的至少一个不是氨基。
在一起以形成亚烷基链(CH2)w，其中w是4时，则R 和R 中的至少一个不是氨基。
[0163] 优选地，r是8至20、更优选地10至18的整数，例如10、12、13、14、15、16、17和18中的任一个。
[0164] 在式(V)内的一组化合物中，R8和R8a选自甲氧基和胍基。在该组化合物内，R9和9a 10 10a
R 通常均是氢，且R 和R 通常选自氢、甲基、三氟甲基和氨基。
R 通常均是氢，且R 和R 通常选自氢、甲基、三氟甲基和氨基。
[0165] 在式(V)内的另一组化合物中，R8和R8a选自氢、氨基、单-和二-C1-4烷基氨基；甲9 9a 10 10a
氧基和胍基；R 和R 均是氢，且R 和R 均是三氟甲基。
氧基和胍基；R 和R 均是氢，且R 和R 均是三氟甲基。
[0166] 在另一实施方案中，类似物可以是10，10’-(癸烷-1，10-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二氯化物(图2)。该化合物在本说明书中因为在以下文献中的原始表示法被称为化合物7：Galanakis等(J.Med.Chem.(1995)35：3536-3546)，其中研究了它作为钙通道的潜在抑制剂。该化合物随后被作为用于递送DNA治疗剂至线粒体的剂进行测试(Weissig等(2001)S.T.P.Pharma Sci.11：91-96)，该出版物中报告了由化合物7类似物形成的复合物的有利稳定性。另一论文(Weissig等(2006)J.Liposome Res.16：249-264)报告化合物7类似物与地喹胺相比在体外具有较低毒性。
[0167] 因为具有较长烷基链的地喹胺类似物显示甚至更低的毒性，所以考虑了具有不同链长度的类似物(Weissig等(2006)J.Liposome Res.16：249-264)。因此，优选地，地喹胺类似物的烷基链具有8至14个甲基基团，但是链的实例含有少至3个甲基基团(Galankis等(1996)J.Med.Chem.39：3592-3595)而其他亲脂性阳离子在烷基链中含有多达36个甲基基团(Eaton等(2000)Angew.Chem.Int.Ed.39：4063-4067)。更优选地，烷基链具有10或12个甲基基团。作为结果，化合物7的类似物被设计为在烷基链中具有12个甲基基团，在下文称为化合物7_12。
[0168] 另一合适的类似物是10，10’-(十二烷-1，12-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二氯化物(图3)，下文称为化合物7_12。化合物7_12衍生自化合物7并具有C12烷基链，而不是化合物7的C10烷基链。
[0169] 地喹胺的其他合适的类似物包括：
[0170] 1-癸烷基-2-甲基-4-氨基喹啉碘化物
[0171] 1-丁基-2-甲基-4-氨基喹啉碘化物
[0172] 1，1，1-三乙基-1-(10-碘代癸烷-1-基)铵碘化物
[0173] 1-[1-(N，N，N-三乙基铵-1-基)-2-甲基-4-氨基喹啉二碘化物
[0174] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(4-氨基吡啶)二碘化物
[0175] 1-(4-戊炔-1-基)-4-氨基吡啶氯化物
[0176] 1，1’-(癸-4，6-二炔-1，10-二基)双(4-氨基吡啶)二氯脱水物
[0177] 2，2’-N，N’-(癸烷-1，10-二基)双(2，4-二氨基嘧啶)[化合物8][0178] 2，2’-N，N’-(癸烷-1，10-二基)双(2-氨基嘧啶)
[0179] 2，2’-N，N’-(癸烷-1，10-二基)双(1-甲基-2-氨基吡啶)二碘化物[0180] 1-(4-戊炔-1-基)-2-甲基-4-氨基喹啉碘化物
[0181] 1，1’-(癸-4，6-二炔-1，10-二基)双(4-氨基-2-甲基喹啉)二碘化物水合物[0182] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(喹啉)二碘化物
[0183] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二溴化物水合物[0184] 2，2’-(癸烷-1，10-二基)双(喹啉)
[0185] 2，2’-(癸烷-1，10-二基)双(1-甲基喹啉)二碘化物水合物
[0186] 2，2’-(癸烷-1，10-二基)双(4-甲氧基喹啉)
[0187] 2，2’-(癸烷-1，10-二基)双(1-甲基-4-甲氧基喹啉)二碘化物
[0188] 2，2’-(十二烷-1，12-二基)双(1-甲基喹啉)二碘化物
[0189] 2，2’-(癸烷-1，10-二基)双(异喹啉)二碘化物
[0190] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(4-溴代异喹啉)二碘化物
[0191] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(1H-苯并咪唑)
[0192] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(3-甲基苯并咪唑)二碘化物半水合物[0193] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(2-甲基苯并咪唑)
[0194] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(2，3-二甲基苯并咪唑)二碘化物
[0195] 1，10-双[N-(吖啶-9-基)氨基]癸烷二盐酸二水合物
[0196] 1，1’-(1，10-癸烷二基)双[4-氨基-2-甲基喹啉]二碘化物
[0197] 1，1’-(1，10-癸烷二基)双[4-氨基喹啉]二碘化物
[0198] 1，1’-(1，10-癸烷二基)双[4-N，N，二甲基氨基喹啉]二碘化物[0199] 1，1’-(1，10-癸烷二基)双[2-甲基喹啉]二碘化物
[0200] 1，1’-(1，10-癸烷二基)双[喹啉]二碘化物
[0201] 1，6-双[N-(1-甲基喹啉-2-甲基)氨基]己烷二碘化物
[0202] 1，1’-(1，10-癸烷二基)双[1-氨基异喹啉]二碘化物
[0203] 1，1’-(1，10-癸烷二基)双[2-甲基苯并噁唑]二碘化物
[0204] 1，1’-(1，10-癸烷二基)双[2-甲基苯并噻唑]二碘化物
[0205] 1，1’-(1，10-癸烷二基)双[2-氨基-1-甲基苯并咪唑]二碘化物
[0206] 1，1’-[(E)-5-癸烯-1，10-二基]双[4-氨基-2-甲基喹啉]，二碘化物[0207] 1，1’-[(Z)-5-癸烯-1，10-二基]双[4-氨基-2-甲基喹啉]，二碘化物[0208] 1，1’-(1，12-十二烷二基)双[4-氨基-2-甲基喹啉]，二碘化物
[0209] 1，1’-(1，14-十四烷二基)双[4-氨基-2-甲基喹啉]，二碘化物
[0210] 1，1’-(1，16-十六烷二基)双[4-氨基-2-甲基喹啉]，二碘化物
[0211] N-癸基-4-氨基奎哪啶碘化物
[0212] 1，1’-[联苯基-3，3’-二基双(亚甲基)]-双(4-氨基喹啉)
[0213] 二溴化物水合物(4)，1，1’-[联苯基-4，4’-二基双(亚甲基)]双(4-氨基喹啉)二三氟乙酸酯
[0214] 1，1’-(菲-3，6--二基双(亚甲基)]双(4-氨基喹啉)二溴化物水合物乙酸酯[0215] 1，1’-[芴-2，7-二基双(亚甲基)]-双(4-氨基喹啉)二三氟乙酸
[0216] 1，1’-[亚甲基双(苯-1，4-二基亚甲基)]双(4-氨基喹啉)二溴化物水合物[0217] 1，1’-[亚乙基双-(苯-1，4-二基亚甲基)]双(4-氨基喹啉)二溴化物水合物[0218] (Z)-1，1’-[芪-4，4’-二基双(亚甲基)]-双(4-氨基喹啉)二溴化物倍半水合物
[0219] (E)-1，1’-[芪-4，4’-二基双(亚甲基)]双-(4-氨基喹啉)二溴化物二水合物[0220] 1，1’-[乙炔-1，2-二基双(苯-1，4-二基亚甲基)]双(4-氨基喹啉)二溴化物倍半水合物
[0221] 1，1’-[丙烷-1，3-二基双(苯-1，4-二基亚甲基)]双(4-氨基喹啉)二溴化物半水合物乙酸酯
[0222] 1，1’-[吡啶-2，6-二基双(苯-1，4-二基亚甲基)]-双(4-氨基喹啉)二溴化物水合物
[0224] 1，1’-[1，1：4’，1”-萜苯基-4，4”-二基双(亚甲基)]双(4-氨基喹啉)二溴化物三水合物
[0225] 1，1’-[萘-2，6-二基(双(亚甲基)]双(4-氨基喹啉)二溴化物水合物[0226] 1，1’-[苯-1，4-二基双(亚甲基)]-双(4-氨基喹啉)二溴化物二水合物[0227] 1，1’-[苯-1，3-二基双(亚甲基)]双(4-氨基喹啉)二溴化物半水合物[0228] 1，1’-(丙烷-1，3-二基)双(4-氨基喹啉)二碘化物
[0229] 1，1’-(丁烷-1，4-二基)双(4-氨基喹啉)二碘化物
[0230] 1，1’-(戊烷-1，5-二基)双(4-氨基喹啉)二碘化物
[0231] 1，1’-(己烷-1，6-二基)双(4-氨基喹啉)二碘化物
[0232] 1，1’-(辛烷-1，8-二基)双(4-氨基喹啉)二碘化物
[0233] 1，1’-(十二烷-1，12-二基)双(4-氨基喹啉)二溴化物半水合物
[0234] 1，10-双[N-(2-甲基喹啉-4-基)氨基]癸烷
[0235] 1，12-双[N-(2-甲基喹啉-4-基)氨基]十二烷
[0236] 1，10-双[(2-甲基喹啉-4-基)氨基]癸烷
[0237] 1，12-双[(2-甲基喹啉-4-基)氨基]十二烷
[0238] 1，10-双(N-喹啉-4-基氨基)癸烷
[0239] 4，4’-[癸烷-1，10-二基双(氧)]双[喹啉]
[0240] 4，4’-[癸烷-1，10-二基双(硫)]双[喹啉]
[0241] 4，4’-十二烷-1，12-二基双[喹啉]
[0242] 1，8-双(N-喹啉-4-基二氨基)辛烷
[0243] 1，8-双[N-(1-甲基喹啉-4-基)氨基]辛烷二碘化物水合物
[0244] 1，10-双[N-(1-甲基喹啉-4-基)氨基]癸烷二碘化物
[0245] 4，4’-[癸烷-1，10-二基双(氧)]双[1-甲基喹啉]二碘化物
[0246] 4，4’-[癸烷-1，10-二基双(硫)]双[1-甲基喹啉]二碘化物水合物(10).[0247] 1，1’-二甲基-4，4’-十二烷-1，12-二基双[喹啉]二碘化物
[0248] 4，4’-癸烷-1，10-二基双[喹啉]
[0249] 1，1’-二甲基-4，4’-癸烷-1，10-二基双[喹啉]二碘化物
[0250] 1，10-双[N-(1-苄基喹啉-4-基)氨基]癸烷二溴化物
[0251] 1，10-双[N-(1-苄基-2-甲基喹啉-4-基)氨基]-癸烷双(三氟乙酸酯)[0252] 1，12-双[N-(1-苄基-2-甲基喹啉-4-基)氨基]-十二烷双(三氟乙酸酯)[0253] 1-[N-(1-苄基-2-甲基喹啉-4-基)氨基]-10-[N’-(2-甲基喹啉-4-基)氨基]癸烷双(三氟乙酸酯)
[0254] 1-[N-(1-苄基-2-甲基喹啉-4-基)氨基]-12-(N’-(2-甲基喹啉-4-基)氨基]十二烷双(三氟乙酸酯)-3，5-二甲氧基苄基碘化物
[0255] 1，10-双[N-[1-(3，5-二甲氧基苄基)-2-甲基喹啉-4-基]氨基]癸烷双(三氟乙酸酯)
[0256] 1-[N-[1-(3，5-二甲氧基苄基)-2-甲基喹啉-4-基]氨基]-10-[N’-2-甲基喹啉-4-基)氨基]癸烷双(三氟乙酸酯)
[0257] 1，1’-(3-碘代亚丙基)双[苯]
[0258] 1，10-双[N-[1-(3，3-二苯基丙-1-基)-2-甲基喹啉-4-基]氨基]癸烷双(三氟乙酸酯)
[0259] 4，7-二氯-1-甲基喹啉碘化物
[0260] 1，10-双[N-(7-氯-1-甲基喹啉-4-基)氨基]-癸烷二碘化物二水合物。
[0261] 地喹胺和其盐是可商业获得的，例如从(Sigma Aldrich)。制备合适的类似物的方法描述于WO 97/48705，Galanakis等(1995)J.Med.Chem.38：595-606，Galanakis等(1995)J.Med.Chem.38：3536-3546 和 Galanakis 等 (1996)J.Med.Chem.39：3592-3595，Abeywickrama等(2006)Bioorganic MedicinalChem.14：7796-7803，Qin等(2000)J.Med.Chem.43：1413-1417，Campos Rosa等(1996)J.Med.Chem.39：4247-4254，其内容通过引用并入本文。具体地，化合物7的合成描述于Galanakis等(1995)，上文，并且化合物7_12的合成可由其衍生。
[0262] 式(IV)和(V)的化合物可通过与用于制备地喹胺的已知方法类似的方法制备，如以上所描述和参考的。
[0263] 例如，式(IV)和(V)的化合物可通过使式(VI)的喹啉化合物与式I-(CH2)r-I的化合物反应制备：
[0264]
[0265] 反应通常在高温，例如120℃至160℃范围内，如约150℃左右进行。
[0266] 式(VI)的喹啉化合物是可商业获得的，或可通过技术人员熟知的标准方法或与其类似的方法制备，参见例如Advanced Organic Chemistry，Jerry March，第4版，John Wiley & Sons，1992，Organic Syntheses，第1-8卷，John Wiley，Jeremiah P.Freeman编著(ISBN：0-471-31 192-8)，1995，Fiesers’Reagents for Organic Synthesis，第1-17卷，John Wiley，Mary Fieser编著(ISBN：0-471-58283-2)，和Handbook of Heterocyclic Chemistry，A.R.Katritzky等，第3版，Elsevier，2010。
[0267] 其中R8是氨基且R9和R10连接在一起以形成亚烷基链(CH2)w的式(VI)化合物可借助于以下反应顺序制备：
[0268]
[0269] 然后可通过标准方法将氨基基团转化成其他官能团，例如通过重氮化然后进行Sandmeyer反应。
[0270] 核酸序列可以是寡核苷酸序列或多核苷酸序列。寡核苷酸序列一般认为是通过磷酸二酯键连接的多达20个核苷酸的线性序列，而多核苷酸序列通常具有多于20个核苷酸，并可以是具有不同量的内部折叠的单链或双链。主链还可以进行修饰以并入已知减少分子的电荷或增加其在生物液中的稳定性的合成化学物质。这些的实例包括肽核酸(PNA)、锁核酸(linked nucleic acid，LNA)、吗啉代寡核苷酸和硫代磷酸酯核苷酸以及这些的组合。
[0271] 在一个实施方案中，核酸序列包含转录因子的天然细胞结合位点的序列。这种序列称为转录因子诱饵(TFD)。优选地，诱饵包含细菌Sig结合位点的序列。可选地，诱饵包含细菌Fur结合位点的序列。
[0272] 合适的TFD序列的实例以SEQ ID NO：11、12、13、32、33、39、40、41、42、43和44提供。
[0273] TFD在纳摩尔浓度有效，并且在体外和体内在低至1nM的浓度下有效阻止细菌生长，尽管预期针对某些细菌和在更复杂的环境下，诸如在患者中，可能需要更高的浓度。所以，优选的范围将因此是介于约10至100nM之间，并高达大约1μM。应理解，该范围涵盖以下浓度：介于约10nM至1μM之间，诸如20nM、20nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、150nM、200nM、500nM、750nM及其中间浓度，例如27.2nM。
[0274] 当递送部分是式(I)至(V)中任一项的化合物诸如地喹胺或其类似物时，使用核酸和化合物(如地喹胺或其类似物)的不同比例在二者之间形成复合物。该比例通常称为N/P比(例如参见Zhao等(2007)Biomacromolecules 8：3493-3502)，其定义了递送分子中带正电荷的氮原子/核酸中带负电荷的磷酸原子、或当不存在磷酸原子时递送分子中带正电荷的氮原子/核苷酸。通常以介于0.1至1之间的N/P比(其足以实现电荷中和)在地喹胺(或其类似物)和TFD之间形成复合物。应理解，本发明涵盖0.1和1之间的比例，诸如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和其中间比例，如0.23。
[0275] 能够体外转染细菌的复合物在动物研究中是良好耐受的。而且，此类复合物的组分可以以低于其已知的最大耐受剂量(MTD)的浓度使用。最大耐受剂量(MTD)是不会引起明显毒性的最高日剂量。MIC可通过动物研究评估为当施用给一组测试动物时对长期存活性没有可测量的影响的化合物的量。例如，施用含有1μM的N/P比为1的100个核苷酸的TFD的复合物将产生大约3mg/kg地喹胺类似物的剂量。应理解，此地喹胺类似物剂量显著低于地喹胺的MTD。地喹胺的类似物诸如化合物7显示比地喹胺更低的体外毒性(Weissig等(2006)J.Liposome Res.16：249-264)。因为地喹胺在小鼠中具有15mg/kg的MTD(Gamboa-Vujicic等(2006)J.Pharm.Sci.82：231-235)，预测复合物应该被良好耐受。计算和制备合适的浓度在技术人员的合理技能和知识范围之内。
[0276] 在可选的实施方案中，抗细菌复合物包含核酸序列和抗细菌肽。术语抗细菌肽包括并涵盖抗微生物肽、细胞穿透肽、非核糖体合成肽和糖肽。
[0277] 抗微生物肽(AMP；也称为宿主防御肽)是多样和分布广泛的古老和天然的抗微生物剂。它们是先天免疫应答的进化保守组分，并发现于所有类别的生命中。可代表抗微生物肽的靶标的原核和真核细胞之间存在根本差异。这些肽是展示出新型治疗剂潜能的有效的、广谱的抗生素。已显示抗微生物肽杀伤革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌(包括对传统抗生素具有抗性的菌株)、分枝杆菌(包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、有包膜病毒和真菌。与大多数传统抗生素不同，抗微生物肽似乎还可具有通过作为免疫调节剂起作用而增强免疫性的能力。
[0278] 抗微生物肽一般介于12和50个氨基酸之间。这些肽包括两个或多个由精氨酸、赖氨酸提供的或在酸性环境中由组氨酸提供的带正电荷的残基和很大比例(一般＞50％)的疏水残基。这些分子的二级结构遵循四种主题，包括i)α-螺旋、ii)由于两个或多个二硫键的存在的β-链、iii)由于单个二硫键的存在和/或肽链的环化的β-发夹或环和iv)延伸。这些肽中的许多肽在自由溶液中是无结构的，并在分配到生物膜中后折叠成其最终构型。肽含有沿螺旋分子的一侧排列的亲水性氨基酸残基和沿另一侧排列的疏水性氨基酸残基。抗微生物肽的这种两亲性允许肽分配到膜脂质双层中。这些肽具有从膜通透性至作用于多种细胞质靶标的多种抗微生物活性。
[0279] 抗微生物肽杀伤细菌的作用模式是多样的，并包括破坏膜、干扰代谢和靶向细胞质组分。肽和靶生物体之间的初始接触将是静电性的，因为大多数细菌表面是阴离子的。其氨基酸组成、两亲性、阳离子电荷和尺寸允许它们粘附并插入到膜双层中以通过‘桶-衬里(barrel-stave)’、’毯(carpet)’或’环形-孔(toroidal-pore)’机制形成孔。细胞被穿透后，肽与对细胞存活关键的胞内分子结合，由此抑制细胞壁合成，改变细胞质膜，激活自溶素，抑制DNA、RNA和蛋白质合成，并抑制某些酶。然而，在许多情形下，杀伤的准确机制是未知的。与许多传统抗生素相反，这些肽显示是杀细菌性的(杀细菌剂)而不是抑菌性的(细菌生长抑制剂)。
[0280] 在细菌细胞和宿主细胞与抗微生物肽的竞争中，抗微生物肽将优先与细菌细胞而不是哺乳动物细胞相互作用，这使得它们能够杀伤微生物而不会对哺乳动物细胞有显著毒性。因为细菌膜的表面比哺乳动物细胞具有更多负电荷，抗微生物肽将显示对细菌膜和哺乳动物细胞膜的不同亲和力。
[0281] 众所周知，胆固醇正常广泛分布于哺乳动物细胞膜中作为膜稳定剂，但是在细菌细胞膜中不存在。这些胆固醇的存在还将通常降低抗微生物肽的活性，这是由于脂双质层的稳定或由于胆固醇和肽之间的相互作用。因此，哺乳动物细胞中的胆固醇将保护该细胞不受抗微生物肽攻击。
[0282] 另外，众所周知，跨膜电位影响肽-脂质相互作用。细胞膜的外侧小叶和内侧小叶之间存在负的跨膜电位。这一内部负跨膜电位很可能通过促进带正电荷的肽插入到膜中而促进膜透化。比较而言，细菌细胞的跨膜电位与正常哺乳动物细胞的跨膜电位相比是更负的，所以细菌膜将易于被带正电荷的抗微生物肽攻击。
[0283] 如上所讨论的，AMP是一组独特且多样的分子，其基于氨基酸组成和结构划分为亚组。许多已知AMP的数据库可发现于http：//www.bbcm.units.it/～tossi/pag1.htm。具有抗感染性质的其他肽组包括非核糖体肽，其实例包括短杆菌肽，以及作为一个亚组，其中肽(其通常为环状的)被糖基化的糖肽抗生素。这些的实例包括多粘菌素。
[0284] 本发明人对所有这些肽进行了功能分类，其在本文中被称为抗细菌肽(ABP)，以基于细菌杀伤机制将它们与AMP区分开来，并包括衍生自其他抗细菌剂类别的肽，诸如细胞穿透肽、非核糖体合成肽和糖肽。应理解，本发明涵盖天然存在的和非天然存在的、合成的肽。
[0285] 第I类。具有膜活性(多粘菌素、短杆菌肽)并通过引起足够的损害以在外膜穿洞和允许细菌内膜形成大分子可通过的突起(或‘泡’)的ABP。这些肽中的几种在临床中使用，但是由于它们也损害真核膜而存在毒性方面的顾虑。
[0286] 针对抗细菌肽的抗性率相当低，并且这些肽在自然界中广泛存在。因为这一类别主要是阳离子性的，所以抗性机制将采取改变细菌外膜的电荷密度的形式，而这种改变已在实验室中被观察到。所以，相对低的抗性发生率可能反映以下事实：ABP不是那么有效而不是难以抵抗。
[0287] 第II类。这一类别小得多。这些ABP不损害膜而是具有细胞内靶标。因此，肽必须易位穿过细菌膜才能到达其靶标。作为结果，它们的毒性显著低于第I类ABP，因为它们不损害真核膜、导致溶血等。尽管它们是阳离子的，但是它们穿过膜的能力预期不仅基于其电荷而且还基于其他更广的结构性质而断定，而这些是未确定的。因此，认为不太可能发生抗性机制，因为此类机制将需要改变细菌膜自身的疏水性质。
[0288] 能够易位的ABP的实例是Buforin和截短形式Buforin II(BF2)。该肽显示针对病原细菌(弱的)广谱的活性(Park等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：8245-8250)。其已用于易位穿过真核膜和甚至递送28 kDa肽(GFP)至人类细胞系(Takeshima等(2003)J.Biol.Chem.278：1310-1315)，尽管这是经由内吞并很可能是由于肽的阳离子性质。
[0289] ABP可以是天然存在的肽，诸如短杆菌肽或Buforin。可选地，ABP可以是肽模拟物或天然存在的肽的合成变体，诸如Buforin II或多粘菌素九肽。
[0290] 具有透化生物膜能力的抗微生物肽的实例提供于Papagianni等((2003)Biotechnol.Adv.21：465-499)并包括防御素、鱼类抗菌肽(pleuricidin)、爪蟾抗菌肽、蛙皮抗菌肽、蜜蜂抗菌肽、天蚕抗菌肽(cecropin)、小菌素和片球菌素(pediocin)。
[0291] 具有透化生物膜能力的抗细菌肽的实例提供于Varra等((1992)Microbiol.Rev.56：395-411)并包括硫醚抗生素(lantibiotic)、糖肽抗生素、阳离子多肽诸如聚赖氨酸和聚精氨酸。
[0292] ABP的类型和特征总结于表1：
[0293]
[0294] ABP可通过静电或共价键与核酸连接。具体地，当ABP的杀伤机制是经由细胞内靶标而不是膜透化时，复合物理想地包括共价键，诸如核酸序列和ABP之间的合适的连接子或交联体。合适的连接子的实例是将羧基基团偶联到伯胺的连接子。例如，合适的连接子可以是EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)。
[0295] EDC因其用作用于偶联伯胺以产生酰胺的羧基活化剂而被已知，并且该碳二亚胺的常见用途是蛋白质与核酸的交联。
[0296] 尽管ABP自身具有抗微生物活性，但是已发现这种肽当与TFD组合时协同地作用以阻止细菌生长。一些ABP具有抑菌作用，而其他的在接触后快速杀伤。已发现该肽的亚致死浓度允许TFD的进入。该肽对细菌造成应激，使得它们更易于受TFD攻击，然后TFD阻断应激，造成生长停滞或细胞死亡。
[0297] 制备复合物以使ABP处于通常比其最低抑制浓度(MIC)低5-10倍的浓度。化合物的MIC是化合物阻止细菌的可见生长的最低浓度。通常通过稀释方法确定MIC，其中将接种的细菌培养物与一系列浓度的化合物孵育过夜，并且阻止生长的浓度被作为MIC。计算和制备合适的浓度在技术人员的合理技能和知识范围内。
[0298] 在又一其他的实施方案中，本发明的抗细菌复合物包含：a)核酸序列，b)季胺化合物或双氨基烷烃、或其不饱和衍生物，其中所述氨基烷烃的氨基组分是形成杂环的一部分的氨基基团，和c)抗细菌肽。
[0299] 换种方式表达，本发明的抗细菌复合物包含：a)核酸序列，b)喹啉或吖啶的四价衍生物，和c)抗细菌肽。
[0300] 在特别优选的实施方案中，抗细菌复合物包含：a)转录因子诱饵，b)地喹胺类似物和任选地，c)抗微生物肽。
[0301] 在又另外的方面，本发明在于以合适的制剂使用本发明的复合物用于治疗一种或多种细菌感染。
[0302] 具体地，本发明提供用于治疗受治疗者中的细菌感染的方法，包括施用如本文描述所配制的核酸序列。受治疗者可以是人或动物。本发明还提供用于药物的如本文描述所配制的核酸序列，如用于治疗或预防受治疗者中的细菌感染，和如本文描述所配制的核酸序列用于制造用于治疗细菌感染的药物的用途。
[0303] 本发明还涉及包含以下的药物组合物或药物：核酸序列、核酸序列、至少一个递送部分，其中所述递送部分选自季胺化合物；双氨基烷烃类和其不饱和衍生物，其中所述氨基烷烃的氨基组分是形成杂环的一部分的氨基基团；以及抗细菌肽和生理上可接受的载体或赋形剂。组合物可另外包含一种或多种抗生素或其他抗细菌化合物或组合物。
[0304] 对所靶向的基因的表达显示预测作用并具有抑菌或杀菌作用所需要的核酸序列的数量可少至大约5000个分子/细胞。已发现多达1,000,000个细菌细胞被少至1nM的TFD有效杀伤(WO/2010/038083)，暗示低于0.001％的转染效率足以实现杀伤。与处理细菌感染的其他基于核酸的策略诸如反义策略相比，杀伤细胞所需要的这一分子数量低100至1000倍。这部分反映出：尽管反义方法和TFD二者均起抑制基因作用，但是TFD在早期步骤起作用来阻止转录，而反义方法在最常见的重复中在空间上阻断转录的产物：成千上万的mRNA分子。第二，TFD已被设计为靶向被正诱导，所以为了存活需要开启，和正调节的关键基因(转录因子驱动自身的产生)。在体外，这后一种特征意味着当基因未被诱导时可能存在相当低拷贝的转录因子，并且因此少量的TFD可阻断诱导。
[0305] 在治疗情形下，由于细菌群体之间的自然多样性或已被诱导的基因，每个细胞可能存在更多的转录因子。在这种情形下，预期将需要更多的TFD以观察到治疗作用，并估计使剂量增至100倍(至100nM)或提高转染效率(两个数量级)将足以观察到有益作用。转染可使用荧光显微术进行定量(Zhang等(1996)J.Mol.Neurosci.7：13-28)。
[0306] 根据本发明的和根据本发明使用的药物组合物可包含，或除活性成分以外还包含：药学上可接受的赋形剂或稀释剂，任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应是无毒的并且不应干扰活性成分的功效。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是药学领域熟知的，并描述于，例如，Remington’Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编著，1985)。载体或其他材料的精确性质将取决于施用途径，其可以是口服、或通过注射，如皮肤、皮下或静脉注射。
[0307] 活性成分定义为与递送部分和抗细菌肽复合(或配制)的核酸序列，诸如TFD，该递送部分是选自以下的递送部分：季胺化合物；双氨基烷烃类和其不饱和衍生物，其中所述氨基烷烃的氨基组分是形成杂环的一部分的氨基。在复合物/制剂中，四价胺化合物、双氨基烷烃类或其不饱和衍生物，诸如地喹胺或其类似物，是bolasome的形式。术语‘bolasome’在本说明书中用于描述化合物经受声处理后形成的衍生物小泡(参见Weissig和Torchilin(2001)Adv.Drug Delivery Rev.49：127-149)。
[0308] 多种方法可用于将本发明的抗细菌复合物递送至细菌感染的部位。用于体内和/或体外递送的方法包括，但不限于：含服或口服递送、静脉递送、直接注射到感染部位或间接注射(如皮下、腹膜内、肌内、或其他注射方法)、局部应用、直接暴露于水溶液或介质溶液、转染(如磷酸钙、电穿孔、基于DEAE-葡聚糖的、和脂质介导的)、转基因表达(如通过显微注射、胚胎干细胞产生、或逆转录病毒转移递送的诱饵表达系统)、或本领域已知的任何其他常用核酸递送系统。施用可与合适剂量的抗生素组合进行，其中抗生素与核酸序列同时、或分开施用。
[0309] 用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或液体形式。片剂可包含固体载体诸如白明胶或佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0310] 对于静脉、皮肤或皮下注射、或在病灶部位的注射，活性成分将是以胃肠外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并具有合适的pH、张力和稳定性。本领域的相关技术人员能够很好地使用例如等渗媒介物诸如氯化钠、林格注射液、乳酸盐林格注射液制备合适的溶液，根据需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
[0311] 对于一些应用，可能不需要药物制剂。例如，本发明的抗细菌复合物可自身作为药物而被耐受，而不需要赋形剂和/或载体。
[0312] 可选地，抗细菌复合物可适合用作抗细菌消毒剂，并因此可能需要合适的含水形式。在该情形下，复合物还可包含含水溶剂和有机溶剂以及它们的组合。
[0313] 本发明的抗细菌复合物可用于治疗多种细菌感染，无论它们发生于人体的什么地方。可描述细菌感染的五个一般区域。
[0315] 在社区和医院实践中一个常见的问题是尿道感染，其中尿被感染，并且抗细菌剂需要进入膀胱、前列腺、输尿管和肾。
[0316] 肠易受感染，其中细菌通过粘膜侵入或毒素产生导致疾病，其实例包括霍乱流行病，并且当使用时，抗生素是摄取的或通过静脉施用的。
[0317] 皮肤和软组织感染是创伤性损伤或烧伤之后常见的，其可通过局部应用来治疗，允许微生物的定殖和内移，造成局部的或快速扩散整个组织的感染。造成皮肤感染的微生物经常来源于正常皮肤菌群，诸如引起表面皮肤感染(脓疱病)的化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、蜂窝织炎(可扩散到血液中的更深位置的感染)和坏死性筋膜炎，坏死性筋膜炎是一种经常威胁生命的进展迅速的感染。
[0318] 最后，中枢神经系统的感染诸如细菌脑膜炎可能是治疗最有挑战的，因为治疗剂必须穿透血脑屏障，同样具有致病性细菌。
[0319] 本发明的抗细菌复合物可与一种或多种抗生素组合使用，核酸序列使得细菌细胞对该抗生素更敏感，和/或可与另一种抗细菌剂组合使用。合适的抗生素描述于共同待决的申请WO 2009/044154和WO2010/038083。应理解，其中提供的列表可能不是详尽的。本发明涵盖任何合适的抗生素或抗细菌化合物或组合物。
[0320] 抗生素或抗细菌化合物可与本发明的抗细菌复合物同时、或在其之前或在其之后施用。抗生素/抗细菌化合物和抗细菌复合物可在同一组合物中或在分开的组合物中施用。因此本发明包括组合疗法，其中本文所鉴定的和/或所描述的抗细菌复合物与一种或多种抗生素或其他抗细菌疗法组合施用于受治疗者。该组合物可另外包含一种或多种抗生素或其他抗细菌化合物或组合物。
[0321] 本发明涵盖的合适的TFD和/或其靶标在下文列出。本文提供的序列说明了结合位点的单链。然而，应理解，在自然界中和在本发明的TFD中，序列将是双链的。本文所列序列的互补链是可清楚且容易地推导的，例如，来自Joseph Sambrook和David Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)，2001的实例。
[0322] WhiB7
[0323] 耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)菌株MC2155中的天然WhiB7结合位点包含：
[0324] 5’-CACCAGCCGA AAAGGCCACG GACCCGCAGT CACCCGGATCCGTGGCCATT TTTGTCGGAC CCCCCGAGAA ATCTGGTCGCAGGATCCATC AGCTCAGACA GATCAC-3’(SEQ ID NO：1)[0325] WhiB7 TFD：
[0326] 5’TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TGG CCT 3’(SEQ ID NO：2)[0327] FadR
[0328] 大肠杆菌(E.coli)K12中的天然FadR结合位点包含以下序列：
[0329] 5’AGTAAGTTTC GAATGCACAA TAGCGTACAC TTGTACGCCGAACAAGTCCG ATCAGCCATT TAA-3’(SEQ ID NO：3)
[0330] FadR TFD序列的一个实例包含
[0331] 5’TTT ATT CCG AAC TGA TCG GAC TTG TTC AGC GTA CAC GTG TTA GCTATC CTG CGT GCT TCA 3’(SEQ ID NO：4)
[0332] YycG/YycF
[0333] 金黄色葡萄球菌(S.aureus)中的YycF和YycG的天然结合位点(在LytM和Ssa启动子中)包含：
[0334] YycF_LytM
[0335] 5’-GCTATTTTGTAATGACAATGTAATGAGTTTAGTAAAAA-3’(SEQ ID NO：5)[0336] YyeF_SsaA
[0337] 5’-ATTACAAATTTGTTAACAGACTTATTTTA-3’(SEQ ID NO：6)
[0338] YycG/YycF TFD序列的实例包括：
[0339] LytM TFD 5’GCT ATT TTG TAA TGA CAA TGT AAT GAG TTT AGT AAA AA 3’(SEQ ID NO：7)
[0340] SsaA TFD 5’ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A 3’(SEQ ID NO：8)[0341] σ54或SigB
[0342] 金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)中的天然结合位点包含：
[0343] SA_sig：5’-TTATTATATA CCCATCGAAA TAATTTCTAA TCTTC-3’(SEQ ID NO：9)[0344] KP_sig：5’-CCGATAAGGG CGCACGGTTT GCATGGTTAT-3’(SEQ ID NO：10)[0345] Fur
[0346] 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中Fur结合的共有序列包含：
[0347] SA_fur：5’-ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TT-3’(SEQ ID NO：11)。共有序列(‘Fur BOX’)如Horsburgh，J.Bacteriology(2001)183：468所述。
[0348] EC_fur：5’-GATAATGATAATCATTATC-3’(SEQ ID NO：12)。共有序列如deLorenzo，J.Mol.Biol.(1998)283：537所述。
[0349] 幽门螺杆菌(H.pylori)中的天然结合序列包含：
[0350] HP_fur：5’-GTT GTC CCA TAA TTA TAG CAT AAA TGA TAA TGA AAA AGTAAA-3’(SEQ ID NO：13)
[0351] TcdR
[0352] 艰难梭菌(C.difficile)中的共有结合位点包含：
[0353] 5’-AAG TTT ACA AAA TTA TAT TAG AAT AAC TTT TTT ATT-3’(SEQ ID NO：14)。共有序列(TcdR，其中-35和-10盒标有下划线)如Dupuy，Mol.Micro.(2006)55：1196所述。
[0354] Vfr
[0355] 铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)中的共有序列和两个天然结合位点是：
[0356] PA_Vfr：5’-AAA TGT GAT CTA GAT CAC ATT T-3’(SEQ ID NO：15)。共有序列如Kanack，Microbiol.(2006)55：1196所述。
[0357] PA_ToxA：5’-CACTCTGCAA TCCAGTTCAT AAATCC-3’(SEQ ID NO：16)[0358] PA_RegA：5’-GTAACAGCGGAACCACTGCACAG-3’(SEQ ID NO：17)
[0359] NtrC
[0360] 肺炎克雷伯氏菌中的天然结合位点包含：
[0361] 5’-GCTTTGCACTACCGCGGCCCATCCCTGCCCCAAAACGATCGCT-3’(SEQ ID NO：18)[0362] ArsR
[0363] 天然结合序列的实例包含：
[0364] HP_AmiE：5’-ATAATCATAA TGATTAAAGT TTTCATATTC ATTATAAATCCGTTTACACA ATTATT-3’(SEQ ID NO：19)
[0365] HP_RocF：5’-GAAATTGTTC TATTTATTAT CCATTTGCTT ATTAATAATTGGTTGTTAAT TTTGGTTTAG A-3’(SEQ ID NO：20)
[0366] 糖肽抗性共有序列(GISA)
[0367] 已知的毒性正调节物tcaA的启动子中发现的共有序列的实例(Maki，Antimicrobial Agents Chemother(2004)48：1953)可用于本发明的抗细菌复合物，例如：
[0368] SA_TcaA：5’-TGAACACCTTCTTTTTA-3’(SEQ ID NO：21)
[0369] AgrA
[0370] 受与毒性相关的调节物Agr正调节的基因中发现的基序的序列的实例(Dunman，J.Bacteriol.(2001)183：7341)是：
[0371] SA_Agr_2093：5’-AGA AAG ACA AAC AGG AGT AA-3’(SEQ ID NO：22)[0372] SA_Agr_1269：5’-GAA GAA ACA AAA AGC AGC AT-3’(SEQ ID NO：23)[0373] 金黄色葡萄球菌Sig TFD的合适引物序列是：
[0374] SAsigB FOR：GAA GAT TAG AAA TTA TTT CGA T GGG TAT ATA ATA A(SEQ ID NO：24)；和
[0375] SASigB REV：TAT TAT ATA CCC ATC GAA ATA ATT TCT AAT CTT C A(SEQ ID NO：25)。
[0376] 金黄色葡萄球菌Fhu TFD的合适引物序列是：
[0377] SAfhu FOR：ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TA(SEQ ID NO：26)；和[0378] SAfhu REV：AGG GTT AAC TAT TAC TAA TAG TAC TTG TAG TA(SEQ ID NO：27)[0379] 金黄色葡萄球菌SsaA TFD的合适引物序列是：
[0380] SsaA FOR：ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A SEQ ID NO：28)；和[0381] SsaA REV：AAA ATA AGT CTGTTA CAA ATT TGT AAT A SEQ ID NO：29[0382] 为了形成Sig哑铃型TFD(称为SA3TFD)，可合成以下磷酸化的寡核苷酸：
[0383] SigDB_SA3：CTTGG TTTTT CCAAG GAA GAT TAG AAA TTA TTT CGA TGGG TAT ATA ATA(SEQ ID NO：30)；和
[0384] SigDE_SA3：P-CCG TCT TTT TGA CGG TAT TAT ATA CCC ATC GAA ATAATT TCT AAT CTT C(SEQ ID NO：31)
[0385] 用于形成WalR_TFD的寡核苷酸对的序列是：
[0386] WalR1：5’-P-CTT GGT TTT TCC AAG TAA TGA ATG AGT TTA AAG CCC ATGTAA AAG GGG TAT CAG TAC-3’(SEQ ID NO：32)；和
[0387] WalR2：5’-P-CCC TCT TTT TGA GGG GTA CTG ATA CCC CTT TTA CATGGG CTT TAA ACT CAT TCA TTA-3’(SEQ ID NO：33)。
[0388] TFD的其他合适引物包括：
[0389] fabBf：5’-tct tta aat ggc tga tcg gac ttg-3’(SEQ ID NO：34)；和[0390] fabBr 5’-agt aag ttt cga atg cac aat agc gta-3’(SEQ ID NO：35)。
[0391] KS54f：P-CCG ATA AGG GCG CAC GGT TTG CAT GGT TAT A(SEQ ID NO：36)；和[0392] KS54r：P-ATA ACC ATG CAA ACC GTG CGC CCT TAT CGG A(SEQ ID NO：37)。
[0393] WalR TFD的共有序列可以是TGT WAW NNN NNT GTA AW(SEQ ID NO：38)，其中：W是A或T。
[0394] SigB TFD的共有序列可以是GKT TWA NNN NNN NNN NNNNNK GGT AW(SEQ ID NO：39)，其中：K是G或T；W是A或T。
[0395] KP sig TFD序列的实例是TGG CAC AGA TTT CGC T(SEQ ID NO：40)[0396] KP_Sig TFD的共有序列可以是TGG NNN NNN WTT TGC W(SEQ ID NO：41)，其中W是A或T。
[0397] 此类TFD可按照共同待决申请WO 2009/044154和WO2009/044154中所描述进行制备和测试。
[0398] 现在将通过非限制性实例和图进一步描述本发明，其中：
[0399] 图1.地喹胺的化学结构。
[0400] 图2.10，10’-(癸烷-1，10-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二氯化物的化学结构。
[0401] 图3.10，10’-(十二烷-1，12-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二氯化物的化学结构。
[0402] 图4.通过动态光散射测量的100μM sC7 bolasome的大小分布。
[0403] 图5.通过动态光散射测量的100μM sC7_12bolasome的大小分布。
[0404] 图6.测量化合物7bolasome与TFD的结合的SYBR Green-DNA结合测定。
[0405] 图7.测量化合物7_12bolasome与TFD的结合的SYBRGreen-DNA结合测定。
[0406] 图8.定量化合物7bolasome和Sig_TFD形成的复合物的稳定性的SYBR Green-DNA结合测定。
[0407] 图9A&9B.化合物7bolasome和Sig TFD形成的TFD复合物的电子显微照片。
[0408] 图10.证明用化合物7形成的Sig复合物对EMRSA-15的生长延迟的体外生物测定。
[0409] 图11.证明用化合物7形成的EC_Fur复合物对大肠杆菌的生长延迟的体外生物测定。
[0410] 图12.证明用化合物7_12形成的Sig复合物对EMRSA-15的生长延迟的体外生物测定。
[0411] 图13.流逝时间对光密度的图，显示发夹Sig TFD/化合物7_12复合物与乱序复合物(scrambled complex)和空白对照对MRSA菌株生长的作用。
[0412] 图14.流逝时间对光密度的图，显示发夹Sig TFD/地喹胺复合物与乱序复合物和空白对照对MRSA菌株生长的作用。
[0413] 图15.显示用SA_Sig TFD/化合物7复合物、SA_Sig TFD/化合物7_12复合物或盐水溶液处理的小鼠的体重增加的图，a)和b)表示实验的独立重复。
[0414] 图16.显示用化合物7_12、SA_Sig TFD/化合物7_12复合物、SA_Sig_Scr TFD/化合物7_12复合物、SA_Sig TFD、万古霉素或媒介物处理小鼠后肾组织负荷的条形图。
[0415] 图17.显示Sig TFD与短杆菌肽混合对EMRSA-15的生长延迟的体外生物测定。
[0416] 图18.显示Sig TFD与Buforin II混合对EMRSA-15的生长延迟的体外生物测定。
[0417] 图19.荧光显微术证实通过用化合物7形成的Buforin II-衍生的复合物向MRSA递送染料标记的寡核苷酸。
[0418] 图20.显示EC_Fur TFD与多粘菌素混合对大肠杆菌的生长延迟的体外生物测定。
[0419] 图21.荧光显微术证实通过用化合物7形成的Buforin II-衍生的复合物向MRSA递送染料标记的寡核苷酸。
[0420] 图22.显示用化合物7形成的Buforin II-衍生的Sig TFD复合物对EMRSA-15的生长延迟的体外生物测定。
[0421] 序列简述
[0422] SEQ ID NO：1-耻垢分枝杆菌菌株MC2155中的天然WhiB7结合位点
[0423] SEQ ID NO：2-WhiB7转录因子诱饵
[0424] SEQ ID NO：3-大肠杆菌K12中的天然FadR结合位点
[0425] SEQ ID NO：4-FadR转录因子诱饵
[0426] SEQ ID NO：5-金黄色葡萄球菌中YycF/YycG的天然结合位点
[0427] SEQ ID NO：6-金黄色葡萄球菌中YycF/YycG的天然结合位点
[0428] SEQ ID NO：7-LytM诱饵
[0429] SEQ ID NO：8-SsaA诱饵
[0430] SEQ ID NO：9-金黄色葡萄球菌中SigB的天然结合位点
[0431] SEQ ID NO：10-肺炎克雷伯氏菌中SigB的天然结合位点
[0432] SEQ ID NO：11-金黄色葡萄球菌中Fur结合的共有序列
[0433] SEQ ID NO：12-大肠杆菌中Fur结合的共有序列
[0434] SEQ ID NO：13-幽门螺杆菌中Fur的天然结合序列
[0435] SEQ ID NO：14-艰难梭菌中TcdR的共有结合位点
[0436] SEQ ID NO：15-铜绿假单胞菌中Vfr的共有结合位点
[0437] SEQ ID NO：16-铜绿假单胞菌中Vfr的天然结合位点
[0438] SEQ ID NO：17-铜绿假单胞菌中Vfr的天然结合位点
[0439] SEQ ID NO：18-肺炎克雷伯氏菌中NtrC的天然结合位点
[0440] SEQ ID NO：19-幽门螺杆菌中ArsR的天然结合序列
[0441] SEQ ID NO：20-幽门螺杆菌中ArsR的天然结合序列
[0442] SEQ ID NO：21-金黄色葡萄球菌中的糖肽抗性共有序列
[0443] SEQ ID NO：22-金黄色葡萄球菌中的Agr结合基序
[0444] SEQ ID NO：23-金黄色葡萄球菌中的Agr结合基序
[0445] SEQ ID NO：24&25-PCR制备SAsigB TFD的正向和反向引物序列
[0446] SEQ ID NO：26&27-PCR制备SAfhu TFD的正向和反向引物序列
[0447] SEQ ID NO：28&29-PCR制备SsaA TFD的正向和反向引物序列
[0448] SEQ ID NO：30-磷酸化的Sig哑铃型TFD寡核苷酸序列
[0449] SEQ ID NO：31-磷酸化的Sig哑铃型TFD寡核苷酸序列
[0450] SEQ ID NO：32-并入WalR结合位点的磷酸化的寡核苷酸
[0451] SEQ ID NO：33-并入WalR结合位点的磷酸化的寡核苷酸
[0452] SEQ ID NO：34&35-FabB启动子的正向和反向引物
[0453] SEQ ID NO：36&37-含有肺炎克雷伯氏菌的σ54因子的识别序列的TFD的正向和反向引物
[0454] SEQ ID NO：38-WalR TFD共有序列
[0455] SEQ ID NO：39-SigB TFD共有序列
[0456] SEQ ID NO：40-KP_Sig TFD序列
[0457] SEQ ID NO：41-KP_Sig TFD共有序列
[0458] SEQ ID NO：42-革兰氏阴性Sig TFD发夹序列
[0459] SEQ ID NO：43&44-乱序金黄色葡萄球菌Sig结合位点的正向和反向引物[0460] SEQ ID NO：45&46-用于从pGEMT-Easy载体扩增靶序列的正向和反向引物[0461] SEQ ID NO：47&48-WhiB7 TFD的正向和反向引物
[0462] SEQ ID NO：49-SA SIG发夹TFD序列
[0463] SEQ ID NO：50-SA_SIG乱序发夹TFD序列
[0464] SEQ ID NO：51-Buforin II肽序列
[0465] SEQ ID NO：52-Tef衍生的SASig TFD
[0466] 实施例1.用地喹胺类似物和TFD形成复合物
[0467] Weissig等已显示(WO99/013096)地喹胺(DQA)可用于将DNA递送至线粒体。经过声处理，DQA形成直径介于约70和700mm之间的球状外观的聚集体，其与磷脂小泡相似。这些聚集体在WO99/013096中被称为‘DQAsome’并且在Weissig和Torchilin((2001)Adv.Drug Delivery Rev.49：127-149)中被称为’bolasome’。术语‘bolasome’在本说明书中用于描述在DQA和其类似物经受声处理后该化合物的小泡。
[0468] 复合物由用合适的递送化合物自组装的转录因子诱饵(TFD)寡核苷酸组成。TFD寡核苷酸长度为40至100个核苷酸，并具有天然磷酸主链。它自身退火形成所靶向的转录因子的结合位点，并具有天然形成的发夹来保护5’和3’端，下面显示了其实例(GN_SIG_HP)：
[0469] -agc-gtg-ata-atc-att-atc-g-
[0470] agcg5’ g
[0471] 3’-cac-tat-tag-taa-tag-a- SEQ ID NO：42
[0472] 在可选的结构中，位于TFD任一端的小发夹环起保护分子不被降解的作用，并使TFD为哑铃(DB)形。
[0473] 材料和方法。
[0474] 递送化合物的制备。将15mg的每种化合物(Sygnature Ltd.)溶解于10ml甲醇中并使用旋转蒸发仪彻底干燥，然后重悬于5mM HepespH7.4至终浓度为10mM。化合物7容易溶解，产生澄清的、浅黄色溶液。化合物7_12在置于超声波浴中1h后溶解，形成不透明的、浅黄色溶液。使用MSE Soniprep 150将两种溶液在冰上进行探头声处理。使用的条件为：60个循环：30s开(振幅10微米)和60s关。经这一处理后，化合物7_12是完全澄清的。将两种样品离心以除去碎片并称为sC7(声处理的化合物7)或sC7_12(声处理的化合物7_12)。这一步骤形成小泡或’bolasome’。
[0475] 哑铃型TFD复合物的制备。将2μgTFD(已连接形成单体环的32bp寡核苷酸)与1ml的5mM Hepes pH7.4缓冲液或LB肉汤(Luria Bertani肉汤：1％(w/v)细菌用胰蛋白胨、5％(w/v)细菌用酵母提取物、5％(w/v)NaCl)混合，然后与1至10μl的sC7或sC7_12在室温下混合。
[0476] 发夹TFD复合物的制备。寡核苷酸以1mM浓度悬浮于水中(即180nmol于180μl中)。将该悬浮液于在水中稀释至10μM并在干燥加热块中加热至95℃持续2min，之后将悬浮液于从加热中取出，并让其冷却至室温。为了证实TFD已适当退火，将1μl TFD与1μl10xNEB缓冲液1、6μl水和1μl外切核酸酶I(NEB)混合。对照混合物不包括1μl TFD。混合物在37℃孵育30min，然后在3％低熔点琼脂糖凝胶/TAE上分离，用0.5x SYBR Green染色。通过抵抗外切核酸酶消化确认正确的TFD构象。
[0477] 为了制备递送复合物，将10mg化合物悬浮于12.5ml 5mMHepes pH7.5(终浓度0.8mg/ml)并通过声处理(30x30s开，30s关，在冰上以10μ)溶解。在327nm测量所得溶液的吸光度以建立准确浓度。将12.5μl递送化合物与40μl 10μM TFD和447.5μl 5mM Hepes(pH7.5)混合，并使用附有微探头的MSE 150Soniprep在冰浴中进行声处理。以30s开(以50％功率，大约10μ)和30s关进行三十个循环的声处理。
[0478] DNA结合测定。为了确定被小泡结合的TFD的比例，使用SYBR-green结合测定。TFD复合物如上所述在Hepes缓冲液中形成，其中修改是缓冲液含有5μl SYBR Green I染料(Invitrogen，在DMSO中制备10,000x贮存液)的1比10稀释液。测量荧光(λEX 497nm，λEM520nm)以确定需要添加多少bolasome来猝灭SYBR Green与TFD的结合。
[0479] 大小确定。使用Dynapro Titan DLS Instrument通过动态光散射确定bolasome的大小。
[0480] 颗粒的显现。颗粒的大小使用电子显微术测量。在成像前，直接用乙酸双氧铀染色样品。
[0481] 结果。
[0482] 1.1sC7bolasome的大小分布
[0483] sC7bolasome在5mM Hepes缓冲液中以10mM的浓度制备。在通过动态光散射测量bolasome的大小分布之前，将它们在同一缓冲液中稀释1000倍。按质量计，绝大多数材料具有超过3μm的直径，并且这由非特异性聚集体或尘土造成。剩余颗粒具有68nm的平均直径(图4)。这在一定程度上不同于已公开的小泡的大小分布(Weissig等2001S.T.P.Pharma Sci.11：91-96：表I，参见化合物7)，其估计大小分布为169nm+/-50nm，并评述这一分布是严格的。sC7bolasome的值与已公开的值更接近，尽管差异可能反映不同的实验参数和测量仪器。实际上，sC7bolasome在稀释下稳定的事实表明它们具有超过声处理地喹胺溶液所形成的bolasome的增加的稳定性，因为这些在稀释后恢复成单体(其具有小于10nm的直径)。
[0484] sC7和sC7_12bolasome的直径(参见1.2)在表2中列表显示：
[0485] 表2.猝灭SYBR Green与固定浓度的TFD的结合所需要的sC7和sC7_12bolasome的最低浓度的计算值。
[0486]
[0487] 1.2sC7_12bolasome的大小分布
[0488] sC7_12bolasome在5mM Hepes缓冲液中以10mM的浓度制备。在通过动态光散射测量bolasome的大小分布之前，将它们在同一缓冲液中稀释1000倍。如1.1中所述，来自大部分材料的信号减弱。剩余颗粒具有48.4nm或197.7nm的平均直径，并以1：2.5的比例存在(图5)。这显著不同于sC7bolasome的直径。然而，颗粒具有比其他人对用相似浓度的地喹胺形成的那些所报告的更好的大小分布，并与Weissig对从化合物7形成的bolasmome获得的那些相当(Weissig等(2001)S.T.P.Pharma Sci.11：91-96)。
[0489] 1.3用DNA-结合测定建立sC7和sC7_12与TFD的最佳结合条件
[0490] SYBR-Green I染料特异性地结合双链DNA，并在此时产生强烈的荧光信号。由于bolasome排除染料，所以通过测量在不同浓度和类型的bolasome存在下的信号变化，可以计算猝灭SYBR-Green结合所需要的bolasome的最低量。这通过从加入的bolasome的量与荧光信号绘图的滴定曲线的线性部分外推实现。使用2μgTFD/ml的固定浓度，发现sC7bolasome的最低浓度是6.13μg/ml(图6)。在这些浓度下，通过单体C7未观察到猝灭。
[0491] 发现sC7_12bolasome的最低浓度是9.26μg/ml(图7)。
[0492] 使用需要的bolasome的最低量制备TFD复合物。还使用该浓度以确保bolasome制备物之间的样品变化尽可能地小。一般而言，观察到大约20％的变化，并且对生物功能没有可观察的影响。
[0493] 复合物的稳定性通过监测由于SYBR Green染料结合而产生的标准化的荧光来测量。当在4℃储存时，用sC7bolasome形成的TFD复合物的滴定曲线保持恒定超过72h(图8)，显示此处说明的条件提供所形成的复合物的稳定性的显著改善。
[0494] 1.4sC7bolasome和TFD复合物的电子显微照片成像
[0495] sC7bolasome和TFD之间形成的TFD复合物通过利用乙酸双氧铀的负染色的电子显微术显现。两个实例显示于图9A和9B。内部致密染色的50和100nm之间的圆形颗粒清楚可见，内部明显的小粒可能是DNA的凝缩体。
[0496] 实施例2.在化合物7BOLASOME中递送TFD杀伤MRSA
[0497] 材料和方法
[0498] 通过连接制备TFD哑铃(DB-TFD)
[0499] 合成两种寡核苷酸，各自含有金黄色葡萄球菌可选σ蛋白的识别位点的一条链。在分子的任一末端，小发夹环起保护分子不被降解的作用。将每种寡核苷酸以250pmol/μl的浓度重悬于dH2O中。为了形成Sig哑铃型TFD(称为Sig TFD)，合成以下磷酸化的寡核苷酸：
[0500] SEQ ID NO：30-SigDB1：CTT GGT TTT TCC AAG GAA GAT TAG AAA TTATTT CGA TGG GTA TAT AAT A
[0501] SEQ ID NO：31-SigDB2：P-CCG TCT TTT TGA CGG TAT TAT ATA CCC ATCGAA ATA ATT TCT AAT CTT C
[0502] 当退火时，这些形成以下分子：
[0503] T CCAAG gaa gat tag aaa tta ttt cgat ggg tat ata ata PCCGTCTTTT TTT[0504] T GGTTCPCTT CTA ATC TTT AAT AAA GCTA CCC ATA TAT TAT GGCAG T[0505] 将30μl各种寡核苷酸与27μl dH2O混合，并使用以下PCR程序退火：退火：95℃3min，以-0.1℃/s冷却至8℃，结束。之后，加入10μl 10xNEB连接酶缓冲液和3μl HC T4DNA连接酶(NEB)。将混合物在16℃孵育过夜。然后用T7外切核酸酶(NEB)充分消化材料以除去任何未连接的寡核苷酸，并随后通过两轮乙醇沉淀进行回收。还制备了含有乱序形式的Sig结合位点的DB_TFD，称为Scr TFD。在这种情形下，使用的磷酸化的引物是：
[0506] SEQ ID NO：43-SigScr_SA1：CTT GGT TTT TCC AAG TAG AAA GAA GATTTA GGG CGA T TTT ATA ATA TAT
[0507] SEQ ID NO：44-SigScr_SA2：CCG TCT TTT TGA CGG ATA TAT TAT AAAATC GCC CTA AAT CTT CTT TCT A
[0508] 复合物形成
[0509] 根据经验建立结合2μg任一种TFD所需要的sC7bolasome的最低量，并将适当量的bolasome与TFD在5mM Hepes pH7.4中混合以形成复合物。在随后的生物测定中使用TFD纳米颗粒的稀释物。
[0510] 在96-孔板中进行生长研究
[0511] 使用由与sC7bolasome混合的Sig TFD或Scr TFD组成的复合物进行生长测定，以确定对临床分离的MRSA菌株的生长的作用。确定对细菌细胞的生长的作用的测定使用96孔板进行，每个孔含有200μl由LB培养基组成的肉汤。将1μl各种浓度的TFD复合物加入到每个孔中，并通过在孵育期间以一定的间隔测量肉汤的吸光度来监测对金黄色葡萄球菌的细菌生长的作用。将平板在37℃下伴随振荡孵育，并使用酶标仪(plate reader)采集吸光度读数(在450nM下)。
[0512] 结果
[0513] 2.1TFD复合物在体外可有效杀伤MRSA
[0514] 使用称为‘Sig TFD’的已知杀伤MRSA细胞的TFD或作为对照的乱序形式’Scr TFD’制备与sC7bolasome的TFD复合物。使用MRSA菌株EMRSA15接种LB肉汤以提供5
5×10/ml的细胞终浓度。将200μl等份分散到96孔板的孔中。孔中补充有不同浓度的Sig TFD复合物、ScrTFD复合物、等同浓度的作为地喹胺类似物的任何抗细菌作用的对照的sC7bolasome(sC7对照)，或孔是未处理的(图10)。两种TFD复合物均含有浓度为500ng/ml的sC7和浓度为5μg/ml的TFD。sC7对照由浓度为500ng/ml的bolasome组成。
5×10/ml的细胞终浓度。将200μl等份分散到96孔板的孔中。孔中补充有不同浓度的Sig TFD复合物、ScrTFD复合物、等同浓度的作为地喹胺类似物的任何抗细菌作用的对照的sC7bolasome(sC7对照)，或孔是未处理的(图10)。两种TFD复合物均含有浓度为500ng/ml的sC7和浓度为5μg/ml的TFD。sC7对照由浓度为500ng/ml的bolasome组成。
[0515] 对于未处理样品、sC7对照和对照复合物(由ScrTFD组成)，细胞生长是基本相似的。然而，Sig TFD复合物阻止细菌生长。所以，sC7bolasome与Sig TFD的组合杀伤MRSA菌株，而对照TFD复合物则没有。这是由于有效递送TFD治疗剂至MRSA的复合物所造成。单独的递送作用加上相伴的膜损害没有杀伤细菌，因为对照复合物或等同量的sC7bolasome无一影响细胞生长。
[0516] 实施例3.通过化合物7BOLASOME递送TFD杀伤大肠杆菌
[0517] 材料和方法
[0518] 通过PCR制备Fur TFD
[0519] Fur TFD被设计为并入脂肪酸合成酶的转录调节物FadR的结合位点，其发生于大肠杆菌FabB基因的上游。FabB基因编码参与脂肪酸合成的酶(J.Bacteriology(2005)183：5292)。用于扩增启动子序列的寡核苷酸是：
[0520] SEQ ID NO：34-fabBf 5’-tct tta aat ggc tga tcg gac ttg-3’[0521] SEQ ID NO：35-fabBr 5’-agt aag ttt cga atg cac aat agc gta-3’[0522] 将得到的片段连接到pGEMTEasy载体(Promega)中，并通过使用寡核苷酸引物的PCR扩增合成PCR TFD，所述寡核苷酸引物设计为与插入物两侧的载体主链退火，例如：
[0523] SEQ ID NO：45TEf：5’-ggc cgc cat ggc ggc cgc ggg aat tc-3’[0524] SEQ ID NO：46TEr：5’-agg cgg ccg cga att cac tag tg-3’.[0525] 对PCR产物进行乙醇沉淀，并重悬于浓度为500-1000ng/μl的TE缓冲液(10mM Tris.HCl、1mM EDTA pH8.0)。
[0526] 还产生了具有以下序列的对照TFD，该序列在用于使用分离自耻垢分枝杆菌的基因组DNA的扩增反应中时产生相似大小的PCR片段。这些寡核苷酸的序列为：
[0527] SEQ ID NO：47-WhiB7.f CAC GAG CCG AAA AGG CCA CGG
[0528] SEQ ID NO：48-WhiB7.r CAA AAA TGG CCA CGG ATC CGG GTG
[0529] 结果
[0530] 3.1TFD复合物在体外可有效杀伤大肠杆菌
[0531] TFD复合物使用以下形成：已知对大肠杆菌有活性的TFD，ECFur，和对照TFD，EC FurScr TFD。如实施例2.1中的描述进行实验，并获得了相似的结果(图11)。再次，结果显示用sC7bolasome和ECFur TFD形成的复合物阻止大肠杆菌(菌株DH10B)在铁限制的培养基中的生长。
[0532] 实施例4.通过化合物7_12BOLASOME递送TFD杀伤MRSA
[0533] 材料和方法
[0534] 按照实施例2的描述用Sig TFD或Scr TFD形成TFD复合物，例外的是使用sC7_12bolasome。测试得到的TFD复合物阻止MRSA菌株EMRSA15生长的活性。
[0535] 结果
[0536] 4.1TFD复合物在体外可有效杀伤MRSA
[0537] 使用称为‘Sig TFD’的已知杀伤MRSA细胞的TFD和作为对照的乱序形式’Scr TFD’与sC7_12bolasome制备TFD复合物。使用MRSA菌株EMRSA15接种LB肉汤以产生5
5×10/ml的细胞终浓度。将200μl等份分散到96孔板的孔中。孔中补充有不同浓度的Sig TFD复合物、ScrTFD复合物、等同浓度的作为地喹胺类似物的任何抗细菌作用的对照的sC7_12bolasome(sC7_12对照)，或孔是未处理的(图12)。两种TFD复合物均含有浓度为
800ng/ml(1.3μM)的sC7_12和5μg/ml(153nM)的TFD。sC7_12对照由浓度为800ng/ml的bolasome组成。
5×10/ml的细胞终浓度。将200μl等份分散到96孔板的孔中。孔中补充有不同浓度的Sig TFD复合物、ScrTFD复合物、等同浓度的作为地喹胺类似物的任何抗细菌作用的对照的sC7_12bolasome(sC7_12对照)，或孔是未处理的(图12)。两种TFD复合物均含有浓度为
800ng/ml(1.3μM)的sC7_12和5μg/ml(153nM)的TFD。sC7_12对照由浓度为800ng/ml的bolasome组成。
[0538] 对于未处理样品、sC7_12对照和对照复合物(包括Scr TFD)，细胞生长是基本相似的。然而，Sig TFD复合物阻止细菌生长。所以，sC7_12bolasome与Sig TFD的组合杀伤MRSA菌株，而对照TFD复合物则没有。这是由于复合物有效递送TFD治疗剂至MRSA。单独的递送作用加上相伴的膜损害没有杀伤细菌，因为对照复合物或等同量的sC7_12bolasome无一影响细胞生长。
[0539] 实施例5.通过不同的递送化合物递送发夹TFD杀伤MRSA
[0540] 使用实施例1中列出的方法制备含有发夹TFD SA SIG和地喹胺、化合物7或化合物7_12的TFD复合物。形成的小泡的大小分布使用Malvern Nanosizer利用标准方法测量，并列于下面的表3：
[0541] 表3.
[0542]
[0543] 发现，当使用具有不同序列的TFD时，小泡的大小分布没有改变。SA SIG HP(靶向于结合金黄色葡萄球菌中的可选σ因子)的序列是：
[0544] SEQ ID NO：49-5’-gcg aag cga aga tta gaa att att tcc atg ggt ata taa tac ttg gttttt cca agt att ata tac cca tgg aaa taa ttt cta atc ttc-3’[0545] 5.1.与化合物7_12复合的SA_SIG_HP TFD的功效
[0546] 按照实施例1中的描述制备TFD复合物(称为Sig)，两个对照陷阱也一样，一个不含有TFD(空白)和，而另一个为SA SIG HP的乱序形式(乱序)，含有TFD SA_SIG_Scr_HP，其具有以下序列：
[0547] SEQ ID NO：50-5’-gcg aag cat ctt gta tgc aaa tag aat gaa taa tag ttt gac ttg gttttt cca agt caa act att att cat tct att tgc ata caa gat-3’[0548] 将1μl每种递送复合物添加到接种有1μl的浓度为3×106菌落形成单位/μl的MRSA菌株EMSRA15的甘油储备液的200μl LB肉汤中。使培养物以温和振荡在37℃下生长，并以半小时间隔在酶标仪中测量培养物的光密度。
[0549] 图13中显示的流逝时间对光密度的图证明Sig复合物在500ng/ml化合物7_12和20pmol TFD的浓度下有效阻止MRSA菌株的生长。用Scr复合物(以相似的化合物7_12和TFD二者的浓度)处理的细菌生长得比空白对照和未处理样品二者慢。前面的实验中已观察到这一点，并解释为是由于生长被递送乱序TFD至细胞的作用减慢。当TFD抑制应激应答时，如SA_SIG_HP所做的，细胞不能恢复。空白对照和未处理样品的生长是难以区分的。
[0550] 所以，含有设计为阻断金黄色葡萄球菌中的关键途径的SIG_SA_HP TFD的复合物对于细菌细胞是致命的，而递送乱序形式的TFD或单独的递送媒介物则是无效的。
[0551] 5.2.与地喹胺复合的SA_SIG_HP的功效
[0552] 按照上面5.1节的描述制备TFD复合物，例外是使用的地喹胺的浓度高达化合物712的浓度的6倍。相似地，制备了两个对照陷阱，一个不含有TFD(空白)和，而另一个为SA SIG HP的乱序形式(乱序)，其含有TFD SA_SIG_Scr_HP。
[0553] 将1μl每种递送复合物添加到接种有浓度为1μl的3×106菌落形成单位/μl的MRSA菌株EMSRA15的甘油储备液的200μl LB肉汤中。培养物以温和振荡在37℃下生长，并以半小时间隔在酶标仪中测量培养物的光密度。图14中显示的流逝时间对光密度的图证明Sig抗细菌剂在3μg/ml化合物7_12和10pmol TFD的浓度下有效阻止MRSA菌株生长。用Scr抗细菌剂(以相似的地喹胺和TFD二者的浓度)处理的细菌生长得比空白对照和未处理样品二者慢。前面的实验中已观察到这一点，并解释为是由于生长被递送乱序TFD至细胞的作用减慢。当TFD抑制应激应答时，如SA_SIG_HP所做的，细胞不能恢复。空白对照和未处理样品的生长是难以区分的。
[0554] 所以，含有设计为阻断金黄色葡萄球菌中的关键途径的SIG_SA_HP TFD的复合物对于细胞是致命的，而递送乱序形式的TFD或单独的递送媒介物则是无效的。
[0555] 实施例6.借助化合物C7_12的SA Sig TFD在小鼠脓毒症模型中治疗MRSA的功效
[0556] 本研究中使用的小鼠，雄性CD1小鼠，由Charles River(MargateUK)供应，并且无特异性病原体(交货时16-18g)。在实验开始时，所有小鼠重22-25g。
[0557] 6.1.耐受性研究
[0558] 动物以每个处理组两只小鼠的组进行处理，因此总共使用六只动物进行研究。对所有小鼠在研究第1天进行称重，并被随机放到箱中。小鼠具有以10ml/kg静脉施用的以下处理：
[0559] ·100μM SA Sig TFD(2mg/ml；SEQ ID NO：9)和525μM(0.315mg/ml)化合物7，于盐水溶液中；
[0560] ·100μM SA Sig TFD(2mg/ml；SEQ ID NO：9)和525μM化合物7_12(0.315mg/ml)，于盐水溶液中；和
[0561] ·仅盐水溶液。
[0562] TFD和递送分子的浓度选择为是预测期有效剂量的大约十倍。
[0563] 处理后，每日对小鼠进行称重，持续100h时段，然后将它们安乐死。摘取肺、肝、脾和肾，目视检查并称重。图15显示所有三组的体重增加，符号a)和b)指独立的实验重复。
[0564] 未观察到对照处理(盐水)和用TFD和递送化合物的组合处理的那些之间的显著差异。因此，所有处理是按照静脉施用良好耐受的。未报告急性事件。处理后，小鼠正常进食和饮水，没有不适迹象。处理小鼠的体重增加与媒介物对照相同。尸检显示肾、肺、肝或胃肠道总体无异常。肾、肺和肝的重量在正常范围内，所有测试化合物是耐受的并适合进一步增加剂量至本耐受性研究中使用的最大剂量。
[0565] 6.2.组织负荷研究
[0566] 动物按每个处理组since小鼠的组进行处理，因此本研究总共使用四十八只动物。制备两份10ml金黄色葡萄球菌EMRSA 16培养物，并置于37℃下的定轨振荡器(220rpm)过夜。第二天，从振荡器中取出金黄色葡萄球菌EMRSA 16培养物，沉淀，并洗涤两8
次，然后重悬于盐水中至OD为0.132(1.5×10cfu/ml)。然后将金黄色葡萄球菌EMRSA16
8 7
的这一储备溶液在盐水中以1：1.5进一步稀释1×10cfu/ml)，即每只小鼠2.0×10 细菌。
次，然后重悬于盐水中至OD为0.132(1.5×10cfu/ml)。然后将金黄色葡萄球菌EMRSA16
8 7
的这一储备溶液在盐水中以1：1.5进一步稀释1×10cfu/ml)，即每只小鼠2.0×10 细菌。
[0567] 然后通过静脉注射至小鼠尾静脉用0.2ml 1.0×108/ml悬浮液感染所有四十八只小鼠。还计数剩余悬浮液中每ml的金黄色葡萄球菌EMRSA 16细菌的数目，以确认感染量。
[0568] 感染后1、9和17小时用化合物或媒介物处理小鼠，但是万古霉素仅在1h后施用。处理是用复化合物7_12和不同的TFD制备的抗生素复合物的组合，如下面表3所列的。
[0569] 表3.
[0570]
[0571] 感染后25小时，对所有动物进行称重，然后将其安乐死。立即摘取肾并在冰冷的无菌磷酸盐缓冲盐水+0.05％Tween 80中匀浆。将器官匀浆物在CLED琼脂上定量培养，并在37℃下孵育多达3天，计数菌落。利用Stats Direct通过Kruskal-Wallis检验分析培养物负荷的数据。
[0572] 6.3.组织负荷研究
[0573] 施用的感染剂量以3.7×107细菌/小鼠靶向，以确保建立相对急性的感染，即对治疗敏感的感染。用以下的系统注射处理小鼠：(A)仅递送化合物(化合物C7_12)，(B)1nM SA_Sig/化合物7_12复合物，(C)1nM乱序对照复合物，(D)仅1nM SA_Sig TFD，(E)万古霉素，以足以实现菌落形成单位(cfu)的2倍降低的浓度使用，或(F)媒介物。处理后，处死小鼠，并测量肾内发现的负荷(参见图16)。
[0574] 结果的统计分析显示Sig陷阱抗细菌剂处理的小鼠实现的负荷降低与万古霉素实现的负荷降低相似。所有其他对照显示与媒介物处理相似的负荷(表4)。
[0575] 表4.体内结果的统计分析。Kruskal-Wallis：对Sig TFD复合物的全部逐对比较(Dwass-Steel-Chritchlow-Fligner)
[0576]处理 Sig复合物 Scr复合物 Sig TFD 万古霉素 媒介物
C712 0.0001 0.5490 0.4695 0.0004 0.4109
Sig陷阱 0.0008 ＜0.0001 0.7263 ＜0.0001
Scr陷阱 0.1894 0.0023 0.1588
Sig TFD ＜0.0001 0.9203
万古霉素 ＜0.0001
C712 0.0001 0.5490 0.4695 0.0004 0.4109
Sig陷阱 0.0008 ＜0.0001 0.7263 ＜0.0001
Scr陷阱 0.1894 0.0023 0.1588
Sig TFD ＜0.0001 0.9203
万古霉素 ＜0.0001
[0577] 发现本实验中的Sig复合物在纳摩尔/升浓度下在体外和体内均具有针对MRSA的快速杀菌活性。
[0578] 实施例7.抗细菌肽介导的TFD的递送
[0579] 材料和方法
[0580] 测定以下抗细菌肽递送TFD至细菌细胞的能力：短杆菌肽、多粘菌素九肽(均购自Sigma Aldrich)和Buforin II(Park等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：8245-8250)。通常将1μg如实施例1所述的Sig DB-TFD和SigScr DB-TFD与0.2至5μg短杆菌肽在总体积为5μl的50mM NaCl中混合。其中，将1μl添加至接种有1/100稀释的初始密度为0.3OD(600nm下的吸光度)的EMRSA-15甘油储备液的200μl LB肉汤，并等分到96孔板的孔中。一式三份进行实验。在37℃伴随振荡下孵育平板，并使用酶标仪采集吸光度读数(在450nM下)。
[0581] 结果
[0582] 7.1.短杆菌肽有效递送TFD至金黄色葡萄球菌
[0583] 向接种有EMRSA-15和150ng/ul短杆菌肽的LB培养基中添加1μg Sig DB-TFD导致无细菌生长。相反，仅TFD、仅短杆菌肽或与乱序形式的DB-TFD的混合的短杆菌肽生长与未处理对照一样好(图17)。
[0584] 7.2.Buforin II有效递送TFD至金黄色葡萄球菌
[0585] 21氨基酸Buforin II肽由以下序列组成：TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(SEQ ID NO：51)。当与膜活性抗微生物肽Buforin II混合时，与Buforin II混合的Sig TFD延迟EMRSA-15的生长，并在体外测定中阻止96孔板中的细菌生长。对照TFD，Scr，其为Sig TFD序列的乱序形式，当与未处理肉汤或仅用肽处理的细胞相比时对生长没有可辨别的作用(图18)。
[0586] 作为替代，使用荧光标记的寡核苷酸作为TFD的替代物。尽管这不具有TFD分子的预测活性，但是荧光素标记的寡核苷酸掺入荧光标记，所以可通过荧光显微术检测其吸收(图19)。
[0587] 7.3.多粘菌素有效递送TFD至大肠杆菌
[0588] 当与革兰氏阴性活性的抗微生物环状糖肽多粘菌素混合时，ECFur TFD延迟DH5a的生长，并在使用铁限制培养基的体外测定中阻止96孔板中的细菌生长。对照TFD，WhiB7TFD，其为具有与Fur TFD相似的大小的无关序列，当与未处理肉汤或仅用肽处理的细胞相比时对生长没有可辨别的作用(图20)。
[0589] 实施例8.与BUFORIN II轭合的TFD/地喹胺复合物的递送
[0590] 材料和方法
[0591] 用抗微生物肽衍生复合物
[0592] 使用交联剂EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐；Thermo Scientific)并按照生产商描述的两步骤偶联方案的修改用抗微生物肽Buforin II衍生TFD复合物。
[0593] 合成Buforin II肽，并冻干，并以1mg/ml的浓度重悬于活化缓冲液(0.1M MES[2-(N-吗啉)乙烷磺酸]、0.5M NaCl、pH6.0)。将1ml此溶液与0.4mg EDC和1.1mg Sulfo-NHS(Thermo Scientific)混合，并在室温下孵育5至120min，最通常地30min。孵育后，加入1.4μl2-巯基乙醇以猝灭EDC。使用具有低分子量截留的管(Pierce，Slide-A-Lyzer，2K MWCO)通过透析从肽样品除去未掺入的EDC和Sulfo-NHS。
[0594] 利用实施例2和3中描述的技术制备浓缩的TFD复合物。将35μl浓度为1.5mg/ml的TFD与130μl PBS(磷酸盐缓冲盐水；0.1M磷酸钠缓冲液pH7.2，0.15M NaCl)和35μl浓度为3.15mg/ml的声处理的化合物7(bolasome)混合。通常将90μl浓缩的TFD复合物与10μl衍生的Buforin II混合，并让其在室温下反应2小时。通过加入10mM羟胺猝灭反应。
[0595] 在用于生物测定之前，将衍生的TFD纳米颗粒稀释至适当浓度。
[0596] 作为替代，使用荧光素标记的寡核苷酸作为TFD的替代物。尽管这不具有TFD分子的预测活性，但是荧光素标记的寡核苷酸掺入荧光标记，所以可通过荧光显微术检测其吸收。
[0597] 结果
[0598] 8.1.Buforin II衍生的TFD复合物有效递送寡核苷酸至金黄色葡萄球菌[0599] 如所述形成衍生的TFD复合物，例外是用荧光标记的寡核苷酸Tef替代TFD，Tef在5’端含有荧光素染料。寡核苷酸的序列为：
[0600] SEQ ID NO：52-Tef-荧光素-AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TGA。
[0601] 将衍生的复合物加至200μl接种有MRSA菌株EMRSA-15的LB肉汤，并使其伴随振荡在37℃生长过夜。第二天早上，通过离心收获细胞，并在等体积的PBS中洗涤四次。将一滴细菌悬浮液置于显微镜玻片上并晾干。然后通过使玻片穿过本生灯焰对细胞进行热固定。然后使吕氏亚甲基蓝溶液(5mg/ml亚甲基蓝，于69∶30∶1(v/v)的水∶甲醇∶1％(w/v)KOH溶液中)漫过玻片，并静置1min，之后用水洗去过量的溶液，并用Cairn CCD荧光显微镜观察细胞。
[0602] 在亮视野(无荧光)下，可清楚地观察到细菌成团(图21)，而在荧光视野下，可以观察到标记的寡核苷酸被内化，这与实现递送的衍生的纳米颗粒一致。在无衍生的复合物的肉汤中生长的细菌未显示荧光。
[0603] 8.2.Buforin II衍生的TFD复合物可阻止MRSA的细菌生长
[0604] 产生含有Sig TFD或作为对照的Scr TFD的衍生的复合物(如实施例2中所述)。衍生的复合物的储备液中TFD组分的浓度是8μM，并将复合物稀释以产生16nM TFD和
1.8μM化合物7的工作浓度。
1.8μM化合物7的工作浓度。
[0605] 在此浓度下，含有Sig TFD的衍生的复合物完全阻止MRSA菌株的生长，而含有对照TFD的衍生的复合物则没有。实际上，生长与未处理样品和含有1.8μM化合物7bolasome的sC7对照肉汤相似(图22)。
[0606] 所以，用Buforin II衍生的复合物递送Sig TFD至病原体细菌以阻止生长。而且，使用的复合物的有效浓度低于非衍生的复合物的浓度(4.1节)。
[0607] 实施例9
[0608] 用其他地喹胺类似物形成复合物
[0609] 通过遵循本文描述的一般合成方法，制备了以下地喹胺类似物：
[0610] 10，10’-(辛烷-1，8-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二碘化物；
[0611] 10，10’-(十二烷-1，12-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二碘化物；
[0612] 10，10’-(十四烷-1，14-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二碘化物；
[0613] 10，10’-(十八烷-1，18-二基)双(9-氨基-1，2，3，4-四氢吖啶)二碘化物；
[0614] 5，5’-(十二烷-1，12-二基)双(11-氨基-7，8，9，10-四氢-6H-环庚[b]喹啉)二碘化物；
[0615] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(4-氨基喹啉)二碘化物；
[0616] 1，1’-(十二烷-1，12-二基)双(4-氨基喹啉)二碘化物；
[0617] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(4-甲氧基喹啉)二碘化物；和
[0618] 1，1’-(癸烷-1，10-二基)双(2-氨基喹啉)二碘化物。
[0619] 以上列出的化合物可用于实施例1至8中描述的方法以制备根据本发明的其他复合物。
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