迷迭香酸是多种天然来源中存在的一种多酚，所述天然来源包括迷迭 香、牛至(oregano)、甘牛至草、百里香、胡椒薄荷、聚合草、欧芹、蜜蜂 花、鼠尾草、海索草、罗勒、熏衣草等。这些植物作为药草治疗已经被报 道，具有抗氧化、抗炎、抗癌和保肝特性。这些生物学作用与多酚、特别 是迷迭香酸、黄酮和黄烷醇的存在有关，例如这些物质在迷迭香叶子中被 鉴定出来。
在本领域中还没有描述如何改善包含迷迭香酸或植物提取物的组合物 的生物学作用，所述植物提取物包含所述迷迭香酸。
发明目的
因此，仍然需要改善包含迷迭香酸或植物提取物的组合物的生物学作 用，所述植物提取物包含所述迷迭香酸及其衍生物。
发明概述
因此，本发明的目的是通过独立权利要求的特性来解决的。从属权利 要求进一步发展了本发明的中心思想。
因此，第一方面，本发明涉及包含迷迭香酸和/或其衍生物与水解酶和 /或微生物组合的组合物，所述微生物包含或产生所述酶。
第二方面，本发明涉及包含迷迭香酸和/或其衍生物与其水解产物组合 的组合物。
用于改善或预防对皮肤损伤的权利要求1至15中任意一项的组合物也 是本发明的一部分。
另外，本发明包括权利要求1至15中任意一项的组合物的美容用途。
另一方面，本发明涉及用于水解迷迭香酸的水解酶或微生物的用途， 所述微生物包含或产生所述酶。
包含迷迭香酸和/或其衍生物的组合物中的水解酶或微生物在改善所 述组合物的生物学作用中的用途包括在本发明的进一步的方面中，所述微 生物包含或产生所述酶。
另外，本发明还提供了制备具有提高的生物学作用的包含迷迭香酸和/ 或其衍生物的组合物的方法，该方法包括以下步骤：
a.提供迷迭香酸和/或其衍生物，
b.提供水解酶或微生物，所述微生物包含或产生所述酶，和
c.将所述迷迭香酸和/或其衍生物以及水解酶或微生物与进一步的成 分混合，所述微生物包含或产生所述酶，以产生所述组合物，从而迷迭香 酸的水解发生在组合物中或体内。
最后，提供了用于改善个体健康的方法，该方法包括施用权利要求1 至15中任意一项的组合物的步骤。
附图
本发明在下文中进一步描述了附图所示的某些实施方案，其中：
-图1描述了迷迭香酸的分子结构，
-图2描述了咖啡酸的分子结构，
-图3描述了3，4-二羟基苯基乳酸的分子结构，
-图4是显示氯原酸酯酶量对迷迭香酸水解的影响((▲)0.01U/mg， (◆)0.02U/mg)以及对咖啡酸形成的影响((□)0.01U/mg，(●)0.02U/mg)的图，
-图5是显示pH对应用氯原酸酯酶在pH 5.0(●)、pH 6.0(□)、pH 7.0(▲) 和pH 8.0(◆)下由迷迭香酸形成咖啡酸的影响的图，
-图6是显示温度对迷迭香酸水解的影响(□)和对咖啡酸形成的影响(●) 的图，温度为30℃、40℃和50℃，应用0.02U酶/mg的迷迭香酸，
-图7是显示底物浓度对迷迭香酸水解速率和产量的影响的图，应用 (●)1mg、(◆)2mg、(▲)4mg和(□)6mg的迷迭香酸和0.02单位的酶，pH 6.6和40℃，
-图8是显示与包含迷迭香酸的提取物(Naturex PE20)比较，包含水解 后的迷迭香酸的提取物(水解的Naturex PE20)的改善的生物学作用。
发明详述
本发明涉及包含迷迭香酸及其衍生物的组合物。该组合物可以是“食 物组合物”或“局部组合物”。“食物组合物”表示可以用于营养、药物 和/或美容目的的任何可消耗的产品。“局部组合物”表示可以应用于个体 的皮肤、皮毛、指甲或头发用于药物和/或美容目的的任何组合物。优选的 是，组合物是食物组合物。
迷迭香酸(图1)及其衍生物通常存在于植物中，例如迷迭香、牛至、甘 牛至草、百里香、胡椒薄荷、聚合草、欧芹、蜜蜂花、鼠尾草、海索草、 罗勒、熏衣草、紫苏等。
迷迭香酸的“衍生物”表示包含至少一个迷迭香酸部分的任何化合物。 这些包括迷迭香酸的低聚物、聚合物、糖苷等。
迷迭香酸及其衍生物可以以纯的化合物或通过不同药草来提供，所述 药草例如紫苏(Perilla frutescens L.)、鼠尾草(Salvia officinalis L.)、薄荷 (Mentha arvense L.)、罗勒(Ocimum basilicum L.)、百里香(Thymus vulgaris L.)、中国南蛇藤(Celastrus hindsii)等。优选其是通过迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)来提供的。
另外，包含迷迭香酸源的植物的提取可以应用本领域已知的方法进行。 实际上，本发明的组合物优选包含植物提取物，所述植物提取物包含迷迭 香酸和/或其衍生物。优选的是，提取物在组合物中存在的量范围为0.01g 至20g(以干物质计算)。
因此，本发明提供了组合物，该组合物包含迷迭香酸和/或其衍生物与 水解酶(例如酯酶)或微生物组合，所述微生物包含或产生能水解迷迭香酸 或其衍生物的水解酶。
由于酶对迷迭香酸和/或其衍生物的水解作用，组合物可以进一步包含 用所述酶水解迷迭香酸和/或其衍生物的水解产物。这些可以包括咖啡酸、 3，4-二羟基苯基乳酸等以及它们的混合物。
本发明的组合物可以是干燥的、湿的或半湿的组合物。“干燥的”表 示具有小于0.6的水活性的组合物。“半湿的”表示具有0.6和0.9之间的 水活性的组合物，并且“湿的”表示具有大于0.9的水活性的组合物。
组合物可以包含适合的食物或药物载体。这些包括牛奶、酸奶酪、奶 酪、发酵牛奶、基于牛奶的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷类的产品、基 于牛奶的粉末、儿童和婴儿用配方、动物(特别是宠物)用食物、片剂或锭 剂、液体细菌混悬剂、干燥形式的口服添加物和液态形式的口服添加物。
因此，组合物可以是以下形式的食物组合物：完全营养食物、饮料、 矿泉水、汤、食物添加物和代替食物、溶液剂、喷雾剂、散剂、片剂、胶 囊剂、营养棒、液体细菌混悬剂、糖果、基于牛奶或基于发酵牛奶的产品、 酸奶酪、基于牛奶的粉末、肠营养产品、儿童和/或婴儿用组合物、基于谷 类的产品或基于发酵谷类的产品、基于大豆的产品、冰淇淋、巧克力、咖 啡、“烹调”产品例如蛋黄酱、番茄泥或色拉调味品、宠物食物等。因此， 该组合物还可以用于动物。
对于摄食，许多口服组合物并且特别是食物添加物的实施方案是可能 的。它们是通过用于制备糖包衣片剂、明胶胶囊剂、凝胶剂、乳剂、片剂、 胶囊剂或溶液剂的常规方法来配制的。特别的是，可以将包含迷迭香酸和/ 或其衍生物与水解酶或微生物组合的组合物掺入到食物添加物或浓缩食物 (例如食物棒或压缩或非压缩粉末)的任何其它形式中，所述微生物包含或 产生所述酶。粉末可以在泡腾饮料、乳酪产品或大豆衍生的产品中用水稀 释，或者可以掺入到食物棒中。
可选择的是，组合物可以是以下形式的局部组合物：水、水-醇或油性 溶液剂、溶液型的分散剂或者洗液或浆液型的分散剂、具有液体或半液体 稠度的牛奶型的乳剂，其通过将油相分散在水相中获得(O/W)，反之亦然 (W/O)，或者具有柔软、半-固体或固体稠度的乳膏、水凝胶或无水凝胶型 的混悬剂或乳剂，或者其它离子和/或非离子型微乳、微囊或微粒或者囊泡 分散体。
本发明的组合物可以包含常规的赋形剂和组分，例如脂肪和/或水组 分、保湿剂(humectifying agents)、增稠剂、防腐剂、结构改进剂、矫味剂 和/或包衣剂、抗氧化剂、染料，它们通常存在于食物和/或局部领域。
优选的是，组合物中存在的水解酶是酯酶。
本发明的基本原则是某些水解酶能够将迷迭香酸(图1)裂解为咖啡酸 (图2)和3，4-二羟基苯基乳酸(图3)，它们比迷迭香酸更容易被生物利用。 因此，改善了包含迷迭香酸或植物提取物的组合物的生物功效，所述植物 提取物包含迷迭香酸。
通过提供包含所述水解酶的组合物，本发明使迷迭香酸转化为上述咖 啡酸和3，4-二羟基苯基乳酸的过程在食物基质本身中、在局部应用产品的 本身中或者在体内消化过程的早期或在局部应用上发生，从而提高包含迷 迭香酸和/或其衍生物的组合物的生物功效。
因此，包含迷迭香酸和/或其衍生物的本发明的组合物具有改善的生物 学作用。
可选择的或另外的是，本发明的组合物可以包含微生物，所述微生物 包含或产生此类水解酶。
本发明的组合物中存在的酶或微生物的量是使得至少10％、优选至少 30％、更优选至少50％的迷迭香酸(图1)可以被水解为咖啡酸(图2)和3，4- 二羟基苯基乳酸(图3)的酶或微生物的量。这可以由技术人员通过本领域已 知的方法容易确定。
取决于应用，水解酶可以在组合物中以0.01至1000U/g的量范围存在。
当在组合物中应用微生物时，其优选以1×103至1×1012cfu/g的量范围 存在。
本发明的组合物中所用的微生物可以选自细菌、酵母或真菌。优选的 是，微生物是有益菌种微生物。更优选的是，其选自约氏乳杆菌 (Lactobacillus johnsonii)(CNCM I-1225)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(ATCC BAA-999)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)(CNCM I-3446)或它们的混合物。
本发明的另一方面提供了包含迷迭香酸或植物提取物与其水解产物组 合的组合物，所述植物提取物包含迷迭香酸和/或其衍生物。优选的是，水 解产物是通过迷迭香酸和/或其衍生物的酶裂解可获得的。此类水解产物可 以选自咖啡酸、3，4-二羟基苯基乳酸等以及它们的混合物。
本发明的组合物特别用于改善或预防对皮肤的损伤。实际上，已经发 现它们特别用于抑制基质金属蛋白酶的表达。优选的是，基质金属蛋白酶 是1型。图8显示在组成性MMP1释放中水解对包含迷迭香酸的提取物的 作用。与对照、阿魏酸和包含迷迭香酸(没有水解)的提取物相比，可以看 出至少部分水解的迷迭香酸对组成性MMP1释放具有相当大的作用，这使 其特别用于改善和/或预防对皮肤的损伤。
根据实施方案，本发明的组合物可以用于美容。在该实施方案中，可 以将组合物设计为口服消耗或局部应用。
“美容用途”表示非治疗性用途，其可以改善美容方面或者安抚人或 宠物的皮肤、皮毛和/或头发。
在上下文中，美容用途可以包括预防对人或宠物的皮肤、皮毛和/或头 发的损伤，和/或改善人或宠物的皮肤、皮毛和/或头发。此类损伤特别包括 皮肤的光化性和老化损伤，例如干燥、无规则色素沉着(显著的是雀斑、雀 斑样痣、斑状黑素减少症和持久性色素沉着过度)、皱纹(显著的是细微表 面线条和深沟)、星状假瘢痕、弹性组织变性、无弹性、毛细血管扩张、静 脉湖、粉刺、皮脂增生、软垂疣和脂溢性角化病。
美容用途还可以对头发和皮毛具有特别的益处，例如改善的头发或皮 毛的密度、纤维直径、颜色、油性、光泽度、皮脂产生，并且可以帮助预 防头发和皮毛脱落。
当用作美容用途时，本发明的组合物可以采用上述食物组合物的任何 形式。优选的是，其是饮食添加物的形式，其可以是液体或干燥形式，例 如溶液剂、喷雾剂、片剂、胶囊剂、明胶胶囊剂、锭剂、散剂、凝胶剂、 乳剂等。更优选的是，其是胶囊剂形式。
可选择的是，组合物可以采用局部组合物形式，其可以是以下形式： 水、水-醇或油性溶液剂、溶液型的分散剂或者洗液或浆液型的分散剂、具 有液体或半液体稠度的牛奶型的乳剂，其通过将油相分散在水相中获得 (O/W)，反之亦然(W/O)，或者具有柔软、半-固体或固体稠度的乳膏、水 凝胶或无水凝胶型的混悬剂或乳剂，或者其它离子和/或非离子型微乳、微 囊或微粒或者囊泡分散体。
这些组合物根据技术人员已知的常规方法制备。在优选的实施方案中， 这些局部组合物是如此设计的以便酶和/或微生物与迷迭香酸仅在局部应 用时相互作用。
局部应用的组合物可以特别组成用于脸、手、脚、主要解剖学的褶或 身体的清洁、保护、治疗或护理的霜剂(例如日霜、晚霜、卸妆霜、粉底霜、 防晒霜)、化妆产品例如液体粉底、卸妆乳、身体的保护或护理乳、日晒后 乳、护肤洗剂、凝胶剂或泡沫剂，例如清洁或消毒洗剂、防晒洗剂、人工 晒黑洗剂、沐浴组合物、包含杀菌剂的除臭组合物、剃须后的凝胶剂或洗 剂、脱毛膏或用于虫咬的组合物、肥皂、清洁块、乳膏剂、凝胶剂、乳剂 或摩丝、用于头发的气雾剂组合物等。
另一方面，本发明涉及水解酶或微生物在水解迷迭香酸(图1)中的用 途，所述微生物包含或产生水解酶。对于图4至7，迷迭香酸水解为咖啡 酸(图2)和3，4-二羟基苯基乳酸(图3)可以取决于所用酶的量、水解进行的 pH和温度以及迷迭香酸的存在量。
因此，本发明提供了包含迷迭香酸和/或其衍生物的组合物中的水解酶 或微生物在改善所述组合物的生物功效中的用途，所述微生物包含或产生 所述水解酶。
当微生物用于该目的时，其优选选自细菌、酵母或真菌。更优选的是， 其是有益菌种微生物。最优选的是，其选自约氏乳杆菌(CNCM I-1225)、 长双歧杆菌(ATCC BAA-999)、乳双歧杆菌(CNCM I-3446)或它们的混合 物。
根据本发明的另一个实施方案，给出了制备具有提高的生物功效的包 含迷迭香酸和/或其衍生物的组合物的方法。
该方法包括第一步，提供迷迭香酸和/或其衍生物。这可以通过多种药 草，例如迷迭香、牛至、甘牛至草、百里香、紫苏、胡椒薄荷、聚合草、 欧芹、蜜蜂花、鼠尾草、海索草、罗勒、熏衣草等或它们的混合物，或者 通过天然来源的提取物来提供。
优选的是，迷迭香酸以0.01mg至10g(以干物质计算)的量范围来提 供。
第二步，提供了水解酶或微生物，所述微生物包含或产生所述水解酶。
当酶以本身应用时，其优选以0.01-1000U/g的量范围来提供。
如果应用微生物时，其优选以1×103至1×1012cfu/g的量范围来提供。 微生物可以选自细菌、酵母或真菌。根据优选的实施方案，微生物是有益 菌种。更优选的是，其选自约氏乳杆菌(CNCM I-1225)、长双歧杆菌(ATCC BAA-999)、乳双歧杆菌(CNCM I-3446)或它们的混合物。
然后，该方法的第三步包括将迷迭香酸和/或其衍生物以及水解酶和/ 或微生物与进一步的成分混合，所述微生物包含或产生所述酶，以产生所 述组合物，从而迷迭香酸的水解发生在组合物中或体内。
因此，将迷迭香酸转化为上述咖啡酸和3，4-二羟基苯基乳酸的过程在 食物基质本身中、在局部应用的产品本身中或者在体内消化过程的早期或 在局部应用上发生，从而提高包含迷迭香酸和/或其衍生物的所述组合物的 生物功效。
进一步的成分可以包括用于制备食物产品、局部组合物和功能成分的 任何成分。这些包括碳水化合物、蛋白质、脂质、纤维、维生素、益生元、 矿物质、植物提取物等。
产生的组合物可以是任何形式，例如上述的那些组合物。
本发明进一步包括改善个体健康的方法，该方法包括施用权利要求1 至15中任意一项的组合物的步骤。施用可以是局部的或口服的。
本发明的组合物确实可以用作抗氧化剂、抗炎剂和抗高血压剂。另外， 其在预防或治疗心血管和脑血管疾病中、在预防2型糖尿病中以及在脑退 化疾病中具有正向作用。
另外，本发明的组合物可以施用用于治疗和/或预防皮肤损伤，所述损 伤是例如由应激环境产生的，例如通过化学、生物学或物理学应激，例如 暴露于氧化剂或致癌物，暴露于细菌、病毒、真菌、衍生自周围细胞和/ 或微生物的脂质，或暴露于UV-辐射产生的。
这些损伤进一步包括光化性角化病、紫癜、cherry angiodema、基底 细胞癌和鳞状细胞癌、皮肤烧伤和/或发疱、表皮增生、炎症、免疫抑制和 癌症，例如非-黑素瘤和黑素瘤皮肤癌。
本发明的组合物对人或宠物皮肤的作用可以通过应用常规方法来测 定，包括最小红斑量(MED)、比色法、经表皮失水、DNA修复、测量白介 素和蛋白聚糖的产生或者胶原酶活性、屏障功能或细胞更新。因此本发明 的组合物用于改善和预防对皮肤的损伤。
应当理解的是，本发明的概念也可以用作辅助治疗，给目前所用的药 物疗法以帮助。由于本发明的组合物易于与食物一起口服施用，因此可以 施用包含高量的目标物质的特别的临床食物。
通过下述非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1
口服施用的美容剂
硬胶囊剂形式的组合物具有以下配方：
  化合物   mg/胶囊剂   迷迭香提取物   500   约氏乳杆菌   5×108cfu   片芯赋形剂   微晶纤维素   70   EncompressTM   60   硬脂酸镁   3   无水胶体二氧化硅   1   包衣剂   Gum-lac   5   滑石粉   61   蔗糖   250   聚维酮   6   二氧化钛   0.3
  着色剂   5
该组合物可以以每天2至3个胶囊剂的量施用于个体。
实施例2
食物配方通过将迷迭香提取物(或迷迭香酸)与约氏乳杆菌(La1， CNCM I-1225)以1×105至1×1012cfu细菌对应1g至10g迷迭香提取物(或 迷迭香酸)的比例混合而制备。将产生的混合物加入至任何适合的载体中或 者与任何适合的载体混合，所述载体例如发酵牛奶、酸奶酪、新鲜奶酪、 凝乳(renneted milk)、糖果棒、早餐谷类片或棒、饮料、奶粉、基于大豆 的产品、非牛奶发酵产品或营养添加物，用于临床营养。
实施例3
迷迭香酸的酶裂解
酶量的影响
试验是在磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.6)中、在40℃下应用不同量的 酶(0.01U、0.02U和1U酶/mg迷迭香酸)进行的。如图4所示，反应速率 与酶量成比例，并且当氯原酸酯酶以1U/mg底物应用时，仅30分钟反应 时间后，迷迭香酸完全转化为咖啡酸和3，4-二羟基苯基乳酸(没有列出数 据)。
pH的影响
研究了pH对迷迭香酸的酶水解(0.02U/mg)的影响。图5显示了在pH 值5.0、6.0、7.0和8.0下咖啡酸的产生。在pH 8.0下，2小时反应时间后， 迷迭香酸完全转化，而反应速率在pH 6.0下非常低，并且在pH 5.0下没 有观察到水解。
温度的影响
为了研究温度对反应速率和对产物稳定性的影响，试验是在pH 6.6下、 在磷酸盐缓冲液(50mM)中、应用0.02U/mg底物的酶并且在30℃、40℃ 和50℃下进行的。如图6所示，当反应在40℃或50℃下进行时，没有观 察到显著的差异，而在30℃下反应速率非常低。
底物浓度的影响
底物浓度对反应速率和产量的影响是在40℃、pH 6.6下，应用0.02 单位的酶和1mg、2mg、4mg或6mg的迷迭香酸研究的。图7显示了反 应速率和产量受酶/底物比例的强烈影响。
实际上，当应用1mg底物时，高于90％的迷迭香酸在4小时后被水 解，而当应用6mg底物时，在相同条件下仅观察到40％水解。
实施例4
用微生物裂解迷迭香酸
1.与约氏乳杆菌(CNCM I-1225)培养
将细菌在37℃、缺氧状态下、在MRS培养基中生长16小时。离心后， 将细胞沉淀用10mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH 8)洗涤3次。将细胞(0.60 g)悬浮于1mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH 8)中并且加入迷迭香酸(5mg/mL) 并且将混合物在45℃下培养24小时。每隔1/2小时取出等份用于动力学研 究。离心后，将上清液通过HPLC分析。培养4小时后，所有的迷迭香酸 转化为咖啡酸和3，4-二羟基苯基乳酸。
2.与乳双歧杆菌(CNCM I-3446)培养
将细菌在37℃、缺氧状态下、在MRS+0.05％半胱氨酸培养基中生长 16小时。离心后，将细胞沉淀用10mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH 8)洗涤 3次。将细胞(0.60g)悬浮于1mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH 8)中并且加入 迷迭香酸(5mg/mL)并且将混合物在45℃下培养24小时。每隔1/2小时取 出等份用于动力学研究。离心后，将上清液通过HPLC分析。培养24小 时后，大于50％的迷迭香酸转化为咖啡酸和3，4-二羟基苯基乳酸。
实施例5
试验条件，MMP-1(基质金属蛋白酶)剂量(ELISA)
处理和辐射
将成纤维细胞置于96孔板的培养基中。预培养24小时后，将培养基 用包含试验产物的培养基(或没有产物的培养基，用作参考)代替。每个试 验条件进行三次(应用3个培养孔)。
在试验产物的存在(或不存在)下培养24小时后，将培养基除去并且用 缓冲液(EBSS)代替并且将细胞避开任何光源。
在培养结束后，将EBSS溶液用包含试验化合物的培养基代替，并且 将板在37℃、5％CO2下放置。
处理48小时后，收集培养上清液用于ELISA MMP-1剂量。然后，细 胞层的细胞生存是根据标准方法通过测量活细胞脱氢酶还原MTT来评价 的。
胶原酶(MMP-1)的定量
MMP-1剂量(人间质胶原酶)是通过ELISA，应用“BIOTRACK人 MMP-1，ELISA系统，Amersham RPN2610”试剂盒，根据供应商的说明 书来实现的。
数据处理
将计算数据转出并且用PRISM软件(Graph Pad Software)处理。组间 比较是通过方差分析(ANOVA)，应用邓奈特(Dunnett)多重比较检验来进行 的。
下表显示由成纤维细胞释放的组成性MMP-1。＊表示与参考具有显著 差异(p＜0.01)。Naturex是可商购获得的包含迷迭香酸的天然提取物。
水解的Naturex是通过用约氏乳杆菌的有益菌种(CNCM I-1225)处理 包含迷迭香酸的天然提取物而获得的。迷迭香酸在培养过程中至少部分转 化为咖啡酸和3，4-二羟基苯基乳酸。

上表中所示的结果表明与未水解的迷迭香酸相比，至少部分水解的迷 迭香酸提供皮肤益处。更特别的是，其显示了本发明的组合物对MMP-1 的表达的抑制作用。