最近几十年基因工程的快速发展已经导致新鉴定了大量具有潜 在治疗效果的蛋白质基因，并且可以在生物表达系统的帮助下毫无困 难相对大量地生产纯或几乎纯的相应基因产物。

然而，这些蛋白质在实际中的应用，例如在诊断、治疗和生物转 化中的应用常常遇到困难，因为它们的稳定性和可溶性通常不能令人 满意，特别是在生理pH值下。这些蛋白质的两个实例是肿瘤坏死因 子TNF-α或白介素-2。

另外，糖蛋白在原核系统如大肠杆菌中表达时经常出现可溶性问 题，因为它们没有经过自然糖基化就被表达，在有些情况下导致溶解 度大大降低。这可能要求必须使用成本高得多的真核表达系统。

在体内治疗的应用方面，多种蛋白质被极快地从血流中清除或降 解。全身施用分子量大于约70kD的蛋白质可能被网状内皮系统或者 通过与细胞受体的特异性相互作用从循环中清除。分子量小于约70 kD的较小蛋白质还可以被肾脏的肾小球滤过而大量清除(排阻限度约 为70kD)。

最近解决所述问题的一种方法包括将这些问题蛋白质与具有良 好水溶性的生物相容聚合物(例如，聚乙二醇和葡聚糖)偶联。一方面， 通过偶联能够使分子量升高到70kD的阈值以上，使得较小蛋白质的 血浆滞留时间能够显著延长，另一方面，亲水性聚合物部分能够提高 蛋白质在水介质中的溶解度。

此外，可能与蛋白质与这些聚合物偶联有关的有利作用通常是基 于结合的聚合物对蛋白质分子上蛋白酶识别位点和抗原决定簇的掩 蔽。一方面，治疗性蛋白质基本上能够避免被水解降解，另一方面， 基本上抑制了外源性治疗性蛋白质引起的变态反应的诱导。除了分子 量增加外，聚合物的存在保护蛋白质免于酶降解，另外通常免于热变 性。在许多情况下，蛋白质的稳定性和体内半衰期显著增加，而免疫 原性和抗原性降低。

迄今为止，大多数修饰用聚乙二醇或葡聚糖进行，通常优选PEG， 因为它产生较简单的产物。

目前只有少数关于蛋白质葡聚糖偶联的描述，例如：链激酶，纤 溶酶、血红蛋白或抑酶肽。然而，葡聚糖偶联物通常显示可能由葡聚 糖降解产物引起的高变应原性，低代谢稳定性，以及在许多情况下偶 联反应的低产率。这使得这些葡聚糖偶联产物至今均未被批准用于人 或动物的治疗。

PEG衍生化已经被相当频繁地进行，因此该方法现在可以被认为 是提高蛋白质分子量的标准方法。这些衍生物中的一些在美国处于临 床试验的不同阶段或者已经被批准。PEG-血红蛋白和超氧化物歧化酶 (SOD)的一种PEG加合物目前处于III期临床实验，后者是在聚合物 偶联方面研究得最多的蛋白质。PEG偶联的天冬酰胺酶已经被用于急 性淋巴细胞白血病的治疗。2001年，PEG-干扰素α被批准用于丙型肝 炎患者的治疗。

然而，也报道了关于这些PEG偶联物使用的从不适到危险的副 作用，如瘙痒、超敏反应和胰腺炎。另外，PEG偶联后蛋白质的生物 活性通常非常低，PEG偶联物降解产物的代谢仍然基本上不为人知， 并且可能是一种健康危险。

WO 99/49897描述了血红蛋白的偶联物，该偶联物是由氧化开环 多糖(如羟乙基淀粉或葡聚糖)的醛基与蛋白质的伯胺基反应形成。然 而，在这种情况下，使用的多糖被用作多功能试剂，产生性质难以调 节的非常不均匀的产物混合物。

美国专利6,083,909描述了在DMSO中将选择性氧化的羟乙基淀 粉与血红蛋白偶联的一种方法。然而，我们的研究表明，在所述条件 下不能获得希望的产物，因为血红蛋白在DMSO中变性，从而丧失 了生物活性。

因此仍然需要生理上良好耐受的葡聚糖或PEG偶联蛋白质的替 代物，它们能够提高蛋白质的溶解度，或者能够延长蛋白质的血浆滞 留时间。

因此，本发明的一个目的是提供这些替代物，以及发展制备这些 替代蛋白质衍生物的简单、有效的方法。

用具有以下特征的羟烷基淀粉-蛋白质偶联物实现本发明的这个 目的：羟烷基淀粉分子与蛋白质之间的结合作用是以以下基团之间偶 联反应形成的共价键合为基础：羟烷基淀粉分子的末端醛基或通过化 学反应由该醛基衍生的官能团，和能够与羟烷基淀粉分子的该醛基或 由其衍生的官能团反应的蛋白质的官能团，其中偶联反应直接形成的 键合必要时可以通过进一步的反应进行修饰。

本发明还包括含有这些偶联物的药物组合物，以及这些偶联物和 组合物在人或动物体预防或治疗中的用途，以及制备这些偶联物和组 合物的方法。

令人吃惊地发现，通过适当选择条件，上述反应能够在水溶液中 进行，从而使得蛋白质在许多情况下生物活性被完全或部分保留。

在这种情况下，用于偶联反应的水反应介质优选是水或水与有机 溶剂的混合物，其中混合物中水的比例至少约为70％(重量)，优选 至少约80％(重量)，更优选至少约90％(重量)。

偶联反应中羟烷基淀粉(HAS)与蛋白质的摩尔比通常约为20∶1到 1∶1，优选约为5∶1到1∶1。

基于蛋白质最初活性，本发明羟烷基淀粉-蛋白质偶联物的剩余生 物活性通常为至少40％，优选至少50％，更优选至少70％，进一步优 选至少90％，最优选至少95％。

本发明使用的羟烷基淀粉(HAS)能够用已知的方法制备，例如用 烯化氧或2-氯链烷醇如2-氯乙醇，使淀粉在脱水葡萄糖单元的C2和/ 或C6位点处羟烷基化(关于淀粉的羟乙基化，参见例如US 5,218,108)， 它们具有希望的不同分子量范围和取代程度。也可以使用可以购到的 任何制品。此处所用的“羟烷基淀粉”中烷基的定义包括甲基、乙基、 异丙基和正丙基，特别优选乙基。HES的一个基本优点是，它已经被 官方批准作为生物相容性血浆增容剂(expander)，并在临床上大规模 使用。

羟烷基淀粉的平均分子量可以是约3kD到几百万道尔顿，优选约 4kD到约1000kD，更优选约4kD到约50kD，或者约70kD到约 1000kD，特别优选约130kD。为了与小分子蛋白质偶联，优选地选 择羟烷基淀粉的平均分子量，使得偶联物超过上述70kD的阈值，而 对于与大分子蛋白质的偶联，羟烷基淀粉的平均分子量优选在所述范 围的较低区域。由于偶联可能在蛋白质的多个位点发生，因此偶联多 个小聚合物链而不是一个高分子量聚合物也可能是有利的。取代程度 (修饰的脱水葡萄糖单元的数量与脱水葡萄糖单元总数之比)同样可能 不同，通常在约0.2到0.8范围内，优选约0.3到0.7，更优选约0.5。 (注意：数值与介于0到1之间的“取代程度”有关)。C2与C6取代之比 通常在4到16范围内，优选8到12范围内。

这些参数可以用已知方法调整。使用羟乙基淀粉(HES)作为血液 代用品的经验表明，HES在血浆中的滞留时间取决于分子量和取代 程度以及取代类型(C2取代或C6取代)，较高的分子量、较高的取代程 度和较高比例的C2取代可延长滞留时间。

这些关系也适用于本发明的羟烷基淀粉-蛋白质偶联物，因此血浆 中一种具体偶联物的滞留时间能够通过多糖的比例进行调节。

平均分子量为130kD、取代程度为0.5和平均分子量为200kD、 取代程度为0.25的羟乙基淀粉产物已经在临床上用作血液代用品，也 适于在本发明中使用。

适用于本发明的蛋白质原则上是具有与HAS分子官能团反应的 必要官能团(例如游离氨基、硫醇基或羧基)的任何蛋白质。

也可以通过使蛋白质与一种适合的、生理耐受的双功能接头分子 反应来引入希望的官能团。对于本发明目的而言，偶联的接头分子的 剩余反应性官能团同样被看作“该蛋白质的反应性官能团”。

适合的接头分子在一端含有一个能够与蛋白质的反应性官能团 (例如氨基、硫醇基或羧基)共价键合的基团，在另一端含有一个能够 与末端醛基或通过化学反应由它衍生的官能团(例如羧基、活化的羧 基、氨基或硫醇基)共价键合的基团。在接头分子的两个官能团之间 有一个适当长度的生物相容的桥连分子，例如来源于链烷烃的基团、 (寡)烷撑二醇基团或另一种适合的寡聚物基团。优选能够与氨基反应 的基团是，例如：N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、 亚氨酸酯或其它活化的羧基；优选能够与硫醇基反应的基团是，例如： 马来酰亚胺和羧基；优选能够与醛基或羧基反应的基团是，例如：氨 基或硫醇基。

用于连接SH和NH官能团的接头分子的实例有：

AMAS  (N-α(马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯)

BMPS  (N-β(马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯)

GMBS  (N-γ(马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)

EMCS  (N-ε(马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯)

MBS  (m-(马来酰亚胺基苯甲酰)-N-羟基琥珀酰亚胺酯)

SMCC  (4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)

SMPB  (4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯)

SPDP  (3-(2-吡啶二硫代)丙酸琥珀酰亚胺酯)

Sulfo-GMBS  (N-γ(马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)

Sulfo-EMCS  (N-ε(马来酰亚胺基己酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)

用于连接SH和SH官能团的接头分子的实例有：

BMB  (1，4-二-马来酰亚胺基丁烷)

BMDB  (1，4-二-马来酰亚胺基-2，3-二羟基丁烷)

BMH(二-马来酰亚胺基己烷)

BMOE(二-马来酰亚胺基乙烷)

DTME(二硫代-二-马来酰亚胺基乙烷)

HBVS  (1，6-己烷-二-乙烯砜)

BM(PEO)3 (1，8-二-马来酰亚胺基三甘醇)

BM(PEO)4 (1，11-二-马来酰亚胺基四甘醇)

用于连接NH和NH官能团的接头分子的实例有：

BSOCOES  (二-(2-琥珀酰亚胺基氧基羰氧基)乙基)砜

BS3 (辛二酸二-(磺基琥珀酰亚胺基)酯)

DFDNB  (1，5-二氟-2，4-硝基苯)

DMA  (己二酰亚氨酸二甲酯HCl)

DSG  (戊二酸二琥珀酰亚胺基酯)

DSS  (辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)

EGS  (双(琥珀酰亚胺基琥珀酸)乙二醇酯)。

用于连接SH和CHO官能团的接头分子的实例有：

BMPH  (N-β(马来酰亚胺基丙酸)酰肼TFA)

EMCA  (N-ε(马来酰亚胺基己酸)酰肼)

KMUH  (N-κ(马来酰亚胺基十一烷酸)酰肼)

M2C2H(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基酰肼HCl)

MPBH  (4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼HCl)

PDPH  (3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼)。

用于连接SH和OH官能团的接头分子的实例有：

PMPI  (异氰酸N-(对马来酰亚胺基苯基)酯)

用于将SH官能团转化为COOH官能团的接头分子的实例有：

BMPA  (N-β-马来酰亚胺基丙酸)

EMCH  (N-β-马来酰亚胺基己酸)

KMUA  (N-κ-马来酰亚胺基十一烷酸)

用于将NH官能团转化为COOH官能团的接头分子的实例有 MSA(己二酸N-琥珀酰亚胺基酯甲基酯)或其更长链的同系物或乙二 醇的相应衍生物。

用于将COOH官能团转化为NH官能团的接头分子的实例有 DAB(1，4-二氨基丁烷)或其更长链的同系物或乙二醇的相应衍生物。

与分子的氨基反应、并且为了避免空间位阻在距该分子较远距离 处提供保护氨基的一个接头分子实例是TFCS(N-ε(三氟乙酰己酰氧 基)-琥珀酰亚胺酯)。

其它适合的接头分子为本领域技术人员公知，可以购到或者能够 如需要进行设计，并且取决于将要偶联的HAS和蛋白质中存在和希 望的官能团，利用已知的方法制备。

对于本发明目的，术语“蛋白质”包括含有至少9-12个氨基酸、优 选至少15个氨基酸、更优选至少25个氨基酸、特别优选至少50个 氨基酸的任何氨基酸序列，也包括天然衍生物，例如前(pre)或原(pro) 形式的蛋白质、糖蛋白、磷蛋白或合成的修饰衍生物，例如融合蛋白、 新糖蛋白，或通过基因工程方法修饰的蛋白质，例如融合蛋白、氨基 酸交换引入优选偶联位点的蛋白质。

为了人或动物体的预防或治疗，有关蛋白质将在体内行使所希望 的特定功能。因此，该蛋白质优选具有例如调节或催化功能、信号传 导或转运功能、或者免疫应答或免疫应答诱导中的功能。

例如，该蛋白质可以选自：酶、抗体、抗原、转运蛋白、生物粘 附蛋白、激素、生长因子、细胞因子、受体、抑制因子、激活剂、抑 制剂或其功能衍生物或片段。就此而言，“功能衍生物或片段”是指全 部或部分保留(例如至少10-30％，优选50％以上，更优选70％以上， 最优选90％以上)希望的母体分子的生物学性质或活性的衍生物或片 段。这种片段的特别优选实例是抗体片段。

具体例子有：α-、β-或γ-干扰素，白介素-例如IL-1到IL-18，生 长因子-例如表皮生长因子(EGF)、血小板生长因子(PDGF)、成纤维 细胞生长因子(FGF)、脑源性生长因子(BDGF)、神经生长因子(NGF)、 B细胞生长因子(BCGF)、脑源性神经营养生长因子(BDNF)、睫状神 经营养因子(CNTF)、转化生长因子如TGF-α或TGF-β，集落刺激因 子(CSF)-例如GM-CSF、G-CSF，BMP(骨形态发生蛋白)，生长激素 -例如人生长激素，肿瘤坏死因子-例如TNF-α或TNF-β，促生长素 抑制素，促生长素，生长调节素，血清蛋白-例如凝血因子II-X III， 白蛋白，促红细胞生成素，肌红蛋白，血红蛋白，纤溶酶原活化因子 -例如组织纤溶酶原活化因子，激素或激素原-例如胰岛素，促性腺 激素，黑素细胞刺激素(α-MSH)，曲普瑞林，下丘脑激素-例如抗利 尿激素(ADH)和催产素，释放素和抑制素，甲状旁腺激素，甲状腺激 素-例如甲状腺素、促甲状腺素、促甲状腺素释放素，催乳素，降钙 素，胰高血糖素，胰高血糖素样肽(GLP-1、GLP-2等)，肠促胰岛素 类似物(exendin)-例如肠促胰岛素类似物-4，瘦素(leptin)，加 压素，胃泌素，促胰液素，整联蛋白(integrin)，糖蛋白激素(例如 LH、FSH等)，色素激素，脂蛋白和载脂蛋白-例如Apo-B、Apo-E、 Apo-La，免疫球蛋白-例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD或其片段，水 蛭素，组织途径抑制剂，植物蛋白-例如凝集素或蓖麻毒素，蜂毒， 蛇毒，免疫毒素，E抗原，butroxobina，α-蛋白酶抑制剂，豚草变应 原，黑色素，寡赖氨酸蛋白(oligolysine protein)，RGD蛋白，或适 当时这些蛋白质之一的相应受体；或这些蛋白质或受体之一的功能衍 生物或片段。

例如，适合的酶可选自：碳水化合物特异性酶，蛋白水解酶，氧 化酶，氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂合酶，异构酶，激酶和连接 酶。具体的非限制性实例有：天冬酰胺酶，精氨酸酶，精氨酸脱氨酶， 腺苷脱氨酶，谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶-天冬酰胺酶，苯丙氨酸-氨 裂合酶，色氨酸酶，酪氨酸酶，超氧化物歧化酶，内毒素酶 (endotoxinase)，过氧化氢酶，过氧化物酶，激肽释放酶，胰蛋白 酶，胰凝乳蛋白酶，弹性蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，脂酶，尿酸酶，腺 苷二磷酸酶，嘌呤核苷磷酸化酶，胆红素氧化酶，葡萄糖氧化酶， glucodase，葡糖酸氧化酶，半乳糖苷酶，葡糖脑苷脂酶，葡糖苷酸酶， 透明质酸酶，组织因子，组织纤溶酶原激活物，链激酶，尿激酶， MAP激酶，DNAse，RNAse，乳铁蛋白，及其功能衍生物或片段。

如上所述，HAS分子参与偶联反应的官能团是末端醛基或通过化 学反应由其衍生的基团。

这种化学反应的一个实例是，利用一种温和氧化剂，例如碘、溴 或某些金属离子，或者通过电化学氧化，将该醛基选择性氧化为羧基 或活化的羧基，例如酯、内酯、酰胺，该羧基必要时在第二次反应中 被转化为活化的衍生物。该羧基或活化羧基然后可与蛋白质的伯氨基 或硫醇基偶联，形成酰胺键或硫酯键。

在一种特别优选的制备方法中，该醛基用摩尔过量的碘在碱性水 溶液中选择性氧化，碘与HAS的摩尔比优选为2∶1到20∶1，特别优 选约5∶1到6∶1。在实施例1描述的优化方法中，开始时将一定量的 羟烷基淀粉溶解于热蒸馏水中，加入优选浓度为约0.05-0.5N、特别 优选约0.1N的略低于1摩尔当量的碘水溶液。之后，以几分钟的间 隔，向反应溶液中逐滴缓慢加入摩尔浓度为碘溶液的约5-15倍、优 选约10倍的NaOH水溶液，直到溶液在加入后再变澄清。再向反应 溶液中加入略低于1摩尔当量的上述碘水溶液，再次逐滴加入NaOH溶液，重复加入碘和NaOH，直到已经加入了基于羟烷基淀粉的约 5.5-6摩尔当量的碘溶液和11-12摩尔当量的NaOH溶液。然后终止反 应，使反应溶液脱盐(例如通过透析或超滤)，进行阳离子交换层析， 通过冻干法获得反应产物。利用该方法，获得与HAS分子量无关的 基本定量的产率。

在另一个特别优选的实施方案中，用碱稳定的金属离子(例如Cu++或Ag+)溶液进行选择性氧化，也得到基本定量的产率(实施例2)。在 这种情况下优选使用约3-10倍摩尔过量的氧化剂。

已经形成的选择性氧化的羟烷基淀粉(ox-HAS)随后在活化试剂 存在下与所需蛋白质的游离氨基反应，形成酰胺键。适合的活化试剂 的实例有：N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基邻苯二甲酰亚胺，苯硫酚，对 硝基酚，邻，对-二硝基酚，三氯苯酚，三氟苯酚，五氯苯酚，五氟苯 酚，1-羟基-1H-苯并三唑(HOBt)，HOOBt，HNSA，2-羟基嘧啶，3- 羟基嘧啶，3，4--二氢-4-氧代苯并三嗪-3-醇，4-羟基-2，5-二苯基-3(2H)- 噻吩酮1，1-二氧化物，3-苯基-1-(对硝基苯基)-2-吡唑啉-5-酮)，[1-苯 并-三唑基-N-氧三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐](BOP)，[1-苯并三唑基氧 三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐](PyBOP)，[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四 甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)，[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基 脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)，[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-二(亚戊基) 脲鎓六氟磷酸盐]，[O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-二(四亚甲基)脲鎓六 氟磷酸盐，羰基二咪唑(CDI)，或者优选碳二亚胺，例如1-(3-二甲基 氨丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，二环己基碳二亚胺(DCC)，二异丙基 碳二亚胺(DIPC)，特别优选EDC。与关于类似偶联反应的文献中描述 的常规方法相反，令人吃惊地发现常规使用碳二亚胺后不必使用其它 必须的活化剂如三唑(例如HOBt)，它们甚至使产量降低。在EDC 的存在下和在不含HOBt的情况下，ox-HES与各种典型化合物进行 的本发明偶联反应能够获得基本与HES分子量无关的高产率(参见实 施例)。

除羧基或活化羧基与蛋白质的(例如赖氨酸或精氨酸残基的)游离 伯氨基反应外，与蛋白质的(半胱氨酸的)硫醇基的类似反应在原则上 也是可能的。然而，就这一点而言，必须考虑半胱氨酸通常参与S-S 键，因此不能用于偶联反应。另一方面，如果存在游离半胱氨酸，它 们通常在催化中起重要作用，或者与亚单位的接触位点有关。对这些 半胱氨酸的修饰将导致生物活性部分或完全丧失。可以利用常规基因 工程方法解决这一问题，例如在已知不参与活性的蛋白质位点处进行 定点诱变或化学肽合成，导入游离半胱氨酸。这样对偶联位点进行最 佳控制成为可能。同样，也可以向蛋白质内定向引入其它反应氨基酸， 例如Lys、His、Arg、Asp、Glu。

羟烷基淀粉分子的反应性基团也可能是通过末端醛基的化学反 应产生的胺或硫醇基团。例如，在氢和催化剂存在下、或者在氰基硼 氢化钠存在下，通过与氨反应能够进行醛基的还原胺化。产生的氨基 或硫醇基然后可与蛋白质(例如任选活化的谷氨酸或天冬氨酸)的游离 羧基反应，形成酰胺或硫酯键。

羟烷基淀粉分子的末端醛基或通过化学反应由其衍生的官能团 也可以与合适的生理耐受的双功能接头分子反应。在这种情况下，参 与偶联反应的“通过化学反应由羟烷基淀粉分子的末端醛基衍生的官 能团”是与末端醛基或由其衍生的官能团反应的双功能接头分子的剩 余反应性官能团。这样，就可以将末端醛基转化为希望的官能团。

适合的接头分子在一端含有一个能够与末端醛基或通过化学反 应由它衍生的官能团(例如羧基、活化的羧基、氨基或硫醇基)共价键 合的基团，在另一端含有一个能够与蛋白质的反应性官能团(例如氨 基、硫醇基或羧基)共价键合的基团。在接头分子的两个官能团之间 有一个适当长度的生物相容的桥连分子，例如来源于链烷烃的基团、 (寡聚)亚烷基二醇基团或另一种适合的寡聚物基团。能够与氨基反应 的优选基团是，例如：N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚 胺酯、亚氨酸酯或其它活化的羧基；能够与硫醇基反应的优选基团是， 例如：马来酰亚胺和羧基；能够与醛基或羧基反应的优选基团是，例 如：氨基或硫醇基。

适合的接头分子的多个具体非限制性实例已经在上文关于接头 分子与蛋白质偶联的部分中列出。

在本发明的另一种偶联方法中，末端醛基直接与蛋白质的(例如 赖氨酸或精氨酸残基的或N端的)伯氨基反应，形成希夫碱。形成的 希夫碱随后或者平行地通过与适合的还原剂反应被还原，形成在水介 质中稳定的蛋白质与HAS的键合。优选的还原剂是硼氢化钠、氰基 硼氢化钠、有机硼复合物，例如4-(二甲基氨基)吡啶-硼复合物、N- 乙基二异丙基胺-硼复合物、N-乙基吗啉-硼复合物、N-甲基吗啉-硼复 合物、N-苯基吗啉-硼复合物、卢剔啶-硼复合物、三乙基胺-硼复合物、 三甲基胺-硼复合物；适合的立体选择性还原剂有，例如：三乙酸硼 氢化钠、三乙基硼氢化钠、三甲氧基硼氢化钠、三仲丁基硼氢化钾 (K-Selectride)、三仲丁基硼氢化钠(N-Selectride)、三仲丁基硼氢化锂 (L-Selectride)、三戊基硼氢化钾(KS-Selectride)和三戊基硼氢化锂 (LS-Selectride)。

通过适当改变反应条件能够提高产率。这些优化实验的参数包括 反应混合物的pH(碱性硼氢化物引起的可能的蛋白质降解)、温度和 温育时间，和一锅反应的还原剂的性质。另一个选择是分两步进行反 应，在此情况下还原步骤可以使用固定化的还原剂。

偶联反应的产物可以用已知方法进行研究，可以测定偶联效率。 因此，例如可以在与三硝基苯磺酸偶联之前和之后测定蛋白质中游离 的伯氨基(Habeeb，ASAF，Anal.Biochem.14，328-336(1966))。伯胺反 应的偶联产率也可以通过用荧光胺衍化非反应性胺及测定荧光来检 测。分子量分布可以通过SDS-PAGE和凝胶渗透来测定。偶联物中的 蛋白质含量可以通过SDS-PAGE和随后的银染色检测，而糖含量可以 通过将SDS-PAGE分离的带印迹到膜上后进行聚糖特异性染色来确 定。也可以进行定量聚糖测定。通过作肽图和/或MALDI-TOF质谱法 或电喷雾电离质谱法能够准确地鉴定蛋白质上的偶联位点。这样就可 以优化偶联、预先确定分子量分布、甚至可能预先确定(例如，如果 蛋白质上的反应性基团的反应性不同)产物的偶联位点。

本发明的偶联物适当时可以直接使用，或者以药物组合物的形式 用于人或动物体的预防或治疗。

这种类型的组合物包括药学有效量的作为活性成分的本发明偶 联物，和可药用载体，以及必要的其它治疗剂或药学成分或赋形剂。 赋形剂可包括，例如：稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性 剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)和用来使制剂与目的受 体的血液等渗的物质。药学有效量是在在治疗过程中一次或多次施用 后足以显示所需有效效果以缓解、治愈或预防一种病理状态的量。可 药用载体是与药物活性成分和患者身体均相容的载体。

组合物的形式因希望或适合的给药途径而不同。一种优选途径是 肠胃外给药，例如：皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、关节内、鞘内、 硬膜外注射或必要时输注。也可以鼻内、气管内或局部给药。例如， 局部施用根据本发明偶联的生长因子可以加速创伤愈合。药物组合物 可以方便地以剂量单位的形式提供，用药学领域众所周知的任何方法 生产。

本发明的偶联物也可以用于已经使用其它蛋白质-聚合物偶联物 (例如PEG-蛋白质偶联物)的其它所有领域。一些具体的非限制性实例 包括使用HAS-蛋白质偶联物作为在不均相中反应的固定化催化剂或 反应物，或者作为(免疫)亲和层析的柱材料。了解此处公开的本发明 HAS-蛋白质偶联物性质的熟练技术人员应当知道其它可能的用途。

下列实施例旨在更详细地说明本发明，而非限制本发明。具体而 言，也可以用羟甲基淀粉和羟丙基淀粉进行类似的反应，并且能够获 得类似的结果。

实施例1

用碘选择性氧化羟乙基淀粉(HES)

通过在圆底烧瓶中加热，将10g HES-130kD溶解于12ml去离 子水中。向该溶液中加入2ml I2溶液(0.1N)。含有2ml 1.0N NaOH的一个移液管通过一个双向连接器与该烧瓶连接，以每4分钟约1滴 的速度逐滴加入NaOH溶液。在加入约0.2ml NaOH溶液后使该溶液 脱色，同时加入第二部分2ml 0.1N碘溶液。在加入总共14ml碘溶 液和2.8ml NaOH溶液后完成反应。然后用去离子水透析反应混合物。

内酯化：

为了将醛糖酸盐基团转化为醛糖酸基团，部分脱盐的溶液在阳离 子交换柱(Amberlite IR-120，H+型)上进行层析。随后通过冻干除去水， 获得内酯形式。

氧化程度的测定：

每次将1ml碱性铜试剂(3.5g Na2PO4、4.0g酒石酸钾钠溶于50 ml H2O中，加10ml 1N NaOH，8.0ml 10％浓度(重量/体积)CuSO4溶 液和溶于10ml H2O中的0.089g碘酸钾，加入18g硫酸钠后，补水 至100ml)在N2气环境下移液到1ml样品溶液中。将该混合物在 100℃下加热45分钟。冷却后，加入0.2ml 2.5％浓度的KI溶液和0.15 ml 1M H2SO4。5分钟后加入1滴酚红指示剂溶液(1％重量/体积)，用 5mM Na2S2O3溶液进行滴定直到颜色消失。未反应醛基的浓度可以 根据滴定剂的消耗量来计算。

获得近乎定量的产率(＞98％)。通过该方法，能够像氧化较低分子 量(例如10kD、25kD、40kD)的羟乙基淀粉一样以类似高产率氧化 较高分子量(例如130kD、250kD、400kD)的羟乙基淀粉。

实施例2

用Cu2+离子选择性氧化HES

通过加热在10ml去离子水中制备0.24mmol HES-130kD的溶 液。将该溶液在100ml圆底烧瓶中加热至70-80℃，加入1.17mmol 稳定化Cu2+(例如使用作为稳定剂的罗谢尔盐或其它稳定剂)和稀 NaOH水溶液(终浓度为0.1N NaOH)。然后升高温度至100℃，继续 反应直到出现微红色。终止反应，将反应混合物冷却到4℃，过滤除 去微红色沉淀。滤液用去离子水透析，然后如实施例1所述转化为内 酯并冻干。氧化是定量进行的(产率＞99％)。通过该方法也能够氧化低 分子量HES(例如HES-10kD、HES-25kD、HES-40kD)和较高分子量 的HES类。

实施例3

选择性氧化的高分子量HES(ox-HES-130kD)与人血清白蛋白 (HSA)的偶联

通过在具有磁力搅拌器的圆底烧瓶中温和加热，使4.3g ox-HES-130kD和200mg HAS(Sigma，Taufkirchen)完全溶解于水中。 向该溶液中加入溶于水的30mg乙基二甲基氨丙基碳二亚胺(EDC)。 非常温和地搅拌2小时后，加入第二部分30mg EDC。非常温和地再 搅拌2小时后，加入第三部分40mg碳二亚胺。将反应混合物在这些 条件下放置过夜，用蒸馏水透析15小时，然后冻干。通过凝胶渗透 层析、SDS-PAGE和印迹到PVDF膜后进行碳水化合物特异性染色 (Glyco-Dig试剂盒，来自Roche-Boehringer，Basle)证实偶联成功。偶 联产物的产率约为90％。

实施例4

选择性氧化的低分子量HES(ox-HES-10kD)与人血清白蛋白 (HSA)的偶联

在有磁力搅拌器的圆底烧瓶中使7.4g ox-HES-10kD和50mg HAS完全溶解于水中。通过上述对高分子量HES的方法进行反应， 分三份加入总共282mg EDC。将反应混合物如上所述透析并冻干。 分析(见上)表明获得偶联产物，但是产率略低于与高分子量ox-HES 的偶联。

实施例5

ox-HES-130kD与肌红蛋白(Mb)的偶联

将4.3g ox-HES-130kD完全溶解于水(6-7ml)中，然后加入溶解 于10ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)的100mg Mb(Sigma， Taufkirchen)。加入30mg EDC开始偶联反应。每2小时重复加入EDC， 直到消耗总共90mg碳二亚胺。反应混合物然后用50mM磷酸盐缓 冲液pH7.0透析，冻干。GPC显示在450nm处的滞留体积中检测到 一个明确的产物峰。可以据此计算出偶联产率为88％。HES化肌红蛋 白的氧气结合能力约为未修饰Mb结合能力的76％。

实施例6

ox-HES-10kD与超氧化物歧化酶(SOD)的偶联

将一体积份的ox-HES-10kD水溶液(1.05g/ml)与一体积份的7 mg/ml SOD溶液(Sigma，Taufkirchen)在50mM磷酸盐缓冲液pH7.6 中室温温育。在24小时内分5份加入280mg EDC开始偶联反应。在 磷酸盐缓冲液中进行GPC分析，并在280nm下检测，跟踪反应的进 程。24小时后，在分离柱的较高分子量区域内发现81％的蛋白质， 之后终止反应。反应混合物用30kD膜透滤，然后冻干。产物的质谱 分析显示HES与蛋白质的平均摩尔比约为3∶1。

实施例7

ox-HES-130kD与链激酶(SK)的偶联

将3.8mg ox-HES-130kD与35mg链激酶(Sigma，Taufkirchen)一 起溶解于最小量的50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中。在室温下，加入 46.5mg EDC和20mg水合1-羟基苯并三唑(HOBt)，轻轻搅拌维持反 应总共24小时。透析并冷冻干燥后，经GPC分析发现约78％的蛋白 质为HES偶联物。在银染色的SDS-PAGE中，可以观察到链激酶分 子量明显提高。与之平行，利用洋地黄毒苷法在高分子波段中明显检 测到碳水化合物结构。

实施例8

ox-HES-130 kD与人白介素-1(IL-2)的偶联

温和加热，使45mg ox-HES-130kD完全溶解于0.5ml 50mM磷 酸钠缓冲液pH6.5中。加入0.25mg人IL-2(Sigma，Taufkirchen)，后 者使溶液不透明，在室温下搅拌混合物4-6小时。然后以2小时的时 间间隔分4份加入5mg EDC，持续搅拌过夜，形成澄清的溶液。GPC 分析显示偶联产率约为65％。

实施例9

ox-HES-25kD与人肿瘤坏死因子α(TNFα)的偶联

将0.3mg hTNFα(Sigma，Taufkirchen)加入86mg ox-HES-25kD在 约0.4ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的溶液中。将该浑浊的溶液搅 拌约2小时，之后加入1mg EDC和0.5mg HOBt。继续搅拌约6小 时，溶液在反应时间内变得澄清。偶联产物通过超滤分离、冷冻干燥， 通过GPC和在280nm处的检测进行分析。发现本反应的偶联产率约 为74％。

实施例10

ox-HES-130kD与胰高血糖素样肽(GLP-1)的偶联

通过加热和轻柔搅拌将7.4g ox-HES-130kD溶解于最小体积的 水中。用移液管加入10mg酰胺形式的GLP-1(Bachem，瑞士)在50mM 磷酸盐缓冲液pH7.4中的溶液。加入35mg EDC开始反应，小心搅 拌2小时。该步骤重复两次，在这之后，在GPC分析中280nm处的 肽峰不再明显，即几乎完全转化为偶联产物。该偶联产物用30kD膜 透滤，从磷酸盐缓冲液中冻干。根据MALDI质谱分析的结果能够推 断肽与HES的化学定量为1∶1。

实施例11

高分子量HES(HES-130kD)与人血清白蛋白(HSA)的偶联

将9.75g HES-130kD完全溶解于水(6-7ml)中，然后加入溶解于 1ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中的50mg HSA。反应混合物用磁力 搅拌器搅拌。该溶液然后与NaBH3CN(50-70mg)混合，轻轻搅拌几分 钟。每2小时进一步搅拌该溶液15分钟。然后加入另一等份 NaBH3CN(约50mg)。最终(接近36小时的反应时间之后)使用了总量 为285mg的NaBH3CN。然后将该溶液透析并冻干。如实施例4所述 进行分析。偶联效率约为65％。

实施例12

低分子量HES(HES-130kD)与人血清白蛋白(HSA)的偶联

将4.5g HES完全溶解于水(4-5ml)中，加入溶解于1ml 0.1M磷 酸盐缓冲液(pH7.4)中的50mg HSA。当溶液澄清时(必要时用磁力 搅拌器搅拌实现)，加入NaBH4(50-70mg)，轻轻搅拌混合。将该溶 液不加搅拌静置2小时，然后如同与高分子量HES的反应一样每2 小时搅拌15分钟。当溶液不再有任何气泡时(生成H2)，加入另一份 NaBH4(约50mg)。最终使用了总量为180mg的NaBH4。然后将该 溶液透析并冻干。通过凝胶渗透层析(GPC)进行分析，产率约为15％。

实施例13

HES-40kD与天冬酰胺酶的偶联

将3.0g HES-40kD完全溶解于水(约4ml)中。加入80mg天冬酰 胺酶(Sigma，Taufkirchen)在6ml 0.1M硼酸盐缓冲液pH9.0中的溶 液，搅拌直到反应混合物澄清。然后使温度升高到37℃，2小时后加 入约50mg NaBH3CN。该反应循环再重复3次。反应混合物用0.1M 磷酸盐缓冲液pH7.4透析，获得产物。偶联产物的产率约为61％， 约73％的天冬酰胺酶活性保留。

实施例14

HES-130kD与人白介素-2(IL-2)的偶联

将50mg HES-130kD完全溶解于水(约0.2ml)中。加入0.25mg 人IL-2(Sigma，Taufkirchen)在0.2ml 0.1M硼酸盐缓冲液pH9.0中的 悬液，搅拌直到反应混合物澄清(4小时)。以每4小时的间隔加入1mg 份的NaBH3CN，持续搅拌。再经过24小时的反应时间后，混合物用 0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4透析，冻干。根据GPC分析，偶联产物 的产率约为42％。

实施例15

HES-130kD与胰岛素的偶联

将4.0g HES-130kD完全溶解于水(约6ml)中。加入溶于7.5ml 0.1M硼酸盐缓冲液(pH9.0)的55mg来自牛胰腺的胰岛素(Sigma， Taufkirchen)，在37℃下搅拌约24小时。在8小时内缓慢逐滴加入还 原剂NaBH3CN(60mg，30ml)。然后再搅拌反应混合物24小时，通 过超滤(30kD)除去无关物质和未反应的试剂。冻干产生稳定的偶联产 物。使用的胰岛素中约有55％作为HES偶联物回收。

实施例16

ox-HES-130kD与超氧化物歧化酶(SOD)的偶联

将130mg ox-HES-130kD完全溶解于6ml PBS pH 6中，然后加 入溶于1ml PBS pH 6的10mg SOD(Roche，Mannheim)。加入10mg EDC开始偶联反应。每3小时重复加入EDC，直到消耗39mg碳二 亚胺。通过GPC在258nm处监测反应。24小时后，在分离柱的高分 子量区域内发现50％的蛋白质，终止反应。反应混合物用25mM磷 酸盐缓冲液pH7.2透析，冻干。SOD活性是最初活性的95％。通过 GPC-光散射联合测定HES蛋白质样品的质量分布，显示HES与蛋白 质的摩尔比为1∶1。

实施例17

ox-HES 70kD与胰高血糖素的偶联

将胰高血糖素(66×10-9mol，0.23mg)、ox-HES 70kD(6.6×10-6mol， 123mg)在圆底烧瓶中溶解于磷酸盐缓冲液(1ml，pH 5)中。以1小时 的间隔分10份加入26mg EDC。在24小时反应时间后，加入10ml 水终止反应。用水透析后通过GPC和离子交换层析纯化偶联产物。 冷冻干燥产生88mg白色偶联产物(73％)。