本发明要解决的技术问题之一是提供一种特异靶向性药物,该药物将介导肝细 胞特异性感染的病毒蛋白或多肽与药物相结合,利用病毒蛋白或多肽介导药物靶向肝 脏,从而治疗病毒性肝炎等肝脏局域性疾病。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种编码特异靶向性药物的核酸分子。
本发明要解决的技术问题之三是提供一种包含上述编码特异靶向性药物核酸分 子的载体。
本发明要解决的技术问题之四是提供一种包含上述载体的宿主细胞。
本发明要解决的技术问题之五是提供一种药物组合物,该组合物含有安全有效 量的特异靶向性药物和药学上可接受的载体。
本发明要解决的技术问题之六是提供所述特异靶向性药物在制备治疗肝脏疾病 的药物中的应用。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
在本发明的一个方面,提供了一种特异靶向性药物,它具有通式X-L-Y,其中,
X表示氨基酸序列,该序列包含:(a)来源于具有肝脏特异性或相对特异性感染 病毒的蛋白的氨基酸序列,(b)由(a)的序列发生一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、 插入或添加且与(a)具有相同活性的氨基酸序列,所述病毒蛋白与细胞感染受体或辅 受体相结合,并介导或辅助病毒的感染;
L表示X与Y之间的任一连接,该连接可缺失;
Y表示对正常细胞、病理状态下细胞、受感染细胞、肿瘤细胞及病原
微生物具有 药理或生理作用的药物和或基团;
所述X和Y的
位置可颠倒,X、L、Y之间可进行单一或多倍的排列组合,且多倍 排列组合中的各X或Y可相同或不同。
较佳地,所述具有肝脏特异性或相对特异性感染病毒包括甲型肝炎病毒、乙型 肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒及未分型肝炎病毒;尤其较 佳地,所述X序列包含:人乙型肝炎病毒表面大蛋白Pre-S1的多肽,或其保守性变 异多肽、或其活性
片段,或其活性衍生物;更佳地,所述X序列包含:具有SEQ ID NO:1 氨基酸序列的人乙型肝炎病毒表面大蛋白Pre-S1多肽,或其保守性变异多肽、或其 活性片段,或其活性衍生物;尤其更佳地,所述X序列选自下组:(a)具有SEQ ID NO:1 氨基酸序列的多肽,(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的置 换、缺失、插入或添加且具有与SEQ ID NO:1氨基酸序列相同活性的由(a)衍生的多 肽;特别优选X为具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽。
较佳地,所述Y是对正常肝细胞、病理状态下肝细胞、受感染肝细胞、肝肿瘤 细胞及肝细胞内病毒或病原微生物具有药理或生理作用的药物,包括
蛋白质、多肽、 细胞毒性药物、小分子药物及
放射性药物;尤其较佳地,所述Y为蛋白质药物,包括 细胞因子、干扰素、白细胞介素、生长因子、集落刺激因子、趋化因子及该类蛋白质 药物的突变体;更佳地,所述Y包含:干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素ω、 干扰素κ、干扰素τ、干扰素δ,或其保守性变异蛋白质、或其活性片段,或其活性 衍生物;尤其更佳地,所述Y选自下组:(a)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的干扰素 α-2b,(b)由(a)的蛋白发生一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入或添加且与 (a)的干扰素α-2b具有相同活性的衍生蛋白质;特别优选Y为具有SEQ ID NO:5氨 基酸序列的干扰素α-2b。
较佳地,所述L为X与Y之间的氨基酸连接;更佳地,所述L为主要由G(甘 氨酸)、A(丙氨酸)、S(丝氨酸)和T(苏氨酸)四种氨基酸组成的氨基酸序列。
本发明的特异靶向性药物优选为具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列,尤其优选SEQ ID NO:6氨基酸序列第15位氨基酸N(天冬酰氨)被氨基酸Q(谷氨酰氨)替换后产生 的SEQ ID NO:7氨基酸序列,特别优选第13位氨基酸G(甘氨酸)被豆蔻酰化的SEQ ID NO:7氨基酸序列。
在本发明的另一方面,提供了一种核酸分子,它编码上述特异靶向性药物的氨 基酸序列。
较佳地,所述核酸分子包括下列核苷酸序列之一:
(1)
序列表中SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的DNA序列;
(2)编码序列表中SEQ ID NO:7氨基酸序列的多核苷酸;
(3)与序列表中SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的DNA序列具有70%以上同源性, 且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
在本发明的另一方面,还提供了一种载体,它包含上述编码特异靶向性药物的 核酸分子。
在本发明的另一方面,还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面,还提供了一种药物组合物,该组合物含有安全有效量的 特异靶向性药物和药学上可接受的载体。
本发明还提供了特异靶向性药物在制备治疗肝脏局域性疾病的药物中的应用。
较佳地,所述肝脏局域性疾病包括病毒性肝炎、肝硬化及肝脏肿瘤。
在本发明中,X可来源于具有肝脏特异性或相对特异性感染的病毒的蛋白,这些 病毒包括人甲(Hepatitis A Virus,HAV)、乙(Hepatitis B Virus,HBV)、丙(Hepatitis C Virus,HCV)、丁(Hepatitis D Virus,HDV)、戊(Hepatitis E Virus,HEV)以及 其他型人类肝炎病毒、鸭肝炎病毒(Duck hepatiris virus,DHV)、土拨鼠肝炎病毒 (WHV)、旱獭乙肝病毒(WHBV)、地松鼠肝炎病毒(GSHV)、长毛猴肝炎病毒(WMHV)、 灰苍鹭乙型肝炎病毒(HHBV)、
雪鹅肝炎病毒(SGHV)以及其他动物嗜肝病毒、以及 其他具有肝脏特异性或相对特异性感染的病毒。本发明中的X优选地来源于人HBV、 HCV、HAV病毒及其他人嗜肝病毒,进一步优选地来源于人HBV表面蛋白及其他介导或 辅助人HBV特异性感染肝细胞的HBV病毒蛋白、人HCV病毒E1和E2蛋白及其他介导 或辅助人HCV特异性感染肝细胞的HCV病毒蛋白、人HAV病毒VP1、VP2、VP3、VP4 蛋白及其他介导或辅助人HAV特异性感染肝细胞的HAV病毒蛋白、以及其他介导或辅 助人嗜肝病毒特异性感染肝细胞的嗜肝病毒蛋白。本发明中的X还包括能结合肝细胞 表面特异或相对特异表达蛋白的多肽(天然序列或人工序列)或基团,这些在肝细胞 表面特异或相对特异表达的蛋白包括CD81、低
密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDL-R)、氨基葡糖多聚糖(glycosaminoglycans,GAG)、多 聚人血清
白蛋白(PHSA)、修饰的血清蛋白(modified serum albumin,MSA)、IgA 受体、HBV结合因子(HBV BF)、p80、羧基肽酶D(gp180)、B类I型清道夫受体(scavenger receptor class B type I,SR-BI)、甘露糖结合的凝血素DC SIGN(mannose binding lectins DC SIGN)、L SIGN、无唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor, ASGPr)、HAV细胞受体1(HAV cellular receptor 1,HAVcr-1)及其他在肝细胞表 面特异或相对特异表达的蛋白。本发明中的一个
实施例中,X来源于人HBV的病毒蛋 白,优选地来源于人HBV的表面大蛋白,进一步地优选来源于HBV表面大蛋白Pre-S1 区,其序列可进一步优选地自N和/或C末端缩短0至119个氨基酸,尤其优选X包 含SEQ ID:1或与该序列具有0.1%至99.9%同源性的氨基酸序列,同时也包括来源 于不同基因型(包括A至H基因型)和血清型(包括ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、 adw2、adw4、adrq+、adrq-)表面大蛋白序列和突变序列。在本发明的一个优选方案 中,X特别优选地采用如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
本发明中X任何部分或末端可被优选地修饰,这些修饰包括在其N和/或C末端 添加1至1000个氨基酸组成的多肽序列、在X的任何部分糖基化等化学修饰,较优 选地SEQ ID NO:7的第13位氨基酸甘氨酸或本发明所包含其他序列所对应的氨基酸 带有的疏
水基团,这些疏水基团优选地具有4个以上
碳原子的饱和或不饱和
脂肪酸的 丙烯残基,更优选的是豆蔻酸、棕榈酸、
硬脂酸、油酸、亚油酸或花生四烯酸。疏水 基团另外还优选胆固醇及其类似基团。在本发明的一个优选方案中,SEQ ID NO:6 和SEQ ID NO:7的第13位氨基酸甘氨酸经豆蔻酰化(myristoylation)修饰。本发 明中X的任何氨基酸残基可被替换,在一个优选方案中,SEQ ID NO:6的第15位氨基 酸N(天冬酰氨)可被氨基酸Q(谷氨酰氨)替代。
本发明中的L为X与Y之间的任何连接(可完全缺失,使X与Y直接连接),这 些连接包括氨基酸、多肽、蛋白质、化学键、核酸(DNA或RNA)、
偶联剂(包括硫醋 类、碳化二亚酰胺、琥珀酰亚胺酯类、二异氰酸酯(例如
甲苯-2,6-二异氰酸酯)、 谷二
醛(gluteraldehydes)、重氮苯和六亚甲基二胺类(例如双-(对重氮苯甲酰基) -乙二胺)、亚氨酸酯类的双功能化衍生物(例如己二酰亚胺酸二甲酯)、双活性氟化 合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)、N-琉拍酞亚胺基-3--(2-吡啶基二硫代) 丙酸(SPDP)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺
盐酸盐(EDC)、4- 琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(SMPT)以及其 他偶联剂),以及其他用于生物分子之间的连接。优选地L为多肽连接,较优选地含 有丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸等柔性氨基酸组成的多肽链,更优选地L为含有 1至999个氨基酸的多肽链。在本发明的一个优选方案中,L为SEQ ID NO:4所示的 多肽链。
本发明中Y表示具有药理或生理作用的药物或基团,优选地Y为对肝细胞、肝 肿瘤细胞、肝细胞内病毒或肝脏内的细胞、肿瘤细胞及病原微生物具有药理或生理作 用的药物或基团。Y包括蛋白质、多肽、细胞毒性小分子药物、
放射性药物及其他药 物,较优选地Y为对肝细胞、肝肿瘤细胞、肝细胞内病毒或肝脏内的细胞、肿瘤细胞 及病原微生物具有药理或生理作用的蛋白质,包括细胞因子、毒性蛋白,更优选地Y 为细胞因子,包括干扰素(interferon,IFN)、白细胞介素(包括白细胞介素1、白 细胞介素2至白细胞介素100)、生长因子(包括肝细胞生长因子、肝
细胞增殖素、肝 生长抑制因子、肝促分化因子、促肝细胞生长素、肝素结合生长因子、
纤维母细胞生 长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、
角蛋白细胞生长因子、神经生长因、胰 岛素样生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、干细胞因子、生长
激素、肿 瘤特异性生长因子、
成纤维细胞生长因子)、集落刺激因子(包括粒细胞集落刺激因 子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、干细 胞生成因子、多能集落刺激因子)、趋化因子(包括趋化因子α、β、γ、δ)及这 些细胞因子的突变体和人工设计序列。尤其优选地Y为干扰素,包括IFNα、β、γ、 ω、κ、τ、δ及其突变体和人工设计序列。特别优选地Y为干扰素α,包括IFNα-1a、 α-1b、α-2a、α-2b其突变体和人工设计干扰素(包括INFERGEN及其他复合干扰素 (consensus interferon),以及其他具有干扰素活性的突变体和人工设计的干扰素)。 在本发明的一个优选方案中,Y为IFNα-2b(SEQ ID NO:5)或其突变体。本发明的Y 包括与SEQ ID NO:5具有大于50%同源性的氨基酸序列。Y的任何部分或末端可被修 饰,这些修饰包括在其N和/或C末端添加1至1000个氨基酸组成的多肽序列、在Y 的任何部分糖基化、去糖基化、聚乙二醇(PEG)及其他化学修饰。
本发明中X和Y的位置可颠倒,X、L、Y之间可进行单一的或多倍的排列组合, 例如但不限于形成X-L-Y-L-X、Y-X-Y等形式。多倍排列组合中的各X或Y可相同或 不同。在本发明中的一个优选方案中,采用X-L-Y结构,X来源于人乙型肝炎病毒表 面大蛋白Pre-S1区多肽,L为柔性氨基酸链接,Y为干扰素α-2b,从而发明了特异 靶向性干扰素,特别优选氨基酸序列见SEQ ID NO:7,其中X和Y分别位于序列的N 和C末端,该特异靶向性IFN,能在延长IFN半衰期的同时,将IFN靶向到肝脏,提 高了IFN在肝脏的局部浓度,且在增强IFN治疗肝部疾病疗效的同时降低肝脏外IFN 引起的不良反应。。
本发明的特异靶向性药物可采用核酸序列编码(包括DNA和RNA序列),优选地 采用DNA序列编码。在本发明的一个实施例中,优选的氨基酸序列见SEQ ID NO:7, 其对应的DNA编码序列为SEQ ID NO:8,本发明包含与SEQ ID NO:8编码相同氨基 酸序列的简并DNA序列。在保持简并性条件下优选地按照细菌、
酵母细胞、动物细胞、
植物细胞和昆虫细胞及其他细胞或生物喜用密码子规律调整DNA编码序列,使DNA编 码序列更好地在细菌、酵母细胞、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞及其他细胞或生物 中表达。本发明优选地采用酵母细胞喜用密码子编码靶向性干扰素SEQ ID NO:7,其 相应的DNA序列为SEQ ID NO:9。进一步优选地,本发明对SEQ ID NO:6中的潜在糖 基化为点进行替换,以避免在酵母表达过程中特异靶向性干扰素被过分糖基化而影响 特异靶向性干扰素的活性,替换后的序列为SEQ ID NO:7。其他位点经替换而形成的 序列为本发明的一部分,本发明包含与SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9具有大于50%同 源性的DNA序列。
本发明中的载体包括细菌表达载体、酵母表达载体、动物细胞表达载体、植物 细胞表达载体、昆虫细胞表达载体、病毒载体及其他表达载体。在本发明的一个优选 方案中将编码特异靶向性药物的DNA片段克隆入酵母分泌性表达和胞内表达载体,这 些载体包括pPIC9、pPIC9K、pPIC3、pPIC3K、pA0804、pA0815、pHIL-S1、pHIL-D2、 pHW010、pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pYAM7SP6、pMEN6K、pMEX9K及其他酵母 表达载体。更优选地将编码特异靶向性药物的DNA片段克隆入pPIC9K酵母表达载体。 在本发明的一个实施例中,化学合成的特异靶向性干扰素编码DNA片段克隆入pPIC9K 酵母表达载体,形成重组酵母表达载体pPIC9K-IFN(图3B)。
本发明还包含由含有编码特异靶向性药物DNA序列表达载体转化的细胞宿主和 动植物宿主,这些细胞宿主包括细菌、酵母菌、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞,其 中的细菌包括大肠杆菌DH5α、BL21、JM83、JM107、JM109、C600、KS476、JM109、 MC1061、YA21、YK537;动物宿主包括牛、羊、猪;植物宿主包括番茄、马铃薯、香 蕉。在本发明的一个优选方案中,包含由含有特异靶向性药物DNA序列的表达载体转 化的酵母菌,这些酵母菌包括巴斯德毕赤氏母(Pichia pastoris)、博伊丁假丝酵母 (Candida boidinii)、汉逊酵母(Hansenula)、球拟酵母(Torulopsis)、
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae),优选巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母,尤其优选营 养
缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株GS115(NRRLY-15851)、GS190(NRRLY-18014)、 PPFI(NRRLY-18017)、KM71和蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株SMD 1168,特别优选 巴斯德毕赤酵母菌株GS115。在本发明的一个实施方案中,重组的酵母表达载体 pPIC9K-IFN经线性化后转化酵母菌GS115,经筛选获得整合有特异靶向性干扰素编码 DNA序列的GS115菌株。
整合有特异靶向性药物编码DNA序列的宿主,经过培养或
发酵,表达特异靶向 性药物,经纯化可获得特异靶向性药物。在本发明的一个实施例中,整合有特异靶向 性干扰素编码DNA序列的宿主GS115菌株经发酵表达特异靶向性干扰素蛋白。这些含 有特异靶向性干扰素蛋白的发酵上清经纯化后获得特异靶向性干扰素纯蛋白。特异靶 向性干扰素按照中国生物制品规程(中国生物制品标准化委员会编.[M].北京:化 学工业出版社,2000,373-375.)进行活性测定,表明目的蛋白具有良好的抗病毒活性 (0.9×108IU/mg)。同时,特异靶向性干扰素对人肝细胞具有明显的特异性亲和作用。
本发明中所述药物组合物含有安全有效量的特异靶向性药物和药学上可接受的 载体,这类载体包括
淀粉、糊精、
蔗糖、乳糖、
纤维素类、硬脂酸镁、吐温-80、卡 波姆、甲基纤维素、
羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、甘油、明胶、聚乙二醇、硫柳汞、 尼泊金丙酯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、三氯叔丁醇、苯
甲酸钠、
硼砂、新洁尔灭、 山梨醇、丙二醇、异丙醇、月桂氮桌
酮,异丙醇/丙二醇、异丙醇/丙二醇、三
乙醇 胺、氢氧化钠凡士林、硬脂酸、液状
石蜡、羊毛脂、十八醇、十六醇、单硬脂酸甘油 酯、月桂醇
硫酸钠、司盘60、平平加、甘露醇、山梨醇及其他药物载体。制剂方式包 括注射剂、
冷冻干燥注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、片剂、胶囊剂、喷雾 剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服液、混悬剂、冲剂、贴剂、丸剂、散剂、注射剂、输 液剂、栓剂、缓释制剂、
控释制剂及其他制剂。
本发明还包括特异靶向性药物在制备治疗肝炎(包括甲、乙、丙、丁、戊及其 他型病毒性肝炎)、肝硬化、肝脏肿瘤(原发肿瘤及转移肿瘤)及其他肝脏疾病的药 物中的应用。
本发明的特异靶向性药物利用嗜肝病毒的嗜肝特异性分子机制,将介导肝细胞特 异性感染的病毒蛋白或多肽与治疗性分子相连接,产生的特异靶向性药物可对病毒性 肝炎、肝硬化、肝脏肿瘤等肝脏疾病进行靶向治疗,在增强药物疗效的同时又降低药 物对肝脏以外器官造成的不良反应。
附图说明
图1特异靶向性干扰素氨基酸序列N连接糖基化位点分析;
图2编码特异靶向性干扰素DNA序列的酵母菌密码子偏好性分析;
图3pPIC9K、pPIC9K-IFN图谱及KEX-2、STE-13酵母内源蛋白酶加工位点;
图4特异靶向性干扰素SDS-PAGE
电泳图及HPLC纯度分析图;
图5FITC标记的特异靶向性干扰素及rIFNα-2b对人肝细胞亲和
力比较。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具 体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手 册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按 照制造厂商所建议的条件。
实施例1特异靶向性干扰素氨基酸序列的设计
1.X序列选择HBV毒株FMC#97表面大蛋白第1到50氨基酸序列(SEQ ID NO:3), 该序列包括被广泛证实的与肝细胞表面特异性结合并介导HBV感染肝细胞的关键序 列。
2.L选择由柔性氨基酸组成的序列(SEQ ID NO:4),以减少X与Y之间在蛋白构 象和功能上的相互影响。
3.Y序列选择IFNα-2b全长氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
4.X和Y分别位于L序列的N末端和C末端,形成的整体序列见SEQ ID NO:6。
5.对SEQ ID NO:6进行糖基化位点分析(见图1),其中第15位氨基酸天冬酰氨 为可能的N连接糖基化修饰位点,将其进行类似氨基酸突变替换(15N→Q),以消除 特异靶向性干扰素在酵母表达过程中出现过度糖基化而影响IFN和Pre-S1的功能活 性,形成的最终特异靶向性干扰素氨基酸序列为SEQ ID NO:7。
实施例2编码特异靶向性干扰素的DNA序列的设计
1.选择毕赤酵母作为特异靶向性干扰素的表达系统。毕赤酵母是一种用于外源 蛋白表达最成功的真核表达系统(Cereghino J L,Cregg J M.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev,2000,24(1):45-66.)。既具有原核表达系统繁殖迅速、
费用低廉及操作方便 的特点,又具有外源蛋白质加工折叠正确和适度糖基化的真核表达系统优点。因此越 来越广泛地用于蛋白质的大量表达,目前已有200多种蛋白在该表达系统中得以表达 (Cregg JM,Cereghino JL,Shi JY,et al.Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J].Mol Biotechnol,2000,16(1):23-52.)。毕赤酵母具有 胞内表达和分泌表达两种表达方式,其中分泌表达方式因其表达量高、糖基化完全、 二硫键和高级结构形成正确、后续分离纯化简便而备受青睐。
2.进行特异靶向性干扰素编码基因设计时考虑如下原则:1)特异靶向性干扰素 编码基因尽可能选用巴斯德毕赤酵母醇
氧化酶(AOX 1)基因偏爱的密码子,降低该 基因中毕赤酵母罕用密码子的比例;2)消除特异靶向性干扰素基因内部可能出现的 复杂二级结构(包括重复结构、互补结构、发夹结构及大片段的反向回文结构等);3) 消除特异靶向性干扰素基因内部不适宜基因操作的限制性内切酶位点;4)在特异靶 向性干扰素基因内部尽量减少连续的G-C
配对,增加毕赤酵母偏爱的A-T配对,但避 免出现基因G+C%失调。
3.特异靶向性干扰素SEQ ID NO:7对应的自然DNA序列为SEQ ID NO:8,其酵母 密码子偏好分析见图2A。经过以上原则的重新设计,用于酵母表达载体的特异靶向性 干扰素DNA序列为SEQ ID NO:9,其酵母密码子偏好分析见图2B,未见偏好小于10 %的稀有密码子。
实施例3特异靶向性干扰素酵母表达载体的构建
1.选择pPIC9K为特异靶向性干扰素的酵母表达载体。pPIC9K是Invitrogen公 司推出的多拷贝分泌型表达载体,大小为9.3kb(如图3A)。该载体含有大肠杆菌复 制起点Col E1和氨苄青霉素及卡那霉素两个抗性基因,其中卡那霉素抗性基因还可 以使毕赤酵母对G418产生抗性,可用于多拷贝插入的筛选。载体中使用醇氧化酶基 因的启动子(pAOX1)做为诱导型启动子,该启动子受
葡萄糖抑制,甲醇诱导后才开 始转录和翻译,非常适合于外源基因的表达。pPIC9K利用a交配因子引导序列的分泌
信号将目的基因产物分泌至胞外。由于毕赤酵母本身仅将总量5%的蛋白分泌至胞外, 因此对分泌表达的蛋白进行分离纯化极为方便。该载体在a交配因子引导序列与目的 蛋白之间引入了酵母内源性蛋白酶KEX-2和STE-13加工位点(图3C),使表达的目的 产物经酵母内源性蛋白酶加工后,可以直接获得N末端无a交配因子引导序列的目的 蛋白。
2.在设计的特异靶向性干扰素DNA序列(SEQ ID NO:9)的5’和3’两端根据 需要分别加入EcoR I、Not I酶切位点粘性末端。化学合成特异靶向性干扰素DNA序 列的正链和负链,
退火后将特异靶向性干扰素DNA序列克隆入pPIC9K的EcoR I、Not I酶切位点。将链接后的载体
转染大肠杆菌中扩增,挑取单克隆菌落,抽提质粒测序 鉴定正确连入的重组pPIC9K,即pPIC9K-IFN(图3B)。
实施例4特异靶向性干扰素的酵母表达
1.酵母表达载体分为附加体型与整合体型两种宿主携带方式。附加体型的重组 载体存在于酵母的
细胞质内,重组质粒在酵母宿主细胞芽殖分裂、世系传代中容易丢 失,因而难以用于工业化大型
发酵罐的大生产。整合体型表达载体是以线形化质粒或 环形质粒形式通过同源重组方法整合到酵母的基因组内(单拷贝或多拷贝整合),然 后随着酵母宿主菌
染色体的复制而复制,外源目的基因在酵母世系传代趋于稳定,适 合用工业化大型发酵罐来进行发酵生产。pPIC9K即为多拷贝整合体型酵母表达载
2.重组酵母表达载体pPIC9K-IFN经酶切线性化后,电转化法转化毕赤酵母宿主 菌GS115,其方法参照Invitrogen毕赤酵母实验手册。
3.重组酵母克隆的筛选,其筛选方法参照Invitrogen毕赤酵母实验手册。
4.特异靶向性干扰素的诱导表达:将筛选出的重组克隆接种于5ml BMGY培养基 中,30℃ 300r/min培养至OD600 4.0至6.0。室温6000r/min离心4min收集菌体, 用BMMY悬浮并稀释至OD600 1.0,30℃ 300r/min每12h补充甲醇至0.5%诱导培养48h 后收集培养上清,SDS-PAGE检测蛋白表达。
5.结果显示,电转化后的毕赤酵母GS115经过筛选得到1个最高表达的转化酵 母宿主菌株(GS115/pPIC9K-IFN)。
实施例5特异靶向性干扰素的分离纯化
1.在本发明中,发酵培养酵母工程菌(GS115/pPIC9K-IFN)的
种子培养基和发 酵培养基(发酵罐用)均为已知培养基,如:YPD平板、BMGY液体培养基、
基础盐(合 成)培养基(参见“High Cell-Density Fermentation in Pichia Protocols”,edited by David R.Higgins and James M.Cregg,Vol.103,107-120,1998)和FM22培养 基;酵母工程菌(GS115/pPIC9K-IFN)的种子培养、发酵罐培养、外源蛋白诱导表达 的方法,均为Pichiafermentation process guidelines(Invitrogen Corporation, 2002)上提到的方法或在此基础上
修改的方法。
2.GS115/pPIC9K-IFN高表达酵母经种子培养、发酵罐培养、外源蛋白诱导表达 后,将诱导发酵48h的菌液10,000r/min离心10min后,取上清用0.45um滤膜过 滤,上清液经Hiprep疏水层析、Blue Sepharose FF亲和层析、Superdex 75凝胶过 滤层析纯化。
3.GS115/pPIC9K-IFN高表达酵母经发酵培养后发酵液内特异靶向性干扰素经纯 化后,SDS-PAGE(图4A)所示分子量约27kDa处蛋白条带即为重组酵母表达的特异 靶向性干扰素蛋白,HPLC鉴定纯度大于95%(图4B)。
实施例6特异靶向性干扰素的干扰素活性检测
1.通过WISH-VSV法测定特异靶向性干扰素的干扰素活性。
2.将人羊膜WISH细胞悬液接种于96孔板,每孔3.5×1011cell/100ul,37℃、5 %CO2条件下培养4-6h,取纯化的特异靶向性干扰素做系列稀释后每孔加入100ul, 37℃培养24h后吸弃上清,用含3%牛血清的DMEM培养基稀释水泡性口炎病毒(VSV) 至工作浓度(250TCID50/ml),每孔加入100ul以感染WISH细胞,继续培养24h。
3.每孔加入200ul0.5%的结晶紫液(0.5g结晶紫、0.85g NaCl溶于50ml无水 乙醇、3ml甲醇、47ml水),置37℃15min,漂洗残余染料,每孔加入200ul脱色液 溶解细胞内染料,测定每孔的A578nm吸收值,以rHuIFNα-2b为参考品按下列公式计算 特异靶向性干扰素效价:
待检样品效价=标准品效价×(待检样品预稀释倍数/标准品预稀释倍 数)×(待检样品半效稀释倍数/标准品半效稀释倍数)
其中待检样品半效稀释倍数,即从特异靶向性干扰素溶液至相当于标准品50 %最大效应点的稀释倍数。
4.结果表明特异靶向性干扰素比活达到0.9×108IU/mg。
实施例7特异靶向性干扰素肝细胞靶向效应的检测
1.人原代肝细胞的培养:非HBV相关的肝癌患者外科手术肿瘤
切除物相邻的正 常组织,按文献所述方法进行分离〔Guguen-Guillouzo,C.,和A.Guillouzo,1986. Methods for preparation of adult and fetal hepatocytes,第1-12页,在A. Guillouzo和C.Guguen-Guillouzo编辑的“Isolated and cultured hepatocytes” 中.Les E′ditions INSERM Paris,John Libbey and Co.,Ltd.,英国伦敦〕,培 养于添加了3.5×10-6M氢化可的松
琥珀酸单酯(hydrocortisone hemisuccinate)、2% 二甲基亚亚砜、5%人血清和5%胎牛血清的H培养基中。
2.特异靶向性干扰素和rHuIFNα-2b蛋白的FITC标记。将蛋白溶液置于碳酸盐 缓冲液(0.16M Na2CO3,0.33M NaHCO3,pH9.5)中
透析过夜。FITC溶于DMSO中,终 浓度为1mg/ml。将透析过的蛋白溶液置于小瓶中,按250μg FITC/mg蛋白的比例, 边搅拌边滴加适量的FITC溶液。于4℃,避光搅拌结合12hr。将Sephadex G25充分 膨胀后,仔细装柱,柱长度为15cm,直径为0.9cm,柱体积为9.5ml。装柱完毕后, 于凝胶表面
覆盖一层
滤纸,用PBS充分洗柱。将标记的蛋白
混合液加入柱中,上样体 积不超过柱床体积的10%。用PBS洗脱,收集第一个洗脱峰,检测各收集管的A280 和A495。计算
荧光素与蛋白质结合比率(F/P),计算公式为F/P=2.87×A495/ (A280-0.35×A495)。F/P值为2~4的组份混合,PBS透洗后即为FITC标记好的蛋 白。
3.人原代肝细胞于12孔培养板中培养,每孔约106细胞与FITC标记的特异靶 向性干扰素或rHuIFNα-2b蛋白孵育60分钟。移除上清后PBS漂洗细胞2次,经1 %甲醛固定后于荧光
显微镜488nm下观察。可见特异靶向性干扰素(图5A)较 rHuIFNα-2b(图5B)对肝细胞具有更高的亲和力。
序列表
<110>刘宏利
<120>
特异靶向性药物及其用途<130>NP-10451
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>119
<212>PRT
<213>人乙型肝炎病毒
<400>1
Met Gly Gly Trp Set Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Val Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
115
<210>2
<211>166
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu
1 5 10 15
Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys
20 25 30
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
165
<210>3
<211>62
<212>PRT
<213>人乙型肝炎病毒
<400>3
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Ash Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala
50 55 60
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(7)
<400>4
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210>5
<211>165
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
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Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
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130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu
165
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MOD_RES
<222>(13)..(13)
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(15)..(15)
<400>6
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1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
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Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr
165 170 175
Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln
180 185 190
Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp
195 200 205
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210 215 220
Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
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<211>233
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(233)
<220>
<221>MOD_RES
<222>(13)..(13)
<400>7
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(705)
<400>8
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cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagcg 180
ggagcaggtt ctggttctgg ttcttgtgac ctaccacaaa cccacagcct gggtagcagg 240
aggaccttga tgctcctggc gcagatgagg agaatctctc ttttctcctg cttgaaggac 300
agacatgact ttggatttcc ccaggaggag tttggcaacc agttccaaaa ggctgaaacc 360
atccctgtcc tccatgagat gatccagcag atcttcaacc tcttcagcac aaaagactca 420
tctgctgctt gggatgagac cctcctagac aaattctaca ctgaactcta ccagcagctg 480
aatgacctgg aagcctgtgt gatacagggg gtgggggtga cagagactcc cctgatgaag 540
gaggactcca ttctggctgt gaggaaatac ttccaaagaa tcactctcta tctgaaagag 600
aagaaataca gcccttgtgc ctgggaggtt gtcagagcag aaatcatgag atctttttct 660
ttgtcaacaa acttgcaaga aagtttaaga tctaaagagt aatag 705
<210>9
<211>705
<212>DNA
<213>人工序列
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<221>misc_feature
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ggagcaggtt ctggttctgg ttcttgtgac ttgccacaaa cccactccct gggttccagg 240
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atccctgtct tgcatgagat gatccagcag atcttcaact tgttctccac aaaagactca 420
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gaggactcca ttctggctgt gaggaaatac ttccaaagaa tcactttgta tctgaaagag 600
aagaaatact ccccttgtgc ctgggaggtt gtcagagcag aaatcatgag atctttttct 660
ttgtcaacaa acttgcaaga aagtttaaga tctaaagagt aatag 705