脓毒症是一种对生命存在潜在危险的、系统性临床疾病，它是由感染 或外伤的发展而引起的(Mesters，R.M.等(1996)Thromb Haemost.75： 902-907；Wheeler A.P.和Bernard G.R.(1999)N Engl J Med.340： 207-214)。通常，认为脓毒症是在严重感染过程中由于微生物毒素的释放 而引起的，但是脓毒性反应也可以在没有任何伴随微生物感染的迹象下由 其他疾病如外科手术、身体外伤、烧伤、器官移植或胰腺炎引起(Balk R.A. 和Bone R.C.(1989)Crit Care Clin 5：1-8；Ayres S.M.(1985)Crit Care Med 13：864-66)。在人体内，事实上来自所有革兰氏阴性细菌外膜上的脂 多糖类的内毒素的释放被认为是脓毒症的通常致因。
脓毒症后遗症的症状包括严重的低血压、连续多发性的器官衰竭或功 能紊乱和坏死性细胞死亡，并且可能是在重症监护病房中引起死亡的最常 见致因，同时可能导致严重的脓毒症、脓毒症诱发的低血压或脓毒性休克 (Parrillo，J.E.等(1990)Ann Intern Med 113：227-42；Manship，L.等(1984) Am Surg 50：94-101；Niederman M.S.和Fein A.M.(1990)Clin Chest Med 11：663-65)。尽管在医药和临床护理方面有了很大进步，但是身患脓毒性 休克的患者死亡率估计在30％至50％之间，这取决于是否存在其他并发病 症(Natanson，C.等(1998)Crit Care Med.26：1927-1931；Zeni，F.等(1997) Crit Care Med.25：1095-1100)。
因此，及时提出对脓毒症的治疗方案以产生好的结果是至关重要的。 拖延患者的最早治疗时间将会带来严重的后果。另外，治疗剂的最佳用药 时间取决于脓毒症的发病阶段。所以，对脓毒症及时可靠的诊断是有效治 疗的关键所在。
当前对脓毒症的诊断技术包括检验血液中的微生物或酸中毒是否呈阳 性，或者检验血液中的白血球或血小板的数目的变化；或是对一些身体症 状进行检查，比如发烧、发冷、打颤、换气过度、心跳加速、精神错乱等 (von Landenberg，P和Shoenfeld，Y(2001)IMAJ 3：439-442；Marshall，J. C等(1995)Crit Care Med 23(10)：1638-1652；Vincen，J.L等(1996) Intensive Care Med 22：707-710；Le Gall，J.R.等(1996)JAMA 276： 802-810；Knaus，W.A.等(1985)Crit Care Med 13：818-829)。然而，这些诊 断技术具有局限性，比如血液培养物检查可能因为太慢而耽误了最好的治 疗时机，或不足够灵敏，而且这些脓毒症的身体症状可能会被归因于其他 疾病症状，这些都可能导致不合理的治疗。
研究一种既迅速又可靠的诊断检验方法是非常有用的，它可以用于脓 毒症发展早期的诊断，一般在它发展成为脓毒性休克前就可以发现，这样 就可以监测正在接受脓毒症治疗的患者的情况或鉴定有发展为脓毒症可能 的患者。研发脓毒症诊断性检验方法对促进脓毒症新疗法的发现和发展是 有用的。
发明概述
在多种备选方面中，本发明提供了检测患者脓毒症的多种方法，概括 地说，是根据脓毒症患者的线粒体核酸(比如线粒体DNA或RNA，如线 粒体mRNA)耗损情况来定的。在某些患者身上，这些方法对于检测脓毒 症是很有用的，而通常无视引起脓毒症的潜在原因。
一方面，本发明提供了一种在需要诊断脓毒症的受试者中诊断脓毒症 的方法。这种方法包括检测受试者样本中线粒体核酸的相对量，这些数据 可以指示出受试者是否出现了脓毒症。另一方面，本发明提供了可以预测 出受试者是否具有发生脓毒症可能性的方法。这个方法包括检测受试者样 本中线粒体核酸的相对量，从而可以指示出受试者中感染脓毒症的可能性。 无论哪一个方面，患者都有可能感染脓毒症。
另一方面，本发明提供了一种可以监测脓毒症在发病受试者发展变化 的方法。此方法包括在两个不同时间点检测出受试者样本中线粒体核酸的 相对量，这两个时间点测定的线粒体核酸相对量变化可以指示脓毒症在受 试者中的发展变化。此方法还包括在样品中取一系列时间点测线粒体核酸 的相对量，或包括预测受试者体内脓毒症可能的临床进程。
另一方面，本发明提供了一种确定脓毒症治疗效果的方法。此方法包 括从对照受试者和试验受试者样品中测出线粒体核酸的相对量，其中让试 验受试者接受治疗，然后进行检测，两者的线粒体核酸相对量的区别可以 指示出治疗的效果。
在一个备选的方面中，本发明提供了诊断试剂盒，通过测定受试者样 品中线粒体核酸相对量来诊断受试者中脓毒症的程度。这个试剂盒可包括 线粒体核酸引物和核核酸引物。
在备选实施方案中，受试者可能是人(比如婴儿、老人或免疫缺陷的 个体)或是非人动物(比如患脓毒症的动物模型，像LPS引起的脓毒症)。 在某些实施方案中，如果受试者中线粒体核酸的相对量比预定的低，那么 受试者可被诊断出患有脓毒症或有感染脓毒症的可能，或对受试者启动脓 毒症的治疗。测定时设定的指标可以是任选地表示成比值，例如，线粒体 DNA(mtDNA)与核DNA(nDNA)的比值，若将标准的mtDNA/nDNA的 比值设定为1，那么预定的比值可以是0.45或更少。
在其它的备选实施方案中，脓毒症疾病状态可能是由革兰氏阴性细菌 感染、革兰氏阳性细菌感染、真菌感染、细菌感染、外伤、胰腺炎、器官 移植、出血、成人呼吸窘迫综合征、烧伤、外科手术、化学治疗或暴露于 电离辐射导致的脓毒症症状。样品可以是例如外周血液样本。
在备选实施方案中，线粒体核酸的相对量可以指示脓毒症的严重性或 脓毒症治疗成功与否。线粒体核酸数量可描述为受试者细胞中线粒体核酸 与核核酸的比值，例如，通过聚合酶链反应，比如定量聚合酶链反应，其 中，可将扩增后的线粒体核酸的含量与参考核酸的扩增相比较。聚合酶链 反应可以是实时聚合酶链反应，此时需要通过杂交探针来检测扩增后产物。
本发明的详细描述
在本发明的上下文中所使用的“脓毒症，”包括术语“脓毒症”、“菌 血症”、“败血症”、“脓毒性综合征”、“脓毒性休克”、“严重的脓 毒症”和“全身炎症反应综合征(SIRS)”，一般是指急性全身性炎症反 应，其与内源性炎症介质比如促炎性细胞因子、粘着分子、血管活性物质 和活性氧释放入血管相关联，伴随而来的是白细胞数目、体温、心跳和呼 吸作用的改变(Bone，R.C.等(1992)，Chest 101：1644-55；Paterson，R.L.， 和N.R.Webster(2000)J.R.coll.Surg.Edinb.，45：178-182)。一般认为脓 毒症是由感染或外伤引起的，并且是一种对所传染的微生物产生的非特异 性宿主反应，这些微生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌、原生 动物和病毒；或是对由感染或受伤引起的炎症介质产生的非特异性宿主反 应(Bone，R.C.等(1992)Chest 101：1644-55；Paterson，R.L.和N.R. Webster(2000)J.R.coll.Surg.Edinb.，45：178-182)。
在某些实施方案中，SIRS经诊断在患者中有以下两个或更多的症状： 体温超过38℃或低于36℃；心跳超过90次/分钟；呼吸频率超过20次/分 钟或PaCO2小于4.3kPa；白血球数目多于12×109/L或少于4×109/L或大 于10％的不成熟形态。在备选实施方案中，脓毒症可以定义为由感染引起 的SIRS，而重度脓毒症可以定义为具有明显器官低灌注性脓毒症。在备选 实施方案中，脓毒性休克可限定为低血压性(心脏收缩压少于90mmHG)重 度脓毒症，尽管它能通过血管加压/收力提供足够的回复力和修复来维持血 压(Paterson，R.L.和N.R.Webster(2000)J.R.coll.Surg.Edinb.，45： 178-182)。如果诊断和治疗不及时，脓毒症就能发展成脓毒性休克，导致 可致死的血压下降，而脓毒症的炎症相关效应可能导致组织损伤和进行性 器官功能紊乱和器官衰竭。
脓毒症可能由器官例如肾脏(例如，因上部泌尿管道感染)；肝脏； 胆囊；肠(例如，腹膜炎)；皮肤(例如，蜂窝组织炎)；肺(例如，细菌性肺 炎)；泌尿生殖道(例如，尿道脓毒)；或脑和脊髓(例如，细菌性脑膜炎)的 局部感染引起，或由全身性症状例如中毒性休克综合征引起。脓毒症也因 一些非传染性损伤比如化学治疗、急性胰腺炎、外科手术、身体外伤、烧 伤、器官移植、多器官功能失调综合征(MODS)、急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)、急性肺损伤(ALI)、播散性血管内凝血(DIC)、出血、或暴露于 电离辐射而引起(Bone，R.C.等(1992)Chest 101：1644-55；Paterson，R.L. 和N.R.Webster(2000)J.R.coll.Surg.Edinb.，45：178-182)。
脓毒症发生时有一系列生理症状：从发抖、发颤、发烧、虚弱、恶心、 呕吐、腹泻到严重的低血压、智力下降和连续的多器官功能紊乱和器官衰 竭(比如说，肾脏尿排泄量少；肺呼吸困难和血中溶氧量少；心脏中血液 滞留和肿胀，以及具脓毒性休克典型症状的坏死性和编程性细胞死亡。
在备选实施方案中，本发明的方法中包括对来自受试者的样品例如外 周血液样本或其细胞碎片中的线粒体核酸比如线粒体DNA(mtDNA)或线 粒体RNA例如线粒体mRNA(mt mRNA)定量以确定线粒体核酸的水平是 否预示脓毒症。“样品”可包括任何体液、细胞或组织，包括但不限于受 试者的外周血、淋巴细胞(例如B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞)、唾液、 尿、创伤组织、导管入口部位，或由其衍生的细胞系。在本发明的备选方 案中，用于化验的样品可以通过诸如尸体解剖或活组织切片从多种组织比 如心脏、脑、肺、肾、脂肪、脾、肝脏或从由其衍生的细胞中获得。
在备选实施方案中，本发明的方法还包括确定受试者如疑似感染脓毒 症或有感染脓毒症危险的受试者中线粒体核酸的相对量的测定法。这个受 试者可以是因为急性感染而接受治疗的患者，或是对脓毒症敏感的群体中 的一员。在某些实施方案中，受试者可以是非人类动物，例如家养的或放 牧的动物，像狗、猪、山羊、牛、鸡或火鸡。在某些实施方案中，受试者 可以是脓毒症的动物模型，如本领域技术人员所熟知或如这里所描述，可 以是大鼠、小鼠、山羊、猪、狒狒、恒河猴或狗。
本发明的检测方法包括PCR检测，如包括线粒体序列和参比序列比如 一个基因组序列的共扩增的半定量、定量PCR或RT-PCR。本发明的检 测方法还包括杂交检测，例如，RNA或DNA杂交检测，利用线粒体和核 DNA或RNA样品以及线粒体序列和参比序列(例如基因组或cDNA)作 为探针。从这些检测结果中可以估计出受试者细胞或组织中线粒体核酸与 核核酸的比值(例如，mtDNA比nDNA或mt mRNA比核RNA(nRNA))。
在本发明的多种实施方案中，检测方法因而可以在脓毒症发展或恶化 成脓毒性休克之前提供临床信息。线粒体核酸(例如mtDNA或mtRNA) 的损耗可以在施用合适的治疗后逆转，比如说用合适的广谱抗生素治疗。 参考对照的样品或已知的标准，包括脓毒症性休克在内的一些严重的脓毒 症症状可能在线粒体核酸(例如mtDNA或mtRNA)水平下降到低于正常水 平的约50％，40％，30％，20％或10％时出现。当线粒体核酸与核核酸的比 值(例如mtDNA与nDNA的比值或mt mRNA与nRNA的比值)低于阈值 比如0.5，0.45，0.4，0.35或0.3时(此参考对照样品或已知的标准测得)， 也预示可对脓毒症作临床治疗。
在备选实施方案中，在一段时间内线粒体核酸(如，mtDNA或mtRNA) 的相对浓度变化率也作为诊断信息。对于一些受试者，线粒体核酸(例如 mtDNA或mtRNA)的相对量的相对快速减少也可以作为脓毒症的指示指 标。在八至十天或更短的时间内，线粒体核酸与核核酸比值的相对量(比如 说mtDNA/nDNA或mt mRNA/nDNA)相对快速下降了50％或更多(或许 有些情况为大于40％)，这可以表明这个受试者正在发展为脓毒症，并需 要密切监控，和/或可能需要施用抗生素或其他抗脓毒症疗法。
在备选实施方案中，本发明也提供了这样的方案，例如，避免了确定 mtDNA拷贝数本身的必要，简化为测定线粒体核酸(例如mtDNA或mt mRNA)的相对量，比如说，测定相对于核核酸(例如nDNA或nRNA)序列 的数量。在一些情况下，这个方法可以简化此发明的诊断方法。比如说， 如图1所示，将代表核-基因组-等同物的数目(30-30,000)指定为nDNA的 扩增标准，如所述数目是用已知核-基因组-等同物浓度的对照人DNA校准 而确定。
将同样的线粒体基因数目随意对应在标准曲线上(虽然它们不能表示 计算出的线粒体基因拷贝数)。在备选的方法中，代表核-基因组-等同物 的数值可被随意赋予比如说nDNA扩增标准，其只基于样品的稀释度(这 样，这个数据反映了核-基因组-等同物的相对拷贝数，而不是此类等同物 的绝对值)，这些随意的数目可以类似地被赋予mtDNA扩增标准。然后 本发明的检验结果可以通过比如说mtDNA和nDNA比例来表示，而不需 要测定绝对的mtDNA拷贝数。在这样的实施方案中，优选地使用可提供 足够PCR模板的样品DNA或RNA的最初浓度，这样它的扩增循环次数 在能提供最可靠结果的范围内，比如说，从5到15的任何最小整数到从 15到40的任何最大整数。
因此本发明提供了用于比较核酸序列相对丰度的方法，包括：a)在第 一个和第二个核对照样品中、在核扩增反应条件下测定核DNA或RNA序 列的扩增动力学，以得到对照核扩增测定值，其中第一个和第二个核对照 样品具有不同的核DNA或RNA序列浓度；b)由对照核扩增测定值构建 对照核DNA或RNA序列数据库，以得到表示核DNA或RNA序列扩增 动力学和浓度之间的模型标准相关性；c)在第一个线粒体对照样品和在第 二个线粒体对照样品中、在线粒体扩增反应条件下测定线粒体DNA或 RNA序列的扩增动力学，以得到对照线粒体扩增测定值，其中第一个和第 二个线粒体对照样品具有不同的线粒体DNA或RNA序列浓度；d)由对 照线粒体扩增的测定值构建对照线粒体DNA或RNA序列数据库，以得到 线粒体DNA或RNA序列扩增动力学和浓度之间的模型标准相关性；e) 在受试样本中、在核扩增反应条件下测定核DNA或RNA序列的扩增动力 学，以得到受试样本核扩增测定值；f)将核DNA或RNA序列扩增动力 学和浓度之间的模型标准相关性应用于受试样本核扩增测定值中，以得到 受试样本核DNA或RNA序列浓度测定值；g)在受试样本中、在线粒体扩 增反应条件下测定线粒体DNA或RNA序列的扩增动力学，以得到受试样 本线粒体扩增测定值；h)将线粒体DNA或RNA序列扩增动力学和浓度之 间的模型标准相关性应用到受试样本线粒体扩增测定值，以得到受试样本 线粒体DNA或RNA序列浓度测定值；i)比较受试样本中核DNA或RNA 序列浓度测定值与受试样本中线粒体DNA或RNA序列浓度测定值，以确 定受试样本中相对于核DNA或RNA序列，线粒体DNA或RNA序列的 相对浓度。
在备选实施方案中，本发明的方法和试剂盒能用来确认处于急性感染 或因此引起脓毒症危险的易感人群中的那些个体。例如，新生儿(即刚出 生的婴儿或胎儿)以及年幼的孩子(两岁以下)特别对导致脓毒症的感染 易感，还有年老的人和免疫力低下的人(包括受过严重物理创伤比如烧伤 的患者)。在本发明的某些实施方案中，诊断具有、疑似患有或有可能HIV 感染或癌症的个体被排斥在本发明的方法外，所以本发明包括测定来自不 包括诊断具有、疑似患有或有可能HIV感染或癌症的个体的患者的样品中 线粒体核酸相对量的方法。在一些实施方案中，本发明的方法和试剂盒能 用来鉴定或监控在非人类动物比如，家养的，放牧的或实验动物中的脓毒 症疾病状态。
现在的治疗方法包括对易感高体温个体使用广谱抗生素或进行腰穿孔， 以排除脑膜炎。这样，在当前治疗脓毒症治疗策略下，诸多未患脓毒症的 患者不需要地进行了抗脓毒症治疗，有一些因素决定了这不是所期望的。 例如，广谱抗生素的使用是不提倡的，因为抗生素有一定的副作用，比如， 药物过敏、听力丧失或由于药物清除不好或抗生素抗性细菌菌株的发展导 致的内脏受损。而用像腰穿孔治疗具有相当的侵入性并给患者带来更多的 创伤。
应用快速、相对无侵入性的本发明的检测方法，治疗措施可限制于用 在已确诊患有脓毒症的患者。如果需要的话，这些患者可用感染特异的疗 法治疗；也可较早地或更积极地用广谱抗生素治疗；或使用像腰穿孔的方 法来治疗。不同于根据血液中微生物的存在而检测脓毒症的方法，本发明 的方法可以用来检测例如当受试者使用抗脓毒症的药物比如一种新抗生素 时是否可能患脓毒症。
在备选实施方面，本发明的方法也可以用于确认易感个体和患脓毒症 个体，其可从早期治疗中受益。这种确定可帮助保健医生更早地或可能更 积极地施行治疗。这样，显示严重耗竭的相对线粒体核酸水平比如mtDNA 或mt RNA水平的患者可受益于积极的、持续的和/或多种抗生素治疗。同 样地，对于耗竭的相对线粒体核酸水平比如mtDNA或mtRNA水平的患 者建议推迟手术。
在备选的方面中，本发明的方法可以用于，比如说，患脓毒症的实验 模型上，以测定治疗脓毒症的新疗法的效果。患脓毒症的动物模型包括但 不限于：在大鼠中施用细菌性内毒素(脂多糖，LPS)模拟由革兰氏阴性菌引 起的脓毒症；化疗诱发的感染；盲肠结扎和重穿孔，以模拟呼吸窘迫综合 征；或任何其他可以模拟脓毒症症状的实验模型。患脓毒症动物模型的描 述可在以下参考文献中找到且不限于这些文献：Bhatti AR和Micusan VV (1996)Microbios 86(349)：247-53；Redl H等(1993)Immunobiology 187(3- 5)：330-45；Fink MP和Heard SO(1990)J Surg Res.49(2)：186-96；Dunn DL(1988)Transplantation 5(2)：424-9；Bohnen JM等(1988)Can J Microbiol.34(3)：323-6；Mela-Riker L等(1988)Circ Shock.25(4)：231-44； Walker JF等(1986)Am J Kidney Dis.8(2)：88-97；Lopez-Garrido J等 (1987)Lab Invest.56(5)：534-43；Quimby F和Nguyen HT(1985)Crit Rev Microbiol.12(1)：1-44；Noel GJ等(1985)Pediatr Res.19(3)：297-9； Moesgaard F等(1983)Eur J Clin Microbiol.2(5)：459-62；Hinshaw LB， 等(1976)Surg Gynecol Obstet.142(6)：893-900；Tieffenberg J.等(1978) Infect Immun.19(2)：481-5；Wing D.A.，et al.(1978)J Lab Clin Med.92 (2)：239-51，所有这些均在此处引用作为参考。
在备选实施方案中，本发明提供了用于本发明方法中的具有组分的试 剂盒。这种试剂盒可以包含PCR组分，如以下所作详细说明，包括对 mtDNA或mtRNA序列和对nDNA或nRNA序列特异的PCR引物。 此试剂盒也可包括实施这里描述的本发明方法的书面说明。
在备选实施方案中，可使用多种技术来检测细胞中线粒体DNA或 RNA的相对量。定量PCR方法例如被公开在下列文献中，所有这些文献 在这里引用作为参考文献：美国专利号6,180,349，于2001年1月30日 授权于Ginzinger等；美国专利号6,033,854，于2000年3月7日授权于 Kurnit等；以及美国专利号5,972,602，于1999年10月26日授权于Hyland 等；Song，J.等(2001)Diabetes Care 24：865-869。线粒体DNA或RNA序 列可选自任何线粒体特异的核苷酸序列，包括但不限于ATP合成酶6， GenBank登录号为AF368271；tRNA-Leu，GenBank登录号为S49541； NADH脱氢酶亚基5(MTND5)，GenBank登录号为AF339085；IDL， GenBank登录号为AF079515；细胞色素b，GenBank登录号为AF254896， CCOI，或任何其它合适的线粒体特异核苷酸序列。核DNA或RNA序列 可选自包括但不限于人28S rRNA序列、ASPOL-γ序列、β-球蛋白序列、 或任何其它合适的核DNA或RNA序列。扩增探针可根据本领域已知方法 设计并被描述例如在Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)或Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，1994).
在备选实施方案中，本发明的方法可与其他有关脓毒症的治疗、预防 或诊断的方法联合使用，所述其它方法包括但不局限于描述在von Landenberg，P和Shoenfeld，Y(2001)IMAJ 3：439-442；Marshall，J.C.， Cook，D.J.，Christou，N.V.，Bernard，G.R.，Sprung，C.L.，Sibbald，W. J.(1995)Crit Care Med 23(10)：1638-1652；Vincent J.L.，Moreno R.， Takala J.，Willats S.，(1996)Intensive Care Med 22：707-710；Le Gall J. R.，Klar J.，Lemeshow S.(1996)JAMA 276：802-810；Knaus，W.A.， Draper，E.，Wagner，D.和Zimmerman，J.(1985)Crit Care Med 13： 818-829；Knaus W.A.，Wagner D.P.，Draper E.A.，Zimmerman J.E.等 (1991)Chest 100：1619-38；Bone，R.C.，Balk，R.A.，Cerra，F.B.， Dellinger，R.P.，Fein，A.M.，Knaus，W.A.，Schein，R.M.H.，Sibbald，W. J.(1992)Chest 101：1644-55；美国专利号6,303,321，于2001年10月16 日授权于Tracey等；美国专利号5,993,811，于1999年11月30日授权于 Becker等；美国专利号5,830,679，于1998年11月3日授权于Bianchi 等；美国专利号5,804,370，于1998年9月8日授权于Romaschin等；美 国专利号5,780,237，于1998年7月14日授权于Bursten等；美国专利号 5,639,617，于1997年6月17日授权于Bohuon；美国专利号5,545,721， 于1996年8月13日授权于Carroll等；或美国专利号5,998,482，于1999 年12月7日授权于David等，所有这些均在本文中作为参考。备选地或另 外地，这些患者可接受线粒体治疗，即有益于线粒体的组分，如线粒体酶 的辅酶因子或前体。在一些实施方案中，这种线粒体疗法治疗物例如可选 自核黄素(维生素B2)，辅酶Q10，维生素B1(硫胺素)，维生素B12，维生 素K，1-乙酰基肉毒碱，N-乙酰基半胱氨酸和烟碱。
实施例1
脓毒症与血细胞中mtDNA含量的显著下降有关系。提供了监测例如 脓毒症受试者中线粒体DNA水平的方法。本发明的方法可以用来评估抗 脓毒症药物的效果以及在患脓毒症的患者或者在怀疑有患脓毒症危险的个 体中诊断脓毒症。
材料和方法
从受试者采集纵向血样。从血细胞中提取总DNA，并且用杂交探针通 过实时PCR扩增并定量核基因和线粒体基因。mtDNA水平可表示为线粒 体与核DNA的比值(mtDNA/nDNA)。
样品采集和DNA提取。
血沉棕黄层可从血样中收集并在-70℃下保藏直到使用。用QIAamp DNA血液微型试剂盒(QIAGEN，Missisauga，Ontario，加拿大)根据生产 商提供的实验方法从200μL的血沉棕黄层中提取总DNA，并在200μL 的洗脱缓冲液中重悬。对标准曲线，相似的样品可从对照的志愿者身上收 集，并将DNA提取并收集。DNA库中的核基因组等同物(g.eq.)可用含有 已知浓度的人DNA核基因组等同物的对照试剂盒校准而确认(Roche分子 生物化学，Laval，Quebec，加拿大)。
定量实时PCR
对于mtDNA CCOI基因，CCOI1F 5′-TTCGCCGACCGTTGACTATT-3′(SEQ ID NO：1)和 CCOI2R5′-AAGATTATTACAAATGCATGGGC-3′(SEQ ID NO：2)引 物可用于PCR扩增，而下列寡核苷酸：3′-荧光素标记的CCOIPR1 5′-GCCAGCCAGGCAACCTTCTAGG-F-3′(SEQ ID NO：3)和5′LC Red640-标记的CCOIPR2 5′-L-AACGACCACATCTACAA CGTTATCGTCAC-P-3′(SEQ ID NO：4)，后者的3′末端用磷酸盐分子 封闭，可用做杂交探针。
对于nDNA ASPOLγ基因，ASPG3F 5′-GAGCTGTTGACGGAAAGGAG-3′(SEQ ID NO：5)和ASPG4R 5′-CAGAAGAGAATCCCGGCTAAG-3′(SEQ ID NO：6)引物被用来做 PCR，而下列寡聚核苷酸：3′-荧光素标记的ASPGPR1 5′- GAGGCGCTGTTAGAGATCTGTCAGAGA-F-3′(SEQ ID NO：7)和 5′LC Red640-标记的、3′-磷酸盐封闭的ASPGPR2 5′-L-GGCATTTCCTAAGTGGAAGCAAGCA-P-3′(SEQ ID NO：8)可用 作杂交探针。
采用LightCycler FastStart DNA Master杂交探针试剂盒(Roche Molecular Biochemicals，Laval，Quebec，加拿大)，实时PCR反应可分开 进行并且每个基因做2次。PCR反应可包含5mM MgCl2，每种引物0.5 μM，0.1μM 3′-荧光素探针，0.2pM 5′LC Red640探针和4μL在洗脱缓冲 液中的以1∶10稀释的DNA提取液。PCR扩增包括95℃10分钟的单次变 性//酶活化步骤，然后于0秒/95℃，10秒/60℃，5秒/72℃进行45个循环， 其间温度转化速率20℃/秒。增益设置(gain settings)可为F1＝1，F2＝8， 在每个退火步骤的最后能得到一个单一的荧光物。每个LightCycler运行 可包括30、300、3000和30000核基因组等同物的外部标准曲线，将相同 的核基因组等同物的值用于核(ASPOLγ)和线粒体(CCOI)基因。利用每 个扩增反应的第二次衍生最大值来分析这些数据并将之与各自的标准曲线 相关。对于特定的提取物，定量PCR的结果可表示为两次测定值的平均 mtDNA基因组等同物与两次测定值的平均nDNA基因组等同物的相对比 值(mtDNA/nDNA)，这些比值随意的分布在1.0左右，实际上相同的核基 因组等同物值在两条标准曲线上都出现了。
在一些实施方案中，本发明的PCR方法可以是实时聚合酶链反应，其 中，扩增产物的检测可用杂交探针，如上文所描述的利用LightCycler FastStart DNA Master杂交探针试剂盒(Roche Molecular Biochemicals， Laval，Quebec，加拿大)，或备选地使用商业上可获得的技术如ABI Taqman技术(例如ABI Prism 7700仪器来持续观察PCR过程中PCR 产物的积累，Applied Biosystems，Foster City，California，U.S.A.)。备 选的PCR方法和上述方法的改动方法可被采用，如例如公开在下列美国专 利中，这些专利在文中引用作参考：6,180,349(Ginzinger等，2001年1 月30日)；6,033,854(Kuit等，2000年3月7日)；5,972,602(Hyland；1999 年8月26日)；5,476,774和5,219,727(Wang；1995年12月19日和1993 年6月15日)；6,174,670(Wittwer等，2001年1月16日)；6,143,496 (Brown；2000年11月7日)；6,090,556(Kato；2000年7月18日)；6,063, 568(Gerdes等，2000年5月16日)。
实施例2
LPS诱导的脓毒症被用在动物模型中以检测脓毒症。表1显示小鼠施 用LPS后6和24小时，在肺、肝脏组织中线粒体DNA(mtDNA)与核 DNA(nDNA)比值。
           表1小鼠施用LPS后6和24小时组织中线粒体DNA的相对量
处理                 组织           N           mtDNA/nDNA比值(平均值±SD)
对照                 肺             6           0.29±0.05
LPS-6小时            肺             6           0.23±0.04
LPS-24小时           肺             6           0.25±0.06
对照                 肝脏           3           2.40±0.99
LPS-24小时           肝脏           3           2.50±0.22
结果显示：由LPS诱导产生的脓毒症动物肺组织中mtDNA/nDNA的 比值有明显变小的趋势(P＝0.06)。
结论
虽然这里公开了本发明的多种实施方案，根据本领域技术人员所熟知 的常识可在本发明的范围内进行很多改进和变化。这些变化包括对本发明 的任何方面采用已知等同物的替代品以基本相同的方式达到同样结果。数 据范围包括在限定的数据范围内。在说明书中，单词“包含”用作开放式术 语，基本上等同于短语“包括，但不限于”，而单词“comprises”具有相 应的意思。文中引用的参考文献不构成表明这些参考文献为本发明的现有 技术。所有的出版物，包括但不限于引用在本说明书中引用的专利和专利 申请以及本申请要求优先权的美国临时申请60/393,368(于2002年7月5 日申请)于文中引用作为参考，就像每一单独的出版物专门并单独指出在 文中引用作为参考一样，并且就像在文中充分公开一样。本发明包括基本 上如前文中描述的所有实施方案以及对其所做的变动并参照实施例和附 图。
                           序列表
<110>英属哥伦比亚大学
<120>应用线粒体核酸测定法诊断脓毒症
<130>80021-539
<140>WO PCT/CA03/01006
<141>2003-07-04
<150>US 60/393,368
<151>2002-07-05
<160>8
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
ttcgccgacc gttgactatt                                                  20
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
aagattatta caaatgcatg ggc                                              23
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>3’-荧光素标记的
<400>3
gccagccagg caaccttcta gg                                               22
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5’-LC Red640标记的
<400>4
aacgaccaca tctacaacgt tatcgtcac                                        29
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
gagctgttga cggaaaggag                                                  20
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
cagaagagaa tcccggctaa g                                                21
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(27)..(27)
<223>3’-荧光素标记的
<400>7
gaggcgctgt tagagatctgt tcagaga                                         27
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(25)
<223>3’-磷酸盐封闭的
<400>8
ggcatttcct aagtggaagc aagca                                            25