RNF2在治疗病毒感染或病毒感染相关的炎症性疾病中的用途
阅读：609发布：2020-05-13
专利汇可以提供RNF2在治疗病毒感染或病毒感染相关的炎症性疾病中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 涉及RNF2在 治疗 病毒感染 或病毒感染相关的 炎症 性 疾病 中的用途。本申请涉及人RNF2基因或其表达产物作为靶点在制备用于治疗病毒感染或病毒感染相关疾病的药物中的用途；以及人RNF2基因或其表达产物作为靶点在制备药物筛选装置中的用途；本申请还涉及一种靶向人RNF2基因或其表达产物的 试剂 ，尤其是靶向人RNF2基因的siRNA。通过本公开的方法，可实现对I型干扰素治疗病毒感染效果的调控，为病毒感染及相关疾病的诊断和治疗提供新的指标和靶点。，下面是RNF2在治疗病毒感染或病毒感染相关的炎症性疾病中的用途专利的具体信息内容。
1.人RNF2基因或其表达产物作为靶点在制备用于治疗受试者中病毒感染或病毒感染相关疾病的药物中的用途，其中：
所述人RNF2基因是SEQ ID No.6所示；所述人RNF2基因的表达产物选自：cDNA、mRNA、RNF2前体蛋白、成熟的RNF2蛋白、及其片段；
所述的病毒感染选自：水泡口炎病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒的感染；
所述的病毒感染相关疾病是病毒感染相关的炎症性疾病或病毒感染相关的免疫炎症损伤；
所述的病毒感染相关疾病选自：流行性感冒、乙型肝炎、丙型肝炎、获得性免疫缺陷综合症；
所述治疗包括选自以下任一项：抑制受试者中病毒的复制、提高干扰素刺激基因的表达、提高受试者的存活、减轻病毒感染所致的炎症免疫损伤、提高干扰素抗病毒治疗效果、或其组合；
其中所述干扰素刺激基因选自：ISG15、MX1、IFIT1、IFIT2、OAS2、CXCL9、CXCL10、或其组合。
2.靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂在制备用于治疗病毒感染或病毒感染相关疾病的药物中的用途，其中：
所述人RNF2基因是SEQ ID No.6所示；
所述人RNF2基因的表达产物选自：cDNA、mRNA、RNF2前体蛋白、成熟的RNF2蛋白、及其片段；
所述靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂选自：核酸或多肽；优选，所述多肽选自抗体或其抗原结合片段；优选，所述的核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA；
更优选地，所述靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂选自：反义寡核苷酸、siRNA、dsRNA、核酶、esiRNA、shRNA；
最优选地，所述靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂是siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，其中所述正义链和所述反义链互补，并且所述反义链与人RNF2基因或其表达产物中的靶序列能够杂交或者能够互补；
所述siRNA的正义链或反义链的长度各自选自：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26或27个核苷酸；优选19、20、21、22、或23个核苷酸；最优选，19、20或者21个核苷酸；
所述的病毒感染选自：水泡口炎病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒的感染；优选病毒感染的早期或急性感染；
所述的病毒感染相关疾病是病毒感染相关的炎症性疾病或病毒感染相关的免疫炎症损伤；
所述的病毒感染相关疾病选自：流行性感冒、乙型肝炎、丙型肝炎、获得性免疫缺陷综合症。
3.根据权利要求2所述的用途，其中：
所述治疗包括选自以下任一项：抑制受试者中病毒的复制、提高干扰素刺激基因的表达、提高受试者的存活、减轻病毒感染所致的炎症免疫损伤、提高干扰素抗病毒治疗效果、或其组合；
优选，所述干扰素刺激基因选自：ISG15、MX1、IFIT1、IFIT2、OAS2、CXCL9、CXCL10、或其组合。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述siRNA的正义链是SEQ ID NO：8所示。
5.人RNF2基因或其表达产物在制备用于治疗慢性病毒感染或慢性病毒感染相关疾病的药物中的用途，其中：
所述人RNF2基因是SEQ ID No.6所示；
所述人RNF2基因的表达产物选自：cDNA、mRNA、RNF2前体蛋白、成熟的RNF2蛋白、及其片段；
所述的慢性病毒感染选自：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒的感染。
6.人RNF2基因或其表达产物作为靶点在制备药物筛选装置中的用途，其中：
所述的筛选是指筛选用于治疗病毒感染或病毒感染相关疾病的药物；
所述人RNF2基因是SEQ ID No.6所示；
所述人RNF2基因的表达产物选自：cDNA、mRNA、RNF2前体蛋白、成熟的RNF2蛋白、及其片段；
所述的病毒感染选自：水泡口炎病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒的感染；
所述的病毒感染相关疾病是病毒感染相关的炎症性疾病或病毒感染相关的免疫炎症损伤；
所述的病毒感染相关疾病选自：流行性感冒、乙型肝炎、丙型肝炎、获得性免疫缺陷综合症；
所述筛选装置包含用于确定人RNF2基因或其表达产物的水平或活性的检测试剂，优选选自：特异于人RNF2基因或其表达产物的引物、探针、抗体或其抗原结合片段。
7.一种靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂，其能够调节人RNF2基因或其表达产物的水平或活性，其中：
所述人RNF2基因是SEQ ID No.6所示；
所述人RNF2基因的表达产物选自：cDNA、mRNA、RNF2前体蛋白、成熟的RNF2蛋白、及其片段；
所述靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂选自：核酸或多肽；优选，所述多肽选自抗体或其抗原结合片段；优选，所述的核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA；
更优选地，所述靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂选自：反义寡核苷酸、siRNA、dsRNA、核酶、esiRNA、shRNA；
最优选地，所述靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂是siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，其中所述正义链和所述反义链互补，并且所述反义链与人RNF2基因或其表达产物中的靶序列能够杂交或者能够互补；
所述siRNA的正义链或反义链的长度各自选自：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26或27个核苷酸；优选19、20、21、22、或23个核苷酸；最优选，19、20或者21个核苷酸。
8.根据权利要求7所述的靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂，其中所述siRNA的正义链是SEQ ID NO：8所示。
9.一种调节人RNF2基因或其表达产物的水平或活性的表达载体，其编码权利要求7-8中任一项所述的靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂。
10.一种治疗病毒感染或病毒感染相关疾病的药物组合物，其包含：
权利要求7-8中任一项所述的靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂；以及
任选地，药学上可接受的载体。
RNF2在治疗病毒感染或病毒感染相关的炎症性疾病中的用途
技术领域
[0001] 本公开属于生物技术和医学领域。具体地说，本公开涉及含有环指结构域的蛋白质分子2(ring finger protein 2，RNF2)在诊断或治疗与I型干扰素信号通路相关的疾病或症状中的用途；还涉及RNF2在诊断或治疗病毒感染或病毒感染相关的炎症性疾病或免疫炎症损伤中应用。
背景技术
[0002] 抵抗各种病毒的感染和侵袭是天然免疫系统的一项重要功能。抗病毒天然免疫反应主要依赖三类模式识别受体(Pattern recognize receptors,PRRs)，包括：Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)；RNA病毒受体，如RIG-I样受体(RIG-I-like receptors，RLRs)、Nod样受体(Nod-like receptors，NLRs)等；以及一些识别DNA病毒的受体，例如cGAS核酸转移酶对病毒DNA、RNA成分等的病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)进行识别。当病毒受体感受到相应的PAMPs信号后，会激活一系列的胞内信号通路，从而启动下游炎性细胞因子及I型干扰素(Type I interferon，IFN-I)的表达(Gurtler C.等Trends Microbiol.2013；21，413-420)。其中，IFN-I是发挥抗病毒效应的主要细胞因子，也是目前应用最为广泛的一类抗病毒感染药物。
[0003] IFN-I抗病毒感染效应的发挥主要依赖于JAK-STAT信号通路。IFN-I与广泛分布于多种类型细胞表面的受体(即I型干扰素受体IFNAR(IFN a receptor))结合后，会结合并激活胞浆内的磷酸激酶janus激酶1(JAK1)和酪氨酸激酶2(TYK2)，招募STAT转录因子(即，信号转导子和转录激活子1/2、signal transducer and activator of transcription 1/2、STAT1/2)，使得STAT1/2发生酪氨酸磷酸化修饰。经磷酸化修饰后的STAT1/2和干扰素调节因子9(IRF9)形成三聚体，进入细胞核；识别启动子区的特定序列干扰素刺激反应元件(IFN-stimulated response elements，ISRE)并与之结合，启动一系列干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)的表达，从而发挥抵抗病毒感染和调控适应性免疫应答的功能。此外，酪氨酸磷酸化修饰后的STAT1还能够形成同源二聚体，结合于启动子区的gamma激活序列(gamma-activated sequences，GAS)，启动ISGs的表达(McNab F等Nat.Rev.Immunol.2015；15，87-103)。
[0004] 虽然IFN-I具有重要的抗病毒效应，但是在临床应用中特别是对一些慢性病毒感染如HBV，HCV，HIV等的治疗效果却差强人意。首先，由于个体表达干扰素信号的本底差异及对干扰素信号的反应性差异，应用干扰素治疗的效果往往因人而异。通过对不同治疗效果患者进行血浆细胞因子水平检测或基因测序分析，目前已发现在慢性感染患者中，血浆中高水平的IL-6、IL-9对于IFN-I治疗不能获得SVR具有预测价值(Guzman-Fulgencio M等J.Antimicrob.Chemother.2012；67，1238-1245)。III型干扰素信号通路IL28B的基因遗传多样性，与HCV易感性和干扰素治疗的耐受密切相关(Eslam M等J.Hepatol.2014；61，235-241；Shaker OG等J.Gastroenterol.Hepatol.2012；27，1842-1849)。其次，IFN-I信号的过度活化或长期应用干扰素治疗，都会诱导免疫抑制因子的产生，如IL-10或PDL1，加重慢性病毒感染(Honke N等Eur.J.Immunol.2016；46，372-380；Li Y等Rev.Med.Virol.2014；24，
332-342)。即使在流感病毒的急性感染模型中，IFN-I的过度活化也会增加小鼠的死亡率(Davidson S等Nat.Commun.2014；5，3864)，而抑制IFN-I信号通路能够促进小鼠LCMV感染的清除(Teijaro JR等Science 2013；340，207-211；Wilson EB等Science2013；340，202-
207)。Sandler等人(Sandler NG等Nature 2014；511，601-605)在对恒河猴免疫缺陷病毒感染模型的研究中，应用了两种截然不同的干预方式，发现封闭干扰素受体后会减少抗病毒基因的产生，增加病毒的复制，从而加速获得性免疫缺陷(AIDS)的发生；而应用干扰素的干扰方式则能够获得短期的抗病毒效应，但是持续的治疗会降低对干扰素反应的敏感性，反而导致抗病毒基因的表达量下降。这说明在治疗病毒感染过程中，把握干扰素的作用时期是取得良好治疗效果的关键。再次，IFN-I主要包括IFN-α和IFN-β两类。无论在产生的细胞和还是功能的发挥上，IFN-α和IFN-β都有着各自不同的特点。因此，在抗病毒反应中具有不同的作用模式。IFN-α由天然免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞及浆细胞样树突状细胞)产生，主要作用在于控制早期的病毒扩散。与IFN-α不同的是，上皮细胞、成纤维细胞及天然免疫细胞均能够产生并分泌IFN-β。在信号通路的激活过程中，IFN-β与IFNAR有着更强的结合能力。有报道显示，在LCMV引起的慢性感染中，IFN-β是导致持续性感染的主要原因。利用抗体封闭IFN-β能够有效加速病毒的清除(Ng CT等Cell Host Microbe 2015，17，653-661)，说明对IFN-β信号通路的负向调控在防止慢性感染中尤为关键。
332-342)。即使在流感病毒的急性感染模型中，IFN-I的过度活化也会增加小鼠的死亡率(Davidson S等Nat.Commun.2014；5，3864)，而抑制IFN-I信号通路能够促进小鼠LCMV感染的清除(Teijaro JR等Science 2013；340，207-211；Wilson EB等Science2013；340，202-
207)。Sandler等人(Sandler NG等Nature 2014；511，601-605)在对恒河猴免疫缺陷病毒感染模型的研究中，应用了两种截然不同的干预方式，发现封闭干扰素受体后会减少抗病毒基因的产生，增加病毒的复制，从而加速获得性免疫缺陷(AIDS)的发生；而应用干扰素的干扰方式则能够获得短期的抗病毒效应，但是持续的治疗会降低对干扰素反应的敏感性，反而导致抗病毒基因的表达量下降。这说明在治疗病毒感染过程中，把握干扰素的作用时期是取得良好治疗效果的关键。再次，IFN-I主要包括IFN-α和IFN-β两类。无论在产生的细胞和还是功能的发挥上，IFN-α和IFN-β都有着各自不同的特点。因此，在抗病毒反应中具有不同的作用模式。IFN-α由天然免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞及浆细胞样树突状细胞)产生，主要作用在于控制早期的病毒扩散。与IFN-α不同的是，上皮细胞、成纤维细胞及天然免疫细胞均能够产生并分泌IFN-β。在信号通路的激活过程中，IFN-β与IFNAR有着更强的结合能力。有报道显示，在LCMV引起的慢性感染中，IFN-β是导致持续性感染的主要原因。利用抗体封闭IFN-β能够有效加速病毒的清除(Ng CT等Cell Host Microbe 2015，17，653-661)，说明对IFN-β信号通路的负向调控在防止慢性感染中尤为关键。
[0005] I型干扰素的治疗应用虽然存在以上这些难题，但是由于还没有发现其他的替代药物，对IFN-I介导的抗病毒反应的调控机制研究就具有重要的临床意义及应用价值。特别是，在充分发挥IFN-I抵抗病毒感染作用基础之上的负向调控，对于防止过度活化造成的免疫损伤、控制慢性感染进程至关重要。目前对这一信号通路的负向调控研究主要集中在以下几个层面：受体水平的调控，如通过促进受体的内化降解来减少上游IFN-I信号的激活；信号转导水平的调控，即通过对信号通路上的信号分子或转录因子的修饰来改变其激活或转导功能；转录水平的调控，即通过改变转录因子、表观调控分子、增强子及其他的共激活分子、抑制分子等之间的相互作用来调控下游ISGs的转录；以及，负反馈基因的诱导表达，如IFN-I刺激诱导的SOCS(Suppressor of cytokine signaling)家族基因的表达能够负反馈抑制IFN-I信号(Ivashkiv LB等Nat.Rev.Immunol.2014；14，36-49)。然而，以上这些机制对于揭示抗病毒反应和I型干扰素信号通路的功能及负向调控机制仍然是不足的，特别是在转录因子STAT1介导的ISGs的转录水平的负向调控机制还有待于进一步深入的研究。
[0006] 泛素化修饰是一种常见的蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification，PTM)方式。由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶介导的一系列酶催化反应共同完成对底物蛋白分子的修饰。其中E3泛素连接酶识别结合底物，并将泛素分子转移至底物上。因此，决定了整个泛素化修饰反应的特异性(Heaton SM等
J.Exp.Med.2016；213，1-13)。E3泛素连接酶根据其组成结构域，主要可以分为三大类：含有HECT结构域的HECT E3s；含有RING(Really interesting new gene)结构域的RING E3s；和含有RBR(RING-in-between-RING)结构域的RBR E3s(Smit JJ等Adv.Exp.Med.Biol.2012；
770，27-37)。其中，RING E3s具有更多的家族成员，参与调控的细胞生理过程更为广泛和复杂。目前对RING E3研究最多的是其中的一个亚家族，TRIM(Tripartite motif)家族。TRIM家族蛋白因均具有N端的三个保守结构域，包括RING结构域、一或两个B-box结构域和卷曲螺旋(Coiled-coil)结构域而命名。近年来也不断有文献报道TRIM家族成员在天然免疫领域内的功能及调控机制。Versteeg等人(Versteeg GA等Immunity 2013；38，384-398)通过系统性的分析研究发现TRIM家族是天然免疫系统不可或缺的组成成分，可通过不同的机制增强抗病毒天然免疫反应。Kimura等人(Kimura T等J.Cell Biol.2015；210，973-989)则发现一系列能够调控自噬通路的TRIM蛋白，包括TRIM20和TRIM21等。除此之外，TRIM家族蛋白还参与其他天然免疫信号通路的调控，如TRIM38能够通过泛素化降解TRIF调控TLR3/4信号通路介导的炎症反应(Hu MM等J.Immunol.2015；195，4415-4425)，TRIM39则参与调控炎性信号TNFα激活的NF-κB信号通路(Suzuki M等Cell Mol.Life Sci.2016；73，1085-1101)。
J.Exp.Med.2016；213，1-13)。E3泛素连接酶根据其组成结构域，主要可以分为三大类：含有HECT结构域的HECT E3s；含有RING(Really interesting new gene)结构域的RING E3s；和含有RBR(RING-in-between-RING)结构域的RBR E3s(Smit JJ等Adv.Exp.Med.Biol.2012；
770，27-37)。其中，RING E3s具有更多的家族成员，参与调控的细胞生理过程更为广泛和复杂。目前对RING E3研究最多的是其中的一个亚家族，TRIM(Tripartite motif)家族。TRIM家族蛋白因均具有N端的三个保守结构域，包括RING结构域、一或两个B-box结构域和卷曲螺旋(Coiled-coil)结构域而命名。近年来也不断有文献报道TRIM家族成员在天然免疫领域内的功能及调控机制。Versteeg等人(Versteeg GA等Immunity 2013；38，384-398)通过系统性的分析研究发现TRIM家族是天然免疫系统不可或缺的组成成分，可通过不同的机制增强抗病毒天然免疫反应。Kimura等人(Kimura T等J.Cell Biol.2015；210，973-989)则发现一系列能够调控自噬通路的TRIM蛋白，包括TRIM20和TRIM21等。除此之外，TRIM家族蛋白还参与其他天然免疫信号通路的调控，如TRIM38能够通过泛素化降解TRIF调控TLR3/4信号通路介导的炎症反应(Hu MM等J.Immunol.2015；195，4415-4425)，TRIM39则参与调控炎性信号TNFα激活的NF-κB信号通路(Suzuki M等Cell Mol.Life Sci.2016；73，1085-1101)。
[0007] 然而，除TRIM家族外，其他种类的RING E3在天然免疫领域内的功能虽也有零星报道，但是它们在抗病毒天然免疫反应及IFN-I信号通路中的调控功能还有很多的未知。对这些RING E3s功能的探索与研究将有利于揭示IFN-I在抗病毒反应中的时空调控方式，为抗病毒药物及治疗靶点的开发提供新的理论基础。
[0008] RNF2蛋白质分子是重要的表观调控复合物多梳抑制复合物(polycomb repressive complex 1，PRC1)的一个重要组分。RNF2能够单泛素化组蛋白H2A，参与维持染色质的紧密状态。以往对RNF2的研究，主要集中在对发育相关基因的表观调控及肿瘤的侵袭进展方面(Endoh M等PLoS Genet.2012；8，e1002774；Rai K等Cancer Discov.2015；5，
1314-1327)。此外，目前已发现RNF2还参与维持免疫系统中淋巴细胞的静息状态相关的基因的调控(Frangini A等Mol.Cell2013；51，647-661)。通过检索已经发表的基因表达谱数据库，发现在经过治疗的慢性HCV感染患者的外周血细胞中，RNF2的表达量显著上升(与对照组相比上升2.7倍，GSM90864)；而在抗肿瘤药物治疗后的小肠腺癌细胞中，RNF2的表达量显著下降(与对照组相比下降4.2倍，GSM60143)，提示RNF2的表达水平变化可能与慢性疾病的治疗效果密切相关。但是RNF2在天然免疫特别是抗病毒领域内的功能还没有确切报道。
1314-1327)。此外，目前已发现RNF2还参与维持免疫系统中淋巴细胞的静息状态相关的基因的调控(Frangini A等Mol.Cell2013；51，647-661)。通过检索已经发表的基因表达谱数据库，发现在经过治疗的慢性HCV感染患者的外周血细胞中，RNF2的表达量显著上升(与对照组相比上升2.7倍，GSM90864)；而在抗肿瘤药物治疗后的小肠腺癌细胞中，RNF2的表达量显著下降(与对照组相比下降4.2倍，GSM60143)，提示RNF2的表达水平变化可能与慢性疾病的治疗效果密切相关。但是RNF2在天然免疫特别是抗病毒领域内的功能还没有确切报道。
[0010] 鉴于本领域的上述需求，本公开发现了一种免疫调节分子，其调节抗病毒的天然免疫反应，为病毒感染和病毒感染相关的炎症性疾病或免疫炎症损伤的诊断、治疗提供新的方法和靶标。
[0011] 根据本公开的一些实施方式，提供了人RNF2基因或其表达产物作为治疗靶点的用途。具体而言，提供了人RNF2基因或其表达产物在制备用于治疗病毒感染或病毒感染相关疾病的药物中的用途。具体而言，提供了人RNF2基因或其表达产物作为靶点在制备用于治疗病毒感染或病毒感染相关疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，病毒感染相关疾病是指病毒感染相关的炎症性疾病或免疫炎症损伤。
[0012] 在一些实施方案中，人RNF2基因的表达产物是指人RNF2基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于人RNF2基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟的蛋白、及其片段。
[0013] 在一些实施方案中，人RNF2基因是SEQ ID No.6所示。在一些实施方案中，人RNF2基因的表达产物(例如，成熟RNF2蛋白)是SEQ ID No.7所示。
[0014] 根据本公开的一些实施方式，提供了靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂在制备用于治疗病毒感染或病毒感染相关疾病的药物中的用途。在一些实施方式中，靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂，能识别并结合人RNF2基因或其表达产物。在一些实施方式中，靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂，能够调节人RNF2基因或其表达产物的水平或活性。在一些具体的实施方式中，靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂，能够降低人RNF2基因或其表达产物的水平或活性。在一些具体的实施方式中，靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂，能够沉默人RNF2基因或其表达产物。
[0015] 在一些实施方式中，靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂，选自：核酸或多肽。在一些实施方式中，所述核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA；多肽选自：抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方式中，靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂选自：反义寡核苷酸、siRNA、dsRNA、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
[0016] 在一些具体的实施方式中，人RNF2基因或其表达产物作为治疗靶点是指，将人RNF2基因或其表达产物作为靶标(例如通过RNA干扰作用)从而调节(提高或降低)病毒感染的细胞内RNF2基因或其表达产物的水平或活性。
[0017] 在另一些实施方式中，提供了人RNF2基因或其表达产物作为靶点在筛选用于治疗病毒感染或病毒感染相关疾病的药物中的用途。在一些具体的实施方式中，提供了人RNF2基因或其表达产物在制备药物筛选装置中的用途，其中所述筛选是指筛选用于治疗病毒感染或病毒感染相关疾病的药物。在一些具体的实施方式中，人RNF2基因或其表达产物作为靶点用于药物筛选是指：将人RNF2基因作为靶点，对候选物进行筛选，以找到能够调节(抑制、促进、降低、提高)RNF2基因或其表达产物的水平或活性的候选物，治疗病毒感染或病毒感染相关疾病的药物。
[0018] 在一些具体的实施方式中，筛选装置是试剂盒的形式。在一些具体的实施方式中，筛选装置包含用于确定人RNF2基因或其表达产物的水平或活性的检测试剂，例如但不限于特异于人RNF2基因或其表达产物的引物、探针、抗体或其抗原结合片段。
[0019] 在本公开中，病毒感染选自：急性病毒感染(如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、水泡口炎病毒)；慢性病毒感染(如乙型、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒)。在一个具体的实施方案中，病毒感染是水泡口炎病毒感染。
[0020] RNF2在不同的病毒感染中有不同的作用：在病毒感染早期或急性感染中，敲低RNF2的表达能够提高干扰素刺激基因(例如ISG15、MX1、IFIT1、IFIT2、OAS2、CXCL9、CXCL10、或其组合)的表达，从而增强机体抗病毒反应；而在病毒感染转为慢性或是慢性病毒感染中，提高RNF2的表达能够防止干扰素信号的过度活化对机体造成免疫损伤，减少干扰素耐受的发生，增强干扰素的抗病毒治疗效果。
[0021] 在一些实施方案中，病毒感染是慢性病毒感染，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒。
[0022] 根据一些实施方式，提供了一种靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂，其能够识别并结合人RNF2基因或其表达产物。根据一些实施方式，提供了一种靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂，其能够调节人RNF2基因或其表达产物的水平或活性。在具体的实施方式中，靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂选自：核酸或多肽。在一些实施方式中，所述核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA；多肽选自：抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方式中，靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂选自：反义寡核苷酸、siRNA、dsRNA、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。在具体的实施方案中，所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有人RNF2基因的信息序列。在一个具体的实施方案中，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。
[0023] 所述siRNA包含正义链和反义链；其中所述正义链和所述反义链互补，共同形成RNA二聚体；并且，所述反义链与人RNF2基因或其表达产物中的靶序列能够杂交或者能够互补。在另一个具体的实施方案中，所述siRNA能特异性地结合人RNF2基因或其表达产物中的靶序列。
[0024] 在另一个具体的实施方案中，所述正义链和反义链的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸；优选19、20、21、22、或23个核苷酸；最优选，长度为19、20或者21个核苷酸。
[0025] 在另一个具体的实施方案中，当针对小鼠的SEQ ID No.4时，siRNA的正义链序列是SEQ ID NO：1所示。本领域的技术人员应当理解，当针对人类的SEQ ID No.6作为靶点时，能够根据本领域中公知的干扰RNA设计原则，设计并制备得到有效的siRNA或hnRNA，例如但不限于，siRNA的正义链序列是SEQ ID NO：8所示。
[0026] 在另一个具体的实施方案中，所述shRNA是载体表达所得，例如将可转录所述shRNA的DNA片段克隆至病毒表达载体后，得以表达。所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述反义链的序列与人RNF2基因中靶序列的转录产物序列互补或杂交。所述shRNA经酶切后可成为siRNA，进而特异性调节人RNF2基因或其表达产物的水平或活性。
[0027] 在一些实施方案中，以治疗有效量向受试者提供靶向人RNF2基因或其表达产物的试剂、或者以治疗有效量向受试者提供RNF2基因或其表达产物。所述治疗有效量是指所述试剂足够调节(降低或提高)人RNF2基因的转录或翻译，或者足够调节人RNF2基因表达产物的表达或活性。在一些实施方案中，降低是指，相对于没有施用试剂的对照而言，人RNF2基因或其表达产物的水平或活性至少被降低了50％、60％、70％、80％、90％、100％、或者上述任意两个数值之间的范围。具体的治疗有效量还应考虑给药途径、患者健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内。
[0028] 根据一些实施方式，提供了一种调节人RNF2基因或其表达产物的水平或活性的表达载体，其编码上述siRNA或者shRNA。根据另一些实施方式，提供了一种调节人RNF2基因或其表达产物的水平或活性的表达载体，其编码RNF2基因或其表达产物。所述表达载体还任选包含可检测的标记物，例如但不限于绿色荧光蛋白。所述表达载体选自：dsRNA载体、慢病毒载体；例如是慢病毒表达载体。
[0031] 图2A至图2C为荧光定量PCR检测，其显示在转染了si-RNF2的细胞中，ISGs的表达水平显著升高(“**”，P<0.01)。
[0032] 图3A至图3C为荧光定量PCR检测，增加细胞中RNF2的过表达降低IFN-β诱导的ISGs的表达(“*”，P<0.05，“**”，P<0.01)。
[0033] 图4为双荧光素酶报告基因检测，增加细胞中RNF2的表达降低STAT1/ISRE的转录活性。
[0034] 图5为生存曲线分析，显示敲低小鼠RNF2的表达增强小鼠对VSV的抵抗能力。
[0035] 图6A和6B为免疫印迹检测，显示敲低小鼠RNF2的表达增强病毒感染小鼠组织中的IFN-I通路活化程度和ISGs表达水平。
[0036] 图7A至7D为HE染色检测，显示敲低小鼠体内RNF2的表达减轻病毒感染小鼠肺脏中的组织病变。
具体实施方式
[0037] 实施例1.敲低RNF2的表达使得细胞的抗病毒能力增强
[0038] (1)实验1：
[0039] 分离小鼠腹腔巨噬细胞；设计并合成针对小鼠RNF2基因的小干扰RNA(si-RNF2)及阴性对照干扰RNA(si-Ctrl)。序列如下：
[0040] si-RNF2:
[0041] 5’-GGAUCAACAAACACAACAATT-3’(SEQ ID No.1)；
[0042] 当针对人类RNF2基因时，si-RNF2可以是例如但不限于：
[0043] 5’-GGAUCAACAAGCACAAUAATT-3’(SEQ ID No.8)。
[0044] si-Ctrl:
[0045] 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQ ID No.2)。
[0046] 使用转染试剂(Lipofectamine RNAiMAX，Thermo)将si-RNF2或si-Ctrl分别转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞中。
[0047] 48小时后，加入表达绿色荧光蛋白的重组水泡口炎病毒(GFP-VSV)进行感染(感染复数为1)；12小时后利用荧光显微镜观察病毒复制情况。
[0048] 结果显示与对照干扰RNA相比，转染了si-RNF2的细胞中，病毒的复制受到显著抑制(图1A至1D)。
[0049] (2)实验2：
[0050] 在I型干扰素受体缺失小鼠的原代腹腔巨噬细胞中分别转染si-RNF2或si-Ctrl，48小时后加入水泡口炎病毒(VSV)进行感染，12小时后检测细胞中ISGs的表达。
[0051] RNF2敲低细胞中的ISG表达与对照组相比无明显差异，说明本公开中的RNF2主要依赖I型干扰素信号通路发挥功能。
[0052] (3)实验3：
[0053] 在小鼠的原代腹腔巨噬细胞中分别转染si-RNF2或si-Ctrl；48小时后，加入水泡口炎病毒(VSV)进行感染(感染复数为10)。12小时后，收集细胞，提取RNA；经反转录成cDNA后，使用荧光定量PCR方法检测细胞中干扰素刺激基因(ISG)，如Ifit1，Mx1等的表达水平。
[0054] 结果显示，与对照干扰RNA相比，转染了si-RNF2的细胞中，几种ISGs的表达水平均显著升高(图2A至2C)。
[0055] 以上结果表明，在细胞中敲低RNF2的表达后，细胞受到病毒感染时，表达的干扰素刺激基因增多，对病毒复制的抑制能力增强。
[0056] 实施例2.RNF2过表达的巨噬细胞对I型干扰素刺激的反应能力降低
[0057] (1)实验1：
[0058] 扩增小鼠RNF2基因的CDS序列，构建含HA标签及嘌呤霉素抗性的RNF2过表达载体。使用转染试剂(FuGENE HD，Promega)将RNF2过表达载体转染入小鼠的巨噬细胞系RAW264.7细胞中，24后加入嘌呤霉素(4μg/ml)进行筛选，7天后，取存活的单细胞克隆即为RNF2稳定过表达的细胞。在此细胞中加入IFN-β刺激(500pg/ml)，4小时后收集细胞，提取RNA，经反转录成cDNA后，使用荧光定量PCR方法检测细胞中干扰素刺激基因(ISG)，如Ifit1，Mx1等的表达水平。
[0059] 结果显示与野生型细胞相比，RNF2过表达的巨噬细胞，在IFN-β刺激后，几种ISGs的表达水平显著降低(图3A至3C)。
[0060] (2)实验2：
[0061] 合成ISG基因上游启动子区ISRE序列(AGTTTCGATTCGT重复4次，SEQ ID No.3)，将其插入含有荧光素酶的报告基因载体中。在L929细胞系中转染这一载体和起质量控制作用的Renilla对照载体，转录因子STAT1表达载体，以及不同浓度梯度的RNF2表达载体。36小时后，加入IFN-β刺激细胞12小时，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)检测RNF2蛋白质过表达对STAT1/ISRE转录活性的影响。
[0062] 结果显示，RNF2蛋白质分子的过表达显著降低了STAT1/ISRE的转录活性，并且ISRE转录活性的降低与RNF2表达量的增加成负相关(图4)。
[0063] 以上的结果表明增强RNF2在细胞中的表达量，能够降低细胞对IFN-β刺激的反应能力。
[0064] 实施例3.敲低RNF2表达的小鼠对VSV感染的抵抗能力增强
[0065] (1)实验1：
[0066] 在通过CRISPER-Cas9技术，构建纯合敲除RNF2基因小鼠的过程中，发现RNF2纯合敲除会导致小鼠胚胎致死，所以选择6-8周健康、雄性的RNF2杂合敲除小鼠与其同窝对照的野生型小鼠进行实验。
[0067] 通过尾静脉注射给予致死剂量的VSV病毒感染(每克体重2×107PFU)，然后在不同的时间点观察两组小鼠的死亡情况。
[0068] 结果显示，野生型小鼠在3天内全部死亡，而RNF2杂合敲除小鼠在感染第6天时，仍有一半存活(图5)。
[0069] (2)实验2：
[0070] 通过尾静脉注射非致死剂量的VSV病毒感染(每克体重2×106PFU)，16小时后，取脾脏、肺脏组织提取蛋白质，利用免疫印迹的方法检测组织中IFN-I信号通路变化及ISGs的表达情况。取肺组织进行HE染色，检测肺组织的病理变化情况。
[0071] 结果显示，与野生型小鼠相比，RNF2杂合敲除小鼠组织内IFN-I信号通路活化程度增强，ISGs的表达水平明显增多(图6A和6B)，肺组织的炎症浸润和实变程度明显减轻(图7A至7D)。
[0072] 以上的结果表明，小鼠体内敲低RNF2的表达后，小鼠对病毒感染的抵抗能力增强。
[0073] 通过本公开，可实现对I型干扰素治疗病毒感染效果的调控，为病毒感染及相关疾病的诊断和治疗提供新的指标和靶点，对IFN-I过度活化或长期应用造成的免疫耐受、免疫抑制甚至免疫损伤都提供了新的诊断治疗依据。
[0074] 序列描述
[0075] RNF2基因在人与小鼠中高度保守。人的RNF2氨基酸序列与小鼠的RNF2相差一个氨基酸(第214个氨基酸：人为甲硫氨酸，鼠为缬氨酸)，两者核苷酸序列上有所差别。人的Gene ID是6045，鼠的Gene ID是19821。序列如下：
[0076] 小鼠中的CDS序列(SEQ ID No.4)：
[0077]ATGTCTCAGGCTGTGCAGACAAATGGAACTCAACCATTAAGCAAAACATGGGAACTCAGTTTGTATGAGTTACAACGAACACCTCAGGAGGCAATAACAGATGGCTTGGAAATTGTGGTTTCACCTAGAAGTCTACACAGTGAATTAATGTGCCCAATTTGTTTGGATATGTTAAAGAACACCATGACTACAAAGGAGTGTTTACATCGGTTTTGCGCGGATTGTATTATCACAGCCCTTAGAAGTGGCAACAAAGAGTGTCCTACCTGTCGGAAAAAACTGGTTTCTAAAAGATCACTAAGGCCAGACCCGAACTTTGATGCACTCATCAGCAAGATTTATCCCAGTCGTGATGAGTATGAAGCGCATCAGGAAAGGGTCTTAGCAAGGATCAACAAACACAACAATCAGCAGGCTCTCAGCCACAGCATCGAGGAGGGGCTGAAGATACAGGCCATGAACAGATTACAGCGAGGCAAAAAGCAGCAGATAGAAAATGGTAGTGGAGCAGAAGATAATGGTGACAGCTCCCACTGTAGTAACGCATCCACACACAGCAACCAGGAAGCGGGCCCGAGTAACAAACGGACCAAAACCTCTGATGACTCTGGGCTTGAACTTGATAACAACAATGCAGCAGTGGCGATTGATCCAGTCATGGACGGTGCCAGTGAGATTGAGTTAGTCTTCAGGCCCCATCCAACTCTTATGGAAAAGGACGACAGCGCACAGACAAGATACATAAAGACTTCAGGCAATGCCACTGTTGATCACTTATCCAAGTATCTGGCTGTGAGGTTAGCTTTAGAAGAACTTCGAAGCAAAGGAGAATCAAACCAGATGAACCTGGATACAGCCAGTGAGAAGCAGTACACCATTTACATAGCCACAGCCAGTGGCCAGTTCACCGTTTTAAATGGCTCCTTTTCTTTGGAATTGGTCAGTGAGAAATACTGGAAAGTGAACAAACCCATGGAACTTTATTATGCACCCACCAAGGAGCACAAATGA。
[0078] 小鼠中的氨基酸序列(SEQ ID No.5)：
[0079]MSQAVQTNGTQPLSKTWELSLYELQRTPQEAITDGLEIVVSPRSLHSELMCPICLDMLKNTMTTKECLHRFCADCIITALRSGNKECPTCRKKLVSKRSLRPDPNFDALISKIYPSRDEYEAHQERVLARINKHNNQQALSHSIEEGLKIQAMNRLQRGKKQQIENGSGAEDNGDSSHCSNASTHSNQEAGPSNKRTKTSDDSGLELDNNNAAVAIDPVMDGASEIELVFRPHPTLMEKDDSAQTRYIKTSGNATVDHLSKYLAVRLALEELRSKGESNQMNLDTASEKQYTIYIATASGQFTVLNGSFSLELVSEKYWKVNKPMELYYAPTKEHK。
[0080] 人的核苷酸序列(SEQ ID No.6)：
[0081]ATGTCTCAGGCTGTGCAGACAAACGGAACTCAACCATTAAGCAAAACATGGGAACTCAGTTTATATGAGTTACAACGAACACCTCAGGAGGCAATAACAGATGGCTTAGAAATTGTGGTTTCACCTCGAAGTCTACACAGTGAATTAATGTGCCCAATTTGTTTGGATATGTTGAAGAACACCATGACTACAAAGGAGTGTTTACATCGTTTTTGTGCAGACTGCATCATCACAGCCCTTAGAAGTGGCAACAAAGAATGTCCTACCTGTCGGAAAAAACTAGTTTCCAAAAGATCACTAAGGCCAGACCCAAACTTTGATGCACTCATCAGCAAAATTTATCCAAGTCGTGATGAGTATGAAGCTCATCAAGAGAGAGTATTAGCCAGGATCAACAAGCACAATAATCAGCAAGCACTCAGTCACAGCATTGAGGAAGGACTGAAGATACAGGCCATGAACAGACTGCAGCGAGGCAAGAAACAACAGATTGAAAATGGTAGTGGAGCAGAAGATAATGGTGACAGTTCACACTGCAGTAATGCATCCACACATAGCAATCAGGAAGCAGGCCCTAGTAACAAACGGACCAAAACATCTGATGATTCTGGGCTAGAGCTTGATAATAACAATGCAGCAATGGCAATTGATCCAGTAATGGATGGTGCTAGTGAAATTGAATTAGTATTCAGGCCTCATCCCACACTTATGGAAAAAGATGACAGTGCACAGACGAGATACATAAAGACTTCTGGTAACGCCACTGTTGATCACTTATCCAAGTATCTGGCTGTGAGGTTAGCTTTAGAAGAACTTCGAAGCAAAGGTGAATCAAACCAGATGAACCTTGATACAGCCAGTGAGAAGCAGTATACCATTTATATAGCAACAGCCAGTGGCCAGTTCACTGTATTAAATGGCTCTTTTTCTTTGGAATTGGTCAGTGAGAAATACTGGAAAGTGAACAAACCCATGGAACTTTATTACGCACCTACAAAGGAGCACAAATGA。
[0082] 人的氨基酸序列(SEQ ID No.7)：
[0083]MSQAVQTNGTQPLSKTWELSLYELQRTPQEAITDGLEIVVSPRSLHSELMCPICLDMLKNTMTTKECLHRFCADCIITALRSGNKECPTCRKKLVSKRSLRPDPNFDALISKIYPSRDEYEAHQERVLARINKHNNQQALSHSIEEGLKIQAMNRLQRGKKQQIENGSGAEDNGDSSHCSNASTHSNQEAGPSNKRTKTSDDSGLELDNNNAAMAIDPVMDGASEIELVFRPHPTLMEKDDSAQTRYIKTSGNATVDHLSKYLAVRLALEELRSKGESNQMNLDTASEKQYTIYIATASGQFTVLNGSFSLELVSEKYWKVNKPMELYYAPTKEHK。
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