技术领域
[0001] 本
发明涉及
肿瘤的过继免疫
治疗领域，具体涉及一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK及其制备方法。
背景技术
[0002] NK(Nature Killer)细胞是免疫系统中一类重要的细胞毒性杀伤细胞，它能够释放穿孔素和细胞因子诱导癌症细胞凋亡。NK细胞对靶细胞的识别不具有MHC限制性和肿瘤相关
抗原依赖性，因此具有比T细胞更广谱的抗肿瘤能
力。NK细胞的非MHC限制性使得它可以支持异体移植，并且能够杀伤那些通过降低MHC分子表达来躲避T细胞杀伤的癌细胞。NK细胞不会大量分泌IL-6，因此不会造成强烈的细胞因子
风暴。但是NK细胞在血液细胞中只占10％左右，需要繁琐的血细胞分离与富集过程，而且NK细胞的
转染效率较低，也增加了其基因修饰的难度。
[0003] NK-92是一株来源于非霍奇金淋巴瘤病人的NK细胞系，它具有NK细胞的优点并克服了NK细胞的缺点。它既拥有MHC非限制性和肿瘤相关抗原非依赖性的广谱抗肿瘤能力，又非常易于大规模培养，而且更容易进行基因操作。更重要的是，NK-92输注病人的临床一期数据已经显示了很高的安全性，即使在1×1010/m2的剂量条件下都未出现严重的不良反应。
[0004] NK细胞的增殖和激活需要细胞因子，尤其白细胞介素-2(IL-2)或IL-15。IL-2会刺激Treg
细胞增殖，并诱发T细胞凋亡，在临床应用中存在一定的毒
副作用。IL-15与IL-2的功能有很多相同的地方，且IL-15是负责NK发育、分化、维持而不可缺少的细胞因子。表达IL-15的NK-92细胞系表现出了更强的增殖能力和癌细胞杀伤能力，但仍然不能摆脱对IL-2的依赖。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK及其制备方法，以改变NK-92细胞的
生物学特性，摆脱对IL-2的依赖，提高增殖和杀伤能力，使NK-92细胞更适于临床应用。
[0006] 第一方面，本发明要求保护一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK的制备方法。
[0007] 本发明所提供的不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK的制备方法，可包括如下步骤：将含有IL-15蛋白和IL-15Rα的IL-15结合区的蛋白复合物以膜结合的方式表达于NK-92细胞系的表面，然后用无IL-2的培养基进行培养，得到的克隆化细胞系即为自然杀伤细胞系SILK-NK。
[0008] 进一步地，所述蛋白复合物自N端到C端依次由IL-15Rα的IL-15结合区、跨膜区和IL-15蛋白组成(如图1所示)。
[0009] 其中，所述跨膜区可为但不限于CD8α跨膜区。在本发明的具体
实施例方式中，所述跨膜区为CD8α跨膜区。
[0010] 更进一步地，所述IL-15Rα的IL-15结合区的
氨基酸序列可为SEQ ID No.1，或者为与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。所述CD8α跨膜区的氨基酸序列可为SEQ ID No.2，或者为与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。所述IL-15蛋白的氨基酸序列可为SEQ ID No.3，或者为与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。
[0011] 更加具体的，所述蛋白复合物的氨基酸序列可为SEQ ID No.4，或者为与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。
[0012] 进一步地，所述方法可包括如下步骤：将所述蛋白
复合体的编码基因插入到慢病毒表达载体，然后利用所得到的重组慢病毒载体
包装出慢病毒(如通过将所得的重组慢病毒载体与包装质粒共转染293T细胞的方式制备得到所述慢病毒)，用所述慢
病毒感染所述NK-92细胞系，在无IL-2的培养基中培养并通过有限稀释的方法得到所述克隆化细胞系。
[0013] 在本发明的具体实施方式中，所述无IL-2的培养基具体为含有终浓度为2.5％(体积百分含量)的血清替代物(如货号：HPCFDCGL50，Helios公司产品)的GT-T551-H3培养基(如货号：WK593S，TAKARA公司产品)。
[0014] 其中，所述蛋白复合体的编码基因中，编码所述IL-15Rα的IL-15结合区的核苷酸序列可为SEQ ID No.5的第1-216位，或者为与SEQ ID No.5的第1-216位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述IL-15Rα的IL-15结合区的序列。所述蛋白复合体的编码基因中，编码所述CD8α跨膜区的核苷酸序列可为SEQ ID No.5的第217-423位，或者为与SEQ ID No.5的第217-423位具有99％以上、95％以上、
90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述CD8α跨膜区的序列。所述蛋白复合体的编码基因中，编码所述IL-15蛋白的核苷酸序列可为SEQ ID No.5的第490-831位，或者为与SEQ ID No.5的第490-831位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、
80％以上或者75％以上同源性且编码所述IL-15蛋白的序列。
[0015] 具体地，所述蛋白复合体的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.5，或者为与SEQ ID No.5具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述蛋白复合体的序列。
[0016] 第二方面，本发明要求保护由前文所述方法制备得到的不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK。
[0017] 所述自然杀伤细胞系SILK-NK的STR表型为
[0018] Amelogenin：X,Y
[0019] CSF1PO：11,12
[0020] D13S317：9,12
[0021] D16S539：11,12
[0022] D5S818：12,13
[0023] D7S820：10,11
[0024] THO1：6,9.3
[0025] TPOX：8
[0026] vWA：18
[0027] D21S11：31.2,32。
[0028] 其mRNA反转录PCR可检测到IL-15及IL-15Rα的IL-15结合区的表达。
[0029] 其形态为悬浮的克隆团或分散细胞。
[0030] 进一步地，所述自然杀伤细胞系SILK-NK具体为保藏于中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.15583的细胞系。
[0031] 第三方面，前文所述的自然杀伤细胞系SILK-NK在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0032] (A1)制备用于肿瘤过继免疫治疗的产品；
[0033] (A2)制备用于细胞治疗的相关产品。
[0034] 如对所述自然杀伤细胞系SILK-NK进行基因改造使其表达一个嵌合抗原受体，利用此嵌合抗原受体的靶向性介导该细胞系对表达靶抗原的癌细胞进行特异性杀伤。对所述自然杀伤细胞系SILK-NK进行基因改造使其表达一个嵌合抗原受体，通过将这种改造过的细胞给病人输注来进行细胞治疗。
[0035] 本发明通过尝试将IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区复合物同时表达于NK-92，建立一种称作SILK-NK的新型杀伤细胞(Specific Interleukin Linked Killer,SILK-NK)，利用IL-15Rα的IL-15结合区作为IL-15的超级激活剂，用IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区组成的复合体来激活NK-92细胞并提高NK-92细胞的癌细胞杀伤能力。此复合体一方面以膜结合的形式顺式(cis-presented)刺激NK-92，使其在没有添加细胞因子的培养环境下得以增殖，另一方面反式(trans-presented)刺激宿主自体T细胞、NK细胞的增殖与激活，提高其自身抗肿瘤能力。
[0036] 本发明从NK细胞分化发育过程中起调节作用的细胞因子入手，因为1.IL-15在人体内多种组织都有表达，对NK细胞的分化发育过程起着重要作用；2.NK-92是未分
化成熟的NK细胞，细胞表面能够表达IL-15受体；3.IL-15的毒副作用显著小于IL-2；4.IL-15Rα的IL-15结合区能够作为IL-15活性的激活剂。所以，本发明采用表达膜结合的IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区复合体的病毒载体感染NK-92细胞，以期获得表达膜结合IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区复合体的NK-92细胞，通过IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区复合体的反式和顺势激活作用，使NK-92细胞的培养完全摆脱对IL-2的依赖，提高NK-92细胞的增殖能力、杀伤能力以及降低毒副作用，显著提高其在临床上的使用潜力。
[0037] 本发明的有益效果：
现有技术使NK-92表达IL-15可以提高NK-92的细胞杀伤毒性，但其NK-92细胞仍不能摆脱对IL-2的依赖。本发明在NK-92细胞稳定表达膜结合的IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区的复合体，利用IL-15Rα的IL-15结合区对IL-15的超级激动剂作用，可以使NK-92细胞在无IL-2的培养条件下长期增殖并拥有更高的杀伤活性，有利于大规模培养和临床应用。
[0038] 保藏说明
[0039] 建议分类命名：人自然杀伤细胞系
[0041] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0042] 保藏机构简称：CGMCC
[0043] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0044] 保藏日期：2018年04月03日
[0045] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15583
附图说明
[0046] 图1为本发明的蛋白复合体结构图。A：IL-15Rα的IL-15结合区，B：跨膜区，C：IL-15。
[0047] 图2为本发明的蛋白复合体的编码核酸序列结构示意图。A：IL-15Rα的IL-15结合区，B：跨膜区，C：IL-15。
[0048] 图3为本发明的装载了IL-15Rα-TM-P2A-IL-15核酸序列的慢病毒载体图谱。
[0049] 图4为本发明的SILK-NK-D8细胞与NK-92细胞的形态照片。A是NK-92细胞，B是SILK-NK-D8细胞。
[0050] 图5为本发明的SILK-NK-D8细胞与NK-92在不同培养时间点测定的3天增值倍数的比较。A是NK-92加100U/mL IL-2培养的3天增值倍数曲线图；B是SILK-NK-D8无IL-2培养的3天增值倍数曲线图。
[0051] 图6为本发明的RT-PCR鉴定IL-15及IL-15Rα的IL-15结合区的mRNA表达的
电泳图。A是NK-92细胞，B是SILK-NK-D8细胞。P1是引物1+引物2，P2是引物3+引物4。
[0052] 图7为本发明的NK-92和SILK-NK-D8细胞对表达GFP的K562细胞的杀伤实验。
荧光显示K562细胞。
[0053] 图8为本发明的NK-92和SILK-NK-D8细胞对表达萤火虫荧光素酶的K562细胞的杀伤实验。A是NK-92细胞，B是SILK-NK-D8细胞。
[0054] 图9为本发明的SILK-NK-D8细胞的STR分析结果。
具体实施方式
[0055] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0056] 下述实施例中所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0057] NK-92细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，培养基为可用于培养T淋巴细胞和NK细胞的GT-T551-H3培养基(货号：WK593S，TAKARA公司产品)，添加血清替代物(货号：HPCFDCGL50，Helios公司产品))至其终浓度为2.5％(体积百分含量)。
[0058] 293T培养基为DMEM添加10％(体积百分含量)胎
牛血清。
[0059] pLTR-abg019：南京尔宾堇生物技术有限公司，货号abg019。
[0060] pCMV-dR8.2质粒：Addgene，货号8455。
[0061] pCMV-VSV-G质粒：Addgene，货号8454。
[0062] 表达GFP和荧光素酶的K562细胞系K562-GFP-Luc：南京尔宾堇生物技术有限公司，货号562-GL。
[0063] 实施例1、不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK的制备及鉴定[0064] 一、pLTR-IL15Rα-IL15慢病毒表达载体的构建
[0065] 如图2和图3所示，IL-15Rα-TM-P2A-IL-15的DNA序列(SEQ ID No.5)合成自南京金斯瑞生物科技股份有限公司，两端加上了BamHI(5’)和MluI(3’)，合成的序列与pLTR-abg019质粒分别用BamH I和Mlu I双酶切后连接并转化DH5α感受态细菌，用IL-15Rα的IL-15结合区序列内的上游引物(SEQ ID No.6)和IL-15序列内的下游引物SEQ ID No.7)做菌落PCR鉴定阳性克隆后测序鉴定得到目的表达质粒pLTR-IL15Rα-IL15。
[0066] 重组质粒pLTR-IL15Rα-IL15的结构描述为：将pLTR-abg019质粒的酶切位点BamH I和Mlu I之间的小
片段替换为SEQ ID No.5所示DNA片段后得到的重组质粒。
[0067] SEQ ID No.5为IL-15Rα-TM-P2A-IL-15蛋白复合体的编码基因序列，其中第1-216位为IL-15Rα的IL-15结合区的编码基因，第217-423位为CD8α跨膜区的编码基因，第490-831位为IL-15蛋白的编码基因。SEQ ID No.5编码SEQ ID No.4所示的
蛋白质。其中，SEQ ID No.4的第1-72位为所述IL-15Rα的IL-15结合区的氨基酸序列(即SEQ ID No.1)；SEQ ID No.4的第73-141位为所述CD8α跨膜区的氨基酸序列(即SEQ ID No.2)；SEQ ID No.4的第
164-277位为所述IL-15蛋白的氨基酸序列(即SEQ ID No.3)。
[0068] 二、pLTR-IL15Rα-IL15质粒包装病毒
[0069] 将步骤一构建的重组载体pLTR-IL15Rα-IL15、包装质粒pCMV-dR8.2和pCMV-VSV-G以15：10：1的比例(
质量比)用PEI(1μg/μl)转染293T细胞。
[0070] 具体实施为：第0天传代293T细胞8×106个细胞至T75培养瓶；第1天：1mlOpti-MEM中加入三种质粒pLTR-IL15Rα-IL15：pCMV-dR8.2：pCMV-VSV-G＝15μg：10μg：1μg，混匀后加入78μl PEI，震荡混匀后室温放置15分钟，之后加入到培养293T的T75培养瓶中，轻柔摇晃混匀。转染后12-16小时换新鲜培养基。转染后48小时即第3天收集培养基，0.45μM滤
膜过滤去除细胞得到病毒原液。病毒原液添加1/3体积的40％PEG，混匀后4℃放置过夜。第二天离心，4℃，1800g，45分钟，弃上清后用病毒原液1/10体积的NK-92培养基(添加终浓度为100U/ml IL-2)重悬病毒沉淀，得到10倍浓缩的病毒悬液。
[0071] 三、感染NK-92细胞
[0072] 取3×105NK-92细胞用1mL步骤二制备得到的10倍浓缩病毒重悬并添加8μg/mlpolybrane，转移到24孔板一个孔中，32℃，1500g离心45分钟后转移到二
氧化
碳培养箱培养，3小时后离心去上清，换添加终浓度为100U/ml IL-2的NK-92培养基；第二天再重复一次感染后换添加终浓度为100U/ml IL-2的NK-92培养基，之后保持3天传代一次。2周后传代时培养基不再添加IL-2，继续培养两周，活下来的细胞即为得到的目的细胞SILK-NK(Specific Interleukin Linked Killer)。得到的细胞在96孔板做梯度稀释，鉴定出5个单克隆细胞系：A6，A9，D8，F6，F7，后续实施例中是用的克隆D8(后续称为SILK-NK-D8)。
[0073] SILK-NK-D8于2018年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.15583，建议分类命名为人自然杀伤细胞系；参椐的生物材料(株)为SILK。
[0074] 四、细胞形态与增殖
[0075] 如图4，SILK-NK-D8具有和NK-92类似的细胞形态，倾向于形成松散的克隆团，如图5所示，SILK-NK-D8在不添加IL-2的培养基中可以达到2-3天倍增的增殖速率，与NK-92相同。
[0076] 五、外源基因表达鉴定
[0077] SILK-NK-D8和NK-92分别提取总RNA，用Oligo(dT)18做反转录得到cDNA，用针对IL-15Rα的IL-15结合区的引物(P1是引物1+引物2，P2是引物3+引物4)做PCR，如图6所示，1％琼脂糖胶电泳显示SILK-NK-D8有约500bp大小的阳性条带而NK-92没有。
[0078] 引物1：5’-atgtccgtggaacacgcagac-3’(SEQ ID No.6)；
[0079] 引物2：5’-cttgaggtcg gagatgacgt tc-3’(SEQ ID No.7)；
[0080] 引物3：5’-cccagtctcaaatgcattagagacc-3’(SEQ ID No.8)；
[0081] 引物4：5’-ggtgtcatggatgctggcg-3’(SEQ ID No.9)。
[0082] 六、细胞杀伤能力检测
[0083] 用表达GFP和荧光素酶的K562细胞系K562-GFP-Luc做靶细胞，SILK-NK-D8和NK-924
分别以10:1,5:1,1:1的比例与1×10靶细胞在96孔板100μl体系中孵育，24小时后检测GFP荧光和荧光素酶。结果如图7和图8所示，SILK-NK-D8与NK-92对K562细胞有相同的杀伤活性。
[0084] SILK-NK-D8细胞做STR检测，结果如图9所示，STR表型为
[0085] “Amelogenin：X,Y
[0086] CSF1PO：11,12
[0087] D13S317：9,12
[0088] D16S539：11,12
[0089] D5S818：12,13
[0090] D7S820：10,11
[0091] THO1：6,9.3
[0092] TPOX：8
[0093] vWA：18
[0094] D21S11：31.2,32”。
[0095] 其mRNA反转录PCR可检测到IL-15及IL-15Rα的IL-15结合区的表达。
[0096] 以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及
修改。本项发明的技术性范围并不局限于上述具体实施方试中的内容，必须要根据
权利要求和
说明书范围来确定其技术性范围。
