慢病毒感染胚胎的方法
阅读：636发布：2020-05-12
专利汇可以提供慢病毒感染胚胎的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种慢 病毒感染 胚胎的方法，其是在胚胎2细胞期时，将慢病毒悬液注入至胚胎卵周隙。研究表明2细胞期Piezo注射组较之1细胞期注射可以明显获得较高的胚胎成活率、胚胎发育率和阳性胚胎率。本发明方法效率高、成本低，适合在实验研究以及胚胎工程中广泛推广使用。，下面是慢病毒感染胚胎的方法专利的具体信息内容。
慢病毒感染胚胎的方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种慢病毒感染胚胎的方法。
背景技术
[0002] 慢病毒（Lentivirus)载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能
力。有关慢病毒载体的研究发展很快也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿
主基因组DNA上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细
胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗
效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
力。有关慢病毒载体的研究发展很快也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿
主基因组DNA上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细
胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗
效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
[0003] 慢病毒能够有效感染非周期性和终末分化的细胞。慢病毒载体能够介导shRNA的表达片段整合到宿主基因组上，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代
细胞中表达shRNA，实现在单种类型的细胞和整个个体中特异而稳定的基因功能性沉默，为
在动物和人的组织细胞中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物
提供了可能性。慢病毒作为siRNA的载体，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且
充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
细胞中表达shRNA，实现在单种类型的细胞和整个个体中特异而稳定的基因功能性沉默，为
在动物和人的组织细胞中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物
提供了可能性。慢病毒作为siRNA的载体，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且
充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
[0004] 目前，在慢病毒感染小鼠胚胎的试验中最常用的方法有两种：应用Piezo介导的显微注射的方法将慢病毒注射到1细胞期胚胎或卵母细胞的卵周隙来感染胚胎；另一种方
法是将胚胎的透明带剥离，通过胚胎和病毒的共孵育来生产转基因胚胎。
法是将胚胎的透明带剥离，通过胚胎和病毒的共孵育来生产转基因胚胎。
[0005] 传统的注射方案，由于受精卵或卵母细胞体积较大、胚胎/卵子卵周隙较小，注射的病毒液的体积非常有限，所以要求慢病毒悬液必须有相当高的滴度才能达到较高的感染
效率。 一般来讲，要求的病毒滴度为109(感染单位/毫升，Infectious units (I. U.)/ml)，
而获得如此高滴度的病毒不仅耗费大量的人力物力，同时繁琐的滴度浓縮程序增加了慢病
毒的危险性。
效率。 一般来讲，要求的病毒滴度为109(感染单位/毫升，Infectious units (I. U.)/ml)，
而获得如此高滴度的病毒不仅耗费大量的人力物力，同时繁琐的滴度浓縮程序增加了慢病
毒的危险性。
[0006] 另一种感染胚胎的方法是将胚胎的透明带剥离，通过胚胎和病毒的共孵育来生产 转基因胚胎。此种方法虽然不需要高滴度的病毒，但由于透明带剥离操作比较困难，加之无 透明带的胚胎发育潜力及后续妊娠率都受到极大损伤，所以此种方法很少被采用。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于针对上述不足提供一种慢病毒感染胚胎的方法。
[0008] 本发明方法是在胚胎2细胞期将慢病毒悬液注射到胚胎的卵周隙处。
[0009] 用于感染的慢病毒可以携带有外源基因，例如，通常作为载体慢病毒均带有标记基因，如GFP标记，在研究或者应用中还进一步整合其他外源基因，从而通过感染获得转基
因胚胎细胞，进而为获得转基因动物提供了可能。
因胚胎细胞，进而为获得转基因动物提供了可能。
[0010] 在本发明中慢病毒悬液的滴度为一般为2X106〜2X108I.U./ml，优选为 2X106I.U./ml。当然，本领域技术人员可以适当地提高病毒滴度或降低病毒滴度。但在同等条件下，采用2细胞期进行感染的阳性胚胎率显著高于1细胞期进行感染的阳性胚胎率，这在2乂1061』./ml的滴度下尤为突出。
[0011] 在本发明实例中2细胞期Piezo注射组较之1细胞期注射可以明显获得较高的胚胎成活率、胚胎发育率和阳性胚胎率。
[0012] 目前，通常采用Piezo辅助打孔法将慢病毒悬液注入至胚胎卵周隙。Piezo辅助打孔，是利用脉冲打穿细胞膜，形成一个微小的能够将注射针插入的小孔。Piezo辅助打孔通常条件设置为：频率"Speed"为l，脉冲强度"Int"为1-2。
[0013] 注入胚胎中的慢病毒悬液量可以根据不同类型的胚胎进行调整，通常以注入卵周隙饱和剂量为佳（这里的饱和剂量或饱和量是指注入慢病毒悬液至满卵周隙）。[0014] 本发明方法采用在2细胞期感染慢病毒，由于2细胞期胚胎有较大的卵周隙，透明带与卵黄膜间距较大，该时期胚胎正处于合子基因组激活期；所以Piezo脉冲带来的对胚胎的损伤可以最大程度的避免，同时慢病毒注入卵周隙的体积较多，加之2细胞胚胎高的转录活性，慢病毒整合效率也随之增高。最终使得2细胞期慢病毒感染胚胎的效率比传统的方法有了大幅度的提高，可以提高病毒拷贝数（参见图2)，即使在注射低滴度病毒2X 106时也能保持较高的转基因阳性胚胎获得率。附图说明
[0015] 图l为注射方式示意图，其中l为卵周隙，2为注射针头，箭头指示Piezo电脉冲的力。
具体实施方式
[0018] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0019] 实施例1
[0020] 本例通过慢病毒的包装、Piezo介导的2细胞期胚胎透明带下慢病毒注射以及胚胎的培养和后续观察，来考察在2细胞期胚胎注入慢病毒的感染效率。[0021] 1、病毒的包装及病毒悬液制备
[0022] 包装慢病毒所用的三质粒Fugw、 A 8. 9、 Vsvg由麻省理工学院Carlos Lois惠贝曾(Lois C， Hong EJ， Pease S， Brown EJ， Baltimore D(2002)Germline transmissionand tissue—specific expression oftransgenes delivered by lentiviral vectors.Science, 295 :868-72)，利用磷酸钙的方法将三质粒转染到293T细胞中，进行病毒包装。磷酸钙AB液配方为：A :16. 4g NaCl、11.9g HEPES、0. 27g Na2HP04、2. 5g葡萄糖/1L水(pH7. 01〜7. 03) ;B :CaCl2溶液（2. 5mol. L—0 。
[0023] 病毒包装完成后采用高速离心（70， 000g，2. 5小时）进行浓縮，后用小鼠胚胎操作液M2(购自Sigma公司）进行病毒悬浮。将慢病毒原液按照10倍、102倍、103倍、104倍、4105倍、106倍、107倍、108倍、109倍稀释通过感染细胞来测定病毒滴度。按照不同的稀释比例获得2X 108和2X 106滴度的病毒来进行后续的注射。[0024] 2、显微注射及结果观察
[0025] 冲取2细胞期小鼠胚胎，将其置于M2操作液中用Piezo辅助透明带打孔法对胚胎进行卵周隙病毒注射（频率"Speed"设置为l，脉冲强度"Int"设置为1_2)。注射后的胚胎置于M16培养液（购自Sigma公司）中进行培养，60小时后观察报告基因的表达情况。[0026] 本例对3组小鼠胚胎的慢病毒注射（参见图1)。分别为：1细胞期注射作为对照组、2细胞期注射和1细胞期胚胎蔗糖处理注射来模拟2细胞期胚胎较大的卵周隙。每组都注射饱和剂量病毒。注射后的胚胎置于M16培养液中进行培养，60小时后观察报告基因的表达情况。
[0027] 3、结果及讨论
[0028] 结果如表1所示，2细胞期Piezo注射组较之1细胞期注射可以明显获得较高的胚胎成活率、胚胎发育率和阳性胚胎率，尤其在病毒滴度为2X 106时，其阳性胚胎率极显著高
于传统的1细胞期胚胎注射。[0029]table see original document page 5
于传统的1细胞期胚胎注射。[0029]
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