沙棘(Hippophae rhamnoides L.)，胡颓子科落叶灌木，主 要生长在中国黄河流域，此外，还广泛分布于欧洲、前苏联、西 亚、中东等地。在中国，自古以来，沙棘的果实就被用于哮喘、 消化不良、炎症等的治疗中。
此外，近年来，沙棘还被应用于动脉硬化、心绞痛、溃疡、 放射线伤害等的治疗中。作为该植物的化学成分，已报道了包含 于其果实、种子、茎和叶中的类黄酮糖苷、甾醇、精油、三萜衍 生物。关于药理作用，已知有降低血压、抗动脉硬化、镇咳、祛 痰、平喘、抗菌作用。
例如，在日本专利特开2004-217545号公报中，公开了来源 于沙棘的显示出蛋白质非酶性糖化抑制活性、醛糖还原酶抑制活 性和自由基清除活性的新的类黄酮糖苷，并且可被有效用于糖尿 病或糖尿病并发症的预防·治疗、衰老或癌症、动脉硬化、脑栓 塞等疾病的预防·治疗中。

发明要解决的问题
迄今为止，尽管已知沙棘具有抗炎症效果，但是关于其有效 成分，一直都是未知的。本发明的目的在于探明来源于沙棘的具 有抗炎症效果的化合物，并开发该化合物的新用途。
解决本发明的问题的方法
本发明人们针对来源于沙棘的有效成分进行了积极的研究， 结果探明了具有抗炎症效果的化合物。本发明是基于该发现完成 的，并提供下述通式(1)所示的三萜衍生物。该三萜衍生物及其 药学上可接受的盐具有抗炎症作用(抑制一氧化氮的产生的作 用)、自由基清除作用。

上式中，R1、R2和R3同时或者各自独立地表示羟基、氢原子、 C1-6烷基或烷基醚基。
另外，本发明还提供以下述通式(2)所示的苯并吡喃衍生物 或其药学上可接受的盐作为有效成分的一氧化氮抑制剂。该苯并 吡喃衍生物或其药学上可接受的盐具有自由基清除作用。

上式中，R4表示氢原子、烷基、酰基、糖类。

该三萜衍生物和苯并吡喃衍生物以及它们的药学上可接受的 盐，具有抗炎症作用(抑制一氧化氮的产生的作用)、自由基清除 作用。因此，可以认为它们能够有效用于各种炎症性疾病、各种 变态反应性疾病、糖尿病等的治疗中。
为了基于治疗目的而使用新的三萜衍生物和苯并吡喃衍生物 以及它们的药学上可接受的盐，可以将各个化合物及其无毒性盐 作为有效成分，通过口服或非口服方式给药。给药量根据症状、 年龄、性别、体重、给药方式等而异，例如，对成人口服给药时， 每日剂量通常为0.1～1000mg。
用于将新的三萜衍生物和苯并吡喃衍生物以及它们的药学上 可接受的盐制剂化的剂型并没有限制，可以以口服方式使用锭利、 丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂等固体制剂，溶液、悬浮液、乳剂 等液态制剂。另外，也可以以非口服方式使用静脉内、肌肉、皮 下等的注射剂，栓剂、贴付剂等。
在制成固体制剂时，可以使用淀粉、乳糖、葡萄糖、磷酸钙、 硬脂酸镁、羧甲基纤维素等赋形剂。另外，如果需要，还可以使 用润滑剂、崩解剂、包覆剂、着色剂等。当以注射利及液态制剂 形式使用时，可以包含稳定化剂、溶液助剂、悬浮化剂、乳化利、 缓冲剂、保存剂等。
下面，对上述通式(1)所示的三萜衍生物和通式(2)所示 的苯并吡喃衍生物的制造实例进行说明。
将沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的树枝皮(3kg)浸渍 在80％的丙酮(10L)中48小时，得到提取物。重复进行3次，浓 缩、干燥所得到的提取物，得到929.84g的浸膏。
将该929.84g的浸膏溶于水中，依次使用正己烷、氯仿、乙酸 乙酯、正丁醇进行分配萃取，接着在减压条件下进行浓缩。其结 果分别得到正己烷馏分(21.14g)、氯仿馏分(29.34g)、乙酸乙 酯馏分(37.12g)、正丁醇馏分(180.23g)、水馏分(631.73g)。
针对各个馏分，将样品浓度调整至100μg/mL，并用它们进行 后述的一氧化氮(NO)产生抑制试验。结果发现它们各自的NO产生抑制活性分别为：正己烷馏分(89.5％)、氯仿馏分(90.3％)、 乙酸乙酯馏分(67.2％)、正丁醇馏分(24.6％)、水馏分(0.8％)。
接着，对各个馏分进行MTT分析，然后使用硅胶柱(wako gel C-300，6.5×18cm)对活性最强的28.1g氯仿馏分进行处理， 依次使用正己烷、乙酸乙酯∶正己烷(2∶98、4∶96、8∶92、 15∶85、20∶80、40∶60、80∶20)、乙酸乙酯、以及甲醇进行 洗脱。结果得到6个馏分fr.1(1.3g)、fr.2(1.0g)、fr.3(2.0g)、 fr.4(1.5g)、fr.5(2.8g)、fr.6(12.2g)。
然后，针对fr.3馏分，使用正相HPLC(色谱柱：Shiseido Silica SG 80A 10×250mm；流动相为己烷∶乙酸乙酯＝70∶30；流速 为4.0mL/min(室温))进行洗脱，利用Shodex RI-72(差示折 光计)接收保留时间为8分20秒时洗脱出来的峰。使用反相HPLC (色谱柱：Capcell PAK C18 10×250mm；流动相为甲醇∶水 ＝95∶5，流速为4.0mL/min(室温))洗脱该馏分(230mg)。利 用UV(210nm)检测器接收保留时间为10分40秒时洗脱出来的峰， 得到化合物1(24.9mg)。下面显示了化合物1的结构式(3)：

接着，以水∶甲醇(50∶50→0∶100)为流动相的ODS柱 (Chromatorex ODS 100-200目，5.5×15cm)洗脱fr.4馏留分， 得到9个馏分(fr.4-1至fr.4-9)。其中，使用反相HPLC(色谱柱： Capcell PAK C18 10×250mm；流动相为甲醇∶水＝35∶65； 流速为4.0mL/min(室温))洗脱fr.4-1(0.12g)，利用UV(254nm) 检测器接收保留时间为13分40秒时洗脱出来的峰，得到化合物3 (12.8mg)。下面显示了化合物2的结构式(4)。

下面给出了所得的化合物的1H-NMR和13C-NMR数据、 MS、IR、UV数据。其中，化合物3和4是通过VSRIAN Mercury 300 测定的，1H-NMR是在300MHz下测定的，13C-NMR是在 75MHz下测定的。
              [表1]   性状   黄色油   ESI-MS(m/z)   163   分子量   162   分子式   C10H10O2   UV λmaxnm(logε)   275(3.42)   250(3.32)     IR(KBr)νmaxcm-1   2960   1490   1205
另外，在表2中，给出了化合物2的1H-NMR和13C-NMR数 据(300MHz，氘代氯仿(chloroform-d)溶剂)。
                  [表2]   位置   δH   δC   2   4.43(dd，6.6，0.6)   58.9   3   5.75m   128.2   4   6.48m   130.0   4a   127.8   5   6.90m   113.1   6   145.0   7   6.71m   121.1   8   6.76m   110.2   8a   143.8   OCH3   3.88s   55.0
接着，使用正相HPLC(色谱柱：Shiseido Silica SG 80A 10 ×250mm；流动相为己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝60∶35∶5；流速 为4.0mL/min(室温))洗脱fr.4-6(0.07g)，利用UV(254nm) 检测器接收保留时间为11分13秒时洗脱出来的峰，得到化合物3 (6.0mg)。下面显示了化合物3的结构式(5)：

下面给出与化合物3的性状有关的数据。另外，HR-FAB-MS (m/z)的测定是使用JOEL GC mate进行的，UVλmaxnm(logε) 的测定是使用Shimadzu UV-160进行的，IRνcm-1 max的测定是 使用JASCO IR A-2进行的。
                [表3]   性状   无色粉末   HR-FAB-MS(m/z)   计算值     633.38057   测定值   633.37912   分子量   634   分子式   C39H54O7     UVλmaxnm(logε)   327(4.30)   300(4.26)   245(4.21)     IRνmaxcm-1   3430(OH)   1695   1515
另外，在表4中，给出了化合物4的1H-NMR和13C-NMR数 据(600MHz，氘代甲醇(methanol-d4)溶剂)。
                                              [表4]   位置   δH   δC   位置   δH   δC   1   2.03m，1.00m   45.2   21   1.38m，1.20m   34.9   2   5.04(ddd，11.8，10.0，4.4)   73.8   22   1.36m，1.52m   33.8   3   3.24(d，10.0)   81.2   23   1.06s   29.2   4   41.0   24   0.88s   17.4   5   0.93m   56.6   25   1.09s   16.9   6   1.60m，1.48m   19.6   26   0.83s   17.7   7   1.72m，1.51m   33.8   27   1.17s   26.4   8   43.0   28   181.8   9   1.67m   49.1   29   0.89s   33.5   10   39.5   30   0.94s   24.0   11   1.98m，1.85m   24.6   1′   127.9   12   5.24(t，3.8)   123.4   2′   7.03(d，2.1)   115.2   13   145.3   3′   146.6   14   40.6   4′   149.5   15   1.78m   28.8   5′   6.77(d，8.6)   115.9   16   2.00m，1.60m   24.1   6′   6.93(dd，8.6，2.1)   122.8   17   47.6   7′   7.55(d，15.8)   146.8   18   2.84(dd，13.8，3.8)   42.7   8′   6.27(d，15.8)   116.5   19   1.66m，1.12m   47.3   9′   169.3   20   31.6
[试验例1]NO产生抑制活性试验
以化合物1～3为样品，按照下述步骤进行一氧化氮产生抑制 活性试验。将各个样品溶解于DMSO中。另外，通过在500mL F -12HAM培养基中加入5mL的L-谷氨酰胺(200mM)、50mL FBS，制备成培养基，并使该培养基中的DMSO成为0.2重量％。 接着，将50mL铺满的RAW264.7细胞加入到所制备的培养基中， 制成细胞悬浊液。将该细胞悬浊液放入Falcon试管中。
使用离心机(1000rpm，3分钟，4℃)离心RAW264.7细胞， 使用抽吸器除去上清液。接着，在除去了上清液的Falcon试管中 加入20mL新鲜的培养基，通过悬浮而得到调制成1.5×105个/mL 的浓度的悬浮液。接着，在96孔板(住友Bakelite公司制造的 8096R)中各注入200μL上述悬浮液，使用CO2培养箱使细胞粘附 1小时。
培养后，在96孔板中加入2μL的LPS(10μg/mL，sigma公司 制造的O5:B5)和2μL的小鼠INF-γ(33ng/mL，Genzyme公司 制造)以及0.4μL的化合物溶液。将其在CO2培养箱中培养16小时， 取100μL培养上清液。
向其中加入50μL 0.1％的萘二胺和50μL磺胺溶液，在室温下 遮光放置10分钟，然后使用分光光度计在O.D.570nm(对照 655nm)下进行测定。通过显微镜检查观察和MTT法判定细胞生 存率(Cell viability)。
抑制率(％)＝{1-(X-Y)/(Z-Y)}×100
X：在试验化合物的存在下由IFN-γ和LPS诱导的NO2 -量
Y：在没有试验化合物、IFN-γ和LPS的状态下诱导的NO2 -量
Z：由IFN-γ和LPS诱导的NO2 -量
进而，从所计算出的值，求出样品化合物的NO产生抑制活性 被阻碍50％的浓度(IC50)。细胞生存率(Cell viability)的结果 一并如表5所示。另外，在表中，“A”表示NO产生抑制率(％)， “B”表示细胞生存率(％)。
                                           [表5]     样品   100μM   30μM   10μM   3μM   A   B   A   B   A   B   A   B   化合物1   85   96   21   100   18   99   -   -   化合物2   85   95   50   99   28   100   -   -   化合物3   99   96   89   97   53   99   22   101
[试验例2]自由基清除活性
以化合物1～3为样品，根据Okada等的方法进行自由基清除 活性试验。在96孔板(住友Bakelite公司制造的#8096R)中加入 40μL的0.2M醋酸缓冲液(pH5.5)、120μL的12％含水乙醇溶液、 0.4μL以二甲亚砜溶解的试验化合物，然后进一步加入40μL 0.5mM的DPPH溶液，并在暗处放置30分钟。然后使用平板读取 器(Bio-Rad公司制造的3550 Plate Reader)测定520nm的吸 光度。并且，基于所得到的测定值，使用下述计算式计算出DPPH 自由基的清除率。进而，从所计算出来的值，求出样品化合物的 自由基清除活性被阻碍50％的浓度(IC50)，结果如表6所示。
清除率(％)＝{1-(X-Z)/(Y-Z)}×100
X：添加了实验化合物时的吸光度
Y：未添加实验化合物时的吸光度
Z：仅为二甲亚砜和12％乙醇溶液时的吸光度
                [表6]   样品   IC50(μM)   化合物1(比较例1)   ＞100   化合物2(实施例1)   55.0   化合物3(实施例2)   34.7
专利文献1：日本专利特开2004-217545号公报