1.发明领域

本发明总地涉及癌症治疗和放射治疗领域。更具体地说，本发明涉及低剂量 的蛋白激酶C(PKC)抑制剂白屈菜红碱和低剂量的电离辐射相组合来预想不到地 有效杀死抗辐射性肿瘤细胞。

2.相关领域描述

某些癌症治疗方法(包括放射治疗)涉及破坏癌细胞的DNA。细胞对DNA破 坏的反应包括激活DNA修复、细胞周期停滞和致死(Hall，1988)。电离辐射(IR； x-辐射)介导哺乳动物细胞杀伤作用的特征通常是在一次或多次细胞分裂后丧失 繁殖的完整性(Chang和Little，1992a，1991，1992b；Bussink等人，1996)。诱导DNA 双链断裂会导致染色体致死性畸变(包括缺失、染色体双着丝、成环和分裂后期成 桥)(Hall，1994)。有丝分裂死亡然后经IR照射而频死的细胞的形态学特征包括(和 坏死中的一样)：多核巨细胞、细胞-细胞融合(Hall，1994)、以及丧失膜完整性 (Quintans等人，1994；Maity等人，1994；Harmon和Allan，1988；Radford和Murphy， 1994)。与坏死相反，IR诱导的凋亡的形态特征(Quintans等人，1994；Maity等人， 1994；Harmon和Allan，1988；Radford和Murphy，1994)包括激活一个基因程序， 该程序可由导致细胞质呈泡状、染色质凝缩和DNA片段化的细胞质或细胞核行 为所引发(Jacobson等人，1994；Raff等人，1994)。

肿瘤系统中的研究提示，经历凋亡的肿瘤细胞组分的增加增强了IR的肿瘤 退化和肿瘤治愈(Meyn等人，1993；1994；1995；Martin和Green，1994；Indap 和Rao，1995；Dewey等人，1995；Lowe等人，1993b；Stephens等人，1991；1993)。 在人体研究中已经采用了破坏DNA、干扰DNA修复或改变细胞周期校验点的试 剂来修饰辐射肿瘤反应，但临床效果有限(Hall，1988；Vokes和Weichselbaum，1990； Rosenthal等人，1995)。部分原因可能是对x辐照凋亡反应的丧失与抗辐射表型有 连系。肿瘤抗辐射性可能会通过激活DNA修复基因和细胞周期校验点而产生 (Maity等人，1994；Sanchez和Elledge，1995；Szumiel，1994；Park，1995；Shen等人， 1996；McKenna等人，1991)。例如，由于经历凋亡的能力减退，p53功能的丧失 与抗辐射性表型有关(Boise等人，1995)，且通常与抗治疗性和肿瘤复发有关 (Lowe等人，1993a；1993b；1994)。抗凋亡性和原凋亡性蛋白比例的增加也减少了 IR诱导的凋亡。

已经证实，在一些细胞类型中，鞘磷脂酶的激活以及随后神经酰胺的产生发 生在x射线诱导的凋亡之前(Quintans等人，1994；Haimovitz-Friedman等人，1994； Verheij等人，1996；Kolesnick，1994；Jarvis和Kolesnick，1996；Santana等人， 1996)。最近已经表明，在酸性鞘磷脂酶敲除小鼠的细胞以及选出的中性鞘磷脂酶 产生缺陷型肿瘤细胞中，x射线照射后神经酰胺产生的丧失，赋予了抗辐射性表 型。另外，白屈菜红碱氯化物(Herbert等人，1990)和钙感光蛋白C(calphostin C)(Kobayashi等人，1989b)(PKC同种型的抑制剂)通过激活中性鞘磷脂酶诱导了凋 亡和神经酰胺的产生(Chmura等人，1996a；Chmura等人，1996b)。

电离辐射诱导PKC和蛋白酪氨酸激酶活性(Hallahan等人，1990；Uckun等人， 1995)。然而，负责这些活性的特异性激酶及其底物并未被完全了解。PKC激活 在功能上与哺乳动物经IR照射后的基因诱导有关(Young等人，1994；Kondratyev 等人，1996；Hallahan等人，1995；Hallahan等人，1994)。丝氨酸/苏氨酸激酶的蛋白 激酶C家族包括至少13个相关的同种型(Magnuson等人，1994)，它们对钙和脂质 激活剂的敏感性不同。另据报道，PCK激活还抑制了鞘磷脂水解产生神经酰胺， 并挽救了受IR介导而凋亡的细胞(Kolesnick等人，1994；Haimovitz-Friedman等人， 1994)。

关于PKC抑制剂和人肿瘤细胞中编程性细胞死亡的诱导之间的关系的现有 信息很少，且已有的报道中描述的结果不一致。例如，据报道，强效而非特异性 的PKC抑制剂星形孢菌素不仅能起对抗作用(Cotter等人，1992)，而且还能引发 HL-60细胞凋亡(Bertrand等人，1993)；同样，也出现了与之矛盾的关于抑制剂H7 作用的报道(Ojeda等人，1990；Forbes等人，1992)。总地来说，缺乏不同PKC抑制 剂在调节凋亡中浓度反应关系的详细比较研究。Jarvis等人于1994年证明，尽管 这些试剂的效果有所不同且很大程度上取决于浓度，但是将HL-60细胞短暂接触 PKC抑制剂的一种亚型(尤其是白屈菜红碱)会在HL-60细胞中明显诱导凋亡性 DNA片段化和细胞死亡，此种短时间(即6小时)接触白屈菜红碱足以诱导人髓性 白血病细胞株HL-60凋亡。另外，用PKC抑制剂和其它丝氨酸-苏氨酸激酶体外 处理某些细胞，通过不明确的机制能增加IR介导的杀细胞作用(Hallahan等人， 1992)。

最近的研究表明，细胞接触肿瘤坏死因子α(TNFα)、Fas配体、IgM交联、 辐射和其它DNA损伤因子后的信号传导行为可能通过膜鞘磷脂水解产生神经酰 胺来触发凋亡(Quintans等人，1994；Nagata和Golstein，1995；Dressler等人， 1992)，佛波酯或生长因子激活蛋白激酶C对抗了神经酰胺诱导的凋亡，且间接 的证据提示，PKC激活可能抑制了神经酰胺的产生(Fuks等人，1994；Haimovitz- Friedman等人，1994a；Haimovitz-Friedman等人，1994b)。神经酰胺及其代谢产物 鞘氨醇的一种潜在的作用是防止特异性PKC同种型激活(Chmura等人，1996b； Jones和Murray，1995；Kolesnick，1989；Ohta等人，1994)。结合起来考虑，这些研 究提示PKC激活可能对抗凋亡通道中神经酰胺产生的作用。

最近研究了辐射介导凋亡的机制，结果证实，x射线后鞘磷脂水解立即产生 脂质第二信使神经酰胺对凋亡反应有作用(Kolesnick等人，1994；Haimovitz- Friedman等人，1994b；Verheij等人，1996)。两种形式的鞘磷脂酶参与了x射线后 的神经酰胺的产生。首先提出Mg++依赖型中性鞘磷脂酶的参与成为电离辐射后内 皮细胞膜上产生神经酰胺的来源(Haimovitz-Friedman等人，1994)。最近，Santana 等人证实，酸性鞘磷脂酶敲除小鼠的组织和细胞对于电离辐射后的凋亡更具抵抗 力(Santana等人，1996)。这一研究暗示酸性鞘磷脂酶是某些组织中凋亡反应的一 种成分。

肿瘤细胞中PKC同种型的信号传导相互作用还有很多有待阐明。很明显的 是，PKC通道在控制肿瘤细胞凋亡中起关键作用。还有证据是，抗辐射性肿瘤细 胞中的这些通道的改变导致治疗这些类型肿瘤的难度增加。目前需要开发出新的 改进的治疗方法来克服抗辐射性肿瘤细胞对凋亡的抵抗力。

                          发明概述

本发明提供了一种抑制肿瘤细胞生长的方法，该方法包括使肿瘤细胞与白屈 菜红碱接触，并使肿瘤细胞与电离辐射接触，其中白屈菜红碱的剂量在与电离辐 射剂量组合时能有效地抑制肿瘤细胞生长。

在本发明的一个实例中，肿瘤细胞在接触电离辐射前先与白屈菜红碱接触。 在本发明的另一个实例中，肿瘤细胞在接触白屈菜红碱之前先与电离辐射接触。 在本发明的还有一个实例中，白屈菜红碱和电离辐射同时与肿瘤细胞接触。

本发明提供的白屈菜红碱的剂量约为0.5-10毫克/千克，更佳的白屈菜红碱 剂量约为1-4毫克/千克。

本发明还提供了电离辐射，该电离辐射选自γ辐射、x辐射、微波辐射和紫 外辐射，其中电离辐射的总剂量约为1-80Gy，但是更佳的电离辐射总剂量约为 70Gy。电离辐射总剂量宜以连续的等份给予。

在本发明的一个方面，白屈菜红碱与肿瘤细胞接触至少两次。在本发明的另 一方面，电离辐射与肿瘤细胞接触至少两次。

在本发明的一个实例中，肿瘤细胞选自皮肤癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细 胞、脑癌细胞、乳房癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、肝癌细胞、胰癌细胞、 结肠癌细胞、胃癌细胞和白血病细胞。在本发明的另一个实例中，肿瘤细胞是人 肿瘤细胞。在本发明的还有一个实例中，人肿瘤细胞位于人患者体内。

在本发明的另一个方面，全身给予白屈菜红碱。在本发明一个具体方面，将 白屈菜红碱局部给予含有肿瘤细胞的肿瘤块。在本发明的还有一个方面，将白屈 菜红碱直接给予含肿瘤细胞的肿瘤块。在本发明一个具体方面，将白屈菜红碱给 予含肿瘤细胞的切除肿瘤后的瘤床。

在本发明的另一个实例中，将电离辐射给予整个患者。在本发明的另一个实 例中，将电离辐射局部给予含肿瘤细胞的肿瘤块。

本发明还提供了一种诱导肿瘤细胞凋亡的方法，该方法包括使肿瘤细胞接触 白屈菜红碱，并使肿瘤细胞接触电离辐射，其中白屈菜红碱的剂量与电离辐射剂 量结合时能有效地诱导肿瘤细胞凋亡。

本发明还提供了一种杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括使肿瘤细胞接触白屈 菜红碱，并使肿瘤细胞接触电离辐射，其中白屈菜红碱的剂量与电离辐射剂量结 合时能有效地杀死肿瘤细胞。

本发明还提供了一种治疗人患者体内癌症的方法，该方法包括给予人患者白 屈菜红碱，并给予人患者电离辐射，其中白屈菜红碱的剂量与电离辐射剂量结合 时能有效地治疗癌症。

在本发明的一个实例中，癌症选自皮肤癌、前列腺癌、肺癌、脑癌、乳房癌、 卵巢癌、宫颈癌、肝癌、胰癌、结肠癌、胃癌和白血病。

本发明还提供了一种强化电离辐射对肿瘤细胞作用的方法，该方法包括使肿 瘤细胞接触白屈菜红碱，然后使肿瘤细胞接触电离辐射。

如本文所定义的，癌症、肿瘤、肿瘤细胞、癌细胞、从肿瘤或癌组织获得的 组织的治疗指比未治疗状态的改进，其包括(但不局限于)癌、肿瘤、组织或细胞 的稳定、缓解、退化、收缩或体积减小。

                          附图简述

下列附图组成了本说明书的一部分，它们被包括在内以便进一步证实本发明 的某些方面。通过参照一张或多张这些附图，结合本文所述具体实例的详细描 述，就能更好地了解本发明。

图1。白屈菜红碱的化学结构。

图2。白屈菜红碱氯化物通过分裂性死亡作用增强IR介导的杀细胞作用。 在接触浓度增加的白屈菜红碱和电离辐射后，测定促克隆形成的存活。以约 500-2000细胞/平板的细胞数目接种细胞，在辐射前用0μM、0.5μM、或1.0μM 白屈菜红碱氯化物处理30分钟。2周后，如果集落由50个细胞以上组成，给菌 落的存活评分。结果代表三组单独试验的平均值，每组试验测定两次或三次。误 差条表示为平均值+/-标准误差(SEM)。

图3A-3E。用碘化丙锭对经白屈菜红碱处理的SQ20-B细胞染色，结果证明 zVAD-fmk抑制了编程性细胞死亡。M1定义为凋亡细胞的百分数，其通过(a)摄 取1个log或更多荧光的碘化丙锭和(b)细胞大小减少50％或更多来确定。FL3- 高度表示细胞摄取的碘化丙锭。在图3A中，M1＝5％；图3B，M1＝22％；图 3C，M1＝73％；图3D，M1＝16％；图3E，M1＝24％。

图4。辐射和白屈菜红碱体外处理72小时后SQ20B的活力。

图5A。白屈菜红碱和电离辐射共同处理后，中性和酸性鞘磷脂酶活性得到 增强。用测定鞘磷脂酶活性的混合分子团试验(mixed micellar assay)来定量测定增 加的酶活性。单用辐射时未显示鞘磷脂酶活性比对照有所增加。用白屈菜红碱处 理细胞使得中性和酸性鞘磷脂酶的活性分别比对照增加大约212％和179％。x 射线和白屈菜红碱组合处理细胞使中性和酸性鞘磷脂酶活性分别比对照平均增 加了大约200％和170％。

图5B。SQ20B模型中，在辐射后5分钟用鞘磷脂酶试验测定了辐射(20Gy)、 肿瘤坏死因子(TNFα)以及辐射(20Gy)和TNFα(5ng)组合对中性和酸性鞘磷脂酶活 化的作用。

图5C。在受辐射的培养物中加入神经酰胺减少了促克隆形成的存活。实心 圆表示单用辐射；实心方块表示在x射线前30分钟加入20μM C2-神经酰胺。

图6。用SQ-20B异种移植系统评价30天内组合治疗方式的治疗效果。每组 中治疗340只动物(n＝40)，测定所有动物的肿瘤生长平均百分数。用测径仪测定 肿瘤生长。非致死剂量的白屈菜红碱(药物)和50Gy IR(每次5Gy，2周内)的组合 减小了肿瘤体积，并比二者单独治疗时增强了杀细胞作用(p＜0.001 Mann- Whitney Rank Sum试验)。

图7A。PKC的抑制通过激活中性鞘磷脂酶增加了神经酰胺的产生，并减少 鞘磷脂水平。用DAG激酶试验定量测定WEHI-231 JM细胞的神经酰胺的产生， 用总脂质抽提物测定鞘磷脂质量。加入10μM白屈菜红碱后，在合适的时间点(如 本文所述)裂解细胞。每个时间点表示神经酰胺或鞘磷脂产生距基线变化的平均百 分数，它得自所有时间点的至少8个独立的研究结果，除了用*标记的(n＝4)以外， 标准误差用误差条表示。经碘化丙锭排斥和FACS测试，在2小时时间点没有检 测到活力或细胞大小有所改变。

图7B。钙感光蛋白C诱导了神经酰胺产生，并降低鞘磷脂水平。神经酰胺 的产生和鞘磷脂质量的定量测定与白屈菜红碱的相同。在加入250nM钙感光蛋白 C2小时后裂解细胞。神经酰胺和鞘磷脂产生距基线变化的平均百分数得自至少 三个独立的研究结果。标准误差用误差条表示。

图7C。中性和酸性鞘磷脂酶活性标准化成对照百分数的图。在测定中性或 酸性鞘磷脂活性前，用白屈菜红碱处理细胞(2×107)30分钟。误差条表示为4次独 立试验+/-SEM，每次试验重复测定两次。

图8A-8C。外源性神经酰胺和PKC抑制诱导WEHI-231细胞的氧化改变。 WEHI-231细胞(1×106)经抗IgM抗体处理2小时(图8A)、30μM外源性神经酰胺 处理15分钟(图8B)、或用10μM白屈菜红碱处理15分钟(图8C)。然后用二氯二 氢荧光素(DCHF-DA)测定细胞内的反应氧，并用FACS分析法定量测定。荧光素 的直方图分析绘成LOG函数。灰色区域表示对照细胞，阴影线区域表示处理过 的细胞。

图9A。经辐照(8Gy)的WEHI-231 JM(◇)和OE()细胞中神经酰胺产生的时间 过程。数据(平均值+/-SD)表示与未辐射对照相比的至少4次独立试验的数据，其 中*p＜0.002。

图9B。中性和酸性鞘磷脂酶体外活性标准化成对照百分数的图。数据(平均 值+/-SEM)得自4次独立试验，与未辐射对照相比，每次试验测定两次或多次， 其中WEHI-231 JM细胞中中性鞘磷脂酶活性的p＜0.04(斯图登特分布试验 (Student′s t-测试))。

图10A。与对神经酰胺诱导的凋亡仍保持敏感的JM细胞相比，WEHI-231 OE细胞对凋亡有相当抵抗力。在指定时间点用10Gy处理24小时后，对WEHI- 231 JM和OE细胞作末端转移酶和FACS分析。在FACScan(Becton-Dickson)上用 流式细胞计数法(FACS)分析细胞，采用Lysis II软件，FL2和FSH补偿分别定为 50％和25％。横坐标：细胞数；纵坐标：DNA片段化荧光值的对数。根据阳性 对照F15-12细胞，评价记分R2含有的凋亡细胞，其用平滑的轮廓线表示。图中 显示了R2框中凋亡细胞的估计百分数，这根据最初细胞计数数据。

图10B。在8Gy辐照后WEHI-231 OE细胞继续增殖。辐照4-5×105指数型 生长的JM或OE细胞，并间隔6-72小时后将细胞返回恒温箱。在指定的时间点， 用血细胞计数器计数排斥台盼蓝的细胞并评为活细胞。数据(至少两次试验(每次 测定两次)的平均值+/-SD)表示成根据最初细胞数计的存活细胞百分数。

图11A。外源性神经酰胺可使WEHI-231 OE细胞对辐射介导的凋亡作用敏 感。在用8Gy处理前30分钟，将C2神经酰胺(Cer)加入3×105WEHI-231 OE细 胞中。用碘化丙锭染色和FACS分析定量测定凋亡。凋亡细胞百分数显示在辐射 后24小时内的R2框中。

图11B。WEHI-231 JM和OE细胞对鞘氨醇激酶和外源性神经酰胺的抑制 同等敏感。细胞用浓度增加的C2-神经酰胺或DL-苏(糖)二氢鞘氨醇(一种鞘氨醇 激酶的强效抑制剂)处理。处理24小时后用PI染色和FACS分析测定活力。图线 显示了3次试验(每次测定2次)的平均值。

图12。照射30分钟后接触浓度增加的白屈菜红碱的有抗性的WEHI-231 OE(IM)MG(MG)以及转染了bcl-X(bcl-x)细胞的WEHI-231细胞的活力。

                        说明性实例描述

本发明证明了白屈菜红碱氯化物在IR后降低了肿瘤细胞(尤其是抗辐射性肿 瘤细胞)的凋亡临界值。白屈菜红碱和IR组合诱导凋亡之前是激活中性和酸性鞘 磷脂酶。令人惊奇的是，白屈菜红碱和IR二种处理的组合所诱导的凋亡发生在 比根据常规技术和治疗所预计的剂量低得多的情况下。

用IR和白屈菜红碱组合处理肿瘤细胞增大了凋亡作用，并取决于蛋白酶类 (caspases)的激活。这些数据与最近的报道是一致的，该报道证实IR和神经酰胺 通过激活CPP32和其它蛋白酶类来诱导凋亡(Kufe，1996)。白屈菜红碱氯化物通 过寻靶细胞死亡通道中凋亡所需的常见组分而增强了电离辐射诱导的凋亡，并克 服了细胞体外和体内对辐射诱导凋亡作用的抵抗力。

IR后在低浓度白屈菜红碱下观察到的与分裂或有丝分裂相联的死亡导致体 内肿瘤体积减小。在联合辐照和白屈菜红碱治疗后有丝分裂死亡的增加代表了非 凋亡性的、因而非重叠的杀肿瘤细胞机制。本发明证实，肿瘤细胞的破坏与周围 正常组织相比有所增加，并表明白屈菜红碱与IR联合是一种临床上有用的工具， 可增强电离辐射对有抵抗力肿瘤细胞群的致死作用。

A.低剂量的白屈菜红碱和辐照的联合应用

肿瘤细胞对DNA破坏试剂的抵御是临床肿瘤学中主要的问题。目前癌研究 的一个目的是寻找改进化疗和放疗效率的方法。在本发明的内容中，考虑可用 PKC抑制剂(较佳的是白屈菜红碱或白屈菜红碱氯化物)化疗和辐射治疗联合来进 行治疗性干预。本发明的一个令人惊奇的出乎意料的结果是，白屈菜红碱和辐射 联合允许用更低剂量的各组分来实现肿瘤生长的减少，其减少程度高于根据目前 常规辐射和化疗所预计的。因此，利用本发明，在治疗时必须接触辐照的健康细 胞因辐射引起的毒性和其它副作用就可减少。

这里，应理解，用白屈菜红碱治疗最好是用白屈菜红碱氯化物治疗。

为了用本发明的方法和组合物来抑制或甚至杀死细胞(如恶性或转移性细 胞)，通常要使“目标”细胞与PKC抑制剂(如白屈菜红碱)和低剂量的电离辐射 接触。这些组分应以能有效抑制细胞增殖、或恢复凋亡功能或甚至杀死细胞的组 合用量来提供。该方法可能包括使细胞同时接触白屈菜红碱和辐射，或先接触白 屈菜红碱然后接触辐射，或先接触辐射然后接触白屈菜红碱。细胞可以接触白屈 菜红碱单一组分或其药物制剂，或接触两种或多种不同的白屈菜红碱组分或制 剂。

辐射源包括诱导DNA损伤的波，例如γ射线、x射线、UV辐射、微波、电 子发射等。在按照本发明方法治疗癌症时，可通过用破坏DNA的辐射(如x射线、 紫外光、γ射线或甚至是微波)照射局部肿瘤部位来使肿瘤细胞接触辐射。

预想向癌症患者局部输送白屈菜红碱将是一种非常有效的输送治疗有效量 化合物来抵御临床疾病的方法。同样，放疗将针对对象身体的特定受影响区域。 另外，在某些情况下(例如当发生广泛转移时)，宜全身输送白屈菜红碱、给予辐 射或两者。

B.白屈菜红碱，一种苯并菲啶生物碱

苯并菲啶生物碱白屈菜红碱(1，2-二甲氧基-12-甲基[1，3]苯并二氧杂[5，6-c]菲 啶鎓；C21H18NO4)也称为勒钩碱(toddaline)，它可从白屈菜(Chelidonium majus L.)， 野花椒(Zanthoxylum simulans)，Sanguinaria candensis(即血根)，博落回(Macleaya cordata).Carydali sevctocozii，Carydali ledebouni，白屈菜(Chelidonium majusm)和 罂粟科(Papaveracaceae)其它成员中作为纯的形式或作为和其它苯并菲啶生物碱 的混合物提取出来。野花椒中的主要生物碱是白屈菜红碱以及少量二氢和氧-白屈 菜红碱、N-乙酰胺(anomine)，茵芋碱，崖椒碱，谷淄醇和芝麻素。Gray等人于 1980年描述了从野花椒中提取和鉴定白屈菜红碱和其它组分。

可以和白屈菜红碱一起存在于植物中的其它苯并-c-菲啶生物碱包括血根 碱、血根红碱、血根黄碱、高白屈菜碱、白屈菜红碱和前鸦片碱。纯的白屈菜红 碱还可从一些化学供应商获得(尽管很少)。半纯化形式的苯并-c-菲啶生物碱是商 业上可获得的，这些通常指血根碱硝酸盐、血根碱硫酸盐。这些盐是植物血根 (Sanguinaria)的混合生物碱的盐，主要包含血根碱、白屈菜红碱和前鸦片碱。

尽管在文献中可能几乎找不到关于任何一种纯的苯并-c-菲啶生物碱使用的 参考文献，但是含有这些化合物的植物用于各种失调的医学目的已有一段时间。 例如，美国专利209,331公开了用等份的血根、氯化锌和煤油来治疗外溃疡。美 国专利433,257描述血根粉末、亚美尼亚树干(armenian bole)、松香粉末、猪油和 松焦油的油膏剂来治疗痔，美国专利2,344,830公开了用氯化锌、辉锑矿和血根 的混合物来固定和显示外科切除的患病组织。一些专利描述了用血根提取物作为 抗微生物剂，它们是美国专利4,145,412；美国专利4,406,881；和美国专利 4,376,115。白屈菜红碱还被用来治疗牙周病(美国专利5,324,520)和治疗血栓形成 (美国专利5,137,912)。苯并-c-菲啶生物碱还表现出具有某种抗真菌和抗原虫的性 能，缓解了急性病后拖延的轻度贫血和与类风湿性关节炎相关的轻度贫血。

在中国，人们用野花椒的浆果作为猪肉的调料。该提取物在中国长期广泛的 使用表明该提取物对于人食用是安全的。提取物没有任何显著的副作用，并不刺 激肠胃道。而且，已经发现在同时给予该提取物有助于缓解因使用抗炎剂而可能 发生的肠胃道刺激。

白屈菜红碱以浓度依赖方式特异性抑制蛋白激酶C(PKC)，并强烈抑制由强 凝集诱导物(如花生油烯酸和胶原)诱导的血小板凝集。其化学结构显示在图1 中。

PKC的抑制剂可与底物结合位点(ATP或蛋白)或产生激活的调节结构域(二 酰基甘油或佛波酯结合位点)相互作用。白屈菜红碱直接与PKC的催化结构域相 互作用。它是已鉴定的PKC最强效抑制剂之一，并且不抑制其它任何研究过的蛋 白激酶。白屈菜红碱通过抑制细胞生长和分化表现出对L-1210肿瘤细胞有强效 的细胞毒性作用，IC50值为0.053μM(Herbert等人，1990)。

白屈菜红碱表现出双相浓度反应关系，因而，随着所用药物水平的增加超过 最大有效浓度，DNA片段化减退并最终消退(Jarvis等人，1994)。然后，DNA损 伤的减少并不伴随细胞活力的恢复，这表明其它致死行为的进行未受损害。

在Herbert等人于1990描述的条件下，白屈菜红碱在大鼠中的IC50值(引起 50％抑制的浓度)为0.66μM。酶的基础活性(在没有Ca++、磷脂酰丝氨酸和二油 酸甘油酯存在下的活性)未受影响。在本发明中，小鼠的LD50(引起50％死亡的剂 量)为20毫克/千克(腹膜内给药IP)。

白屈菜红碱的有效剂量很大程度上取决于所用的给药途径和受治疗动物的 大小和种类。通常，对于任何给定的个体，口服输送剂量可高于注射剂量。在本 发明中，有效剂量是能在受治疗细胞中诱导凋亡的剂量。特别需要治疗的细胞包 括肿瘤和癌细胞，尤其是抗放射的肿瘤或癌细胞。典型的有效剂量范围在小鼠内 约为0.5-10毫克/千克(IP)，更佳的在小鼠内为1-4毫克/千克(IP)。

C.电离辐射

电离辐射引起DNA损伤和杀细胞作用通常与剂量率成比例。已经假定电离 辐射能诱导多种生物效应：直接与DNA相互作用或通过形成自由基导致DNA损 伤(Hall，1988)。这些效应包括基因突变、恶性转化和细胞杀伤。尽管已经证实电 离辐射在一些原核细胞和低等真核细胞中能诱导某些DNA修复基因的表达，但 是关于电离辐射对哺乳动物基因表达的调节作用却知之甚少(Borek，1985)。几个 研究描述了在辐照哺乳动物细胞后发现蛋白质合成方式有所改变。例如，人恶性 黑色素瘤细胞的电离辐射治疗伴随诱导出几种未鉴定的蛋白质(Boothman等人， 1989)。电离辐射在大鼠REF52细胞中抑制了细胞周期蛋白和共调节多肽的合成， 但在肿瘤基因转化的REF52细胞系中却不(Lambert和Borek，1988)。其它研究业 已证实，某些生长因子或细胞因子可能参与了x射线诱导的DNA损伤。在这方 面，辐射后从内皮细胞中释放出血小板衍生的生长因子(Witte等人，1989)。

在本发明中，术语“电离辐射”指包含粒子或光子的辐射，其具有足够的能 量或能通过细胞核相互作用产生电离来产生足够的能量(获得或丧失电子)。一种 典型的较佳的电离辐射是x辐射。将x辐射输送至目标组织或细胞的方式是本领 域中熟知的。另外，术语“诱导有效表达的电离辐射剂量”指刺激或启动“辐射 反应性增强子-启动子”(这是本发明的一个实例)所需的电离辐射剂量。

1.辐射反应性增强子-启动子

辐射反应性增强子-启动子(如美国专利5,571,797中所述，纳入本文作参考) 是一种转录控制功能受电离辐射影响的启动子。增强子-启动子区域用作选择性影 响该序列编码多肽的表达的开关。不同的目标细胞或组织中特异性多肽表达的调 节为治疗性破坏、改变或灭活该细胞或组织提供了机会。

启动子是DNA分子的一个区域，其通常在转录开始的位点(即转录起始位点) 前(上游)约100个核苷酸对内。该区域通常含有几种DNA序列元件，在不同的基 因中这些元件均位于相对相似的位置上。本文所用的术语“启动子”包括本领域 中所指的上游启动子区、启动子区或广义真核RNA聚合酶II转录单位的启动子。 典型且较佳的启动子是TATA盒，CAAT盒和富含GC序列的元件。

另一类不连续的转录调节序列元件是增强子。增强子提供了时空特异性和对 特定编码区(如基因)的表达水平特异性。增强子的主要功能是在含有一种或多种 结合该增强子的转录因子的细胞中，提高编码区的转录水平。与启动子不同，只 要启动子存在，增强子可在距离转录起始位点不同距离外起作用。

本文所用的短语“增强子-启动子”指含有增强子和启动子元件的组合单元。 本文所用的术语“辐射反应性增强子-启动子”指转录控制功能受电离辐射影响的 增强子-启动子。通常，在暴露于有效剂量的电离辐射下时，本发明的辐射反应性 增强子-启动子刺激或提高了受该增强子-启动子控制的编码区的转录速度。用于 本发明DNA分子的典型且较佳的增强子-启动子是Egr-1启动子(肿瘤坏死因子 α(TNF-α)基因的启动子)的CArG结构域或c-Jun启动子。

辐射反应性增强子-启动子与编码至少一种多肽的编码区操作性相连。本文 所用的短语“操作性相连”指增强子-启动子与编码区连接的方式使得该编码区的 转录受该增强子-启动子控制和调节。使增强子-启动子与编码区操作性相连的方 式是本领域中所熟知的。相对于转录受控制的编码区的精确取向和位置取决于增 强子-启动子的特异性质，这也是本领域中熟知的。因此，TATA盒最小启动子 通常位于转录起始位点上游约25-30个碱基对处，上游启动子元件通常位于转录 起始位点上游约100-200个碱基对处。相反，增强子可以位于转录起始位点的下 游并且可以距离该位点相当长的距离。

2.电离辐射的剂量和输送

给定细胞所需的电离辐射量通常取决于该细胞的性质。通常，诱导有效表达 的剂量低于引起细胞破坏或直接死亡的电离辐射剂量。测定辐射有效量的方法是 本领域中熟知的。给定细胞所需的电离辐射量当然取决于该细胞的性质。本文所 用的术语电离辐射的“有效剂量”指当与病毒结合给予时使细胞破坏或死亡增加 的电离辐射剂量。

在某些实例中，有效表达诱导量约为1至30格雷(Gy)，以每分钟约0.5-4Gy 的速度给予。更佳的是，电离辐射的有效表达诱导量约为1-80Gy(总剂量)。在其 它实例中，采用约1-9Gy的单剂剂量。电离辐射的有效剂量约为4.5-100Gy，总 共约为70Gy(单剂或更佳的是等份多剂)是较佳的。这些剂量范围比常规辐射治疗 中所用剂量要低得多，因此减小了更高剂量辐射伴随的有害副作用。

在本发明中，除了外部方式外，还可用任何合适的方式来向组织输送辐射。 例如，可以这样来输送辐射，首先提供与肿瘤抗原起免疫反应的放射性标记的抗 体，然后将有效量的放射性标记抗体输送给肿瘤。另外，可用放射性同位素来向 组织或细胞输送电离辐射。

本发明可治疗的肿瘤包括，但不局限于，脑(成胶质细胞瘤、成神经管细胞 瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤)、肺、肝、脾、淋巴结、小肠、胰、 血细胞、结肠、胃、乳房、子宫内膜、前列腺、睾丸、卵巢、皮肤、头和颈、食 管、骨髓、血液或其它组织的肿瘤。肿瘤可区分为转移性和非转移性。各种实例 包括皮肤、肌肉、面部、脑、前列腺、乳房、子宫内膜、肺、头和颈、胰、小肠、 血细胞、肝、睾丸、卵巢、结肠、皮肤、胃、食管、脾、淋巴结、骨髓或肾的肿 瘤细胞。其它实例包括体液样品如外周血液、淋巴液、腹水、血清体液、胸膜腔 积液、痰、脑脊液、泪囊液、粪便或尿液。

D.治疗方案

白屈菜红碱的治疗可在辐射之前或之后进行，间隔可从数秒到数周。在白屈 菜红碱和辐射分开给予细胞的实例中，通常要保证各次输送之间有作用的时期不 要过期，从而使两者联合仍能对细胞发挥组合的有利效果。在这种情况下，考虑 使两种试剂在相互间隔0.1-24小时内接触细胞，更佳的在大约1-4小时内，延迟 时间为大约1-2小时是最佳的。然而，在一些情况下，希望显著延长治疗时间， 其中在分别给药之间的时间长短为几天(2，3，4，5，6或7天)至几周(1，2，3，4，5，6，7或 8)。

还会想到的是，会希望多次给予白屈菜红碱或辐射。可采用各种组合，其中 白屈菜红碱是“A”，辐射是“B”：

 A/B/B          B/A/A          A/A/B

 A/B/A          B/A/B          B/B/A

B/B/B/A        B/B/A/B        B/A/B/A        B/A/A/B

A/A/B/B        A/B/A/B        A/B/B/A        B/B/A/A

A/A/A/B        B/A/A/A        A/B/A/A

B/A/B/B        A/A/B/A        A/B/B/B

为了杀死细胞，将两种试剂以有效杀死细胞的组合量输送给细胞。

x射线的剂量范围为每日50-200cGy(用于长期使用(6至8周))至2000- 6000cGy的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，这取决于同位素的半衰 期、发射的强度和辐射的类型，以及肿瘤细胞的吸收。

E.治疗途径

白屈菜红碱可经静脉内、动脉内、肿瘤内、肠胃外或腹膜内给予。在本发明 中，较佳的给药途径是直接肿瘤内、注射到切除后的肿瘤床、静脉内(IV)、动脉 内、和腹膜内(IP)给药、作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物溶液可用 水来制备，适当与表面活性剂(如羟丙基纤维素)混合。分散液还可用甘油、液态 聚乙二醇及其混合液和用油制备。在常规保藏和使用条件下，这些制备物含有防 腐剂以防止微生物生长。

适用于注射用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌 可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，药物形式都必须是无菌的，并 且是易注射的液体。它必须在制造和保藏条件下稳定，并且必须进行防腐以抵抗 微生物(如细菌和真菌)的污染。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、 丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散液。例如，用 一种包膜(如卵磷脂)维持颗粒的所需大小(在分散液情况下)和用表面活性剂可以 维持适当的流动性。可用各种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如，对 羟基苯甲酸(parabens)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，最好 应包括等渗剂，例如糖或氯化钠。利用组合物中延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝 和明胶)，可延长可注射组合物的吸收。

无菌可注射溶液这样制得，将所需量的活性化合物以及上述列举的其它各种 组分按需加入合适的溶剂中，然后过滤除菌。通常，分散液这样制得，将各种灭 菌活性组分加入无菌运载体中，该运载体中含有基础分散介质和上文列举的其它 所需组分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，较佳的制备方法是真空 干燥和冷冻干燥技术，这些技术可从已无菌过滤的溶液产生活性成分粉末及其它 所需成分的粉末。

本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括任何溶剂、分散介质、包裹剂、 抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用这些介质和试剂制备药物活性物 质是本领域中熟知的。除非常规介质或试剂与活性成分不相容外，可用于治疗性 组合物。组合物中还可掺入辅助性活性成分。

白屈菜红碱还可口服给药，例如和惰性稀释剂或可摄取的可食载体一起，或 包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或压成片剂，或直接掺入饮食食物中。对于口服 治疗给药，活性化合物可以和赋形剂一起加入，并以可消化片剂、颊片剂、锭剂、 胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆、干胶剂等形式使用。这些组合物和制备物应含有 至少0.1％的活性化合物。当然，组合物和制备物的百分数可以变化，并可以是合 适的大约2-60％单位重量。在这些治疗上有用的组合物中的活性化合物量是获得 合适剂量的量。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可含有下列物质：粘合剂，如黄蓍树胶、阿 拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；分解剂，如玉米淀粉，土豆淀 粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；增甜剂，如蔗糖、乳糖或糖精可以加入， 或调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃口味。当剂量单位形式是胶囊时，它可含有除 上述类型材料外的液态载体。可能有其它各种材料存在作为包被或修饰剂量单位 的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可用紫胶片、糖或两者包被。酏剂糖浆 可含有活性化合物蔗糖作为增甜剂，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为 防腐剂，染料和调味剂如樱桃或橘子口味。当然，用于制备任何剂量单位形式的 材料应当是药学纯的，并且采用的量基本上没有毒性。此外，活性化合物可掺入 缓释制备物和制剂中。

F.治疗效果的筛选和监测

在本发明内容中考虑到从个体取出肿瘤细胞、正常细胞或两者，以便监测治 疗的进展或作为治疗的一部分。预计可以这样来监测治疗效果：取出这些细胞， 用DAPI染色处理这些细胞，以确定染色质皱缩的程度，测定凋亡程度，测定中 性鞘磷脂酶产生的水平，或用下述其它方法。

测定凋亡诱导作用的一种特定方法是末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP-生 物素切口末端标记(TUNEL)试验，它测定了DNA的完整性(Gorczyca，1993)。该 试验通过末端转移酶监测标记UTP掺入断开的DNA链中来测定DNA的片段化。 此种掺入可用验电法或细胞分拣方法学(例如FACS)来监测。

G.活体外输送

在本发明中，预想可采用白屈菜红碱和辐射任一或两者的全身性输送。还考 虑到在实施所要求的本发明中，希望用同一患者的健康细胞代替受影响的细胞。 活体外基因治疗指从动物或患者中分离出细胞，将核酸体外输送入细胞，然后将 修饰过的细胞返还动物或个体。这可能涉及外科切取动物或患者的组织/器官、或 细胞和组织的初级培养物。

特别是，将自身骨髓细胞(BMC)移植用作挽救程序，其中在强化辐射或化疗 前取出血液或骨髓并保藏。在制备人单个核细胞(MNC)时，将等份骨髓置于容器 (如离心管)中。起初，MNC可能从骨髓来源(例如胫骨、股骨、脊骨、肋骨、髋 骨和肱骨、桡骨、尺骨、胫骨和腓骨)获得。另外，这些细胞还可从脐带血、外周 血或细胞因子代谢活动的外周血获得。人造血干细胞的其它来源包括胚胎卵黄、 胎儿肝、胎儿和成人脾和血液。离心骨髓层，产生红细胞沉淀(在试管底部)、一 层透明的介质、含有MNC的界面层和顶部的血浆介质层。然后用(例如)抽吸法取 出界面。对该层1000g离心，最终产生MNC沉淀。然后将该沉淀重悬于合适的 缓冲液中用FACS进行细胞分拣。体外克隆分离的MNC，以扩展免疫活性细胞。 然后向患者提供扩展的有治疗活性的细胞，以获得治疗效果。

本文包括下列实施例以描述本发明的较佳实例。本领域技术人员应当理解， 下列实施例中公开的技术代表了本发明人发现在实施本发明时起效果良好的技 术，因此它们被认为是组成了本发明实施的较佳方式。然而，本领域技术人员在 参看了本文后会理解，在不脱离本发明的精神和范围下，仍可对本文公开的具体 实例作多种变化并仍能获得相同或相似的结果。

材料和方法

药物和试剂：

白屈菜红碱[IC50(PKC)＝0.66μM，IC50(PKA)＝170μM]和钙感光蛋白C[IC50 (PKC)＝0.50nM，IC50(PKA)＝50μM]表现出对PKC酶家族有很高的特异性 (Sigma)。与相对没有选择性的但仍广泛使用的试剂星形孢菌素和H7相反，这些 抑制剂阻抑PKC活性的特异性至少高30倍。在本发明研究所用浓度下，它们看 来并不抑制其它激酶(如细胞周期-AMP激酶(PKA))(Kobayashi等人，1989b； Herbert等人，1990)。7-氨基-放线菌素D、ATP、磷酸盐缓冲液(PBS)、鞘氨醇 -1-磷酸、DL-苏(糖)-二氢鞘氨醇和碘化丙锭购自Sigma Chemical Corp.，St.Louis， MO.。C2-神经酰胺和正-油酰乙醇胺购自Matreya Chemicals，PA。末端转移酶试 验用试剂购自Boehringer-Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN。薄层层析板 购自Whatman(10厘米×10厘米LHP-K TLC板)。放射自显影胶片购自Dupont。 [3H]棕榈酸(60Ci/毫摩尔)、[14C]鞘磷脂(60Ci/毫摩尔)和[γ-32P]ATP购自DuPont NEN。所有溶剂为HPLC级。白屈菜红碱溶于无菌水中用于体外试验或溶于PBS 中用于肿瘤内注射。

细胞培养。

按照Chmura等人1996a；1996b中描述的标准步骤，使SQ20B人头颈鳞状细 胞癌细胞系在5％CO2下生长于DMEM中，添加有25％F5-12、20％胎牛血 清(Gibco/BRL，Grand Island，NY)和1％青霉素-链霉素，只是进行下述修改。使 WEHI-231 JM在5％CO2下在RPMI 1640培养基、1％青霉素-链霉素、10％热 灭活胎牛血清(Gibco/BRL，Grand Island，NY)和5×10-5M β巯基乙醇(Sigma)中长至 密度为3-6×105细胞/毫升。

用碘化丙锭排斥进行活力试验

所有试验按照前述标准步骤(Chmura等人，1996a；1996b)进行，将细胞(2.5- 3.5×105)培养在24孔组织培养板中。用不同浓度的白屈菜红碱处理细胞，37℃ 培育30分钟，然后进行辐照。所有样品的辐照用钴60辐射仪(Gammacell 220， Atomic Energy of Canada)以2.0Gy/秒的剂量速度输送。在指定时间点后，收获细 胞，用PBS洗一次，重悬于含有50毫升100毫克/毫升碘化丙锭的PBS中。活 细胞不摄取碘化丙锭，但死细胞摄取。正经历凋亡的细胞在体积上收缩。按照前 述标准步骤(Chmura等人，1996a；1996b)，在FACScan(Becton-Dickson)上用Lysis II软件通过流式细胞计数术(FACS)分析细胞。

DAPI染色使细胞核显色

1000rpm离心细胞(5×105)，重悬于约100μl细胞培养液中。然后使细胞悬浮 液与100μl DAPI(4′，6-脒基(iamidino)-2-苯基吲哚，Sigma D9542，1μg/ml，用 PBS(PBS+1％ Triton X-100)配制)混合。将一滴该混合物置于有盖玻片的微小玻片 上。用荧光显微镜观察细胞，采用的是有100瓦水银灯、16或60倍萤石物镜、 N.A.0.75，(Leco#1-UB527)和紫外滤色六面体(ex 330-385nm，em 420nm，宽波段 通过，Leco#U-M536)的Olympus BX-40显微镜。用Optronics冷却的低光视频相 机(Leco#DEI-470TB)对图象照相，该相机与2X耦合器相连(Leco#HR200-CMT) 图象以72dpi保存成数字文件。

DNA序列梯试验：

如前所述(Gottschalk等人，1993；1994)评价DNA降解。简言之，在100mm板 或24孔板中处理后，收集细胞并以0.5毫升裂解缓冲液裂解(0.6％ SDS+10mM EDTA，pH7.0)。加入氯化钠至最终浓度为1M，颠倒混合，4℃培育12小时，然 后14000g旋转30分钟。用氯仿处理样品(1∶1)，乙醇沉淀，然后在3％琼脂糖 凝胶上电泳，用溴化乙锭显色。

集落形成试验：

用0.05％胰蛋白酶+0.02％ EDTA使指数型生长的SQ20B培养经胰蛋白酶消 化。将细胞(100-50,000)置于100mm组织培养碟中。接种4小时后，加入白屈菜 红碱或C2神经酰胺，在加入白屈菜红碱和C2-神经酰胺后辐照30分钟。用GE Maxitron 250 x射线产生仪辐照细胞，该产生仪在250kV和26mA下操作，剂量 率为114cGy/分钟。12天后，固定细胞并按照标准步骤(Chmura等人，1996a；1996b) 用结晶紫染色。大于50个细胞的集落评为存活者。

DAG激酶反应定量分析神经酰胺和DAG：

用二酰基甘油激酶定量测定神经酰胺与Dressler和Kolesnick(1990)描述的类 似。在辐射后，在20μl 7.5％正-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、5mM心磷脂、1mM DETAPAC浴中超声破碎抽提和重悬脂质。加入70微升反应混合物至最终浓度为 0.05M咪唑/HClpH6.6，0.05M NaCl，12.5mM MgCl2，1mM EGTA和DAG激酶浓度 为0.7U/ml。在5mM ATP中加入10μl[γ-32P]ATP(1.0μCi/管)开始反应，并在室温 下培育30分钟，用450μl CHCl3∶CH3OH(1∶2)和20μl 1％ HClO4抽提脂质终止反 应。混合单相，10分钟后，加入150微升CHCl3和150微升1％ HClO4，振荡 试管，5000g离心5分钟。下层有机相用1％ HClO4洗两次，然后在Speed Vac Apparatus中干燥。在10厘米×10厘米LH P-K TLC平板(Whatman)上分辨磷酸化 产物神经酰胺-1-磷酸和磷脂酸(来自DAG)。通过液闪计数，将数据计算成每106 个细胞的神经酰胺皮摩尔数。在实施例6中，数据(平均值+/-SD)表示与未辐射对 照相比，至少4组独立试验，其中*p＜002。

[3H]棕榈酸标记脂质的标记、抽提和分析：

预先用[3H]棕榈酸盐(10μCi/ml)标记细胞24小时，使细胞在15毫升玻璃管中 同位素平衡，以最大程度地减少由于处理和改变介质引起的细胞神经酰胺和鞘磷 脂的变化(Borchardt等人，1994)。在用白屈菜红碱处理细胞后，用改进的Folch方 法抽提总脂质。简言之，用1毫升MeOH∶2N HCl(100∶6，v/v)重悬细胞沉淀。在每 个管中加入氯仿(2毫升)和水(0.6毫升)，振荡3次，1000g离心20分钟，产生双 层。从每个管中取出等量有机相，干燥并用30μl氯仿∶甲醇(95∶5)重建。将等份(10μl) 划线在10厘米×10厘米LHP-K TLC平板(Whatman)上，此平板已先用 CHCl3∶CH3OH∶H2O(60∶40∶10，v/v)清洗溶剂处理过。将鞘脂溶解在 CHCl3∶MeOH∶CH3COOH∶H2O(32.5∶12.5∶4.4∶2.25，v/v)中，用碘染色，用 En3Hance(DuPont)喷洒并放射自显影。用Epson 1200c 30bit扫描仪和NIH图象软 件(公众主导程序，由NIH开发，可在国际互联网上经FTP从zippy.nimh.nih.gov 获得)对放射自显影进行定量测定。计数和密度分析提供了相似的结果。

中性和酸性鞘磷脂酶活性的测定：

如Wiegmann等人于1994年所述的那样，用[14]C标记的鞘磷脂进行混合分子 团鞘磷脂酶试验，只是如本文所述作小小的改动。处理指数型生长的细胞 (2×107)，收集并在200微升中性缓冲液(20mM Hepes，pH7.4；10mM MgCl2，2mM EDTA，5mM DTT，100mM Na3VO4，100mM NaMO4，10mM b-甘油磷酸，750μM ATP，1mM PMSF，亮抑酶肽，抑胃酶肽、2％ Triton X-100)或酸性缓冲液(pH＝5.5， 2％Triton X-100，1mM PMSF，亮抑酶肽，抑胃酶肽)中裂解。4℃培育5分钟后， 超声破碎匀化细胞，低速离心(800×g)除去细胞碎片。用BioRad蛋白测定系统 (BioRad)测定蛋白浓度。使蛋白(50μg)在缓冲液(总体积为1毫升)中37℃培育2 小时，该缓冲液含有20mM HEPES，1mM MgCl2和0.9μl[N-甲基-14C鞘磷脂]。在 该蛋白浓度下，反应成线性。然后用800毫升氯仿∶甲醇(2∶1 v/v)和250毫升水抽 提磷酸胆碱。用闪烁计数法测定放射活性的磷酸胆碱。酸性和中性鞘磷脂酶的数 据均表示成对照的百分数。在实施例6中，数据(平均值+/-SEM)从4次独立试验 获得，每次测定2次或多次，其中与未辐射对照相比，WEHI-231 JM细胞的中 性鞘磷脂酶活性的p＜0.04(斯图登特t检验)。

人肿瘤异种移植的生长：

将SQ-20B(1-5×106)肿瘤细胞注射到裸鼠(Fredrick Cancer Research Institute) 右后肢内。使异种移植生长2-3周至平均肿瘤体积为300平方毫米。第0天用测 径仪直径测量最初的肿瘤体积。在治疗中，每周用测径仪测量肿瘤体积两次，并 表示成最初肿瘤体积的百分数。用测量椭圆(d3/6)衍化得的公式(a×b×c/2)计算肿 瘤体积。肿瘤治愈指退化至体积小于最初大小的10％，因为在该体积下不可能 辨别残余的肿瘤和疤痕组织。在第0、3、7和10天，将2毫克/千克白屈菜红 碱注入异种移植物。将受辐射的小鼠固定在有机玻璃容器内，将其全身用铅遮 住，带有肿瘤的后肢14除外。用Maxitron产生仪(1.88Gy/分钟)辐照肿瘤(5Gy/天， 4天/周)，总剂量为50Gy。单用辐射、单用白屈菜红碱以及缓冲液或白屈菜红碱 与辐射联合来处理肿瘤。数据计算成最初(第0天)肿瘤体积的百分数，并分段绘 成体积±SEM。

SQ-20B异种移植的组织学：

给肿瘤注射一次或两次(第0天和第4天)白屈菜红碱、白屈菜红碱和 20Gy(5Gy/天)、或单用20Gy，在第7天切下肿瘤，固定在10％中性福尔马林缓 冲液中。然后在Tissue Tek II型组织加工仪中修剪和加工肿瘤。将组织包埋在石 蜡中，切片，用苏木精和伊红或100毫升DAPI(4′，6-脒基-2-苯基吲哚，Sigma D9542，1μg/ml，用PBS(PBS+1％ Triton X-100)配制)染色，然后用光学显微镜检 查凋亡和坏死。

细胞核的分离

沉淀WEHI-231 JM细胞(2×107)，重悬于抽提缓冲液(20mM Hepes pH7.4；10 mM MgCl2；2mM EDTA；5mM DTT；100mM Na3VO4；100mM NaMO4；10mM β-甘 油磷酸；750μM ATP；1mM PMSF，10μM亮抑酶肽，10μM抑胃酶肽；2％ Triton X)中。将细胞置于冰上培育5分钟，然后用Dounce匀浆器打击破碎15次。每次 研究前将新鲜制得的细胞核用RPMI洗两次，在微量离心机中2000RPM旋转， 重悬于含有RPMI和5×10-5M β巯基乙醇的介质中。所有样品的辐射采用钴60 辐射仪(Gammacell220，Atomic Energy of Canada)，剂量率为2.0Gy/秒。

OE变种的选择

用100μM和125μM的N-油酰乙醇胺(Matreya)(一种神经酰胺的强效抑制剂) 依次处理WEHI-231 JM细胞(1×107)两次(Coroneos等人，1995；Ambrosini等人， 1994)。使细胞在含正油酰乙醇胺的培养基中培育96小时。连续稀释分离的单个 抗性细胞，并在每次选择后进行扩展。每两周用125μM正油酰乙醇胺重选择细 胞一次。与亲代细胞系相比，当用75μM抑制剂处理时，所得细胞系(称为 WEHI-231 OE)对凋亡作用的抵抗力要高3倍，且细胞仍具有相似的生长动力学。

凋亡和细胞活力试验

如前所述进行TdT试验(Chmura，1996)。经辐射(10Gy)和血清饥饿的FL5-12 细胞产生了凋亡区域(称为R2)。在FACScan(Becton-Dickson)上用Lysis II软件作 流式细胞计数分析细胞，FL2和FSH补偿值分别设定为50％和25％。

为了检测DNA片段化，收集细胞并在0.5毫升裂解缓冲液(0.6％SDS+10mM EDTA，pH7.0)中裂解。加入氯化钠至1M，倒置混合，4℃下放置12小时，14000g 旋转30分钟。用氯仿和乙醇(1∶1)沉淀样品，在3％琼脂糖凝胶上跑电泳，用 溴化乙啶染色。

对于活力染色，用不同浓度的C2神经酰胺、辐射或这两者处理2.5-3.5×105 个细胞。在指定的时间点后，收获细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次，重悬于 含有50μl 100μg/ml碘化丙锭的PBS中，用流式细胞计数仪(FACS)分析。

                           实施例1

    白屈菜红碱氯化物强化了IR诱导的促克隆形成性存活的减少

SQ20-B(一种人喉癌细胞系)，与其它人细胞系相比，有抗放射性(D0＝2.3Gy-) (Nagasawa等人，1994；Brachman等人，1993)。SQ20-B中p53外显子5中的突变 导致缺乏细胞周期G1期停滞，且IR照射后p53蛋白没有增加(Brachman等人， 1993)。

在单用浓度增加的白屈菜红碱(0.5-1.5μM)、单用IR(1-9Gy)或白屈菜红碱和 IR联合处理细胞后，测定促克隆形成存活。指数型生长的SQ20-B细胞中加入白 屈菜红碱可以浓度依赖型方式减少促克隆形成存活(图2)。在500nM的浓度下， 白屈菜红碱使细胞存活减少至约为未处理的对照细胞的80％(约20％的细胞死 亡)。在3Gy辐射处理前30分钟用500nM白屈菜红碱联合处理使细胞存活减少至 约为未处理细胞的30％(约70％的细胞死亡)。随着白屈菜红碱在输送剂量范围 内(1-9Gy)的增加，细胞死亡增加，并导致促克隆形成存活减少和流产性集落形成 (图2)。在这些白屈菜红碱浓度和IR下，没有观察到细胞收缩和细胞核皱缩(凋亡 的特征)。这些数据证明，钠摩尔浓度的白屈菜红碱通过不依赖凋亡的机制增强了 IR介导的细胞死亡。

                        实施例2

             SQ20-B细胞缺少对IR的凋亡性反应

在SQ-20B细胞经20Gy IR照射后72小时，没有检测到染色质凝缩或细胞质 起泡，且细胞看来与未处理的对照相似。相反，在接触白屈菜红碱23小时后， 10μM白屈菜红碱诱导了染色质凝缩、细胞质起泡，和细胞核小体间 (internucleusomal)DNA片段化。这些资料证明，尽管SQ-20B保留了经历凋亡的 能力，但是单用IR却不足以引发凋亡反应。

为了确定白屈菜红碱诱导凋亡是否涉及激活蛋白酶类，采用了这些蛋白酶的 不可逆zVAD-fmk肽抑制剂。zVAD-fmk的加入阻断了白屈菜红碱诱导的凋亡。 这些发现表明白屈菜红碱通过激活CPP32或相关蛋白酶类来引发凋亡(图3A- 3E)。

                           实施例3

     在鞘磷脂酶激活后，白屈菜红碱增强了IR诱导的凋亡作用

如碘化丙锭排斥和FACS分析所测定的，用x射线(8Gy)和增加量的白屈菜红 碱处理SQ-20B细胞，在48小时时使细胞存活减少至对照细胞的25％(图4)。细 胞存活的减少表示在IR后第一次细胞分裂时可能已死于凋亡的最大细胞数。相 反，8Gy IR使促克隆形成存活减少90％。这些发现揭示IR诱导细胞死亡的主要 机制是分裂性(坏死性)的。2.5μM白屈菜红碱和8Gy的联合诱导了与凋亡相一致 的形态学变化，与单用10μM白屈菜红碱所观察到的那些变化相似，使细胞存活 减少85％。当白屈菜红碱浓度高于2.5μM时，IR和白屈菜红碱的组合效应显示 出高于累加的杀伤效应。这些结果表明，在用白屈菜红碱和IR联合处理细胞后 48小时内，细胞死亡显著增加是由于SQ20-B细胞对IR的凋亡临界值降低。

在用IR和白屈菜红碱(2.5μM)联合处理细胞后，蛋白酶抑制剂zVAD- fmk(20μM)抑制了凋亡，这与单用白屈菜红碱(10μM)观察到的相似。以前的研究 提示，非特异性的PKC抑制剂缩短了细胞周期的G2/M期，因此增强了电离辐射 的杀细胞作用(Thompson和Fields，1996)。在本发明中，用0.5-1μM白屈菜红碱 处理SQ20B细胞不能象辐射细胞中那样缩短G2/M期。然而，单独诱导凋亡的白 屈菜红碱浓度(5μM)也诱导了细胞停滞于细胞周期的G2/M期(Thompson和Fields， 1996)。这些结果证明，白屈菜红碱在浓度低于诱导蛋白酶类依赖型凋亡的临界值 下增加了分裂性死亡。

以前的工作提示，白屈菜红碱增强凋亡部分是通过激活鞘磷脂酶(Chmura等 人，1996b)。用混合分子团试验测定受辐射SQ20-B细胞中的中性和酸性鞘磷脂酶 活性。接触10Gy的SQ-20B细胞在处理30分钟内未能改变鞘磷脂酶活性(图5A)。 用5μM白屈菜红碱预处理SQ20B细胞30分钟，然后用10Gy照射。与其它细胞 系中的发现一样(Chmura等人，1996a；Chmura等人，1996b)，在IR照射后5分钟 内，中性和酸性鞘磷脂酶分别增加至约为未处理对照的200％(p＜0.03)和170％ (p＜0.005)(图5B)。在鞘磷脂酶活性增加后，产生神经酰胺，鞘磷脂的量同时减少。 很明显，在辐射前30分钟加入外源性神经酰胺增强了IR诱导的杀细胞作用(图 5C)。这些研究证明，白屈菜红碱和IR联合在凋亡出现前增加了鞘磷脂酶活性。

                         实施例4

     白屈菜红碱增强了x射线的体内凋亡作用和杀细胞作用

在IR之后白屈菜红碱氯化物的体内杀细胞作用的增加增强了对裸鼠中SQ- 20B异种移植物的杀肿瘤细胞作用。对最初平均体积在305-895立方毫米之间的 肿瘤，在处理期第0、3、7和10天四次注射2毫克/千克白屈菜红碱氯化物(LD50 25毫克/千克，IP)。辐射以5Gy/天的量输送，每周4天，总共50Gy。所有处理 组中的动物在整个研究中看来是健康的。如图6所示，4组分开试验的汇编数据 证明，单用白屈菜红碱氯化物(n＝43)或单用辐射(n＝28)最初抑制了肿瘤再生长(与 注射缓冲液的对照(n＝26)相比)。然而，处理30天后，单用辐射和单用白屈菜红 碱治疗组中肿瘤再生长分别达到原先体积的138％和174％。

第31天，在联合治疗组中，41只动物中有20只表现出肿瘤退化，不到原 先体积的10％。相反，辐射+缓冲液组的16只动物中仅有1只肿瘤退化不到原 先体积的10％，而单用白屈菜红碱治疗的43只动物中则仅有13只。因此白屈 菜红碱和IR的联合效果大于任一种单独处理的累加效果。肿瘤组织学分析揭示， 早在联合处理后第4天，肿瘤坏死增加的面积就超过了单用x射线(XRT)或单用 白屈菜红碱处理。肿瘤非坏死区域的代表性切片用DAPI染色，以检测凋亡的细 胞核变化。肿瘤切片取自2次单独注射白屈菜红碱、单独20Gy、1次注射白屈 菜红碱和20Gy、或用白屈菜红碱和20Gy处理2次后的第7天。经辐射单独处理 的非坏死性肿瘤区域的细胞核看起来变圆形，并含有光滑的异染色质表观。在这 些区域内几乎检测不到染色质边缘化和细胞核收缩所定义的凋亡性细胞核。白屈 菜红碱处理过的肿瘤的细胞核看起来与经辐射处理过的肿瘤细胞核类似。

与单用辐射或单用白屈菜红碱处理相反，经单剂白屈菜红碱和20Gy(分成每 天5Gy共4天)处理的肿瘤的细胞核在非坏死性肿瘤切片中呈现出收缩和片段 化。在用白屈菜红碱和x射线处理两次的肿瘤中没有发现存活组织区域。用IR 处理肿瘤在下表皮和肌肉组织中诱导了典型的炎性反应和坏死，而用x射线和白 屈菜红碱联合处理肿瘤却不增加此种反应，这提示白屈菜红碱所增强的杀细胞作 用仅局限于肿瘤床。这些结果证明，尽管电离辐射不能在体内诱导凋亡，但是白 屈菜红碱通过处理数天内的凋亡诱导作用增强了辐射诱导的细胞杀伤，而下表皮 和周围的正常组织却相对不受该处理的影响。

                       实施例5

            PKC抑制诱导了凋亡和神经酰胺产生

为了了解PKC活性、神经酰胺的产生以及凋亡之间的潜在相互作用，采用 两种PKC抑制剂—白屈菜红碱氯化物和钙感光蛋白C。白屈菜红碱氯化物和钙 感光蛋白C分别竞争PKC的保守催化性位点和调节结构域，是WEHI-231细胞 中发现的PKC同种型(α、β、δ、ε)的强效特异性抑制剂(Chmura等人，1996a； Rotenberg等人，1995；Herbert等人，1990；Haggerty和Monroe，1994)。白屈菜红碱 或钙感光蛋白C的PKC抑制诱导了凋亡。而且，用白屈菜红碱或钙感光蛋白C 处理细胞在激活中性鞘磷脂酶后增强了神经酰胺的产生，这表明PKC和脂质第二 信使神经酰胺在多种细胞信号传递后在决定存活中起相反的作用。

白屈菜红碱和钙感光蛋白C诱导的凋亡：

向生长在完全培养基中的WEHI-231中加入白屈菜红碱(10μM)或钙感光蛋白 C(250nm)24小时后，碘化丙锭FACS分析证明细胞死亡大于90％。低分子量DNA 的凝胶电泳和DAPI荧光染色揭示DNA成梯状和细胞核凝缩。这些结果综合起来 说明WEHI-231在用PKC抑制剂处理后经历了凋亡。

发现白屈菜红碱和钙感光蛋白C与外源神经酰胺类似物协同作用来诱导凋 亡(Chmura等人，1996a)。该发现与以前的报道一致，这证明佛波酯限制了神经酰 胺在WEHI-231和其它细胞系中的毒性(Haimovitz-Friedman等人，1994a； Gottschalk和Quintans，1995；Obeid等人，1993)。由于PKC的激活可能限制了神 经酰胺的产生(Fuks等人，1994；Haimovitz-Friedman等人，1994a；Haimovitz- Friedman等人，1994b)，检查了降低PKC活性对神经酰胺堆积的影响。

神经酰胺的产生是由于中性鞘磷脂酶的激活。

为了测试PKC抑制是否改变了神经酰胺的产生，用DAG激酶试验来定量测 定白屈菜红碱和钙感光蛋白C处理后的细胞内神经酰胺(Dressler和Kolesnick， 1990；Preiss等人，1986)。图7A示出了向指数型生长的细胞培养中加入10μM白 屈菜红碱后神经酰胺产生的时间历程。加入白屈菜红碱约30分钟后，神经酰胺 的产生比基线增加100％，并在数小时内返回接近预处理水平。因此，PKC抑制 在抑制剂处理后的第一小时内诱导了神经酰胺的堆积。

为了调查神经酰胺的增加是否系通过其各自前体的水解还是来自新的脂质 合成，在白屈菜红碱处理后检查了WEHI-231中的鞘磷脂水平。细胞(4×106)用[3H] 棕榈酸盐(10μCi/ml)标记24小时，抽提总脂质，并如前所述(Quintans等人，1994) 用薄层层析分离。图7A显示，随着神经酰胺的增加，鞘磷脂量同时降低，并在 抑制剂处理后60分钟达到其最低水平(约为对照的55％)。如图7B所示，钙感光 蛋白C对神经酰胺的产生和鞘磷脂水平有类似效应。因此，PKC的抑制不仅引 起细胞内神经酰胺增加，而且还同时减少了鞘磷脂，提示神经酰胺是通过鞘磷脂 酶水解其前体而产生的。

为了确认神经酰胺的堆积是否是由于鞘磷脂酶活性增加而引起的，用混合分 子团试验定量测定了体外酶活性。对于这些研究宜采用白屈菜红碱，因为它的溶 解度更大，且活性不依赖于光。图7C描述了在接触白屈菜红碱30分钟内，中性 (非酸性)鞘磷脂酶活性增加至对照的235％(+/-38SD)，这提示大部分神经酰胺的 堆积来自鞘磷脂的水解。热灭活的白屈菜红碱对细胞活力和鞘磷脂酶激活均无影 响。另外，在没有细胞制备物时研究的白屈菜红碱不诱导标记的鞘磷脂水解，这 证明细胞鞘磷脂酶活性的增加负责鞘磷脂的水解。

神经酰胺介导细胞死亡的机制仍未清楚。以前的研究已证明神经酰胺的多个 信号传递靶，包括丝氨酸/苏氨酸激酶(CAPK)和磷酸酶(CAPP)、PKC同种型 (Lozano等人，1994)、p54(Kharbanda等人，1995)和磷脂酶D(Gomez-Munoz等人， 1994；Venable等人，1994)。由于氧化状态的改变在WEHI-231和其它淋巴细胞中 诱导了广泛的细胞反应(包括生长和凋亡)，因此用染料二氯二氢荧光素和FACS 分析来研究PKC的抑制和所产生的神经酰胺堆积对细胞中反应性氧物质水平的 影响。如图8A所示，表面IgM的交联诱导了PKC的特征性活化和反应性氧物质 (ROS)的产生，与以前报道的资料一致(Blumberg，1988)。加入30μM外源性神经 酰胺(图8B)或10μM白屈菜红碱(图8C)15分钟减少了细胞中的ROS，这提示神 经酰胺堆积起了还原剂作用。尽管无毒性氧化作用可促进细胞生长，但是细胞内 的还原作用可导致半胱氨酸蛋白酶(已提出它的凋亡介导剂)激活。

这些结果证明，PKC活性的抑制可能部分通过中性鞘磷脂酶活化和随后的 神经酰胺堆积而诱导了WEHI-231细胞凋亡。以前已经指出，佛波酯激活PKC限 制了神经酰胺的产生并保护细胞免受鞘磷脂水解诱导的凋亡作用(Haimovitz- Friedman等人，1994a；Gottschalk等人，1995)。这些结果表明，PKC活性和神经 酰胺信号传导作用在决定细胞命运上起相反的作用。神经酰胺的产生及其凋亡性 信号传导级联反应的活化可能潜在地代表了增强肿瘤细胞凋亡的新的治疗性目 标。

                          实施例6

     神经酰胺产生的丧失赋予抵抗辐射诱导的凋亡作用的能力

用DAPI染色全细胞来检查辐射后WEHI-231 JM淋巴瘤细胞中凋亡的细胞核 变化。在95％以上的细胞中，通过碘化丙锭排斥和FACScan分析，在20Gy后 观察到凋亡的细胞核凝缩特征。为了评价电离辐射是否需要核外区室来诱导凋亡 的细胞核变化，辐照分离的WEHI-231细胞核。20-40Gy的剂量在辐照后72小时 未能诱导核膜或染色质的凋亡性变化。然而，分离的WEHI-231 JM细胞核在经 激酶抑制剂白屈菜红碱氯化物处理后5小时内经历了DNA凝缩和细胞核分解(凋 亡特征)。这些发现证明，单单细胞核信号无法说明完整细胞在x辐射后的凋亡， 并提示这些细胞中辐射介导的凋亡需要核外行为。

由于已提出神经酰胺是参与对电离辐射和凋亡作用其它介导剂反应的核外 信号(Dressler等人，1992；Gottschalk等人，1995；Ji等人，1995；Martin等人， 1995)，因此测定了8Gy照射细胞后的神经酰胺产生量，因为该剂量的x射线在 72小时内在几乎100％的WEHI-231细胞中诱导了凋亡。图9A示出了辐照指数 型生长的WEHI-231 JM细胞后神经酰胺产生的时间历程。神经酰胺的产生(经 DAG激酶试验测得)在x射线照射后约30分钟升高至高于基线水平(78+/-18皮摩 尔/106细胞)的140％(p＜0.002)，同时伴随中性鞘磷脂酶活性(图9B)的升高，峰值 为未辐射对照(图9B)的138％(p＜0.04)。与最近的其它报道相反，该细胞系中酸 性鞘磷脂酶并没有从其基础水平7.6皮摩尔/毫克/分钟发生改变。这些发现支持了 神经酰胺产生、中性鞘磷脂酶激活和辐射后凋亡诱导之间的时间关系。尽管其它 报道已经指出辐射剂量和神经酰胺产生之间的剂量反应关系，但是在1Gy和8Gy 之间观察到的神经酰胺产生在数值上的差别并不明显。

为了确定观察到的神经酰胺产生的增加是否会导致辐射介导的凋亡作用，选 择了对x射线照射后神经酰胺产生的变化有抵抗力的变异WEHI-231细胞系。据 推测，神经酰胺酶的抑制应选择不耐受神经酰胺产生的细胞，对正-油酰乙醇胺的 抗性会导致细胞应激后神经酰胺产生减少。使WEHI-231 JM细胞与神经酰胺酶 抑制剂正油酰乙醇胺一起培育(Ambrosini等人，1994)。与基准线水平相比，细胞 内神经酰胺的堆积在24小时内以剂量依赖型方式上升。得到的细胞系WEHI-231 OE具有与JM细胞系相似的神经酰胺产生基准水平(100+/-10皮摩尔/106细胞)。 图9B证明了野生型WEHI-231 JM细胞在8Gy照射后观察到的神经酰胺产生的相 对增加。而与未辐照的OE对照细胞相比WEHI-231 OE的神经酰胺产生却没有增 加。如JM细胞系中观察到的那样电离辐射没有改变酸性鞘磷脂酶活性(22皮摩尔 /毫克/分钟)。因此，用正-油酰乙醇胺选择细胞产生了电离辐射后中性鞘磷脂酶活 性有所改变的细胞系。尽管两个细胞系中的神经酰胺基准水平相似，但是OE细 胞系未能在x射线后增加神经酰胺的产生。

与野生型WEHI-231 JM细胞相比，WEHI-231 OE细胞在x射线辐射后的凋 亡反应发生改变。末端转移酶试验(TdT)揭示，在10Gy后24小时，至少50％的 WEHI-231 JM细胞经历着凋亡(图10A)。在48小时时，残留了极少的完整细胞以 作进一步的分析。相反，在24和48小时时，分别只有12％和19％的WEHI-231 OE细胞经历了凋亡。WEHI-231 JM亲代细胞系(而不是WEHI-231 OE细胞系) 早在辐射后14小时就表现出了凋亡的特征性DNA梯，确认了TdT结果。综合起 来，这些结果证明了通过改变中性鞘磷脂酶活化和随后神经酰胺的产生可以产生 凋亡抗性表型。

下面，检测了凋亡的减少以确定它是否允许OE细胞系在x辐射后增殖。在 用6Gy辐照后，OE细胞在24小时内继续增殖，直至进入生长停滞(图10B)。其 余的细胞主要由大多核细胞组成，它们丧失了排斥活性染料的能力并最终片段 化，这与有丝分裂后死亡或坏死细胞死亡相符(Hall，1994)。OE细胞不能继续增 殖和随后的细胞死亡证明，对电离辐射的凋亡反应仅仅代表了x射线杀细胞的一 种机制。

为了说明OE细胞亚系抗性是否部分由于神经酰胺代替产物或靶的改变，进 行了三个研究。用可渗透细胞的神经酰胺类似物C2-神经酰胺预处理经辐射的 WEHI-231 OE细胞，在24小时内恢复了凋亡反应(图11A)。另外，WEHI-231 JM 和OE细胞对于外源神经酰胺和鞘氨醇激酶抑制剂DL-苏(糖)-二氢鞘氨醇(据报道 它特异性地抑制鞘氨醇-1-磷酸(据报道是抑制神经酰胺产生的凋亡效应的神经酰 胺代谢产物)的形成(Cuvillier等人，1996))是同等敏感的(图11B)(IC50分别为30μM 和3μM)。两个细胞系对鞘氨醇激酶的抑制及其导致的神经酰胺减少的效应有同 等程度的敏感性。这些结果证明，与神经酰胺相互作用并诱导凋亡的细胞成分在 WEHI-231 OE细胞内保持未变。因此，抗辐射性可归因于辐射后鞘磷脂酶活化的 缺乏以及随后神经酰胺产生的减少。

这些结果证明，在细胞受电离辐射照射后，核外区室提供了一个基本的凋亡 信号。与这些资料相符的研究表明，核外信号是诱导哺乳动物细胞中凋亡的特征 性细胞质和细胞核变化所需的(Raff等人，1994；Jacobson等人，1994)。这些资料表 明，获得的鞘磷脂水解产生神经酰胺的缺陷，可能导致产生抗辐射性表型。具体 地说，中性(而不是酸性)鞘磷脂酶活性的丧失与对电离辐射后凋亡的抵抗作用有 关，这与以前在酸性鞘磷脂酶敲除小鼠中的研究(Santana等人，1996)提示酸性鞘 磷脂酶是凋亡的主要效应物相反。

与发表的其它细胞系相比，指数型生长的JM和OE细胞系中的酸性鞘磷脂 酶活性很低，并且在电离辐射后不会增加。x射线后不会活化以及基准活性水平 相对较低揭示它不是该系统中对x射线起凋亡反应的成分。这些资料综合起来以 及不能从中性鞘磷脂酶产生神经酰胺的进一步证据提出了一些细胞类型产生x射 线抗性的机制。

已经表明，鞘氨醇转变成鞘氨醇-1-磷酸抑制了神经酰胺诱导的凋亡作用 (Cuvillier等人，1996)。因此，神经酰胺的其它脂质代谢物可能对抗死亡途径，如 Cuvillier等人最近(1996年)所提出的那样。这些研究表明增加鞘氨醇激酶活性可 能是细胞能获得x射线抗性的另一种方式。这些资料证明了抗辐射性和野生型细 胞系对外源性神经酰胺以及鞘氨醇激酶的抑制有同等程度的敏感，并进一步支持 了这样一个假设，即x射线照射后的神经酰胺信号转导行为的丧失是抗性表型(产 生)的原因，这表明肿瘤细胞可能通过类似的机制对体内凋亡产生抗性。

尽管中性鞘磷脂酶不能活化和神经酰胺的产生防止了凋亡，但是OE细胞系 在以后的时间内经历了有丝分裂或分裂性死亡。JM细胞在电离辐射后经历凋亡 的早期凋亡反应，部分取决于中性鞘磷脂酶的活化以及神经酰胺产生的增加。然 而，第一或第二次有丝分裂后细胞不能继续增殖与以前证明x辐射通过几种机制 杀死肿瘤细胞的研究(Dewey等人，1995；Szumiel，1994；Kolesnick等人，1994)相符 (Aldridge等人，1995)。

已提出，神经酰胺产生可通过其它几种DNA破坏剂(包括道诺红菌素和1- B-D阿拉伯糖呋喃糖胞嘧啶(ara-C)(Strum等人，1994；Bose等人，1995))来诱导杀 细胞作用。因此，神经酰胺产生的丧失可能代表了对几种形式的抗肿瘤治疗(据认 为能破坏DNA)产生抗性的一种通用机制。因此，常规策略侧重于使用DNA破坏 剂作为放射敏化剂(Vokes和Weicheslbaum，1990；Horton等人，1995)。这些资料还 提示，提高神经酰胺的产生来诱导凋亡可能是癌症治疗中杀细胞的另一种策略。

                         实施例7

          对其它凋亡诱导剂无反应的抗辐射性细胞，

               对白屈菜红碱诱导的凋亡有反应

利用已描述的过程(Chmura，1996；Chmura等人，1996a；Chmura等人， 1996b)，检查了三个不同凋亡抗性细胞系对白屈菜红碱诱导的凋亡作用的敏感 性。所用的三个细胞系为bcl-x WEHI-231(代表已受bcl-x转染的并对辐射诱导的 凋亡有高度抗性的WEHI-231细胞)、MG细胞和前述WEHI-231 OE(JM)细胞。

如前所述，用白屈菜红碱和x辐射处理所有三个细胞系(Chmura等人，1996a； Chmura等人，1996b)，其中作下列改动。在注射白屈菜红碱前，使细胞预先接触 YVAD-cmk(100μM)(白细胞介素1-b转化酶(ICE)亚家族的一种蛋白酶抑制剂)或 ZVAD(20μM)(抑制cpp32β蛋白酶家族)30分钟。

令人惊奇的是，抗凋亡蛋白bcl-x的过度表达没有阻断白屈菜红碱诱导的凋 亡(图12)。这一结果是出人意料的，因为bcl-x能阻断大多数已知的凋亡诱导剂 的诱导作用(Boise等人，1995；Chen等人，1995；Choi等人，1995；Datta等人，1996； Datta等人，1995；Emoto等人，1995)。其它两个细胞系也对白屈菜红碱没有抗性(图 12)。

接触YVAD-cmk没有阻止白屈菜红碱诱导的凋亡，即使是在低剂量白屈菜 红碱时。但是接触ZVAD却阻断了白屈菜红碱诱导的凋亡，即使当白屈菜红碱剂 量大于15μM时。这些结果提示，bcl-x保护了上游的cpp32β免受凋亡，而白屈 菜红碱直接激活蛋白酶cpp32β。

本文公开的和要求的所有组合物和方法可在参看本文后无需过多试验就可 制得和实行。尽管本发明的组合物和方法已根据较佳实例有所描述，但是本领域 技术人员显然能在不脱离本发明的构思、精神和范围下对本文所述的组合物和方 法以及方法的步骤次序作变动。更具体地说，显然能用某些化学上和生理上相关 的试剂来代替本文描述的试剂并获得相同或相似的结果。所有这些类似的替换和 改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们均将被视为在所附权利要求中 所确定的本发明的精神、范围和构思内。

                          发明背景

根据国立卫生研究院的CA14068号补助金，政府享有本发明的权利。

                           参考文献

下列参考文献被具体纳入本文作参考，以便提供典型的过程或其它细节来补 充本文所述的内容。

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