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一次性芯片型流动室及使用该流动室的流式细胞仪

阅读：874发布：2020-12-18

专利汇可以提供一次性芯片型流动室及使用该流动室的流式细胞仪专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明用于解决现有的流式细胞仪及细胞分选仪具有的生物危害问题。本发明涉及一种液体中微粒子分析装置，包括：载置流动室的器件，该流动室具有使含有微粒子的液体样品流动的流道；对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；检测所述液体样品中的所述粒子发出的散射光和/或荧光的光检测器；以及根据所述光检测器检测出的信号强度来分析该粒子的器件。所述流动室为在平板状基板形成流道，在流道侧面形成反射面，该反射面将流动室的流道内发出的光中朝基板面侧向行进的光引向流动室表面的特定区域，所述光检测器检测从所述特定区域向外部发出的光。，下面是一次性芯片型流动室及使用该流动室的流式细胞仪专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种液体中微粒子分析装置，其特征在于，具备：
载置流动室的器件，该流动室具有使含有微粒子的液体样品流动的流道；
对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；
检测所述液体样品中的所述粒子发出的散射光和/或荧光的光检测器；
基于所述光检测器检测出的信号强度来分析该粒子的器件，
所述流动室，在平板状基板上形成流道，在流道侧面形成反射面，该反射面将流动室的流道内发出的光中朝基板面侧向行进的光引向流动室表面的特定区域，所述光检测器检测从所述特定区域向外部发出的光。
2.如权利要求1所述的液体中微粒子分析装置，其特征在于：
在所述流道侧面形成的所述反射面为由所述流道侧面和气体之间的界面构成的面，且对从流道侧行进过来的光进行全反射的面。
3.如权利要求1所述的液体中微粒子分析装置，其特征在于：
所述流动室为平板状，几乎垂直于平板状流动室基板的表面向流道内照射光，作为利用内置于流动室基板内的反射面从流动室的特定区域引向外部的光，检测出流道内发出且朝流道侧方向的侧向散射光，作为在前方透过流动室向外部发出的光，检测出前向散射光。
4.一种流动室，用于对流动室的流道中流动状态的液体样品照射光，检测该液体样品所含的粒子样品发出的光，其特征在于，
在流动室内部的流道侧面的外侧形成有对从流道方向行进过来的光进行全反射的面，该反射面为由流动室母材和气体之间的界面构成的反射面。
5.如权利要求4所述的流动室，其特征在于，
流动室的结构为在透明的平板状基板上形成流道，该反射面将流道内发出的散射光和荧光向基板表面方向或底面方向反射。
6.如权利要求4所述的流动室，其特征在于，
流动室的结构为在透明的平板状基板上形成流道，该反射面用于对入射到流动室的照射光进行反射，并从基板面侧向对流道照射光。
7.一种流动室，用于对流动室的流道中流动状态的液体样品照射光，检测该液体样品所含的粒子样品发出的光，其特征在于，
流动室的结构为在透明的平板状基板上形成流道，流动室基板内的光反射面为平板状基板的表面底面的扁平面与气体之间的界面、或在基板表面或底面形成的槽结构的侧面，将流道内部发出且朝平面基板面侧向行进的光引向流动室的特定外部表面。
8.如权利要求7所述的流动室，其特征在于，
光反射面为与流道附近的基板表面呈约45度的斜面，将流道内发出的光中朝基板面侧向行进的光向基板表面或底面方向反射。
9.如权利要求7所述的流动室，其特征在于，
包含光照射的流道的特定局部区域的流动室厚度比其周围薄。
10.如权利要求7所述的流动室，其特征在于，
该流动室的结构为在透明基板中形成流道，在该流道的上游侧和下游侧的基板上部分别形成贮液室，流动室中流动的液体封入上游的贮液室、流道和下游的贮液室。
11.一种液体中微粒子测定装置，具有：
载置流动室的器件，该流动室具有使含有粒子样品的液体样品流动的流道；
对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；
检测所述液体样品中的所述粒子样品发出的散射光和/或荧光的光检测器；
基于所述光检测器检测出的信号强度，识别该粒子样品的器件，
所述流动室在平板状基板中的基板面侧向形成阵列状的多个流道，照射所述光的器件将照射波束光从基板面侧向朝横穿多个流道的方向照射，所述光检测器对每个流道区别并测定多个流道中流动的样品微粒子发出的光信号。
12.一种液体中微粒子测定装置，其特征在于，具备：
载置流动室的器件，该流动室具有使含有粒子样品的液体样品流动的流道；
对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；
检测所述液体样品中的所述粒子样品发出的散射光和/或荧光的光检测器；
基于所述光检测器检测出的信号强度来识别该粒子样品的器件，
所述流动室的结构为阵列状配置了多个流道，照射所述光的器件具有在横穿多个流道的方向对照射波束光进行相对扫描的机构，波束比各流道宽度窄，扫描周期比光检测信号的应答频率大，所述光检测器的检测光学系统为成像光学系统，通过在流道的成像面设置阵列型检测器，区别每个流道并同时并行测定多个流道。
13.一种流动室，用于对流动室的流道中流动状态的液体样品照射光，检测该液体样品所含的粒子样品发出的光，其特征在于，
所述流动室为平板状，在平板基板上形成多个液体样品贮液室、和多个液体样品通用的鞘液贮液室，在通用贮液室内形成液体样品贮液室，从而液体不混在一起，在各个液体样品贮液室连接有液体样品用流道，鞘流从各液体样品流的左右合流而形成流道，合流的流道形成为平行且等间隔，最下游连接到流动室上形成的通用贮液室，通过对多个流道用依次步进曝光仅照射一个流道大小的光束的方式移动照射光或流动室，测定多个样品。
14.如权利要求12所述的液体中微粒子测定装置，其特征在于，
流动室的结构为阵列状排列多个毛细管。
15.一种微粒子分离装置，其对流动室的流道中流动状态的含有微粒子的液体样品进行光照射，检测该微粒子发出的散射光和荧光，基于信号强度，识别并分离该生物粒子，其特征在于，
该流动室的结构为在平板基板内形成流道，具有液体样品的导入用流道、配置在其两侧的一对鞘液导入用流道、上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧流动的合流流道，在光照射区域的下游侧的合流流道的至少一个侧面连接有流道(S)，利用粒子通过光照射区域时发出的光信号，判断是否是应分离的粒子，在判断为是应分离的粒子的情况下，通过在该粒子经过流道(S)和连接处时，对经过流道(S)并在合流流道内流动的该微粒子，利用设置在流动室外部的泵施加脉冲流，从而使该粒子的合流流道内的流动位置发生偏移，在判断为不是应分离的粒子时，由于不产生脉冲流，所以流动位置不发生偏移，通过有无该偏移，将粒子分离给下游的多个分支流道。
16.一种微粒子分离装置，其特征在于，具有：
载置流动室的器件，该流动室具有使含有微粒子的液体样品流动的流道；
对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；
根据不同波长检测所述液体样品中的所述微粒子发出的散射光和/或荧光的光检测器；
基于所述光检测器检测出的多个信号强度来识别并分离该生物粒子的器件，该流动室具有液体样品的导入用流道、配置在其两侧的一对鞘液导入用流道、上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧流动的合流流道，在光照射区域的下游侧的合流流道的至少一个侧面连接有流道(S)，检测粒子通过光照射区域时发出的光信号，判断是否是应分离的粒子，在判断为是应分离的粒子的情况下，通过在该粒子经过与流道(S)连接的合流流道处时，对经过流道(S)并在合流流道内流动的该微粒子，经与流道(S)的下游连接的流动室上的贮液室和密封空间的气体，脉冲泵施加引压脉冲，使微粒子流入流道(S)并贮存到贮液室，从而在使整个液流系统封入一个流动室上的状态下进行微粒子分离。
17.一种液体中微粒子分离装置，其特征在于，具备：
载置流动室的器件，该流动室具有使含有微粒子的液体样品流动的流道；
对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；
检测所述液体样品中的所述微粒子发出的散射光和/或荧光的光检测器；
基于所述光检测器检测出的多个信号强度来识别并分离所述微粒子的器件，在所述流动室的流道中形成使液体样品偏向流道截面的一部分流动的样品流和鞘流相合流的流道，在该合流之后样品流变窄集中流动的状态下，在流道侧面附近设置可控制施加磁场的电磁铁，仅使带有磁的粒子从偏移的样品流中的流动位置偏移，形成引导该偏移的粒子的分支流道1，在该分支流道1的途中照射激光，测定来自微粒子的散射光和荧光并识别微粒子，在判断为微粒子是分离对象的情况下，在其下游形成连接到分支流道1的流道(S)，存在连接到流道(S)的下游侧的贮液室(S)，经贮液室(S)和密闭空气，利用脉冲泵的引力脉冲流，使微粒子流入贮液室(S)。
18.一种平板状流动室，用于对流道中流动状态的液体样品所含的微粒子进行分离，其特征在于，
流动室的结构为在透明基板中形成流道，在该流道的上游侧和下游侧的基板上部分别形成贮液室，具有液体样品的导入用流道、配置在其两侧的一对鞘液导入用流道、上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧流动的合流流道，在该合流流道的至少一个侧面连接流道(S)，在流道(S)有可与外部进行管连接的端口，在合流流道的下游形成分离用的多个分支流道，并连接到多个贮液室。
19.一种流动室，用于对流道中流动状态的液体样品所含的微粒子进行分离，其特征在于，
所述流动室在透明基板中形成流道，在该流道的上游侧和下游侧的基板上部分别形成贮液室，具有液体样品导入用流道、配置在其两侧的一对鞘液导入用流道、和上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧流动的合流流道，在该合流流道的至少一个侧面连接流道(S)，在流道(S)的下游连接分离粒子用的贮液室，在该贮液室有可与外部进行管连接的端口，合流流道连接到下游的废液用贮液室。
20.一种从多种细胞群分离出特定细胞的细胞分离方法，其特征在于，
使用聚集和分散温度分别不同的多个热敏磁性粒子，分别结合不同种类抗体，使多种细胞群与抗原抗体反应之后，在不同温度下利用梯度磁场依次进行分离，基于多个抗原抗体反应进行选择性分离。
21.如权利要求1、2、3、11、12、13、14、15、16或17任一项所述的液中微粒子测定装置，其特征在于，
可以控制液体样品的温度并测定。

说明书全文

一次性芯片型流动室及使用该流动室的流式细胞仪

技术领域

[0001] 本发明涉及具有生物粒子分析功能的流式细胞仪等或具有分离功能的细胞分选仪等装置、用该装置实现新功能的测定方法、以及一次性流动室芯片。

背景技术

[0002] 流式细胞仪一般用于鉴别各种类型的细胞及生物学流体。现有的流式细胞仪一般由石英制成，具有形成为应被一个一个识别的细胞流通过其流动的流道的光学上透明的流动室。该流道中流动的细胞流由同心包围该细胞流的鞘液集中到流道的中心部流动。该流道的中心部被激光束照射，在细胞通过该照射区域时，依赖于细胞大小、形状、折射率而发生光散射。该激光波长与荧光色素种类相配合确定，以使用荧光检测由荧光色素特异染色的细胞。像这样，通过对每个细胞，除散射光之外，还用多个光检测器根据不同波长检测荧光，可以多方面地分析细胞。在专利文献1记载了上述流式细胞仪的技术。另外，在特开平2003-302330(专利文献13)和美国专利第7105355号(专利文献14)记载了平板状流动室。在专利文献2、3、4记载了作为流式细胞仪的照射方式，通过在流道内扫描激光束来测定正确的信号光强度的方法。

[0003] 下面对细胞分选方法的公知例子进行说明。美国专利第3710933号(专利文献1)或美国专利第3826364号(专利文献5)记载的方法是现有一般产品所用的分离方法，即从液滴形成用喷嘴将液体样品作为液滴向空气中吐出，包含分离对象细胞的液滴以液滴单位被电场分离的方法。特开昭64-3541(专利文献6)的方法为鞘流在流动室中流动的液体样品的周围流动，通过对液体样品施加电场，使带电的粒子从样品流移向鞘液侧进行分离测定的方法。特开平1-170853(专利文献7)对流动室中流动的粒子施加压力脉冲，将粒子分离给流动室内不稳定流动的流道的方法。国际公开号WO98/10267(专利文献8)公开了对流动室内周围被鞘流挤压流动的微粒子施加场，使微粒子流发生偏移并进行分离的技术。国际公开号WO2004/101731(专利文献9)公开了利用在流动室内的流道两侧设置的凝胶电极，用电场分离液体中带电的细胞的方法。美国专利US6808075(专利文献10)公开了通过垂直形成弯月面的气泡阀对粒子流施加压力脉冲，使流发生偏移并分离的方式。
WO2006/076195(专利文献11)公开了与专利文献8相同地施加压力脉冲，但以含有目的粒子的水滴单位射出并回收到容器的方法。美国专利第4756427号(专利文献12)记载了测定被鞘流挤压的液体样品流中的粒子，在判断为目标粒子时，用脉冲流导入另一流道并分离的方法。专利文献15公开了利用涂敷有抗体的磁粒子，使磁粒子吸附于特定的细胞上，并用梯度磁场分离的方法。专利文献16公开了可根据温度控制聚集的热敏磁性纳米粒子。
非专利文献1公开了利用热敏磁性纳米粒子分离细胞的方法。

[0004] 现有技术文献

[0005] 专利文献

[0006] 专利文献1：美国专利第3710933号

[0007] 专利文献2：特开昭63-1952

[0008] 专利文献3：特开平3-150446

[0009] 专利文献4：特开平4-55740

[0010] 专利文献5：美国专利第3826364号

[0011] 专利文献6：特开昭64-3541

[0012] 专利文献7：特开平1-170853

[0013] 专利文献8：国际公开号WO98/10267

[0014] 专利文献9：国际公开号WO2004/101731

[0015] 专利文献10：美国专利第6808075号

[0016] 专利文献11：国际公开号WO2006/076195

[0017] 专利文献12：美国专利第4756427号

[0018] 专利文献13：特开平2003-302330

[0019] 专利文献14：美国专利第7105355号

[0020] 专利文献15：国际公开号WO96/28732

[0021] 专利文献16：特开平2007-56094

[0022] 非专利文献

[0023] 非专利文献1：Hoshino A，et al.Biotechnology Progress，2007，23，1513-1516发明内容

[0024] (一)要解决的技术问题

[0025] 现有的流式细胞仪及细胞分选仪存在生物危害问题。即，这是因为外部异物混入检测样品中以及检测样品向外部扩散。即，不能简单更换液体样品的贮液室、输液管以及包含流动室的液流系统，现有的流式细胞仪为了防止残留，在每次检测不同的样品时不得不进行清洗。对流式细胞仪增加了粒子分离功能的细胞分选仪也存在同样的问题。一个解决方案是将流动室做成一次性的。为了能够做成一次性的，流动室优选为如载玻片的平板状结构。因为该结构为射出成型等容易形成流道样式且可以廉价批量生产。在使用平板状流动室的情况下，优选为垂直于表面入射激光的方法。但是，检测朝平板面侧向的散射光即侧向散射光方面存在问题。常规流式细胞仪的流动室一般流动室截面为正方形，能够测定激光的照射方向的垂直方向的散射光，且与前向散射光同时测定。但是，在使用平板型流动室的情况下，由于在侧向散射光的方向存在流动室基板，因此流动室的平板结构自身妨碍检测。作为解决该问题的方法，专利文献14记载了在流动室的流道侧面设置光纤并将流道内发出的光引导至光检测器的方法。但是，由于此时光纤连接在流动室，不适合每次检测都更换流动室，因此不适于一次性用途的流动室。

[0026] 另外，如果流动室的造价不低廉，则很难成为一次性。为了使造价便宜，优选为使用透明树脂制造。但是，树脂在波长小于500nm的短波区域存在很小的光吸收带并发出荧光，因此对测定成为背景干扰。即，适合一次性的透明树脂制流动室，其自身荧光妨碍测定。

[0027] 下面说明微粒子分离方法的课题。第一课题是存在生物危害问题。专利文献1或专利文献5记载的利用喷嘴的液滴吐出方式存在生物危害方面的问题。即，样品为被病原性的病菌或细菌污染的细胞的情况下，具有将非常危险的东西作为气溶胶扩撒到大气中的风险。对于解决第一课题的方式考虑了将气溶胶不扩散到大气中而在密闭于流动室内的状态下进行分离的方法。下面几个技术公开了上述方法。专利文献6是鞘流在流动室中流动的液体样品的周围流动，通过对液体样品施加电场，利用电场将带电粒子从样品流移向鞘流侧并进行分离测定的方法。专利文献7是对流动室中流动的粒子施加压力脉冲，将粒子分离给流动室内不稳定流动的流道的方法，但存在不让分离的粒子返回原流道的过程麻烦的问题。专利文献8公开了对流动室内被鞘流挤压流动的微粒子施加电场和磁场等场，使微粒子流发生偏移并进行分离的技术。该方法在作为场适用电场的情况下，相当于上述专利文献6的内容，但与专利文献9的方法相同，利用电场的方法即使用一些方法防止了电分解产生气泡，也由于细胞具有的电荷被周围电解质中所含的离子屏蔽，存在对粒子的作用力降低的问题，因此在电解质中的分离并不实用。专利文献10是在芯片内进行分选的技术。分离一个微粒子需要弯月面形状的往返运动，由于在往返中会产生逆向流，所以需要等待粒子充分远离之后使弯月面位置恢复原样的问题。专利文献11与专利文献7相同，施加压力脉冲，将包含目的细胞的区域以水滴单位射出并回收到容器的方法。上述内容在一次性流动室芯片内不能实现，具有与其他样品混合存在的问题。专利文献12保持不变的话，不适于一次性芯片。

[0028] 下面说明第二课题。与分选目标细胞密度相比，非目标细胞密度非常高，例如在100倍以上的情况下，由于当前的最高分离性能为95％程度，所以分离出的细胞群所包含的非目标细胞多于目标细胞。

[0029] 因此，为了提高分离出的细胞的纯度，需要对回收的样品再次进行分选处理。但是，由于目标细胞的绝对个数少，所以如果重复该处理，则目标细胞的丢失概率变大。因此，在大多情况下，重复分离不能成为解决方案。

[0030] 下面说明利用涂敷有某个特定抗体的磁粒子，将磁粒子吸附到具有与其对应的抗原的细胞上，在梯度磁场分离该细胞的方法。课题之一是由于分离精度仅由一种抗原抗体反应的特异性决定，所以难以利用多种抗原抗体反应来提高分离精度。即，将用涂敷有某个抗体的磁粒子作了标记的细胞用梯度磁场进行分离之后，难以进一步从该分离细胞中用涂敷有其他抗体的磁粒子进一步分离出特定的细胞。这是因为不能选择性分离多个磁粒子、以及难以从分离出的细胞中卸下磁粒子。无论上述哪一方法，现有的利用磁粒子分离细胞的方法，由一种抗原抗体反应的特异性确定分离精度极限。第二课题是利用磁粒子的分离细胞不能确保真正被分离，所以在分离后需要用流式细胞仪分析并判断分离细胞。但是，常规流式细胞仪由于使用大量鞘液，因此分离后的检测细胞液至少被稀释成1000程度，在细胞数微量的情况下，具有细胞丢失风险高的缺点。

[0031] (二)技术方案

[0032] 鉴于上述情况，本发明提供一种一次性流动室以及使用该一次性流动室分析识别生物粒子的装置或进一步分离生物粒子的装置。

[0033] (1)一种液体中微粒子分析装置，其特征在于，具备：

[0034] 载置流动室的器件，该流动室具有使含有微粒子的液体样品流动的流道；

[0035] 对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；

[0036] 根据不同波长检测所述液体样品中的所述粒子发出的散射光和/或荧光的光检测器；

[0037] 基于所述光检测器检测出的信号强度来分析该粒子的器件，

[0038] 所述流动室在平板状基板上形成流道，在流道侧面形成反射面，该反射面将流动室的流道内发出的光中朝基板面侧向行进的光引向流动室表面的特定区域，所述光检测器检测从所述特定区域向外部发出的光。

[0039] (2)如(1)所述的液体中微粒子分析装置，其特征在于，

[0040] 在所述流道侧面形成的所述反射面为由所述流道侧面和气体之间的界面构成的面，且对从流道侧行进过来的光进行全反射的面。

[0041] (3)如(1)所述的液体中微粒子分析装置，其特征在于，

[0042] 所述流动室为平板状，几乎垂直于平板状流动室基板的表面向流道内照射光，作为利用内置于流动室基板内的反射面并从流动室的特定区域引向外部的光，检测出流道内发出且朝流道侧方向的侧向散射光，作为在前方透过流动室向外部发出的光，检测出前向散射光。

[0043] (4)一种流动室，用于对流动室的流道中流动状态的液体样品照射光，检测该液体样品所含的粒子样品发出的光，其特征在于，

[0044] 在流动室内部的流道侧面的外侧形成有对从流道方向行进过来的光进行全反射的面，该反射面为由流动室母材和气体之间的界面构成的反射面。

[0045] (5)如(4)所述的流动室，其特征在于，

[0046] 流动室的结构为在透明的平板状基板上形成流道，该反射面将流道内发出的散射光和荧光向基板表面方向或底面方向反射。

[0047] (6)如(4)所述的流动室，其特征在于，

[0048] 流动室的结构为在透明的平板状基板上形成流道，该反射面用于对入射到流动室的照射光进行反射，并从基板面侧向对流道照射光。

[0049] (7)一种流动室，用于对流动室的流道中流动状态的液体样品照射光，检测该液体样品所含的粒子样品发出的光，其特征在于，

[0050] 流动室的结构为在透明的平板状基板上形成流道，流动室基板内的光反射面为平板状基板的表面底面的扁平面与气体之间的界面、或在基板表面或底面形成的槽结构的侧面，将流道内部发出且朝平面基板面侧向行进的光引向流动室的特定外部表面。

[0051] (8)如(7)所述的流动室，其特征在于，

[0052] 光反射面为与流道附近的基板表面呈约45度的斜面，将流道内发出的光中朝基板面侧向行进的光向基板表面或底面方向反射。

[0053] (9)如(7)所述的流动室，其特征在于，

[0054] 包含光照射的流道的特定局部区域的流动室厚度比其周围薄。

[0055] (10)如(7)所述的流动室，其特征在于，

[0056] 该流动室的结构为在透明基板中形成流道，在该流道的上游侧和下游侧的基板上部分别形成贮液室，流动室中流动的液体被封入上游的贮液室、流道和下游的贮液室。

[0057] (11)一种液体中微粒子测定装置，其特征在于，具备：

[0058] 载置流动室的器件，该流动室具有使含有粒子样品的液体样品流动的流道；

[0059] 对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；

[0060] 检测所述液体样品中的所述粒子样品发出的散射光和/或荧光的光检测器；

[0061] 基于所述光检测器检测出的信号强度来识别该粒子样品的器件，

[0062] 所述流动室在平板状基板中的基板面侧向形成阵列状的多个流道，所述照射光的器件将照射波束光从基板面侧向朝横穿多个流道的方向照射，所述光检测器按不同流道区别并测定多个流道中流动的样品微粒子发出的光信号。

[0063] (12)一种液体中微粒子测定装置，其特征在于，具备：

[0064] 载置流动室的器件，该流动室具有使含有粒子样品的液体样品流动的流道；

[0065] 对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；

[0066] 根据不同波长检测所述液体样品中的所述粒子样品发出的散射光和/或荧光的光检测器；

[0067] 基于所述光检测器检测出的信号强度来识别该粒子样品的器件，

[0068] 所述流动室的结构为阵列状配置了多个流道，照射所述光的器件具有在横穿多个流道的方向对照射波束光进行相对扫描的机构，波束比各流道宽度窄，扫描周期比光检测信号的应答频率大，所述光检测器的检测光学系统为成像光学系统，通过在流道的成像面设置阵列型检测器，区别每个流道并同时并行测定多个流道。

[0069] (13)一种流动室，用于对流动室的流道中流动状态的液体样品照射光，检测该液体样品所含的粒子样品发出的光，其特征在于，

[0070] 所述流动室为平板状，在平板基板上形成多个液体样品贮液室、和多个液体样品通用的鞘液贮液室，在通用贮液室内形成液体样品贮液室，从而液体不混在一起，在各液体样品贮液室连接有液体样品用流道，鞘流从各液体样品流的左右合流而形成流道，合流的流道形成为平行且等间隔，最下游连接到流动室上形成的通用贮液室，通过对多个流道用依次步进曝光仅照射一个流道大小的光束的方式移动照射光或流动室，测定多个样品。

[0071] (14)如(12)所述的液体中微粒子测定装置，其特征在于，

[0072] 流动室的结构为阵列状排列多个毛细管。

[0073] (15)一种微粒子分离装置，其对流动室的流道中流动状态的含有微粒子的液体样品进行光照射，检测该微粒子发出的散射光和荧光，基于信号强度，识别并分离该生物粒子，其特征在于，

[0074] 该流动室的结构为在平板基板内形成流道，具有液体样品的导入用流道、配置在其两侧的一对鞘液导入用流道、上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧流动的合流流道，在光照射区域的下游侧的合流流道的至少一个侧面连接有流道S，利用粒子通过光照射区域时发出的光信号，判断是否是应分离的粒子，在判断为是应分离的粒子的情况下，通过在该粒子经过流道S和连接处时，对经过流道S并在合流流道内流动的该微粒子，利用设置在流动室外部的泵施加脉冲流，从而该粒子的合流流道内的流动位置发生偏移，在判断为不是应分离的粒子时，由于不产生脉冲流，所以流动位置不发生偏移，通过有无该偏移，将粒子分离给下游的多个分支流道。

[0075] (16)一种微粒子分离装置，其特征在于，具备：

[0076] 载置流动室的器件，该流动室具有使含有微粒子的液体样品流动的流道；

[0077] 对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；

[0078] 根据不同波长检测所述液体样品中的所述微粒子发出的散射光和/或荧光的光检测器；

[0079] 基于所述光检测器检测出的多个信号强度来识别并分离该生物粒子的器件，[0080] 该流动室具有液体样品的导入用流道、配置在其两侧的一对鞘液导入用流道、上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧流动的合流流道，在光照射区域的下游侧的合流流道的至少一个侧面连接有流道S，检测粒子通过光照射区域时发出的光信号，判断是否是应分离的粒子，在判断为是应分离的粒子的情况下，通过在该粒子经过与流道S连接的合流流道处时，对经过流道S并在合流流道内流动的该微粒子，经与流道S的下游连接的流动室上的贮液室和密封空间的气体，脉冲泵施加引压脉冲，使微粒子流入流道S并贮存到贮液室，从而在使整个液流系统封入一个流动室上的状态下进行微粒子分离。

[0081] (17)一种液体中微粒子分离装置，其特征在于，具备：

[0082] 载置流动室的器件，该流动室具有使含有微粒子的液体样品流动的流道；

[0083] 对所述流动室的所述流道中流动的所述液体样品照射光的器件；

[0084] 根据不同波长检测所述液体样品中的所述微粒子发出的散射光和/或荧光的光检测器；

[0085] 基于所述光检测器检测出的多个信号强度来识别并分离所述微粒子的器件，[0086] 在所述流动室的流道中形成使液体样品偏向流道截面的一部分流动的样品流和鞘流相合流的流道，在该合流之后样品流变窄集中流动的状态下，在流道侧面附近设置可控制施加磁场的电磁石，仅使带有磁的粒子从偏移的样品流中的流动位置偏移，形成引导该偏移的粒子的分支流道1，在该分支流道1的途中照射激光，测定来自微粒子的散射光和荧光并识别微粒子，在判断为微粒子是分离对象的情况下，在其下游形成连接到分支流道1的流道S，存在连接到流道S的下游侧的贮液室S，经贮液室S和密闭空气，利用脉冲泵的引力脉冲流，使微粒子流入贮液室S。

[0087] (18)一种平板状流动室，用于对流道中流动状态的液体样品所含的微粒子进行分离，其特征在于，

[0088] 流动室的结构为在透明基板中形成流道，在该流道的上游侧和下游侧的基板上部分别形成贮液室，具有液体样品的导入用流道、配置在其两侧的一对鞘液导入用流道、上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧流动的合流流道，在该合流流道的至少一个侧面连接流道S，在流道S有可与外部进行管连接的端口，在合流流道的下游形成分离用的多个分支流道，并连接到多个贮液室。

[0089] (19)一种流动室，用于对流道中流动状态的液体样品所含的微粒子进行分离，其特征在于，

[0090] 所述流动室在透明基板中形成流道，在该流道的上游侧和下游侧的基板上部分别形成贮液室，具有液体样品导入用流道、配置在其两侧的一对鞘液导入用流道、和上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧流动的合流流道，在该合流流道的至少一个侧面连接流道S，在流道S的下游连接分离粒子用的贮液室，在该贮液室有可与外部进行管连接的端口，合流流道连接到下游的废液用贮液室。

[0091] (20)一种从多种细胞群分离出特定细胞的细胞分离方法，其特征在于，[0092] 使用聚集和分散温度分别不同的多个热敏磁性粒子，分别对不同种类磁粒子结合不同种类抗体，使多种细胞群与抗原抗体反应之后，在不同温度下利用梯度磁场依次进行分离，基于多个抗原抗体反应进行选择性分离。

[0093] (21)如(1)、(2)、(3)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)或(17)任一个所述的液中微粒子测定装置，其特征在于，

[0094] 可以控制液体样品的温度并测定。

[0095] 下面对本发明的特征进行说明。

[0096] 1)使用一次性平板型流动室检测侧方散射信号的器件

[0097] 在用于对流动室中的流道中流动状态的液体样品照射光并检测从该液体样品所含的物质发出的光的流动室中，形成将液体样品流动的流道样式和流道中发出的光引向流动室的特定表面的光反射面4。通过利用流动室母材和气体之间的界面，在流动室内形成全反射面。即，如果流动室母材的折射率为Nf，由于大气折射率为1，所以满足全反射条件的临界入射角度由asin(1/Nf)求出。只要入射角大于该角度，就成为全反射。例如，Nf＝1.42时，入射角为44.7度。具体材料的折射率，在400nm至800nm波长范围内，石英的折射率为Nf＝1.45～1.47，玻璃的折射率为Nf＝1.50～1.53，丙烯基的折射率为Nf＝
1.49～1.50，聚碳酸酯的折射率为Nf＝1.64～1.7。因此，可知这些材料在可视光区域且入射角45度以上时，全都满足全反射条件。

[0098] 通过在流动室内部形成该反射面，可以将流道内发出的光高效地反射并引导至特定的流动室表面。流动室母材的折射率越高，临界入射角越小，满足全反射条件的入射角范围变大，所以为了高效地引导光，作为流动室母材使用高折射率母材。图1所示的流动室，平板流动室的表底面起到全反射面的作用。即，在流道5流动的细胞通过照射区域1的瞬间所发出的信号光(散射光或荧光)中向侧方(平板面侧向)行进的信号光6在±45度范围内，由流动室表面和底面4(表裹面)产生全反射，所以可以高效检测向端面外部发出的光。

[0099] 图2所示的结构中，通过在流动室的平面基板形成槽7，其侧面4也成为树脂和气体的边界，所以可以用作全反射面。其结果，流动室为通过上下左右的全反射面将流道内发出的光高效引向端面，可以在端面方向高效检测侧方信号光。图3和图4所示的流动室的结构为在基板内部和端面形成斜面并作为全反射面，利用该全反射面，将信号光向表面方向或底面方向反射，从而检测侧方信号光。综上所述，上述技术内容为流式细胞仪所用的流动室，通过在流动室内形成全反射，可以用平板型流动室检测侧方信号光。利用上述流动室的全反射的检测光学系统采用以下器件。

[0100] 如图1或图2所示，对平板状流动室，垂直于平面向流道照射，在基板端面方向检测侧方信号时，必须高效检测从端面向外部发出的信号光。因此，采用在端面附近设置弹性光导管17引向光检测器2的结构。由此，可自由配置光检测器，并且即使流动室和检测光学系统的位置关系不精确，只要入射到光导管的端面，就可以高效地引向光检测器。

[0101] 下面，对利用上述侧方信号光的检测光学系统之外还利用一次性流动室的流式细胞仪的整个光学系统进行说明。

[0102] 如图4所示，用照射光3几乎垂直于流动室基板地对流道5进行照射，从粒子样品发出的散射光和荧光的检测是通过具有光学系统和检测系统，可以检测每个微粒子的波长与入射光相同的前向散射光信号和侧向散射光信号、波长与入射光不同的荧光。所述光学系统为使用二色镜14和带通滤波器15对透过流动室基板射出基板表面的信号光进行波长分离并检测；所述检测系统为利用流动室内形成的全反射面4，使用设置在流动室外部的光导管17，经带通滤波器15进行波长分离之后引向检测器2进行检测。

[0103] 下面对整个液流系统可与流动室一起更换且可检测前向散射光和侧向散射光的器件进行说明。

[0104] 一种生物粒子分析分离装置，其对流动室的流道中流动状态的含有生物粒子的液体样品进行光照射，用光检测器检测该粒子发出的散射光和荧光，基于其信号强度来识别该粒子，其特征在于，如图7所示，在流动室基板上形成分别与流动室的流道上端和下端连接的上游侧贮液室和下游侧贮液室，具有通过经空气对两个贮液室之间施加压力，从而控制从上游贮液室向下游贮液室流动的液体样品的流速的功能，该流动室的结构为在平板基板内部形成流道，如图4所示，将流道内粒子发出的光中的侧方即该基板面侧向的光，利用在基板形成的全反射面引向设置在流动室外部的光导管，在基板外部用光检测器检测，前向散射光的检测是对从流道透过流动室基板射出基板表面的散射光进行检测。

[0105] 将整个液流系统放入流动室中，可以降低自身荧光并检测侧向散射光的流动室是利用以下器件。

[0106] 使含有粒子的液体样品流动的流动室中，该流动室的结构为在透明基板中形成流道且在该流道的上游侧和下游侧的基板上部分别形成贮液室，具有与上游侧的样品贮液室连接的液体样品导入用流道1、配置在其两侧与鞘液贮液室连接的一对鞘液导入用流道2、上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧以层流状态流动的流道3，如图6所示，包含流道3的一部分的区域的基板厚度比其周围薄，对于在流道内发出的散射光，具有由基板表面与大气的界面构成的全反射面、和由基板内形成的空气层与基板材质的界面构成的全反射面，将散射光引导至基板端的特定区域。

[0107] 即使将全反射面用于照射光学系统，也可以检测侧向散射光。即，这是因为如图5所示，利用在流动室内部形成的全反射面4，从面侧向朝流道5照射时，流动室的基板下的检测光学系统检测侧方信号光。该照射系统也可以有效用作下面说明的多样本测定用的器件。

[0108] 2)实现多样本用流式细胞仪的器件

[0109] 如图8所示，将图5所示的方法适用于多流道的流动室。在此，为了区别多个流道并检测流道内发出的散射光和荧光等信号光，采用作为检测光学系统使用成像透镜使流道像在成像面26成像，并在该面设置阵列检测器23的方法。检测面尺寸为比成像面的各流道宽度小。由此，对按每个流道区别流动室中的多流道的信号脉冲进行并行测定。光吸收器件25用于防止照射波束强的反射光返回流道。图9为不利用流动室内的全反射面，从端面入射照射光，照射多个流道的方法。图10为俯视形成多个流道和全反射面的图8的流动室的图。从流道侧面照射时，由于不需要鞘液，所以不需要鞘液的贮液室，设置了用于对多个样品用贮液室施加相同压力的加压气体用贮液室27。

[0110] 图11表示通过横跨多个流道高速扫描照射激光束来同时检测多个流道的方法。为了高速扫描，利用声光元件的偏转器。该方法为了区别多个流道并进行测定，与上述同样，作为检测光学系统使用成像系统并在成像面设置阵列检测器。通过使激光束扫描周期比检测器的时间响应频率快，使得扫描的激光束对于检测器而言就像用一根线束照射。即，成为可以用扫描宽度来控制线束长度的测定系统。在此，作为频率，利用声光元件的偏转器为10MHz以上，光检测器的响应频率为几10KHz程度。激光束的扫描周期小于检测器的时间响应频率的情况下，如果微粒子通过照射区域的期间被光束扫描照射多次，则多次发生信号脉冲，具有信号处理复杂的缺点。对此，上述高速扫描对于一个微粒子发出的信号脉冲是1个。

[0111] 图12表示将多个流道以流道单位，用步进曝光对流动室或激光束依次进行测定的方法。在此的检测光学系统由于不需要区别流道，所以检测器不需要是阵列检测器。图13为适用于图12所示的装置的流动室的结构。在此，设置鞘液贮液室9，为了使液体样品流集中成比照射光束尺寸小，在各样品用流道从左右合流鞘液。在测定区域1，将激光束在等间隔形成的各流道的中心位置依次停滞一定时间之后，移动到下一流道。由此，依次分析多个液体样品的微粒子。在下游侧，各流道连接到通用废液贮液室。该废液贮液室形成在流动室上。

[0112] 如图14所示，下面所示的器件是作为流动室阵列状一体化微毛细管，并与上述激光束高速扫描的照射系统进行组合形成的。该器件的优点为从样品预处理用多孔板直接吸上来并自动依次测定为目的。对于多孔板液体样品的阵列间隔使用调节毛细管间隔的夹具35。采用的方式为一次测定结束之后，多孔板载物台的高度方向及横向自动移动，将下一液体样品阵列吸上来并进行测定。图15为毛细管阵列的流动室的截面图。照射激光束时，由于在折射率不同的边界反射光，所以在毛细管阵列间隙填充折射率与作为毛细管母材的石英相同的折射率1.42的液体，降低干扰光的产生。

[0113] 4)一次性流动室的细胞分选仪

[0114] 说明利用图16所示的流动室的细胞分离方法。

[0115] 对流动室中的流道中流动状态的含有生物粒子的样品液体照射激光，检测该生物微粒子发出的散射光和荧光，基于其信号强度来识别并分离该生物粒子的方法，具有该流动室具有与上游的液体样品贮液室8连接的液体样品导入用流道45、与鞘液贮液室9连接的一对鞘液导入用流道46、上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧流动的流道5，在激光照射区域1的下游侧具有粒子分离区域39，在流道5的侧面连接有流道47。流道47为一组对应连接，在各流道47连接有脉冲泵。利用粒子通过激光照射区域1时发出的光信号，识别2种应分离的粒子，是应分离的粒子时，如图17所示，对流道5内流动的该微粒子，通过流道47预先提供对应2种分离的来自脉冲泵的脉冲流，使该粒子在流道5内的流位置发生偏移，基于该偏移，在流道5下游的分支流道中分离2个脉冲泵为OFF时的粒子、右侧脉冲泵为ON时的粒子、和左侧脉冲泵ON时的粒子。该分离原理是，通过在流道1的最下游形成与流道1上游的合流部分几乎对应的分支成3个的流道，液体样品和鞘液再次分开回收到3个分支流道，通常粒子流入中心的流道44，但因脉冲流偏移的粒子在脉冲为挤出流时流入流道42，在逆向脉冲流时流入流道43。另外，作为脉冲泵适用压电泵。利用压电提供的电压，可以控制1脉冲流的量。

[0116] 上述细胞分离方法用的流动室结构需要满足下面的条件。

[0117] 具有连接到液体样品贮液室8的液体样品导入用流道45、连接到贮液室9的一对鞘液导入用流道46、和上述流道合流且鞘液夹着液体样品在两侧流动的流道1，在激光照射区域的下游侧，在流道1的侧面连接有流道47，在流道1的最下游形成与流道1的上游的合流部分几乎对应分支成3个的流道。在流道47具有连接流动室外部的端口。图19表示具有流道47和仅仅1个脉冲泵的器件，在此只可以分离一种粒子。图17的脉冲泵的脉冲流为挤出方向，因此在脉冲泵连接有分选用供液箱。但是，在引进方向的情况下，需要分选用回收液箱。但是，由于脉冲流的引进量过多时，会连分离细胞一起引进，因此为了防止该现象，需要调节脉冲流量。从生物危害观点而言，对感染了病菌等的细胞进行分离时，优选液体样品被封入流动室内部的状态，所以优选脉冲流为挤出方向。上述微粒子分离原理是用脉冲流使微粒子流发生偏移，在下游的分支流道进行分离的方法。

[0118] 下面参考图18和图19说明不利用粒子流偏移的方法。该方法为对于通过检测区域1的细胞，利用其信号光的分析来实时判断是否是分离对象细胞，在该细胞到达具有流道分支的区域39的瞬间，如果该细胞为分离对象细胞，则与流道47的下游连接的脉冲泵产生引压脉冲，将目标细胞经流道47回收到贮液室48。图20为从侧面看流动室的截面图。区域39的上游侧为流动室的中心截面，但区域39的下游侧成为沿流道47的截面。流道47连接到分离细胞用贮液室48，该贮液室经空气用密封系统连接到脉冲泵41。由此，液体不流出流动室外部。该方法为用一次性流动室实现专利文献13记载的方法。分离成液体样品、鞘液和废液的细胞的回收液全部在流动室上。由此，确定了避免生物危害的细胞分离方法。

[0119] 下面参考附图21说明在流动室上按多级进行利用不同原理的细胞分离法的方法。

[0120] 该方法的目的在于从高密度夹杂粒子中分离出密度非常低的目标粒子。在此说明作为初级的粒子分离使用磁场，第二级利用上述脉冲流分离的方法。

[0121] 含有粒子的液体样品流动的流动室中，该流动室在透明基板中形成流道，且在该流道的上游侧和下游侧的基板上部分别形成贮液室，具有与上游侧的样品贮液室连接的液体样品导入用流道、与鞘液贮液室连接的鞘液导入用流道2、上述流道合流且将液体样品流限制成细流并以层流状态流动的流道3。在流道3的附近设置有电磁石，在液体样品流动的期间一直产生磁场。液体样品放入流动池的液体样品贮液室之前混合磁粒子和荧光抗体2中的至少一个，所述磁粒子为成为目标细胞标记的膜蛋白的抗体1附着到表面的磁粒子；
所述荧光抗体2为也成为目标细胞标记的另一膜蛋白的荧光抗体2。用于分离的目标细胞，因吸附到磁力线的空间密度大区域的引力而发生作用。由于该力，目标粒子从液体样品流移向鞘液流方向。通过该偏移，分离至下游侧的第一分离用流道50。在该阶段基于抗体1进行分离，在测定区域1测定是否至少附着抗体2，在判断为是检测出抗体2的细胞时，脉冲泵41通过引压脉冲第二分离流道52，作用于目标细胞并回收到分离细胞回收贮液室54。
由此，通过用不同分离方法配合不同抗体标记，提高细胞分离精度的方法。

[0122] 下面对在利用磁粒子的细胞分离中利用多个抗原抗体反应提高分离精度的器件进行说明。该方法的目的也是从高密度夹杂粒子中分离出密度非常低的目标粒子。专利文献16的热敏磁性纳米粒子为可通过温度控制溶液中聚集和分散的粒子。由于磁性粒子为0.1微米以下时，平均一个粒子的磁矩变小，以及由于布朗运动，外力对粒子的影响变大，从而磁分离需要强梯度磁场。但是，由于聚集的磁粒子成为磁矩大的粒子，所以在弱梯度磁场下也可以分离。热敏磁性钠米粒子由磁性粒子和热敏性聚合物构成，所以根据热敏性聚合物的性质，聚集和分散的边界的温度区域不同。因此，本发明提出多重磁多级分离方法，其特征在于，利用对聚集的温度区域不同的多个热敏磁性纳米粒子分别结合了不同抗体的粒子，在不同的聚集温度下依次进行磁分离。例如，从含有包含M抗原和N抗原双方的细胞、只包含某一抗原的细胞、和不包含任一抗原的细胞的细胞群中只分离出包含M抗原和N抗原双方的细胞的方法如下。将2种热敏磁纳米粒子作为A粒子和B粒子，在温度A下只有粒子A聚集，在温度B下只有粒子B聚集。对粒子A结合M抗体作为M抗体结合粒子A，对粒子B结合N抗体作为N抗体结合粒子B。在分离前的细胞液中混合M抗体粒子A和N抗体粒子B，利用抗原抗体反应结合。接着，通过保持温度A并在梯度磁场暴露，分离与粒子A结合的细胞被分离。即，分离出具有M抗原的细胞。接着，通过将只含有该分离的细胞的液体保持在温度B并用梯度磁场分离，进一步分离出具有N抗原的细胞。通过这两个阶段的分离，只分离出具有M抗原和N抗原双方的细胞。下面说明对该分离出的细胞液几乎没有丢失的确认是否为目的细胞的方法。将用不同波长的荧光作标记的M抗体和N抗体放入附有上述磁粒子的分离细胞液中，对分离出的细胞进行荧光染色。用流式细胞仪检测该液体样品。如图1、2、3、7、16、17、19所示，作为流式细胞仪采用具有在上游侧和下游侧形成贮液室的流动室的本发明的流式细胞仪。其理由是检测后液体样品也可以不被稀释地回收。
即，由于流道在下游侧的3个分支流道和上游侧的3个合流流道几乎是对应样式，因此液体样品和在其两侧夹着液体样品流动的鞘液在下游侧的分支流道再次分离并流动。从而防止液体样品被鞘液稀释，并被回收在中心的贮液室。通过上游的样品贮液室放入磁分离的细胞液，可在测定后也可以几乎不丢失地在下游回收细胞。但是，关于检测温度，必须在用于分离的多种热敏磁性纳米粒子全都为分散状态的温度下进行检测。这是因为聚集的粒子有可能会堵塞流道。因此，做成设置了控制流动室温度的机构的装置。该温度控制机构为用珀耳帖元件对用于设置所述流动室的部件进行加热冷却的结构。

[0123] (三)有益效果

[0124] 根据本发明，实现含有鞘液贮液室的整个液流系统可以与流动室芯片一起交换的流式细胞仪或细胞分选仪。另外，实现进行多样本的自动同时并行测定的流式细胞仪。另外，实现利用多个抗原抗体反应的细胞分离方法。

附图说明

[0125] 图1图示本发明的具有将表面底面作为反射面并将流道内发出的信号光引向外部的检测器的功能的流动室芯片。

[0126] 图2图示本发明的具有将表面底面及槽侧面作为反射面并将流道内发出的信号光引向外部的检测器的功能的流动室芯片。

[0127] 图3图示本发明的在流道侧面附近，具有在流动室形成反射面并将流道内发出的信号光向垂直于流动室平面的方面反射，并引向外部的检测器的功能的平面状流动室。

[0128] 图4图示本发明的利用反射内置流动室芯片同时对侧向散射光和前向散射光进行检测的装置的光学系统。

[0129] 图5图示本发明的将芯片内的反射面用于照射光的反射的光学系统。

[0130] 图6图示降低从流动室自身发出的荧光的结构。

[0131] 图7图示本发明的内置有贮液室和反射面的流动室芯片的结构。图示2种反射面。

[0132] 图8图示本发明的被芯片内形成的反射面反射并从侧面同时照射多流道的方法。

[0133] 图9图示本发明的利用设置在芯片外的反射面，从侧面同时照射多流道的方法。

[0134] 图10图示本发明的图8所示的流动室的平面图。

[0135] 图11图示本发明的使用偏转器高速扫描激光束，同时照射多流道，区别每个流道并测定的方法。

[0136] 图12图示本发明的用步进曝光依次移动流动室芯片，依次测定多流道的方法。

[0137] 图13图示本发明的形成多个液体样品贮液室、通用鞘液贮液室和多流道的多样本用流动室。

[0138] 图14图示本发明的将毛细管阵列作为流动室并扫描激光束，对应多样本的方式。

[0139] 图15图示图14的毛细管阵列的流动室截面。

[0140] 图16图示本发明的微粒子分离用流动室的第一例。

[0141] 图17图示利用图16的流动室芯片的微粒子分离方法。

[0142] 图18为在微流道内观察图17情况的照片。

[0143] 图19图示图16的微粒子分离方法中的1个泵的例子。

[0144] 图20图示本发明的微粒子分离用流动室的第二例。

[0145] 图21图示利用图20的流动室的微粒子分离方法。

[0146] 图22为图20的流动室的截面图。

[0147] 图23图示本发明的微粒子多级分离用流动室芯片的例子。

[0148] 【附图标记说明】

[0149]

[0150]

具体实施方式

[0151] 先说明通过在平板状流动室内形成反射面，达到不丧失一次性流动室的功能且实现侧向散射光的测定的流式细胞仪的实施例。

[0152] 图1为说明本发明的最简单的流动室结构的示意图。流动室的材质为丙烯基制透明树脂，在基板底面侧由射出成型形成凹的流道样式，在其上贴附厚度约100um的薄片形成流道。流道截面，典型的为宽度80微米、深度25至50微米。1示出照射区域，对应作为照射光的激光照射到流动室的流道中流动的微粒子的区域。液体样品10充填到液体样品贮液室8。该贮液室8连接到液体样品流道45。用于挤细液体样品而流动的鞘液13贮存在鞘液贮液室9内，贮液室9连接到鞘液流道46。对于液体样品流道45，鞘液流道46从两侧合流，流入一条流道5。如图1的AA截面图所示，贮液室9高于贮液室8，贮液室9为从外部通过空气施加压力的结构。对液体样品10和鞘液13同时施加该气压。该压力值的范围为2kpa至20kpa。由于该压力，液体样品和鞘液流到下游侧并合流之后，在流道5中，液体样品被挤细成为约10微米以下的宽度。在下游侧，与上游侧的合流的流道样式对应形成3个分支流道，由于是层流，鞘液和液体样品再次分离并回收到气压与大气相同的废液贮液室21和液体样品回收贮液室11。作为照射光，波长为473nm，输出10mW的半导体激光光源的光集中成直径约60微米，对流动室基板，从上向下垂直照射到区域1的流道5的中心。
在液体样品所含的粒子通过该照射区域的瞬间，将脉冲式地产生与照射波长波长相同的散射光和比照射波长波长长的荧光。其中，向侧方发出的信号光6被流动室基板的表面底面
4重复进行全反射，高效地到达端面。利用在附近设置的光导管，将从端面向外部发出的信号光引向光检测器，用带通滤波器15选择并检测波长。信号为脉冲信号，对每个粒子记录脉冲高度及脉冲面积等。本发明的内容为利用该流动室内部的全反射，检测侧方信号光，图
1为该内容的最简单的例子。上述例子中，检测器为1个，但也可以利用多个检测器进行多次波长分离，检测散射光和荧光。另外，作为光源，也可以同时用其他波长例如640nm的半导体激光照射，分别检测由该波长激发的荧光信号。

[0153] 在附近设置光引导器引向光检测器的原因是使检测光学系统不易受更换流动室时的位置多少有偏移的影响。

[0154] 图2通过在流动室基板形成一对槽7，垂直于基板平面从流道侧面附近至端面形成全反射面4，通过限制流道内发出的信号光6在基板面内的扩散的光引导器的功能，提高了信号光的检测效率。

[0155] 图3示出利用在流动室内形成的全反射面，对流道发出的向侧方的信号光，用不是设置在端面方向而是设置在表面的检测器进行检测的方法。该图为在表面反射的例子，但底面方向也是相同的。该图示出2种全反射面的位置，即基板内和基板端。任一种都是由树脂和大气的边界形成全反射面。在基板内形成的情况下，由于可以在流道侧面附近形成，所以具有在侧方的信号光扩大之前进行检测的优点。与此不同，将端面呈倾斜面作为全反射面的情况下，具有远离流道的缺点，但具有斜面形成在制造上的品质管理容易的优点。

[0156] 图4是用平板型流动室可以检测作为信号光的前向散射光之外，还可以检测侧向散射光和荧光的光学系统的例子。光源为473nm的半导体激光。侧向散射光利用流动室端面的全反射面，通过光导管和只让473nm的照射波长通过的带通滤波器检测。前向散射光的检测是用透镜将透过流动室底面的信号光变成平行光并反射473nm，用使比473nm长的光透过的二色镜14-1反射，用遮光板16截断照射光的直接透过光之后，经仅透过473nm的照射波长的带通滤波器，用光电二极管等光检测器检测。荧光的检测与前向散射光同样，在从透过流动室底面的信号光中的透过二色镜14-1的信号光中，利用二色镜14-2及带通滤波器15-2的组合、和作为最下游的检测光学系统的带通滤波器15-3选择荧光检测波长并用光电子倍增管检测。作为荧光检测波长的可选方案，在荧光试剂为FITC的情况下，510～550nm，在PI的情况下，570～620nm、在Cy5的情况下，660～720nm，在Cy7的情况下，750～
800nm。图7为俯视图4的流动室的示意图。反射面4形成在基板端面。液体样品的流速由上游侧的贮液室9内部的气压控制。

[0157] 图5中，将流动室基板内形成的全反射面用于照射光，从流动室基板面侧向对流道5照射时，透过流动室底面的光成为向侧方的信号光。

[0158] 但是，在此适用于后面说明的多样本用流动室具有更多优点。

[0159] 图6示出降低树脂制流动室自身发出的荧光的方法。作为透明树脂的丙烯基在波长400nm以上时存在少量的光吸收，所以照射473nm的强激光时，丙烯基的整个照射区域发出荧光。为了降低该荧光强度，使激光透过的照射区域比周围薄。这是克服2个缺点的方法，即如果将整个周围变薄，则流动室容易变形，相反如果将整个周围变厚，则来自流动室的荧光强度变强。该技术通过与流动室内形成全反射面并检测侧方信号光的技术相组合，可以降低侧方信号光的检测中的、尤其是荧光检测中的背景干扰光。

[0160] 下面对多样本用流式细胞仪的实施例进行说明。

[0161] 图8所示的实施例与图5相同，将对流动室基板内形成的全反射面用于照射光，从流动室基板面侧向对流道5照射的方式，在流动室上形成多个流道。图10为俯视该流动室的图。在此，由于在上游侧的贮液室27中没有液体，所以是用于对多个液体样品8施加通用气压的加压空间。在基板内等间隔阵列状形成对多个液体样品贮液室8进行1对1连接的流道。流道宽度为80微米，流道间隔也是80微米。照射激光贯通多个流道照射。照射光的直接透过光在其他全反射面向垂直于基板面的方向反射，并吸收到光吸收部件。这是因为如果没有该反射面，则照射光的透过光照射到端面，会产生成为强干扰的散射光。另外，吸收到光吸收部材的原因是如果光返回到流道，则会影响信号检测波形。如图8所示，检测光学系统为了区别并检测各个流道，在流道的成像面配置阵列光检测器。图9是不利用流动室内部的全反射而使用外部镜子的情况。

[0162] 多个流道互相平行。从流道界面发出的衍射光集中成直线状，所以可以用带状空间滤波器16容易去除掉。这是防止散射光信号的检测灵敏度恶化的方法。

[0163] 图11所示的实施例中，通过对照射激光进行高速扫描，一次测定多个流道中流动的多个液体样品的方法。激光光源将473nm的半导体激光校正为直径1mm，使用AO调制元件的偏转器29高速扫描激光的朝向。利用偏转器的后段的透镜18使朝向改变的波束平行，将朝向角度变化的扫描改变为平行移动的扫描。由于该偏转器的扫描频率为约40MHz，将光检测器的信号处理系统的响应频率设定为约20KHz，所以扫描快1000倍以上，从而从检测系统看照射系统认为是延伸至扫描宽度的线束。此时的多个流道，相互平行是很重要的流道行。其原因是来自流道壁面的衍射光仍然分布在垂直于流道壁面的方向，但如果多个流道的壁面平行，则各衍射光的分布成为直线状，因此可以用较窄的带状遮光板去除掉。该遮光板为用于在前向散射光检测光学系统中截断照射光的透过光的空间滤波器16。

[0164] 检测光学系统为了区别并检测多个流道，作为成像光学系统在流道的成像面26设置阵列检测器23。与图8及图10相同，图11的流动室不需要鞘流。

[0165] 图12所示的实施例为不是同时并行测定而是依次测定多个流道的方法。在此，检测时间与同时并行测定相比变长，但由于检测光学系统不需要区别流道，所以与图1同样，不需要成像光学系统和阵列检测器。依次测定多个流道的方法可以使用2种方式，即用步进曝光移动流动室的方式、和将照射激光的扫描设为步进曝光的方式。

[0166] 图13为适于步进曝光方式的流动室结构。与图1相同，由于此时的照射激光的大小为仅测定单个流道的波束大小，多个流道均被鞘流限制成液体样品流宽度为10微米以下。移动激光的区域为区域1。由于是步进曝光方式，所有流道的宽度为80微米，间隔也为80微米，全都一样。对所有样品流，从通用鞘液贮液室9经对应各液体样品流的一对鞘液导入端口32供给。通过贮液室9的加压，多个液体样品同时流动，但为了在液体样品从液体样品贮液室消失之前完成各样品的测定，利用压力调整样品流速和测定时间。流道宽度80微米、深度25微米的情况下，贮液室9的气压为20kpa的加压条件下，100微升的液体样品持续流动30分钟以上。液体样品贮液室的个数为8个，对于1个样品的测定时间为1分，流道间移动为2秒，从而在10分钟以内完成8个样品的测定。废液经连接到各流道的回收端口33贮存在废液贮液室21。废液贮液室21是大气压。

[0167] 图14不是在流动室上形成整个液流系统的流式细胞仪的实施例。但是，由于是使用一次性流动室时的缺点的多样本的自动测定的实施例，而且是利用本发明的激光束高速扫描的方法，所以作为本发明的实施例记载。在此，作为流动室阵列状固定了微毛细管，以毛细管阵列宽度以上的长度对照射激光束进行高速扫描的方式。与图11的情况相同，激光光源和检测光学系统为了区别各个毛细管，使用成像光学系统和阵列检测器。毛细管为石英制，内径为75微米，外径为150微米。如图15所示，作为流动室用折射率为1.42的折射率匹配液填满间隙并用2张石英板夹持固定8根毛细管。由此，降低激光照射毛细管表面时发出的反射光和衍射光的强度。作为多样本的预处理用例如使用96孔板。放入样品的孔呈8×12的矩阵状，利用调整夹具35使8根毛细管在96孔板的8行上间隔一致，每测定一列，重复12次板的上下移动和列方向的移动和液体样品吸引测定，则完成96种样品测定。

[0168] 下面，说明使用一次性流动室的细胞分离装置的实施例。

[0169] 图16表示本发明的微粒子分离用流动室的第一个例子。与图1所述的流动室相同，流动室的材质为丙烯基制树脂，在基板底面侧用射出成型形成凹的流道样式，在其上贴附厚度约100um的薄片并形成流道。图16的流动室的结构为基于图1的结构，分选流道47从两侧连接到流道5的流道样式，在各流道47经导管连接有流动室外部的脉冲泵41。流道5的流道宽度为80微米，深度为25微米。与此不同，流道47的流道深度同样为25微米，但流道宽度与流道深度相同，为25微米。其原因是射出成型用的模具加工中，槽宽度和深度之比为1的值为当前的实用加工极限。流道深度为50微米时，流道47的宽度必需为50微米。脉冲泵通过压电元件的伸缩运动工作。压电泵具有最大100Hz的时间响应性，脉冲压力约0.9Mpa的性能。每1个脉冲调节为0.5纳立升的流量。每1脉冲的细胞分离空间分解性能由用流道截面积和流速除1脉冲流量的值确定，流道宽度80微米、深度50微米、200毫米/秒的速度的情况下，成为125微米。另外，压电元件抵抗压缩应力强，但拉伸应力容易被破坏，所以只可以利用施加压缩应力的延伸方向上产生的力的变位。因此，需要对一方向的脉冲流对应一个压电泵。由于脉冲流为挤出方向，所以在压电泵连接了分选用供液箱。
在该箱内有PBS缓冲液，该缓冲液必须为即使向流道5中流动的细胞混合脉冲流也不损伤细胞。压电泵产生脉冲流的时间，可以按检测微粒子通过检测区域1的瞬间发出的散射光和荧光的信号之后的延迟时间设定。该延迟时间是粒子从检测区域1到达分离区域39的时间。因此，该延迟时间根据粒子速度设定。基于散射光和荧光的信号强度分布，实时判断是否是目标粒子，在判断为目标粒子的情况下，将仅对应2种目标之一的压电泵设为ON。该过程基于信号光的信号处理结果，在信号检测经过一定延迟时间后，向对应的压电泵的压电泵驱动电路发送触发信号，驱动电路将1脉冲份的电压信号输入给压电泵，使压电泵成为ON。目标粒子的流动位置受到脉冲流而偏移。如图17所示，在下游的3个分支流道中，中心的分支流道44为在脉冲泵OFF状态下粒子流入的流道，脉冲泵ON状态下，由于脉冲流引起的偏移，流入分支流道42。图18为观察流动因脉冲流而偏移瞬间的照片。通过仅对液体样品放入染料，将液体样品的流线可视化。压电泵OFF状态下，可知液体样品被鞘液夹着并在流道的中心部流动，但如果从下游的侧面流道施加脉冲流，则液体样品流偏移。

[0170] 以上，在2条分选流道47相对流道5对置连接的流动室分离2种目标粒子，但如图19所示，也可以仅用1条流道47分离一种目标粒子。

[0171] 下面，不是利用脉冲流引起的目标粒子流的偏移，而是根据附图20说明根据脉冲流本身选取目标粒子的例子。图20的流动室，在检测区域1被识别为应分离的粒子的粒子通过粒子分离区域39的瞬间，利用连接到流道47的脉冲泵选取引入流道47内的脉冲流，分离的粒子贮存到分离粒子用贮液室48。图21示出该分离情况。图22为该流动室结构的截面图。分离粒子用贮液室48和脉冲泵经空气连接。从而分离粒子贮存在分离粒子用贮液室48内。但是，脉冲流工作时的体积在分离粒子贮液室的体积以上时，分离粒子液流入脉冲泵，所以为了防止该现象，对于1个样品的分离处理的脉冲个数进行限制。使用的脉冲泵每1个脉冲的流量为约0.5纳升，分离粒子贮液室为200微升，所以最大分离脉冲个数限制在400000次以下。通过该方案，成为分离对象的细胞不会漏到流动室外部，实现解决了生物危害问题的细胞分离装置。图20为只设置1个脉冲泵的图，与图16同样，具有3条下游分支流道，在两侧经贮液室设置脉冲泵，从而可以分离2种粒子。此时的信号处理至脉冲泵工作的过程与图16的实施例相同。

[0172] 下面，说明在流动室多级进行利用不同原理的细胞分离法的方法的实施例。图23示意性示出在一个流动室内进行的初级利用磁场进行分离、在后级利用脉冲流进行分离的结构。液体样品为在含有各种细胞的样本混合了涂敷有与成为分离目标的细胞的膜蛋白结合的抗体的磁粒子、与目标细胞的另一膜蛋白结合的荧光抗体(荧光试剂为Cy5等)、和为了区别细胞和生物膜断片的核染色剂(SYT09等)的液体。与图1的流动室同样，在上游侧，在鞘液贮液室9内形成液体样品贮液室8。但是，在本实施例中1个鞘液用流道46就足够。这是因为在流道5内，液体样品10集中在流道端并流动即可，没有必要如图1所示那样集中在中心部。由此，在粒子分离区域39-1，因磁石散发的磁力线，具有磁矩的磁粒子聚集到磁力线密度大的区域。磁场强度由电磁石的电流调整，关于磁场的磁粒子的游动速度，用压力调节样品流速，以使通过粒子分离区域39-1的期间产生充分的偏移量。由于第一分离流道50和废液用流道53的关系是，几乎对应于上游侧的流道45和流道46形成流道，所以鞘液在下游分离并流入流道50。从而，磁粒子因磁场向鞘液侧流动时，流入第一分离流道50。照射激光的微粒子测定区域1设定在流道50内。作为激光光源，使用了473nm和640nm的2种半导体激光。因为473nm激光用于激发SYT09，640nm激光用于激发Cy5。将该2种激光以160微米波束均匀照射到流道50，该160微米波束比流道50的流道宽度
80微米宽。在该区域发出荧光抗体的荧光和核染色剂的荧光的粒子，与图4所示的检测光学系统同样，用二色镜和带通滤波器分离并检测波长。在该下游的第二分离流道52，利用从连接的流道47引入的脉冲流贮存在分离细胞贮液室54。脉冲泵经空气与贮液室54连接，使泵侧不流出分离细胞液。该解决方案与图22所述的生物危害解决方案相同。通过上述，在流动室上实现了磁分离和利用荧光信号分离脉冲流的分离。

[0173] 下面记载利用多种热敏磁性纳米粒子的多级磁分离的实施例。作为热敏磁性粒子使用3种，即Magnabeat公司制造的Therma-MAX LSA Streptavidin、Therma-MAX UB Biotin和Therma-MAX LB Biotin。这些粒子的平均粒径为约100nm。Therma-MAX LSA Streptavidin具有在30℃以上聚集，在20℃以下分散的性质，在粒子表面结合有链卵白素，可涂敷与白欧代因结合的各种抗体的热敏磁性粒子。Therma-MAX UB Biotin具有在10℃以上为分散状态，在4℃以下为聚集的性质，在粒子表面结合有白欧代因，可涂敷与卵白素结合的各种抗体的热敏磁性粒子。Therma-MAX LB Biotin具有在32℃以下分散且在
42℃以上聚集的性质，在粒子表面结合有白欧代因，可涂敷与卵白素结合的各种抗体的热敏磁性粒子。

[0174] 将3种抗体，即对上皮细胞特异表达的表面抗原(EpiCAM)的单克隆抗体(抗EpiCAM)、对细胞角蛋白的单克隆抗体(抗CK)、对CD45的单克隆抗体(抗CD45)与上述3种粒子对应结合。将这些磁粒子称为抗EpiCAM粒子、抗CK粒子、抗CD45粒子。10mL以下的血液样本混合上述3种粒子，产生3种抗原抗体反应。接着，通过在抗CD45粒子聚集的42℃下接近磁石，使梯度磁场起作用，对每个粒子将吸附在抗CD45粒子的细胞从血液样本中去除。接着，在EpiCAM粒子聚集的30℃下接近磁石，使梯度磁场起作用，对每个粒子回收吸附在抗CD45粒子的细胞，对每个粒子悬浮PBS缓冲液。

[0175] 通过在温度4℃下接近磁石使梯度磁场起作用，回收吸附在抗CK粒子的细胞，最终悬浮于100uL的PBS缓冲液。该最终悬浮液含有抗EpiCAM粒子和抗CK粒子，从而在保持抗EpiCAM粒子和抗CK粒子分散的20℃的状态下，用具有本发明所示的可回收液体样品的流动室的流式细胞仪测定细胞总数，并回收测定后的细胞。该细胞根据特开2007-178193为血液中所含的浮游细胞，其对应于成为扩散原因的血液中循环的癌细胞。

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