[0001] 本申请要求2017年5月19日提交的美国临时专利申请序列号62/508881的优先权，将所述专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。政府权利

[0002] 本发明是根据由国家心肺血液研究所(National Heart Lung and Blood Institute)授予的合同K08HL107450-01和R01HL128734-01A1以及由国家过敏与传染病研究所(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)授予的合同1U19AI109662、U19AI057229和U54I117925在政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。

[0003] 本发明涉及药物基因组学领域，其应用一种或多种基因组生物标记以及相关的诊断方法、装置、试剂、系统和试剂盒，用于预测个体对用于治疗包括肺高血压在内的某些病症的治疗剂的选择和使用的不同反应(例如像，功效或不良作用)。本发明涉及恩扎妥林(enzastaurin)和升高或诱导脆性组氨酸三联体(FHIT)的其他药剂用于治疗FHIT有缺陷的病症的用途。具体地，本发明涉及可与使用恩扎妥林和其他FHIT升高剂对肺高血压、肺气肿和与减少或不足的FHIT相关的其他病症的治疗结合使用的生物标记。这些FHIT升高剂可用于治疗呈现在肺高血压WHO分类所覆盖疾病(如(但不限于)肺高血压(PH)、肺动脉高血压(PAH)、慢性阻塞性肺病(COPD)和肺气肿)中发现的升高的右心室收缩压(RVSP)、右心室肥大、心肌纤维化、肺血管重建(即，血管损失和血管肌化)或肺气肿的疾病。

[0004] 肺动脉高血压(PAH)是特征在于进行性闭塞性肺血管病变，最终导致右侧心衰竭和寿命显著缩短的毁灭性疾病。骨形态发生受体2(BMPR2)基因中的突变存在于约75％的家族性PAH(FPAH)患者中(1)，从而将BMPR2与所述疾病的发病机制明确地联系起来。尽管在许多特发性PAH(IPAH)和FPAH患者中报道了BMPR2突变和降低的BMPR2表达(2-4)，但是令人惊讶的是，仅有相对较小比例(约20％)的BMPR2突变携带者显露出临床PAH表型，表明另外的环境或遗传因素或‘二次打击(second hit)’通过将BMPR2信号传导降低至低于临界阈值或靶向与PAH发病机制相关的非BMPR2依赖性途径来参与疾病发生。

[0005] 当前PAH治疗是不足的，因为大多数被批准的PAH药物主要起血管扩张剂或潜在的RV稳定剂的作用(5)，从而使肺血管病变不受抑制地进展。需要治疗包括PAH在内的肺高血压和肺气肿的新治疗方法。本发明提供了改进的方法，在不受理论约束的情况下，相信所述方法可通过增加FHIT水平来起作用。对BMPR2信号传导的治疗性靶向被认为是不依赖BMPR2突变状态的改进PAH的有吸引力的策略(6-9)，因为已经显示所述策略使用增加BMPR2信号传导的改变用途的药物FK506是有效的(10-12)。因此，我们的目标是鉴定并在药学上靶向在FPAH和IPAH患者以及具有降低的FHIT表达或活性的其他患者体内增加BMPR2信号传导或表达的BMPR2修饰基因。

[0006] 本文所提供的数据合并了调控BMPR2信号传导的基因的系统性高通量siRNA筛选(HTS)与公共可获得的PAH RNA表达的新型多群组和多组织分析方法。siRNA筛选鉴定出了BMPR2激活基因，所述BMPR2激活基因在被敲低时降低BMPR2信号传导，如通过ID1表达所评估。用公共可获得的PAH基因表达数据集中一致地下调的基因交叉验证这些基因显示，BMPR2修饰基因在PAH中是临床上相关的。结果指示，这些基因的上调会改进患有肺高血压和类似障碍的受试者的临床结果，并且显示，脆性组氨酸三联体(FHIT)是PAH中的潜在修饰基因，并且在体外和在体内，降低的FHIT表达与降低的BMPR2信号传导和内皮细胞(EC)功能障碍相关。

[0007] FHIT是组氨酸三联体家族的成员，位于3号染色体上，与FRA3B基因座重叠(13)，所述FRA3B基因座是对复制压力和相关缺失最敏感的人常见脆性位点。肿瘤抑制基因FHIT在暴露于致癌物或应激物(如吸烟和UV辐照)后易于损失(14、15)。FHIT在肺中高度表达(16)，并且一般在肺癌和其他恶性肿瘤中损失(17、18)。此外，FHIT牵涉在多种细胞类型的细胞凋亡和增殖中(19、20)，潜在地将其与在PAH内皮和平滑肌细胞(PASMC)中观察到的异常增殖表型联系起来。FHIT和BMPR2表达被恩扎妥林上调，恩扎妥林是在III期临床试验中测试用于预防淋巴瘤复发的安全且耐受良好的药物(21)。本文中已经令人惊讶地显示，通过恩扎妥林增加FHIT预防并逆转实验性PH进展。这证实，FHIT在PH发病机制中在机制上是重要的，并且恩扎妥林或其他FHIT增强剂将可用于PAH和类似的FHIT缺陷型病症的临床治疗。摘要(22)。

[0008] 以下发明内容并不意图用于限制要求保护的主题的范围。根据包括附图和所附权利要求中披露的那些方面在内的详细说明，要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将是清楚的。

[0009] 本发明的一个实施例包含FHIT作为生物标记用于预测PH疾病状态的用途。本发明的另一个实施例包含FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂(由于它们作为不依赖PKC抑制的FHIT升高剂起作用)在具有患上肺高血压或其症状的风险因素的哺乳动物中作为预防性或改善性治疗策略的用途。本发明的另一个实施例包含减轻展现肺高血压症状的哺乳动物的肺高血压的方法，所述方法采用FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂以升高FHIT水平。在某些实施例中，所述方法包括向患有肺动脉高血压的哺乳动物以足以降低血压并升高FHIT水平的剂量施用FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。在一些情况下，哺乳动物可以是小鼠、大鼠或人。在特定情况下，哺乳动物患有由BMPR2基因的一个等位基因敲除引起的遗传性肺动脉高血压(例如，FPAH)。在特定情况下，肺高血压是由FHIT基因在两个等位基因上的纯合敲除引起的。在特定情况下，肺高血压是通过诱导FHIT引起的，例如通过在施用Sugen5416和暴露于慢性低氧后诱导实验性肺高血压。在特定情况下，FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂能以足以实现右心室大小和右心室收缩压的降低的剂量口服施用。

[0010] 在一个方面中，本发明提供了预防和/或治疗需要预防和/或治疗的受试者的肺高血压和/或肺气肿的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的：1)提供或增强脆性组氨酸三联体(FHIT)的水平和/或活性的药剂；和/或
2)恩扎妥林。
这个方面包括恩扎妥林在疗法中的用途，特别是恩扎妥林用于治疗肺高血压或肺气肿的用途。这个方面还包括恩扎妥林用于制造药物、特别是治疗肺高血压或肺气肿的药物的用途。

[0011] 在另一个方面中，本发明提供了具有治疗效用的组合，所述组合包含：1)在受试者体内提供或增强脆性组氨酸三联体(FHIT)的水平和/或活性的药剂和/或恩扎妥林；和
2)预防和/或治疗肺高血压和/或肺气肿的第二预防剂或治疗剂。

[0012] 在另一个方面中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含有效量的恩扎妥林或包含恩扎妥林的组合(如上述的那些)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这个方面包括增加FHIT的活性的药剂(如恩扎妥林)用于制造药物的用途，所述药物优选地包括药学上可接受的载体或赋形剂。这个方面还提供了包含增加FHIT的活性的药剂(如恩扎妥林)和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的组合在疗法中的用途，其中在疗法中的用途是用于治疗肺高血压或肺气肿，包括本文所述的这些病症的形式，如FPAH、PAH和/或iPAH。

[0013] 在另一个方面中，本发明提供了预防和/或治疗需要预防和/或治疗的受试者的肺高血压和/或肺气肿的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的恩扎妥林或包含恩扎妥林的组合(如上述的那些)、包含有效量的恩扎妥林(包括包含恩扎妥林的组合(如上述的那些))的药物组合物。

[0014] 在又另一个方面中，本发明提供了评估受试者的肺高血压和/或肺气肿的方法，所述方法包括：a)提供来自受试者的样品；
b)评估所述样品中的FHIT和/或BMPR2水平和/或活性以评估所述受试者的肺高血压和/或肺气肿。

[0015] 在又另一个方面中，本发明提供了选择患有肺高血压的受试者以便用恩扎妥林或包含恩扎妥林的组合物治疗的方法，所述方法包括：a)提供来自受试者的样品；
b)评估所述样品中的FHIT和/或BMPR2水平和/或活性以评估恩扎妥林用于治疗所述受试者的肺高血压和/或肺气肿的适合性。如果FHIT和/或BMPR2的水平低(例如，低于正常水平至少50％或低于正常水平至少80％)或不可检测，则认为受试者适于用恩扎妥林或其他FHIT升高剂治疗。

[0016] 在又另一个方面中，本发明提供了减轻哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的脆性组氨酸三联体(FHIT)升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂，其中施用的剂量低于1000mg/天并且足以降低所述哺乳动物的血压。

[0017] 在又另一个方面中，本发明提供了减轻具有低或不可检测水平的FHIT的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：从所述哺乳动物获得血液样品；
确定所述血液样品中的FHIT水平；以及
如果所述样品具有低或不可检测水平的FHIT，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0018] 在又另一个方面中，本发明提供了减轻具有低或不可检测水平的FHIT的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得组织样品；
b.确定所述组织样品中的FHIT水平；以及
c.如果所述样品具有低或不可检测水平的FHIT，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0019] 在又另一个方面中，本发明提供了减轻具有低或不可检测水平的BMPR2的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得血液样品；
b.确定所述血液样品中的BMPR2水平；以及
c.如果所述样品具有低或不可检测水平的BMPR2，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0020] 在又另一个方面中，本发明提供了减轻具有低或不可检测水平的BMPR2的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得组织样品；
b.确定所述组织样品中的BMPR2水平；以及
c.如果所述样品具有低或不可检测水平的BMPR2，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0021] 在又另一个方面中，本发明提供了减轻具有BMPR2突变的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得组织样品；
b.分析所述组织样品的BMPR2突变；以及
c.如果检测到BMPR2突变，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0022] 在又另一个方面中，本发明提供了减轻具有BMPR2突变的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得血液样品；
b.分析所述血液样品的BMPR2突变；以及
c.如果检测到BMPR2突变，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0023] 在又另一个方面中，本发明提供了减轻具有FHIT突变的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得组织样品；
b.分析所述组织样品的FHIT突变；以及
c.如果检测到FHIT突变，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0024] 在又另一个方面中，本发明提供了减轻具有FHIT突变的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得血液样品；
b.分析所述血液样品的FHIT突变；以及
c.如果检测到FHIT突变，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0025] 在任何前述实施例中，治疗可以包括向有需要的受试者施用药学有效量的具有升高FHIT水平或活性的活性的双吲哚基马来酰亚胺或其类似物或衍生物。在一个实施例中，所述双吲哚基马来酰亚胺或类似物或衍生物是恩扎妥林或其类似物或衍生物：特别地，所述双吲哚基马来酰亚胺是恩扎妥林，其可以作为恩扎妥林的中性化合物或药学上可接受的盐来施用。

[0026] 本文中描述并启用本发明的其他方面和具体实施例。

[0027] 图1A至图1K：雄性FHIT-/-C57BL/6小鼠在慢性暴露于低氧后患上实验性PAH。

[0028] 图2A至图2F：雌性FHIT-/-C57BL/6小鼠在慢性暴露于低氧后患上实验性PAH。

[0029] 图3A至图3F：恩扎妥林预防低氧诱导的实验性PAH在C57BL/6小鼠中的发生。

[0030] 图4A至图4F：恩扎妥林在Sugen 5416/低氧大鼠中逆转血管闭塞、肺气肿、心肌纤维化并改进心输出量。

[0031] 图5：恩扎妥林需要FHIT而不是PKC来逆转肺高血压。

[0032] 图6A至图6C：通过siRNA高通量筛选和PAH荟萃分析鉴定BMPR2调控基因。

[0033] 图7A至图7I：PAH中减弱的FHIT表达与降低的BMPR2表达相关。

[0034] 图8A至图8M：siFHIT PAEC中的mRNA表达和微小RNA谱分析。

[0035] 图9A至图9J：恩扎妥林增加BMPR2上游信号传导分子FHIT在PAEC中的表达，并在FHIT缺陷型PAEC中逆转管形成、细胞凋亡、DNA损伤和增殖方面的PAH特异性功能缺陷。

[0036] 图10A至图10I：Fhit-/-C57BL/6小鼠在慢性暴露于低氧后患上实验性PH。

[0037] 图11A至图11K：恩扎妥林在SUGEN 5416/低氧大鼠中逆转血液动力学参数、严重血管重建、肺气肿、心肌纤维化和RVH。

[0038] 图12：在常氧与3周慢性低氧以及4周复氧中，与C57BL/6对照相比的Fhit-/-小鼠中的FHIT蛋白表达。

[0039] 图13A至图13D：Sprague Dawley大鼠肺中的PKC和p-PKC蛋白表达，在恩扎妥林治疗3周后比较常氧与Sugen/低氧条件。

[0040] 图14A至图14C用恩扎妥林治疗24h增加通过siRNA减少FHIT的PAEC中的FHIT、BMPR2和Id1表达。

[0041] 图15A至图15F：通过除了恩扎妥林以外的药物PKC抑制剂进行的PKC抑制不增加BMPR2信号传导和FHIT表达。

[0042] 图16：恩扎妥林而不是PKCβ抑制剂Ly333531减少PAEC中半胱天冬酶3/7介导的细胞凋亡。

[0043] 图17A至图17B：来自IPAH患者(无BMPR2突变)的代表性免疫组织化学载玻片。

[0044] 图18A至图18F：Fhit-/-C57BL/6小鼠在慢性暴露于低氧后患上实验性PAH。

[0045] 图19A至图19H：在FPAH和携带者与健康对照中BMPR2表达的性别差异。

[0046] 图20A至图20C：用恩扎妥林治疗24h增加通过siRNA减少FHIT的PAEC中的FHIT、BMPR2和Id1表达。

[0047] 图21A至图21D：通过FHIT敲低减少PAEC中的BMPR2和ID1是部分miR17-5依赖性的。

[0048] 图22：在低氧处理后，WT和FHIT-/-C57BL/6小鼠不发生RV纤维化。

[0049] 图23A至图23C：恩扎妥林在FHIT-/-小鼠中在低氧下使得免受增加的RVSP的影响并上调BMPR2/Id1mRNA。

[0050] 图24A至图24G：恩扎妥林预防低氧诱导的实验性PAH在C57BL/6小鼠中的发生。

[0051] 图25A至图25D：FK506和恩扎妥林在野生型C57BL/6小鼠中在低氧下对BMPR2/Id1而不是FHIT mRNA具有另外的作用，从而使得免受RVSP增加的影响。

[0052] 图26：Sprague Dawley大鼠肺中的代表性MOVAT肺组织学，在恩扎妥林治疗3周后比较常氧与Sugen/低氧条件。

[0053] 要求保护的主题的一个或多个实施例的详细描述与说明要求保护的主题的原理的附图一起提供于下文中。要求保护的主题是结合此类实施例来描述的，但是不限于任何特定实施例。应理解，要求保护的主题可以体现为各种形式，并且涵盖多种替代方案、修改和等效物。因此，本文所披露的具体细节并不被视为限制性的，而是被视为权利要求的基础和教授本领域技术人员在实际上任何适当的详细系统、结构或方式中采用要求保护的主题的基础。许多具体细节陈述于以下描述中以提供对本披露内容的充分理解。提供这些细节用于实例的目的，并且在没有这些具体细节中的一些或全部的情况下，可以根据权利要求实践要求保护的主题。应理解，在不背离要求保护的主题的范围的情况下，可以使用其他实施例并且可以进行结构变化。应当理解，一个或多个单独实施例中描述的各种特征和功能不会将所述特征和功能的适用范围限制于描述所述特征和功能的特定实施例。相反，所述特征和功能可以单独地或以某种组合应用于本披露内容的一个或多个其他实施例，不管此类实施例是否被描述，并且不管此类特征是否是作为所述实施例的一部分来呈现。出于清楚的目的，没有详细描述与要求保护的主题相关的技术领域中已知的技术材料，使得要求保护的主题不会不必要地含糊不清。

[0054] 本申请中所提及的所有出版物都是出于所有目的通过引用以其整体并入本文，并入程度如同每个单独出版物通过引用单独并入一般。

[0055] 所有标题都为了方便读者，并且除非如此规定，否则不应当用于限制在标题后的文本的含义。

[0056] 贯穿本披露内容，要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，以范围形式描述仅为了方便和简洁，并且不应当被视为对要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，应当将范围的描述视为已明确披露所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，该范围上限与下限之间的每个中间值以及该所述范围中的任何其他所述值或中间值均涵盖于要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖于要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括所述限值中的一个或两个时，不包括那些所包括限值中的任一个或两个的范围也被包括在要求保护的主题中。无论范围的宽度如何，这都适用。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被视为已经明确披露诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围，以及该范围内的单独数字，例如1、2、3、4、5和6。

[0057] 本文所述的方法是用于治疗具有以下中的任一种的患者的肺高血压：升高的右心室收缩压、右心室肥大、先前未肌化血管的肺血管新肌化和所述血管的周长的增加、肺血管损失、升高的肺血管新内膜形成、升高的肺血管中膜肥大。

[0058] 本发明涉及使用FHIT作为生物标记与使用FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂治疗肺动脉高血压相结合的方法。本发明涉及在家族性和特发性肺动脉高血压中使用FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂治疗肺动脉高血压。本发明还涉及FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂单独地或与先前规定的药物结合地用于改善肺动脉高血压中存在的血管闭塞表型、肺血管损失、升高的右心室收缩压、肺气肿、心肌纤维化和右心室肥大的用途。

[0059] 脆性组氨酸三联体(FHIT)是组氨酸三联体家族的成员，并且牵涉在多种细胞类型的细胞凋亡和增殖中(Accornero等人,1999；Toledo等人,2004)，从而潜在地将其与在PAH内皮和平滑肌细胞中观察到的异常增殖表型联系起来。认为FHIT在被Src激酶脱磷酸后发生降解(Pekarsky等人,2004,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊],101(11):3775-3779)。

[0060] FHIT升高剂恩扎妥林具有化学名称3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-4-[1-[1-(吡啶-2-基甲基)哌啶-4-基]-1H-吲哚-3-基]-1H-吡咯-2,5-二酮并且披露于美国专利5,668,152中，在所述专利中将恩扎妥林描述为蛋白激酶C(PKC)的抑制剂。因此，据报道，恩扎妥林的生物功能得自其对PKC进行的蛋白质磷酸化的抑制。其主要目标是抑制PKCβ激活；然而，其另外抑制细胞增殖和细胞存活途径中涉及的其他蛋白质(Gescher,1998,Gen Pharmacol.[普通药理学],31:721-728；Jarvis,Grant,1999,Invest New Drugs[研究性新药],17:
227-240；Parker,1999,Pharmacol.Ther.[药理学与治疗学],82:263-267)。FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂在多种细胞类型中抑制细胞生长、增殖，并诱导细胞凋亡。

[0061] 在II期试验中，恩扎妥林在研究持续期间显示出6个月的耐受性(Gray等人,Cancer[癌症]2013 119(5):1023-1032)。所报告的副作用包括皮疹、腹胀、低钠血症、DVT和低血压。由于使用这种药物实现的耐受性高、毒性极小并且副作用的数量和严重程度低，本文建议使用所述药物作为肺高血压的治疗和对有风险个体(如BMPR2的阳性突变状态)患上家族性肺高血压的预防。使用恩扎妥林实现的肺高血压疾病逆转是史无前例的，并且因此相信恩扎妥林或其他FHIT升高剂可用作肺高血压的治疗策略。

[0062] FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂可以单独地或与治疗或预防PH(包括PAH)的其他活性化合物组合地施用。其他活性化合物可以在与FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂不同的时间或相同的时间施用，并且在某些实施例中，FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂和其他活性化合物可以存在于同一配制品中，或者作为单独配制品存在于同一试剂盒中。治疗PH的示例性的其他活性化合物包括例如前列环素类似物、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶-5抑制剂、高剂量钙通道阻断剂、抗凝血剂、利尿剂或抗增殖剂。在特定情况下，其他活性化合物可以是例如Isordil(硝酸异山梨酯)、Revatio(西地那非)、Tracleer(波生坦)、Letairis(安贝生坦)、Flolan(依前列醇)、Adcirca(他达拉非)、Remodulin(曲罗尼尔)、Ventavis(伊洛前列素)、Tyvaso(曲罗尼尔)、Dilatrate-SR(硝酸异山梨酯)、Isordil Titradose(硝酸异山梨酯)、IsoDitrate(硝酸异山梨酯)或Isochron(硝酸异山梨酯)。A.一般技术

[0063] 除非另有指示，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有全面解释，所述文献是如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]”,第二版(Sambrook等人,1989)；“Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]”(M.J.Gait编辑,1984)；“Animal Cell Culture[动物细胞培养]”(R.I.Freshney编辑,
1987)；“Methods in Enzymology[酶学方法]”(学术出版社公司(Academic Press,Inc.))；
“Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南]”(F.M.Ausubel等人编辑,1987，和定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应]”(Mullis等人编辑,1994)。
B.定义

[0064] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文中所提及的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物都通过引用以其整体并入。如果本章节中陈述的定义与在通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中陈述的定义相反或在其他方面不一致，则在本章节中陈述的定义优先于通过引用并入本文的定义。

[0065] 如本文所用，除非另有指示，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。例如，“一种”二聚体包括一种或多种二聚体。

[0066] 如本文所用的术语“生物标记”或“标记”通常是指这样的分子(包括基因、蛋白质、碳水化合物结构或糖脂)，所述分子在哺乳动物组织或细胞中或者在哺乳动物组织或细胞上的表达或分泌的所述分子可以通过已知方法(或本文所披露的方法)来检测，并且预测或者可以用于预测(或辅助预测)哺乳动物细胞或组织对治疗方案的敏感性，并且在一些实施例中，预测(或辅助预测)个体对治疗方案的反应性。

[0067] 如本文所用，“药物基因组学生物标记”是这样的客观的生物标记，其与受试者的特定临床药物反应或敏感性相关(参见例如，McLeod等人,Eur.J.Cancer[欧洲癌症杂志](1999)35:1650-1652)。它可以是生物化学生物标记、或临床体征或症状。药物基因组学标记的存在或量与在施用药物之前预测的受试者对特定药物或药物种类的反应相关。通过评估受试者体内一种或多种药物基因组学标记的存在或量，可以选择最适合所述受试者的药物疗法或被预测具有较高成功度的药物疗法。例如，基于受试者体内特定肿瘤标记的DNA、RNA或蛋白质的存在或量，可以选择针对受试者体内可能存在的特定肿瘤的治疗加以优化的药物或疗程。类似地，特定序列突变或多态性的存在或不存在可能与药物反应相关。药物基因组学生物标记的使用因此允许对每名受试者应用最适当的治疗而不是必须施用疗法。

[0068] 如本文所用，术语“多态性基因座”是指核酸中的如下区域，在来自个体群体的大量核酸样品中在所述区域观察到两个或更多个替代性核苷酸序列。例如，多态性基因座可以是两个或更多个核苷酸的核苷酸序列、插入的核苷酸或核苷酸序列、缺失的核苷酸或核苷酸序列或微卫星。长度为两个或更多个核苷酸的多态性基因座的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、500个或更多个或约1000个核苷酸，其中所有或一些核苷酸序列在所述区域内不同。多态性基因座的长度经常是一个核苷酸，这在本文中被称为“单核苷酸多态性”或“SNP”。在一些实施例中，可以通过使用SNP来实施高密度基因分型。在一些实施例中，可以使用约1,000-5,000,000个或更多个SNP。在一些实施例中，高密度基因分型可以是基于阵列的。在一些实施例中，可以通过使用测序(如高通量测序)来实施高密度基因分型。

[0069] 在多态性基因座处存在2、3或4个替代性核苷酸序列的情况下，每个核苷酸序列被称为“多态性变体”或“核酸变体”。在存在两个多态性变体的情况下，例如，在来自群体的少数样品中表现的多态性变体有时被称为“次要等位基因”，并且更普遍表现的多态性变体有时被称为“主要等位基因”。许多生物体具有每个染色体的拷贝(例如，人)，并且具有两个主要等位基因或两个次要等位基因的那些个体关于多态性通常被称为“纯合的”，并且具有一个主要等位基因和一个次要等位基因的那些个体关于多态性通常被称为“杂合的”。与关于另一个等位基因杂合或纯合的个体相比，关于一个等位基因纯合的个体有时倾向于不同表型。

[0070] 单核苷酸多态性可以落在基因的编码序列内、基因的非编码区内或基因间区(基因之间的区域)中。由于遗传密码的简并性，编码序列内的SNP不一定改变所产生的蛋白质的氨基酸序列。

[0071] 编码区中的SNP具有两种类型，即同义和非同义SNP。同义SNP不影响蛋白质序列，而非同义SNP改变蛋白质的氨基酸序列。非同义SNP具有两种类型：错义和无义。

[0072] 不在蛋白质编码区中的SNP仍然可能影响基因剪接、转录因子结合、信使RNA降解或非编码RNA的序列。受这种类型的SNP影响的基因表达被称为eSNP(表达SNP)，并且可以位于基因的上游或下游。

[0073] 在鉴定一种或多种药物基因组学生物标记的遗传分析中，通常对来自在相关表型中具有不同值的个体的样品进行等位基因分型和/或基因分型。如本文所用的术语“等位基因分型”是指在来自病例和对照的合并的DNA样品中和/或在来自每名单独受试者的分离DNA样品中确定多态性变体的等位基因频率的过程。通过对来自每个组的DNA进行基因分型，计算每个组中每个基因座的等位基因频率。然后将这些等位基因频率相互比较。在一些实施例中，使用全基因组SNP阵列对DNA样品进行基因分型，所述全基因组SNP阵列是如由阿菲梅特里克斯公司(Affymetrix)(圣克拉拉，加利福尼亚州)和/或伊鲁米那公司(Illumina)(圣地亚哥，加利福尼亚州)制造的那些，如Affymetrix 500K阵列。除了Affymetrix阵列，还可以使用Illumina芯片和Sequenom MassArray。可以使用任何一种或多种合适的基因分型调用算法。在一些实施例中，基因分型调用是使用以下算法来产生的：使用马氏距离分类器(Mahalanobis Distance Classifier)的鲁棒线性模型(RLMM)算法、TM
使用贝叶斯步长(Bayesian step)的RLMM(BRLMM)算法、Axiom GT1算法、使用完全匹配探针的BRLMM(BRLMM-P)算法或Birdseed算法(Rabbee等人,Bioinformatics[生物信息学](2006)22:7-12；Korn等人,Nat Genet[自然·遗传学](2008)40:1253-60)。

[0074] 基因型或多态性变体可以根据“单倍型”来表示，单倍型如本文所用是指往往一起遗传的一组DNA变异或多态性。单倍型可以指代在同一染色体上发现的等位基因的组合或一组SNP。例如，两个SNP可以存在于基因内，在所述基因中每个SNP位置包括胞嘧啶变异和腺嘌呤变异。群体中的某些个体可能携带一个等位基因(杂合)或两个等位基因(纯合)，所述等位基因具有在每个SNP位置具有胞嘧啶的基因。在对应于基因中每个SNP的两个胞嘧啶在这些个体中的一个或两个等位基因上一起移动时，可以将所述个体表征为关于基因中的两个SNP具有胞嘧啶/胞嘧啶单倍型。

[0075] 有时，在未确定是否在大部分群体中表现多态性变体的情况下，在数据库中报告所述变体。因为这些所报告的多态性变体的子集在群体的在统计学上显著的部分中不表现，所述变体中的一些是测序误差和/或是生物学上不相关的。因此，在个体的群体中检测到所报告的多态性变体的存在并确定所述变体的频率之前，通常不了解所述变体是否在统计学上显著或在生物学上相关。如果多态性变体在群体的1％或更多中，有时在群体的5％或更多、10％或更多、15％或更多或者20％或更多中，并且通常在群体的25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多或者50％或更多中表现，则所述多态性变体在统计学上显著(并且可选地通常在生物学上相关)。然而，对于某些遗传性疾病和/或罕见病，变体可能占群体的极小百分比但仍然在生物学上相关。

[0076] 如本文所用，术语“样品”是指从感兴趣的受试者获得或衍生的组合物，所述组合物含有例如待基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征来表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。例如，短语“临床样品”或“疾病样品”及其变化形式是指从感兴趣的受试者获得的任何样品，可预期或已知所述样品含有待表征的细胞实体和/或分子实体。

[0077] 术语“组织或细胞样品”是指从受试者或患者的组织获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是来自新鲜的、冷冻的和/或保藏的器官或组织样品或活检或抽取物的实体组织；血液或任何血液成分；体液，如脑脊液、羊水、腹膜液或组织液；来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。组织样品也可以是原代或培养的细胞或细胞系。可选地，组织或细胞样品是从疾病组织/器官获得的。组织样品可以含有在自然界不与组织天然混杂的化合物，如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。

[0078] 本文中的生物样品可以是血浆、血清、全血或干血斑样品。如本文所用，“血浆(plasma)”或“血浆(blood plasma)”是指细胞外液(细胞外部的全部体液)的血管内液部分。血浆主要是水并且含有溶解的蛋白质、葡萄糖、凝血因子、无机离子、激素和二氧化碳(血浆是排泄产物运输的主要介质)。血浆是通过以下方式来制备的：在离心机中使含有抗凝血剂的新鲜血液的管旋转，直到血细胞落到管底部为止。然后倒出或吸出血浆。“血清”是不含纤维蛋白原或其他凝血因子的血浆(即，全血减去细胞和凝血因子二者)。

[0079] 如在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物中的任何取代物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸(如甲基化核苷酸)及其类似物。如果存在，可以在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步进行修饰，如通过与标记组分缀合来修饰。其他类型的修饰包括例如“帽”；用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如像具有不带电连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸酯等)和具有带电连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些；含有侧链部分的那些，所述侧链部分是例如像蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)；具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些；含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些；含有烷化剂的那些；具有修饰的连接(例如，α异头核酸等)的那些；以及所述一种或多种多核苷酸的未修饰形式。另外，通常存在于糖中的任何羟基均可以例如通过膦酸酯基团、磷酸酯基团来替代，通过标准保护基团来保护，或者被激活以制备与另外的核苷酸的另外的连接，或者可以被缀合至固体支撑物。5'和3'末端OH可以被磷酸化或者用胺或1至20个碳原子的有机加帽基团部分来取代。也可以将其他羟基衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域中通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，所述类似形式包括例如2'-O-甲基-2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、无环类似物和无碱基核苷类似物(如甲基核糖核苷)。可以用替代性连接基团替代一个或多个磷酸二酯连接。这些替代性连接基团包括但不限于如下实施例：其中用P(O)S(“硫代磷酸酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫代磷酸酯(dithioate)”)、“(O)NR2(“酰胺化物(amidate)”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲乙缩醛(formacetal)”)替代磷酸酯，其中每个R或R'独立地是H或者可选地含有醚(--O--)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)的取代的或未取代的烷基(1-20个C)。多核苷酸中并非所有连接都需要是相同的。上述描述适用于本文中所提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

[0080] 如本文所用，“寡核苷酸”通常是指短的、通常单链的、通常合成的多核苷酸，其长度通常但不一定小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非互相排斥的。上文针对多核苷酸的描述等同地并且全部地适用于寡核苷酸。

[0081] 如本文所用，“扩增”通常是指产生所需序列的多个拷贝的过程。“多个拷贝”意指至少2个拷贝。“拷贝”不一定意指与模板序列的完全序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物(如脱氧肌苷)、故意的序列改变(如通过包含可与模板杂交但不互补的序列的引物引入的序列改变)和/或在扩增期间出现的序列错误。

[0082] 如本文所用的术语“阵列”或“微阵列”是指可杂交阵列元件(如多核苷酸探针(例如，寡核苷酸)、珠或结合试剂(例如，抗体))在基板上的有序排列。基板可以是固体基板，如玻璃或二氧化硅载玻片、纤维光学粘合剂；或半固体基板，如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其任何排列。

[0083] 如本文所用，术语“表型”是指个体之间可以比较的性状，如病症的存在或不存在、个体之间可目测观察到的外表差异、代谢变异、生理变异、生物分子的功能变异等。表型可以是质的或量的。表型的实例是对诸如药物等治疗的反应性。

[0084] “反应性”可以使用指示对患者的益处的任何终点来评估，所述终点包括但不限于：(1)以一定程度对疾病进展的抑制，包括减慢和完全阻止；(2)疾病发作和/或症状数量的减少；(3)病灶大小的减小；(4)对疾病细胞浸润至相邻的周围器官和/或组织中的抑制(即，减少、减慢或完全停止)；(5)对疾病扩散的抑制(即，减少、减慢或完全停止)；(6)与障碍相关的一种或多种症状的一定程度的减轻；(7)治疗后无病表现期长度的增加；(8)在治疗后的给定时间点死亡率的下降；和/或(9)治疗后不良作用的缺乏。反应性还可以使用指示对患者的副作用和/或毒性的任何终点来评估。

[0085] “治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓和(alleviation)”是指治疗性治疗，其中目标是减慢(减小，如果不是治愈)所靶向的病理性病症或障碍或者预防病症复发。如果在接受治疗量的治疗剂之后，受试者显示特定疾病的一种或多种体征和症状的可观察到的和/或可测量的减少或不存在，则所述受试者被成功“治疗”。例如，癌细胞数的显著减少或癌细胞的不存在；肿瘤大小的减小；对肿瘤转移的抑制(即，以一定程度减慢且优选停止)；以一定程度对肿瘤生长的抑制；与特定癌症相关的一种或多种症状以一定程度缓解和/或减轻的长度的增加；降低的患病率和死亡率；以及生活质量问题的改进。患者也可以感受到疾病体征或症状的减少。治疗可以实现完全反应，完全反应定义为癌症的所有体征消失；或部分反应，其中肿瘤大小减小，优选减小超过50％、更优选减小75％。如果患者经历稳定疾病，也认为所述患者被治疗了。在一些实施例中，用治疗剂治疗有效地使患者在治疗后3个月、优选6个月、更优选1年、甚至更优选治疗后2年或更多年无疾病。用于评估疾病的成功治疗和改进的这些参数可通过本领域具有适当技术的医师熟悉的常规程序容易地测量。

[0086] 术语“预测”或“预后”在本文中用于指代患者将对药物或药物组有利地或不利地反应的可能性。在一个实施例中，预测涉及那些反应的程度。在一个实施例中，预测涉及在治疗(例如，用特定治疗剂治疗)后且在不存在疾病复发的某一时间段中，患者是否会存活或改进和/或患者会存活或改进的概率。本发明的预测方法可以在临床上用于通过选择对任何特定患者最适当的治疗方式来做出治疗决定。本发明的预测方法在预测患者是否可能对治疗方案有利地反应方面是有价值的工具，所述治疗方案是如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或组合、手术介入、类固醇治疗等。

[0087] 如本文所用，术语“特异性结合”是指特异性结合对的结合特异性。抗体在其他潜在靶标的存在下对特定靶标的识别是这种结合的一个特征。特异性结合涉及两种不同的分子，其中一种分子通过化学或物理方式与第二种分子特异性结合。在两种分子的相互结合使得它们能够区分它们的结合配偶体与具有类似特征的其他测定成分的意义上，这两种分子是相关的。结合组分对的成员被称为配体和受体(抗配体)、特异性结合对(SBP)成员和SBP配偶体等。分子也可以是分子聚集体的SBP成员；例如，可以将针对第二抗体与其相应抗原的免疫复合物产生的抗体视为免疫复合物的SBP成员。

[0088] 如本文所用，术语“同系物”用于指代与天然存在的核酸(即，“原型”或“野生型”核酸)因对天然存在的核酸的微小修饰而不同，但维持天然存在的形式的基本核苷酸结构的核酸。此类变化包括但不限于：一个或几个核苷酸的变化，包括缺失(例如，核酸的截短形式)、插入和/或取代。同系物可以具有与天然存在的核酸相比增强的、降低的或基本上相似的特性。同系物可以与天然存在的核酸互补或匹配。同系物可以使用本领域中已知用于产生核酸的技术来产生，所述技术包括但不限于重组DNA技术、化学合成等。

[0089] 如本文所用，“互补的”或“匹配的”意指，两个核酸序列具有至少50％序列同一性。优选地，两个核酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％的序列同一性。“互补的或匹配的”还意指，两个核酸序列可以在一种或多种低、中和/或高严格度条件下杂交。

[0090] 如本文所用，“基本上互补的或基本上匹配的”意指，两个核酸序列具有至少90％序列同一性。优选地，两个核酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。替代性地，“基本上互补的或基本上匹配的”意指，两个核酸序列可以在一种或多种高严格度条件下杂交。

[0091] 通常，杂合体的稳定性随离子浓度和温度而变。典型地，杂交反应是在较低严格度的条件下进行，之后进行不同但较高的严格度的洗涤。中等严格的杂交是指允许核酸分子(如探针)结合互补核酸分子的条件。杂交的核酸分子通常具有至少60％同一性，包括例如至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性中的任一个。中等严格的条件是等效于以下的条件：在50％甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSPE、0.2％SDS中在42℃下杂交，之后在0.2×SSPE、0.2％SDS中在42℃下洗涤。可以例如通过以下方式来提供高严格度条件：在50％甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSPE、0.2％SDS中在42℃下杂交，之后在0.1×SSPE和0.1％SDS中在65℃下洗涤。

[0092] 低严格度杂交是指等效于以下的条件：在10％甲酰胺、5×Denhardt溶液、6×SSPE、0.2％SDS中在22℃下杂交，之后在1×SSPE、0.2％SDS中在37℃下洗涤。Denhardt溶液含有1％Ficoll、1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(BSA)。20×SSPE(氯化钠、磷酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA))含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M(EDTA)。其他合适的中等严格度和高严格度杂交缓冲液和条件是本领域技术人员熟知的。

[0093] 如本文所用，术语“输出”是指从电脑算法产生的值或评分。输出可以使用本文所披露的生物标记作为电脑算法的输入基于测定结果来产生。“输出”可以是量的或质的，并且可以用于确定在伴随诊断测试中受试者对治疗的可能的反应性。

[0094] 应理解，本文所述的本发明的方面和实施例包括“由方面和实施例组成”和/或“基本上由方面和实施例组成”。

[0095] 本发明的其他目标、优点和特征将根据以下说明结合附图而变得清楚。C.列举的实施例

[0096] 以下列举的实施例代表本发明的一些方面。

[0097] 在第一实施例中，(1)本发明提供了一种预防和/或治疗需要预防和/或治疗的受试者的肺高血压和/或肺气肿的方法，所述方法包括将有效量的：a)提供或增强脆性组氨酸三联体(FHIT)的水平和/或活性的药剂；和/或
b)恩扎妥林，
施用至所述受试者。

[0098] 2.如实施例1所述的方法，所述方法是用于预防受试者的肺气肿。

[0099] 3.如实施例1所述的方法，所述方法是用于治疗受试者的肺气肿。

[0100] 4.如实施例1所述的方法，所述方法是用于预防受试者的肺高血压。

[0101] 5.如实施例1所述的方法，所述方法是用于治疗受试者的肺高血压。

[0102] 6.如实施例4或5所述的方法，其中所述肺高血压属于WHO I组，即肺动脉高血压(PAH)；WHO I'组，即肺静脉闭塞性疾病(PVOD)或肺毛细血管瘤病(PCH)；WHO I"组，即新生儿持续性肺高血压；WHOII组，即左心疾病继发的肺高血压；WHO III组，即由于肺病或慢性低氧所致的肺高血压；WHO IV组，即慢性动脉闭塞；或WHO V组，即具有不明确或多因素机制的肺高血压。

[0103] 7.如实施例6所述的方法，其中所述受试者具有升高的右心室收缩压(RVSP)；右心室肥大；心肌纤维化；肺血管重建，例如血管损失、血管肌化和/或新内膜形成；或肺气肿。

[0104] 8.如实施例6所述的方法，其中所述肺高血压是肺高血压(PH)、肺动脉高血压(PAH)、慢性阻塞性肺病(COPD)或肺气肿。

[0105] 9.如实施例1-8中任一项所述的方法，其中所述肺高血压或肺气肿在受试者中自发发生(例如，特发性PH)。

[0106] 10.如实施例1-8中任一项所述的方法，其中所述肺高血压或肺气肿基于受试者的遗传背景而发生(例如，家族性PH)。

[0107] 11.如实施例1-8中任一项所述的方法，其中所述肺高血压或肺气肿由于另一种疾病或障碍或与另一种疾病或障碍相关而发生，如继发于慢性阻塞性肺病(COPD)。

[0108] 12.如实施例1-11中任一项所述的方法，其中向受试者施用有效量的提供FHIT或其功能性片段的产生的药剂。

[0109] 13.如实施例12所述的方法，其中所述药剂包含被配置为在所述受试者体内产生FHIT或其功能性片段的多核苷酸。

[0110] 14.如实施例13所述的方法，其中所述多核苷酸是编码FHIT或其功能性片段的DNA分子。

[0111] 15.如实施例13所述的方法，其中所述多核苷酸是编码FHIT或其功能性片段的RNA分子。

[0112] 16.如实施例12所述的方法，其中所述药剂包含含有FHIT或其功能性片段的多肽。

[0113] 17.如实施例1-11中任一项所述的方法，其中向受试者施用有效量的增强FHIT或其功能性片段的水平的药剂，例如微小RNA，如miRNA17-5、微小RNA24a、微小RNA模拟物或微小RNA拮抗剂(antagomir)；或脱甲基化剂，如地西他滨。

[0114] 18.如实施例17所述的方法，其中所述药剂，例如恩扎妥林，增强编码FHIT或其功能性片段的DNA分子在所述受试者体内的表达。

[0115] 19.如实施例17所述的方法，其中所述药剂增强编码FHIT或其功能性片段的RNA分子在所述受试者体内的翻译。

[0116] 20.如实施例17所述的方法，其中所述药剂增强FHIT或其功能性片段在所述受试者体内的稳定性。

[0117] 21.如实施例20所述的方法，其中所述药剂包含激活的Gαq或结合至Gq偶联受体的激动剂，所述激动剂导致Gαq激活和与Gβγ复合物解离。[参见Hao等人,Cell Communication and Signaling[细胞通讯和信号传导],11(1):59,2013年8月]

[0118] 22.如实施例21所述的方法，其中所述药剂阻断或减少所述受试者体内FHIT或其功能性片段的降解。

[0119] 23.如实施例22所述的方法，其中所述药剂阻断或减少所述受试者体内FHIT或其功能性片段的磷酸化，例如Src介导的FHIT在Tyr114位点的磷酸化。

[0120] 24.如实施例1-11中任一项所述的方法，其中向受试者施用有效量的增强FHIT活性的药剂。

[0121] 25.如实施例1-11中任一项所述的方法，其中向受试者施用有效量的恩扎妥林。

[0122] 26.如实施例25所述的方法，其中向受试者施用有效量的恩扎妥林以预防所述受试者的肺气肿。

[0123] 27.如实施例25所述的方法，其中向受试者施用有效量的恩扎妥林以治疗所述受试者的肺气肿。

[0124] 28.如实施例25所述的方法，其中向受试者施用有效量的恩扎妥林以预防所述受试者的肺高血压。

[0125] 29.如实施例25所述的方法，其中向受试者施用有效量的恩扎妥林以治疗所述受试者的肺高血压。

[0126] 30.如实施例1-29中任一项所述的方法，其中所述药剂和/或恩扎妥林在受试者体内上调FHIT和/或骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)。

[0127] 31.如实施例30所述的方法，其中所述药剂和/或恩扎妥林在所述受试者体内通过微小RNA，例如miR17-5和/或miR27a，上调FHIT和/或BMPR2。

[0128] 32.如实施例30或31所述的方法，其中所述药剂和/或恩扎妥林在所述受试者体内上调FHIT和BMPR2。

[0129] 33.如实施例30-32中任一项所述的方法，其中所述药剂和/或恩扎妥林在受试者体内上调BMPR2，所述上调与所述药剂和/或恩扎妥林对FHIT的上调无关。

[0130] 34.如实施例1-33中任一项所述的方法，其中所述药剂和/或恩扎妥林预防和/或治疗受试者的肺高血压和/或肺气肿，所述预防和/或治疗与PKC抑制无关。

[0131] 35.如实施例1-34中任一项所述的方法，其中所述药剂和/或恩扎妥林通过改进右心室收缩压(RVSP)、RV肥大、心肌纤维化和/或血管重建来预防和/或治疗受试者的肺高血压和/或肺气肿。

[0132] 36.如实施例1-35中任一项所述的方法，其中所述药剂和/或恩扎妥林通过预防或降低RVSP增加、RVH增加、血管稀疏、肌化和/或远端血管的新内膜形成来预防和/或治疗受试者的肺高血压和/或肺气肿。

[0133] 37.如实施例1-36中任一项所述的方法，其中向患有或怀疑患有末期PH的受试者施用有效量的药剂和/或恩扎妥林。

[0134] 38.如实施例37所述的方法，其中所述末期PH的特征在于肺血管闭塞；增加的RVSP，例如RVSP>100mmHg；增加的平均PAP和/或PVR；右心衰竭；增加的RVH；降低的RV功能和RV扩张；和/或增加的间质纤维化。

[0135] 39.如实施例37或38所述的方法，其中用所述药剂和/或恩扎妥林治疗增加全肺中的FHIT和/或BMPR2表达，从而减少或逆转一个或多个肺血管闭塞，和/或减少以下中的至少一种：小血管和大血管的肌化、RVH、RV纤维化、RV扩张和RVSP、平均PAP、PVR，以及增加RV功能。

[0136] 40.如实施例39所述的方法，其中接受了治疗的受试者的肺动脉平均压(PAPm)和肺血管阻力(PVR)降低，并且心输出量(CO)增加。

[0137] 41.如实施例1-40中任一项所述的方法，其中所述受试者具有或怀疑具有低水平的BMPR2，或者具有或怀疑具有BMPR2突变。

[0138] 42.如实施例41所述的方法，其中所述受试者的BMPR2水平等于或低于未患肺高血压和/或肺气肿的受试者的BMPR2水平。

[0139] 43.如实施例41所述的方法，其中所述受试者具有BMPR2基因中的点突变、添加和/或缺失，例如BMPR2的配体结合、激酶和/或尾区中的点突变。

[0140] 44.如实施例1-43中任一项所述的方法，其中所述受试者具有或怀疑具有低水平的FHIT，或者具有或怀疑具有FHIT突变。

[0141] 45.如实施例44所述的方法，其中所述受试者的FHIT水平等于或低于未患肺高血压和/或肺气肿的受试者的FHIT水平。

[0142] 46.如实施例44所述的方法，其中所述受试者具有FHIT基因中的点突变、添加和/或缺失，和/或FHIT基因的异常甲基化状态。

[0143] 47.如实施例1-46中任一项所述的方法，其中以在约5mg/天至约1,000mg/天范围内的剂量施用所述药剂和/或恩扎妥林。

[0144] 48.如实施例1-47中任一项所述的方法，其中以获得在约20nmol/L至约6,000nmol/L范围内的体内水平的剂量施用所述药剂和/或恩扎妥林，所述体内水平是例如血清或血浆浓度。在这些实施例中的某些实施例中，所述体内水平是约20nmol/L至约
6000nmol/L的血浆浓度。在这些实施例中的一些实施例中，所述体内水平是约500nmol/L至约2500nmol/L、或约100nmol/L至约500nmol/L、或约20nmol/L至约100nmol/L的血浆浓度。

[0145] 49.如实施例1-48中任一项所述的方法，所述方法还包括向受试者施用药学上可接受的载体或赋形剂。

[0146] 50.如实施例1-49中任一项所述的方法，所述方法还包括施用有效量的预防和/或治疗受试者的肺高血压和/或肺气肿的第二预防剂或治疗剂。

[0147] 51.如实施例50所述的方法，其中预防和/或治疗肺高血压的所述第二预防剂或治疗剂是血管活性物质、前列腺素、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶5型抑制剂或可溶性鸟苷酸环化酶的激活剂。

[0148] 52.如实施例50或51所述的方法，其中预防和/或治疗肺气肿的所述第二预防剂或治疗剂是支气管扩张药物、类固醇药物或抗生素。

[0149] 53.如实施例1-52中任一项所述的方法，其中所述药剂和/或恩扎妥林是通过以下途径来施用：口服、经鼻、吸入、肠胃外、静脉内、腹膜内、皮下、肌内、真皮内、局部或直肠途径。

[0150] 54.如实施例1-53中任一项所述的方法，其中向受试者施用有效量的所述药剂和/或恩扎妥林以降低所述受试者的全身血压。

[0151] 55.如实施例1-54中任一项所述的方法，其中所述治疗导致接受了治疗的受试者的表明PAH症状的至少一种参数得以改进。在一些实施例中，这意味着所述治疗将所述受试者的平均PAP肺动脉压(PAPm)降低至低于25mmHg且优选低于20mmHg，将PVR降低至低于3WU，和/或将PAWP(肺动脉楔压)增加至高于15。在一些实施例中，改进表明PAH症状的至少一种参数是指通过心电描记器所测量的，可测量地改进所测量的右心室收缩压(RVSP)或肺动脉收缩压(PASP)或二者。在一些实施例中，改进表明PAH症状的至少一种参数是指可测量地改进平均肺动脉压(PAPm)、肺动脉楔压(PAWP)、心输出量(CO)和/或肺血管阻力(PVR)，所述参数可以例如通过右心导管插入术来测量。在一个这样的实施例中，在治疗前PAPm>25mmHg的受试者在治疗后展现PAPm<25mmHg且优选<20mmHg。在另一个实施例中，在治疗前患有1组PAH并展现PAPm>25、PVR>3WU且PAWP<15的受试者在治疗后至少一种参数发生改进，例如，PAPm<25，和/或PVR>3WU，和/或PAWP>15。

[0152] 56.如实施例1-55中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

[0153] 57.如实施例56所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0154] 58.如实施例56所述的方法，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物。

[0155] 59.有效量的在受试者体内提供或增强脆性组氨酸三联体(FHIT)的水平和/或活性的药剂和/或恩扎妥林用于制造预防和/或治疗所述受试者的肺高血压和/或肺气肿的药物的用途。

[0156] 60.一种组合，所述组合包含：1)在受试者体内提供或增强脆性组氨酸三联体(FHIT)的水平和/或活性的药剂和/或恩扎妥林；和
2)预防和/或治疗肺高血压和/或肺气肿的第二预防剂或治疗剂。
在一些此类实施例中，所述第二预防剂或治疗剂选自Isordil(硝酸异山梨酯)、Revatio(西地那非)、Tracleer(波生坦)、Letairis(安贝生坦)、Flolan(依前列醇)、Adcirca(他达拉非)、Remodulin(曲罗尼尔)、Ventavis(伊洛前列素)、Tyvaso(曲罗尼尔)、Dilatrate-SR(硝酸异山梨酯)、Isordil Titradose(硝酸异山梨酯)、IsoDitrate(硝酸异山梨酯)和Isochron(硝酸异山梨酯)。典型地，所述组合包含至少一种且优选两种或更多种药学上可接受的赋形剂。

[0157] 61.一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的如实施例60所述的组合以及药学上可接受的载体或赋形剂。

[0158] 62.一种预防和/或治疗需要预防和/或治疗的受试者的肺高血压和/或肺气肿的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施例60所述的组合或如实施例61所述的药物组合物。

[0159] 63.一种评估受试者的肺高血压和/或肺气肿的方法，所述方法包括：a)提供来自受试者的样品；
b)评估所述样品中的FHIT和/或BMPR2水平和/或活性以评估所述受试者的肺高血压和/或肺气肿。

[0160] 64.如实施例63所述的方法，其中所述样品是血液、血清、血浆或体液样品或其任何组合。

[0161] 65.如实施例63或64所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

[0162] 66.如实施例65所述的方法，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物，例如宠物、农场动物、伴侣动物或实验动物。

[0163] 67.如实施例65所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0164] 68.如实施例63-67中任一项所述的方法，所述方法还包括将在b)中评估的FHIT和/或BMPR2水平和/或活性与阈值或参考值、例如来自具有正常血压的可比较受试者的FHIT和/或BMPR2水平和/或活性进行比较，并且低于所述阈值或参考值的在b)中评估的FHIT和/或BMPR2水平和/或活性指示所述受试者患有肺高血压和/或肺气肿或者具有患上肺高血压和/或肺气肿的较高风险。

[0165] 69.如实施例63-68中任一项所述的方法，其中评估样品中的编码FHIT和/或BMPR2的多核苷酸的水平。

[0166] 70.如实施例69所述的方法，其中所述多核苷酸是编码FHIT和/或BMPR2的DNA分子。

[0167] 71.如实施例69所述的方法，其中所述多核苷酸是编码FHIT和/或BMPR2的RNA分子。

[0168] 72.如实施例63-71中任一项所述的方法，其中使用包括对编码FHIT和/或BMPR2的多核苷酸进行扩增、连接、杂交和/或测序的程序来评估样品中的所述多核苷酸的水平。

[0169] 73.如实施例72所述的方法，其中使用选自由以下组成的组的程序扩增所述多核苷酸：聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、引物延伸、滚环扩增(RCA)、自我持续序列复制(3SR)和环介导的等温扩增(LAMP)。

[0170] 74.如实施例72所述的方法，其中所述测序是用选自由以下组成的组的形式来实施的：马克萨姆-吉尔伯特(Maxam-Gilbert)测序、链终止法、鸟枪法测序、桥式PCR、单分子实时测序、离子半导体(离子激流测序)、合成测序、连接测序(SOLiD测序)、链终止(桑格测序)、大规模平行标签测序(MPSS)、聚合酶克隆测序(polony sequencing)、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、DNA纳米球测序、heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、纳米孔DNA测序、隧道电流DNA测序、杂交测序、质谱测序、微流体桑格测序(microfluidic Sanger sequencing)、基于显微术的技术、RNAP测序和体外病毒高通量测序。

[0171] 75.如实施例63-74中任一项所述的方法，其中评估样品中的包含FHIT和/或BMPR2的多肽的水平。

[0172] 76.如实施例75所述的方法，其中使用免疫测定评估样品中的包含FHIT和/或BMPR2的多肽的水平。

[0173] 77.如实施例76所述的方法，其中所述免疫测定选自由以下组成的组：酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹法、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)、免疫染色、乳胶凝集法、间接血凝测定(IHA)、补体固定、间接免疫荧光测定(IFA)、浊度测定法、流式细胞术测定、表面等离子体共振(SPR)、化学发光测定、侧流免疫测定、u-捕获测定、抑制测定和亲合力测定。

[0174] 78.如实施例63-77中任一项所述的方法，所述方法是用于受试者的肺高血压和/或肺气肿的诊断、预后、分层、风险评估或治疗监测。

[0175] 79.如实施例63-78中任一项所述的方法，所述方法具有至少50％的灵敏度。

[0176] 80.如实施例63-79中任一项所述的方法，所述方法具有至少50％的特异性。

[0177] 81.如实施例63-80中任一项所述的方法，所述方法还包括基于对受试者的肺高血压和/或肺气肿的评估来治疗所述受试者或改变所述受试者的治疗。

[0178] 82.如实施例81所述的方法，所述方法包括基于对人类患者的肺高血压和/或肺气肿的评估来治疗所述人类患者或改变所述人类患者的治疗。

[0179] 83.一种减轻哺乳动物的肺高血压和肺气肿的方法，所述方法包括：向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的脆性组氨酸三联体(FHIT)升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂，其中施用的剂量低于1000mg/天并且足以降低所述哺乳动物的血压。

[0180] 84.如实施例83所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0181] 85.如实施例83所述的方法，其中所述剂量提供等于或低于3500nmol/L的预测的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的血清浓度。

[0182] 86.如实施例83所述的方法，其中所述施用是口服的。

[0183] 87.一种减轻具有低或不可检测水平的FHIT的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得血液样品；
b.确定所述血液样品中的FHIT水平；以及
c.如果所述样品具有低或不可检测水平的FHIT，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0184] 88.如实施例87所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0185] 89.如实施例87所述的方法，其中所述剂量提供等于或低于3500nmol/L的预测的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的血清浓度。

[0186] 90.如实施例87所述的方法，其中所述施用是口服的。

[0187] 91.一种减轻具有低或不可检测水平的FHIT的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得组织样品；
b.确定所述组织样品中的FHIT水平；以及
c.如果所述样品具有低或不可检测水平的FHIT，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0188] 92.如实施例91所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0189] 93.如实施例91所述的方法，其中所述剂量提供等于或低于3500nmol/L的预测的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的血清浓度。

[0190] 94.如实施例91所述的方法，其中所述施用是口服的。

[0191] 95.一种减轻具有低或不可检测水平的BMPR2的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得血液样品；
b.确定所述血液样品中的BMPR2水平；以及
c.如果所述样品具有低或不可检测水平的BMPR2，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0192] 96.如实施例95所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0193] 97.如实施例95所述的方法，其中所述剂量提供等于或低于3500nmol/L的预测的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的血清浓度。

[0194] 98.如实施例95所述的方法，其中所述施用是口服的。

[0195] 99.一种减轻具有低或不可检测水平的BMPR2的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得组织样品；
b.确定所述组织样品中的BMPR2水平；以及
c.如果所述样品具有低或不可检测水平的BMPR2，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0196] 100.如实施例99所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0197] 101.如实施例99所述的方法，其中所述剂量提供等于或低于3500nmol/L的预测的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的血清浓度。

[0198] 102.如实施例99所述的方法，其中所述施用是口服的。

[0199] 103.一种减轻具有低或不可检测水平的BMPR2的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得组织样品；
b.确定所述组织样品中的BMPR2水平；以及
c.如果所述样品具有低或不可检测水平的BMPR2，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0200] 104.如实施例103所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0201] 105.如实施例103所述的方法，其中所述剂量提供等于或低于3500nmol/L的预测的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的血清浓度。

[0202] 106.如实施例103所述的方法，其中所述施用是口服的。

[0203] 107.一种减轻具有BMPR2突变的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得组织样品；
b.分析所述组织样品的BMPR2突变；以及
c.如果检测到BMPR2突变，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0204] 108.如实施例107所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0205] 109.如实施例107所述的方法，其中所述剂量提供等于或低于3500nmol/L的预测的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的血清浓度。

[0206] 110.如实施例107所述的方法，其中所述施用是口服的。

[0207] 111.一种减轻具有BMPR2突变的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得血液样品；
b.分析所述血液样品的BMPR2突变；以及
c.如果检测到BMPR2突变，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0208] 112.如实施例111所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0209] 113.如实施例111所述的方法，其中所述剂量提供等于或低于3500nmol/L的预测的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的血清浓度。

[0210] 114.如实施例111所述的方法，其中所述施用是口服的。

[0211] 115.一种减轻具有FHIT突变的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得组织样品；
b.分析所述组织样品的FHIT突变；以及
c.如果检测到FHIT突变，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0212] 116.如实施例115所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0213] 117.如实施例115所述的方法，其中所述剂量提供等于或低于3500nmol/L的预测的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的血清浓度。

[0214] 118.如实施例115所述的方法，其中所述施用是口服的。

[0215] 119.一种减轻具有FHIT突变的哺乳动物的肺高血压或肺气肿的方法，所述方法包括：a.从所述哺乳动物获得血液样品；
b.分析所述血液样品的FHIT突变；以及
c.如果检测到FHIT突变，则向患有肺高血压或肺气肿的所述哺乳动物施用有效量的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。

[0216] 120.如实施例119所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

[0217] 121.如实施例119所述的方法，其中所述剂量提供等于或低于3500nmol/L的预测的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的血清浓度。

[0218] 122.如实施例119所述的方法，其中所述施用是口服的。

[0219] 123.如实施例83-122中任一项所述的方法，其中所述化合物‘FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂’还被称为LY317615、D04014。

[0220] 124.如实施例83-122中任一项所述的方法，其中所述肺高血压或肺气肿呈现以下中的任何一种：升高的右心室收缩压(RVSP)、右心室肥大、心肌纤维化、肺血管重建(即，血管损失和血管肌化)或肺气肿。

[0221] 125.如实施例83-122中任一项所述的方法，其中所述肺高血压或肺气肿可以自发发生(特发性PH)。

[0222] 126.如实施例83-122中任一项所述的方法，其中所述肺高血压或肺气肿可以基于遗传背景而发生(家族性PH)。

[0223] 127.如实施例83-122中任一项所述的方法，其中所述肺高血压或肺气肿可以与另一种疾病相关而发生，如继发于慢性阻塞性肺病(COPD)。

[0224] 128.如实施例83-122中任一项所述的方法，其中使用FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂作为用于具有风险因素(即，BMPR2或FHIT的阳性突变状态)的哺乳动物的预防性措施。

[0225] 129.如实施例83-128中任一项所述的方法，其中肺高血压或肺气肿是指WHO分类I组(肺动脉高血压)、II组(肺静脉高血压)、III组(与慢性肺病相关的肺高血压)、V组(其他)。

[0226] 130.如实施例83-129中任一项所述的方法，其中预防或逆转肺高血压或肺气肿与PKC抑制无关，而是通过新型信号传导分子FHIT来进行。

[0227] 131.如实施例83-130中任一项所述的方法，其中药剂是指药物、化学物质、生物工程化的治疗方法和通过诸如CRISPR等技术进行的遗传修饰。

[0228] 132.FHIT升高剂用于治疗肺高血压的用途。

[0229] 133.如实施例132所述的用途，其中所述FHIT升高剂是恩扎妥林。

[0230] 许多具体细节陈述于以下描述中以提供对本披露内容的充分理解。提供这些细节用于实例的目的，并且在没有这些具体细节中的一些或全部的情况下，可以根据权利要求实践要求保护的主题。应理解，在不背离要求保护的主题的范围的情况下，可以使用其他实施例并且可以进行结构变化。应当理解，一个或多个单独实施例中描述的各种特征和功能不会将所述特征和功能的适用范围限制于描述所述特征和功能的特定实施例。相反，所述特征和功能可以单独地或以某种组合应用于本披露内容的一个或多个其他实施例，不管此类实施例是否被描述，并且不管此类特征是否是作为所述实施例的一部分来呈现。出于清楚的目的，没有详细描述与要求保护的主题相关的技术领域中已知的技术材料，使得要求保护的主题不会不必要地含糊不清。

[0231] 本发明涉及使用FHIT作为生物标记与使用FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂治疗肺动脉高血压相结合的方法。本发明涉及在家族性和特发性肺动脉高血压中使用FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂治疗肺动脉高血压。本发明还涉及FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂单独地或与先前规定的药物结合地用于改善肺动脉高血压中存在的血管闭塞表型、肺血管损失、升高的右心室收缩压、肺气肿、心肌纤维化和右心室肥大的用途。

[0232] 本文所述的方法适用于治疗具有以下中的任一种的患者的肺高血压：升高的右心室收缩压、右心室肥大、先前未肌化血管的肺血管新肌化和所述血管的周长的增加、肺血管损失、升高的肺血管新内膜形成和升高的肺血管中膜肥大。

[0233] 对肺高血压的治疗的有效性或进展可以使用本领域中已知的方法和参数来测量。例如，可以使用心电描记术测量RVSP和PASP，作为PH状态的间接量度。可以使用右心导管插入术测量平均PPAP(PAPm)、PAWP、心输出量和PVR。肺高血压通常定义为PAPm>25mmHg。1组PAH有时定义为PAPm>25，PVR>3WU并且PAWP<15。

[0234] 在II期试验中，FHIT升高剂恩扎妥林在研究持续期间显示出6个月的耐受性(Gray等人,Cancer[癌症]2013 119(5):1023-1032)。所报告的副作用包括皮疹、腹胀、低钠血症、DVT和低血压。

[0235] 由于使用这种药物实现的耐受性高、毒性极小并且副作用的数量和严重程度低，所述药物可用作肺高血压的治疗和对有风险个体(如BMPR2的阳性突变状态)患上家族性肺高血压的预防。使用FHIT升高剂恩扎妥林实现的肺高血压疾病逆转是史无前例的，并且本文提出了恩扎妥林作为肺高血压的治疗策略的用途。此外，恩扎妥林的有效性指示，也可以使用其他FHIT升高剂进行此类治疗。

[0236] FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂可以单独地或与治疗或预防PH的其他活性化合物组合地施用。其他活性化合物可以在与FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂不同的时间或相同的时间施用，并且在某些实施例中，FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂和其他活性化合物可以存在于同一配制品中，或者作为单独配制品存在于同一试剂盒中。治疗PH的示例性的其他活性化合物包括例如前列环素类似物、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶-5抑制剂、高剂量钙通道阻断剂、抗凝血剂、利尿剂或抗增殖剂。在特定情况下，其他活性化合物可以是例如Isordil(硝酸异山梨酯)、Revatio(西地那非)、Tracleer(波生坦)、Letairis(安贝生坦)、Flolan(依前列醇)、Adcirca(他达拉非)、Remodulin(曲罗尼尔)、Ventavis(伊洛前列素)、Tyvaso(曲罗尼尔)、Dilatrate-SR(硝酸异山梨酯)、Isordil Titradose(硝酸异山梨酯)、IsoDitrate(硝酸异山梨酯)或Isochron(硝酸异山梨酯)。

[0237] 与未受影响的突变携带者相比，BMPR2信号传导在FPAH患者中严重受损(29、42、43)，表明：i)BMPR2表达或信号传导的阈值，低于所述阈值时发生PAH，ii)BMPR2修饰因子的存在，或iii)促成PAH发病机制的另外的途径。

[0238] 我们在超过>22,000个基因的广泛siRNA HTS中鉴定出FHIT和LCK作为新型BMPR2修饰基因。为了证实在PAH中的可能的临床重要性，我们在包括所有PAH病因的PAH转录组数据库的新型多群组、多组织分析中交叉验证了两个基因的基因表达，并且证实，FHIT在所有数据集中都一致地且显著地下调。因为LCK的下调更可变，在这项研究中我们主要集中于理解FHIT在PAH中的作用。FHIT在PBMC中最一致地下调，PBMC被认为是PAH患者中用于普遍存在的基因表达的有效替代物(35、42、44、45、46)。我们分别在人PAH淋巴细胞、PAEC和肺组织中验证了我们的FHIT表达降低的发现。

[0239] 我们提出，FHIT是在具有BMPR2突变的易感个体中促进PAH的可变外显率的修饰基因，这与PAH发生的多次打击理论(multiple-hit-theory)一致。在支持下，PAH中BMPR2突变的20％的低外显率(1)与同样仅具有20％-45％外显率的BRCA1突变所致的乳腺癌的遗传易感性相当(47)。FHIT在散发性乳腺癌中用作疾病敏化剂，其中BRCA1和FHIT的一个等位基因损失导致较差预后和更具侵袭性的表型(47)。类似地，肺癌中FHIT和p53的同时损失通过使促增殖途径失调而使得易于发生侵袭性肺癌(48)。降低的FHIT是先决条件，但是不足以在体外诱导致癌表型(49)，这与Fhit-/-小鼠中增加的基因组不稳定性一致(50)。

[0240] 我们进一步提出，鉴于我们在不同PAH病因中都测量到降低的FHIT表达，低FHIT水平可能也促成在非家族性PAH患者中观察到的低BMPR2水平。PAH中降低的FHIT表达的机制是未知的并且应进行进一步研究。FHIT的表观遗传沉默或杂合损失可能由于其在脆性位点FRA3B上的位置而发生(13)，其中链断裂一般在低氧或致癌物暴露(如吸烟)后出现(51-53)。虽然据报道在健康成人中FHIT表达与FRA3B位点断裂无关(54)，但是在DNA损伤修复系统中通过p53增加的诱变剂敏感性和潜在的伴随缺陷(55)可能使PAH患者易发生FHIT减少。
替代性地，在恶性肿瘤(如肺癌)中观察到的(59-63)FHIT或其启动子的超甲基化(56-58)也可以解释PAH中的低FHIT表达。

[0241] 我们证实了，FHIT是BMPR2和Id1的上游调控剂，并且先前显示增加FHIT表达的药物恩扎妥林(64)增加PAEC中的FHIT、BMPR2和Id1表达。为了在机制上理解FHIT可能如何调控BMPR2信号传导，我们评估了所选BMPR2调控性微小RNA的表达。miR17-5和miR100都同样靶向血管(30、65)和非血管细胞(30、65、66)中的BMPR2。miR17-5通过白介素-6/STAT3介导的信号传导下调BMPR2(67)。降低的FHIT表达增加miR17-5，这种效应通过恩扎妥林来挽救。降低的FHIT表达增加miR27a，miR27a是据显示在末期PAH患者的PBMC中增加的miRNA(11)。
miR27a抑制似乎是有益的，因为所述抑制减少PAEC增殖(30)并通过BMPR2/PPARγ阻止肺动脉中的PASMC生长(68)。与miR17-5类似，恩扎妥林能够挽救因FHIT损失诱导的miR27a的增加。抑制miR17-5拮抗剂挽救siFHIT诱导的BMPR2阻遏，并且可能因此提出有希望的治疗策略，如类似方法最近所显示(32、69)，需要注意的是，靶向单一微小RNA可能代表过于简化的方法而无法实现人PAH中血管重建的显著改进。

[0242] Fhit-/-小鼠显露出PAH的肺部标志：小动脉的肌化和远端动脉稀疏、低氧后加重的PH、以及在复氧后未能恢复。在该方面，Fhit-/-小鼠与具有Bmpr2的内皮缺失的小鼠非常相似(70)。除了在整个实验期间降低的Fhit表达，与C57小鼠相比，Fhit-/-小鼠在低氧中出现降低的BMPR2水平，可能解释在低氧中更严重的PH表型。虽然BMPR2水平在4周复氧后正常化，但是Fhit-/-小鼠仍未能完全恢复，这可以通过Fhit-/-小鼠中更严重的血管损伤/功能障碍恢复更慢或者恢复所需的FHIT的另外的非BMPR2依赖性作用来解释。参见图12。

[0243] PAH中的血管功能障碍被认为是通过以下来起始：内皮损伤和早期细胞凋亡导致肺血管损失(12)，之后抗细胞凋亡的血管细胞增殖(71)。可能早于疾病发作的(72)加强的基线DNA损伤和体内诱变剂敏感性(26、34、35)可能进一步促进EC脆弱性。FHIT损失导致增加的对诱变剂损伤的敏化，并且因此可能造成血管损伤和恢复失败的风险因素。如本文所示，降低的FHIT和BMPR2水平与血管功能障碍相关；从而引起PAEC的细胞凋亡、受损的管形成和增加的DNA损伤，以及加强的PASMC增殖，这与在肿瘤前期中FHIT损失后所报道的DNA损伤加重一致(73)。另一方面，如通过使用恩扎妥林所示的，增加BMPR2信号传导的策略改进这些血管表型(7、12、74、75)。

[0244] 已知FHIT抑制肺癌细胞中EGFR/Src/ERK/Slug调控的内皮间充质转变(EndMT)。因此，降低的FHIT水平可以促进EndMT，并且与增加的SMC增殖和低FHIT水平一起，可以解释我们已经观察到的远端肺血管的αSMA阳性细胞增加、中膜肥大和外膜肥大(76-78)。在Fhit-/-小鼠中观察到的血管稀疏可以归因于远端动脉中增加的PAEC细胞凋亡、PAEC的细胞间粘附或PAEC移动至血管损伤位点的缺陷，如通过PAH患者体内增加的循环EC数目所证实(79)。

[0245] 作为恩扎妥林在BMPR2缺陷型PAH患者中的潜在用途的概念验证，我们首先在Bmpr2+/-和野生型C57BL/6小鼠中研究了恩扎妥林并提供如下证据：用恩扎妥林(15mg/kg/天)处理2周减弱低氧诱导的PH，如通过RVSP、RVH和肺生理学的变化所测量。对于潜在翻译相关性，我们发现FK506和恩扎妥林处理在小鼠中的加性效应。

[0246] 然后我们开始在SUGEN5416/低氧/常氧大鼠模型中测试恩扎妥林，所述模型产生最接近模仿人类疾病的严重肺血管重建(41)，包括严重的新内膜形成和RV衰竭(80)，因此优于小鼠模型和主要由于中膜肥大而患上严重PH的野百合碱大鼠模型(81)。极少研究已经证实了在SUGEN5416/低氧/常氧大鼠中已确立PH的逆转(6、12、32、82、83)。我们发现，低剂量恩扎妥林(5mg/kg/天)通过增加FHIT和BMPR2信号传导有效逆转SUGEN5416/低氧/常氧诱导的肺和RV损伤。然而基于小样本量，所述发现的解释是有限的。虽然将恩扎妥林评估为癌症中的PKCβ抑制剂(21)，但是我们在SUGEN5416/低氧/常氧处理的大鼠的恩扎妥林处理后，并未在全肺组织中观察到如通过PKC磷酸化所测量的PKC激活的显著下降(图13)。我们证实，恩扎妥林在体外以低剂量(5-15uM)增加FHIT和BMPR2(图14)，并且恩扎妥林关于其调节FHIT、BMPR2和ID的潜力与其他选择性PKCβ和全面PKC抑制剂不同，对PAEC功能的效应也是如此(图15、图16)。这可能是由于与先前临床试验(84、85)、啮齿类动物体内研究(86)和在体外实现PKC磷酸化减少所需剂量(87)相比，我们的体内相对较低剂量恩扎妥林处理所致。因此我们提出，我们观察到的恩扎妥林对血管重建以及FHIT表达的作用在很大程度上与PKC无关。恩扎妥林如何增加FHIT是未知的；而一种可能的机制可能是Scr介导的对FHIT磷酸化的抑制和对FHIT的后续降解的阻止(88、89)。

[0247] 本文中的数据证实了FHIT在PAH发病机制中作为BMPR2修饰基因的作用，从而提供关于BMPR2调控的见解以及PAH介入的机会。FHIT表达在PAH中一致地下调。降低的FHIT水平降低BMPR2表达和信号传导，并且体内FHIT损失导致响应于低氧加重的实验性PH。可以通过恩扎妥林容易地增加FHIT表达，这在预防和治疗Bmpr2+/-小鼠和SUGEN5416/低氧/常氧大鼠的实验性PH方面是有益的。因此，数据显示，FHIT是PAH中BMPR2信号传导结构的可能必需的新型组分，并且降低的FHIT水平可能使得PAH易于发生。这些研究证实了使用恩扎妥林作为PAH的有益治疗的有效方法。实例

[0248] 提出以下实例以为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整披露内容和描述；以下实例并不意图限制诸位发明人认为的本发明的范围。除非另有指示，否则份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是以摄氏度计，并且压力是或接近大气压。

[0249] 在这项研究中，使用恩扎妥林(赛力克化学公司(Selleckchem)，休斯顿，德克萨斯州)和SUGEN5416(托克利斯公司(Tocris)，布里斯托尔，英国)。实例I.FHIT-/-C57BL/6响应于慢性低氧患上实验性PAH。

[0250] 肺动脉高血压(PAH)是特征在于增加的肺动脉压、右心室(RV)肥大和最终右心衰竭的进行性肺病。骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)突变或异常BMPR2信号传导已经在许多PAH患者中有报道并且与所述疾病的发病机制联系起来。用改变用途的药物调节BMPR2信号传导是治疗这种毁灭性疾病的有吸引力的策略。在siRNA高通量筛选中，我们先前发现脆性组氨酸三联体(FHIT)是新型BMPR2调节性基因。我们证明，降低的FHIT表达与内皮细胞功能障碍相关，并且在PAH患者的PBMC、PAEC、转化的淋巴细胞和肺组织中降低，表明低FHIT促成肺高血压和肺气肿。在体外，FHIT和BMPR2表达可以通过FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂来上调。

[0251] 将FHIT-/-C57BL/6与同窝出生的野生型(C57)小鼠在常氧(Nx，20％O2)、低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，低氧恢复(Rec，3周Hx/4周Nx)期是4周，与7周Nx对照进行比较。
雄性小鼠的结果显示于图1A至图1K中：图1A，通过肺动脉导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)(雄性，C57n＝3，FHIT-/-Nx Rec n＝3，FHIT-/-Hx n＝4)。图1B，通过RV与左心室和间隔的重量比(RV/LV+S)来证实右心室(RV)肥大(雄性，C57NX Rec n＝3，C57Hx n＝6，FHIT-/-Nx Hx n＝3，FHIT-/-Rec n＝4)。图1C，肺泡壁(AW)和肺泡管(AD)肺血管的损失；和图1D，在MOVAT染色的肺切片中评估所述肺血管的完全或部分肌化(％)(雄性，C57n＝3，FHIT-/-Nx n＝3，FHIT-/-Hx Rec n＝4)。图1E，代表性MOVAT肺组织学。箭头指示血管位置。
图1F，来自Nx C57和FHIT-/-小鼠(n＝2)的琼脂糖膨胀的完整肺叶的代表性深层组织成像。
图1G，用aSMA和avWF抗体对肺血管进行的代表性IF染色。图1H，肺组织中针对P-肌动蛋白持家对照归一化的FHIT(图1I)和BMPR2(图1J)蛋白表达的代表性免疫印迹和相对密度计分析(雄性，C57n＝3，FHIT-/-Nx n＝3，FHIT-/-Hx n＝5，FHIT-/-Rec n＝4)。图1K，肺组织中针对P-肌动蛋白持家对照归一化的PKC和磷酸PKC蛋白表达的代表性免疫印迹(雄性，C57n＝
3，FHIT-/-Nx n＝3，FHIT-/-Hx n＝5，FHIT-/-Rec n＝4)。相对于Nx对照，*p<0.05，**p<
0.01，****p<0.0001，相对于C57对照，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，双因素方差分析，图基(Tukey)事后检验。

[0252] 雌性小鼠的结果显示于图2A至图2F中：将FHIT-/-C57BL/6与同窝出生的野生型(C57)小鼠在常氧(Nx，20％O2)、低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，低氧恢复(Rec，3周Hx/4周Nx)期是4周，与7周Nx对照进行比较。图2A，通过肺动脉导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)(雌性)。图2B，通过RV与左心室和间隔的重量比(RV/LV+S)来证实右心室(RV)肥大(雌性)。图2C，肺泡壁(AW)和肺泡管(AD)肺血管的损失；和图2D，在MOVAT染色的肺切片中评估所述肺血管的完全或部分肌化(％)(雌性)。图2E，描绘血管损失的代表性MOVAT肺组织学。箭头指示血管位置。图2F，描绘血管结构的代表性MOVAT肺组织学。箭头指示血管位置。相对于Nx对照，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，相对于C57对照，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，双因素方差分析，图基事后检验。

[0253] 雄性和雌性FHIT-/-C57BL/6小鼠在慢性暴露于低氧后患上实验性PAH。简单来说，将FHIT-/-C57BL/6与同窝出生的野生型(C57)小鼠在常氧(Nx，20％O2)、低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，低氧恢复(Rec，3周Hx/4周Nx)期是4周，与7周Nx对照进行比较。通过肺动脉导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)，并且发现右心室收缩压在雄性中响应于低氧而升高(图1A)，并且在雌性中右心室收缩压已经处于基线(图2A)。在回到常氧后，在两个组中维持升高的RVSP水平。同样，在雄性中在低氧条件下(图1B)以及在雌性中在常氧和低氧两种条件下(图2B)通过升高的RV与左心室和间隔的重量比(RV/LV+S)证实右心室(RV)肥大。在两种情况下，在回到常氧后维持升高的RV/LV+S比。

[0254] 在所有测试条件下始终发现升高的肺泡壁(AW)和肺泡管(AD)肺血管损失(图1C、图2C、图2E)和所述肺血管的完全或部分肌化(％)(图1D、图1F至图G、图2D、图2F)。

[0255] 用于测试FHIT、BMPR2、PKC和磷酸化PKC的蛋白质水平的蛋白质印迹证实了FHIT-/-动物体内降低的FHIT水平，且在低氧中BMPR2水平同时降低。然而，检测到总PKC水平或PKC磷酸化无变化，表明FHIT不调控PKC或PKC磷酸化。

[0256] 这个实验显示，FHIT在肺高血压和肺气肿的发生中是重要的分子，并且其效应与PKC水平和PKC磷酸化状态无关。实例II.恩扎妥林预防低氧诱导的实验性PAH在C57BL/6和BMPR2+/-C57BL/6小鼠中的发生。

[0257] 大多数家族性PAH患者具有BMPR2突变。然而，BMPR2突变的存在仅使得PAH易于发生，但不会单独引起PAH的发生，表明可能存在第二种因子促成疾病发作。由于FHIT易于响应于应激物(如低氧和吸烟)而损失，有人提出，可以通过使用FHIT升高剂FHIT增加性化学物质恩扎妥林来预防低氧诱导的PAH在C57BL/6和BMPR2缺陷型(BMPR2+/-)C57BL/6小鼠中的发生。

[0258] 使BMPR2+/-小鼠和C57对照暴露于3周的慢性低氧并且每天通过渗透泵施用5mg/kg的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂。通过右颈静脉导管插入术测量右心室(RV)收缩压，并且通过RV与左心室+间隔的重量比评估RV肥大。通过MOVAT五色染色使肺血管的血管损失和肌化可视化。对于这个实验，将雄性野生型和BMPR2+/-C57BL/6(C57)小鼠在常氧(Nx，20％O2)和低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，用或不用通过Alzet微型渗透泵2006型每天施用的5mg/kg恩扎妥林处理。数据呈现于图3A至图3F中：图3A，通过肺动脉导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)(n＝3，平均值±SEM，相对于Nx对照，**p<0.01，单因素方差分析，西达克(Sidak)事后检验)。图3B，通过RV与左心室和间隔的重量比证实右心室(RV)肥大(n＝3，平均值±SEM，相对于媒介物对照，#p<0.05，双因素方差分析，图基事后检验)。图3C，肺泡壁(AW)和肺泡管(AD)肺血管的损失；和图3D，在MOVAT染色的肺切片中评估所述肺血管的完全或部分肌化(％)(n＝3，平均值±SEM，相对于C57对照，*p<0.05，相对于媒介物对照，##p<0.01，###p<0.001，双因素方差分析，图基事后检验)。图3E，描绘血管损失的代表性MOVAT肺组织学。箭头指示血管位置。图3F，描绘血管结构的代表性MOVAT肺组织学。箭头指示血管位置。

[0259] 在远高于化合物的所述Ki的高剂量下，FHIT增加性化学物质恩扎妥林预防低氧诱导的实验性PAH在C57BL/6小鼠中的发生。简单来说，将雄性野生型和BMPR2+/-C57BL/6(C57)小鼠在常氧(Nx，20％O2)和低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，用或不用通过Alzet微型渗透泵2006型每天施用的5mg/kg FHIT增加性化学物质恩扎妥林处理。与低氧媒介物对照相比，FHIT增加性化学物质恩扎妥林诱导升高的右心室收缩压(RVSP)水平部分降低(图3A)，并且在饲养于低氧中的C57BL/6小鼠以及BMPR2+/-C57BL/6小鼠二者中观察到右心室(RV)肥大显著减少，如通过RV与左心室和间隔的重量比所证实(图3B)。在C57BL/6小鼠以及BMPR2+/-C57BL/6小鼠二者中，肺泡壁(AW)和肺泡管(AD)肺血管的损失通过用FHIT增加性化学物质恩扎妥林处理得到显著改善(图3C、图3E)，所述肺血管的完全或部分肌化也是如此(图3D、图3F)。

[0260] FHIT增加性化学物质恩扎妥林在高剂量下通过预防血管损失和消除血管肌化来预防肺高血压的发生。在具有降低的BMPR2水平的小鼠中，FHIT增加性化学物质恩扎妥林处理是预防响应于低氧患上肺高血压的有效策略。实现治疗效果所需的高剂量被认为是由于在高剂量下非特异性靶向许多不同的分子靶标而引起的。实例III.恩扎妥林在Sugen 5416/低氧大鼠中逆转实验性PAH。

[0261] 将Sugen 5416施用至大鼠并使大鼠随后暴露于慢性低氧导致不可逆的肺血管重建和右心室收缩压升高以及RV肥大。因此，这种模型是用于评估体内实验性肺高血压和肺气肿的选择模型。

[0262] 在雄性Sasco Sprague Dawley大鼠中通过皮下注射20mg/kg体重的SU5416诱导实验性PAH。在通过口服管饲每天施用5mg/kg体重的FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂或媒介物对照后，将动物在低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，之后是在常氧(Nx，20％O2)中的5周的时间。进行超声心动描记术以评估RV肥大的发生和射血分数。通过右颈静脉导管插入术测量右心室(RV)收缩压，并且通过RV与左心室+间隔的重量比评估RV肥大。通过MOVAT五色染色使肺血管的血管损失和肌化可视化。数据呈现于图4A至图4F中：图4A，通过肺动脉导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)(n＝3，平均值±SEM，相对于Nx对照，**p<0.01，单因素方差分析，西达克事后检验)。图4B，通过RV与左心室和间隔的重量比证实右心室(RV)肥大(n＝3，平均值±SEM，相对于媒介物对照，#p<0.05，双因素方差分析，图基事后检验)。图4C，肺泡壁(AW)和肺泡管(AD)肺血管的损失；和图4D，在MOVAT染色的肺切片中评估所述肺血管的完全或部分肌化(％)(n＝3，平均值±SEM，相对于C57对照，*p<0.05，相对于媒介物对照，##p<0.01，###p<0.001，双因素方差分析，图基事后检验)。图4E，在用恩扎妥林处理之前和处理3周之后，通过心脏结构和功能的超声心动图评估来计算左心室射血分数。图4F，代表性MOVAT肺组织学。

[0263] 恩扎妥林在Sugen 5416/低氧大鼠中逆转血管闭塞、心肌纤维化并改进心输出量。简单来说，在雄性Sasco Sprague Dawley大鼠中通过皮下注射20mg/kg体重的SU5416诱导实验性PAH。在通过口服管饲每天施用5mg/kg体重的FHIT增加性化学物质恩扎妥林或媒介物对照后，将动物在低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，之后是在常氧(Nx，20％O2)中的5周的时间。右心室收缩压(RVSP)(图4A)和右心室肥大(图4B)在FHIT增加性化学物质恩扎妥林处理的患有实验性肺动脉高血压的大鼠中低于媒介物处理的患有实验性PAH的对照。

[0264] 肺泡壁(AW)和肺泡管(AD)肺血管的损失(图4C)和所述肺血管的完全或部分重建被FHIT增加性化学物质恩扎妥林大幅地且显著地逆转(图4D、图4F)。这与在用FHIT增加性化学物质恩扎妥林处理后通过超声心动描记术计算的LVEF(％)的改进一致，而媒介物处理的患有实验性肺高血压和肺气肿的对照的心脏功能急剧下降。

[0265] FHIT增加性化学物质恩扎妥林在Sugen5416/低氧大鼠模型中逆转内皮重建和实验性PAH，表明其在哺乳动物中作为PH的有效治疗策略的用途。实现治疗效果所需的高剂量被认为是由于在高剂量下非特异性靶向许多不同的分子靶标而引起的。实例IV.FHIT增加性化学物质恩扎妥林需要FHIT而不是PKC来逆转肺高血压。

[0266] 在用4种siRNA的siFHIT或非靶向对照(Ntsi)池转染、与或不与15μM FHIT增加性化学物质恩扎妥林一起孵育24小时的PAEC中评估针对GAPDH归一化的FHIT的mRNA表达。使FHIT纯合(-/-)和野生型C57小鼠暴露于常氧或慢性低氧3周，进行或不进行在慢性低氧中暴露3周和每天通过渗透泵进行的5mg/kg FHIT升高剂恩扎妥林或其他FHIT升高剂的施用。将基于通过右颈静脉导管插入术测得的右心室(RV)收缩压测量值评估实验性PAH，并且通过RV与左心室+间隔的重量比评估RV肥大。将通过MOVAT五色染色或使用αSMA和αvWF抗体的IF染色使肺血管的血管损失和肌化可视化。

[0267] 结果显示于图5中：A.在用4种siRNA的siFHIT或非靶向对照(Ntsi)池转染(qPCR，Amaxa核转染，t＝48h，n＝3，平均值±SEM)、与或不与15μM FHIT增加性化学物质恩扎妥林一起孵育24小时的PAEC中的针对GAPDH归一化的FHIT的相对mRNA表达。B，对FHIT与PKC之间的所述关系的独创性途径分析。C，FHIT增加性化学物质恩扎妥林在C57BL/6FHIT-/-小鼠中没有阻止肺高血压发生并且未能增加FHIT水平，同时有效下调PKC水平。

[0268] FHIT缺陷型PAEC中的FHIT mRNA表达显示，FHIT增加性化学物质恩扎妥林有效增加FHIT表达，但是在mRNA被siRNA抑制后不能影响PAEC FHIT水平(图5A)。

[0269] 使用独创性途径分析工具对已知蛋白质相互作用进行的途径分析证实，认为FHIT不与PKC相互作用，而是参与与PKC无关的单独的信号传导途径。

[0270] FHIT是关键的高血压抑制基因，其在损失时导致毁灭性肺高血压表型的发生。因此预期增加FHIT表达的化学物质或药剂(如恩扎妥林)在哺乳动物的肺高血压和肺气肿的预防和治疗方面提供有效治疗策略。实例V.高通量(HTS)siRNA筛选。

[0271] 在斯坦福高通量生物科学中心(Stanford High-Throughput Bioscience Center)，在用或不用250pm BMP4处理的C2C12小鼠成肌细胞瘤细胞系中使用Id1-BRE荧光素酶报告物测定实施>22,000个基因的高通量siRNA筛选，如先前所述(12)。简单来说，将C2C12成肌细胞瘤细胞用与荧光素酶连接的BRE-Id1稳定转染作为报告细胞系(E1)并在72x384孔siRNA板上筛选。使用BMP4作为刺激物，siBMPR2和siTox作为对照，DharmaFect3作为转染试剂以及最佳siRNA浓度(25nM)和细胞数/孔(1500)优化转染条件。靶基因将Id1表达降低至≤60％，与siBMPR2相当，同时维持≥70％的总体细胞活力以排除细胞死亡反应基因。在所得的579个基因中，在二次筛选方法中排除非特异性基因(如假基因、RNA聚合酶亚基、RNA剪接、转运因子和核糖体单位)，得到96个基因，通过靶标特异性siRNA池验证这96个基因。命中定义为Id1表达的减少≤60％，以及使用至少2种单独siRNA的≥80％的较严格细胞活力标准。这得到74个候选基因，使用下文讨论的新型荟萃分析方法对这74个候选基因进行交叉验证。过程和结果概述于图6中。

[0272] 动物模型。Fhit纯合(-/-)小鼠是从Kay F.Huebner(俄亥俄州立大学(Ohio State University))获得的。Bmpr2+/-小鼠是由Marlene Rabinovitch(斯坦福大学(Stanford University))赠予的。将8-10周龄的成年野生型C57BL/6小鼠、Bmpr2+/-或Fhit-/-小鼠在慢性低氧(10％O2)中饲养3周，之后是在常氧(21％O2)中4周的恢复期。将Bmpr2+/-和Fhit-/-小鼠和同窝出生仔畜在研究的持续期间用微型渗透泵施用的每日剂量的恩扎妥林(15和5mg/kg/天)或媒介物处理。在成年Sprague Dawley大鼠(8周龄，180-220g)中通过以下方式诱导实验性PH的发生：皮下给予VEGFR-2抑制剂SUGEN5416(20mg/kg体重)，之后暴露于慢性低氧(10％O2)3周和常氧(21％O2)5周，如先前所述(12)。将SuHx大鼠和同窝出生仔畜用通过口服管饲施用的每日剂量的恩扎妥林(5mg/kg体重)或媒介物处理3周。通过右颈静脉导管插入术测量右心室(RV)收缩压，并且通过RV与左心室和间隔(LV+S)的重量比评估RV肥大(RVH)。

[0273] 所有动物实验都得到斯坦福大学机构动物护理和使用委员会(Stanford University Institutional Animal Care and Use Committee)批准。涉及人组织或衍生的原代细胞的实验得到斯坦福大学机构审查委员会(Stanford  University Institutional Review Board)和人体实验行政管理专门小组(Administrative Panel on Human Subject Research)批准。

[0274] 从人类PAH患者分离细胞。在肺移植时使用CD31-AB下拉(pulldown)珠从消化的全肺组织获得IPAH和FPAH患者的PAEC，如先前所述(12)。通过Ficoll-Paque密度梯度离心从具有阴性BMPR2突变状态的PAH患者或健康志愿者分离外周血单核细胞(PBMC)(10)。使用梯度离心从全血分离来自BMPR2mut+PAH患者及其未受影响的亲属的淋巴细胞，随后进行病毒转化，如先前所述(23)。

[0275] 组织学和ICC。将鼠类和大鼠肺组织在多聚甲醛(PFA)中固定48小时并保存在EtOH中。将石蜡包埋的肺载玻片用Movat五色染色剂(希思托泰克公司(Histo-Tec)，海沃德市，加利福尼亚州)进行染色，其中通过光学显微术使肺血管的血管损失和肌化可视化。在抗原修复后，用针对血管性假血友病因子(von-Willebrand factor)(vWF)和α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的一级抗体对脱石蜡(Histoclear II，国家诊断公司(NationalDiagnostics))组织切片进行肺切片上的荧光免疫细胞化学。针对抗BMPR2(Ab130206，艾博抗公司(Abcam))和抗FHIT(俄亥俄州立大学的KayF.Huebner赠予的)对人PAH肺组织进行染色。将PFA固定的石蜡包埋的心脏组织用三色染色(希思托泰克公司，海沃德市，加利福尼亚州)进行染色，以使纤维化转变可视化。

[0276] 细胞培养。使人PAEC(普乐思尔公司(Promocell))或人PASMC(普乐思尔公司)以单层形式在明胶涂布的培养皿中分别在市售的EC(普乐思尔公司)或SMC(普乐思尔公司)培养基中生长。使细胞以1:3的比率传代并从3-8代用于实验。将转化的淋巴细胞(即，淋巴母细胞)在含有10％-15％FBS的RPMI 1640中培养。

[0277] 从人类PAH患者分离细胞。在肺移植时使用CD31-AB下拉珠(Dynabeads；英杰公司(Invitrogen))从消化的全肺组织获得IPAH和FPAH患者的PAEC，如先前所述(E1)。通过Ficoll-Paque密度梯度离心、葡聚糖沉降和RBC裂解从具有阴性BMPR2突变状态的末期PAH患者或健康志愿者的外周血分离外周血单核细胞(PBMC)，如先前所述(E8)。使用梯度离心从全血分离来自BMPR2mut+PAH患者及其未受影响的亲属的淋巴细胞，随后进行病毒转化，如先前所述(E1)。

[0278] RNA干扰。在PA内皮细胞(PAEC)中通过RNAi调节FHIT表达。使用RNAi Max试剂盒(英杰公司)将针对BMPR2、FHIT、LCK的4种siRNA的池或非靶向对照池(达尔马科恩公司(Dharmacon))转染至PAEC中持续48小时。通过qPCR确定mRNA敲低效率。

[0279] 进行qPCR测定以检测mRNA和miR表达。对于mRNA，使用RNAeasy Plus试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从全肺组织提取总RNA，并根据制造商的说明书使用随机引物和Taqman cDNA逆转录试剂盒(应用生物科技公司(Applied Biosciences))将总RNA逆转录为cDNA。对于miR，使用Taqman miRNA ABC纯化试剂盒(应用生物科技公司)从全肺组织分离总miR，并且使用特异性引物和Taqman微小RNA逆转录试剂盒(应用生物科技公司)逆转录总miR。使用针对靶标的Taqman引物/探针组对mRNA和miR表达水平进行定量，并且针对持家对照(mRNA：GAPDH；miR：RNU48)进行归一化。

[0280] 蛋白质印迹。进行蛋白质印迹，如先前所述(E1)。使用针对以下的抗体：BMPR2(Ab130206，单克隆，艾博抗公司)、FHIT(NBPI-89061，多克隆，诺伟思生物制品公司(Novus Biologicals)；Ab180806，多克隆，艾博抗公司)、PKC(Ab76016，单克隆，艾博抗公司)、P-PKC(Ab32376，[Y124]，单克隆，艾博抗公司)、LCK(NBPI-19840，多克隆，诺伟思生物制品公司)、p38(Ab31828，单克隆，艾博抗公司)、Id1(sc133104，单克隆，圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))、Smad1(#9743，细胞信号传导公司(Cell Signaling))、P-Smad1/5/9(#13820P，细胞信号传导公司)和β-肌动蛋白(Sc47778，单克隆，圣克鲁斯公司(Santa Cruz))。

[0281] 细胞凋亡、DNA损伤、MTT增殖和基质胶管形成测定。测定是根据制造商的说明书并且如先前所述(E1、E9)来实施的。

[0282] 深层组织成像。在Leica M205FA荧光立体显微镜上使用Hamamatsu Orca Flash 4.0LT相机对琼脂糖膨胀的肺实施深层组织成像，如先前所述(E10、E11)。在伴随左肺叶二级横向气道分支L4(L:L4)的动脉中评估琼脂糖膨胀的肺中的动脉肌化(E10)，并命名为在其分岔点之前的分支世代1。将通过分岔或相似的域分支产生的进一步的后代动脉分支世代命名为分支世代2-12。在Fhit-/-小鼠中对于世代6-10，世代数目的增加是明显的，而野生型小鼠未超过肌化血管的世代7。

[0283] 统计学分析。使用GraphPad Prism 7.00版(格拉夫派德软件公司(GraphPad software)，拉荷亚，加利福尼亚州)分析数据。视情况进行统计学检验并且包括以下：学生t检验、单因素方差分析和双因素方差分析，之后进行适当的事后检验，如所指示。如下将差异视为统计学上显著的：p<0.05(*/#)，p<0.01(**/##)，p<0.001(***/###)，p<0.0001(****/####)。实例VI.对公共可获得的PAH基因表达数据的荟萃分析。

[0284] 使用新型的整合荟萃分析算法和验证群组在来自NCBI基因表达汇编(Gene Expression Omnibus，GEO)的7个公共可获得的人PAH转录组数据集(肺：GSE15197、GSE24988、GSE48149；PBMC：GSE19617、GSE22356、GSE33463、GSE703)中交叉验证来自小鼠成肌细胞瘤HTS的74个候选BMPR2修饰基因的所得列表。所有样品一致地使用与国立医学图书馆(National Library of Medicine，NLM)统一医学语言系统(United Medical Language System，UMLS)相关的标准化词汇表来编策，所述统一医学语言系统是包括基因本体论(Gene Ontology)、SNOMED-CT、ICD-9和ICD-10以及超过一百种其他常用标准化词汇表的父词汇表。7个PAH数据集包含来自PAH肺(153个样品)或PBMC(138个样品)的用于开发PAH数据集的291个样品。我们下载并人工编策每个数据集，如先前所述(E2-E5)。简单来说，使用先前公开的方法(E6)将数据本身归一化并转化为log2。我们使用两种不同的荟萃分析方法，称为(i)合并倍数变化，和(ii)合并p值，如先前所述(E7)。选择差异性表达的基因，它们(i)具有<10％的特定假发现率阈值，并且(ii)在至少75％的研究中以相同方向表达(上调或下调)。为了解释由不相等的样品数引起的数据优势，我们一次移取一个数据集进行荟萃分析。

[0285] 在人肺和PBMC PAH数据集中验证来自小鼠成肌细胞瘤HTS的74种靶标，以确保潜在的BMPR2修饰基因在人PAH样品中是重要的。双重筛选方法被认为是解释健康对照受试者变异性所需的，从而确定与人类疾病最相关并且最一致地调控的基因靶标。

[0286] 除了比较HTS siRNA结果与PAH基因表达数据集，我们预测了抗PAH标签，其特征基本上在于与PAH标签相反的基因表达。基因表达谱数据集用于药物的可用性允许鉴定FDA批准的可对治疗PAH有益的药物。我们整合了来自用生物活性小分子处理的培养的人细胞的基因表达谱的参考集合。数据库LINCS对跨许多细胞系的大量药物进行谱分析。LINCS是用不同药物处理的培养的人细胞的基因表达谱的最大数据库。在分析时，有20,413种化学扰动原(perturbagen)在LINCS上在18个“黄金(gold)”细胞系中在L1000平台上进行谱分析(www.lincscloud.org)。我们使用这种技术预测恩扎妥林和达沙替尼会靶向哪些基因，以及基因表达谱是与PAH标签还是抗标签更相似。实例VII.BMPR2调节剂的HTS和多群组PAH基因表达测定。

[0287] 为了找到‘BMPR2修饰基因’，我们用包括22,124个鼠类基因(ORF)和每个基因4种合并的siRNA的鼠类全基因组siRNA文库(凯杰公司)使用如先前所述的BRE-Id1-Luc报告细胞系(12)作为BMPR2信号传导的读出来实施HTS。在两步式筛选方法中，靶基因siRNA将Id1表达降低至≤60％，与siBMPR2相当，同时分别用4种siRNA维持≥70％的总体细胞活力或用2种siRNA维持≥80％的总体细胞活力，以排除细胞死亡反应基因。这得到74个候选BMPR2修饰基因，然后将这74个基因与从公用域获得的多群组、多组织PAH基因表达数据集进行比较(24-26)，以鉴定在IPAH与对照中差异性下调的基因子集(图6A)。我们鉴定了在IPAH患者体内具有降低的表达并且因此在PAH中具有潜在临床重要性的8个候选基因，这8个候选基因与HTS候选BMPR2修饰基因重叠：来自PBMC数据集的ITGA6、FHIT、LCK、CD7和来自肺数据集的PP1R15B、PPM1A、GRIN2B、DUSP7(图6B)。最有希望与PAH发病机制相关的似乎是FHIT和LCK(淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶)。FHIT最一致地减少(>50％；2-1)，从而支持在PAH病理学中一致的作用。LCK与PAH发病机制密切相关，因为已知LCK受达沙替尼抑制(27)，达沙替尼是药物诱导的PAH的所报道触发物(28)。

[0288] 我们此外比较衍生自公共可获得的PAH转录组PBMC数据集的PAH基因表达标签，预测互补的抗PAH标签并将二者与两种药物(达沙替尼和已知增加FHIT的药物恩扎妥林)的基因表达谱进行比较。两种药物和两种表达谱都衍生自LINCS数据库，所述LINCS数据库对跨许多细胞系的大量药物进行谱分析(www.lincscloud.org)。在含有FHIT的基因簇中，恩扎妥林诱导的基因调控与PAH抗标签类似(图6C，框)，而达沙替尼诱导的基因调控与PAH标签类似。这表明，模拟PAH基因表达标签的药物(如达沙替尼)可能对PAH有害，而逆转PAH标签的药物(如恩扎妥林)将可用于治疗PAH。实例VIII.BMPR2及其修饰基因FHIT的下调在PAH细胞和肺组织中被观察到并且似乎修改FPAH疾病外显率。

[0289] 由于在PBMC基因表达数据集中鉴定出FHIT和LCK，我们首先研究FHIT是否在PAH患者细胞(即，外周血单核细胞(PBMC)、肺动脉内皮细胞(PAEC)和转化的淋巴细胞)以及肺组织中一致地降低。

[0290] 我们测量了来自不具有BMPR2突变的8名PAH患者的PBMC中的BMPR2、FHIT和LCK表达，并且证实所有3个基因的表达都显著下降(图7A至图7C)。从在肺移植时收获的IPAH患者肺分离的微血管EC(12)(表1)显示FHIT与BMPR2mRNA表达之间呈正相关(图7D)。与供体肺相比，FHIT和BMPR2的免疫组织化学染色在FPAH和IPAH患者中有所减少(图7E、表1、图17A至图17B)。虽然BMPR2显著且一致地减少，如在BMPR2突变存在下所预期，但是FHIT的更不一致的减少限制于新内膜和内皮下层(图18A至图18F、图17A至图17B)，表明FHIT与BMPR2之间关于它们的基因表达和在血管重建中的潜在作用的不完全重叠。

[0291] 接下来我们确定这些基因在具有BMPR2突变的FPAH患者和健康的肯定BMPR2携带者体内的表达，以评估所述基因是否可以修改FPAH中的疾病外显率。选择具有BMPR2突变的7个家族的群组：10名具有BMPR2突变的患者(P1-8)、10名相关的健康的肯定BMPR2突变携带者(C1-8)和无关的健康对照(表1)。在如先前所述提取的(29)转化的淋巴细胞中，患者体内的BMPR2和FHIT mRNA一致地低于健康携带者(5/7的家族)，表明FHIT可以在BMPR2突变携带者中修改疾病外显率(图7F至图7I、图19G至图19H)。然而，BMPR2和FHIT水平在家族之间是可变的并且在男性与女性中不同(图7H至图7I、图19)，表明抑制PAH发病机制所需的BMPR2或FHIT阈值随遗传背景和性别而变化。

[0292] 图7A至图7E显示，PAH中减弱的FHIT表达与降低的BMPR2表达相关。图7A至图7C描绘了与健康对照相比，对来自具有阴性BMPR2突变状态的末期PAH患者的PBMC中的BMPR2(图7A)、FHIT(图7B)和LCK(图7C)mRNA表达的qPCR分析(对照n＝12，PAH n＝8，平均值±SEM，相对于对照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001，韦尔奇(Welch)t检验)。图7A至图7E显示了与健康对照相比，来自具有阴性BMPR2突变状态的末期PAH患者的PBMC中的mRNA表达(对照n＝
12，PAH n＝8，平均值±SEM，相对于对照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001，韦尔奇t检验)。
图7D，在肺移植时IPAH患者PAEC中BMPR2和FHIT mRNA表达的相关性和线性回归分析(对照n＝6，IPAH n＝6，FPAH n＝4，对照r＝-0.7714，PAH r＝0.5410，IPAH r＝0.5218，Spearmanr，关于患者人口统计学参见表1B)。图7E，在移植时PAH患者和供体对照肺组织中的代表性肺抗BMPR2和抗FHIT IHC(HRP-褐色染色)(n＝3，关于患者人口统计学参见表1C)。
图7F至图7G，对来自FPAH患者、未受影响的BMPR2突变携带者和健康对照的转化的淋巴细胞中的FHIT和BMPR2表达的qPCR分析(n＝10，平均值±SEM，*p<0.05，单因素方差分析，邓尼特(Dunnett)事后检验，关于患者人口统计学参见表1A)。图7H至图7I，对来自所选家族的转化的淋巴细胞中的FHIT和BMPR2表达的qPCR分析(n＝5，P＝FPAH患者，C＝健康突变携带者，箭头指向与他们的FPAH家族成员相比具有一致地增加的FHIT和BMPR2的携带者，关于患者人口统计学参见表1A)。
表1A.
表1B.
表1C.
实例IX.miR17-5和miR27-a负向调控FHIT/BMPR2信号传导，通过恩扎妥林恢复。

[0293] 我们接下来鉴定出，FHIT和LCK是BMPR2的上游调控物。用siRNA敲低PAEC中的FHIT和LCK同时降低通过靶标ID1测量的BMPR2表达以及BMPR2的下游信号传导(图8A、图8B)。相反，siBMPR2不影响PAEC中的FHIT和LCK表达，从而证实BMPR2位于FHIT和LCK的下游(图8C、图8D)。有趣的是，siFHIT将LCK表达降低至50％，表明两个修饰基因之间潜在的相互依赖性(图8D)。

[0294] 这项研究的结果显示于图8A至图8M中，其中siFHIT PAEC中的mRNA表达和微小RNA谱分析揭示了微小RNA miR17-5和miR27a在可以由恩扎妥林接合的FHIT对BMPR2信号传导的调控中的潜在作用。图8A至图8D，在用4种siRNA的siBMPR2、siFHIT、siLCK或非靶向对照(Ntsi)池转染的PAEC中，针对GAPDH归一化的BMPR2(图8A)、Id1(图8B)、FHIT(图8C)和LCK(图8D)的相对mRNA表达(qPCR，Amaxa核转染，t＝48h，n＝3，平均值±SEM，相对于对照，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，单因素方差分析，图基事后检验)。图8E至图8F，在用4种siRNA的siFHIT、siLCK或非靶向对照(Ntsi)池转染的PAEC中，针对RNU48归一化的miR17-5(图8E)和miR100(图8F)的相对miR表达(qPCR，t＝转染后48h，n＝3，平均值±SEM，相对于Ntsi对照，**p<0.01，****p<0.0001，单因素方差分析，邓尼特事后检验)。图8G至图8I，在与
15μM恩扎妥林一起孵育24小时的PAEC中，针对GAPDH归一化的FHIT(图8G)、BMPR2(图8H)和Id1(图8I)的相对mRNA表达(qPCR，t＝转染后72h，n＝3，平均值±SEM，相对于媒介物，***p<
0.001，****p<0.0001，非配对t检验)。图8J，在用4种siRNA的siFHIT或非靶向对照(Ntsi)池转染、用或不用15μM恩扎妥林处理24小时的PAEC中，针对GAPDH归一化的FHIT的相对mRNA表达(qPCR，t＝转染后72h，RNAimax，n＝4，平均值±SEM)。图8K至图8L，在用4种siRNA的siFHIT或非靶向对照(Ntsi)池转染、用或不用15μM恩扎妥林处理24小时的PAEC中，针对RNU48归一化的miR17-5(图8K)和miR27a(图8L)的相对miR表达(qPCR，t＝转染后72h，n＝3，平均值±SEM，相对于Ntsi对照，**p<0.01，****p<0.0001，双因素方差分析，邓尼特事后检验)。图8M，所提出的FHIT对BMPR2的调控的示意性模型。

[0295] FHIT和LCK水平如何调控BMPR2表达是未知的。由于已经显示miRNA在PAH中的BMPR2信号传导的调控中起重要作用(30、31)，我们研究了所选微小RNA是否会协调FHIT和LCK介导的对PAEC中BMPR2表达的调控。我们集中于miR17-5和miR100(二者是BMPR2的直接调控物)以及miR27a(经典Smad信号传导的读出)(30、32)。通过siRNA减少FHIT mRNA增加miR17-5(3-4倍；图8E、图8K)和miR27-a(4倍；图8L)的表达，但不增加miR100表达(图8G)。LCK缺乏将miR17-5和miR100二者的表达分别显著增加8倍或2倍(图8E、图8F)。

[0296] 用恩扎妥林处理24小时(15μM)增加PAEC中FHIT、BMPR2和Id1表达(图8G至图8I、图20A至图20C)。有趣的是，恩扎妥林(15μM)能够挽救FHIT mRNA敲低(在敲低后处理24h，图
8J)，从而支持恩扎妥林有效上调FHIT表达的先前发现。此外，恩扎妥林抑制siFHIT介导的miR17-5和miR27a的增加(图8K、图8L)，从而提供关于FHIT和恩扎妥林可以如何通过调节miRNA表达来调控BMPR2水平的一些机制方面的见解(图8M)。我们此外证明，除了siFHIT，使用抗miR转染减少miR17-5增加BMPR2和ID1表达，表明FHIT介导的BMPR2调节是部分miR17-5依赖性的。(图21A至图21D)。
实例X.恩扎妥林在体外上调FHIT/BMPR2信号传导并预防由于FHIT缺乏诱导的血管功能障碍。

[0297] 鉴于PAH的特征在于肺血管损失(33)，我们研究了在PAEC中FHIT表达如何与血管形成的抑制、增加的细胞凋亡、DNA损伤(34、35)和细胞增殖相关。因此我们评估了降低PAEC中的FHIT和BMPR2表达是否会使EC功能障碍恶化以及用恩扎妥林处理24小时是否可以挽救所述表型。

[0298] 这项研究的结果显示于图9A至图9J中，所述图显示，恩扎妥林增加BMPR2上游信号传导分子FHIT在PAEC中的表达，并在FHIT缺陷型PAEC中逆转管形成、细胞凋亡、DNA损伤和增殖方面的PAH特异性功能缺陷。图9A至图9B，在通过15μM恩扎妥林挽救24小时的siFHIT PAEC中进行的基质胶管形成测定(t＝转染后48h，Amaxa核转染，Ntsi 43.3±5.9，siBMPR2 8.7±1.5，siFHIT 11.0±2.6个管/5个视野(20x)的平均值，n＝3，平均值±SEM，相对于Ntsi，***p<0.001，单因素方差分析，邓尼特事后检验，条表示1mm)。图9C，通过15μM恩扎妥林挽救的siBMPR2和siFHIT PAEC中的半胱天冬酶3/7发光(t＝转染后48h，RNAimax，Caspase- 3/7测定，n＝3，平均值±SEM，相对于Ntsi，****p<0.0001，相对于未处理对照，#p<0.05，####p<0.0001，单因素方差分析，邓尼特事后检验)。图9D至图9E，通过10μM恩扎妥林挽救24小时的siBMPR2和siFHIT PAEC中的γH2AX染色(t＝转染后72h，Dharmafect，n＝3，平均值±SEM，相对于Ntsi，**p<0.01，相对于未处理对照，#p<0.05，单因素方差分析，邓尼特事后检验)。定量的面积＝用自动化软件定量的显示核γH2AX染色的细胞的％(白色核＝阳性染色，灰色核＝背景染色)。图9F，在不同浓度的恩扎妥林中培养的PAEC的总细胞计数和锥虫蓝+PAEC的％(n＝3，单因素方差分析，相对于未处理对照，*p<0.05，**p<0.01)。
图9G至图9H，分别是恩扎妥林处理(0.5-50μM)的PASMC和PAEC中的MTT增殖测定。(n＝3)。图
9I至图9J，分别是与Ntsi对照相比，恩扎妥林处理(5μM)的siFHIT和siBMPR2转染的PASMC中的MTT增殖测定。(n＝3)。

[0299] 与用对照Ntsi处理的细胞相比，在将细胞接种于基质胶管形成测定中之后6小时，FHIT和BMPR2的损失削弱PAEC管形成(12)(图9A、图9B)。在24小时后，恩扎妥林处理完全逆转在FHIT和BMPR2缺陷型PAEC中的管形成缺陷，这与恩扎妥林在这个时间点增加FHIT表达的能力一致(图9J)。

[0300] 作为累积活力测量，我们使用发光Caspase- 3/7测定对半胱天冬酶3/7活性进行定量(36)，并且通过免疫荧光使用组蛋白H2AX磷酸化以及通过共焦显微术定量为核面积染色(％)来对DNA损伤进行定量(34、35、37)。在转染后48小时，减少FHIT和BMPR2mRNA激活PAEC中的半胱天冬酶(图9C)，而恩扎妥林减少siBMPR2和siFHIT诱导的PAEC细胞凋亡。与Ntsi对照相比，降低FHIT水平在48小时后将DNA损伤增加约4倍(图9D、图9E)，与在PAH患者的先前PBMC研究中观察到的DNA损伤程度相当(35)。在PAEC中由FHIT或BMPR2损失诱导的DNA损伤被恩扎妥林显著减弱。通过MTT增殖测定和血细胞计数器细胞计数评估PAEC增殖(36)。依照锥虫蓝活力测定，恩扎妥林不引发细胞毒性。相反，在用恩扎妥林(最高50μM)处理后，我们观察到增加的细胞数，可能反映减少的细胞凋亡，因为没有检测到PAEC增殖增加(图9F、图9G)。

[0301] 鉴于SMC在PAH中的中膜肥大和血管重建中的作用，我们确定，FHIT(图9H、图9I)而不是BMPR2(图9J)的减少在体外增加PASMC增殖(图9I)，这是由恩扎妥林挽救的。我们从这些数据得出结论，FHIT损失促进PAEC和PASMC功能障碍，这可以通过恩扎妥林以FHIT和BMPR2依赖性方式改进。与PASMC功能相比，恩扎妥林对PAEC功能的更强有益效应可以通过PAEC中BMPR2的更强表达来解释，这可能使PAEC对BMPR2调节疗法的反应更强。实例XI：体内的FHIT缺乏使得更易响应于低氧而发生加重的肺高血压。

[0302] PAH患者体内减少的FHIT和足够高FHIT水平在EC和SMC功能中的重要性让我们确定了在体内FHIT损失是否使得PH易于发生。使Fhit-/-小鼠和WT同窝出生仔畜(8周龄，雄性/雌性)暴露于慢性低氧(10％)3周，之后是在常氧中的恢复期(21％，4周)(38、39)。通过右颈静脉测量RV收缩压(RVSP)来评估PH。分别在3周和7周时杀死动物并收集组织。使用RV与左心室和间隔重量的重量比(RV/LV+S)测定RV肥大(RVH)。C57BL/6野生型小鼠展示对低氧的常规适应性反应，伴随RVSP增加(图10A、图18A)、RVH(图10B、图18B)、微动脉和微静脉中的血管稀疏(图10D、图18C)以及增加的肌化(图10E、图18D)，这些都在回到室内空气后可逆。相比之下，Fhit-/-小鼠在低氧中展示加重的RVSP增加和RVH、增加的血管稀疏和肌化，且在4周常氧后没有完全消退(图10A至图10F、图18A至图18F)，但是未出现RV纤维化(图22)。此外，与同窝出生的对照相比，在Fhit-/-小鼠中，基线肌化扩展至更远的血管世代(7-
10个世代)(图10G至图10H)，在所述同窝出生的对照中在世代7以外未观察到肌化的血管(40)。值得注意的是，我们发现基线RVSP、RVH、血管稀疏和小血管肌化的程度存在性别差异(关于详细描述参见附录)。

[0303] 如所预期，在Fhit-/-肺中，在所有条件下，FHIT蛋白都显著减少。慢性低氧减少Fhit-/-肺中的BMPR2蛋白，这与在慢性低氧中在Fhit-/-小鼠中观察到的RVSP和RVH增加相关(图10I)。令人惊讶的是，暴露于低氧并用恩扎妥林(5mg/kg/天，通过微型渗透泵)处理的Fhit-/-小鼠在全肺组织中显示改进的PH以及增加的BMPR2和ID1表达。如所预期，FHIT mRNA表达不可测量地低，表明恩扎妥林对BMPR2调节的另外的非FHIT依赖性机制(图23B)。恩扎妥林在暴露于慢性低氧的小鼠中预防PH。

[0304] 鉴于恩扎妥林增加FHIT和BMPR2水平的能力以及其对内皮和平滑肌细胞功能障碍的有益作用，我们在体内啮齿类动物模型中使用恩扎妥林评估其预防或逆转实验性PH和血管重建的倾向。由于雄性Fhit-/-小鼠的PH的严重程度在低氧中增加，我们仅在雄性动物中使用恩扎妥林。作为先导性预防模型，我们使Bmpr2+/-小鼠和野生型同窝出生仔畜(8周龄)暴露于低氧(10％)3周，且用皮下植入的微型渗透泵供应15mg/kg/天的恩扎妥林或媒介物。恩扎妥林在Bmpr2+/-和野生型小鼠中预防RVSP和RVH增加(图24A、图24B)、血管稀疏以及远端血管的肌化(图24C、图24D)。我们此外用FK506(0.05mg/kg/d)、恩扎妥林(5mg/kg/d)或二者的组合处理暴露于3周低氧的C57BL6小鼠，并且记录FK506和恩扎妥林关于预防PH(如通过RVSP所测量)、BMPR2以及ID1表达的加性效应(图25A至图25D)。
实例XII.恩扎妥林在SUGEN5416/低氧/常氧大鼠中逆转实验性PH。

[0305] 作为逆转模型，我们采用SUGEN5416/低氧/常氧大鼠模型，其充分模拟人末期PAH以及广泛血管重建。这个实验的数据概述于图11A至图11K中。

[0306] 向Sprague Dawley大鼠一次性皮下注射20mg/kg SUGEN5416并将其饲养于慢性低氧(10％，3周)中，之后在常氧中5周，如先前所述(41)。在皮下SUGEN5416注射后8周，大鼠接受每日口服管饲5mg/kg/天的恩扎妥林或媒介物对照3周。对动物进行血液动力学评估(超声心动描记术、右心导管)，之后杀死动物并收集组织。大鼠患上严重的闭塞性“末期”PH，其特征在于管腔闭塞和右心衰竭(图11D至图11H、图26)。与组织学观察结果一致，RVSP(>100mmHg)和RVH在注射SUGEN5416的大鼠中严重增加(图11A至图11B)，并且在这些动物的RV中观察到增加的间质纤维化(图11I至图11K)。

[0307] 这个实验的数据显示于图11A至图11K中，并且显示，恩扎妥林在SUGEN 5416/低氧大鼠中逆转血液动力学参数、严重血管重建、肺气肿、心肌纤维化和RVH。在雄性Sprague Dawley大鼠中通过皮下注射20mg/kg体重的SU5416诱导实验性PH。在通过口服管饲每天施用5mg/kg体重的恩扎妥林或媒介物对照后，将动物在低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，之后是在常氧(Nx，21％O2)中的5周的时间。图11A，通过肺动脉导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)(n＝4，平均值±SEM，相对于Nx对照，**p<0.01，单因素方差分析，西达克事后检验)。图11B，通过RV与左心室和间隔的重量比证实右心室(RV)肥大(n＝4，平均值±SEM，相对于Nx对照，**p<0.01，相对于媒介物对照，#p<0.05，双因素方差分析，图基事后检验)。图11C，肺泡壁(AW)与肺泡管(AD)肺血管的比率；图11D，所述肺血管的完全或部分闭塞(％)；
以及图11E，在MOVAT染色的肺切片中评估所述肺血管的完全或部分肌化(％)(n＝4，平均值±SEM，相对于Nx对照，****p<0.0001，相对于媒介物对照，###p<0.001，####p<0.0001，双因素方差分析，图基事后检验)。图11F，代表性MOVAT肺组织学，突出显示大的肺血管。图11G，全肺组织中针对GAPDH归一化的FHIT或BMPR2的相对mRNA表达(qPCR，n＝4，平均值±SEM，双因素方差分析)。图11H，代表性MOVAT肺组织学，呈现血管闭塞。图11I，RV中纤维化组织与总组织相比的百分比(n＝4，平均值±SEM，相对于Nx对照，**p<0.01，相对于媒介物对照，##p<
0.01，双因素方差分析，图基事后检验)。图11J至图11K，展示全RV组织学(图11J)和放大部分(图11K)的代表性三色染色。

[0308] 用恩扎妥林处理增加全肺中的FHIT和BMPR2表达(图11G)，几乎完全逆转血管闭塞(图11D)，并且有效减少小血管和大血管的肌化(图11E)以及RVH(图11B)和RV纤维化(图11I)。在恩扎妥林处理的SUGEN5416/低氧/常氧大鼠中，RVSP降低超过30mmHg。
实例XIII.恩扎妥林在SUGEN 5416/低氧大鼠中逆转肺气肿。

[0309] 在雄性Sasco Sprague Dawley大鼠中通过皮下注射20mg/kg体重的SU5416诱导实验性PH。在通过口服管饲每天施用5mg/kg体重的恩扎妥林或媒介物对照后，将动物在低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，之后是在常氧(Nx，21％O2)中的5周的时间。对MOVAT肺组织学的线性截距分析(n＝4，平均值±SEM，相对于Nx对照，*p<0.05，相对于媒介物对照，##p<0.01，双因素方差分析，图基事后检验)。代表性MOVAT肺组织学，呈现肺气肿变化(如箭头所标记)和血管闭塞。如图27A和图27B中的数据所示，恩扎妥林处理的动物展现比未处理对照显著更低的肺气肿变化和血管闭塞的证据，从而显示恩扎妥林可以逆转与肺气肿相关的肺组织损伤。
补充实例

[0310] 实例S1.将Fhit-/-C57BL/6与同窝出生的野生型(C57)小鼠在常氧(Nx，20％O2)、低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，低氧恢复(Rec，3周Hx/4周Nx)期是4周，与7周Nx对照进行比较。肺组织中针对β-肌动蛋白持家对照归一化的FHIT蛋白表达的代表性密度计分析(雄性，C57n＝3，Fhit-/-Nx n＝3，Fhit-/-Hx n＝5，Fhit-/-Rec n＝4)。所有条都表示平均值±SEM。相对于C57对照，****p<0.0001，双因素方差分析，图基事后检验。这个实验的数据概述于图12中。

[0311] 实例S2.在雄性Sasco Sprague Dawley大鼠中通过皮下注射20mg/kg体重的SU5416诱导实验性PAH。在通过口服管饲每天施用5mg/kg体重的恩扎妥林或媒介物对照后，将动物在低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，之后是在常氧(Nx，20％O2)中的5周的时间。对肺组织中针对β-肌动蛋白持家对照归一化的PKC(图13A)和p-PKC(图13B)蛋白表达(雄性，Nx n＝4，Nx Enz n＝4，SuHx n＝3，SuHx Enz n＝5)和针对PKC归一化的p-PKC(图13C)的密度计分析。PKC、p-PKC和β-肌动蛋白的代表性印迹(图13D)。所有条都表示平均值±SEM。双因素方差分析，图基事后检验。

[0312] 实例S3.将人PAEC铺板于6孔板上。在70％-80％汇合时，分别以0.5mM、5mM和15mM用恩扎妥林将细胞处理24小时。通过 Plus微型试剂盒(凯杰公司)分离RNA，并且通过 基因表达测定来测量Fhit、BMPR2和Id1基因表达。(图14A)FHIT、(图14B)BMPR2、(图14C)ID1的相对表达。所有条都表示平均值±SEM，n＝3，单因素方差分析，邓尼特(Dunnet)比较检验，与对照相比，*p<0.05，**p<0.01。

[0313] 实例S4.图15A至图15B，同步化PAEC中针对GAPDH归一化的BMPR2的相对mRNA表达，所述同步化PAEC与不同浓度(5nM-5μM)的(图15A)选择性PKCβ抑制剂Ly333531盐酸盐或(图15B)非选择性PKC抑制剂GF109203X一起孵育24小时(qPCR，t＝24h，n＝3，平均值±SEM，单因素方差分析，邓尼特事后检验，NS)。图15C至图15D，同步化PAEC中针对GAPDH归一化的Id1的相对mRNA表达，所述同步化PAEC与不同浓度(5nM-5μM)的(图15C)选择性PKCβ抑制剂Ly333531盐酸盐或(图15D)非选择性PKC抑制剂GF109203X(图15F)一起孵育24小时(qPCR，t＝24h，n＝3，平均值±SEM，单因素方差分析，邓尼特事后检验，NS)。图15E至图15F，同步化PAEC中针对GAPDH归一化的FHIT的相对mRNA表达，所述同步化PAEC与不同浓度(5nM-5μM)的(图15E)选择性PKCβ抑制剂Ly333531盐酸盐或(图15F)非选择性PKC抑制剂GF109203X(I)一起孵育24小时(qPCR，t＝24h，n＝3，平均值±SEM，相对于媒介物对照，**p<0.01，单因素方差分析，邓尼特事后检验)。

[0314] 实例S5.同步化PAEC中的半胱天冬酶3/7发光，所述同步化PAEC与5μM或15μM的恩扎妥林(阴影条)和/或5μM的选择性PKCβ抑制剂Ly333531盐酸盐或5μM的非选择性PKC抑制剂GF109203X一起孵育24小时(t＝24h，Caspase- 3/7测定，n＝3，平均值±SEM，相对于非恩扎妥林处理的对照，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001，相对于未处理的媒介物对照，####p<0.0001，双因素方差分析，邓尼特事后检验)。参见图16。

[0315] 实例S6.来自IPAH患者(无BMPR2突变)的代表性免疫组织化学载玻片。图17A：BMPR2表达，图17B：FHIT表达。FHIT减少主要定位于新内膜中。

[0316] 实例S7.将雌性Fhit-/-C57BL/6与同窝出生的野生型(C57)小鼠在常氧(Nx，20％O2)、低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，低氧恢复(Rec，3周Hx/4周Nx)期是4周，与7周Nx对照进行比较。数据显示于图18A至图18F中：图18A，通过肺动脉导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)(雌性，C57n＝3，FHIT-/-Nx n＝4，FHIT-/-Hx Rec n＝3)。图18B，通过RV与左心室和间隔的重量比(RV/LV+S)证实右心室(RV)肥大(雌性，C57n＝3，Fhit-/-Nx n＝4，FHIT-/-Hx n＝3，Fhit-/-Rec n＝5)。图18C，肺泡壁(AW)和肺泡管(AD)肺血管的损失。图18D，在MOVAT染色的肺切片中评估AW或AD血管的完全或部分肌化(％)(雌性，C57n＝3，Fhit-/-Nx n＝4，Fhit-/-Hx Rec n＝3)。图18E至图18F，代表性MOVAT肺组织学，表示远端小血管的血管损失(图18E)或血管肌化(图18F)。箭头指示血管位置。相对于Nx对照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，相对于C57对照，#p<0.05，###p<0.001，####p<0.0001，双因素方差分析，图基事后检验。

[0317] 实例S8.对FHIT的qPCR mRNA分析概述于图19A至图19H中：来自与健康对照相比具有FPAH患者和健康突变携带者的所选家族的转化的淋巴细胞中的(图19A至图19C)和BMPR2(图19D至图19F)表达，它们是在女性(图19B、图19E)、男性(图19C、图19F)和合并受试者(图19A、图19D)中分析的。n＝10，平均值±SEM，*p<0.05，单因素方差分析，邓尼特事后检验，关于患者人口统计学参见表1。(图19G、图19H)与同一家族的携带者相比，FPAH患者体内BMPR2和FHIT表达的图形展示。配对t检验，p＝0.0054BMPR2，p＝0.0026FHIT。

[0318] 实例S9.将人PAEC铺板于6孔板上(0.5x 106个细胞/孔)并用siFhit(Ambionselect，P/N 4392420)100nM转染，然后用非靶向siRNA 100nM通过RNAiMax(英杰公司)处理48小时。然后将细胞用恩扎妥林15uM处理24小时。通过 Plus微型试剂盒(凯杰公司)分离RNA，并且通过 基因表达测定(英杰公司)分析Fhit、BMPR2和Id1基因表达。使用 基因表达测定测量Fhit、BMPR2和Id1基因表达。图20A：FHIT的相对表达，图20B：BMPR2，图20C：ID1。所有条都表示平均值±SEM，n＝3，单因素方差分析，西达克(Sidack)多重比较检验，Ntsi相对于siFHIT，****p<0.0001，**p<0.01，siFHIT相对于siFHIT+Enz，###p<0.0005，##P<0.01。

[0319] 实例S10.通过FHIT敲低减少PAEC中的BMPR2和ID1是部分miR17-5依赖性的。将人PAEC铺板于6孔板上(0.5x 106个细胞/孔)并用siFhit(Ambion select，P/N 4392420)100nM和抗miR 17-5抑制剂(AM12412，安柏恩公司(Ambion))通过RNAiMax转染48小时。使用抗miR MiRNA抑制剂作为阴性对照(AM17010，安柏恩公司)。通过
miRNA ABC纯化试剂盒分离miRNA，并且使用 微小RNA测定分析所分离的miRNA。
使用 基因表达测定测量Fhit、BMPR2和Id1基因表达；数据显示于图21A：miR17.5的相对表达；图21B：FHIT；图21C：BMPR2；和图21D：ID1。所有条都表示平均值±SEM，n＝3，相对于Ntsi，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，单因素方差分析，图基事后检验，相对于NtMir，#p<0.05，非配对学生t检验。

[0320] 实例S11.在低氧处理后，WT和FHIT-/-C57BL/6小鼠不发生RV纤维化。将雄性野生型和FHIT-/-C57BL/6(C57)小鼠在低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，并且低氧恢复(Rec，3周Hx/4周Nx)期是4周。显示了代表性三色心脏组织学。用蓝色指示纤维化。必须将RV和LV+间隔相互分离以用于RV/LV+间隔的重量评估。参见图22。

[0321] 实例S12.恩扎妥林在FHIT-/-小鼠中在低氧下使得免受增加的RVSP的影响并上调BMPR2/Id1mRNA。使雄性FHIT-/-C57BL/6(C57)小鼠在低氧(Hx，10％O2)中暴露3周，通过微型渗透泵(Alzet 2004型)用恩扎妥林或媒介物(盐水)对照以5mg/kg体重处理。参见图23A，通过肺动脉导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)(n＝3，平均值±SEM，相对于假对照，*p<0.05，非配对学生t检验)。图23B至图23C，对肺组织中mRNA表达的ΔΔCt分析。(n＝3，平均值±SEM，相对于假对照，*p<0.05，**p<0.01，非配对学生t检验)。缩写：Enz-恩扎妥林[0322] 实例S13.恩扎妥林预防低氧诱导的实验性PAH在C57BL/6小鼠中的发生。将雄性野生型和Bmpr2+/-C57BL/6(C57)小鼠在常氧(Nx，20％O2)和低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，用或不用通过口服管饲/Alzet微型渗透泵2006型每天施用的5mg/kg恩扎妥林处理。数据概述于图24A至图24G中：图24A，通过肺动脉导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)(n＝3，平均值±SEM，相对于Nx对照，**p<0.01，单因素方差分析，西达克事后检验)。图24B，通过RV与左心室和间隔的重量比证实右心室(RV)肥大(n＝3，平均值±SEM，相对于媒介物对照，#p<0.05，双因素方差分析，图基事后检验)。图24C，肺泡壁(AW)和肺泡管(AD)肺血管的损失；
和图24D，在MOVAT染色的肺切片中评估所述肺血管的完全或部分肌化(％)(n＝3，平均值±SEM，相对于C57对照，*p<0.05，相对于媒介物对照，##p<0.01，###p<0.001，双因素方差分析，图基事后检验)。图24E，代表性MOVAT肺组织学。箭头指示血管位置。图24F至图24G，分别是大血管(图24F)和小血管(图24G)的代表性MOVAT肺组织学。箭头指示血管位置。

[0323] 实例S14.FK506和恩扎妥林在野生型C57BL/6小鼠中在低氧下对BMPR2/Id1而不是FHIT mRNA具有另外的作用，从而使得免受RVSP增加的影响。使雄性野生型C57BL/6(C57)小鼠在低氧(Hx，10％O2)中暴露3周，并且通过微型渗透泵(Alzet 2004型)用5mg/kg体重的恩扎妥林或媒介物对照(盐水)在0.05mg/kg/d FK506存在或不存在下处理。结果描绘于图25A至图25D中：图25A，通过肺动脉导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)(n＝3，平均值±SEM，相对于假对照，**p<0.01，单因素方差分析，邓尼特事后检验)。图25B至图25D，对肺组织中mRNA表达的ΔΔCt分析。(n＝3，平均值±SEM，相对于假对照，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，单因素方差分析，邓尼特事后检验)。缩写：FK-FK506，Enz-恩扎妥林。

[0324] 实例S15.Sprague Dawley大鼠肺中的代表性MOVAT肺组织学，在恩扎妥林治疗3周后比较常氧与Sugen/低氧条件。

[0325] 在雄性Sasco Sprague Dawley大鼠中通过皮下注射20mg/kg体重的SU5416诱导实验性PAH。在通过口服管饲每天施用5mg/kg体重的恩扎妥林或媒介物对照后，将动物在低氧(Hx，10％O2)的条件下饲养3周，之后是在常氧(Nx，20％O2)中的5周的时间。小肺血管的代表性MOVAT肺组织学显示于图26中。参考文献
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