工程化免疫球蛋白重链-轻链对及其用途
阅读：814发布：2021-10-28
专利汇可以提供工程化免疫球蛋白重链-轻链对及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了可包含第一异二聚体和第二异二聚体的异二聚体对，其中每个异二聚体包含免疫球蛋白重链或其 片段 和免疫球蛋白轻链或其片段。所述异二聚体的至少一个可在CH和/或CL结构域中包含一个或多个 氨 基酸修饰，在VH和/或VL结构域中包含一个或多个氨基酸修饰或包含其组合。经修饰的氨基酸可以是轻链与重链之间的界面的部分，并且通常被修饰来产生每一条重链与所需轻链之间的优先 配对 ，以便当所述异二聚体的两条重链和两条轻链在细胞中共表达时，所述第一异二聚体的重链优先与所述轻链的一条链而非另一条链配对。同样地，所述第二异二聚体的重链可优先与第二轻链而非第一轻链配对。，下面是工程化免疫球蛋白重链-轻链对及其用途专利的具体信息内容。
1.一种分离的抗原结合多肽构建体，其包含至少第一异二聚体和第二异二聚体，
所述第一异二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；并且所述第二异二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中所述第一异二聚体的所述H1或L1序列的至少一个与所述第二异二聚体的对应H2或L2序列不同，并且其中
H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；
L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)；
以及
H1、H2、L1和L2的至少一个包含至少一个恒定结构域和/或至少一个可变结构域的至少一个氨基酸修饰，其中H1相较于L2优先与L1配对，并且H2相较于L1与优先与L2配对。
2.根据权利要求1所述的构建体，其中所述构建体还包含异二聚体Fc，所述Fc包含至少2个CH3序列，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联于所述第一异二聚体和所述第二异二聚体，其中所述二聚化的CH3序列具有约68℃或更高的解链温度(Tm)，如通过差示扫描量热法(DSC)测量的，并且其中所述构建体是双特异性的。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的构建体，其中当H1、H2、L1和L2在细胞或哺乳动物细胞中共表达时，或当H1、H2、L1和L2在无细胞表达系统中共表达时，或当H1、H2、L1和L2共产生时，或当H1、H2、L1和L2通过氧化还原产生体系共产生时，H1相较于L2优先与L1配对，并且H2相较于L1优先与L2配对。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2的至少一个包含VH和/或VL结构域的至少一个氨基酸修饰和CH1和/或CL结构域的至少一个氨基酸修饰，以便H1相较于L2优先与L1配对，和/或H2相较于L1优选与L2配对。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的构建体，其中如果H1在所述CH1结构域中包含至少一个氨基酸修饰，则L1和L2的至少一个在所述CL结构域中包含至少一个氨基酸修饰；和/或如果H1在所述VH结构域中包含至少一个氨基酸修饰，则L1和L2的至少一个在所述VL结构域中包含至少一个氨基酸修饰。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的构建体，其中H1、L1、H2,和/或L2包含至少1、
2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2的至少一个包含至少一个恒定结构域和/或至少一个可变结构域的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的构建体，其中当L1和L2与H1和H2的至少一个共表达时，H1-L1和H2-L2异二聚体对的至少一个对各自对应的H1-L2或H2-L1异二聚体对的至少一个的相对配对大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、
61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，并且其中所述经修饰的H1-L1或H2-L2异二聚体对的相对配对大于在无所述至少一个氨基酸修饰的对应的H1-L1或H2-L2异二聚体对中观察到的各自相对配对。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的构建体，其中
通过如经由所述第一和第二异二聚体的至少一个的DSC测量的解链温度(Tm)所测量的热稳定性在无所述至少一个氨基酸修饰的对应的异二聚体的Tm的约0℃、1℃、2℃、3℃、
4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃内；或
其中通过如经由每个包含至少一个氨基酸修饰的异二聚体的DSC测量的解链温度
(Tm)所测量的热稳定性在无所述至少一个氨基酸修饰的对应的异二聚体的Tm的约0℃、
1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃内。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的构建体，其中每个异二聚体对于其所结合的抗原的亲和力，在通过表面等离子体共振(SPR)或FACS测量的各自未修饰的异二聚体对于相同抗原的亲和力的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45或50倍内。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的构建体，其中
H1和L1的至少一个包含含有至少一个氨基酸修饰的至少一个结构域，当H1相较于L2与L1配对时，导致更大的氨基酸的空间互补性；或
其中H2和L2的至少一个包含含有至少一个氨基酸修饰的至少一个结构域，当H2相较于L1与L2配对时，导致更大的氨基酸的空间互补性；或
其中H1和L1的至少一个包含含有至少一个氨基酸修饰的至少一个结构域，当H1相较于L2与L1配对时，导致更大的带电荷的氨基酸之间的静电互补性；或
其中H2和L2的至少一个包含含有至少一个氨基酸修饰的至少一个结构域，当H2相较于L1与L2配对时，导致更大的带电荷的氨基酸之间的静电互补性。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的构建体，其中所述至少一个氨基酸修饰选自表
29、表30或表31中显示的那些氨基酸修饰的一个或多个修饰。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的构建体，其中所述构建体还包含含有至少两个CH3序列的Fc，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联于所述第一异二聚体和所述第二异二聚体。
14.根据权利要求13所述的构建体，其中所述Fc是人Fc、人IgG1Fc、人IgA Fc、人IgG Fc、人IgD Fc、人IgE Fc、人IgM Fc、人IgG2Fc、人IgG3 Fc或人IgG4 Fc。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的构建体，其中所述Fc是异二聚体Fc。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的构建体，其中所述Fc在CH3序列的至少一个中包含一个或多个修饰。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的构建体，其中所述二聚化CH3序列具有如通过DSC测量的约68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、77.5℃、78℃、
79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃或更高的解链温度(Tm)。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的构建体，其中所述Fc是当产生时以大于约
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异二聚体；或其中所述Fc是当表达时或当通过单细胞表达时以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％的纯度形成的异二聚体。
19.根据权利要求13-18中任一项所述的构建体，其中所述Fc在CH3序列的至少一个中包含一个或多个修饰，所述修饰促进稳定性与野生型同二聚体Fc相当的异二聚体Fc的形成。
20.根据权利要求13-19中任一项所述的构建体，其中所述Fc还包含至少一个CH2序列。
21.根据权利要求20所述的构建体，其中所述Fc的CH2序列包含一个或多个修饰。
22.根据权利要求13-21中任一项所述的构建体，其中所述Fc包含一个或多个修饰以促进Fc-γ受体的选择性结合。
23.根据权利要求13-22中任一项所述的构建体，其中所述Fc通过一个或多个接头偶联于所述异二聚体，或其中所述Fc通过一个或多个接头偶联于H1和H2。
24.根据权利要求23所述的构建体，其中所述一个或多个接头是一个或多个多肽接头。
25.根据权利要求23所述的构建体，其中所述一个或多个接头包含一个或多个抗体铰链区。
26.根据权利要求23所述的构建体，其中所述一个或多个接头包含一个或多个IgG1铰链区。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的构建体，其中所述一个或多个接头包含一个或多个修饰。
28.根据权利要求27所述的构建体，其中所述一个或多个修饰促进Fc-γ受体的选择性结合。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的构建体，其中所述至少一个氨基酸修饰是至少一个氨基酸突变或其中所述至少一个氨基酸修饰是至少一个氨基酸置换。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2的每一个的序列来源于人序列。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的构建体，其中所述构建体是多特异性的或双特异性的。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的构建体，其中所述构建体是多价的或二价的。
33.一种分离的多核苷酸或分离的多核苷酸的组，所述分离的多核苷酸包含编码根据权利要求1至32中任一项所述的构建体的至少一个序列。
34.根据权利要求33所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸或多核苷酸的组是cDNA。
35.一种载体或载体的组，所述载体包含根据权利要求33或34所述的多核苷酸的一个或多个或所述多核苷酸的组。
36.根据权利要求35所述的载体或载体的组，其选自质粒、多顺反子载体、病毒载体、非附加型哺乳动物载体、表达载体和重组表达载体。
37.一种分离的细胞，其包含根据权利要求33-34所述的多核苷酸或多核苷酸的组，或根据权利要求35或36所述的载体或载体的组。
38.根据权利要求37所述的分离的细胞，其中所述细胞是杂交瘤、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK293细胞。
39.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至32中任一项所述的构建体和药学上可接受的载体。
40.根据权利要求39中所述的药物组合物，其还包含一种或多种选自缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂和赋形剂的物质。
41.根据权利要求1-32中任一项所述的构建体或根据权利要求39-40中任一项所述的药物组合物用于治疗受试者的疾病或病症或癌症或血管疾病或用于制造药剂的用途。
42.一种治疗患有疾病或病症或癌症或血管疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用根据权利要求1-32中任一项所述的构建体或根据权利要求39-40中任一项所述的组合物。
43.一种抑制、减弱或阻断细胞内或至细胞的信号的方法，其包括将所述细胞与根据权利要求1-32中任一项所述的构建体或根据权利要求39-40中任一项所述的组合物接触。
44.一种从宿主细胞培养物获得根据权利要求1-32中任一项所述的构建体的方法，所述方法包括步骤：
(a)获得包含含有一个或多个编码所述构建体的核酸序列的至少一个宿主细胞的宿主细胞培养物；和
(b)从所述宿主细胞培养物回收所述构建体。
45.一种获得根据权利要求1-32中任一项所述的构建体的方法，其包括步骤：
(a)获得H1、L1、H2和L2；
(b)使H1相较于L2优先与L1配对，并且使H2相较于L1优先与L2配对；和
(c)获得所述构建体。
46.一种制备根据权利要求1至32中任一项所述的构建体的方法，其包括：
a.获得编码至少一个构建体的多核苷酸或所述多核苷酸的组；
b.确定用于引入至少一个宿主细胞的每个多核苷酸或多核苷酸的组的最佳比率，其中通过估计在H1、L1、H2和L2表达时形成的H1-L1和H2-L2异二聚体对相较于在H1、L1、H2和L2表达时形成的错配的H1-L2和H2-L1异二聚体对的量来确定最佳比率；
c.选择优选的最佳比率，其中用优选的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸的组转染所述至少一个宿主细胞导致所述构建体的表达；
d.用最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸的组转染所述至少一个宿主细胞；和
e.培养所述至少一个宿主细胞以表达所述构建体。
47.根据权利要求46所述的方法，其中选择最佳比率通过在瞬时转染系统中进行转染来估计。
48.根据权利要求46-47中任一项所述的方法，其中用优选的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸的组转染所述至少一个宿主细胞导致所述构建体的最佳表达。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的方法，其中所述构建体包含含有至少两个CH3序列的Fc，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联于所述第一异二聚体和所述第二异二聚体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述Fc是异二聚体，任选地包含一个或多个氨基酸修饰。
51.一种计算机可读存储介质，其存储
包含数据的数据集，所述数据代表包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)的第一异二聚体中的互补突变；以及包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)的第二异二聚体中的互补突变，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，并且其中互补突变的数据集包含代表表29、30或31中所列的那些突变或那些突变的亚组的数据；和
用于测定H1将相较于L2优选与L1配对和/或H2将相较于L1优选与L2配对的可能
性的计算机可执行代码。
52.一种用于测定优先配对的计算机实现的方法，其包括：
获得包含数据的数据集，所述数据代表包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)的第一异二聚体中的互补突变；以及包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)的第二异二聚体中的互补突变，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，并且其中互补突变的数据集包含代表表29、30或31中所列的那些突变或那些突变的亚组的数据；和
通过计算机处理器测定H1将相较于L2优先与L1配对和/或H2将相较于L1优先与
L2配对的可能性。
53.根据权利要求52所述的方法，所述方法还包括产生根据权利要求1-32中任一项所述的构建体。
54.一种产生双特异性抗原结合多肽构建体的方法，所述双特异性构建体包含含有来自第一单特异性抗原结合多肽的第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)的第一异二聚体；和包含来自第二单特异性抗原结合多肽的第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)的第二异二聚体，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，所述方法包括：
a.获得包含数据的数据集，所述数据代表一组H1、H2、L1和L2内的氨基酸修饰，以便在将一个亚组的所述修饰引入H1、H2、L1和/或L2时，在测试系统中H1对相较于L2优先与L1配对并且H2对相较于L1优先与L2配对；
b.将一个亚组的来自所述数据集的一个或多个修饰引入所述第一异二聚体和/或所述第二异二聚体；和
c.在至少一个宿主细胞中共表达所述第一异二聚体和所述第二异二聚体，以产生包含所述双特异性构建体的表达产物。
55.根据权利要求54所述的方法，其还包括测定表达产物中所述双特异性构建体相对于其它多肽产物的量。
56.根据权利要求54-55中任一项所述的方法，其中以相较于其它多肽产物大于70％的纯度产生所述双特异性构建体。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的方法，其中所述数据集是根据权利要求51所述的数据集。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的方法，其还包括将另外的氨基酸修饰添加至H1、H2、L1或L2的至少一个以相较于其它多肽产物增加所述双特异性构建体的纯度的步骤。
59.根据权利要求54-58中任一项所述的方法，其中所述构建体包含含有至少2个CH3序列的Fc，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联于所述第一异二聚体和所述第二异二聚体。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述Fc是异二聚体，任选地包含一个或多个氨基酸修饰。
61.根据权利要求54-60中任一项所述的方法，其中所述抗原结合多肽是抗体、Fab或scFv。
工程化免疫球蛋白重链-轻链对及其用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年11月28日提交的美国临时申请No.61/730,906，2013年2月6日提交的美国临时申请No.61/761,641，2013年5月2日提交的美国临时申请
No.61/818,874和2013年8月23日提交的美国临时申请No.61/869,200的权益，所述每篇临时申请的全文据此出于所有目的以引用的方式并入。
No.61/818,874和2013年8月23日提交的美国临时申请No.61/869,200的权益，所述每篇临时申请的全文据此出于所有目的以引用的方式并入。
[0004] 本申请包含已通过EFS-网提交并全文据此以引用方式并入的序列表。所述ASCII拷贝(于2013年X月X日创建)命名为XXX_sequencelisting.txt，大小为XXX字节。
[0005] 背景
[0006] 双特异性抗体能够结合两个不同表位。该表位可在相同的抗原上，或每一个表位可在不同的抗原上。双特异性抗体的该特性使它们成为用于各种治疗应用的具有吸引力的工具，其中在疾病的治疗中存在靶向或招募超过一种分子的治疗益处。形成双特异性抗体的方法之一可包括两条独特的抗体重链和两条独特的抗体轻链的伴随表达。以与野生型相似的形式正确形成双特异性抗体仍然是个挑战，因为抗体重链已进化至以相对混杂的方式结合抗体轻链。作为这种混杂配对的结果，两条抗体重链和两条抗体轻链的伴随表达自然会导致一加扰的重链-轻链配对。这种错误配对仍然为双特异性治疗剂的产生的一个重大挑战，其中均匀配对是良好的可制造性和生物效能的基本要求。
[0007] 已描述了若干种制备其中特定抗体轻链或片段与特定抗体重链或片段配对的双特异性抗体的方法。各种解决该问题的方法的综述可见于Klein等人，(2012)mAbs 4：6，1-11。国际专利申请No.PCT/EP2011/056388(WO 2011/131746)描述了用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其中不对称突变被引入两个单特异性起始蛋白的CH3区以在还原条件下温育后驱动两个单特异性IgG4-或IgG4-样抗体之间的定向“Fab-臂”或“半分子”交换。
[0008] Schaefer等人(Roche Diagnostics GmbH)描述了将来源于两个现存抗体的两条重链和两条轻链装配成人双价双特异性IgG抗体而不使用人工接头(PNAS(2011)108(27)：11187-11192)的方法。所述方法包括交换双特异性抗体的一半的抗原结合片段(Fab)内的重链与轻链结构域。
[0009] Strop等人(Rinat-Pfizer Inc.)描述通过单独地表达和纯化两种目标抗体，随后在指定的氧化还原条件下将它们混合来产生稳定的双特异性抗体的方法(J.Mol.Biol.(2012)420：204-19)。
[0010] Zhu等人(Genentech)已工程化完全不具有恒定结构域的由变异的结构域抗体片段组成的双链抗体(diabody)构建体的VL/VH界面中的突变，并且产生异二聚体双链抗体(Protein Science(1997)6：781-788)。类似地，Igawa等人(Chugai)还已工程化单链双链抗体的VL/VH界面中的突变，以促进双链抗体的选择性表达和抑制其异构化(Protein Engineering、Design & Selection(2010)23：667-677)。
[0011] 美国专利公开No.2009/0182127(Novo Nordisk、Inc.)描述了通过修饰轻链-重链对的Fc界面和CH1∶CL界面上的氨基酸残基进行的双特异性抗体的产生，所述修饰减弱了一个对的轻链与另一个对的重链相互作用的能力。
[0012] 概述
[0013] 本文中描述了一种包含至少第一异二聚体和第二异二聚体的分离的抗原结合多肽构建体，所述第一异二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；并且所述第二异二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中第一异二聚体的H1或L1序列的至少一个与第二异二聚体的对应H2或L2序列不同，并且其中H1和H2各自包含至少一个重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)；以及H1、H2、L1和L2的至少一个在至少一个恒定结构域和/或至少一个可变结构域中包含至少一个氨基酸修饰，其中H1相较于L2优先与L1配对，并且H2相较于L1与优先与L2配对。
[0014] 在一些方面，所述构建体还包含异二聚体Fc，所述Fc包含至少2个CH3序列，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联于第一异二聚体和第二异二聚体，其中所述二聚化的CH3序列具有约68℃或更高的解链温度(Tm)，如通过测量的差示扫描量热法(DSC)测量的，并且其中所述构建体是双特异性的。
[0015] 在一些方面，所述至少一个氨基酸修饰选自表或实施例中示出的至少一个氨基酸修饰。
[0016] 在一些方面，H1相较于L2优先与L1配对，并且H2相较于L1优先与L2配对，当H1、H2、L1和L2在细胞或哺乳动物细胞中共表达时，或当H1、H2、L1和L2在无细胞表达系统中共表达时，或当H1、H2、L1和L2共表达时，或当H1、H2、L1和L2通过氧化还原产生体系共产生时。
[0017] 在一些方面，H1、H2、L1和L2的至少一个包含VH和/或VL结构域的至少一个氨基酸修饰和CH1和/或CL结构域的至少一个氨基酸修饰，以便H1相较于L2优先与L1配对，和/或H2相较于L1优选与L2配对。
[0018] 在一些方面，如果H1在CH1结构域中包含至少一个氨基酸修饰，则L1和L2的至少一个在CL结构域中包含至少一个氨基酸修饰；和/或如果H1在VH结构域中包含至少一个氨基酸修饰，则L1和L2的至少一个在VL结构域中包含至少一个氨基酸修饰。
[0019] 在一些方面，H1、L1、H2和/或L2包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。在一些方面，H1、H2、L1和L2的至少一个包含至少一个恒定结构域和/或至少一个可变结构域的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
[0020] 在一些方面，当L1和L2与H1和H2的至少一个共表达时，H1-L1和H2-L2异二聚体对的至少一个对各自对应的H1-L2或H2-L1异二聚体对的至少一个的相对配对大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％，并且其中经修饰的H1-L1或H2-L2异二聚体对的相对配对大于在无至少一个氨基酸修饰的对应的H1-L1或H2-L2异二聚体对中观察到的各自相对配对。
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％，并且其中经修饰的H1-L1或H2-L2异二聚体对的相对配对大于在无至少一个氨基酸修饰的对应的H1-L1或H2-L2异二聚体对中观察到的各自相对配对。
[0021] 在一些方面，通过解链温度(Tm)(如通过第一和第二异二聚体的至少一个的DSC测量的)测量的热稳定性在无至少一个氨基酸修饰的对应的异二聚体的Tm的约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃内。在一些方面，通过解链温度(Tm)(如通过每个包含至少一个氨基酸修饰的异二聚体的DSC测量的)测量的热稳定性在无至少一个氨基酸修饰的对应的异二聚体的Tm的约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃内。
[0022] 在一些方面，每个异二聚体对于其所结合的抗原的亲和力在通过表面等离子体共振(SPR)或FACS测量的各自未修饰的异二聚体对于相同抗原的亲和力的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45或50倍内。
[0023] 在一些方面，H1和L1的至少一个包含含有至少一个氨基酸修饰的至少一个结构域，当H1相较于L2与L1配对时，导致更大的氨基酸的空间互补性。在一些方面，H2和L2的至少一个包含至少一个包含至少一个氨基酸修饰的至少一个结构域，当H2相较于L1与L2配对时，导致更大的氨基酸的空间互补性。在一些方面，H1和L1的至少一个包含含有至少一个氨基酸修饰的至少一个结构域，当H1相较于L2与L1配对时，导致更大的带电荷的氨基酸之间的静电互补性。在一些方面，H2和L2的至少一个包含含有至少一个氨基酸修饰的至少一个结构域，当H2相较于L1与L2配对时，导致更大的带电荷的氨基酸之间的静电互补性。
[0024] 在一些方面，所述至少一个氨基酸修饰是一组表或实施例的至少一个中显示的突变。在一些方面，所述至少一个修饰不是H1-Q39E、L1-Q38K、H2-Q39K和L2-Q38E。在一些方面，所述至少一个修饰不是H1-Q39E、L1-Q38E、H2-Q39K和L2-Q38K。
[0025] 在一些方面，所述构建体还包含含有至少两个CH3序列的Fc，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联于第一异二聚体和第二异二聚体。
[0026] 在一些方面，所述Fc是人Fc、人IgG1 Fc、人IgA Fc、人IgG Fc、人IgD Fc、人IgE Fc、人IgM Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc或人IgG4Fc。在一些方面，所述Fc是异二聚体Fc。在一些方面，所述Fc在CH3序列的至少一个中包含一个或多个修饰。在一些方面，二聚化CH3序列具有约68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、77.5℃、78℃、79℃、
80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃或更高的解链温度(如通过DSC测量的)。在一些方面，所述Fc是当产生时以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异二聚体；或其中所述Fc是当表达时或当通过单细胞表达时以大于约75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异二聚体。在一些方面，所述Fc在CH3序列的至少一个中包含一个或多个修饰，所述修饰可促进具有与野生型同二聚体Fc相比较的稳定性的异二聚体Fc的形成。在一些方面，所述Fc还包含至少一个CH2序列。在一些方面，所述Fc的CH2序列包含一个或多个修饰。在一些方面，所述Fc包含一个或多个修饰以促进Fc-γ受体的选择性结合。
80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃或更高的解链温度(如通过DSC测量的)。在一些方面，所述Fc是当产生时以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异二聚体；或其中所述Fc是当表达时或当通过单细胞表达时以大于约75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异二聚体。在一些方面，所述Fc在CH3序列的至少一个中包含一个或多个修饰，所述修饰可促进具有与野生型同二聚体Fc相比较的稳定性的异二聚体Fc的形成。在一些方面，所述Fc还包含至少一个CH2序列。在一些方面，所述Fc的CH2序列包含一个或多个修饰。在一些方面，所述Fc包含一个或多个修饰以促进Fc-γ受体的选择性结合。
[0027] 在一些方面，所述Fc通过一个或多个接头偶联于异二聚体，或其中所述Fc通过一个或多个接头偶联于H1和H2。在一些方面，所述一个或多个接头是一个或多个多肽接头。在一些方面，所述一个或多个接头包含一个或多个抗体铰链区。在一些方面，所述一个或多个接头包含一个或多个IgG1铰链区。在一些方面，所述一个或多个接头包含一个或多个修饰。在一些方面，对所述一个或多个接头的一个或多个修饰促进Fc-γ受体的选择性结合。
[0028] 在一些方面，所述至少一个氨基酸修饰是至少一个氨基酸突变或其中所述至少一个氨基酸修饰是至少一个氨基酸置换。
[0029] 在一些方面，H1、H2、L1和L2的每一个的序列来源于人序列。
[0030] 在一些方面，所述构建体是多特异性的或双特异性的。在一些方面，所述构建体是多价的或二价的。
[0031] 本文中还描述了一种分离的多核苷酸或分离的多核苷酸的组，所述分离的多核苷酸包含至少一个编码本文中描述的构建体的序列。在一些方面，所述多核苷酸或一组多核苷酸是cDNA。
[0032] 本文中还描述了一种载体或载体的组，所述载体包含本文中描述的多核苷酸的一个或多个或多核苷酸的组。在一些方面，所述载体或载体的组选自选自质粒、多顺反子载体、病毒载体、非附加型哺乳动物载体、表达载体和重组表达载体。
[0033] 本文中还描述了一种包含本文中描述的多核苷酸或多核苷酸的组或本文中描述的载体或载体的组的分离的细胞。在一些方面，所述细胞是杂交瘤、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK293细胞。
[0034] 本文中还描述了一种包含本文中描述的构建体和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些方面，所述组合物还包含一种或多种选自缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂和赋形剂的物质。
[0035] 本文中还描述了本文中描述的构建体或本文中描述的药物组合物用于治疗受试者的疾病或病症或癌症或血管疾病或制造药剂的用途。
[0036] 本文中还描述了一种治疗患有疾病或病症或癌症或血管疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用本文中描述的构建体或本文中描述的组合物。
[0038] 本文中还描述了一种从宿主细胞培养物获得本文中描述的构建体的方法，所述方法包括步骤：(a)获得包含含有一个或多个编码所述构建体的核酸序列的至少一个宿主细胞的宿主细胞培养物；和(b)从所述宿主细胞培养物回收所述构建体。
[0039] 本文中还描述了一种获得本文中描述的构建体的方法，其包括如下步骤：(a)获得H1、L1、H2和L2；(b)使H1相较于L2优先与L1配对，并且使H2相较于L1优先与L2配对；和(c)获得构建体。
[0040] 本文中还描述了一种制备本文中描述的构建体的方法，其包括：获得编码至少一个构建体的多核苷酸或多核苷酸的组；确定用于引入至少一个宿主细胞的每个多核苷酸或多核苷酸的组的最佳比率，其中通过估计在H1、L1、H2和L2表达时形成的H1-L1和H2-L2异二聚体对相较于在H1、L1、H2和L2表达时形成的错配的H1-L2和H2-L1异二聚体对的量来确定最佳比率；选择优选的最佳比率，其中用优选的最佳比率的多核苷酸或多核苷酸的组转染至少一个宿主细胞导致构建体的表达；以最佳比率的多核苷酸或多核苷酸的组转染至少一个宿主细胞；和培养至少一个宿主细胞以表达构建体。
[0041] 在一些方面，选择最佳比率通过在瞬时转染系统中进行转染来估计。在一些方面，用优选的最佳比率的多核苷酸或多核苷酸的组转染至少一个宿主细胞导致构建体的最佳表达。在一些方面，构建体包含含有至少残余分子个CH3序列的Fc，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联于第一异二聚体和第二异二聚体。在一些方面，所述Fc是异二聚体，任选地包含一个或多个氨基酸修饰。
[0042] 本文中还描述了一种存储包含数据的数据集的计算机可读存储介质，所述数据代表包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)的第一异二聚体中的互补突变；以及包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)的第二异二聚体中的互补突变，其中H1和H2各自包含至少一个重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，并且其中所述互补突变的数据集包含代表表或实施例中所列的那些突变或那些突变的亚组的数据；以及用于测定H1将相较于L2优选与L1配对和/或H2将相较于L1优选与L2配对的可能性的计算机可执行代码。
[0043] 本文中还描述了一种用于测定优先配对的计算机实现的方法，其包括：获得包含数据的数据集，所述数据代表包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)的第一异二聚体中的互补突变；以及包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)的第二异二聚体的互补突变，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，并且其中互补突变的数据集包含代表表或实施例中所列的那些突变或那些突变的亚组的数据；和通过计算机处理器测定H1将相较于L2优先与L1配对和/或H2将相较于L1优先与L2配对的可能性。在一些方面，所述方法还包括产生本文中描述的构建体。
[0044] 本文中还描述了一种产生双特异性抗原结合多肽构建体的方法，所述双特异性构建体包含含有来自第一单特异性抗原结合多肽的第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)的第一异二聚体；和包含来自第二单特异性抗原结合多肽的第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)的第二异二聚体，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，所述方法包括：获得包含数据的数据集，所述数据代表一组H1、H2、L1和L2内的氨基酸修饰，以便在将一个亚组的修饰引入H1、H2、L1和/或L2时，在该系统中H1相较于L2优先与L1配对并且H2相较于L1优先与L2配对；将一个亚组的来自所述数据集的一个或多个修饰引入所述第一异二聚体和/或所述第二异二聚体；和在至少一个宿主细胞中共表达所述第一异二聚体和所述第二异二聚体，以产生包含所述双特异性构建体的表达产物。
[0045] 在一些方面，所述方法还包括测定表达产物中双特异性构建体相对于其它多肽产物的量。在一些方面，以相较于其它多肽产物大于70％的纯度产生双特异性构建体。在一些方面，所述数据集是本文中描述的数据集。在一些方面，所述方法还包括将另外的氨基酸修饰添加至H1、H2、L1或L2的至少一个以相较于其它多肽产物增加所述双特异性构建体的纯度的步骤。在一些方面，所述构建体包含含有至少2个CH3序列的Fc，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联于第一异二聚体和第二异二聚体。在一些方面，所述Fc是异二聚体，任选地包含一个或多个氨基酸修饰。在一些方面，所述抗原结合多肽是抗体、Fab或scFv。
[0047] 图1提供了显示LCCA设计组中来自本文中描述的抗原结合构建体的异二聚体的优先配对的表，其中已对VH或VL结构域进行了氨基酸修饰。
[0048] 图2提供了显示LCCA设计组中异二聚体的优先配对的表，其中已对CH1或CL结构域进行了氨基酸修饰。
[0049] 图3提供了显示选择的来自本文中描述的抗原结合构建体的优先配对的或错配的异二聚体的热稳定性以及抗原对于其的亲和力的表达。
[0051] 图5提供了选择的异二聚体的尺寸排阻层析特征谱。
[0052] 图6描绘针对同源人种系序列的可变区、恒定区和J-区区段对齐的D3H44重链和轻链氨基酸序列。(图中的符号：*序列同一性，#界面热点(特异性驱动器)，+在设计中测试的已突变的残基)。图6A描绘人VH种系亚组(对于每一个家族展示一个代表性序列)。序列同一性基于D3H44对VH3和IGHJ3*02的比对。图6B描绘人κVL种系亚组(对于每一个家族展示一个代表性序列)。序列同一性基于D3H44对VKI和IGKJ1*01的比对。图6C描绘人λVL种系亚组(从每一个家族展示一个代表性序列)。序列同一性基于D3H44对VL1和IGLJ1*01的比对。图6D描绘人CH1等位基因序列。图6E描绘人κ和λ等位
基因序列。
基因序列。
[0053] 图7描绘概括设计双特异性抗体的策略的流程图。
[0054] 图8举例说明用于形成双特异性Mab(单克隆抗体)的工程化要求，以及定量重链轻链对所需的测定要求的高水平示意性概述。以高纯度(即，极少或无错配H-L缔合)工程化双特异性Mab的设计目标可通过合理地工程化(通过特定氨基酸突变的引入)两条独特重链针对它们的独特同源轻链的优先配对来实现。示意性显示该方法；此处H1已被工程化来优先与L1而非L2配对。同样地，H2已被工程化来优先与L2而非L1配对。双特异性Mab设计的实验筛选需要能够同时定量H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1的测定。这些测定要求可通过假定每一个双特异性Fab臂可被独立地工程化来简化。在该情况下，测定可仅需定量H1-L1∶H1-L2或H2-L2∶H2-L1，而非同时定量两者。
[0055] 图9提供了如何标记重链和轻链以及确定优先配对的示意性描绘。在该示意图中，圆圈代表其中转染3个构建体的细胞。表达产物从细胞分泌，并且使上清液(SPNT)在检测装置(在该情况下SPR芯片)上方流过。基于融合于两个竞争重链配对的轻链的两个不同标签的检测水平，可测定重链对两个轻链的优先配对的定量评估。
[0056] 图10描绘当两条全长重链的每一条与两条不同轻链共表达时预期的重链相关产物。使用MCA评估优先配对。
[0057] 图11描绘了示例性的一组H1、L1、H2、L2链，所述链被这样设计以便H1优先于L2与L1配对并且H2优先于L1与L2配对。提供了可变区重链和轻链界面的3D晶体结构的卡通表示。在所述界面上引入的突变实现两组各自用于优先形成强制对的可变区界面中的静电和空间互补性。在另一方面，在不正确对中存在不利的空间和静电错配，这可导致降低的对错配对的配对倾向性以及降低的稳定性。
[0058] 图12描绘了基于图11中显示的H1、L1、H2、L2链的示例性组，当H1、L1和L2共表达(左图框)时和当H2、L1和L2共表达(右图框)时产生的LC/MS谱。
[0059] 图13描绘了基于图11显示的设计的H1-L1和H2-L2对的生物物理性质的评估。图13A显示在蛋白A纯化之前和之后H1-L1和H2-L2对的非还原性SDS-PAGE分析，以及在凝胶底部显示的产物的产率；图13B显示H1-L1和H2-L2配对的产物的DSC热谱图；以及图
13C显示H2-L2对的UPLC-SEC(H2-L2)特征谱。
13C显示H2-L2对的UPLC-SEC(H2-L2)特征谱。
[0060] 图14描绘了当两个不同轻链与两个不同重链在细胞中共表达时预期的重链相关产物。使用SMCA(单克隆抗体竞争性测定)评估优先配对。
[0061] 图15描绘了基于图11中显示的设计的双特异性抗原结合构建体(H1-L1_H2-L2)的LC/MS谱。
[0062] 图16A左图框描绘了来源于图11中描绘的设计组的双特异性抗原结合构建体的纯度的评估。图显示SMCA变体以及由Her2结合Mab与异二聚体Fc组成的对照变体的考马斯染色的非还原SDS-PAGE。SMCA变体在蛋白A(ProtA)纯化后的纯度很高，并且在性质上与对照相当。SMCA变体的估计的ProtA后产率为20mg/L，并且可与40mg/ml的对照产率相比较。右图框(图16B)描绘上述双特异性构建体的SEC特征谱。观察到的主峰(＞90％的总峰面积)在～150KDa的分子量上运行并且由Mab单体组成。观察到的小峰在～75KDa上运行并且由半抗体组成。未观察到显著更高的分子量峰(潜在地表明聚集体种类)。
[0063] 图17A描绘显示基于图11中描绘的设计组的双特异性构建体对于TF或Her2抗原的单特异性结合的SPR数据(注意：该SMCA设计替换页(细则第26条)利用与图11中描绘的相同的H1-L1和H2-L2 MCA设计)。
[0064] 图17B描绘显示双特异性抗原结合构建体对TF和Her2抗原的同时双特异性结合的SPR数据。
[0065] 图18描绘了关于鉴定至关重要的界面残基和关于有关优先重链-轻链配对的设计的计算机建模的流程图。
[0066] 图19提供了描绘使用本发明中提供的强制突变对文库制备双特异性抗体的方法的示意图。
[0067] 详述
[0068] 本文中提供了可包含第一异二聚体和第二异二聚体的抗原结合多肽构建体(也称为异二聚体对)，其中每个异二聚体包含免疫球蛋白重链或其片段以及免疫球蛋白轻链。所述异二聚体的至少一个可包含免疫球蛋白重链恒定结构域1(CH1)中的一个或多个氨基酸修饰以及免疫球蛋白轻链恒定结构域(CL)中的一个或多个氨基酸修饰；免疫球蛋白重链可变结构域(VH)中的一个或多个氨基酸修饰和免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)中的一个或多个氨基酸修饰；或针对重链和轻链的恒定和可变结构域的前述氨基酸修饰的组合。
被修饰的氨基酸通常是轻链与重链之间的界面的部分，并且被修饰来产生每一个重链与所需轻链之间的优先配对，以便第一异二聚体的重链优先与轻链之一而非另一个配对。同样地，第二异二聚体的重链可优先与第二轻链而非第一轻链配。
被修饰的氨基酸通常是轻链与重链之间的界面的部分，并且被修饰来产生每一个重链与所需轻链之间的优先配对，以便第一异二聚体的重链优先与轻链之一而非另一个配对。同样地，第二异二聚体的重链可优先与第二轻链而非第一轻链配。
[0069] 如上文中指出的，本文中描述的氨基酸修饰的特定组合促进重链与特定轻链的优先配对，从而使得双特异性单克隆抗体(Mab)表达能够以可忽略的或有限的错配发生，并且使将所需的异二聚体从不想要的或错配的产物纯化出来的需要减小至最低限度。异二聚体可展示可与不包括所述氨基酸修饰的异二聚体相比较的热稳定性，并且还可显示可与不包括所述氨基酸修饰的异二聚体相比较的对于抗原的结合亲和力。
[0070] 第一和第二异二聚体的设计可用于产生靶向两个不同治疗靶或靶向相同抗原内的两个不同表位(重叠或非重叠)的双特异性抗体。
[0071] 本发明还提供了制备根据本发明的异二聚体对的方法。
[0072] 定义
[0073] 除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与所要求保护的主题所属领域中的技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的术语存在多个定义的情况下，以本章节中的那些为准。当提到一个URL或其它这种标识符或地址时，应理解这类标识符可以改变，并且互联网上的特定信息可以发生变动，但是等效信息可以通过搜索互联网来发现。对这类信息的援引显示了它们的可用性和公众传播。
[0074] 应理解上文一般描述与下文详细描述仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求保护的任何主题。在本申请中，除非另外明确陈述，否则单数的使用包括复数。
[0075] 在本说明书中，除非另外指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应被理解为包括所列举范围内的任何整数值，并且在适当时其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。如本文中所用，除非另外指明，“约”意指所指示范围、值、序列或结构的±10％。应理解，除非另外说明或由其上下文指定，如本文中所用，术语“一个(a)”和“一种(an)”是指所列举组分中的“一个或多个”。替代(例如，“或”)的使用应被理解为意指所述替代中的任一者、两者或其任何组合。如本文中所用，术语“包括”和“包含”同义地使用。此外，应理解来源于本文中描述的结构和取代基的不同组合的单独的单链多肽或免疫球蛋白构建体由本申请公开，其公开程度就如同每个单链多肽或异二聚体被单独地阐述。因此，选择具体组分以形成单独的单链多肽或异二聚体在本公开的范围内。
[0076] 本文中所用的章节标题仅出于组织性目的，并且不应解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册以及论文，皆据此出于任何目的全文以引用方式明确并入。
[0077] 应理解本文中描述的方法和组合物不限于本文中描述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂，并且这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的而无意限制本文所描述的方法和组合物的范围，所述范围将仅受所附权利要求书限制。
[0078] 本文提及的所有公布和专利出于描述和公开例如在所述公布中描述的构建体和方法的目的通过引用以其整体并入本文，所述构建体和方法可结合本文中所描述的方法、组合物和化合物使用。本文中所论述的公布仅因其公开内容在本申请的提交日期之前而提供。本文的任何内容都不应解释为认可由于先前发明或出于任何其它原因而使本文中描述的发明人无权先于所述公开。
[0079] 在本申请中，氨基酸名称和原子名称(例如N、O、C等)如由蛋白质数据库(PDB)(www.pdb.org)所定义来使用，所述蛋白质数据库是基于IUPAC命名法(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides(残基名称、原子名称等)，Eur.J.Biochem.，138、9-37(1984)连同Eur.J.Biochem.，152，1(1985)中的其修正。术语“氨基酸残基”主要地意欲指由20种天然存在的氨基酸组成的组中包含的氨基酸残基，所述20咱氨基酸即为丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基。
[0080] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述，反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所用，术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键相连接
[0081] 术语“核苷酸序列”或“核酸序列”意欲表示两个或更多个核苷酸分子的连续段。核苷酸序列可具有基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源或其任何组合。
[0082] “细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”在本文中可互换使用，并且所有这类术语应被理解为包括由细胞的生长或培养产生的子代。“转化”和“转染”可互换用于指将核酸序列引入细胞中的过程。
[0083] 术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，结合氢的α碳、羧基、氨基和R基)的化合物，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有经修饰的R基(诸如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。提及氨基酸包括，例如天然存在的蛋白质性L-氨基酸；D-氨基酸；化学修饰的氨基酸，诸如氨基酸变体和衍生物；天然存在的非蛋白质性氨基酸，如β-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有本领域已知的作为氨基酸的特征的特性的化学合成的化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于，□-甲基氨基酸(例如甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如，2-氨基-组氨酸、羟基-组氨酸、高组氨酸)、在侧链中具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)、以及其中侧链中的羧酸官能团被磺酸基团置换的氨基酸(例如，半胱氨酸)。将非天然氨基酸，包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一个或多个D-氨基酸并入本发明的蛋白质中可以是以多种不同的方式有利的。含有D-氨基酸的肽等与含有L-氨基酸的对应物相比展示体外或体内增加的稳定性。因此，当需要或要求较大的细胞内稳定性时，并入D-氨基酸的肽等的构建可以是特别有利的。更具体地说，D-肽等抗内源性肽酶和蛋白酶，从而在需要这类特性时提供改进的分子生物利用度以及延长的体内寿命。此外，D-肽等不能被高效地加工以用于向T辅助细胞进行II类主要组织相容性复合物限制的呈递，并且因此不太可能诱导完整生物体中的体液免疫反应。
[0084] 氨基酸可在本文以其通常已知的三字母符号或以由国际纯化学与应用化学联合会生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样地，核苷酸可以以它们通常公认的单字母代码表示。
[0085] “经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定核酸序列，“经保守修饰的变体”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或当核酸并不编码氨基酸序列时，是指基本上相同的序列。大量功能上相同的核酸由于遗传密码的简并性而对任何给定的蛋白质进行编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG以及GCU皆编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置上，密码子可以被改变成所描述的相应密码子中的任一个，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其为一种具有经保守修饰的变异的种类。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述每种可能的核酸沉默变异。本领域普通技术人员将认识到核酸中的每一个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG外)可被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一个沉默变异均暗含于每一个描述的序列中。
[0086] 关于氨基酸序列，本领域普通技术人员将认识到改变、添加或删除编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对于核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别置换、缺失或添加是“经保守修饰的变体”，其中变化产生氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸被化学上类似的氨基酸置换。提供功能相似的氨基酸的保守置换表对于本领域中普通技术人员来说已知的。这样的保守性修饰的变体附加于并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
[0087] 提供功能相似的氨基酸的保守置换表对于本领域普通技术人员来说已知的。以下八组各自包含为彼此的保守性置换的氨基酸：
[0088] 1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
[0089] 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
[0090] 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
[0091] 4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
[0092] 5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
[0093] 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
[0094] 7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
[0095] 8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
[0096] (参见，例如Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W H Freeman&Co.；第2版(1993年12月)。
[0097] 术语“相同”或百分比“同一性”，在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下是指两个或更多个序列或子序列是相同的。当在比较窗或指定区上针对最大对应进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法中的一种(或对于本领域普通技术人员来说可供使用的其它算法)或通过人工比对和目视检查所测量的，如果序列具有一定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即在指定区域上约50％同一性、约55％同一性、60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％约95％或约99％同一性)，那么所述序列是“大体上相同的”。该定义还指测试序列的互补序列。同一性可以存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或长度75至100个氨基酸或氨基酸或核苷酸的区域上，或者在未指定的情况下，在多核苷酸或多肽的整个序列上存在。编码本发明的多肽的多核苷酸(包括来自除人外的物种的同源物)可以通过包括以下步骤的方法来获得：在严格杂交条件下使用具有本发明的多核苷酸序列或其片段的标记的探针来筛选文库，以及分离含有所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。这类杂交技术对于本领域普通技术人员来说是公知的。
[0098] 如果多肽的衍生物或变体的氨基酸序列与来自原始肽的100个氨基酸的序列具有至少50％同一性，则所述衍生物或变体被认为与所述肽共有“同源性”或“同源”的。在某些实施方案中，所述衍生物或变体与所述肽或具有与所述衍生物相同的数目的氨基酸残基的所述肽的片段的衍生物或变体至少75％相同。在某些实施方案中，所述衍生物或变体与所述肽或具有与所述衍生物相同的数目的氨基酸残基作为衍生物的所述肽的片段的衍生物或变体至少85％相同。在某些实施方案中，所述衍生物的氨基酸序列与所述肽或具有与所述衍生物相同的数目的氨基酸残基的所述肽的片段至少90％相同。在一些实施方案中，所述衍生物的氨基酸序列与具有与所述衍生物相同的数目的氨基酸残基的所述肽的片段的衍生物或变体至少95％相同。某些实施方案中，所述衍生物或变体与所述肽或具有与所述衍生物相同的数目的氨基酸残基的所述肽的片段的衍生物或变体至少99％相同。
[0099] 如本文中所用，“分离的”多肽或构建体意指已被鉴定的以及与其天然细胞培养环境的组分分离的和/或从其回收的构建体或多肽。其天然环境的污染性组分是通常可干扰所述异源多聚体的诊断或治疗用途的材料，其可包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。
[0100] 在某些实施方案中，如本文中所用，本文中描述的“分离的”抗原结合构建体包含异二聚体对或包含异二聚体的“分离的”异二聚体或已被鉴定并且与其天然细胞培养环境的组分分离和/或从其回收的异二聚体对。基天然环境的污染性组分是可干扰异二聚体或抗原结合构建体的疹断或治疗用途的材料，其可包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。
[0101] 异二聚体以及抗原结合构建体和异二聚体对通常被纯化至大体上同质。短语“大体上同质的”、“大体上同质的形式”和“大体上同质”用于指示产物大体上不含来源于不需要的多肽组合(例如同二聚体)的副产品。根据纯度来表达，大体上同质意指副产品的量不超过10％，优选低于5％，更优选低于1％，最优选低于0.5％，其中所述百分比按重量计算。
[0102] 短语“选择性地(或特异性地)与......杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复合物混合物(包括但不限于，总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、形成双链(duplexing)或杂交。
[0103] 除非在本文中被明确地不同地定义，否则抗体技术领域中的技术人员所理解的术语各自被赋予本领域中获得的含义。已知抗体具有可变区、铰链区和恒定结构域。免疫球蛋白结构和功能综述于例如Harlow等人，编辑，Antibodies：A Laboratory Manual，第14章(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1988)中。
[0104] 如本文中所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”或“抗原结合多肽”可互换使用。“抗原结合多肽”是指大体上由免疫球蛋白基因或一个或多个其片段编码的特异性结合分析物(抗原)的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其进而分别定义了免疫球蛋白亚型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。此外，抗体可属于许多亚型中的一个同种型，例如IgG可属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。
[0105] 示例性免疫球蛋白(抗体)结构单位由两对多肽链组成，每一对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。术语“轻链”包括全长轻链和其具有充足的可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域在多肽的氨基末端上。轻链包括κ链和λ链。术语“重链”包括全长重链和其具有充足可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域VH和3个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域在多肽的氨基末端上，并且CH结构域在羧基末端上，CH3最靠近多肽的羧基末端。重链可具有任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)、IgA(包括IgA1和IgA2亚类)、IgM和IgE。术语“可变区”或“可变结构域”是指通常负责抗原识别的抗体的轻链和/或重链的部分，通常包括重链(VH)的大致氨基末端120至130个氨基酸和轻逻(VL)中的约100至110个氨基末端氨基酸。“互补决定区”或“CDR”是促成抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“构架”区(FR)可帮助维持CDR的正确构象以促进抗原结合区与抗原之间的结合。在结构上，构架区可位于抗体中的CDR之间。可变区通常展现通常3个高变区CDR联接的相对保守的构架区(FR)的相同的一般结构。来自每一对的两条链的CDR通常通过构架区来对齐，这可使得能够结合特定表位。从N末端至C末端，轻链和重链可变区通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。除非另外指出，否则氨基酸至每一个结构域的分配通常根据免疫学关注的蛋白质的Kabat序列的定义(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))。
在某些实施方案中，免疫球蛋白构建体包含来自连接至治疗性多肽的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的至少一个免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，本文所提供的免疫球蛋白构建体中包含的免疫球蛋白结构域是来自基于免疫球蛋白的构建体，诸如双抗体或纳米抗体。在某些实施方案中，本文所描述的免疫球蛋白构建体包含来自重链抗体诸如骆驼科动物抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本文所提供的免疫球蛋白构建体包含来自哺乳动物抗体诸如牛抗体、人抗体、骆驼科动物抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。
在某些实施方案中，免疫球蛋白构建体包含来自连接至治疗性多肽的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的至少一个免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，本文所提供的免疫球蛋白构建体中包含的免疫球蛋白结构域是来自基于免疫球蛋白的构建体，诸如双抗体或纳米抗体。在某些实施方案中，本文所描述的免疫球蛋白构建体包含来自重链抗体诸如骆驼科动物抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本文所提供的免疫球蛋白构建体包含来自哺乳动物抗体诸如牛抗体、人抗体、骆驼科动物抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。
[0106] “双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗原结合蛋白或抗体是具有两个不同的结合位点的杂交抗原(hybrid antigen)。双特异性抗原结合蛋白和抗体是多特异性抗原结合蛋白抗体的种类。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，所述表位可位于相同或不同的分子靶中。“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向超过一个抗原或表位的抗原结合蛋白或抗体。“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，所述两个结合位点具有相同的抗原特异性。二价抗原结合蛋白和二价抗体可以是双特异性的，参见，下文。除“多特异性”或“多功能性”抗体外的二价抗体，在某些实施方案中，通常被理解为其结合位点的每一个相同。
[0107] 术语“优先配对”在本文中用于描述第一多肽与第二多肽，例如本文中描述的抗原结合构建体和异二聚体对中的免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链的配对模式。这样，“优先配对”是指当一个或多个另外的不同的多肽同时存在时，当配对在第一与第二多肽之间发生时，所述第一多肽与第二多肽的优选配对。通常地，优先配对作为第一和第二多肽之一或两者的修饰(例如，氨基酸修饰)的结果而发生。通常地，优先配对导致配对的第一与第二多肽是在配对发生后存在的最丰富的二聚体。在本领中已知免疫球蛋白重链(H1)，如果与两个不同的免疫球蛋白轻链(L1和L2)共表达，将在统计上与两条轻链等同地配对，这导致大致50∶50的与L1配对的H1和与L2配对的H1的混合物。在该上下文中，如果当H1与L1和L2共表达时，H1-L1重链-轻链异二聚体的量大于H1-L2异二聚体的量，则“优先配对”可在例如H1与L1之间发生。因此，在该情况下，H1相对于L2优先与L1配对。
[0108] 抗体重链与抗体轻链配对并且在″界面″彼此相遇或接触。″界面″包括第一多肽中的与第二多肽的一个或多个″接触″氨基酸残基相互作用的一个或多个″接触″氨基酸残基。在一个上下文中，术语界面可用于描述Fc的二聚化的CH3结构域的界面，其中所述Fc优选来源于IgG抗体，诸如IgG1，最优选人IgG1抗体。
[0109] 与抗体轻链缔合的抗体重链通常彼此在“界面”相遇或接触。免疫球蛋白轻链与免疫球蛋白重链通过″界面″可操作地缔合。″界面″包含免疫球蛋白重链中的与免疫球蛋白轻链的界面中的一个或多个“接触”氨基酸残基相互作用的一个或多个“接触”氨基酸残基。如本文中所用，界面可包含免疫球蛋白重链的VH和CH1结构域以及免疫球蛋白轻链的VL和CL结构域。“界面”可来源于IgG抗体，最优选人IgG1抗体。
[0110] 如本文中所用，术语“氨基酸修饰”包括但不限于氨基酸突变、插入、缺失、置换、化学修饰、物理修饰和重排。
[0111] 抗原结合构建体和异二聚体对
[0112] 本文中描述的抗原结合构建体可包含第一异二聚体和第二异二聚体；每个异二聚体通过使免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链配对获得。免疫球蛋白重链和轻链的恒定和可变结构域的结构和组织在本领域是公知的。免疫球蛋白重链通常包含一个可变(VH)结构域和3个恒定结构域CH1、CH2和CH3。免疫球蛋白轻链通常包含一个可变(VL)结构域和一个恒定(CL)结构域。可产生这些典型形式的各种修饰。
[0113] 本文中描述的抗原结合构建体和异二聚体对可包含第一异二聚体和第二异二聚体，每个异二聚体包含免疫球蛋白/抗体重链或其具有至少VH和CH1结构域的片段，以及免疫球蛋白/具有VL结构域和CL结构域的抗体轻链。在一个实施方案中，异二聚体对的异二聚体和抗原结合构建体包含全长免疫球蛋白重链。在另一个实施方案中，异二聚体对的异二聚体或抗原结合构建体包含包括至少VH和CH1结构域的免疫球蛋白重链的片段。在一个实施方案中，异二聚体对的两个异二聚体都包含免疫球蛋白重链的包含至少VH和CH1结构域的氨基末端片段。在另一个实施方案中，异二聚体对的两个异二聚体都包含免疫球蛋白重链的包含至少VH和CH1结构域的羧基末端片段。
[0114] 异二聚体对的每个异二聚体可特异性结合抗原或表位。在一个实施方案中，每个异二聚体的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链来源于已知的治疗性抗体或从其工程化而来。治疗性抗体是在治疗具有疾病或病症或易患所述疾病或病症的哺乳动物的所述疾病或病症中有效的抗体。每个异二聚体所源自的合适的治疗性抗体可来源于(包括但不限于)阿巴伏单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、奥罗格雷(aurograb)、巴皮纽阻单抗、巴利昔单抗、贝利单抗、贝伐单抗、贝伐珠单抗(briakinumab)、卡那单抗、卡妥索单抗、赛妥珠单抗单抗、西妥昔单抗、赛尼哌、狄诺塞麦、依法利珠、加利昔单抗、吉妥珠单抗单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、易普利姆玛、鲁昔单抗、美泊利单抗、莫维珠单抗、莫罗单抗、依夫单抗(mycograb)、那他珠单抗、尼妥珠单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥伐单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、培妥珠单抗、兰尼单抗、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥昔单抗、替利珠单抗(teplizumab)、托珠单抗/阿他珠单抗(atlizumab)、托西莫单抗、曲妥单抗、ProxiniumTM、RencarexTM、优特克单抗和扎妥木单抗。
[0115] 在一个实施方案中，每一个二聚体的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链来源于抗体或从抗体工程化而来，所述抗体结合分子，包括但不限于下列表的蛋白质以及属于下列表的蛋白质的亚单位、结构域、基序和表位：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子诸如因子VII、因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病因子；抗凝血因子诸如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；RANTES(活化调节正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白诸如人血清白蛋白；苗勒抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体诸如，例如，EGFR、VEGFR；干扰素诸如α干扰素(α-IFN)、β干扰素(β-IFN)和γ干扰素(γ-IFN)；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子诸如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子诸如AFGF及PFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；去(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80和CD147；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素诸如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，诸如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如，IL-1至IL-13；TNF-α，超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原诸如，例如，在AIDS包膜的一部分，例如，gp120；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；细胞粘附分子诸如LFA-1、Mac
1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3和VCAM、a4/P7整联蛋白和(Xv/p3整联蛋白，包括任何一个或它们的亚基、整联蛋白α亚单位诸如CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整联蛋白β亚单位诸如CD29、CD 18、CD61、CD104、β5、β6、β7和β8；整联蛋白亚单位组合、包括但不限于αVβ3、αVβ5和α4β7；细胞凋亡途径的成员；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mp1受体；CTLA-4；蛋白C；Eph受体诸如EphA2、EphA4、EphB2等；人白细胞抗原(HLA)诸如HLA-DR；补体蛋白诸如补体受体CR1、C1Rq及其它补体因子诸如C3和C5；糖蛋白受体诸如GpIb.α.、GPIIb/IIIa和CD200；及上文所列多肽的任何多肽的片段。
1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3和VCAM、a4/P7整联蛋白和(Xv/p3整联蛋白，包括任何一个或它们的亚基、整联蛋白α亚单位诸如CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整联蛋白β亚单位诸如CD29、CD 18、CD61、CD104、β5、β6、β7和β8；整联蛋白亚单位组合、包括但不限于αVβ3、αVβ5和α4β7；细胞凋亡途径的成员；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mp1受体；CTLA-4；蛋白C；Eph受体诸如EphA2、EphA4、EphB2等；人白细胞抗原(HLA)诸如HLA-DR；补体蛋白诸如补体受体CR1、C1Rq及其它补体因子诸如C3和C5；糖蛋白受体诸如GpIb.α.、GPIIb/IIIa和CD200；及上文所列多肽的任何多肽的片段。
[0116] 在实施方案中，每个异二聚体的免疫球蛋白重链和轻链来源于抗体或从其工程化而来，所述抗体特异性结合癌症抗原，包括但不限于ALK受体(多效蛋白受体)、多效蛋白、KS 1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸性磷酸酯；前列腺特异性抗原(PSA)；黑素瘤相关抗原p97；黑素瘤抗原gp75；高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)；前列腺特异性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多形上皮粘蛋白抗原；人乳脂肪球抗原；结直肠肿瘤相关抗原诸如：CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1、LEA；伯基特淋巴瘤抗原38.13；CD19；人B淋巴瘤抗原CD20；CD33；黑素瘤特异性抗原诸如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3；肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(TSTA)；病毒诱导的肿瘤抗原，包括T-抗原、DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原；癌癌胚抗原α胎蛋白诸如结肠癌的CEA、514癌胚滋养糖蛋白和膀胱肿瘤癌胚抗原，分化抗原诸如人肺癌抗原L6和L20，纤维肉瘤的抗原；人白血病T细胞抗原Gp37；新糖蛋白，神经鞘脂；乳腺癌抗原诸如EGFR(表皮生长因子受体)；NY-BR-16；NY-BR-16和HER2抗原(p185HER2)；多形上皮粘蛋白(PEM)；
恶性人淋巴细胞抗原APO-1；分化抗原诸如在胎儿红细胞中发现的I抗原；在成人红细胞中发现的原发性内胚层I抗原；植入前胚胎；在胃腺癌中发现的I(Ma)；在乳腺上皮细胞中发现的M18、M39；在骨髓细胞中发现的SSEA-1；VEP8；VEP9；Myl；Va4-D5；在结直肠癌中发现的D156-22；TRA-1-85(血型H)；在睾丸和卵巢癌中发现的SCP-1；在结肠腺癌中发现的C14；在肺腺癌中发现的F3；在胃癌中发现的AH6；Y半抗原；在胚胎癌细胞中发现的Ley；
TL5(血型A)；在A431细胞中发现的EGF受体；在胰腺癌中发现的E1系列(血型B)；在胚胎癌细胞中发现的FC10.2；胃腺癌抗原；在腺癌中发现的CO-514(血型Lea)；在腺癌中发现的NS-10；CO-43(血型的Leb)；在A431细胞的EGF受体中发现的G49；在结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)、在结肠癌中发现的19.9；胃癌粘蛋白；在骨髓细胞中发现的T5A7；在黑素瘤中发现的R24；在在胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1∶22∶25∶8和在4至8细胞期胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4；皮肤T细胞
淋巴瘤抗原、MART-1抗原；Sialy Tn(STn)抗原；结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变体A；腺癌抗原ART1；副肿瘤相关的脑-睾丸癌抗原(癌神经元抗原MA2；副肿瘤神经抗原)；神经肿瘤腹部抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4-a、MAGE-4-b和MAGE-X2；癌-睾丸抗原(NY-EOS-1)和上文所列多肽的任何多肽的片段。
恶性人淋巴细胞抗原APO-1；分化抗原诸如在胎儿红细胞中发现的I抗原；在成人红细胞中发现的原发性内胚层I抗原；植入前胚胎；在胃腺癌中发现的I(Ma)；在乳腺上皮细胞中发现的M18、M39；在骨髓细胞中发现的SSEA-1；VEP8；VEP9；Myl；Va4-D5；在结直肠癌中发现的D156-22；TRA-1-85(血型H)；在睾丸和卵巢癌中发现的SCP-1；在结肠腺癌中发现的C14；在肺腺癌中发现的F3；在胃癌中发现的AH6；Y半抗原；在胚胎癌细胞中发现的Ley；
TL5(血型A)；在A431细胞中发现的EGF受体；在胰腺癌中发现的E1系列(血型B)；在胚胎癌细胞中发现的FC10.2；胃腺癌抗原；在腺癌中发现的CO-514(血型Lea)；在腺癌中发现的NS-10；CO-43(血型的Leb)；在A431细胞的EGF受体中发现的G49；在结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)、在结肠癌中发现的19.9；胃癌粘蛋白；在骨髓细胞中发现的T5A7；在黑素瘤中发现的R24；在在胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1∶22∶25∶8和在4至8细胞期胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4；皮肤T细胞
淋巴瘤抗原、MART-1抗原；Sialy Tn(STn)抗原；结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变体A；腺癌抗原ART1；副肿瘤相关的脑-睾丸癌抗原(癌神经元抗原MA2；副肿瘤神经抗原)；神经肿瘤腹部抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4-a、MAGE-4-b和MAGE-X2；癌-睾丸抗原(NY-EOS-1)和上文所列多肽的任何多肽的片段。
[0117] 可将人抗体分类成同种型，包括IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。在一个实施方案中，Fc来源于IgG同种型。在另一个实施方案中，Fc来源于IgA同种型。在另一个实施方案中，Fc来源于IgE同种型。在另一个实施方案中，Fc来源于IgM同种型。在另一个实施方案中，Fc来源于IgD同种型。
[0118] 人IgG抗体还可被细分成亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，在一些实施方案中，预期Fc可来源于抗体的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。
[0119] 异二聚体对的每个异二聚体可特异性结合表位或抗原。在一个实施方案中，异二聚体对的每个异二聚体结合相同表位。在另一个实施方案中，异二聚体对的第一异二聚体特异笥结合一个抗原上的表位并且异二聚体对的第二异二聚体特异性结合相同抗原上的不同表位。在另一个实施方案中，异二聚体对的第一异二聚体特异性结合第一抗原上的表位，异二聚体对的第二异二聚体特异性结合与所述第一抗原不同的第二抗原上的表位。例如，在一个实施方案中，第一异二聚体特异性结合组织因子，而第二异二聚体特异性结合抗原Her2(ErbB2)。在另一个实施方案中，第一异二聚体特异笥结合上述分子或癌症抗原。在另一个实施方案中，第二异二聚体特异性结合上述分子或癌症抗原。在另一个实施方案中，第一异二聚体特异性结合抗原CD3，而第二异二聚体特异性结合抗原CD19。
[0120] 如上文中指示的，在一些实施方案中，每个异二聚体的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链可来源于已知的治疗性抗体或从其工程化而来，或来自结合不同靶分子或癌症抗原的抗体。许多这类分子的氨基酸和核苷酸序列是可容易获得的(参见例如，GenBank：AJ308087.1(人源化抗-人组织因子抗体D3H44轻链可变区和CL结构域)；GenBank：
AJ308086.1(人源化抗-人组织因子抗体D3H44重链可变区和CH1结构域)；GenBank：
HC359025.1(培妥珠单抗Fab轻链基因模块)；GenBank：HC359024.1(培妥珠单抗Fab重链基因模块)；GenBank：GM685465.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀(Herceptin))-野生型；轻链)；GenBank：GM685463.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀)-野生型；重链)；
GenBank：GM685466.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀)-GC-最优化的轻链)；和GenBank：
GM685464.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀)-GC-最优化的重链。本文中描述的GenBank编号的每一个的序列可获自2012年11月28目的NCBI网站，并且各自出于所有目的全文以引用方式并入。
AJ308086.1(人源化抗-人组织因子抗体D3H44重链可变区和CH1结构域)；GenBank：
HC359025.1(培妥珠单抗Fab轻链基因模块)；GenBank：HC359024.1(培妥珠单抗Fab重链基因模块)；GenBank：GM685465.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀(Herceptin))-野生型；轻链)；GenBank：GM685463.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀)-野生型；重链)；
GenBank：GM685466.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀)-GC-最优化的轻链)；和GenBank：
GM685464.1(抗体曲妥珠单抗(＝赫赛汀)-GC-最优化的重链。本文中描述的GenBank编号的每一个的序列可获自2012年11月28目的NCBI网站，并且各自出于所有目的全文以引用方式并入。
[0121] 在一些方面，分离的抗原结合构建体包含与本文中公开的表或登录号中所示的氨基酸序列或其片段具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，分离的抗原结合构建体包含由与本文中公开的表或登录号中所示的核苷酸序列或其片段具有至少80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸编码的氨基酸序列。
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸编码的氨基酸序列。
[0122] 对免疫球蛋白重链和轻链的氨基酸修饰
[0123] 异二聚体对的异二聚体的至少一个可包含一个或多个对它们的免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链的氨基酸修饰，以便第一异二聚体的重链优先与轻链的一个而非另一个配对。同样地，第二异二聚体的重链可优先与第二轻链而非第一轻链配对。一条重链与两条轻链之一的该优先配对可基于包含一条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的设计组，其中当所述免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所述免疫球蛋白重链相对于两条免疫球蛋白轻链的另一条轻链与两条免疫球蛋白轻链的一条轻链优先配对。因此，LCCA设计组可包含一条免疫球蛋白重链，第一免疫球蛋白轻链和第二免疫球蛋白轻链。
[0124] 在一个实施方案中，一个或多个氨基酸修饰包含一个或多个氨基酸置换。
[0125] 在一个实施方案中，LCCA设计组中展示的优先配对通过修饰作为轻链与重链之间的界面的部分的一个或多个氨基酸来建立。在一个实施方案中，LCCA设计组中展示的优先配对通过修饰免疫球蛋白重链的CH1结构、第一免疫球蛋白轻链的CL结构域和第二免疫球蛋白轻链的CL结构域的至少一个中的一个或多个氨基酸来建立。
[0126] 在一个实施方案中，一个或多个氨基酸修饰限制于如通过残基的Kabat编号指示的可变(VH，VL)和恒定(CH1，CL)结构域的保守构架残基。例如，Almagro[Frontiers In Bioscience(2008)13：1619-1633]提供了基于Kabat，Chotia和IMGT编号方案的构架残基的定义。
[0127] 在一个实施方案中，异二聚体的至少一个包含在彼此互补的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链中引入的一个或多个突变。重链和轻链界面上的互补性可基于空间和疏水性接触、静电/电荷相互作用或多种相互作用的组合来实现。蛋白质表面之间的互补性在文献中通过锁和钥匙配合、钮孔、突出和空腔、供体和受体等(全部蕴涵两个相互作用表面之间的结构和化学匹配的性质)进行了广泛描述。在一个实施方案中，异二聚体的至少一个包含一个或多个突变，其中在免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链中引入的突变在所述界面上引入跨越轻链和重链的新的氢键。在一个实施方案中，异二聚体的至少一个包含一个或多个突变，其中在免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链中引入的突变在所述界面上引入跨越轻链和重链的新的盐桥。
[0128] 合适的LCCA设计组的非限制性实例示于表1中，显示了异二聚体的一个免疫球蛋白重链CH1结构域(H1)和两个免疫球蛋白轻链CL结构域(L1和L2)中的氨基酸修饰，其中当H1、L1和L2共表达时，H1优先与L1配对。这些LCCA设计组中显示的氨基酸修饰基于抗-组织因子抗体D3H44免疫球蛋白重链和轻链的氨基酸序列。
[0129] 表1：具有对1条免疫球蛋白重链(H1)及2条免疫球蛋白轻链L1和L2的恒定结构域修饰的选择的LCCA设计组，其中H1优先与L1配对
[0130]
[0131] *Kabat编号；#WT是指无氨基酸突变的野生型免疫球蛋白链
[0132] 合适的LCCA设计组的另外的非限制性实例示于表2中，显示了异二聚体的一个免疫球蛋白重链CH1结构域(H2)和2个免疫球蛋白轻链CL结构域(L1和L2)中的氨基酸修饰，其中当H2、L1和L2共表达时，H2优选与L2配对：
[0133] 表2：具有对1条免疫球蛋白重链(H2)及2条免疫球蛋白轻链L1和L2的恒定结构域修饰的选择的LCCA设计组，其中H2优先与L2配对
[0134]组号 H2_突变＊ L1_突变 L2_突变
C501 A139W_V190S WT# F116A
C502 A139W_V190A WT F116A
C504 F100W WT F98L
C506 A139W F116S F118W_V133S
C508 A139V F116A F118W_V133S
C512 A139I WT F118W_V133S
C516 A139W L135W_N137A F116A_L135A
C518 A139W L135W F116A_L135A
C520 A139W L135W F116A_L135V
C522 WT WT S176V_T178L
C526 F174V_P175S_S188G V133S S176L
C528 F174V_S188L S176L WT
C529 S188L S176L WT
C531 K145T_Q179D_S188L Q124E_Q160E_T178D Q160K_T178R
C533 K145T_Q179D_S188F Q124E_V133W_Q160E_T180E V133A_Q160K_T178R
#
C501 A139W_V190S WT# F116A
C502 A139W_V190A WT F116A
C504 F100W WT F98L
C506 A139W F116S F118W_V133S
C508 A139V F116A F118W_V133S
C512 A139I WT F118W_V133S
C516 A139W L135W_N137A F116A_L135A
C518 A139W L135W F116A_L135A
C520 A139W L135W F116A_L135V
C522 WT WT S176V_T178L
C526 F174V_P175S_S188G V133S S176L
C528 F174V_S188L S176L WT
C529 S188L S176L WT
C531 K145T_Q179D_S188L Q124E_Q160E_T178D Q160K_T178R
C533 K145T_Q179D_S188F Q124E_V133W_Q160E_T180E V133A_Q160K_T178R
#
[0135] *Kabat编号；WT是指无氨基酸突变的野生型免疫球蛋白链
[0136] 合适的LCCA设计组的另外的非限制性实例描述于实施例、表和图中。
[0137] 在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中无任何氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在另一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在另一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在另一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
[0138] 在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中无氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中无氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
[0139] 在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少三个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
[0140] 在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少三个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少三个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少三个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少三个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在CH1结构域中具有至少三个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在CL结构域中具有至少四个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在CL结构域中具有至少三个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
[0141] 在一个实施方案中，LCCA设计组中展示的优先配对通过修饰免疫球蛋白重链的VH结构域、第一免疫球蛋白轻链的VL结构域和第二免疫球蛋白轻链的VL结构域的至少一个中的一个或多个氨基酸来建立。合适的LCCA设计组的非限制性实例示于表3中，显示了异二聚体的一条免疫球蛋白重链VH结构域(H1)和两条免疫球蛋白轻链VL结构域(L1和L2)中的氨基酸修饰，其中当H1、L1和L2共表达时，H1优先与L1配对：
[0142] 表3：具有对1条免疫球蛋白重链和2条免疫球蛋白轻链的可变结构域修饰的选择的LCCA设计组，其中H1优选与L1配对
[0143]组号 H1_突变＊ L1_突变 L2_突变
[0144]V001 V37W_W103H F98L F98W
V004 V37W_W103H F98L P44W
V005 V37A_W103H P44W F98L
V006 V37W_W103F F98L F98W
V007 V37W F98A F98W
V009 V37W F98A WT#
V011 V37I WT F98L
V013 V37A_W103V P44W F98A
V015 V37A_W103H P44W F98A
V016 V37A_W103H P44W F98W
V020 L45W Y87G P44W
V022 WT F98W F98A
V023 WT WT F98A
V024 Q39R Q38E F98A
V026 Q39R Q38E WT
V028 Q39R Q38E Q38R
V030 Q39R Q38D Q38R
V032 Q39M Q38M Q38E
V034 Q39K Q38N_T85E Q38N_T85K
V037 Q39E Q38R F98A
V039 Q39D Q38R Q38D
V040 V37E L89R_F98T WT
V042 V37E_F100D L89R_F98W WT
V044 V37E_F100D L89R_F98W F98Y
V004 V37W_W103H F98L P44W
V005 V37A_W103H P44W F98L
V006 V37W_W103F F98L F98W
V007 V37W F98A F98W
V009 V37W F98A WT#
V011 V37I WT F98L
V013 V37A_W103V P44W F98A
V015 V37A_W103H P44W F98A
V016 V37A_W103H P44W F98W
V020 L45W Y87G P44W
V022 WT F98W F98A
V023 WT WT F98A
V024 Q39R Q38E F98A
V026 Q39R Q38E WT
V028 Q39R Q38E Q38R
V030 Q39R Q38D Q38R
V032 Q39M Q38M Q38E
V034 Q39K Q38N_T85E Q38N_T85K
V037 Q39E Q38R F98A
V039 Q39D Q38R Q38D
V040 V37E L89R_F98T WT
V042 V37E_F100D L89R_F98W WT
V044 V37E_F100D L89R_F98W F98Y
[0145] *Kabat编号；#WT是指无氨基酸突变的野生型免疫球蛋白链
[0146] 合适的LCCA设计组的另外的非限制性实例描述于表4中，显示了异二聚体的一条免疫球蛋白重链VH结构域(H2)和两条免疫球蛋白轻链VL结构域(L1和L2)中的氨基酸修饰，其中当H2、L1和L2共表达时，H2与L2优先配对：
[0147] 表4：具有对1条免疫球蛋白重链和2条免疫球蛋白轻链的可变结构域修饰的选择的LCCA设计组，其中H2优选与L2配对
[0148]组号 H2_突变＊ L1_突变 L2_突变
V002 V37I F98L F98W
V003 WT# F98L F98W
V005 V37A_W103H F98L P44W
V007 V37W F98W F98A
V008 V37I F98A F98W
V009 V37W WT F98A
V010 V37I F98A WT
V012 F100W WT F98L
V002 V37I F98L F98W
V003 WT# F98L F98W
V005 V37A_W103H F98L P44W
V007 V37W F98W F98A
V008 V37I F98A F98W
V009 V37W WT F98A
V010 V37I F98A WT
V012 F100W WT F98L
[0149]V014 V37W P44W F98A
V017 V37A_W103V P44W F98W
V018 V37A_W103V P44W F98L
V019 V37I_F100W P44W F98L
V021 V37A_W103H Y87G P44W
V025 V37W Q38E F98A
V027 WT Q38E WT
V029 Q39E Q38E Q38R
V030 Q39R Q38R Q38D
V031 Q39E Q38D Q38R
V033 Q39R Q38M Q38E
V035 Q39D Q38N_T85E Q38N_T85K
V036 Q39E Q38N_T85E Q38N_T85K
V038 V37W Q38R F98A
V041 WT L89R_F98T WT
V043 WT L89R_F98W WT
V045 V37S_A97K L89R_F98W F98Y
V017 V37A_W103V P44W F98W
V018 V37A_W103V P44W F98L
V019 V37I_F100W P44W F98L
V021 V37A_W103H Y87G P44W
V025 V37W Q38E F98A
V027 WT Q38E WT
V029 Q39E Q38E Q38R
V030 Q39R Q38R Q38D
V031 Q39E Q38D Q38R
V033 Q39R Q38M Q38E
V035 Q39D Q38N_T85E Q38N_T85K
V036 Q39E Q38N_T85E Q38N_T85K
V038 V37W Q38R F98A
V041 WT L89R_F98T WT
V043 WT L89R_F98W WT
V045 V37S_A97K L89R_F98W F98Y
[0150] *Kabat编号；#WT是指无氨基酸突变的野生型免疫球蛋白链
[0151] 在一个实施方案中，LCCA设计组包含在VH结构域中无氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在VL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在VH结构域中无氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在VL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在VL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
[0152] 在一个实施方案中，LCCA设计组包含在VH结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在VL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在VH结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，在一个实施方案中，LCCA设计组包含在VH结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在VL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在VL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
[0153] 在一个实施方案中，在一个实施方案中，LCCA设计组包含在VH结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在VL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在VH结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在VL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计组包含在VH结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链，在VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链和在VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
[0154] 在一个实施方案中，将表1至4中显示的LCCA设计组组合以提供包含两个不同的免疫球蛋白重链(H1和H2)和两个不同的免疫球蛋白轻链(L1和L2)的组合，其中当H1、H2、L1和L2共表达时，H1优先与L1配对并且H2优先与L2配对。在一个实施方案中，将来自表1的包含重链的CH1结构域和/或轻链的CL结构域的LCCA设计组与来自表2的还包含重链的CH1结构域和/或轻链的CL结构域的修饰的LCCA设计组组合。
[0155] 来源于LCCA设计组的组合的设计组的非限制性实例示于表5中：
[0156] 表5：包含恒定结构域修饰的设计组
[0157]
[0158]
[0159] *Kabat编号；#WT是指无氨基酸突变的野生型免疫球蛋白链
[0160] 在一个实施方案中，将来自表3的包含重链的VH结构域和/或轻链的VL结构域的LCCA设计组与来自表4的还包含重链的VH结构域和/或轻链的VL结构域的修饰的LCCA设计组组合。来源于LCCA设计组的这样的组合的设计组的非限制性实例示于表6中：
[0161] 表6：包含可变结构域修饰的设计组
[0162]组号 组号 H1_突变＊ L1_突变 H2_突变 L2_突变
V001 V002 V37W_W103H F98L V37I F98W
V001 V003 V37W_W103H F98L WT# F98W
V004 V005 V37W_W103H F98L V37A_W103H P44W
V006 V002 V37W_W103F F98L V37I F98W
V006 V003 V37W_W103F F98L WT F98W
V007 V008 V37W F98A V37I F98W
V009 V010 V37W F98A V37I WT
V011 V012 V37I WT F100W F98L
V013 V014 V37A_W103V P44W V37W F98A
V015 V014 V37A_W103H P44W V37W F98A
V016 V017 V37A_W103H P44W V37A_W103V F98W
V005 V018 V37A_W103H P44W V37A_W103V F98L
V005 V019 V37A_W103H P44W V37I_F100W F98L
V020 V021 L45W Y87G V37A_W103H P44W
V022 V007 WT F98W V37W F98A
V023 V009 WT WT V37W F98A
V024 V025 Q39R Q38E V37W F98A
V026 V027 Q39R Q38E WT WT
V001 V002 V37W_W103H F98L V37I F98W
V001 V003 V37W_W103H F98L WT# F98W
V004 V005 V37W_W103H F98L V37A_W103H P44W
V006 V002 V37W_W103F F98L V37I F98W
V006 V003 V37W_W103F F98L WT F98W
V007 V008 V37W F98A V37I F98W
V009 V010 V37W F98A V37I WT
V011 V012 V37I WT F100W F98L
V013 V014 V37A_W103V P44W V37W F98A
V015 V014 V37A_W103H P44W V37W F98A
V016 V017 V37A_W103H P44W V37A_W103V F98W
V005 V018 V37A_W103H P44W V37A_W103V F98L
V005 V019 V37A_W103H P44W V37I_F100W F98L
V020 V021 L45W Y87G V37A_W103H P44W
V022 V007 WT F98W V37W F98A
V023 V009 WT WT V37W F98A
V024 V025 Q39R Q38E V37W F98A
V026 V027 Q39R Q38E WT WT
[0163]V028 V029 Q39R Q38E Q39E Q38R
V030 V031 Q39R Q38D Q39E Q38R
V032 V033 Q39M Q38M Q39R Q38E
V034 V035 Q39K Q38N_T85E Q39D Q38N_T85K
V034 V036 Q39K Q38N_T85E Q39E Q38N_T85K
V037 V038 Q39E Q38R V37W F98A
V039 V030 Q39D Q38R Q39R Q38D
V040 V041 V37E L89R_F98T WT WT
V042 V043 V37E_F100D L89R_F98W WT WT
V044 V045 V37E_F100D L89R_F98W V37S_A97K F98Y
V030 V031 Q39R Q38D Q39E Q38R
V032 V033 Q39M Q38M Q39R Q38E
V034 V035 Q39K Q38N_T85E Q39D Q38N_T85K
V034 V036 Q39K Q38N_T85E Q39E Q38N_T85K
V037 V038 Q39E Q38R V37W F98A
V039 V030 Q39D Q38R Q39R Q38D
V040 V041 V37E L89R_F98T WT WT
V042 V043 V37E_F100D L89R_F98W WT WT
V044 V045 V37E_F100D L89R_F98W V37S_A97K F98Y
[0164] *Kabat编号；#WT是指无氨基酸突变的野生型免疫球蛋白链
[0165] 本文中鉴定的特定氨基酸修饰至其它抗体的可移植性：
[0166] 虽然已在D3H44抗-组织因子细胞外结构域抗体免疫球蛋白重链和轻链方面描述上文中鉴定的对免疫球蛋白重链和轻链的特定氨基酸修饰，但在本文中(参见实施例、图和表)预期和展现，这些氨基酸修饰可转移至其它免疫球蛋白重链和轻链，从而基于下列内容，导致相似的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链中的一条的优先配对的模式。
[0167] 免疫球蛋白重链与轻链之间的界面中的VH∶VL和CH1∶CL界面残基是相对良好地保守的(Padlan等人，1986，Mol.Immunol.23(9)：951-960)。该序列保守，进化约束的结果，增加了在轻链与重链的组合配对过程中形成功能活性抗体结合结构域的可能性。作为该序列保守的结果，可得出上文中针对D3H44序列指出的特定实例中的序列修饰，所述修饰驱动优先配对，可转移至其它重链和轻链对异二聚体，对于优先配对获得大致相同的结果，因为该区域在抗体间显示高序列保守性；此外，当序列差异存在时，这些修饰通常位于CH1∶CL界面的远端。对于CH1和CL结构域尤其如此。然而，对于CDR(互补决定区)环残基(和长度)，特别是对于CDR-H3，在抗原结合位点上存在一些序列变异性。因此，在一个实施方案中，当抗原结合位点的氨基酸序列与D3H44抗体的抗原结合位点的氨基酸序列显著不同时，根据本发明的异二聚体对包含异二聚体，其中至少一个异二聚体在VH和/或VL结构域中包含一个或多个位于CDR环的近端或远端的氨基酸修饰。在另一个实施方案中，当抗原结合位点的氨基酸序列与D3H44抗体的抗原结合位点的氨基酸序列大体上相同时，根据本发明的异二聚体对包含异二聚体，其中至少一个异二聚体在VH和/或VL结构域中包含一个或多个CDR环的近端或远端的氨基酸修饰。
[0168] 在一个实施方案中，本文中描述的氨基酸修饰可转移至基于人或人源化IgG1/κ的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。这样的IgG1/κ链的非限制性实例包括奥伐单抗(对于人)或曲妥单抗、培妥珠单抗或贝伐珠单抗(对于人源化的)。
[0169] 在另一个实施方案中，本文中描述的氨基酸修饰可转移至利用通常使用的VH和VL亚组的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。这样的抗体的非限制性实例包括帕妥珠单抗。
[0170] 在一个实施方案中，本文中描述的氨基酸修饰可转移至具有接近种系的构架的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。这样的抗体的实例包括阿托珠单抗。
[0171] 在一个实施方案中，本文中描述的氨基酸修饰可转移至具有接近对于重链和轻链对观察到的平均值的VH∶VL结构域间角的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。该类型的抗体的实例包括但不限于培妥珠单抗。在另一个实施方案中，本文中描述的氨基酸修饰可转移至具有经典CL和CH1结构域的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。这类抗体的合适实例包括但不限于曲妥珠单抗。
[0172] 在一些实施方案中，本文中描述的氨基酸修饰的某些亚组用于上文中提供的抗原结合构建体中的变异结构域。
[0173] 实例、图和表显示，氨基酸修饰(例如，一个或多个包含可变区和恒定区的Fab片段内的)可转移至其它免疫球蛋白重链和轻链，从而导致相似的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链中的一条的优先配对的模式。
[0174] 优先配对
[0175] 如上文中描述的，根据本发明的抗原结合构建体/异二聚体对的至少一个异二聚体可包含一个或多个对它们的免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链的氨基酸修饰，以便一个异二聚体的重链例如H1优先与轻链中的一条例如L1而非另一条轻链L2配对，并且另一个异二聚体的重链H2优先与轻链L2而非轻链L1配对。换句话说，所需要的优先配对被认为在H1与L1之间和H2与L2之间。如果当将H1与L1和L2组合时，H1-L1异二聚体的产率大于错配的H1-L2异二聚体的产率，则相对于无一个或多个氨基酸修饰的对应的H1/L1对对H2/L2对的各自配对，认为例如H1与L1之间的优先配对发生。同样地，如果当将H2与L1和L2组合时，H2-L2异二聚体的产率大于错配的H2-L1异二聚体的产率，则相对于无一个或多个氨基酸修饰的对应的H1/L1对对H2/L2对的各自配对，认为H2与L2之间的优先配对发生。在该上下文中，包含H1和L1(H1-L1)或H2和L2(H2-L2)的异二聚体在本文中称为优先配对的、正确配对的、强制配对的或所需的异二聚体，而包含H1和L2(H1-L2)或H2和L1(H2-L1)的异二聚体在本文中称为错配的异二聚体。意欲实现H1-L1和H2-L2的选择性配对的对应于两条重链和两条轻链的突变的组称为设计组。
[0176] 因此，在一个实施方案中，当异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体的相对产率大于55％。在另一个实施方案中，当异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体的相对产率大于60％。在另一个实施方案中，当异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体的相对产率大于70％。在另一个实施方案中，当异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体的相对产率大于80％。在另一个实施方案中，当异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体的相对产率大于90％。在另一个实施方案中，当异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体的相对产率大于95％。
[0177] 在上述实例中，如果当将H1与L1和L2共表达时，所需的H1-L1异二聚体的量大于错配的H1-L2异二聚体的量，则认为H1-L1之间的优先配对发生。类似地，如果将当H2与L1和L2共表达时，所需的H2-L2异二聚体的量大于错配的H2-L2异二聚体的量，则认为H2-L2之间的优先配对发生。因此，在一个实施方案中，当将异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体对错配的异二聚体的比率大于1.25∶1。在一个实施方案中，当将异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体对错配的异二聚体的比率大于1.5∶1。在另一个实施方案中，当将异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体对错配的异二聚体的比率大于2∶1。在另一个实施方案中，当将异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体对错配的异二聚体的比率大于3∶1。在另一个实施方案中，当将异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体对错配的异二聚体的比率大于5∶1。在另一个实施方案中，当将异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体对错配的异二聚体的比率大于10∶1。在另一个实施方案中，当将异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体对错配的异二聚体的比率大于25∶1。在另一个实施方案中，当将异二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异二聚体对错配的异二聚体的比率大于50∶1。
[0178] 异二聚体的热稳定性
[0179] 在一个实施方案中，根据本发明的异二聚体对的每个异二聚体具有可与包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的热稳定性相比较的热稳定性。在一个实施方案中，热稳定性通过解链温度或或Tm的测量来测定。因此，在一个实施方案中，根据本发明的异二聚体的热稳定性在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的热稳定性的约10℃内。因此，在一个实施方案中，根据本发明的异二聚体的热稳定性在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的热稳定性的约5℃内。在另一个实施方案中，根据本发明的异二聚体的热稳定性在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的热稳定性的约3℃内。在另一个实施方案中，根据本发明的异二聚体的热稳定性在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的热稳定性的约2℃内。在另一个实施方案中，根据本发明的异二聚体的热稳定性在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的热稳定性的约1.5℃内。在另一个实施方案中，根据本发明的异二聚体的热稳定性在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的热稳定性的约1℃内。在另一个实施方案中，根据本发明的异二聚体的热稳定性在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的热稳定性的约0.5℃内。在另一个实施方案中，根据本发明的异二聚体的热稳定性在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的热稳定性的约0.25℃内。
[0180] 异二聚体对于抗原的亲和力
[0181] 在一个实施方案中，异二聚体对的每个异二聚体具有与包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的对于其各自抗原的亲和力相同或可与其相比较的对于其各自抗原的亲和力。在一个实施方案中，异二聚体对的异二聚体具有在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的对于其各自抗原的亲和力的约50倍或一个数量级内的对于其各自抗原的亲和力。在一个实施方案中，异二聚体对的异二聚体具有在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的对于其各自抗原的亲和力的约25倍或一个数量级内的对于其各自抗原的亲和力。在一个实施方案中，异二聚体对的异二聚体具有在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的对于其各自抗原的亲和力的约10倍或一个数量级内的对于其各自抗原的亲和力。在另一个实施方案中，异二聚体对的异二聚体具有在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的对于其各自抗原的亲和力的约5倍或一个数量级内的对于其各自抗原的亲和力。在另一个实施方案中，异二聚体对的异二聚体具有在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的对于其各自抗原的亲和力的约2.5倍或一个数量级内的对于其各自抗原的亲和力。在另一个实施方案中，异二聚体对的异二聚体具有在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的对于其各自抗原的亲和力的约2倍或一个数量级内的对于其各自抗原的亲和力。在另一个实施方案中，异二聚体对的异二聚体具有在包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的对于其各自抗原的亲和力的约1.5倍或一个数量级内的对于其各自抗原的亲和力。在另一个实施方案中，异二聚体对的异二聚体具有与包含相同免疫球蛋白重链和轻链但无本文中描述的对CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异二聚体的对于其各自抗原的亲和力大致相同的对于其各自抗原的亲和力。
[0182] 另外的任选的修饰
[0183] 在一个实施方案中，还可进一步修饰(即，通过不同类型的分子的共价附接)根据本发明的异二聚体对的免疫球蛋白重链和轻链，以便共价附接不干扰重链与轻链之间的优先配对或影响异二聚体结合其抗原的能力，或影响其稳定性。这样的修饰包括但不限于限制、糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、利用已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、至细胞配体或其它蛋白的连接等。许多化学修饰的任何修饰可通过已知的技术来进行，包括但不限于特定化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
[0184] 在另一个实施方案中，可将根据本发明的异二聚体对的免疫球蛋白重链和轻链缀合于(直接或间接)修饰给定的生物反应的治疗剂或药物部分。治疗剂或药物部分将不被解释为限制于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可包括例如毒素诸如相思豆毒素、篦麻毒素A、Onconase(或另一种细胞毒性RNA酶)、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质诸如肿瘤坏死因子、α干扰素，β干扰素，神经生长因子，血小板衍生的生长因子，组织纤维蛋白溶酶原活化剂，凋亡剂，例如TNF-α、TNF-β、AIM I(参见国际公布No.WO 97/33899)，AIM II(参见国际公布No.WO97/34911)和Fas配体(Takahashi等人，1994，J.Immunol.，6：1567)和VEGI(参见国际公布No.WO 99/23105)，血栓形成剂或抗血管生成剂，例如血管生长抑素或内皮抑素；或生物反应调节剂，诸如，例如，淋巴因子(例如，白细胞介素-1(“IL-1”)，白介素-2(“IL-2”)，白介素-6(“IL-6”)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))或生长因子(例如，生长激素(“GH”))。
[0185] 此外，在替代实施方案中，可将抗体缀合于治疗性部分诸如放射性材料或用于缀合放射性金属离子的大环螯合剂(关于放射性材料的实例参见上文)。在某些实施方案中，所述大环螯合剂是可通过接头分子附接于抗体的1，4，7，10-四氮杂-N，N′，N″，N″-四乙酸(DOTA)。这类接头分子在本领域中是公知的，并且描述于Denardo等人，1998，Clin Cancer Res.4：2483；Peterson等人，1999，Bioconjug.Chem.10：553和Zimmerman等人，1999，Nucl.Med.Biol.26：943中。
[0186] 在一些实施方案中，异二聚体的免疫球蛋白重链和轻链表达为包含标签以有利于纯化和/或测试等的融合蛋白。如本文中所提及的，″标签″是在C末端、N末端或内部提供于蛋白质中的任何添加的系列氨基酸，其有利于蛋白质的鉴定或纯化。合适的标签包括但不限于本领域普通技术人员已知的用于纯化和/或测试的标签。诸如白蛋白结合结构域(ABD)、His标签、FLAG标签、谷胱甘肽S-转移酶、血凝素(HA)和麦芽糖结合蛋白。还可对这样标记的蛋白质工程化以包含切割位点，诸如凝血酶、肠激酶或因子X切割位点，以便于在纯化之前、期间或之后除去标签。
[0187] 在一些实施方案中，可将轻链(位置214，Kabat编号)和重链(位置233，Kabat编号)的Fab结构域的底部上的形成链间二硫键的一个或多个半胱氨酸残基修饰成丝氨酸或丙氨酸或非半胱氨酸或不同的氨基酸。
[0188] 预期可对免疫球蛋白重链进行另外的氨基酸修饰以升高优先配对的水平和/或增强异二聚体对的热稳定性。例如，可对免疫球蛋白重链Fc结构域进行另外的氨基酸修饰以驱动异二聚体对相对于同二聚体对之间的优先配对。这样的氨基酸修饰在本领域中是已知的，包括例如美国专利公开No.2012/0149876中描述的那些氨基酸修饰。或者，还可应用驱动异二聚体对相对于同二聚体对之间的优先配对的替代策略，例如“钮孔”、具有离子相互作用的带电荷残基和链交换工程化的结构域(SEED)技术。后一种策略已在本领域中进行了描述，并且综述于Klein等人(同上)中。在下文中进行Fc结构域的进一步论述。
[0189] Fc结构域
[0190] 本文中描述的构建体还可包括Fc。在一些方面，所述Fc包含至少一个或两个CH3结构域序列。在一些方面，所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联于第一异二聚体和/或第二异二聚体。在一些方面，所述Fc是人Fc。在一些方面，所述Fc是人IgG或IgG1Fc。在一些方面，所述Fc是异二聚体Fc。在一些方面，所述Fc包含至少一个或两个CH2结构域序列。
[0191] 在一些方面，所述Fc在CH3结构域序列的至少一个中包含一个或多个修饰。在一些方面，所述Fc在CH2结构域序列的至少一个中包含一个或多个修饰。在一些方面，所述Fc是单个多肽。在一些方面，Fc是多个肽，例如两个多肽。
[0192] 在一些方面，所述Fc在CH3序列的至少一个中包含一个或多个修饰。在一些方面，所述Fc在CH2序列的至少一个中包含一个或多个修饰。在一些方面，Fc是单个多肽。在一些方面，Fc是多个肽，例如两个多肽。
[0193] 在一些方面，Fc是2011年11月4日提交的专利申请PCT/CA2011/001238或2012年11月2日提交的PCT/CA2012/050780(所述专利申请的每一个的整个公开内容出于所有目的据此全文以引用方式并入)中描述的Fc。
[0194] 在一些方面，本文中描述的构建体包含异二聚体Fc，所述异二聚体Fc包含已被不对称修饰的经修饰的CH3结构域。异二聚体Fc可包含两个重链恒定结构域多肽：第一重链多肽和第二重链多肽，其可互换使用，只要Fc包含一个第一重链多肽和一个第二重链多肽。通常地，所述第一重链多肽包含第一CH3序列，并且所述第二链多肽包含第二CH3序列。
[0195] 当两个包含以不对称方式引入的一个或多个氨基酸修饰的CH3序列二聚化时，所述两个CH3序列通常导致异二聚体Fc而非同二聚体。如本文中所用，“不对称氨基酸修饰”是指任何修饰，在所述修饰中第一CH3序列上的特定位置上的氨基酸与和第二CH3序列上相同位置上的氨基酸不同，并且第一与第二CH3序列优先配对形成异二聚体而非同二聚体。该异二聚化可以是每一个序列上相同的各自氨基酸位置上的两个氨基酸中的仅一个的修饰的结果；或第一和第二CH3序列的每一个上的相同的各自位置上的每一个序列上的两个氨基酸的修饰的结果。异二聚体Fc的第一和第二CH3序列可包含一个或超过一个不对称氨基酸修饰。
[0196] 表X提供对应于全长人IgG1重链的氨基酸231至447的人IgG1Fc序列的氨基酸序列。所述CH3序列包含全长人IgG1重链的氨基酸341-447。
[0197] 通常地，Fc可包括能够二聚化的两个连续重链序列(A和B)。在一些方面，Fc的一个或两个序列包括下列位置上的一个或多个突变或修饰：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390(使用EU编号)。在一些方面，Fc包括表X中显示的突变体序列。在一些方面，Fc包括变体1A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体2A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体3A-B的突变。在一些方面，包括变体4A-B的突变。在一些方面，包括变体5A-B的突变。
[0198]
[0199] 第一和第二CH3序列可包含本文中描述的氨基酸突变，参照全长人IgG1重链的氨基酸231至447。在一个实施方案中，所述异二聚体Fc包含具有在位置F405和Y407上具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T394上具有氨基酸修饰的第二CH3序列的经修饰的CH3结构域。在一个实施方案中，异二聚体Fc包含具有拥有选自L351Y、F405A和Y407V的一个或多个氨基酸修饰的第一CH3序列和拥有选自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的一个或多个氨基酸修饰的第二CH3序列的经修饰的CH3结构域。
[0200] 在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，所述经修饰的CH3结构域具有在位置L351、F405和Y407上具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T366、K392和T394上具有氨基酸修饰的第二CH3序列，并且第一或第二CH3序列的一个还在位置Q347上包含氨基酸修饰，另一个CH3序列还在位置K360上包含氨基酸修饰。在另一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，所述经修饰的CH3结构域具有在位置L351、F405和Y407上具有氨基酸修饰的第一CH3序列，和在位置T366、K392和T394上具有氨基酸修饰的第二CH3序列，第一或第二CH3序列的一个还包含位置Q347上的氨基酸修饰，并且另一个CH3序列还包含位置K360上的氨基酸修饰，所述CH3序列的一个或两个还包含氨基酸修饰T350V。
[0201] 在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，所述经修饰的CH3结构域具有在位置L351、F405和Y407上具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T366、K392和T394上具有氨基酸修饰的第二CH3序列，并且所述第一和第二CH3序列的一个还包含D399R或D399K的氨基酸修饰，另一个CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D的一个或多个。在另一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，所述经修饰的CH3结构域具有在位置L351、F405和Y407上具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T366、K392和T394上具有氨基酸修饰的第二CH3序列，并且所述第一和第二CH3序列的一个还包含D399R或D399K的氨基酸修饰，另一个CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D的一个或多个，并且所述CH3序列的一个或两个还包含氨基酸修饰T350V。
[0202] 在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，所述经修饰的CH3结构域具有在位置L351、F405和Y407上具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T366、K392和T394上具有氨基酸修饰的第二CH3序列，其中所述CH3序列的一个或两个还包含T350V的氨基酸修饰。
[0203] 在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，所述经修饰的CH3结构域包含下列氨基酸修饰，其中“A”代表对所述第一CH3序列的氨基酸修饰，“B”代表对所述第二CH3序列的氨基酸修饰：A：L351Y_F405A_Y407V，B：T366L_K392M_T394W，A：L351Y_F405A_Y407V，B：T366L_K392L_T394W，A：T350V_L351Y_F405A_Y407V，B：T350V_T366L_K392L_T394W，A：T350V_L351Y_F405A_Y407V，B：T350V_T366L_K392M_T394W，A：T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V，和/或B：T350V_T366L_N390R_K392M_T394W。
[0204] 一个或多个不对称氨基酸修饰可促进异二聚体Fc的形成，其中所述异二聚体CH3结构域具有可与野生型同二聚体CH3结构域相比较的稳定性。在实施方案中，一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚体Fc结构域的形成，其中所述异二聚体Fc结构域具有可与野生型同二聚体Fc结构域相比较的稳定性。在实施方案中，一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚体Fc结构域的形成，其中所述异二聚体Fc结构域具有在差示扫描量热法研究中通过解链温度(Tm)观察到的稳定性，并且其中所述解链温度在针对对应的对称野生型同二聚体Fc结构域观察到的解链温度的4℃内。在一些方面，所述Fc在CH3序列的至少一个中包含一个或多个修饰，所述修饰促进稳定性与野生型同二聚体Fc相当的异二聚体Fc形成。
[0205] 在一个实施方案中，CH3结构域的稳定性可通过例如利用差示扫描量热法(DSC)测量CH3结构域的解链温度来评估。因此，在其它实施方案中，CH3结构域具有约68℃或更高的解链温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约70℃或更高的解链温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约72℃或更高的解链温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约73℃或更高的解链温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约75℃或更高的解链温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约78℃或更高的解链温度。在一些方面，二聚化的CH3序列具有约68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、77.5℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃或更高的解链温度(Tm)。
[0206] 在一些实施方案中，包含经修饰的CH3序列的异二聚体Fc可在表达的产物中相较于同二聚体Fc以至少约75％的纯度形成。在另一个实施方案中，异二聚体Fc以大于约80％纯度形成。在另一个实施方案中，异二聚体Fc以大于约85％的纯度形成。在另一个实施方案中，异二聚体Fc以大于约90％纯度形成。在另一个实施方案中，异二聚体Fc以大于约95％的纯度形成。在另一个实施方案中，异二聚体Fc以大于约97％的纯度形成。在一些方面，Fc是当表达时以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异二聚体。在一些方面，Fc是当通过单细胞表达时以大于约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异二聚体。
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异二聚体。在一些方面，Fc是当通过单细胞表达时以大于约75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异二聚体。
[0207] 用于修饰单体Fc多肽以促进异二聚体Fc形成的另外的方法描述于国际专 利 公 开No.WO 96/027011(纽 孔 )中，Gunasekaran等 人(Gunasekaran K.等 人(2010)J Biol Chem.285，19637-46，electrostatic design to achieve selective heterodimerization)中，Davis等人(Davis，JH.等人(2010)Prot Eng Des Sel；23(4)：
195-202，strand exchange engineered domain(SEED)technology)中以及Labrijn等人[Efficient generation of stable bispecific IgG1by controlled Fab-arm exchange.Labrijn AF，Meesters JI，de Goeij BE，van den Bremer ET，Neijssen J，van Kampen MD，Strumane K，Verploegen S，Kundu A，Gramer MJ，van Berkel PH，van de Winkel JG，Schuurman J，Parren PW.Proc Natl Acad Sci U S A.2013Mar 26；110(13)：5145-50中。
195-202，strand exchange engineered domain(SEED)technology)中以及Labrijn等人[Efficient generation of stable bispecific IgG1by controlled Fab-arm exchange.Labrijn AF，Meesters JI，de Goeij BE，van den Bremer ET，Neijssen J，van Kampen MD，Strumane K，Verploegen S，Kundu A，Gramer MJ，van Berkel PH，van de Winkel JG，Schuurman J，Parren PW.Proc Natl Acad Sci U S A.2013Mar 26；110(13)：5145-50中。
[0208] 在一些实施方案中，本文中描述的分离的构建体包含结合抗原的抗原结合构建体；和具有相对于不包括相同Fc多肽的抗原结合构建体更优的生物物理性质如稳定性和制造容易性的二聚体Fc多肽构建体。在本领域中已知Fc的重链序列中的许多突变用于选择性改变抗体Fc对于不同Fcγ受体的亲和力。在一些方面，所述Fc包含一个或多个修饰以促进Fc-γ受体的选择性结合。
[0209] CH2结构域是表X中显示的序列的氨基酸231-340。示例性突变列于下文中：
[0210] S298A/E333A/K334A、S298A/E333A/K334A/K326A(LuY，Vern es JM，Chiang N，等人J Immunol Methods.2011年2月28；365(1-2)：132-41)；
[0211] F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(StaVenhagen JB，Gorlatov S，Tuaillon N，等人Cancer Res.2007年9月15日；
67(18)：8882-90；Nordstrom JL、Gorlatov S，Zha ng W，等人Breast Cancer Res.2011年
11月30日；13(6)：R123)；
67(18)：8882-90；Nordstrom JL、Gorlatov S，Zha ng W，等人Breast Cancer Res.2011年
11月30日；13(6)：R123)；
[0212] F243L(Stewart R，Thom G、Levens M，等人Protein Eng Des Sel.2011年 9月；24(9)：671-8.)、S298A/E333A/K334A(Shields RL，Namenuk AK，Hong K，等人J Biol Chem.2001年3月2日；276(9)：6591-604)；
[0213] S239D/I332E/A330L、S239D/I332E(Lazar GA，Dang W，Karki S，等人Proc Natl Acad Sci U S A.2006年3月14日；103(11)：4005-10)；
[0214] S239D/S267E、S267E/L328F(Chu SY， Vostiar I，Karki S，等人Mol Immunol.2008年9月；45(15)：3926-33)；
[0215] S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D以及WO2011/120134和W O2011/120135(通过引用并入本文)中所列的其它突变。Therapeutic A ntibody Engineering(由William R.Strohl和Lila M.Strohl编著，Wo odhead Publishing series in Biomedicine No 11，ISBN 1 907568 379，2012年10月)在第283页所列了突变。
[0216] 在一些实施方案中，CH2结构域包含一个或多个不对称氨基酸修饰。在一些实施方案中，CH2结构域包含一个或多个不对称氨基酸修饰以促进FcγR的选择性结合。在一些实施方案中，所述CH2结构域允许分离和纯化本文中描述的分离的构建体。
[0217] FcRn结合和PK参数
[0218] 如在本领域中已知的，对FcRn的结合使胞吞抗体从内体再循环回血液(Raghavan等人，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ghetie等人，2000，Annu Rev Immunol18：739-766)。与因全长分子的大的尺寸而排除肾脏过滤偶联的该过程导致范围为1至3周的有利的抗体血清半衰期。Fc对FcRn的结合还在抗体运输中起着至关重要的作用。因此，在一个实施方案中，本发明的构建体能够结合FcRn。
[0219] 增强效应子功能的另外的修饰
[0220] 在一些实施方案中，本文中描述的构建体可经修饰以增强其效应子功能。这类修饰在本领域中是已知的，包括无岩藻糖基化或抗体的Fc部分对激活受体主要地FCGR3a(对于ADCC)，和对C1q(对于CDC)的亲和力的工程化。下表Y概述了文中报导的用于效应子功能工程化的各种设计。
[0221]
[0222]
[0223] 因此，在一个实施方案中，本文中描述的构建体可包括包含一个或多个在上表中指出的氨基酸修饰的二聚体Fc，所述修饰赋予增强的效应子功能。在另一个实施方案中，可将构建体无岩藻糖基化以增强效应子功能。
[0224] 接头
[0225] 本文中描述的构建体可包括一个或多个可操纵地偶联于本文中描述的Fc的本文中描述的异二聚体。在一些方面，Fc通过或不通过一个或多个接头偶联于一个或多个异二聚体。在一些方面，Fc直接偶联于一个或多个异二聚体。在一些方面，Fc通过一个或多个接头偶联于一个或多个异二聚体。在一些方面，Fc通过接头偶联于每个异二聚体的重链。
[0226] 在一些方面，所述一个或多个接头是一个或多个多肽接头。在一些方面，所述一个或多个接头是一个或多个抗体铰链区。在一些方面，所述一个或多个接头包含一个或多个IgG1铰链区。
[0227] 制备异二聚体对的方法
[0228] 如上文中描述的，根据本发明的异二聚体对可包含第一异二聚体和第二异二聚体，每个异二聚体包含免疫球蛋白重链或其具有至少VH和CH1结构域的片段，以及具有VL结构域和CL结构域的免疫球蛋白轻链。异二聚体的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链可容易地使用本领域中已知的重组DNA技术来制备。标准技术诸如例如Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第3版，2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor、N.Y.，第2版，1989)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，John Wiley and Sons，New York，第4版，1999)；和Glick and Pasternak，Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA(ASM Press，Washington，D.C.，第2版，1998)中描述的那些技术可用于重组核酸法、核酸合成、细胞培养、转基因掺入和重组蛋白质表达。或者，根据本发明的异二聚体和异二聚体对可化学合成。
[0229] 异二聚体所源自的抗体的免疫球蛋白重链和轻链的核酸和氨基酸序列在本领域中是已知的或可使用核酸或蛋白质测序法来容易地测定。将本文中描述的标签基因融合于免疫球蛋白重链和/或轻链的方法在本领域中是已知的，并且一些方法描述于下文中和实施例中。
[0230] 例如，在宿主细胞中表达和共表达免疫球蛋白重链和轻链的方法在本领域中是公知的。此外，使用重组DNA技术标记重链和/或轻链的方法在本领域中也是公知的。适合于重链和轻链的表达的表达载体和宿主细胞在本领域中也是公知的，如下文中描述的。
[0231] 不依赖于仅使用表达所有4条链的单个克隆或瞬时细胞系的双特异性抗体产生法在本领域中是已知的(Gramer，等人(2013)mAbs 5，962；Strop等人(2012)J Mol Biol420，204.)。这些方法依赖于在氧化还原条件下两对参与双特异性抗体的形成(氧化还原产生)的轻链和重链的产生后臂交换。在该方法中，H1∶L1和H2∶L2对在两个不同的细胞系中表达以独立地产生两个Fab臂。随后，将两个Fab臂在选择氧化还原条件下混合以实现两条独特重链H1和H2形成包含L1∶H1∶H2∶L2链的双特异性抗体的再缔合。
可设想本文中描述的设计的文库/数据集在使用氧化还原产生法或该方法的改进形式产生双特异性抗体中的用途。
可设想本文中描述的设计的文库/数据集在使用氧化还原产生法或该方法的改进形式产生双特异性抗体中的用途。
[0232] 在某些实施方案中，利用无细胞蛋白质表达系统来共表达多肽(例如，重链和轻链多肽)而不使用活细胞。相反地，在溶液中提供DNA转录成RNA以及将RNA翻译成蛋白质所需的所有组分(例如核糖体、tRNA、酶、辅因子、氨基酸)以在体外使用。在某些实施方案中，体外表达需要(1)编码重链和轻链多肽的遗传模板(mRNA或DNA)和(2)含有必需转录和翻译分子机器的反应溶液。在某些实施方案中，细胞提取物大体上提供反应溶液的组分，例如：用于mRNA转录的RNA聚合物、用于多肽翻译的核糖体、tRNA、氨基酸、酶的辅因子、能量来源和进行正确蛋白质折叠所必需的细胞组分。可使用来源于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、人细胞或其组合的裂解物来制备无细胞蛋白质表达系统。这样的细胞裂解物可提供翻译所需的酶和构件块的正确组成和比例。在一些实施方案中，除去细胞膜以仅留下细胞的胞质和细胞器组分。
[0233] 几种无细胞蛋白质表达系统在本领域中是已知的，如在Carlson等人(2012)Biotechnol.Adv.30：1185-1194中综述的。例如，无细胞蛋白质表达系统是可其于原核或真核细胞获得的。原核无细胞表达系统的实例包括来自大肠杆菌(E.coli.)的那些无细胞表达系统。真核无细胞蛋白质表达系统是可基于来自例如兔网织红细胞、小麦胚和昆虫细胞的提取物获得的。这类原核和真核无细胞蛋白质表达系统可从公司诸如Roche、Invitrogen、Qiagen和Novagen商购获得。本领域普通技术人员能够容易地选择可产生能够彼此配对的多肽(例如，重链和轻链多肽)的合适的无细胞蛋白质表达系统。此外，无细胞蛋白质表达系统还可补充伴侣分子(例如BiP)和异构酶类(例如二硫化物异构酶)来提高IgG折叠的效率。
[0234] 在一些实施方案中，无细胞表达系统用于从DNA模板(转录和翻译)或mRNA模板(仅翻译)共表达重链和轻链多肽。
[0235] 载体和宿主细胞
[0236] 重链和轻链的重组表达需要构建含有编码重链或轻链(例如，抗体或融合蛋白)的多核苷酸的表达载体。在已获得编码重链或轻链的多核苷酸后，可使用本领域中公知的技术，通过重组DNA技术产生用于产生重链或轻链的载体。因此，用于通过表达含有重链或轻链编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法在本文中进行了描述。对于本领域普通技术人员来说是公知的方法可用于构建含有重链或轻链编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了包含可操作地连接于启动子的编码重链或轻链的核苷酸序列的可复制载体。
[0237] 通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，随后通过常规技术培养所述转染的细胞以产生用于本发明的方法的经修饰的重链或轻链。在具体实施方案中，将用于所述方法的重链和轻链在用于表达完整免疫球蛋白分子的宿主细胞中共表达，如下文中详述的。
[0238] 可将多种宿主表达载体系统用于表达经修饰的重链和轻链。这类宿主表达系统代表可籍以产生目标编码序列和随后对其进行纯化的媒介物，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达经修饰的重链和轻链的细胞。这些细胞包括但不限于利用含有经修饰的重链和轻链编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物诸如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；利用含有经修饰的重链和轻链编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；利用含有经修饰的重链和轻链编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；或利用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或利用含有经修饰的重链和轻链编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的物细胞系统；或具有含有来源于哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、HEK-293、NSO和3T3细胞)。在某些实施方案中，细菌细胞诸如大肠杆菌，或真核细胞用于表达经修饰的重链和轻链，所述重链和轻链是重组抗体或融合蛋白分子。例如，哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，结合载体诸如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件，是抗体的有效表达系统(Foecking等人，1986，Gene 45：101；和Cockett等人，1990，Bio/Technology8：2)。在具体实施方案中，编码每个异二聚体的免疫球蛋白重链和轻链的核苷酸序列的表达受组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调控。
[0239] 在哺乳动物宿主细胞中，可使用许多基于病毒的表达系统。在其中将腺病毒用作表达载体的情况下，可将经修饰的目标重链和轻链编码序列连接于腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。随后可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组。病毒基因组(例如，区域E1或E3)在非必需区域中的插入将导致可在感染的宿主中存活并且能够表达所述经修饰的重链和轻链的重组病毒(例如，参见Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：355-359)。特定的起始信号也可以是插入的抗体编码序列的高效翻译所需的。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框架同相以确保完整插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可具有多种来源(天然的和合成的)。表达效率可通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强(参见，例如，Bittner等人，1987，Methods in Enzymol.153：516-544)。
[0240] 异二聚体的免疫球蛋白重链和轻链的表达可受本领域中已知的任何启动子或增强子元件控制。可用于控制编码经修饰的重链和轻链(例如，抗体或融合蛋白)的基因的表达的启动子包括但不限于SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)、劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复中包含的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell 22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78.1441-1445)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人，1982，Nature 296：39-42)、四环素(Tet)启动子(Gossen等人，1995，Proc.Nat.Acad.Sci.USA89：5547-5551)；原核细胞表达载体诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，
1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)或tac 启动 子(DeBoer等 人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25；也参见″Useful proteins from recombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94)；包含胭脂碱合成酶启动子区域(Herrera-Estrella等人，Nature 303：209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等人，1981，Nucl.Acids Res.9：2871)以及光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等人，1984，Nature 310：115-120)的植物表达载体；来自酵母或其它真菌诸如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子的启动子元件以及下列动物转录控制区，所述转录控制区展示组织特异性并且已被用于转基因动物：在胰腺癌细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等 人，1984，Cell 38：639-646；Ornitz 等 人，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)、在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984，Cell38：647-658；Adames等人，1985，Nature 318：533-538；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)、在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等人，1986，Cell45：
485-495)、在肝中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，Genes and Devel.1：
268-276)、在肝中具有活性的α-甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987，Science 235：53-58；在肝中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1：161-171)、在骨髓细胞中具有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，Nature315：338-340；Kollias等人，1986，Cell 46：89-94；在脑的少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，1987，Cell 48：703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani、1985，Nature 314：283-286)；在神经元细胞中具有活性神经元特异性烯醇酶(NSE)(Morelli等人，1999，Gen.Virol.80：571-83)；在神经元细胞中具有活性的脑源性神经营养因子(BDNF)基因控制区(Tabuchi等人，1998，Biochem.Biophysic.Res.Com.253：
818-823)；在星形细胞中具有活性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(Gomes等人，1999，Braz J Med Biol Res 32(5)：619-631；Morelli等人，1999，Gen.Virol.80：571-83)和在下丘脑中具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，1986，Science 234：
1372-1378)。
1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)或tac 启动 子(DeBoer等 人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25；也参见″Useful proteins from recombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94)；包含胭脂碱合成酶启动子区域(Herrera-Estrella等人，Nature 303：209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等人，1981，Nucl.Acids Res.9：2871)以及光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等人，1984，Nature 310：115-120)的植物表达载体；来自酵母或其它真菌诸如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子的启动子元件以及下列动物转录控制区，所述转录控制区展示组织特异性并且已被用于转基因动物：在胰腺癌细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等 人，1984，Cell 38：639-646；Ornitz 等 人，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)、在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984，Cell38：647-658；Adames等人，1985，Nature 318：533-538；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)、在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等人，1986，Cell45：
485-495)、在肝中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，Genes and Devel.1：
268-276)、在肝中具有活性的α-甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987，Science 235：53-58；在肝中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1：161-171)、在骨髓细胞中具有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，Nature315：338-340；Kollias等人，1986，Cell 46：89-94；在脑的少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，1987，Cell 48：703-712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani、1985，Nature 314：283-286)；在神经元细胞中具有活性神经元特异性烯醇酶(NSE)(Morelli等人，1999，Gen.Virol.80：571-83)；在神经元细胞中具有活性的脑源性神经营养因子(BDNF)基因控制区(Tabuchi等人，1998，Biochem.Biophysic.Res.Com.253：
818-823)；在星形细胞中具有活性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(Gomes等人，1999，Braz J Med Biol Res 32(5)：619-631；Morelli等人，1999，Gen.Virol.80：571-83)和在下丘脑中具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，1986，Science 234：
1372-1378)。
[0241] 此外，可选择调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰或加工基因产物的宿主细胞菌株。可在某些诱导物存在的情况下升高来自某些启动子的表达；因此，可控制基因工程融合蛋白的表达。此外，不同的宿主细胞具有转录和翻译后加工及修饰(例如，蛋白质的糖基化、磷酸化)的特征性和特异性机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的所需修饰和加工。例如，细菌系统中的表达将产生非糖基化产物，酵母中的表达将产生糖基化产物。可使用具有用于基因产物的初级转录物的正确加工(例如，糖基化和磷酸化)的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、HEK-293、3T3、WI38、NSO，特别地神经元细胞系诸如，例如SK-N-AS、SK-N-FI、SK-N-DZ人成神经细胞瘤(Sugimoto等人，1984，J.Natl.Cancer Inst.73：51-57)、SK-N-SH人成神经细胞瘤(Biochim.Biophys.Acta，1982，704：450-460)、Daoy人脑细胞髓母细胞瘤(He等人，1992，Cancer Res.52：1144-1148)、DBTRG-05MG胶质母细胞瘤细胞(Kruse等人，1992，In Vitro Cell.Dev.Biol.28A：609-614)、IMR-32人成神经细胞瘤(Cancer Res.，1970，30：2110-2118)、1321N1人星形细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977，74：4816)、MOG-G-CCM人星形细胞瘤(Br.J.Cancer，1984，49：269)、U87MG人胶质母细胞瘤-星形细胞瘤(Acta Pathol.Microbiol.Scand.，1968，74：465-486)、A172人胶质母细胞瘤(Olopade等人，1992，Cancer Res.52：2523-2529)、C6大鼠神经胶质瘤细胞(Benda等人，1968，Science 161：370-371)、Neuro-2a小鼠成神经细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1970，65：129-136)、NB41A3小鼠成神经细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1962，48：1184-1190)、SCP绵羊脉络丛乳头状瘤(Bolin等人，1994，J.Virol.Methods 48：
211-221)、G355-5、PG-4猫正常星形胶质细胞(Haapala等人，1985，J.Virol.53：827-833)、Mpf白鼬脑(Trowbridge等人，1982，In Vitro 18：952-960)和正常细胞系诸如，例如CTX TNA2大鼠正常皮层脑(Radany等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6467-6471)诸如，例如，CRL7030和Hs578Bst。此外，不同的载体/宿主表达系统可影响加工反应达到不同的程度。
211-221)、G355-5、PG-4猫正常星形胶质细胞(Haapala等人，1985，J.Virol.53：827-833)、Mpf白鼬脑(Trowbridge等人，1982，In Vitro 18：952-960)和正常细胞系诸如，例如CTX TNA2大鼠正常皮层脑(Radany等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6467-6471)诸如，例如，CRL7030和Hs578Bst。此外，不同的载体/宿主表达系统可影响加工反应达到不同的程度。
[0242] 对于重组蛋白的长期高产率产生，稳定的表达通常是优选的。例如，可工程化稳定地表达经修饰的本发明的重链和轻链(例如，抗体或融合蛋白)的细胞系。可用受适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和可选择标记控制的DNA而非使用含有病毒复制起始点的表达载体来转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可使工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，随后转换至选择培养基。重组质粒中的可选择标记赋予对选择的抗性并且允许细胞稳定地将质粒整合进它们的染色体中，并且生长以形成集落(foci)，可进而克隆所述集落并将其扩增成细胞系。
[0243] 可使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell 11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，Cell 22：817)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。同样地，还可将抗代谢物抗性用作如下基因的选择的基础：dhfr(其赋予对甲氨蝶呤的抗性)(Wigler等人，1980，Natl.Acad.Sci.USA77：3567；O′Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt(其赋予对霉酚酸的抗性)(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo(其赋予对氨基葡糖苷G-418的抗性)(Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.150：1)；和hygro(其赋予对潮霉素的抗性)(Santerre等人，1984，Gene 30：147)基因。
[0244] 重链和轻链的共表达
[0245] 根据本发明的异二聚体对的免疫球蛋白重链和轻链可在哺乳动物细胞中共表达，如上文中指出的。在一个实施方案中，一条重链与两条不同的轻链在上述LCCA设计组中共表达，其中重链优先与两条轻链中的一条配对。在另一个实施方案中，两条重链与两条轻链共表达，其中每一条重链优先与轻链中的一条轻链配对。
[0246] 异二聚体对的测试
[0247] 如上文中描述的，根据本发明的异二聚体对的至少一个异二聚体可包含一个或多个对它们的免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链的氨基酸修饰，以便当异二聚体对的两条重链和两条轻链在哺乳动物细胞中共表达时，第一异二聚体的重链优先与轻链中的一条而非另一条配对。同样地，第二异二聚体的重链优先与第二轻链而非第一轻链配对。优先配对的程度可以例如通过使用上文中描述的方法来评估。异二聚体对的每个异二聚体对于其各自抗原的亲和力可如下所述进行测试。异二聚体对的每个异二聚体的热稳定性还可如下所述进行测试。
[0248] 测量优先配对的方法
[0249] LCCA
[0250] 在一个实施方案中，免疫球蛋白重链与轻链之间的优先配对通过进行轻链竞争性测定(LCCA)来测定。2013年10月3日提交的共同拥有的专利申请PCT/US2013/063306描述了LCCA的不同实施方案，并且出于所有目的全文以引用方式并入本文。所述方法允许定量分析共表达的蛋白质混合物中重链与特定轻链的配对，并且可用于确定当重链和轻链共表达时，一条特定免疫球蛋白重链是否与两条免疫球蛋白轻链中的任一条选择性缔合。如下简述所述方法：至少一条重链和两条不同的轻链以这样的比率在细胞中共表达，以便所述重链为限制性配对反应物；任选地将分泌的蛋白质与细胞分离；将结合于重链的免疫球蛋白轻链多肽与其余的分泌蛋白分离以产生分离的重链配对级分；检测所述分离的重链级分中的每一种不同的轻链的量；和分析所述分离的重链级分中的每一种不同轻链的相对量以测定至少一种重链选择性地与轻链中的一种配对的能力。
[0251] 所述方法提供合理的处理量，并且是强劲的(即对操作诸如使用者或流速的少许变化不敏感)和精确的。所述方法提供可测量蛋白质序列的小的变异的作用的灵敏测定。巨大表面积上的混杂的蛋白质-蛋白质、结构域-结构域、链-链相互作用通常需要多个突变(交换)来引入选择性。蛋白质产物不必被分离和纯化，这使得能够进行更高效的筛选。
关于该方法的实施方案的进一步详细内容描述于实施例中。
关于该方法的实施方案的进一步详细内容描述于实施例中。
[0252] 测定优先配对的替代方法
[0253] 用于检测优先配对的替代方法包括使用LC-MS(液相色谱-质谱)，通过使用它们的分子量的差异鉴定每一个不同的种类，来定量相对异二聚体群体(包括每一种轻链)。抗原活性测定还可用于定量含有每一种轻链的相对异二聚体群体，由此测量的结合程度(相对于对照)可用于评估每一个各自的异二聚体群体。
[0254] 另外的方法诸如SMCA描述于实施例、图和表中。
[0255] 热稳定性
[0256] 可按照本领域中已知的方法测定异二聚体的热稳定性。每个异二聚体的解链温度指示其稳定性。异二聚体的熔点可使用技术诸如差示扫描量热法(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68：47-52)来测量。或者，可使用圆二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)来测量异二聚体的热稳定性。
[0257] 对于抗体的亲和力
[0258] 异二聚体对于它们各自抗原的结合亲和力和相互作用的离解率可通过根据本领域中公知的方法的竞争性结合测定来进行测定。竞争性结合测定的一个实例是放射免疫测定，其包括在递增量的未标记的抗原存在的情况下温育标记的抗原(例如，对于目标分子(例如本发明的异二聚体)，3H或125I)，和检测结合于标记的配体的分子。本发明的异二聚体对于抗原的亲和力以及结合离解率可通过Scatchard分析从饱和数据测定。
[0259] 根据本发明的异二聚体的动力学参数还可使用本领域已知的基于表面等离子体共振(SPR)的测定(例如，BIAcore动力学分析)来测定。关于基于SPR的技术的综述，参见Mullet等人，2000，Methods 22：77-91；Dong等人，2002，Review in Mol.Biotech.，82：303-23；Fivash等人，1998，Current Opinion in Biotechnology 9：97-101；Rich等人，2000，Current Opinion in Biotechnology 11：54-61。此外，美国专利No.6,373,577、
6,289,286、5,322,798、5,341,215、6,268,125中描述的用于测量蛋白质-蛋白质相互作用的任何SPR装置和基于SPR的方法可期望用于本发明的方法。FACS还可用于测量亲和力，这在本领域中是已知的。
6,289,286、5,322,798、5,341,215、6,268,125中描述的用于测量蛋白质-蛋白质相互作用的任何SPR装置和基于SPR的方法可期望用于本发明的方法。FACS还可用于测量亲和力，这在本领域中是已知的。
[0260] 药物组合物
[0261] 本发明还提供了包含本文中描述的异二聚体或异二聚体对的药物组合物。这类组合物包含治疗有效量的异二聚体或异二聚体对和药学上接受的载体。在具体实施方案中，术语″药学上可接受的″意指由联邦或州政府的监管机制批准的或美国药典或其它用于动物，更特别地用于人的普遍公认的药典中所列的。术语″载体″是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成来源的那些液体，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选载体。盐水溶液以及含水葡萄糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别地用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。必要时，组合物还可含有少量湿润或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。可用常规粘合剂和载体诸如甘油三酯将所述组合物配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于由E.W.Martin编著的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”。这类组合物将含有(优选以纯化的形式)治疗有效量的所述化合物，以及合适量的载体，以提供用于向患者正确施用的形式。所述制剂应该适合施用模式。
[0262] 在某些实施方案中，按照常规方法将包含异二聚体或异二聚体的组合物对配制为适于向人类静脉内施用的药物组合物。通常地，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。一般地，单独地提供所述成分或以单位剂量形式(例如，作为干的冻干粉末或无水浓缩物)将其于标明活性剂的量的溶封容器诸如安瓿或小袋中混合在一起。当所述组合物将通过输注施用时，可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配其。当组合物通过注射施用时，可提供一安瓿注射用无菌水或盐水以便可在施用前混合所述成分。
[0263] 在某些实施方案中，将本文描述的组合物配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些盐，诸如从盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生的那些盐，和与阳离子形成的那些盐，诸如从氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的那些盐。
[0264] 在与治疗性蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病或病症的治疗、抑制和预防中有效的本文中描述的组合物的量可通过标准临床技术来确定。此外，体外测定可任选地用于帮助鉴定最佳剂量范围。待用于制剂的精确的剂量还将取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并应根据医生的判断和每个患者的情况来决定。从来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。
[0265] 异二聚体对的用途
[0266] 如上文中所述，根据本发明的异二聚体对可包含第一异二聚体和第二异二聚体，其中每个异二聚体的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链来源已知的治疗性抗体或从其工程化而来，或来源于结合分子的已知抗体。因此，预期来源于这些抗体或从其工程化而来的异二聚体可用于治疗或预防可对其使用已知的治疗性抗体或已知的抗体的相同疾病、病症或感染。
[0267] 因此，在一个实施方案中，还可将根据本发明的包含异二聚体的异二聚体对用于治疗或预防癌症和相关病症，所述异二聚体具有来源于可用于治疗和/或预防癌症或相关病症的治疗性抗体的重链和轻链。
[0268] 在另一个实施方案中，根据本发明的包含异二聚体的异二聚体对还可用于预防、治疗或管理受试者的炎性病症的症状，所述异二聚体具有来源于可用于预防、治疗或管理受试者的炎性病症的症状的治疗性抗体的重链和轻链。
[0269] 在另一个实施方案中，根据本发明的包含异二聚体的异二聚体对还可用于治疗或预防受试者的自身免疫性病症或炎性疾病，所述异二聚体具有来源于可用于治疗或预防受试者的自身免疫性病症或炎性疾病的治疗性抗体的重链和轻链。
[0270] 在另一个实施方案中，根据本发明的包含异二聚体的异二聚体对还可用于治疗或预防受试者的感染性疾病，所述异二聚体具有来源于可用于治疗或预防受试者的感染性疾病的治疗性抗体的重链和轻链。
[0271] 在另一个实施方案中，根据本发明的包含异二聚体的异二聚体对还可用于治疗受试者的血管疾病，所述异二聚体具有来源于可用于治疗受试者的血管疾病的治疗性抗体的重链和轻链。
[0272] 在另一个实施方案中，还可有利地将根据本发明的异二聚体对与本领域中已知的用于治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、炎性病症或感染性疾病的其它治疗剂组合使用。在具体实施方案中，可将根据本发明的异二聚体对与例如用于增加效应细胞的数目或活性的单克隆或嵌合抗体、淋巴因子或或造血生长因子(诸如，例如，IL-2、IL-3和IL-7)组合使用，所述效应细胞与所述分子相互作用，增强免疫反应。还可有利地将根据本发明的异二聚体对与一种或多种用于治疗疾病、病症或感染的药物(诸如，例如抗癌剂、抗炎剂或抗病毒剂)组合使用。
[0273] 试剂盒
[0274] 本发明另外地提供了包含一种或多种异二聚体对的试剂盒。可将试剂盒的单独组分包装在单独的容器中以及，与这样的容器结合，其可以由管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府监管机构规定的形式存在的通告，所述通告反映被制造、使用或销售的监管机制批准。试剂盒可任选地含有概述异二聚体的使用方法和施用方案的说明书或指导。
[0275] 当以溶液形式，例如水溶液或无菌水溶液提供试剂盒的一个或多个组分时，所述容器装置本身可以是吸入器、注射器、移液器、滴眼管或其它这样的类似装置，可从所述容器装置将溶液施用给受试者或用于试剂盒的另外组分或与所述另外组分混合。
[0276] 还可以以干燥或冻干形式提供试剂盒的组分，并且试剂盒可额外地含有用于冻干组分重建的合适的溶剂。无论容器的数目或类型如何，本发明的试剂盒还可包含帮助向患者施用组合物的装置。这样的装置可以是吸入器、鼻喷雾装置、注射器、移液器、镊子、测量勺、滴眼管或类似的医学上认可的递送载体。
[0277] 计算机实现
[0278] 在一个实施方案中，计算机包含至少一个偶联于芯片组的处理器。还偶联于芯片组的是内存、存储设备、键盘和网络适配器。显示器被偶联于图形适配器。在一个实施方案中，芯片组的功能由内存控制器集线器和I/O控制器集线器提供。在另一个实施方案中，内存被直接偶联至处理器而非芯片组。
[0279] 存储装置是能够保持数据的任何装置，如硬盘驱动器、光盘只读存储器(CD-ROM)、DVD或固态存储装置。所述内存保存由处理器使用的指令和数据。点击设备可以是鼠标、轨迹球或其他类型的点击设备，并且与键盘组合用于输入数据至计算机系统中。图形适配器在显示器上显示图像和其他信息。网络适配器将计算机系统偶联于局域或广域网。
[0280] 如本领域中已知的，计算机可具有与先前描述的组件不同的组件和/或其它组件。此外，计算机可以缺少某些组件。此外，存储装置可以是来自本地和/或远程计算机(诸如在存储区域网络(SAN)内体现的)。
[0281] 如本领域中已知的，计算机适于执行用于提供本文所描述的功能性的计算机程序模块。如本文中所用，术语“模块”指用于提供特定的功能的计算机程序逻辑。因此，模块可在硬件、固件和/或软件中来实现。在一个实施方案中，程序模块被存储在存储设备上，加载至内存中，并且由处理器执行。
[0282] 应当理解，本文中描述的实例和实施例仅用于举例说明性目的，并且鉴于其的各种变动或变化将被建议给本领域的技术人员，并且被包括在本申请的精神和权限之内和所附权利要求的范围内。实施例
[0283] 下面是用于进行本发明的具体实施方案的实例。所述实施例仅出于举例说明目的提供，并且无意以任何方式限制本发明的范围。已作出努力以确保关于所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但当然应当允许一定的实验误差和偏差。
[0284] 除非另有说明，否则本发明的实践将采用在本领域普通技术人员的能力范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这类技术在文献中进行了充分解释。参见，例如，T.E.Creighton、Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，当前版本)；Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick 和 N.Kaplan 编 辑，Academic Press，Inc.)；Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A和B卷(1992)。
[0285] 实施例1：编码D3H44 IgG重链和D3H44 IgG轻链的构建体的制备。
[0286] 如下制备用于本文中描述的共表达组的抗组织因子抗体D3H44的野生型重链和轻链。D3H44 Fab轻链(AJ308087.1)和重链(AJ308086.1)序列获自GenBank(表A、A1和A2)，针对哺乳动物表达合成基因和优化密码子。将由5’-EcoRI切割位点-HLA-A信号肽-HA或FLAG标签-轻链Ig克隆-‘TGA终止’-BamH1切割位点-3’组成的轻链载体插入物连接入pTT5载体(Durocher Y等人，Nucl.Acids Res.2002；30，No.2e9)。对所得的载体+插入物进行测序以确认正确的阅读框架和编码DNA的序列。同样地，将由5’-EcoR1切割位点-HLA-A信号肽-重链克隆(终止于T238；参见表A1)-ABD2-His6标签-TGA终止-BamH1切割位点-3’组成的重链载体插入物连接入pTT5载体(ABD；白蛋白结合结构域)。也对所得的载体+插入物进行测序以确认正确的阅读框架和编码DNA的序列。通过基因合成或通过定点诱变产生不同的D3H44构建体(Braman J，Papworth C & Greener A.，Methods Mol.Biol.(1996)57：31-44)。
[0287] 分别在C和N末端标记重链和轻链，以有利于通过竞争性测定-SPR筛选评估优先配对。ABD2-His6重链标签特异性地允许HC-LC复合物被捕获在抗-his标签SPR芯片表面上，而FLAG和HA轻链标签允许相对LC1和LC2群体被定量。
[0288] 实施例2：异二聚体在于D3H44 IgG轻链和/或重链中包含可变结构域修饰的共表达组中的优先配对的评估
[0289] 测定异二聚体在包含D3H44重链和轻链的共表达组中优先与经修饰的VL和/或VH结构域配对的能力，结果示于图1中。图1中提供的结果是初步的，一个更完整的组的结果提供于下文中。参照D3H44重链和D3H44轻链的氨基酸序列鉴定图1-3中显示的氨基酸修饰鉴定。参见表A，A1和A2。
[0290] 将一个D3H44重链构建体与两个独特的D3H44轻链构建体共表达，根据竞争性测定-SPR筛选(图1中标题为“竞争性测定实验结果”的栏)测定相对轻链配对特异性(例如H1-L1∶H1-L2)。通过轻链竞争性测定验证法验证选择的异二聚体命中，其中L1∶L2 DNA比率在转染过程变化经历40∶60、50∶50和60∶40(图1中标题为“竞争性测定验证结果”的栏)。对于竞争性测定筛选和验证，以有限量(即HC＜L1+L2)保持重链。代表该测定的设计的示意图示于图8中。
[0291] 如下进行所述方法：轻链竞争性测定(LCCA)定量一条重链对于至少两个独特轻链的相对配对。可如下概括测定和前述步骤：1.重链和轻链的伴随表达，重链以有限量(例如HC∶LC1∶LC2＝1∶1∶1)存在，2.HC-LC复合物的分离-通过经由his-标签下拉将重链结合于SPR芯片来实现，和3)相对HC-LC群体的定量(即H1-L1∶H1-L2)。在SPR形式中，将对于独特的轻链标记的群体是特异性的抗体用于进行定量。注意：可利用或不利用H-L二硫化物进行该测定。代表该方法的示意图示于图9中。
[0292] 转染方法
[0293] 如下将包含如实施例1中所述制备的一条重链和两条轻链构建体的共表达组转6
染进CHO-3E7细胞中。将CHO-3E7细胞以1.7-2×10个细胞/ml的密度于37℃培养在补TM
充有4mM谷氨酰胺和0.1％Pluronic F-68(Invitrogen cat#24040-032)的FreeStyle F17培养基(Invitrogen cat#A-1383501)中。使用PEI-pro(Polyplus cat#115-010)，以
1∶2.5的DNA∶PEI比率用总共2ug DNA转染2ml的总体积。在添加DNA-PEI混合物后
24小时，将细胞转移至32℃。在第7天，通过非还原SDS-PAGE分析，随后进行考马斯蓝染色以显现条带来测试上清液的表达。HC∶LC比率如表7中所指定的。
染进CHO-3E7细胞中。将CHO-3E7细胞以1.7-2×10个细胞/ml的密度于37℃培养在补TM
充有4mM谷氨酰胺和0.1％Pluronic F-68(Invitrogen cat#24040-032)的FreeStyle F17培养基(Invitrogen cat#A-1383501)中。使用PEI-pro(Polyplus cat#115-010)，以
1∶2.5的DNA∶PEI比率用总共2ug DNA转染2ml的总体积。在添加DNA-PEI混合物后
24小时，将细胞转移至32℃。在第7天，通过非还原SDS-PAGE分析，随后进行考马斯蓝染色以显现条带来测试上清液的表达。HC∶LC比率如表7中所指定的。
[0294] 表7：
[0295]
[0296] ^填充片段DNA(填充DNA)：无DNA插入物的PTT5载体。
[0297] 竞争性测定SPR法
[0298] 使用位于每一条轻链的N末端上的独特表位标签的基于SPR的读出来评估对共表达组中的D3H44重链的优先D3H44轻链配对的程度。
[0299] 表面等离子体共振(SPR)设备。GLM传感器芯片，Biorad ProteOn胺偶联试剂盒(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sNHS)和乙醇胺)和10mM醋酸钠缓冲液购自Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON)。重组Her-2蛋白购自eBioscience(San Diego，CA)。4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)和NaCl购自Sigma-Aldrich(Oakville，ON)。10％Tween 20溶液购自Teknova(Hollister，CA)。
[0300] SPR 互 物 传 感 器 测 定。 使 用 BioRad ProteOn XPR36 仪 (Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))用PBST电泳缓冲液(含有0.05％Tween20的PBS Teknova Inc)在25℃的温度下进行所有表面等离子体共振测定。使用通过在分析物(水平)方向上以100μL/分钟注射(持续140秒)的标准BioRad sNHS/EDC溶液的1∶5稀释物活化的GLM传感器芯片生成抗penta His捕获表面。紧接活化之后，在分析物(垂直)方向上以25μL/分钟的流速注射25μg/mL的抗penta His抗体(Qiagen Inc.)在10mM NaOAc pH 4.5中的溶液，直至约3000共振单位(RU)被固定。通过在分析物方向上以100μL/分钟注射1M乙醇胺140秒来淬灭剩余活性基团，这也确保模拟物活化的中间点(interspot)被产生来用于空白参照。
[0301] 在如下两个步骤中进行异二聚体的对抗FLAG(Sigma Inc.)和抗HA(Roche Inc.)单克隆抗体的结合的筛选：通过在配体方向上将异二聚体间接捕获至抗penta His表面上，随后在分析物方面上注射抗FLAG和抗HA注射。首先，将在配体方向上以100uL/分钟进行的一次缓冲液注射(持续30秒)用于稳定碱基线。对于每个异二聚体捕获，将细胞培养基中的未纯化的异二聚体于PBST中稀释至4％。在单个配体通道中以25μL/分钟的流速同时注射(持续240秒)1至5种异二聚体或对照(即含有100％HA-轻链或100％FLAG-轻链的对照)。这导致约300至400RU的至抗penta His表面上的饱和异二聚体捕获。如果需要，使第一配体通道留空以用作空白对照。在该异二聚体捕获步骤之后，随即在分析物方向上进行两次缓冲液注射以稳定基线，随后一式两份以50μL/分钟各自注射5nM抗FLAG和5nM抗HA，持续120秒，进行180秒的解离期，从而对于每一种捕获的异二聚体产生一组具有缓冲液参照的结合传感图。如果可能的话，还可在最后剩余的分析物通道上方注射异二聚体所结合的抗原作为活性对照。通过18秒脉冲的0.85％磷酸(以100μL/分钟进行
18秒)再生该异二聚体，以制备用于下一个注射循环的抗penta His表面。将传感图进行比对，并使用缓冲液空白注射和中间点进行双参照，使用ProteOn Manager软件v3.0分析所得的传感图。
18秒)再生该异二聚体，以制备用于下一个注射循环的抗penta His表面。将传感图进行比对，并使用缓冲液空白注射和中间点进行双参照，使用ProteOn Manager软件v3.0分析所得的传感图。
[0302] L1和L2的总百分比在理论上应当加起来达到100％。在实践中，对于一些变体观察到，L1和L2的总量加起来显著小于100％。总的轻链百分比的该差异据认为部分归因于在SPR芯片上的初始异二聚体捕获过程中可变非特异性结合的发生。
[0303] 实施例3：异二聚体在于D3H44 IgG轻和/或重链中包含恒定(CL或CH1)结构域修饰的共表达组中的优先配对的评估
[0304] 如实施例2中针对具有可变结构域修饰的异二聚体所描述的，测定异二聚体在包含D3H44重链和轻链的共表达组中优先与经修饰的CL和/或CH1结构域配对的能力，结果示于图2中。将一个D3H44重链构建体与两个独特的D3H44轻链构建体共表达，根据竞争性测定-SPR筛选(图2中标题为“竞争性测定实验结果”的栏)测定相对轻链配对特异性(例如H1-L1∶H1-L2)。通过改进的竞争性测定验证验证选择的异二聚体命中，其中L1∶L2DNA比率在转染过程变化经历40∶60、50∶50和60∶40(图2中标题为“竞争性测定验证结果”的栏)。如实施例2中描述的，对于竞争性测定筛选和验证，以有限量(即HC＜L1+L2)保持重链。如实施例2中所述进行优先配对的评估。
[0305] 实施例4：按比例放大以进行生物物理表征
[0306] 将选择的异二聚体(配对的和错配的)按比例放大(通常达到50ml)，如对其进行纯化以测试热稳定性和抗原结合。表达并纯化图3中显示的异二聚体HD100-HD115。在上述培养条件下在50ml CHO-3E7细胞的培养物中表达每个异二聚体的重链和轻链。将细胞离心，如下文中所述，通过将上清液加载在装填有镍的Fractogel柱上纯化所述异二聚体。
[0307] 在装填有镍的Fractogel柱上进行的纯化(His)
[0308] 用镍装填柱子：用5倍柱体积(CV)的0.5M NaCl(无pH调整)，随后用4CV 200mM的NiCl2(镍)和2CV的0.5M NaCl pH 5.0连续洗涤。样品加载和洗脱：用10CV PBS平衡柱子。加载样品，用10CV的洗涤缓冲液#1(50mM磷酸钠pH 7.0、300mM NaCl)，随后用10CV的洗涤缓冲液#2(50mM磷酸钠pH 7.0、300mM NaCl、25mM咪唑)洗涤以除去结合于柱的杂质。用洗涤缓冲液#1+300mM咪唑在级分中洗脱异二聚体。每一个级分的蛋白质含量通过Bradford蛋白质测定来测试。将含有蛋白质的级分混合。随后如实施例5中所述，测定纯化的异二聚体的抗原结合和热稳定性。
[0309] 实施例5：异二聚体的热稳定性和抗原亲和力测量
[0310] 测量选择的异二聚体对的热稳定性和抗原亲和力，以将这些特性与野生型未修饰的重链-轻链对的所述特性相比较。单独地按比例放大来自共表达组的正确配对和错配的异二聚体，如下文中所述对其进行纯化(即His标签亲和纯化)并评估其热稳定性和抗原结合。结果示于图3中。
[0311] 热稳定性的测量
[0312] 如下使用差示扫描量热法(DSC)测量选择的异二聚体对的热稳定性。
[0313] 如实施例3中所述纯化每一种异二聚体，将其在PBS中稀释至0.2mg/mL，将总共400μL用于利用VP-Capillary DSC(GE Healthcare)的DSC分析。在每一个DSC运行起始时，进行5次缓冲液空白注射以稳定基线，在每一次异二聚体注射之前设置缓冲液注射以用于参照。以60℃/小时的速率，利用低反馈、8秒的过滤、5分钟preTstat和70psi氮压力从20℃至100℃扫描每一个样品。参考所得的热谱图，使用Origin 7软件进行分析。
[0314] 测试的异二聚体的热展开曲线示于图4中。结果显示正确配对的异二聚体(从设计观点来看)通常显著比有意错配的异二聚体(例如HD107对HD108)更稳定。此外，许多正确配对的异二聚体展示接近野生型Fab(例如HD114)的热稳定性。
[0315] 抗原亲和力的测量
[0316] 使用表面等离子体共振(SPR)测定来测量异二聚体对对于抗原(组织因子细胞外结构域)的亲和力。使用BioRad ProteOn XPR36仪(Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON)，利用PBST电泳缓冲液(含有0.05％Tween20的PBS Teknova Inc)在25℃的温度下进行所有表面等离子体共振测定。使用通过在分析物(垂直)方向上以100μL/分钟注射(持续140秒)的标准BioRad sNHS/EDC溶液的1∶10稀释物活化的
GLM传感器芯片生成纯化的组织因子(TF)表面。紧接活化之后，在配体方向上以25μL/分钟的流速注射25μg/mL的TF在10mM NaOAc pH 4.5中的溶液，直至约1000共振单位(RU)被固定(或当流动60nM FAB足以产生100RU的最大反应)。通过在分析物方向上以
100μL/分钟注射1M乙醇胺140秒来淬灭剩余活性基团。对于每一个注射系列，在纯化的异二聚体之前以水平注射进行两次缓冲液空白注射。以50μL/分钟同时注射(持续120秒)每一种异二聚体的3倍稀释系列(60nM、20nM、6.7nM、2.2nM)和空白缓冲液对照，进行
20分钟的解离，对于每一种异二聚体，产生一组具有缓冲液参照的结合传感图。通过18秒脉冲的0.85％磷酸(以100μL/分钟进行18秒)再生SPR表面上的该异二聚体：TF复合物，以制备用于下一个注射循环的TF表面。将传感图进行比对，并使用缓冲液空白注射和中间点进行双参照，使用ProteOn Manager软件v3.0内的1∶1结合模型分析所得的传感图。
GLM传感器芯片生成纯化的组织因子(TF)表面。紧接活化之后，在配体方向上以25μL/分钟的流速注射25μg/mL的TF在10mM NaOAc pH 4.5中的溶液，直至约1000共振单位(RU)被固定(或当流动60nM FAB足以产生100RU的最大反应)。通过在分析物方向上以
100μL/分钟注射1M乙醇胺140秒来淬灭剩余活性基团。对于每一个注射系列，在纯化的异二聚体之前以水平注射进行两次缓冲液空白注射。以50μL/分钟同时注射(持续120秒)每一种异二聚体的3倍稀释系列(60nM、20nM、6.7nM、2.2nM)和空白缓冲液对照，进行
20分钟的解离，对于每一种异二聚体，产生一组具有缓冲液参照的结合传感图。通过18秒脉冲的0.85％磷酸(以100μL/分钟进行18秒)再生SPR表面上的该异二聚体：TF复合物，以制备用于下一个注射循环的TF表面。将传感图进行比对，并使用缓冲液空白注射和中间点进行双参照，使用ProteOn Manager软件v3.0内的1∶1结合模型分析所得的传感图。
[0317] 结果表明正确配对的异二聚体(从设计观点来看)展示一系列对于抗原的亲和力，一些设计显示野生型样对于抗原的结合亲和力(例如HD107和HD114)。
[0318] 实施例6：野生型标记的D3H44异二聚体和单独的优先配对的异二聚体的代表性样品的尺寸排阻层析(SEC)特征谱
[0319] 按照本领域中已知的和与实施例1和4中描述的那些方法相似的方法，表达和纯化在重链上具有C末端ABD2-His6标签并且在轻链上具有N末端FLAG标签的野生型D3H44异二聚体(一条重链和一条轻链)。单独地按比例放大来自共表达组的优先或正确配对的异二聚体(图3中显示的异二聚体HD100、HD105和HD107)，通过如实施例4中描述的His标签亲和层析和SEC进行纯化。
[0320] 如下进行SEC。使用架在Pharmacia(GE Healthcare) Purifier系统上的Superdex 200HR 10/30 Pharmacia(GE Healthcare)柱分离异二聚体样品。将PBS中的异二聚体样品(0.3-0.5ml)手工加载至充满PBS的0.5ml环中。随后样品被自动地注射至柱上，并且利用1CV洗脱体积以0.5ml/分钟进行分离。在OD280监测蛋白质洗脱，并收集在
1ml级分中。
1ml级分中。
[0321] 如图5中显示的，正确配对的异二聚体展现与对于无氨基酸修饰的野生型异二聚体观察到的SEC特征谱接近的SEC特征谱(主峰[*]：异二聚体)。当野生型异二聚体的轻链具有N末端HA标签时，获得等同的结果。
[0322] 实施例7：与异二聚体的稳定性相关的另外的数据
[0323] 将表8中显示的设计突出显示为设计驱动器与增强的HC-LC选择性的组合。
[0324] 表8：
[0325]
[0326]
[0327] 残基编号遵照Kabat命名法(Kabat E.A.等人，(1983)Sequence of Proteins of Immunological Interest National Institutes of Health，Bethesda)。
[0328] 大部分设计保持表9中显示的野生型样热稳定性(Tm)和TF结合亲和力。
[0329] 表9：
[0330]
[0331] 设计12含有野生型H2-L2配对(参见表8)。作为结果，H2-L2Fab保持野生型结合亲和力。野生型抗TF D3H44 Fab Tm＝～76℃(数据未显示)。
[0332] 实施例8：另外的异二聚体及所述异二聚体的测试
[0333] 制备和测试如表10中描述的另外的异二聚体对。这些异二聚体被设计来增加Fab热点覆盖度。
[0334] 表10：
[0335]
[0336]
[0337] *表10中的残基编号遵照用于D3H44 Fab的晶体结构(PDB ID＝1JPT[Faelber K 等 人，J.Mol.Biol.(2001)313：83-97]；www.rcsb.or g/pdb/explore/explore.do ？structureId＝1JPT)中的残基的常规。
[0338] 如实施例5中所述，测定这些异二聚体的稳定性、结合至靶的能力以及选择性配对的能力，并示于表11中。
[0339] 表11：
[0340]
[0341] 野生型抗-TF D3H44 Fab KD＝0.052nM；野生型抗-TF Fab Tm＝～76℃
[0342] 实施例9：另外的异二聚体
[0343] 还制备下列异二聚体对，并测试其选择性配对的能力。
[0344] 表12：
[0345]
[0346] 表12中的残基编号遵照用于D3H44 Fab的晶体结构(PDB ID＝1JPT[Faelber K 等 人，J.Mol.Biol.(2001)313：83-97]；www.rcsb.or g/pdb/explore/explore.do ？structureId＝1JPT)中的残基的常规。
[0347] 表13：
[0348]
[0349]
[0350] 表13中的残基编号遵照用于D3H44 Fab的晶体结构(PDB ID＝1JPT[Faelber K 等 人，J.Mol.Biol.(2001)313：83-97]；www.rcsb.o rg/pdb/explore/explore.do ？structureId＝1JPT)中的残基的常规。
[0351] 实施例10：异二聚体在于D3H44重链和轻链Fab形式中包含恒定结构域和/或可变结构域修饰的共表达组中的优先配对的评估
[0352] 设计除了图1和2中显示那些共表达组以外的共表达组。如实施例1中所述，制备编码包含根据共表达组的设计的氨基酸修饰的以Fab形式存在的D3H44 IgG重链和轻链的构建体。如实施例2和3中所述，评估D3H44重链和轻链Fab对优先配对的能力。如实施例5中所述，测定所述设计的稳定性和结合亲和力。表14和15中显示的结果是累积性的，并且包括除新设计以外的图1和2中显示的设计的结果。参照D3H44重链和D3H44轻链的氨基酸序列鉴定这些表中显示的氨基酸修饰。参见表A、A1和A2。
[0353] 要注意，本申请中的“设计”或“设计组”是指H1、L1、H2和L2链上的一组突变。“LCCA设计”是指H1、L1和L2中的突变的组。
[0354] 给每一个独特组的H1、L1和L2突变(LCCA形式)指定唯一编号，或所谓的‘唯一标识符’。当数据以H1 L1 H2 L2形式(Fab对形式或SMCA)提供时，这样的设计组由此用由两个组成LCCA(例如1-2)的唯一标识符组成的‘唯一标识符组’表示。首先指定D3H44 LCCA数据集中表征的设计。不存在于该组中但存在于不同的同质或混合系统数据中或/和不同形式(MCA)中的设计另外地用*表示。在指定唯一标识符的该练习中，通过许多表的自动化处理，已产生一定冗余。其中系统中除D3H44外不同的WT氨基酸占据相同的位置的案例是：309*＝319*＝47，316*＝101，317*＝183，318*＝182，310*＝48，311*＝102，323*＝180，324*＝179。其中掺入另外的突变以进行LC/MS的案例是：442*＝326*和
443*＝23。
443*＝23。
[0355] 要注意，对不存在位于恒定结构域(H/C233S-L/C214S)中的链间Fab二硫键的构建体进行大部分LCCA实验。
[0356] 在表14中，提供了展示55％∶45％(H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1)或更大的正确配对特异性的设计。为了突出显示关于优先配对的特定设计的成功，以Fab对的形式表示两个互补的LCCA组(H1、L1、L2和H2、L2、L1)。
[0357] 标签(L：HA和FLAG以及H：ABD2)的存在不影响～50％∶50％的对于D3H44 WT预期的中性配对(这进一步得到实际设计的配对结果的支持；因此标签信息不包括在该表中)。
[0358] 在表中，以比率形式(H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1)包括相关Fab种类(H1-L1、H1-L2和H2-L2、H2-L1的测量的量)的测量的量。在大多数情况下，进行数个LCCA实验重复(筛选和验证)。还提供了中间H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1的以归一化比率(即达到100％的H1-L1与H1-L2之和)的格式存在的摘要栏。
[0359] 按照热稳定性数据(Tm)和抗原亲和力(在表格桶中，‘TF’符号用于组织因子亲和力)类别将数据聚类。
[0360] Tm1(x＝＞71℃)；Tm2(71℃＞x＝＞66℃)；Tm3(66℃＞x)。Tm3种类还包括ND(未进行实验)案例。
[0361] 作为参考，D3H44WT Fab(无二硫键)的Tm为～76℃。
[0362] TF1(x＝＜5X WT的KD的中位值)；TF2(5＜x＝＜20X WT的KD的中位值)；和包括x＞20X WT的KD的中位值的案例的混杂类别，其中分别标记NB案例(无结合：对大于500nM的KD，其为～10000X WT的KD的中位数)。该最后类型还包括ND案例(实验未进行)。
[0363] 例如，D3H44 WT Fab的中位KD为0.06nM(范围为0.1)。
[0364] 注意：在提及抗原亲和力和热稳定性的表栏中，如果进行的实验次数大于1(n＞1)，则指示范围(最小-最大读数)。
[0365] 在每一个桶内，按H1-L1∶H1-L2的配对特异性，随后H2-L2∶H2-L1的配对特异性的降序对设计进行排序。
[0366] 表中的读数桶类别的实例：
[0367] 仅Tm1(H1-L1和H2-L2Tm都属于Tm1类别)
[0368] Tm1/Tm2(H1-L1或H2-L2Tm属于Tm1并且另外的属于Tm2类别)
[0369] 相同的逻辑用于‘TF’类别。
[0370] 将另外一组LCCA结果(表15)(也以Fab对形式存在，在另外的设计循环后获得的)包括在单独的表中。按照递减的配对特异性的顺序排列该组数据，其包含少许有限的关于热稳定性的数据。
[0371] 表14和15中的结果显示，我们的芯片设计方法导致跨不同组的设计和它们变型的H1-L1相对于H1-L2的优先配对和H2-L2相对于H2-L1的优先配对的实现。这些设计通常分成两个主要类别：静电(基于利用氢键合或电荷间相互作用的特异性驱动器)和空间互补。对于两种LCCA设计，这样的配对特异性从中等变化至～100％的正确配对。如根据表很明显地，这些设计中的一些设计不影响热稳定性(Tm)或抗原结合亲和力，然而一些展示不同程度的对这两个性质的影响。此外，成功的设计存在于恒定和可变结构域中，以及存在于结构域设计组合形式中。
[0372] 实施例11：异二聚体在于混合的Ab或纯Ab重链和轻链Fab形式中包含恒定结构域和/或可变结构域修饰的共表达组中的优先配对的评估
[0373] 在其中异二聚体对来源于不同的Ab(参见D3H44)或两个不同的抗体的系统中测试前述实施例中描述的某些设计，以评估共表达组的设计是否在这些类型的系统中导致优先配对。测试许多不同的系统。在一个实例中，一种异二聚体对来源于以Fab形式存在的D3H44重链和轻链并且第二异二聚体对来源于以Fab形式存在的培妥珠单抗重链和轻链。在另一个实例中，一种异二聚体对来源于以Fab形式存在的D3H44重链和轻链，并且第二异二聚体对来源于以Fab形式存在的曲妥珠单抗重链和轻链。
[0374] 如实施例1中所述制备构建体，所述构建体编码包含根据共表达组的设计的氨基酸修饰的以Fab形式存在的D3H44IgG、培妥珠单抗和曲妥珠单抗重链和轻链。培妥珠单抗重链的基本DNA序列、培妥珠单抗的轻链的基本DNA序列、曲妥珠单抗重链的基本DNA序列和曲妥珠单抗的轻链的基本DNA序列示于表A、A1和A2中。通过定点诱变将氨基酸修饰引入这些序列，或合成所述DNA序列，包括来自如实施例1中描述的碱基序列的氨基酸修饰。
[0375] 除当测试混合的系统时，使用的非强制链属于不同的Fab的事实外，如实施例2和3中所述评估异二聚体设计优先配对的能力。
[0376] 结果示于表16中。参照D3H44重链和D3H44的轻链、培妥珠单抗重链和培妥珠单抗的轻链、曲妥珠单抗重链和曲妥珠单抗的轻链的氨基酸序列鉴定表16中显示的氨基酸修饰。参见表A、A1和A2。
[0377] 在不同的系统(曲妥珠单抗(TRAS)和培妥珠单抗(PERT))以及在混合的系统(D3H44/TRAS、D3H44/PERT和TRAS/PERT)(与D3H44LCCA一样，构建体不存在Fab二硫化物)中测试在D3H44系统中展示成功的优先配对的代表性和多样性亚组的设计。
[0378] 数据以LCCA(表16)和Fab对形式(表17)提供。LCCA数据反映最小‘竞争单位’(即H1-L1∶H1-L2)并且是用于解释LCCA设计是否可成功地在Fab间转移的最佳形式。Fab对形式(包括第二Fab对(即H2-L2∶H2-L1))的分析进一步举例说明翻译成完整设计(即H1-L1和H2-L2)的程度以及其在这些不同Fab系统中的效力。除H1-L1∶H1-L2的比率以外，我们还提供相对于不正确配对的进行正确配对的相对倾向作为标量，其中标量＝ln(H1-L1∶H1-L2)。
[0379] 在一些混合的系统中，观察到固有的跨系统配对优先性(例如H_D3H44对相较于L_D3H44优先与L_PERT配对)(表17)。在一些实例中，H_D3H44优先与L_PERT配对也得到热稳定性测量(Tm)的支持，所述热稳定性测量显示H_D3H44-L_PERT种类比H_D3H44-L_D3H44更稳定。因此，与报导测量的实际种类的量一起，以ΔScalar(VAR-REF_WT)的形式提供各自WT LCCA系统(REF)行为的标准化数据，其中ΔScalar＝ln(H1-L1∶H1-L2/H2-L2∶H2-L1)。该度量是LCCA设计的实际效力的指标。表中包括的数据包含产生具有55％∶45％或更大的配对特异性(即ΔScalar(VAR-REF_WT)＞0.2)的等同物的设计。
[0380] 与在D3H44系统中不同，某些种类比率似乎有时受仅WT PERT系统中的以及WT TRAS(在较小的程度上)系统中的轻链标签影响(表18)。这似乎归因于HA-标签切割的随机事件(当以Mab形式测试系统时，LC/MS证据是可获得的)，而非标签干扰配对。因此，当在相关表中提供结果时考虑标签。
[0381] 在表19和20中报告了跨不同系统的以LCCA和Fab对形式表示的结果的概述。结果显示跨不同测试的Fab系统的设计可转移性。这些结果不一定反映一些设计比其它设计更好；它们也不反映更广泛的可移植性评估。表19中显示的两个系统或更多个系统中的成功的LCCA设计(例如，中位数ΔScalar(VAR-REF_WT)＞0.2)在这些不同系统中构成约
30％的测试的LCCA设计。这表示可转移性，取决于特定系统和设计。因此，具有独特设计的集合允许为许多系统产生双特异性对并且突出显示了可在任何目标抗体(或抗体对)的背景中进行评估的设计组的文库的效用。本实施例显示，突变/设计组可用于实现异二聚体在于混合的Ab或纯Ab重链和轻链Fab形式中包含恒定结构域和/或可变结构域修饰的共表达组中的优先配对。
30％的测试的LCCA设计。这表示可转移性，取决于特定系统和设计。因此，具有独特设计的集合允许为许多系统产生双特异性对并且突出显示了可在任何目标抗体(或抗体对)的背景中进行评估的设计组的文库的效用。本实施例显示，突变/设计组可用于实现异二聚体在于混合的Ab或纯Ab重链和轻链Fab形式中包含恒定结构域和/或可变结构域修饰的共表达组中的优先配对。
[0382] 实施例12：异二聚体在于D3H44重链和轻链中，在全长重链(Mab)形式中包含恒定结构域和/或可变结构域修饰的共表达组中的优先配对的评估
[0383] 评估异二聚体共表达组设计以确定它们是否也允许以其中重链是全长重链而非Fab部分的形式(Mab形式)优先配对。
[0384] 构建体的制备：
[0385] 如下制备编码包含根据共表达组的设计的氨基酸修饰的D3H44IgG重链和轻链的构建体。如实施例1中所述，制备D3H44 Fab轻链构建体。除通过将编码铰链-CH2-CH3结构域的IgG1*01 DNA序列附加至D3H44 Fab重链的C末端上来产生全长D3H44重链外，如实施例1中所述，制备D3H44重链序列。值得注意地，除去经典C末端重链赖氨酸残基以防止因C末端赖氨酸裁剪而导致的LC-MS信号异质性(Lawrence W.Dick Jr.等人，Biotechnol.Bioeng.(2008)100：1132-43)。
[0386] Mab测定形式
[0387] 如下评估D3H44重链和轻链优先配对的能力：将一个全长D3H44重链构建体与两个独特的D3H44轻链构建体共表达，从而产生3个可能的抗体种类：H1-L1∶H1-L1、H1-L2∶H1-L2和H1-L1∶H1-L2(参见图10)。在蛋白A(pA)纯化后使用LC-MS测定相对轻链配对特异性(根据优选H1-L1∶H1-L1种类相对其它种类的量)。如果可能的话，不对链进行标记，只要由3条链的共转染产生的3种可能的Mab种类彼此相异至少50Da。当质量差异排除该可能性时，利用N末端HA或FLAG标签融合构建轻链的至少一个，以在种类之间提供足够的质量区别。如实施例2中描述的，使重链保持有限量(即HC＜L1+L2)。
[0388] 用于Mab测定形式的转染法
[0389] 如下将如实施例12中所述制备的包含一个重链和2个轻链构建体的共表达组转6
染进CHO-3E7细胞中。将CHO-3E7细胞以1.7-2×10个细胞/ml的密度于37℃培养在补充有4mM谷氨酰胺和0.1％Pluronic F-68(Invitrogen cat#24040-032)的FreeStyle(TM)F17培养基(Invitrogen cat# A-1383501)中。使用PEI-pro(Polyplus cat#115-010)，以
1∶2.5的DNA∶PEI比率用总共50ug DNA转染50ml的总体积。添加DNA-PEI混合物后
24小时，将细胞转移至32℃。在第7天，通过非还原SDS-PAGE分析，随后进行考马斯蓝染色(以显现条带)来测试上清液的表达。使用的HC∶L1∶L2比率为1∶1∶1。
染进CHO-3E7细胞中。将CHO-3E7细胞以1.7-2×10个细胞/ml的密度于37℃培养在补充有4mM谷氨酰胺和0.1％Pluronic F-68(Invitrogen cat#24040-032)的FreeStyle(TM)F17培养基(Invitrogen cat# A-1383501)中。使用PEI-pro(Polyplus cat#115-010)，以
1∶2.5的DNA∶PEI比率用总共50ug DNA转染50ml的总体积。添加DNA-PEI混合物后
24小时，将细胞转移至32℃。在第7天，通过非还原SDS-PAGE分析，随后进行考马斯蓝染色(以显现条带)来测试上清液的表达。使用的HC∶L1∶L2比率为1∶1∶1。
[0390] 用于Mab测定形式的质谱法
[0391] 在蛋白A纯化和去糖基化后，使用质谱法评估D3H44轻链在共表达组中优先与D3H44重链配对的程度。如下利用PNGaseF对纯化的样品去糖基化：0.2U PNGaseF/μg的50mM Tris-HCl pH 8.0中的抗体，在37℃下温育过夜，终蛋白质浓度为0.45mg/mL。使用通过高流电喷雾接口偶联于LTQ-Orbitrap XL混合质谱仪(ThermoFisher Scientific)的Agilent 1100HPLC系统，通过LC-MS分析蛋白质样品。将样品(2.5μg)注射至2.1×10mm Poros R2柱(Applied Biosystems)上，使用下列梯度条件进行洗脱：0-3分钟：20％溶剂B；
3-6分钟：20-90％溶剂B。溶剂A为0.1％甲酸水溶液，溶剂B为65％CAN，25％THF，9.9％ddH2O，0.1％甲酸。流速为1mL/分钟。流在柱后被分开以100μL/分钟注入电喷雾接口中。将柱和溶剂加热至80℃以改善蛋白质峰形。使用ThermoFisher Scientific’s LTQ Positive Ion ESI校准液(咖啡因，MRFA和Ultramark 1621)校准LTQ-Orbitrap XL，使用10mg/mL的CsI溶液进行调谐。锥孔电压(源片段化设置)为40V，FT分辨率为7,500并且扫描范围为m/z 400-4,000。
3-6分钟：20-90％溶剂B。溶剂A为0.1％甲酸水溶液，溶剂B为65％CAN，25％THF，9.9％ddH2O，0.1％甲酸。流速为1mL/分钟。流在柱后被分开以100μL/分钟注入电喷雾接口中。将柱和溶剂加热至80℃以改善蛋白质峰形。使用ThermoFisher Scientific’s LTQ Positive Ion ESI校准液(咖啡因，MRFA和Ultramark 1621)校准LTQ-Orbitrap XL，使用10mg/mL的CsI溶液进行调谐。锥孔电压(源片段化设置)为40V，FT分辨率为7,500并且扫描范围为m/z 400-4,000。
[0392] 使用MassLynx仪控制和数据分析算法(Waters)的MaxEnt模块对蛋白质频谱进行去卷积。简而言之，首先在QualBrower(Xcalibur的波谱观察模块(Thermo Scientific))中打开原始蛋白质LC-MS数据，使用Databridge(由Waters提供的文件转换程序)将其转换以与MassLynx相容。在MassLynx的光谱模块中观察转换的蛋白质频谱，使用MaxEnt去卷积。直接从所得的分子量特征谱测定每一个样品中不同抗体种类的丰度。
[0393] 结果示于表21中。参照D3H44重链和D3H44轻链的氨基酸序列鉴定表21中显示的氨基酸修饰。参见表A、A1和A2。
[0394] 选择一个亚组的设计(所述设计在D3H44系统中展示成功的优先配对，其也代表多样性设计组)用于评估形式的可转移性，即从利用Fab结构的LCCA至基于Mab结构的Mab竞争性测定(MCA)。
[0395] 如表21中显示的，用于Mab竞争性测定的D3H44 WT展示与50％H1-L1_H1-L2和各自25％的H1-L1_H1-L1和H1-L2_H1-L2的期望理论种类分布的偏离，其中轻链的区别在于标签(HA或FLAG)的存在或不存在。该偏离可能是标签依赖性表达水平而非标签依赖性配对的结果(例如，基于在不同WT H1∶L1∶L2比率上进行的实验，以及基于设计行为的间接观察)。同样地包括实验重复和/或差异在于标签身份的变体间的所有测量的种类的中位值。
[0396] 包含给定的设计的两个成功的Mab测定变体的LC/MS谱的实例(图11)见于图12中。在这些变体的情况下，大部分测量的种类与所需H1-L1_H1-L1种类相符。图13中报告的表达特征谱、UPLC-SEC(仅对H2-L2_H2-L2种类(在图中，表示为H2-L2)显示的)和DSC热谱图通常用于针对某些命中进行的变体的表征。在该特定情况下，这些数据显示良好表达的均质的种类，对Fab稳定性影响相对较小。
[0397] 表21中的结果显示对于在LCCA设计中是显著成功的，至Mab形式中的可转移性也得以实现。测试的12个LCCA设计中有11个展示等于或大于25％的理论正确配对种类。该数据表明，用作设计文库的初始筛选的LCCA形式适合用于评估和/或预测Mab形式的成功。
[0398] 实施例13：异二聚体在双特异性抗体形式中包含恒定结构域和/或可变结构域修饰的共表达组中的优先配对的评估
[0399] 评估异二聚体共表达组设计以确定它们是否也允许双特异性Mab抗体形式的优先配对。在本实施例中，对每个异二聚体的全长重链的Fc区域进行不对称修饰以促进独特重链的异二聚化(相较于同二聚化)。
[0400] 构建体的制备：
[0401] 在下列双特异性抗体的背景中测试异二聚体共表达组设计：a)D3H44/培妥珠单抗，b)D3H44/曲妥珠单抗，c)D3H44/雷莫芦单抗和d)曲妥珠单抗/雷莫芦单抗。除将互补Fc异二聚化突变引入共表达设计组的两条重链的每一条中外，如实施例12中所述，制备在恒定和/或可变结构域中包含氨基酸修饰的D3H44、培妥珠单抗和曲妥珠单抗重链和轻链。基于雷莫芦单抗重链和轻链的基本DNA序列制备雷莫芦单抗重链和轻链。参见表A。重链的CH3序列包括下列氨基酸修饰：
[0402] a)D3H44/培妥珠单抗：链A：T371V_T389L_K420L_T422W，链B：T371V_L372Y_F436A_Y438V
[0403] b)D3H44/曲妥珠单抗：链A：T371V_T389L_K420L_T422W，链B：T371V_L372Y_F436A_Y438V
[0404] c)D3H44/雷莫芦单抗：链A：T371V_T389L_K420L_T422W，链B：T371V_L372Y_F436A_Y438V
[0405] d)曲妥珠单抗/雷莫芦单抗：链A：T371V_T389L_K420L_T422W，链B：T371V_L372Y_F436A_Y438V
[0406] 测定形式(SMCA)
[0407] 如下文中所描述的，评估异二聚体共表达组设计优先配对以形成双特异性抗体的能力。所述测定基于共表达4条链(2条来自A1，两条来自Ab2)和使用质谱法(LC-MS)检测正确形成的双特异性抗体的存在。如下进行所述测定。图14提供了描绘4条起始多肽链和因在异源二聚体对的重链与轻链之间的优先配对不存在的情况下这些起始多肽链的共表达而产生的潜在产物的示意图。两个全长重链构建体与两个独特轻链构建体共表达，产生可能的抗体种类：H1-L1∶H1-L1、H1-L2∶H1-L2、H1-L1∶H1-L2、H2-L1∶H2-L1、H2-L2 ∶ H2-L2、H2-L1 ∶ H2-L2、H1-L1 ∶ H2-L1、H1-L2 ∶ H2-L2、H1-L2 ∶ H2-L1 和H1-L1∶H2-L2。较后的种类是正确配对的异二聚体(参见下图)。在蛋白A纯化后使用LC-MS测定相对轻链配对特异性(根据优选种类H1-L1∶H2-L2种类相对其它种类的量)。如果可能的话，不对链进行标记，只要所有Mab和半-Ab种类彼此相异至少50Da。当质量差异排除该可能性时，利用N末端HA标签融合构建轻链的至少一个，以在种类之间提供足够的质量区别。我们将包括双特异性抗体的表达和筛选步骤的该测定称为SMCA。
[0408] 转染方法
[0409] 如下将如实施例1中所述制备的包含2个重链和2个轻链构建体的共表达组转染6
进CHO-3E7细胞中。将CHO-3E7细胞以1.7-2×10个细胞/ml的密度于37℃培养在补充有4mM谷氨酰胺和0.1％Pluronic F-68(Invitrogen cat#24040-032)的FreeStyle(TM)F17培养基(Invitrogen cat#A-1383501)中。使用PEI-pro(Polyplus cat#115-010)，以
1∶2.5的DNA∶PEI比率用总共20ug DNA转染20ml的总体积。添加DNA-PEI混合物后
24小时，将细胞转移至32℃。在第7天，通过非还原SDS-PAGE分析，随后进行考马斯蓝染色(以显现条带)来测试上清液的表达。最初使使用的H1∶H2∶L1∶L2比率保持中性(15∶15∶35∶35)以评估表达效率。随后在CHO表达中测试一组H1∶H2∶L1∶L2DNA比率以评估当所有链都是野生型时，哪个条件产生的混合物反映不同种类的理论分布。这些比率补偿了两种不同抗体的表达水平上的天然差异和/或重链与轻链之间的固有配对偏爱。
进CHO-3E7细胞中。将CHO-3E7细胞以1.7-2×10个细胞/ml的密度于37℃培养在补充有4mM谷氨酰胺和0.1％Pluronic F-68(Invitrogen cat#24040-032)的FreeStyle(TM)F17培养基(Invitrogen cat#A-1383501)中。使用PEI-pro(Polyplus cat#115-010)，以
1∶2.5的DNA∶PEI比率用总共20ug DNA转染20ml的总体积。添加DNA-PEI混合物后
24小时，将细胞转移至32℃。在第7天，通过非还原SDS-PAGE分析，随后进行考马斯蓝染色(以显现条带)来测试上清液的表达。最初使使用的H1∶H2∶L1∶L2比率保持中性(15∶15∶35∶35)以评估表达效率。随后在CHO表达中测试一组H1∶H2∶L1∶L2DNA比率以评估当所有链都是野生型时，哪个条件产生的混合物反映不同种类的理论分布。这些比率补偿了两种不同抗体的表达水平上的天然差异和/或重链与轻链之间的固有配对偏爱。
[0410] SPR生物传感器测定
[0411] EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；sNHS：N-羟基硫代琥珀酰亚胺；SPR：表面等离子体共振；EDTA：乙二胺四乙酸；HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；TF：组织因子。
[0412] SPR设备。GLC传感器，Biorad ProteOn胺偶联试剂盒(EDC，sNHS和乙醇胺)和10mM醋酸钠缓冲液购自Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON)。重组Her-2蛋白购自eBioscience(San Diego，CA)。含0.05％Tween20(PBST)的PBS电泳缓冲液购自Teknoca Inc.(Hollister，CA)。山羊多克隆抗-人Fc抗体购自Jackson Immuno Research Laboratories Inc.(West Grove，PA)。
[0413] 使 用 BioRad ProteOn XPR36 仪 (Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))用PBST电泳缓冲液在25℃的温度下进行所有表面等离子体共振测定。使用通过在分析物(水平)方向上以100μL/分钟注射(持续140秒)的标准BioRad sNHS/EDC溶液的1∶5稀释物活化的GLM传感器芯片生成抗人Fc捕获表面。紧接活化之后，在配体(垂直)方向上以25μL/分钟的流速注射10μg/mL的抗人Fc抗体在10mM NaOAc pH
4.5中的溶液，直至约3000共振单位(RU)被固定。通过在分析物方向上以100μL/分钟注射1M乙醇胺140秒来淬灭剩余活性基团，这也确保模拟物活化的中间点被产生来用于空白参照。在如下两个步骤中进行抗体变体的对Her2或TF抗原靶的结合的筛选：在配体方向上将抗体变体间接捕获至抗人Fc表面上，随后在分析物方面上同时注射5个浓度的纯化的抗原和一个缓冲液空白以用于双参照。首先，将在配体方向上以100uL/分钟进行的一次缓冲液注射(持续30秒)用于稳定碱基线。对于每一个抗体变体捕获，将细胞培养基中的未纯化的变体于PBST中稀释至4％。在单个配体通道中以25μL/分钟的流速同时注射(持续240秒)1至5种变体或对照。这导致约400至600RU的至抗人Fc表面上的捕获。
如果需要，使第一配体通道留空以用作空白对照。在该捕获步骤之后，随即在分析物方向上进行两次缓冲液注射以稳定基线，随后以50μL/分钟同时注射(持续120秒)60nM、20nM、
6.7nM、2.2nM和0.74nM抗原(TF或Her2)连同缓冲液空白，进行300秒的解离期。通过18秒脉冲的0.85％磷酸(以100μL/分钟进行18秒)再生该捕获抗体表面，以准备下一个注射循环。将传感图进行比对，并使用缓冲液空白注射和中间点进行双参照，使用ProteOn Manager软件v3.1分析所得的传感图。将双参照的传感图与1∶1结合模型拟合。将每一个抗原的Rmax值针对每一个变体的抗原捕获水平进行标准化，并与100％对照相比较。
4.5中的溶液，直至约3000共振单位(RU)被固定。通过在分析物方向上以100μL/分钟注射1M乙醇胺140秒来淬灭剩余活性基团，这也确保模拟物活化的中间点被产生来用于空白参照。在如下两个步骤中进行抗体变体的对Her2或TF抗原靶的结合的筛选：在配体方向上将抗体变体间接捕获至抗人Fc表面上，随后在分析物方面上同时注射5个浓度的纯化的抗原和一个缓冲液空白以用于双参照。首先，将在配体方向上以100uL/分钟进行的一次缓冲液注射(持续30秒)用于稳定碱基线。对于每一个抗体变体捕获，将细胞培养基中的未纯化的变体于PBST中稀释至4％。在单个配体通道中以25μL/分钟的流速同时注射(持续240秒)1至5种变体或对照。这导致约400至600RU的至抗人Fc表面上的捕获。
如果需要，使第一配体通道留空以用作空白对照。在该捕获步骤之后，随即在分析物方向上进行两次缓冲液注射以稳定基线，随后以50μL/分钟同时注射(持续120秒)60nM、20nM、
6.7nM、2.2nM和0.74nM抗原(TF或Her2)连同缓冲液空白，进行300秒的解离期。通过18秒脉冲的0.85％磷酸(以100μL/分钟进行18秒)再生该捕获抗体表面，以准备下一个注射循环。将传感图进行比对，并使用缓冲液空白注射和中间点进行双参照，使用ProteOn Manager软件v3.1分析所得的传感图。将双参照的传感图与1∶1结合模型拟合。将每一个抗原的Rmax值针对每一个变体的抗原捕获水平进行标准化，并与100％对照相比较。
[0414] 如实施例5中所述，测试双特异性抗体的稳定性。使用实施例12中描述的方法进行双特异性抗体的LCMS分析。
[0415] 以SMCA形式测试许多选择的D3H44LCCA设计。此外，仅以SMCA形式直接评价一些设计。在D3H44/培妥珠单抗系统中测试大部分设计。在3个另外的双特异性Mab系统：D3H44/曲妥珠单抗、D3H44/雷莫芦单抗(RAMU)和曲妥珠单抗/雷莫芦单抗系统中进一步测试在该系统(包括多种设计)中选择的一个亚组的设计。
[0416] 在LCCA实验中针对D3H44/培妥珠单抗和D3H44/曲妥珠单抗观察到的固有跨系统轻链/重链优先性(实施例11)在全长抗体形式中同样地是可重现的。此类，对于另外两个系统也观察到类似行为，尽管存在不同的跨系统配对倾向性。
[0417] 通常不能基于LC/MS在实验上区分所需的双特异性种类H1-L1_H2-L2与错配类型：H1-L2_H2-L1。这样，当在表中报告双特异性含量时，不能完全排除其不含有该类型的错配种类。然而，对于种类诸如H1-L2_H1-L2和H2-L1_H2-L1以及H1-L2和H2-L1半抗体观察到的极低含量表明如果双特异性种类的污染发生，其仅是少量的。通过LC/MC测量的存在于特定样品中的所有其它种类包括在表中。在大多数情况下，MS峰伴随着侧峰；然而这些不能仅被注释为双特异性种类的。当标准化MS峰强度时，不考虑这些加合物种类。表中代表侧峰的数字通过与主双特异性峰的强度的强度比较来获得。一些初步分析表明侧峰与轻链标签的存在相关(牵涉加合物的形成或前导肽的切割的异质性)，并且其可能代表主峰种类。
[0418] 最后除了错配的种类以外，将所有配对的种类加起来，以获得配对：错配栏中报造的比率。这进一步用于按照实施例11中描述的数学方法计算ΔScalar(VAR-REF_WT)以显示特定设计的强度。在系统内，按降序将设计的标量指标值排序。
[0419] 由于实施例12中描述的轻链与重链的配对的跨系统天然优先性，因此H1∶L1∶H2∶L2的DNA比率需要改变(例如H1(D3H44)相对于H2(PERT)的过表达)以
产生最高含量的所需双特异性种类(H1-L1_H2-L2)。最佳比率因此也可随特定设计变化至一定程度。DNA比率主要影响双特异性种类：配对的半抗体种类(通常的一个类型：H1-L1或H2-L2的)实际比率。实例包括在表23中，其中DNA滴定随该比率变化，但配对的：错配的种类的总体比率相对恒定。
产生最高含量的所需双特异性种类(H1-L1_H2-L2)。最佳比率因此也可随特定设计变化至一定程度。DNA比率主要影响双特异性种类：配对的半抗体种类(通常的一个类型：H1-L1或H2-L2的)实际比率。实例包括在表23中，其中DNA滴定随该比率变化，但配对的：错配的种类的总体比率相对恒定。
[0420] 在D3H44/培妥珠单抗系统的情况下，对于大部分设计进行有限组的DNA滴定。关于导致最高配对的：错配的种类含量的比率的数据示于表22和24中。对于另外3个系统，仅在一个比率上进行转染，如表中报告的。如果在所述报告的比率上重复实验，平均值包括在表中。关于标签身份的信息未被包括，因为对于WT未观察到标签影响(表26)。这样选择提供的WT参照以代表在报告的设计数据间最常见的DNA比率。
[0421] 对在pH4以及pH7下贮存的样品进行LC/MS分析。在D3H44/曲妥珠单抗、D3H44/雷莫芦单抗(RAMU)和曲妥珠单抗/雷莫芦单抗系统的情况下测试对在pH7下贮存的样品的实验。因此数据示于2个表(表22(pH4)和24(pH7))中。对于两个实验之间的配对的：错配的种类比率观察到满意的相关性，这表明pH不可能在LC/MS实验中，即存在的种类的类型的表征中起着重大作用。
[0422] 图15提供了基于图11和图12中显示的以MCA形式存在的设计的靶向TF和Her2的双特异性构建体的LC/MS分析结果。观察到接近92％的具有强制重链与轻链的正确配对的优选双特异性抗体。图16提供了上清液中蛋白质产物(在蛋白A纯化后于SDS PAGE中)的表达特征谱和以及蛋白A纯化的化合物的SEC特征谱。图17提供了双特异性分子的双特异性靶结合特性，首先针对两个靶(单独地TF和Her2)，随后在夹心(桥连)模式中。
[0423] 在一些情况下，在有限组的变体中表征的H/S 115和H/S156上的突变不是实际设计的部分，相反地因实际原因被添加用以获得必需质量差异(为了LC/MS实验的目的)。这些氨基酸位于恒定结构域的表面上，充分远离实际设计组的突变并且预期不影响抗体的行为。
[0424] 在D3H4/培妥珠单抗系统中评估许多设计的热稳定性和抗原亲和力，并将其示于表25中。手工注释Tm值(以斜体字标示的)。同二聚体Mab对照(WT)展示在转染重复(在pH 7)中表达的产物：PERT(72.03-77.72)和D3H44(77.97-78.88)的下列稳定性范围的热解链(Tm)。对于培妥珠单抗观察到的更宽的范围可能归因于其固有性质。仅在pA纯化后进行亲和力测量。观察到的同二聚体Mab的KD范围是：TF：0.04-0.076nM，HER2：1.84-6.3nM。在大多数情况下，可预期两个解链转变归因于上文中指示的两个Fab的不同范围。在其中仅报告一个Tm的值的情况下，其因两个原因之一而潜在地升高：培妥珠单抗稳定性的变化和/或对D3H44 Fab的设计的去稳定化(可与培妥珠单抗Fab的去稳定化一致)。结果表明SMCA为体的选择可从最小地影响热稳定性以及抗原结合的变体变化至表现所述行为达到不同程度的变体。
[0425] 利用两种可能的Fc突变布局测试一些设计。这些可通过具有相同的唯一标识符来鉴定，并且标以*D3H44(或在表25中在唯一标识符设置前利用#)。如从表22可明显看出，除有限的例外外，Fc突变的布局似乎不影响配对的：错配的种类结果。
[0426] SMCA结果显示相当数目的代表多样性组的设计可克服Mab形式的天然跨种类配对倾向性。在这些设计当中，接近1/4的测试的设计落入高配对：错配比率(＞＝80∶20)的类别中(数目被提供用于更穷尽测试的系统，D3H44/帕妥珠单抗)。跨不同系统的设计效力的比率显示了不同程度的可转移性。此外，约60％的表27中所列的设计(从D3H44LCCA转移至SMCA形式中)在4个测试的SMCA系统的至少一个中导致高度的优先配对(＞75％∶25％)。
[0427] 对于在除D3H44/培妥珠单抗外的系统中测试的设计，同样地针对结合结构域倒转设计布局，例如D3H44结合结构域上的H1-L1设计，TRAS上的H2-L2设计以及TRAS上的H1-L1设计和D3H44上的H2-L2设计。结果表明在大多数情况下设计的效力可被这样的影响倒转布局影响。
[0428] 上文中论述的结果表明设计的可转移性可受与设计组分的驱动势能偶联的抗原结合结构域的组合影响(例如H1L1L2驱动可好于H2L2L1)。结果表明大量的基本核心设计工作覆盖一系列Mab对以形成具有大于75％的选择性配对的双特异性Ab。
[0429] 实施例14：Fab界面的分子建模和计算机指导的工程化
[0430] 我们使用结构和计算机分子建模指导的方法来产生重链和轻链突变设计的文库，可在其它抗体或其片段的背景中筛选所述文库以鉴定在目标抗体中展示所需特异性的突变。用于工程化优先HC-LC配对的设计策略包括首先鉴定一起工作的代表性Ab(即D3H44)。该Ab的关键标准示于表28中。
[0431] 表28：
[0432]
[0433]
[0434] 如表28中指示的，由该抗体提供的关键标准是其为人/人源化Ab，具有常用的VH和VL亚组以及最小构架区突变。此外，结构考虑是VH∶VL结构域间角应当接近对于Ab观察到的平均值。在选择Fab后，进行Fab界面的芯片分析，目的在于鉴定和理解重要残基。采用双管齐下的方法。首先，通过公共可获得的Ab的序列和结构比对进行跨Fab可变和恒定界面的序列保守性的全局分析。来自不同抗体亚组的恒定和可变结构域序列的比对示于TM
图6中。并行地，使用图18中所列的许多分子建模工具(例如ResidueContacts )分析晶体结构界面D3H44。这些分析导致一列用于工程化优先HC-LC配对的热点位置的鉴定。从该分析测定的热点位置列于表29中。
图6中。并行地，使用图18中所列的许多分子建模工具(例如ResidueContacts )分析晶体结构界面D3H44。这些分析导致一列用于工程化优先HC-LC配对的热点位置的鉴定。从该分析测定的热点位置列于表29中。
[0435] 表29：来源于人VH和VLκ链的典型的Fab中的重链(H)和轻链(L)的界面上的热点氨基酸位置。这些位置和氨基酸在VLλ链中也是最保守的。除少数位于DCR3环中外，这些氨基酸主要是构架残基。亲代D3H44序列中的氨基酸(利用Kabat编号)提供于表A1-A2中。
[0436]H(Kabat) L(Kabat)
V37 Y36
Q39 Q38
L45 P44
W47 L89
F100 F98
W103 F116
L124 F118
A139 V133
F174 L135
V37 Y36
Q39 Q38
L45 P44
W47 L89
F100 F98
W103 F116
L124 F118
A139 V133
F174 L135
[0437] 随后，模拟热点位置以及在3D晶体结构中与目标热点相邻的位置上的潜在突变TM和设计，通过计算机诱变以及包装/建模(利用Zymepack )鉴定其，基于许多因素包括空间和静电互补性对其进行评分。图11提供了有限数目的可变结构域中的重链与轻链界面上的热点位置，以及可如何在这些界面位置上引入突变以帮助强制链的选择性配对，同时不利于不正确链配对的形成。对空间互补性建模，并且还基于能量因子如范德瓦尔斯堆叠、空腔化效应和疏水性基团的紧密接触来计算所述互补性。类似地，对静电相互作用能量建模，基于电荷之间的库仑相互作用、氢键以及去溶剂化效应进行评价。模拟通过引入目标突变获得的优选重链与轻链配对模型诸如H1∶L1(或H2∶L2)和不正确配对诸如H1∶L2(和H2∶L1)，计算相对空间和静电评分。这允许我们确定特定突变组是否导致有利的能量，即优选(强制)重链-轻链对相对于不正确(非强制)对的更大的空间或静电互补性。计算的空间和静电能量是与轻链与重链配对相关的自由能的组成部分。因此更大的空间和静电互补性表示与强制对的配对相关的相对于非强制对的配对更大的自由能变化。更大的空间或静电互补性导致强制重链与轻链相对于非强制对的优先(选择性)配对，并且可根据共表达后两种产物(强制配对的对非强制配对的重链与轻链)的百分比来检测。强制对中更大的空间或静电互补性通常还可根据相对于非强制对的更好/更大的热稳定性来观察。列出候选设计的候选名单并对其进行评级。一开始使用LCCA系统体外测试设计。通过额外轮的芯片设计和体外筛选进一步改善展现非最适生物物理特征诸如差的HC-LC配对特异性、低热稳定性或减小的抗原结合亲和力的适度表现的设计。随后在双特异性Mab形式中测试最佳设计；体外筛选主要通过SMCA形式进行。
[0438] 实施例15：使用双特异性抗体突变设计组的文库产生由Mab1和Mab2衍生的双特异性抗体
[0439] 在一个实施方案中，此处提供目标在于选择性形成由两个经典抗体Mab1和Mab2衍生的双特异性抗体(分别由抗原结合片段Fab1和Fab2组成)的双特异性抗体突变设计组。设计组由分别对应于Fab1、Fab2和Fc的同源突变组成。在Fab1的轻链与重链的界面上引入突变以在Fab2的竞争性轻链和重链存在的情况下实现两个强制链之间的选择性配对。通过基于界面上的某些热点构架残基之间的空间、疏水性或静电互补性，在两条强制轻链和重链中引入有利的互补突变来实现选择性配对，同时包含这些突变的残基不利于非强制链对的界面相互作用。在每一个设计组中，还可在Fab2的轻链和抗体的界面上引入选择性配对突变，以在Fab1的竞争性轻链和重链存在的情况下实现这两个强制链之间的选择性配对。突变的目的在于减少来自Fab1的轻链与Fab2的重链的错配，反之亦然。在Fc界面上引入突变以实现重链的选择性配对，以形成包含两条不同重链的不对称抗体分子。
[0440] 在抗体的轻链和重链的某些界面残基位置上工程化通常可导致有害效应，诸如该抗体的抗原结合亲和力、稳定性、可溶性、聚集倾向的丢失。许多相关性质可被影响，诸如kon和koff率、解链温度(Tm)、对应激条件如酸、碱、氧化、冷冻/融解、搅拌、压力等的稳定性。这通常受目标抗体的互补决定区(CDR)影响。鉴于抗体的CDR通常不同，因此突变设计组的影响在所有抗体之间可以不同。在另一个实施方案中，定义了构成双特异性抗体突变设计组的文库的许多不同的双特异性突变设计组，所述突变设计组在界面上的不同热点位置上包含突变。这样的双特异性抗体突变组的文库示于表30中。此处提供了产生相对于含有不正确配对的抗体样结构(由任何两种可获得的抗体Mab1和Mab2衍生的)具有显著纯度的双特异性抗体的方法。在引入每一个突变设计组的同源突变后共表达Mab1和Mab2的轻链和重链，分析筛选表达的抗体产物以评估蛋白质产物中优选双特异性抗体相对于其它表达的Mab样种类的纯度。在一些实施方案中，分析筛选法可基于LC-MS技术。在一些实施方案中，分析筛选法可基于基于电荷的分离诸如毛细管等电聚焦(cIEF)技术。筛选技术的实例示于基于SMCA法的实施例13中。在一些实施方案中，双特异性抗体的显著纯度被定义为在表达的蛋白质产物中大于70％的所有获得的Mab样种类。在一些实施方案中，双特异性抗体的显著纯度被定义为在表达的蛋白质产物中大于90％的所有获得的Mab样种类。用于由Mab1和Mab2衍生的双特异性Mab设计组的制备和选择的方法示意性地示于图19中。
[0441] 本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入说明书中，其引用程度就如同每一个单一出版物、专利或专利申请被特别地和单独地指明通过引用并入本文。
[0442] 虽然已参考优选实施方案和各种替代实施方案具体地显示和描述了本发明，但相关领域普通技术人员应理解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下产生形式和内容的各种变化。
[0443] 本说明书的主体中引用的所有参考资料、颁布的专利和专利申请出于所有目的据此全文以引用方式并入。
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