技术领域
[0001] 本
发明涉及一种工程菌株、一种细菌胞外多糖及其制备方法，尤其涉及一种产胞外多糖的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，以及该胞外多糖的制备方法。
背景技术
[0002]
生物材料是用于人体组织和器官的诊断、修复或增进其功能的一类高科技材料，即用于取代、修复活组织的天然或人造材料，其作用药物不可替代。生物材料应用广泛，种类很多，其用途主要包括①承受或传递负载功能。如人造骨骼、关节和牙等；②控制血液或体液流动功能。如人工瓣膜、血管等；③电、光、声传导功能。如心脏起博器、
人工晶状体、
耳蜗等；④填充功能。如整容手术用填充体等。近年来用于人体的生物材料虽然各有优点，但也存在一定的缺点，需要不断研发更具优势的新材料来补充市场。就注射填充材料而言，近年来常用的几种注射填充材料有脂肪、透明质酸、
胶原蛋白、真皮微粒等。由于自体脂肪具有来源丰富，应用范围广泛，操作简单，无排斥反应，手感好，安全可靠，成活后保留持久，成本低，可重复多次注射，无瘫痕，可调整等优点而重新受到重视。但其吸收率高，吸收率个体差异大，甚至同一个体不同注射填充区域吸收率也不相同，且注射后表面形态不佳，易感染，有
液化、
钙化及形成脂肪瘤的可能等缺点，仍然阻碍着它的发展。透明质酸具有无免疫性、无排斥反应、适宜的pH值，可被降解和吸收等特点，在注射美容领域里成为科技含量高、应用安全的组织代用品，但其缺点是维持时间短，一般为6～12个月。而胶原蛋白注射后的吸收、重复注射的过敏反应和胶原
抗体形成与自身免疫性
疾病的关系是注射胶原的3个主要问题。目前，在生物医学领域有着广泛应用的聚乳酸虽然具有良好的
生物相容性、
生物可降解性、降解产物可被
机体吸收以及较好的
力学性能等优点，但是，聚乳酸结构中含有大量的酯键，对细胞的粘附性较弱，其降解过程中的酸性环境会导致无菌性
炎症反应。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种工艺简单、性能优越的医用生物材料的制备方法。
[0004] 本发明采用的技术方案：一种胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0005] 1、工程菌构建和
发酵：利用PCR构建了整合型和附加型表达载体，接着导入枯草芽孢杆菌构建了一株工程菌，然后接种于LB培养基进行发酵；
[0006] 2、胞外多糖粗提：将上述发酵液经过稀释，离心去沉淀，用
乙醇醇沉获得胞外多糖粗品；
[0007] 3、胞外多糖精制：将上述胞外多糖粗品经反复溶解醇沉后再用
透析袋透析处理后，
冷冻干燥获得胞外多糖精品；
[0008] 4、胞外多糖的PMP衍生化-HPLC分析
[0009] 称取胞外多糖精品10.0mg于安瓿瓶中，加入2mol/L三氟乙酸1mL，封口，100℃
水解8h，使用甲醇洗涤水解液4次去除三氟乙酸，再加2mL超纯水溶解完全水解产物。取上步完全水解后超纯水溶解的水解产物100μL，加入50μL的0.6mol/L NaOH，混合后加入100μL PMP甲醇溶液，混匀后放入烘箱，70℃反应100min，取出冷却后，加入100μL 0.3mol/L HCl，混匀后再加入750μL的超纯水，用1mL三氯甲烷萃取过量的PMP，静置后取水层再加入1mL氯仿萃取，重复三次，将水相用0.45μm微孔
膜过滤后供HPLC进样分析。
[0010] 色谱条件：色谱柱为RP-C18(4.6mm×250nm，5μm)，检测器为紫外检测器，检测
波长为250nm，柱温为30℃，流速为1mL/min，进样量为10μL。流动相为
磷酸盐-乙腈溶液，比例为84∶16。
[0011] 该胞外多糖的PMP-HPLC单糖组成分析图谱如图1所示。
[0012] 5、胞外多糖的HPAEC-PAD分析
[0013] 标准溶液的配制：分别精密称取各标准糖50.00mg，置于50mL容量瓶中，超纯水定容，配成1.00mg/mL储备液，准确移取各储备液1mL，超纯水定容至20mL，至终浓度为50.00μg/mL的各单糖标准溶液。淋洗液的配制：准确称取4.1015g CH3COONa，置于250mL容量瓶中，超纯水定容至终浓度为200mmol/L。准确吸取21mL 50％过饱和NaOH，置于2L容量瓶中，超纯水定容，至终浓度为200mmol/L。色谱条件：Carbo PACTM PA10(2.0mm×250mm)阴离子交换柱，Carbo PACTM PA10(2mm×50mm)保护柱，脉冲安培检测器。淋洗液条件：0～30min，13.5％200mmol NaOH，86.5％超纯水，30～60min，13.5％200mmol NaOH，75％200mmol CH3COONa，11.5％超纯水；流速：0.5mL/min；柱温：28℃；进样体积25μL。
[0014] 该胞外多糖的HPAEC-PAD图谱如图2所示。
[0015] 6、胞外多糖的SEC-HPLC分析
[0016] 液相条件：色谱柱为Shodex OHpak SB-806 HQ(8mm ID×300mm)，检测器为示差折光检测器，流动相为0.2mol/L NaCl，流速为0.5mL/min，进样量为20μL。
[0017] 分子量标准曲线绘制：取聚苯乙烯
硫酸酯钠盐(PSS))系列标准品，分子量分别为3.61×103，1.06×104，2.07×104，6.39×104，1.45×105，2.82×105，6.66×105，9.76×105，
2.26×106，5.64×106Da，分别用流动相配制成2mg/mL的标准溶液，分别取上述标准溶液进样，记录色谱图，使用GPC计算
软件绘制标准曲线。
[0018] 样品测定：取多糖样品加流动相溶解制成2mg/mL的样品溶液，0.45μm微孔膜过滤，进样后记录色谱图，使用GPC计算软件按照标准曲线计算出胞外多糖的相对分子量为Mn约为340万道尔顿，Mw约为450万道尔顿。
[0019] 该胞外多糖的SEC-HPLC图谱如图3所示。
[0020] 7、胞外多糖的UV图谱分析
[0021] 精密称取烘干至恒重的胞外多糖10.0mg置于10mL容量瓶，以蒸馏水溶解并定容至10mL得1mg/mL多糖溶液，于200～400nm区间进行扫描得到该多糖的紫外全波长扫描
光谱图。
[0022] 该胞外多糖溶液的紫外全波长扫描图谱如图4所示。
[0023] 8、胞外多糖的IR图谱分析
[0024] 仪器：BRUKER-MPA型红外光谱仪；方法：多糖样品和KBr以1∶100混合
研磨压片，样品约2.0mg，KBr约200mg，研磨取样；检测
波数：4000～500cm-1。在此条件下得到胞外多糖的IR图谱。
[0025] 该胞外多糖的IR图谱如图5所示。
[0027] 配制不同的胞外多糖溶液，采用安东帕MCR302旋转流变仪完成稳态剪切实验和动态
频率扫描实验，选用型号为CP50-1的锥板，锥板与平板间的间距为0.099mm，
扭矩变化1％，
剪切速率的变化范围为0.1-1000s-1，实验
温度控制在25℃。在考察温度对多糖溶液弹粘性影响实验中，设定温度的变化范围为25～80℃，每个时间点停留1min，剪切速率恒定为
50s-1，为防止溶液挥发，在夹具周围
覆盖硅油。实验结果表明，与天然多糖大分子及合成高分子相似，多糖溶液的表观
粘度具有很强的浓度依赖，且表现出了粘度随剪切速率增加而减小的剪切变稀即
假塑性流体行为。
[0028] 该胞外多糖水溶液的
表观粘度对剪切速率的变化关系如图6所示。
[0029] 7、胞外多糖的组织相容性分析
[0030] 组织相容性实验主要包括全身性毒性试验，即小鼠最大
给药量口服急性毒性试验、
皮肤刺激性试验和迟发性超敏反应试验，即豚鼠最大剂量试验。
[0031] 全身性毒性试验结果显示，样品在2.0g/kg的最大灌胃给药剂量下对小鼠毒性较小，提示该多糖安全性较高；皮肤刺激性试验结果显示阴性，试验期间胞外多糖样品溶液对家兔完整皮肤及破损皮肤均未见刺激性反应，提示该多糖无皮肤刺激性；迟发性超敏反应试验结果显示，与对照组相比，该胞外多糖样品豚鼠封闭贴敷试验未见过敏反应，迟发型超敏反应结果为阴性。最终组织相容性研究分析结果显示，该多糖具有良好的组织相容性。
[0032] 有益效果
[0033] 本发明利用基因工程技术构建了一株新的工程菌，经发酵分离纯化获得一种细菌胞外多糖，经组成成分分析及理化性质研究表明，该胞外多糖为全新结构多糖。其流体动力学研究分析显示，该多糖是一种假塑性流体；其组织相容性研究分析显示，该多糖具有良好的组织相容性。本发明内容为组织工程材料，如填充修复材料、
支架材料、载药支架材料、创伤
敷料的研发提供了一种潜在材料。
附图说明
[0034] 图1为胞外多糖的柱前衍生化PMP-HPLC图谱
[0035] 各峰分别为：Man-甘露糖，GlcA-
葡萄糖醛酸，Glc-葡萄糖，Gal-半乳糖，Fuc-岩藻糖
[0036] 图2为胞外多糖的HPAEC-PAD图谱
[0037] 各峰分别为：Fuc-岩藻糖，Gal-半乳糖，Glc-葡萄糖，Man-甘露糖，GlcA-葡萄糖醛酸
[0038] 图3为胞外多糖的SEC-HPLC图谱
[0039] 图4为胞外多糖溶液的紫外全波长扫描图谱
[0040] 图5为胞外多糖的IR图谱
[0041] 图6为25℃时5mg/ml，10mg/ml和20mg/ml胞外多糖水溶液的粘度对剪切速率的变化关系图
具体实施方式
[0042] 为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法、达成目的与功效易于明白了解，下面进一步阐述本发明。
[0043] 1、一种工程菌株(保藏号为CCTCC M 2016074，分类命名Bacillus subtilis，由中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国.武汉.武汉大学，电话：027-68754052)，其构建方法如下：利用PCR构建了整合型和附加型表达载体，接着导入枯草芽孢杆菌构建了一株工程菌。
[0044] 作为进一步的方案：构建方法具体包括以下步骤：
[0045] (1)根据PmHAS基因序列GenBank accession no.AF036004，利用低保真Taq酶进行PCR获得PmHAS编码基因，再用KpnI和BamHI限制性内切酶及pSG1729载体质粒构建整合型表达载体pSG1729-PmHAS；
[0046] (2)以Bacillus subtilis 168基因组DNA为模板，分别根据UDP-葡萄糖脱氢酶基因序列(GenBank accession no.AF015609)、乙酰转移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖胺焦磷
酸化酶基因序列(GenBank accession no.AL009126)，利用低保真Taq酶进行PCR得到tuaD基因和gcaD基因。利用BamHI和XbaI限制性内切酶依次将tuaD和gcaD基因连接到pHCMC05质粒上，获得表达载体pHCMC05-tuaD-gtaB；
[0047] (3)依次用pSG1729-PmHAS、pHCMC05-tuaD-gtaB转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168获得工程菌株。
[0048] 2、一种胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0049] (1)工程菌发酵：接种工程菌株至已配制好的LB液体培养基中，37℃恒温摇瓶培养48h。发酵1小时加入Xyl诱导剂，发酵3小时加入IPTG诱导剂；
[0050] (2)胞外多糖粗提：工程菌发酵液用纯化水等体积稀释，6000rpm离心20min，上清液用2倍体积醇沉，6000rpm离心20min，沉淀干燥，即得胞外多糖粗品；
[0051] (3)胞外多糖精制：粗品溶于0.5M NaCl溶液，2倍体积醇沉，6000rpm离心20min，重复3次，沉淀溶解后用30WM透析24h，
透析液冷冻干燥，即得胞外多糖精品；
[0052] 所述的胞外多糖的制备方法制备的胞外多糖，包括甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖及葡萄糖醛酸，胞外多糖的相对分子量为Mn约为340万道尔顿，Mw约为450万道尔顿。
[0053] 所述的胞外多糖的用途，可制成凝胶、交联微球中的任意一种形式药物组合物；药物组合物可作填充修复、组织工程支架材料、载药支架材料、创伤敷料中任意一种。
[0054] 通过以下实验例对本发明作进一步阐述：
[0055] 实验例
[0057] 配制不同的胞外多糖溶液，采用安东帕MCR302旋转流变仪完成稳态剪切实验和动态频率扫描实验，选用型号为CP50-1的锥板，锥板与平板间的间距为0.099mm，扭矩变化1％，剪切速率的变化范围为0.1-1000s-1，实验
温度控制在25℃。在考察温度多糖溶液弹粘性影响实验中，设定温度的变化范围为25～80℃，每个时间点停留1min，剪切速率恒定为
50s-1，为防止溶液挥发，在夹具周围覆盖硅油。实验结果表明，与天然多糖大分子及合成高分子相似，多糖溶液的表观粘度具有很强的浓度依赖，且表现出了粘度随剪切速率增加而减小的剪切变稀即假塑性流体行为。
[0058] 实验例2组织相容性分析
[0059] 组织相容性实验主要包括全身性毒性试验——小鼠最大给药量口服急性毒性试验、皮肤刺激性试验和迟发性超敏反应试验——豚鼠最大剂量试验
[0060] (1)全身性毒性试验：
[0061] 实验采用18～22g的ICR小白鼠。实验动物分为2组，每组20只，分别给予蒸馏水和受试物溶液，采用最大配药浓度(20mg/ml)×最大给药体积(0.5ml/10g)给药(本试验中最大给药剂量为2.0g/kg)，上午、下午各灌胃给药1次，观察14天，记录小鼠各种中毒症状及死亡情况，死亡动物进行尸检。结果显示，本发明的胞外多糖样品14天观察期内未见明显的毒性症状，亦无动物死亡，受试物组小鼠体重变化与对照组相当。由此可见，该多糖样品在2.0g/kg的最大灌胃给药剂量下对小鼠毒性较小，提示本品安全性较高。
[0062] (2)皮肤刺激性试验：
[0063] 实验采用2.0～2.5kg的白色家兔。
[0064] 完整皮肤刺激性试验采用同体左右侧自身对比法。取白兔4只，试验前24小时背部2侧进行脱毛处理(剃毛)，不损伤脱毛区皮肤。去毛范围左、右各3×3cm。取受试物(最大浓度)0.5ml直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用二层纱布(2.5×2.5cm)和一层塑料
薄膜覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋形剂作对照。每天贴敷时间4小时，连续贴敷7天。贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性
溶剂清洁受试部位。在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应，按评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。在每次去除受试物后1小时以及再次贴敷前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除受试物后30-60分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。
[0065] 破损皮肤刺激性试验采用同体左右侧自身对比法。取白兔4只，试验前24小时背部2侧进行脱毛处理(剃毛)，范围左、右各3cm×3cm，用
注射器针头在两侧脱毛区划“井”字并以渗血为度。观察指标和评价标准同完整皮肤刺激性试验部分。
[0066] 结果显示，试验期间本发明的胞外多糖溶液样品对家兔完整皮肤及破损皮肤均未见刺激性反应，实验结果为阴性。
[0067] (3)迟发性超敏反应试验：
[0068] 实验采用250～300g的健康成年白化豚鼠。实验豚鼠共30只分为2组，分别为对照组(蒸馏水，10只)和多糖组(20mg/ml，20只)。试验方法参考《GBT16886.10-2005医疗器械生物学评价第10部分刺激与迟发型超敏反应试验》中“7.5项”所述进行。结果显示，与对照组相比，本发明的胞外多糖样品豚鼠封闭贴敷试验未见过敏反应，迟发型超敏反应结果为阴性。
[0069] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。上述
实施例和
说明书中描述的只是说明本发明的原理，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进也应视为本发明的保护范围内。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明精神和范围的前提下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更改、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
