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切向流过滤设备和白细胞富集方法

阅读：413发布：2020-05-11

专利汇可以提供切向流过滤设备和白细胞富集方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了切向流过滤设备，以及通过去除非白细胞血液成分富集白细胞血液成分非均匀混合物的方法。在特定的实施方案中，本设备可以提供富集单核细胞的组合物。一个实施方案包括一个具有交叉流室(3)的去除器单元(1)，该室被微孔性过滤器 (5)与滤过物室(4)分隔开来，去除单元还有一个切向流入口(6)、一个富集白细胞的流体的流体出口(7)和一个滤过物出口(8)。，下面是切向流过滤设备和白细胞富集方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于制备富集白细胞的细胞群的切向流过滤设备，包括：
具有交叉流室、滤过物室以及置于其间的过滤器的去除器单元，过滤器与交叉流室和滤过物室流体交流；
交叉流室为圆柱形，并具有一个入口和一个出口，安置入口来引导包括白细胞的血液成分样品进入交叉流室并且平行于过滤器表面；出口位于过滤器中央对面，并与过滤器表面垂直；
过滤器具有为1至10微米范围的平均孔径；以使通过过滤器的样品流针对白细胞富集血液成分样品。
2.根据权利要求1的设备，另外包括：
对交叉流室入口提供预设输入速率的样品的装置；
控制流过物通过过滤器进入滤过物室的过滤速率的装置；并且
其中过滤速率控制装置限制过滤速率低于过滤器非对抗过滤速率。
3.根据权利要求1或权利要求2的设备，其中过滤器孔径为3微米至7微米。
4.根据权利要求1或权利要求2的设备，其中过滤器孔径为3微米至5.5微米。
5.根据权利要求1或权利要求2的设备，另外包括：
与交叉流室入口流体交流的血液成分来源。
6.根据权利要求5的设备，其中血液成分来源为白细胞去除术设备。
7.根据权利要求或权利要求2的设备，另外包括：
包括入口和出口的回收单元，交叉流室和回收单元相互连接成环形，其中交叉流室入口与回收单元出口流体交流，交叉流室出口与回收单元入口流体交流。
8.根据权利要求7的设备，其中回收单元另外包括样品入口和洗涤入口。
9.根据权利要求8的设备，另外包括与洗涤入口流体交流的置换液来源。
10.根据权利要求9的设备，其中置换液为等渗缓冲液或组织培养基。
11.根据权利要求1或权利要求2的设备，另外包括与去除器单元流体交流的细胞处理设备。
12.根据权利要求11的设备，其中细胞处理设备包括珠子。
13.根据权利要求11的设备，其中细胞处理设备包括富集白细胞的细胞群的培养装置。
14.根据权利要求13的设备，其中培养装置包括：
具有第一端口和第二端口的容器；
单核树突细胞前体粘附基质，该基质与该第一端口和该第二端口流体交流；
将基质保持在容器中的滤膜，该滤膜具有足够允许单核树突细胞前体和树突细胞通过的孔径；
与第一端口流体交流的排放管道；
与第一端口流体交流的收集管道
15.根据权利要求14的设备，另外包括与第一端口或第二端口流体交流的多个流体来源。
16.根据权利要求14的设备，另外包括适于无菌接受单核细胞前体的可封闭的组织培养容器。
17.根据权利要求16的设备，其中可封闭的组织培养容器为组织培养袋、瓶或生物反应器。
18.根据权利要求14的设备，其中流体来源包括结合介质、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。
19.根据权利要求14的设备，另外包括与多个流体来源和第一端口流体交流的泵。
20.根据权利要求14的设备，另外包括：
将基质保持在预设温度的温度控制装置。
21.根据权利要求20的设备，其中的温度控制装置为加热器。
22.用于针对白细胞富集血液成分样品的切向流设备，包括：
包括被过滤器(5)分隔的圆柱形交叉流室(3)和滤过物室(4)的去除器单元，其中交叉流室(3)具有入口(6)和出口(7)，该出口位于过滤器中央对面，并与过滤器表面垂直，并且其中入口置于过滤器上方，以引导流体与过滤器基本平行的进入交叉流室；
提供预设输入速率(14)的样品通过交叉流室入口的装置；
以及降低通过过滤器的过滤速率(15)的装置；
其中的过滤器具有3微米至7微米的孔径；以及
样品由此在交叉流室内保留物中富集白细胞。
23.针对白细胞富集血液成分样品的切向流设备，包括：
包括被过滤器(5)分隔的圆柱形交叉流室(3)和滤过物室(4)的去除器单元，该交叉流室具有入口(6)和出口(7)，该出口位于过滤器中央对面，并与过滤器表面垂直，并且其中该过滤器置于交叉流室入口下方并与其基本平行；
提供预设输入速率(14)的样品通过交叉流室入口的装置；
提供预设过滤速率(15)的流体通过过滤器的装置，其中的预设过滤速率为预设输入速率的五分之一至百分之一；
7
以及提供样品中预设浓度的血细胞的装置，其中的血细胞预设浓度为每毫升10 至
10
10 个细胞；
其中过滤器具有孔径为3微米至7微米的孔；以及
样品由此在交叉流室内保留物中富集白细胞。
24.从来自受试者的包含白细胞的血液成分样品中分离白细胞的方法，该方法包括：
(1)引导样品经权利要求1-23任一项所述设备的去除器单元入口进入该去除器单元；
(2)将样品进行基本平行过滤器的交叉流处理，过滤器孔径为1至10微米；
(3)将流体通过过滤器过滤；以及
(4)从样品中选择性去除非白细胞血液成分，形成富集白细胞的细胞群。
25.根据权利要求24的方法，另外包括通过白细胞去除术、密度离心、差异裂解、过滤或制备棕黄层从受试者制备样品，引导入去除器单元。
26.根据权利要求24的方法，其中非白细胞血液成分包括血浆和血小板。
27.根据权利要求24的方法，其中非白细胞血液成分包括红细胞。
28.根据权利要求24的方法，其中白细胞包括单核细胞。
29.根据权利要求24的方法，另外包括重复步骤(1)、(2)和(3)至少两次，以形成富集白细胞的细胞群。
30.根据权利要求24的方法，其中富集的细胞群包括至少20％的白细胞。
31.根据权利要求24的方法，其中富集的细胞群包括至少60％的白细胞。
32.根据权利要求24的方法，另外包括引起交叉流室中样品的漩涡运动。
33.根据权利要求24的方法，另外包括使用洗涤溶液洗涤富集白细胞的细胞群。
34.根据权利要求24的方法，另外包括从富集白细胞的细胞群中制备单核树突细胞前体。
35.根据权利要求34的方法，其中单核树突细胞前体的分离包括：
将单核树突细胞前体粘附基质与富集白细胞的细胞群接触；
允许细胞群中的单核树突细胞前体可逆地粘附到基质上，形成包括单核树突细胞前体和基质的复合物；
将复合物与非粘附白细胞分离，获得包括单核树突细胞前体的复合物；以及培养该单核树突细胞前体使之分化形成未成熟或成熟树突细胞。
36.根据权利要求35的方法，其中单核树突细胞前体在培养前从基质上洗脱。
37.根据权利要求35的方法，其中单核树突细胞前体在基质上被培养。
38.根据权利要求35的方法，其中基质包括玻璃、聚苯乙烯、塑料或玻璃包被的聚苯乙烯微珠。
39.针对白细胞富集血液成分样品的方法，包括：
(1)引导样品进入权利要求1-23任一项所述设备的切向流过滤单元；
(2)将该样品以预设输入速率和预设过滤速率通过切向流过滤单元再循环，该预设输入速率至少是预设过滤速率的五倍；其中的预设过滤速率低于过滤器的非对抗过滤速率；
以及
(3)分离富集白细胞的细胞群
40.根据权利要求39的方法，其中富集的细胞群基本不合非白细胞血液成分。
41.根据权利要求39的方法，另外包括：
从受试者采集血液，并使用白细胞去除术、密度离心、差异裂解、过滤或制备棕黄层来制备样品。
42.根据权利要求39的方法，其中非白细胞血液成分包括血浆和血小板。
43.根据权利要求40的方法，其中非白细胞血液成分包括红细胞。
44.根据权利要求39的方法，其中白细胞包括单核细胞。
45.根据权利要求39的方法，其中富集的细胞群包括至少20％的白细胞。
46.根据权利要求39的方法，其中富集的细胞群包括至少60％的白细胞。
47.根据权利要求39的方法，其中样品在交叉流室中以涡旋运动流动。
48.根据权利要求39的方法，另外包括使用洗涤溶液洗涤富集的细胞群。
49.根据权利要求39的方法，另外包括从富集的细胞群中制备树突细胞。
50.根据权利要求49的方法，其中树突细胞的制备通过：
将单核树突细胞前体粘附基质与富集的细胞群接触；
允许富集细胞群中的单核树突细胞前体可逆地粘附到基质上，形成包括单核树突细胞祖细胞和基质的复合物；
将复合物与非粘附白细胞分离，获得包括单核树突细胞前体的复合物；以及培养该单核树突细胞前体使之分化形成未成熟或成熟树突细胞。
51.根据权利要求50的方法，其中基质包括玻璃、聚苯乙烯、塑料或玻璃包被的聚苯乙烯微珠。
52.根据权利要求50的方法，另外包括分离未成熟或成熟树突细胞。
53.根据权利要求44的方法，其中使用促进单核细胞分化成为树突细胞的细胞因子培养单核细胞。
54.根据权利要求53的方法，其中细胞因子为GM-CSF、GM-CSF和IL-4。
55.根据权利要求53的方法，其中树突细胞被成熟为成熟树突细胞。
56.根据权利要求53的方法，其中在有益于加工抗原、形成负荷抗原的树突细胞的条件下，使用抗原培养树突细胞。
57.根据权利要求56的方法，另外包括将负荷抗原的树突细胞给予个体的步骤。
58.根据权利要求56的方法，其中负荷抗原的树突细胞使用成熟试剂培养使细胞成熟为成熟抗原呈递树突细胞。
59.根据权利要求39的方法，其中过滤器具有3至5.5微米的孔径。
+
60.根据权利要求59的方法，其中白细胞包括CD34 细胞。
61.根据权利要求60的方法，其中血液成分样品来自经至少一种干细胞动员剂处理的供体。
62.根据权利要求61的方法，其中干细胞动员剂为G-CSF或环磷酰胺。
+
63.根据权利要求60的方法，另外包括针对CD34 细胞富集白细胞。
+
64.根据权利要求63的方法，其中针对CD34 细胞富集白细胞包括使用缀合于磁珠的+
抗-CD34 抗体。
+
65.根据权利要求60的方法，另外包括离体扩增CD34 细胞。
66.根据权利要求59的方法，另外包括从富集白细胞的细胞群中制备单核细胞衍生的多能干细胞。
67.根据权利要求59的方法，另外包括诱导祖细胞或干细胞的分化。
68.根据权利要求59的方法，另外包括诱导分化细胞的转分化。

说明书全文

切向流过滤设备和白细胞富集方法

[0001] 有关申请

[0002] 本申请要求美国临时专利申请序列号60/390,730的优先权，该申请于2002年6月19日提出，此处引用全文作为参考。

[0003] 发明背景

[0004] 在研究和治疗当中经常需要使用富集了白细胞的血细胞群。白细胞的一般来源包括全部外周血、白细胞去除术或单采血液成分术产物，或者是其他较少见的来源，例如脐带血。白细胞的富集可以通过几条途径完成。一般方法包括密度等级梯度(比如硅胶等等)、洗脱、离心、通过低渗冲击裂解红细胞以及这些方法的各种组合。这些方法每个都具有缺点，其中之一就是富集步骤之后需要进行费力的洗涤过程。

[0005] 细胞一般在富集后经过重复的步骤洗涤。这些步骤通常包括将富集的细胞悬液置于离心管中，使用离心机将细胞沉淀到管底。将管从离心机取出，将上清从细胞沉淀轻轻移走。将洗涤液加入管中，重悬细胞沉淀。这些步骤一般重复2～4次。

[0006] 这个洗涤过程的一个缺点是后续的重悬和离心会降低细胞活力并增加细胞裂解。通过离心洗涤的另一个缺点是细菌或其他感染剂污染细胞的机会。即使所有材料都保持无菌，重复的打开离心管、洗涤液瓶和移液管暴露于空气中，也会导致污染。对于一些医疗管理机构，污染的风险足够显著到要求在细胞处理过程中仅仅使用“封闭”系统。

[0007] 还使用过滤方法从血液中去除白细胞而保留其他血液成分供以后使用。这些方法通常将白细胞以不可回收的形式捕获于过滤器上，但是允许其他血液成分通过过滤器并且进入收集容器中。例如，可以使用过滤器从血液中去除白细胞，从而将输血后的同种免疫反应发生率降至最低。去除一般使用由缠结的塑料纤维网制成的过滤器完成。此网经常用来将白细胞捕获于具有足够深度的网状矩阵中，使得细胞在遍及过滤器的深度被捕获，从而防止过滤器被堵塞，这是将白细胞捕获于一个平坦表面时可能发生的。

[0008] 除了物理捕获细胞之外，过滤器的材料和巨大的表面积也允许白细胞不可逆的粘附于其表面。这些粘附的细胞当中有许多正是一些医疗程序所需求的。由捕获和粘附到过滤器得到的组合产生了一种高效的去除白细胞的方法，用于在输血治疗之前的处理。然而，当白细胞是需要的细胞时，这种方法并不有利。

[0009] 对多种粒子分级曾有用的一种方法是切向流过滤(tangentialflow filtration)(TFF)或“交叉流”(cross-flow)过滤。TFF依赖于流体平行于多孔透水膜过滤器表面的移动。膜孔允许流体和流体中比孔小的粒子通过。另外，平行于过滤器的流体的交叉流(或“切向”流)防止了比孔大的粒子在过滤器表面的阻塞。

[0010] TFF曾用于多种材料的粗分离。对切向流过滤在药学领域的应用由Genovesi综述(J.Parenter.Aci.Technol.，37：81，1983)，包括注射用消毒水的过滤、溶剂系统的净化和酶从肉汤和细菌培养基的过滤。Marinaccio等人(WO 85/03011)报告了用于从血液中去除微粒血成分的血浆去除法方法，Robinson等人(美国专利5,423,738)描述了TFF在从血液去除血浆中的用途，从而允许血细胞和血小板回输到病人体内。

[0011] 在另一个用途中，TFF被报告用于啤酒过滤(EP 0 208 450)，特别是去除例如酵母细胞和其他悬浮固体的微粒。Kothe等人(美国专利4,644,056)公布了TFF在从乳汁或初乳中纯化免疫球蛋白中的用途，Castino(美国专利4,420,398)描述了TFF在从含有抗病毒物质和病毒颗粒、细胞的肉汤中分离抗病毒物质(例如干扰素)中的应用。类似的，TFF还曾用于从细胞碎片中分离细菌酶(Quirk等人，EnzymeMicrob.Technol.，6：201，1984)。另外，切向流过滤单元还在浓缩悬浮于培养基中的细胞中得到使用。(见：例如Radlett，J.Appl.Chem.Biotechnol.，22：495，1972.)

[0012] 最近还报告TFF用于根据大小来分离脂质体和脂质颗粒(Lenk等人，美国专利5,948,441)。TFF允许脂质体和脂质颗粒的形成和分离，两者在这些粒子的异源群体中具有确定的大小范围(如前，见Lenk等人)。

[0013] 但是，尽管TFF曾被用于生物液体粗分级和诸如脂质体的分离，但本领域还没有认识到TFF在分离具有确定特征的不同活细胞群中的用途。尤其是在保持无菌、细胞活力、+造血分化潜能和免疫治疗细胞活性的情况下，选择性的将白细胞群(例如单核细胞、CD34造血干细胞和祖细胞、树突状祖细胞等等)与其他血细胞分离的相关联的独特问题没有被解决。另外，现有方法还未解决其它细胞群如具有重叠大小范围的细胞群的去除。

[0014] 因此，该领域仍需要另外的设备和方法用于在保持无菌、细胞活力、分化潜能和免疫治疗细胞活性的同时，从包括血浆、红细胞和/或血小板在内的其他血液成分当中选择性富集白细胞。发明概要

[0015] 本发明涉及白细胞从血液的分离和血液制剂。特别是通过使用切向流过滤设备制备富集白细胞的细胞群。提供了使用该设备制备富集的白细胞群和富集的单核细胞群、+CD34 造血干细胞和前体细胞群等等的方法。使用本发明设备和方法获得的富集白细胞和/或单核细胞等细胞群可以用来制备给予个人来诱导免疫应答的抗体呈递细胞(例如抗体呈递树突细胞)的组合物，制备诱导上皮细胞、神经元细胞、内皮细胞或肝细胞形成的多能干细胞(例如f-巨噬细胞(f-MΦ))组合物，制备包括富集的造血干细胞或前体细胞等的组合物。

[0016] 本发明的切向流过滤设备包括去除器(remover)单元，其具有交叉流室、滤过物室和置于两者之间的过滤器。过滤器的一侧，即保留物表面，与交叉流室流体交流，另一面，即滤过物表面，与滤过物室流体交流。交叉流室有一个入口，适合将含有白细胞的血液成分样品引入交叉流室，并与过滤器保留物表面平行。交叉流室中还提供一个出口，居中置于室中与过滤器保留物表面相对的部分。适于应用于切向流过滤设备中的过滤器一般具有约1至约10微米的平均孔径。在某些实施方案中，过滤器具有约3至约7微米，或者约3至约5.5微米的平均孔径。

[0017] 另外，该设备可以包括用于提供预设输入速率的样品进入交叉流室入口的装置，以及控制滤过物通过过滤器、进入滤过物室的过滤速率的装置。过滤速率控制装置限制过滤速率使其低于过滤器的非对抗过滤速率(unopposed filtration rate)。包括血液成分的样品可以由来源设备例如白细胞去除术设备，或含有从诸如从白细胞去除术设备收集的样品的容器等提供。

[0018] 此外，切向流过滤设备可以包括回收单元。回收单元包括一个出口和一个入口，可与去除器单元的交叉流室相互连接为环状。在本设备的这个实施方案中，交叉流室入口与回收单元出口流体交流，交叉流室出口与回收单元入口流体交流。此外回收单元可以还包括样品入口和洗涤液入口。在某些切向流过滤设备的实施方案中，样品入口和洗涤液入口是单一的共用入口。一般，洗涤液入口与置换液或洗涤液来源流体交流。置换液或洗涤液可以是，例如，等渗缓冲液或组织培养基。

[0019] 回收单元样品入口与血液成分来源流体交流。在本发明的一个实施方案中，血液成分来源是细胞处理设备。细胞处理设备可以是白细胞去除术设备或是能够产生部分富集了白细胞的细胞群的设备。在一个实施例中，细胞处理设备包括具有第一端口(port)和第二端口的容器、与第一端口和第二端口流体交流的单核树突细胞前体粘附基质、将基质保持在容器中并且具有足以允许单核树突细胞前体和树突细胞通过的滤膜(screen)。该设备此外包含与第一或第二端口流体交流的排放管道，以及与第一或第二端口流体交流的收集管道，其也与切向流过滤设备回收单元样品入口流体交流。

[0020] 细胞处理设备也可以包括多个提供结合介质、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的流体来源。该设备可另外包括将多种流体转运到细胞处理设备内外的泵。也提供了温度控制装置，例如加热或冷却装置。本发明的一个提供闭合系统的实施方案中，血液样品或血产品制剂被提供给细胞处理设备，细胞处理设备包括能粘附单核树突细胞前体的珠子材料。血液样品可以和珠子材料接触足够长的时间来粘附单核树突细胞前体，设备中其他细胞成分通过排放管线被洗涤掉。将洗脱缓冲液加入细胞处理设备，单核树突细胞前体无菌通过收集管线进入回收单元的样品入口，用于进一步富集血液样品中的单核细胞。

[0021] 在本发明的一个实施方案中，提供针对白细胞对血液成分样品富集的切向流过滤设备，该设备包括含有被过滤器分隔的交叉流室和滤过物室的去除器单元，其中交叉流室具有出口和入口，出口居中置于室上部，其中入口置于过滤器上方，引导流体基本平行于过滤器进入交叉流室；提供预设输入速率的样品通过交叉流室入口装置；以及降低通过过滤器的过滤速率的装置；其中过滤器具有约3至约7微米的孔径，样品由此在交叉流室中的保留物中富集了白细胞。此外，在另一个特定的实施方案中，过滤器具有大约3至约5.5微米+的孔径来富集CD34 白细胞的细胞群。

[0022] 本发明另一个实施方案中，提供用于针对单核细胞对血液成分样品富集的切向流过滤设备，该设备包括含有位于过滤室下方并被过滤器分隔的交叉流室，其中交叉流室具有出口和入口，出口居中置于室的较下部分，其中入口置于过滤器下方，引导流体基本平行于过滤器进入交叉流室；用于提供预设输入速率的样品通过交叉流室入口的装置；保持通过过滤器过滤速率的装置；其中过滤器具有约为3至约7微米的孔径；样品由此在交叉流室中的保留物中富集了白细胞。此外，在另一个特定的实施方案中，过滤器具有约为3至约+5.5微米的孔径，来富集CD34 白细胞的细胞群。

[0023] 在本发明另一个实施方案中，提供用来富集包括血液成分的样品的切向流过滤设备，该设备包括具有被过滤器(5)分隔的交叉流室(3)和滤过物室(4)的去除器单元(1)，交叉流室有入口(6)和出口(7)，出口在入口上方，居中置于室的上部，其中过滤器置于交叉流室入口下方并与其基本平行。该装置此外包括用于提供预设输入速率的样品通过交叉流室入口的装置；用于提供流体通过过滤器的预设过滤速率的装置，其中预设过滤速率约为预设输入速率的五分之一到百分之一；以及用于提供样品中预设浓度的血细胞的装置，7 10
其中血细胞预设浓度一般约为每毫升10 至10 个细胞。一般，过滤器具有约3至约7微米的孔径。此外，在另一个特定的实施方案中，过滤器具有约3至约5.5微米的孔径来富集+
CD34 白细胞的细胞群。

[0024] 本发明还提供从包含白细胞的血液成分样品中分离白细胞的方法。这些方法中，提供步骤包括：(1)引导样品通过去除器单元入口进入去除器单元；(2)使样品基本平行于过滤器进入交叉流室，过滤器具有约1至约10微米的孔径；(3)使流体通过过滤器进行过滤；以及(4)从样品中选择性去除非白细胞血液成分，形成富集了白细胞的细胞群。通过白细胞去除术、密度离心、差异裂解(differentiallysis)、过滤或制备棕黄层，样品能得到部分纯化或富集，用于引导入去除器单元。在一个实施方案中，诱使样品在交叉流室中以漩涡运动流动。另外，富集白细胞的细胞群能够使用洗涤液洗涤。

[0025] 在本发明方法中，从样品中去除的非白细胞血液成分包括血浆、血小板、红细胞等。由本发明方法得到的产物中的白细胞可以包括基本富集的单核细胞群。富集的细胞群可包括至少约20％的白细胞，但是一般包括至少60％或更多的白细胞。在本发明方法的一个实施方案中，步骤(1)、(2)和(3)重复至少两次，来形成富集白细胞的细胞群。富集了白细胞的细胞群可以进一步用来制备单核树突细胞前体。在一个实施方案中，富集的细胞群可以通过一种方法产生，该方法包括将单核树突细胞前体粘附基质与富集了白细胞的细胞群接触；允许细胞群中的单核树突细胞前体可逆的粘附到基质上，形成包括单核树突细胞前体和基质的复合物；将复合物与非粘附白细胞分离，得到包括单核树突细胞前体的复合物；培养单核树突细胞前体，分化该前体形成不成熟或成熟树突细胞。在一个特定的实施方案中，单核树突细胞前体在培养前从基质上洗脱。粘附单核树突细胞前体的基质可以包括玻璃、聚苯乙烯、塑料或玻璃包被的聚苯乙烯微珠。

[0026] 还是在本发明另一个实施方案中，提供富集血液成分的样品中白细胞的方法，该方法包括(1)引导样品进入切向流过滤(TFF)单元，TFF单元包括交叉流室、滤过物室以及与交叉流室和滤过物室的流体交流的过滤器，过滤器具有约1至10微米的孔径；(2)以预设的输入速率和预设过滤速率再循环样品通过TFF单元，预设输入速率至少是预设过滤速率的五倍；其中预设过滤速率要低于过滤器的非对抗速率；以及(3)分离富集了白细胞的细胞群。该方法能得到基本无非白细胞成分的富集细胞群，其中非白细胞成分包括血浆、血小板和红细胞。由此方法产生的富集细胞群可以包括至少约20％的白细胞，一般至少约60％或更多白细胞。该方法可另外包括从受试者收集血液，以及使用白细胞去除术、密度离心、差异裂解、过滤或制备棕黄层从血液中制备样品。

[0027] 一旦细胞群富集了白细胞，该方法可以另外包括制备可以从白细胞诱导的特定细+胞型，例如树突细胞前体、CD34 造血干细胞或多能干细胞(如f-巨噬细胞)等。在一个特定实施方案中，树突细胞可以从富集的细胞群制备。在此方法中如下制备树突细胞：将单核树突细胞前体粘附基质与富集的细胞群接触；让富集细胞群中树突细胞前体可逆的与基质粘附，形成包含单核树突细胞前体和基质的复合物；将复合物与非粘附白细胞分离，得到包括单核树突细胞前体的复合物；培养单核树突细胞前体，分化该前体形成不成熟或成熟树突细胞。基质可以包括玻璃、聚苯乙烯、塑料或玻璃包被的聚苯乙烯微珠。另外，单核树突细胞前体可以使用促进单核细胞分化为树突细胞的细胞因子培养。在一个特定的实施方案中，细胞因子为GM-CSF和IL-4。此外，树突细胞可以成熟为成熟树突细胞。

[0028] 一旦树突细胞前体被分离，树突细胞可以在有益于抗原加工的条件下使用抗原培养，来形成负荷抗原的树突细胞(antigen loadeddendritic cells)。然后该抗原负荷树突细胞可以给予个体，或者将负荷抗原的树突细胞与T细胞在体外或离体培养，诱导抗原特异性的细胞毒T细胞形成。细胞毒T细胞可以给予需要诱导抗原特异性免疫应答的个体，例如癌症和细菌或病毒感染治疗。

[0029] 可以产生富集造血干细胞的细胞群。在一个实施方案中，可以提供个体干细胞动员剂，例如G-CSF、GM-CSF、AMD3100(或其他抑制CXCR-4功能的试剂)，或者高剂量或低剂+量环磷酰胺等等。干细胞动员剂诱导释放到外周血流中的CD34 干细胞增殖。来自个体的白细胞去除术样品被导入切向流过滤(TFF)单元，TFF单元包括交叉流室、滤过物室和与交叉流室和滤过物室流体交流的过滤器，过滤器具有约3至5.5微米的孔径；(2)以预设输入速率和预设过滤速率再循环样品通过TFF单元，其中预设输入速率至少是预设过滤速率的+
五倍；预设过滤速率要低于过滤器的非对抗速率；以及(3)分离富集CD34 白细胞的细胞群。该方法能得到基本无非白细胞成分的富集细胞群，其中非白细胞成分包括血浆、血小板+
和红细胞。由此方法产生的富集细胞群可以使CD34 细胞百分率增加2至5倍，从白细胞去除术材料的1％至大约5％，到富集细胞群细胞的约10至40％。

[0030] 此外，按照前面描述分离的单核细胞可以在非贴壁细胞培养容器(例如Teflon培养袋)中，使用含有M-CSF的培养基培养。在M-CSF中培养单核细胞导致产生巨大数量+的CD34 细胞。按照前面描述富集了白细胞或单核细胞的细胞群也可在许多其他本领域公知的细胞因子和leukokines存在下培养，来诱导产生许多其他祖细胞类型。例如，富集白细胞和/或单核细胞的细胞群可以在VEGF、bFGF、IGF-1、EGF和胎血清存在下，在纤连蛋白包被表面培养，弃去非粘附细胞，得到内皮样循环血管生成细胞(endothelial-like circulating angiogeniccells)，或者通过在EGF中培养使f-MΦ分化为上皮细胞、分别通过在NGF或VEGF中孵育分化成神经元细胞和内皮细胞、或者在HGF等存在下经诱导分化成为肝细胞。

[0031] 附图概述

[0032] 图1A至1C描述从血制品样品中分离白细胞和单核细胞的切向流过滤设备的实施方案。图1A提供了富集白细胞的设备的实施方案，其中交叉流室在过滤室上方。图1B描述该设备正面图，其中，样品在过滤器下方输入，滤过物向上流过过滤器富集单核细胞。图1C是图1B所述设备的俯视图。

[0033] 图2描述在不同条件下对白细胞去除术产物进行切向流过滤(TFF)的实例。10ml白细胞去除术产物，1∶5稀释到PBS+肝素+DNaseI的缓冲液中，使用3微米过滤器，以过滤速率15ml/min进行TFF处理。显示了TFF后保留物(指定为“Retentate”；阴影带)和滤过物(指定为“Filtrate”；黑色带)中白细胞(WBC)的百分比。再循环(输入)速率Max、10、9、8、7和6分别对应于1680、1380、1080、870和540ml/min。

[0034] 图3描述在TFF设备中对白细胞去除术产物进行TFF的研究结果，该设备中使用3微米过滤器，在三个不同过滤速率(11、15和19.6ml/min)下，再流通(输入)速率为1080ml/min。显示了保留物(阴影带)或滤过物(指定为“Filtrate”；黑色带)中白细胞(指定为“WBC”)百分比。

[0035] 图4描述图1所述的研究中，对白细胞去除术产物样品进行TFF的另外的结果。10ml白细胞去除术产物，1∶5稀释，使用3微米过滤器，以15ml/min过滤速率进行TFF处理。显示TFF后保留物(阴影框)和滤过物(黑色框)中红细胞(指定为“RBC”)百分比。
再循环(输入)速率Max、10、9、8、7和6分别对应于1680、1380、1080、870和540ml/min。

[0036] 图5描述图2所述的研究中，对白细胞去除术产物样品进行TFF的另外结果。10ml白细胞去除术产物，1∶5稀释，使用3微米过滤器，在三个不同过滤速率(11、15和19.6ml/min)下，以1080ml/min再循环(输入)速率进行TFF处理。显示保留物(阴影带)和滤过物(指定为“Filtrate”，黑色带)中红细胞(指定为“RBC”)百分比。

[0037] 图6描述在样品中增加白细胞去除术材料浓度的影响的实例。50ml白细胞去除术材料。1∶5稀释到PBS+肝素+DNase I中，使用具有3微米孔径过滤器的设备进行TFF。以过滤速率的函数显示保留物(指定为“Retentate”)中红细胞(指定为“RBC”)和白细胞(指定为“WBC”)的百分比。

[0038] 图7描述随白细胞去除术产物(120ml或整个单元的1/2)扩大、在3微米和5微米过滤器分离白细胞去除术产物的实例。再循环(输入)速率为1680ml/min，过滤速率15ml/min。对于使用5微米过滤器进行的TFF，约80％的红细胞(指定为“RBC”；黑色阴暗带)从保留物中去除，而约62％的输入白细胞(指定为“WBC”；浅色阴影带)或多于70％的输入单核细胞被保留。相反，使用3微米过滤器，约65％的输入白细胞保留在保留物中，但是仅有3％的红细胞被去除。

[0039] 图8描述放大量的白细胞去除术产物为样品通过约4.5微米和8微米过滤器分离白细胞去除术产物的比较。再循环(输入)速率为1680ml/min，过滤速率为15ml/min。对于使用4.5微米过滤器进行的TFF，约99％的红细胞(指定为“RBC”；黑色阴暗带)从保留物中去除，而约90％的输入白细胞(指定为“WBC”；浅色阴影带)被保留。相反，使用8微米过滤器，约98％的输入红细胞被去除，但是仅有4％的白细胞得到保留。

[0040] 图9描述放大量的处理白细胞去除术产物(250ml或整个单元)，在4.5微米过滤器上分离的实例。再循环(输入)速率为1680ml/min，过滤速率为15ml/min。对于使用4.5微米过滤器、对三个不同的白细胞去除术产物进行90分钟的TFF，80％至95％之间的红细胞从保留物中去除，而约80％至100％的输入单核细胞得到保留。一个白细胞去除术样品在TFF后，化验保留物，发现仅有2％的输入血小板和3％的输入血浆(在表1中指定为实验7)。

[0041] 特定实施方案描述

[0042] 本发明提供处理血液成分非均匀混合物来提供富集的白细胞群的设备和方法。在本发明的一方面，提供了通过选择性去除非白细胞血液成分(例如血浆、血小板和/或红细胞等)来富集白细胞的设备和方法。另一方面，提供了通过从该混合物选择性去除非单核细胞血液成分(例如去除淋巴细胞、红细胞、血小板等)富集单核细胞的设备和方法。

[0043] 富集的白细胞群一般从包括血液成分的样品或流体混合物中制备。此处使用的术语“血液成分”指一般出现在血液当中的任何物质，包括一般出现在疾病和非疾病状态下的某种物质。血液成分包括白细胞，并且可以包括例如淋巴细胞、单核细胞、红细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞(NK)、和/或血小板、可溶性或不可溶蛋白质或蛋白质复合物(例如酶、免疫球蛋白或免疫球蛋白-抗原复合物)、其他大分子成分(例如脂类)、或整个血液当中可以物理分离、不考虑其精确分子或细胞修饰的其他任何部分(比如包括血浆或血清)。

[0044] 在实施本发明方法前，样品或流体混合物可以部分富集白细胞。术语“白细胞(leukocyte)”与“白细胞(white blood cells)”(“WBC”)可以交替使用。这些术语包括单核无颗粒白细胞(包括例如单核细胞。树突细胞前体和淋巴细胞)以及具有节段核和细胞质颗粒的多形核粒细胞(包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)。“单核细胞”指一类髓样白细胞(myeloid leukocyte)，通常比淋巴细胞大，具有卵形或肾形细胞核，一般含有溶酶体颗粒并且一般表达CD14。

[0045] 在本发明的某个方面，淋巴细胞从白细胞中分离。“淋巴细胞”指衍生于淋巴祖细胞的细胞，包括B-淋巴细胞、T-淋巴细胞和天然杀伤(NK)细胞。术语“小淋巴细胞”指直径约7-8微米的淋巴细胞。

[0046] 此处使用的术语“白细胞群”指包括白细胞的任何细胞群。白细胞群可以包括广泛范围的白细胞亚型或特定亚型，例如，单核细胞和\或单核树突前体细胞。术语“富集(名词)”、“富集(动词)”和“富集的”意为使用本设备对血液成分混合物的处理、或按照本发明方法得到细胞群，与其他血液成分相比，该细胞群比最初的混合物(例如，在富集前)具有更高的活性白细胞百分比。此处使用的术语“活性”指能够在适宜培养条件下分化的白细胞。

[0047] 根据本发明的设备利用切向流过滤富集白细胞群。术语“切向流过滤”和“交叉流过滤”可以交替使用，指从流体混合物分离悬浮粒子(例如细胞)，包括从流体混合物非均匀粒子混合物中分离具有确定特征(例如要求的粒度范围)的粒子。将流体混合物(例如样品流体)在样品室中基本平行或者垂直于过滤器(例如，过滤器表面面向样品流体)传递或循环，一般在正压下，使用包括浓缩粒子或白细胞的流体混合物，持续切线流过膜表面，使粒子得到分离。

[0048] 通常，决定哪些粒子从“滤过物”(即通过过滤器的流体部分)中去除、哪些粒子保留在“保留物”中，依赖于多种因素。这些因素包括，例如，过滤器孔径、输入速率、过滤速率、流体混合物中粒子浓度、温度和流体混合物粘度。此处所用的“孔径”指过滤器中孔的平均大小。“输入速率”指样品(例如流体混合物)被引导进入容纳过滤器的室的速率。当样品多次再循环经过过滤器(例如本发明的装置中的过滤器)时，输入速率也指“再循环速率”。“交叉流”指流体混合穿物过过滤器基本平行(即在任何方向平行于过滤器表面)的流动。
“交叉流速率”指样品或流体混合物越过并基本平行于过滤器的流动速率；流体混合物的交叉流速率通常依赖于多种参数，包括例如输入速率、过滤器容纳室的大小和形状。“过滤速率”指流体混合物经过过滤器的流速。对于根据本发明方法和设备的过滤速率，一般低于非对抗(例如空心管，open tube)过滤速率。“输出速率”指从交叉流室去除流体混合物的速率，不同于流经过滤器的流体混合物(即滤过物)。输出速率通常等于输入速率减去过滤速率。

[0049] 此处使用的术语“过滤器”指由任何具有许多小孔的材料或材料的组合制成的物品，允许越过其进行交叉流的样品或流体混合物中一种或多种成分(例如血液成分)通过小孔，从而将这些成分(例如非白细胞)与其他成分(例如白细胞)分离。尽管可以使用更大或更小的面积，过滤器表面可以是任何适宜的面积，例如，直径约42到145mm。在某些实施方案中，一个TFF设备仅使用一个过滤器。在其他实施方案中，TFF设备可以使用额外的过滤器。

[0050] 本发明中TFF设备一般使用的过滤器可以从大范围的有机聚合体过滤器中选择。这些过滤器包括但是不限于尼龙、聚偏二氟乙烯(PVDF)、醋酸/硝酸纤维素、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯、聚酯、聚丙烯和聚酰胺的微孔膜。也可以使用其他过滤器(例如陶瓷过滤器和金属过滤器)。可以使用亲水性和疏水性的、带电荷和不带电荷的过滤器。在某些申请中，可以优选亲水性过滤器。

[0051] 本发明的过滤器一般包括大量分布于过滤器区域的小孔。在某些实施方案中，过滤器孔径具有小的变化。例如，孔径变异度约为±20％，或在约+0至20％之内。在一个典型的实施方案中，使用“核孔”或“径迹蚀刻(track etched)”过滤器(例如聚乙烯或聚碳酸酯径迹蚀刻滤膜(Osmonics，Minnetonka，MN))。这些过滤器一般具有严格控制材料中孔径的光滑表面。这类过滤器一般通过将一片无孔塑料暴露于具有足够穿透塑料片的能量的放射性粒子源中而制备。暴露于化学溶剂或蚀刻试剂中，“轨迹”直径于是增大。孔的大小可以通过轨迹蚀刻条件而控制。

[0052] 本发明利用血液中多种细胞型之间的差异富集白细胞(例如单核细胞、树突细胞前体等等)。这些差异可以包括，例如，在大小、形状和/或可塑性的差异。人类血液中细胞的大小和可塑性一般随细胞型而变化。红细胞一般为双凹碟形、无核，大直径(major diameter)测量约为7微米，相对可变形。多形核白细胞一般为类球形，也约为7微米，但是不如红细胞可变形。单个核细胞中，淋巴细胞一般为7至10微米，单核细胞通常在10至15微米范围内。

[0053] 在多种实施方案中，选择过滤器孔径来富集白细胞，和/或对血液成分进行分级从而富集白细胞。例如，在某些实施方案中，标称直径为10至15微米的单核细胞，以及标称直径为7微米的红细胞，可以由使用孔径约5至5.5微米的过滤器的TFF分离。在一个特定的实施方案中，4.5微米过滤器成功的被用于将单核细胞与白细胞去除术样品中其他细胞成分分离。

[0054] 在其他实施方案中，过滤器孔径可在约1至10微米范围内，或者约3至8微米、或3至5微米。孔径在约3微米范围内的过滤器可以保留大多数白细胞，对于从白细胞中去除红细胞的作用效率较低。相反，孔径在约8微米范围内的过滤器去除红细胞的作用可以更有效，但是增加了白细胞在滤过物中的丢失。约为3至5.5微米的过滤孔径可以用来富集+
CD34 造血干细胞。

[0055] 从其他血液细胞成分中富集白细胞也可受到输入速率、过滤速率和/或样品或流体混合物中细胞浓度的影响。例如，红细胞比白细胞更容易变形，因此更容易通过孔径比红细胞大直径小的过滤器(例如小于7微米)。在一个特定的实施例中，可以使用孔径约5微米的过滤器将红细胞从白细胞中分离。在其他实施方案中，过滤器孔径减小到约3微米，细胞浓度(如前)升高来有效的从白细胞中分离红细胞。

[0056] 白细胞从其他血液细胞成分中的富集也可受到在同样输入速率或再循环速率下，维持过滤速率低于非对抗(如空心管)过滤速率的影响。在其他实施方案中，白细胞在滤过物中的损失可以通过维持输入或再循环速率高于过滤速率而得到降低。在示范实施方案中，输入或再循环速率可以是过滤速率的至少5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。

[0057] 用于使用TFF进行细胞分级的、包括多种血液成分样品或流体混合物，可以从多种来源获得，可包括处理过程中多个阶段的血制品流体混合物。例如，血源可以是人类或非人类。另外，流体混合物可以是例如全血、全血的多种稀释物，或者经过诸如去除血浆或其他血液成分处理的全血或血液稀释物。因而，流体混合物可以包括例如至少已经部分富集了白细胞的血细胞群。

[0058] 血液成分或白细胞群，可以使用本领域技术人员公知的方法制备。这些方法一般包括采集肝素化血液、单采血液成分术或白细胞去除术、制备棕黄层、rosetting、离心、密度梯度离心(例如蔗糖等)、非白细胞差异裂解和过滤等等。白细胞群还可以通过从个体采集血液、除去纤维蛋白来去除血小板、以及裂解大部分红细胞来制备。白细胞群还可以选择经例如梯度离心来富集单核细胞。

[0059] 包括血液成分的流体混合物可以根据需要任选稀释或浓缩。例如，在某些实施方案中，血液成分被稀释为1∶2、1∶5、1∶10或其他任何适宜的稀释度。血液成分可以稀释到诸如等渗缓冲液(例如PBS或HEPES缓冲盐溶液)、组织培养基等等中。一般，进行TFF6 8
处理的血液成分样品具有每毫升约10 至10 个细胞的细胞浓度。

[0060] 根据富集的白细胞群的使用需要，血细胞群可以从多种类型的个体获得。个体可以是健康个体。作为选择，血细胞可以从需要免疫刺激的个体(例如癌症患者或者免疫刺激对其有益的其他患者)获得。同样，血细胞可以从自身免疫失调的患者(例如类风湿性关节炎、糖尿病、狼疮和多发性硬化等等)这类需要免疫抑制的受试者获得。血细胞群也可以从HLA匹配的健康个体获得，给予需要免疫刺激的HLA匹配的患者。血细胞群同样可以从给以干细胞动员剂的个体采集，例如GM-CSF、G-CSF和AMD3100(或其他已知CXCR-4功能的试剂)，或者低/高剂量环磷酰胺等等(Deliliers等，Leuk.Lymphoma 43：1957，2002)。个体可以是将要接受富集的细胞群的患者、亲属或者HLA匹配个体。

[0061] 在某些实施方案中，富集白细胞群可以从保留物中收集，而其他血液成分则进入到滤过物中。例如，为了富集白细胞群(例如，包括单核细胞和淋巴细胞)，诸如血浆、血小板和/或红细胞其他血液成分可以选择性去除到滤过物中。在另一个实施方案中，淋巴细胞或小淋巴细胞可以选择性去除，进入滤过物。

[0062] 如图1A至1C中所述的根据本发明的设备一般包括交叉流室(3)和滤过物室(4)。过滤器(5)定位与二者之间，一个表面与交叉流室流体交流(保留物表面)，另一表面同滤过物室流体交流(滤过物表面)。交叉流室、滤过物室和过滤器组成去除器单元(1)。在一个实施方案中，交叉流室一般具有约55ml的容积，滤过物室具有约25ml的容积。过滤器直径一般与交叉流室直径基本相同。在某些证明本发明效用的实施方案中，过滤器直径约为
140至143mm。

[0063] 流体混合物经流体入口(6)进入交叉流室(3)，入口一般置于过滤器保留物表面附近，以致流体混合物(例如样品)基本平行于过滤器保留物表面进入交叉流室。一般，流体经流体出口(7)从交叉流室(3)去除，流体出口通常置于交叉流室垂直于过滤器保留物表面的部分。在某些示范实施方案中，交叉流室入口(6)直径约为7mm至8mm，交叉流室出口(7)直径约为8mm至10mm。滤过物经出口(8)去除到滤过物室中(4)。

[0064] 一般，流体混合物以足够的输入速率被引导进入交叉流室中，以致越过过滤器表面(保留物表面)的流体混合物的交叉流具有足够高的速率，在过滤器接触表面(例如界面层)逐渐将流体与细胞瓦解并反混合(back-mix)。此处所用的“界面层”，指在过滤器保留物面上、或者与之毗邻的流体层，一般通过流过过滤器的流体留下。界面层的瓦解通过阻止过滤器接触表面的物质与过滤器结合或形成可阻碍有效过滤的停滞而有利于有效过滤。然而，流体混合物的输入速率通常并不足以引起大量的白细胞的裂解。

[0065] 在某些实施方案中，流体混合物被泵入交叉流室(3)，使血液成分通过过滤器的保留物表面。用于驱动流体交叉流通过过滤器的泵称为“交叉流泵”或“再循环泵”(14)。交叉流泵可以包括与交叉流室(3)流体交流的任何泵设备，其足以将流体流引导进入室中并以特定的输入速率通过过滤器，而不会引起细胞的基本损伤(例如细胞裂解)。适于在本发明中使用的交叉流泵可以包括例如蠕动泵、活塞泵、膜片泵或滚子泵。在例如需要将TFF设备保持为“封闭”系统的一部分时，可以使用蠕动泵。

[0066] 流体混合物一般以超过过滤速率的输入速率被泵入交叉流室(3)。在一个示范实施方案中，输入速率约为1680ml/分钟，过滤速率约为15ml/分钟。在另一个示范实施方案中，输入速率约为1600至1800ml/分钟，过滤速率约为10至20ml/分钟。非白细胞物质(例如红细胞、免疫复合物和蛋白质等)通过过滤器(5)进入过滤物室中(4)。

[0067] 如前文所讨论，过滤速率一般低于非对抗(如空心管，open tube)速率。过滤速率是可以控制的，例如通过减小或限制滤过物室出口大小、利用第二个泵装置(例如过滤泵)来限制液流等等方法。

[0068] 另一个示范实施方案中，引导流体混合物进入设备在液体内产生涡流。例如，通过引导流体混合物以约为过滤速率的5倍或10倍至100倍的输入速率，基本平行于圆形过滤器进入圆柱形交叉流室，可以实现这一点。流过的液流通过出口(7)去除，出口(7)位于与过滤器垂直的圆柱形室内，一般临近于过滤器表面中央。这样的布局导致液流漩涡进入过滤器中央。液流一般不湍急或达到引起白细胞基本裂解的高速。如前文所讨论，液流也可以“净化”过滤器表面，防止界面层的结合或阻滞。校准输入速率使其大于(例如，至少约5倍)过滤速率，由此富集了白细胞的细胞群可有至少约20％或至少40％或更多白细胞。

[0069] 另一个示范实施方案中，保留物被再循环来提高分离效率。例如，包括血液成分的流体混合物可被引导进入交叉流室，然后保留物可以通过交叉流室中的流体出口(7)撤入另一室中，例如最初提供液体的室(“回收单元”；(2))。回收单元中的流体混合物然后可以再次引导进入交叉流单元。通过将回收单元(2)与去除器单元(1)连接成“环形”，可以实现流体混合物持续的再循环和过滤。作为选择，保留物可以通过交叉流室(3)中的流体出口(7)撤出，直接再循环进入交叉流入口(即不用经过回收单元或另一个室)。流体混合物通过交叉流室可以持续任意适宜的时间。在某些实施方案中，流体混合物可以再循环5至60分钟或更久，以达到要求的白细胞纯度或丰度。

[0070] 在另一个实施方案中，可以通过加入缓冲液、洗涤溶液或其他溶液(统称为“置换液”)来调节流体混合物的体积。例如，可以在回收单元(例如通过一个溶液入口(13))中、在去除器单元中、在泵上(14)、在延伸至或延伸自去除器单元的管中，或在其他任何方便的位置，将洗涤溶液与流体混合物组合。保留物中的细胞于是可在同一操作中富集并洗涤。一般，洗涤溶液与细胞等渗。适宜的缓冲液和洗涤溶液可包括多种缓冲液(例如磷酸缓冲液(PBS)或HEPES缓冲盐溶液)、组织培养基等。

[0071] 在某个实施方案中，细胞群在封闭的无菌系统中得到富集的白细胞细胞群。此处所用的术语“封闭的无菌系统”或“封闭系统”指将暴露于未经消毒、周围环境、流通空气或其他未经消毒条件的机会降至最低或消除的系统。用来富集细胞群的封闭系统通常排除在顶端开放的管中进行离心、开放空气中转移细胞、在组织培养板或未封闭瓶中培养细胞等。包括例如任何细胞容器、孵化器、组织培养容器或其他用于细胞处理的装置(见下文)在内的整个过滤系统可以维持为一个“封闭”系统。在一个典型的实施方案中，封闭系统允许白细胞的无菌富集，并且可以任选从起初的收集容器转移到可封闭的组织培养容器，而不暴露于未经消毒的空气。在封闭系统中一般使用蠕动泵(图1A和1C；(15))装置。

[0072] 本发明的另一方面，经过从混合物中选择性去除非白细胞血液成分(包括例如血浆、血小板、红细胞等)，血液成分的非均匀混合物基本富集了白细胞。此处使用的术语“基本富集的”意为经过根据要求的许多循环的再循环后，从保留物中回收的细胞群包括至少约20％、至少约40％、或者至少约60％的所需细胞型(例如白细胞)。在其他实施方案中，血液成分的非均匀混合物得以富集白细胞，以形成基本不含非白细胞血液成分的富集的白细胞群。此处所用的术语“基本不含”意为富集白细胞的细胞群包括至少50％的白细胞。

[0073] 在本发明此方面的一个示范实施方案中，TFF设备包括容积约为55ml的交叉流室(3)和容积约为25ml的滤过物室(4)。该装置另外包括如下：孔径约为1至10微米、或约为2至8微米，或3至5微米的过滤器；约为1600至1800ml/min的输入速率；约为12至17ml/min的过滤速率，以及直径约为142mm的过滤器。初始流体混合物一般具有至少约每
7
毫升10 个细胞(例如白细胞或其他细胞)的细胞浓度。

[0074] 在本发明的另一方面，经过从混合物中选择性去除非单核细胞血液成分(例如从混合物中去除淋巴细胞)，血液成分的非均匀混合物基本富集了单核细胞。此处使用的术语“选择性去除”、“被选择性去除的”和“选择性去除”指优先去除一种细胞型、并富集另一种细胞型。在此方面的一个示范实施方案中，TFF设备包括容积约为55ml的交叉流室(3)和容积约为25ml的滤过物室(4)。此外，该装置包括如下：孔径约为1至10微米、或约为2至8微米，或3至5微米的过滤器；约为1600至1800ml/min的输入速率；约为12至17ml/min的过滤速率，以及直径约为142mm的过滤器。初始流体混合物一般具有至少约每毫升7
10 个细胞(例如单核细胞或其他细胞)的细胞浓度。在这个实施方案中，该设备以相反方式(inverted manner)操作。

[0075] 富集细胞群的培养、扩增和分化

[0076] 如上所述富集白细胞细胞群后，可任选的培养白细胞来保持细胞活力、增加细胞数量和/或将细胞分化为另一个细胞型。适宜的组织培养容器包括例如组织培养瓶、袋、板和生物反应器(包括发酵罐)等。

[0077] 在一个示范实施方案中，富集的白细胞群可以在封闭、无菌系统(例如生物反应器、组织培养袋等)中培养。此封闭系统可以具有一个入口和/或出口用于对流体(例如组织培养基、洗涤缓冲液)、气体、细胞等的可控制的、无菌引入或去除。

[0078] 在另一个示范实施方案中，富集的白细胞群可以转移到生物反应器中。此生物反应器可以装备合适的入口和/或出口，来引入细胞、消毒气体(例如氧气、二氧化碳和/或空气)、组织培养基等。生物反应器还可具有温度控制手段。生物反应器一般在约37℃运行。生物反应器还可具有搅拌生物反应器中细胞或培养基的装置。搅拌装置可以包括例如浆或旋转过滤器(也可以起培养基出口的作用)。

[0079] 在更多一个示范实施方案中，富集的白细胞群可以转移到诸如组织培养袋这样的封闭系统中。适宜的组织培养袋包括例如培养容器(Nexell TherapeuticsInc.)或培养袋(AmericanFluoroseal Corp.)。此封闭系统可以具有任何适宜的大小和体积，以使技术人员满意。尽管更大或更小的体积是可能的并且在本发明范围内，适宜的体积包括，例如，从约0.01升至约5升，或约0.01升至0.05升。

[0080] 根据本发明的各种实施方案中，富集白细胞的细胞群(例如，包括单核细胞、单核+树突细胞前体、CD34 造血干细胞或其他前体细胞)可以任选地被培养，并且通过加入合适诱导剂而分化，来获得特定细胞型的细胞，包括例如未成熟或成熟树突细胞、f-巨噬细胞、+
CD34 造血干细胞或前体细胞、或者其他前体细胞。适宜的组织培养基包括，例如，AIM-V、TM
RPMI 1640、DMEM、X-VIVO 15 等。组织培养基可以根据需要添加氨基酸、维生素、细胞因子(例如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白介素4(IL-4)、二价阳离子等)，促进细胞向诸如未成熟树突细胞的分化。典型的细胞因子组合是GM-CSF和IL-4各约500U/ml。

[0081] 富集的白细胞群可以被培养任意适宜的时间。在某些实施方案中，细胞分化为未成熟树突细胞的适宜的培养时间可以约为4至7天。从前体细胞向未成熟树突细胞的分-化，可以用本领域技术人员公知的方法监测，例如存在或缺乏细胞表面标志(例如CD14、+ 1o +
CDllc、CD83 、HLA-DR)。未成熟树突细胞也可以在适宜的组织培养基中培养来扩增细胞群，和/或将未成熟树突细胞保持在用作进一步分化或抗原摄入、加工和呈递的状态。例如，未成熟树突细胞可以在GM-CSF和IL-4存在下得以维持。

[0082] 在某些实施方案中，优选未成熟树突细胞用于最佳抗原呈递，因为他们保持了加工新抗原的能力(见例如Koch等，J.Immunol.155：93-100，1995)。相反，曾暴露于适宜的- + + + +成熟剂、并且曾经加工抗原的成熟树突细胞(例如CD14、CD11c、CD83、CD86、HLA-DR)，典型地丢失了有效加工新抗原的能力。

[0083] 在培养过程中，未成熟树突细胞可以任选暴露于预先确定的抗原。适宜的预先确定抗原可包括呈递给T细胞的任何抗原(例如活化、刺激增殖、诱导无反应性等)。在一个实施方案中，将未成熟树突细胞在肿瘤相关抗原存在下培养，这类抗原例如前列腺特异性膜抗原(PSMA)(用于肿瘤免疫治疗和/或肿瘤生长抑制)。其他抗原可以包括，例如，细菌和病毒抗原、肿瘤特异性或肿瘤相关抗原(例如肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞膜制剂、从肿瘤分离的抗原、融合蛋白、脂质体等)、以及任何其他抗原。接触抗原后，可以将细胞培养任何适宜的时间，以允许抗原摄入和加工、扩增抗原特异性树突细胞群等等。未成熟树突细胞也能够成熟为在MHC分子情况下呈递抗原的成熟树突细胞。这样的成熟可以例如通过在成熟因子，如细胞因子(例如TNF-α)、细菌产物(例如BCG)等存在下培养得以完成。

[0084] 本发明另外一个方面，血液成分的非均匀混合物被基本富集了单核树突细胞前体细胞。如上文所述，白细胞或单核细胞细胞群得到富集后，单核树突细胞前体(例如来自外周血之类)可以通过选择性粘附到基质上(例如单核树突细胞前体结合基质)而从富集的细胞群中分离。这样的基质可以通过例如组织培养皿或瓶提供。作为选择，可以使用具有高表面积/体积比的基质，例如微粒或纤维性基质(如2002年7月25日提出的PCT/US02/23865中所公开，此处引用其中公开内容作为参考)。单核树突细胞前体可以是粘附到基质上、形成单核树突细胞前体与基质复合物的单核细胞，而其他白细胞保持未结合状态(“非粘附的”)。结合的白细胞于是与未结合白细胞分离，在基质上形成富集了单核树突细胞前体的细胞群。单核树突细胞前体可以在基质上得到培养和分化，或者从基质上洗脱继而分别培养和分化，来获得未成熟和/或成熟的抗原呈递树突细胞。根据这个方面，单核树突细胞前体可选地被分离并在封闭的无菌系统中分化。

[0085] 根据另一个方面，暴露于预先确定的抗原的树突细胞可以用于在体外或体内激活针对该抗原的T细胞。暴露于抗原来激活T细胞后，树突细胞任选可以立即使用。作为选择，在暴露于抗原和T细胞之前，树突细胞可以在细胞因子组合物(例如GM-CSF和IL-4)存在下维持。在一个特定的实施方案中，人类树突细胞被用于在体内或体外刺激人T细胞。

[0086] T细胞或T细胞亚群可以从多种淋巴组织中获得。这类组织包括但是不限于脾脏、淋巴结和外周血。T细胞纯化可以通过诸如正选或负选实现，正选或负选包括但是不限于使用针对CD2、CD3、CD4、CD5和/或CD8的抗体。

[0087] T细胞可以作为混合T细胞群或者纯化的T细胞亚群与暴露于预设抗原的树突细+胞共培养。例如，纯化的CD8T细胞可以与暴露于抗原的树突细胞共培养，来引起抗原特异+ + + +
性的CTL。在某些实施方案中，早期去除CD4T细胞，可以防止CD4 细胞在CD4 和CD8T细+ +
胞混合培养中的过度生长。作为选择，CD4 和CD8T细胞的混合群可以与树突细胞共培养，来引发包括细胞毒性和TH免疫应答的抗原特异性反应。

[0088] 这种经过刺激的T细胞可任选再输入到受试者体内(见例如，Riddle和 Greenberg，J.Antimicrobial Chemotherapy 45：35-43，2000；Correale 等，J.Neuroimmunology 107：130-39，2000；此处引用其中公开内容作为参考)。例如，未成熟树突细胞可以与抗原(例如PSMA)接触并成熟，形成成熟树突细胞。T细胞可以从受试者分离，离体与成熟树突细胞接触，然后再次给予该受试者。例如，可以每周或每两周给予受试
7 9 +
者剂量约为1×10 至5×10 的CD8T细胞，持续1-4个月或更久。作为选择，成熟树突细
7
胞可以直接给予受试者。一般，病人每次给予约1×10 个树突细胞。

[0089] 一般，来自经过干细胞动员剂处理的供体的白细胞去除术产物，包括约约1％至5％的细胞，约5％至20％粒细胞，约40％至60％左右淋巴细胞，约10％-约25％单核细胞，带有显著数量的红细胞和血小板。使用本发明中带有约3至约5.5微米孔径的过滤器的TFF装置，得到富集的白细胞群，其包括约60％至70％单核细胞，几乎没有粒细胞，约10％+
淋巴细胞和约10％至40％CD34 细胞。该富集的白细胞群能够如下文所述使用。

[0090] 在其他实施方案中，本发明方法用于获得除单核细胞或单核细胞前体之外的其他细胞亚群。例如，富集白细胞的细胞群可以作为造血干细胞来源用于诸如同种异体或自体移植。在特定的实施方案中，富集白细胞群可以在交叉流分离程序后进一步富集干细胞。从外周血白细胞来源富集造血干细胞的方法为本领域公知，并且适于用于按照此处描述所分离的富集的白细胞群。例如，富集的白细胞群可以使用例如免疫磁分离技术(见：例如Rowley 等，Bone Marrow Transplant.21：1253，1998；Denning-Kendall等，+Br.J.Haematol.105：780，1999)进一步富集CD34 细胞。另外，为了进一步提高干细胞产量，富集了单核细胞继而按照本发明描述进行TFF的细胞群，可以在例如存在约50ng/ml +
M-CSF的含有胚胎血清的培养基中培养，以产生CD34 细胞。培养必须在非贴壁细胞培养容器中进行，例如培养袋。此外，外周血供体可以在采集外周血和使用TFF分离白细胞之前进行干细胞动员。提高干细胞收获效率的多种动员剂为本领域公知。例如，供体可以使用GM-CSF、G-CSF、AMD3100(或其他抑制CXCR-4功能的试剂)，和/或化学治疗动员剂，例如高剂量或低剂量环磷酰胺处理(见：例如Deliliers et al.，Leuk.Lymphoma，43：
1957，2002)。血液供体可以是接受移植的患者、近亲或HLA匹配个体等。

[0091] 在另一个实施方案中，本发明方法也用于获得非干细胞亚群，例如富集祖细胞的细胞群(例如造血或内皮祖细胞)或分泌目的因子(例如造血或血管生长因子)的细胞。例如，通过共表达VEGFR-2和AC133(还有VE-钙粘着蛋白和E-选择蛋白)，可以将循环内+
皮祖细胞(CEPs)识别为循环CD34 细胞的一个亚群(见：例如Peichev等，Blood95：952，
2000)。使用例如针对VEGFR-2和AC133抗体的免疫磁分离技术可以对富集白细胞的细胞群进一步富集CEP。而且，在TFF前可以使用细胞因子例如VEGF动员CEP(见：例如Gill等，Circ Res.，88：167，2001)。另外，在其他实施方案中，在纤联蛋白包被的表面，使用例如VEGF、bFGF、IGF-1、EGF和FBS培养富集的白细胞群，然后弃去非粘附细胞，获得内皮样循环生血管细胞(CACs，其分泌例如VEGF、HGF、G-CSF和GM-CSF)(见：例如Rehman等，Circulation 107：1164，2003)。

[0092] 另外，富集的白细胞群可以被培养来诱导多能祖细胞或干细胞增殖。例如，CD34+干细胞可以通过使用造血生长因子(例如IL-1、IL-3、IL-6和干细胞因子(SCF)的组合物)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和G-CSF培养，而得以增殖(见：例如Sun等，Haematologica 88：561，2003)。作为选择，例如，富集的单核细胞群可以使用诸如M-CSF、LIF和/或IL-6处理，来获得多能“f-巨噬细胞”(f-MΦ)，这种细胞在形态学上类似成纤维细胞，而不像标准巨噬细胞，展示高水平CD34(见Zhao等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 100：2426，2003)。祖细胞或干细胞可以继而使用多种细胞因子和生长因子处理，来诱导向造血或非造血系的分化。

[0093] 在其他实施方案中，富集白细胞的细胞群可以在适宜诱导分化的条件下培养(例如，祖细胞的分化或更多分化的细胞型(例如单核细胞或单核细胞衍生的树突细胞)的转分化(transdifferentiation)。(此处使用的“转分化”指分化细胞的表型调制过程，一般不需要细胞分裂使分化细胞由此分化成为形态学和/或功能不同的细胞群)。例如，除分化为树突细胞外，依赖培养条件，单核细胞可以转化为其他造血或非造血细胞型，包括例如巨噬细胞、破骨细胞和内皮样细胞(见：例如Becker等，J.Immunol.139：3703，1987；Nicholson等，ClinSci.99：133，2000；Havemann等，Novel Angiogenic Mechanisms：
Role of Circulating Progenitor Endothelial Cells 47-57(NicanorI.Moldovan eds.，
2003))。在一个实施方案中，在纤连蛋白包被的表面，使用VEGF、bFGF、IGF-1、氢化可的松和FCS培养，富集的单核细胞或单核细胞衍生的树突细胞得以转分化为内皮样细胞(Havemann等，见前文)。同样，在诱导相对未分化的细胞亚群(例如多能祖细胞和干细胞)分化为造血或非造血系的条件下，富集的白细胞群可以使用多种细胞因子或生长因子中的任何进行培养。例如，单核细胞衍生的多能干细胞(f-MΦ)，分别经例如LPS、IL-2、EGF、NGF、VEGF、或HGF处理，可以被诱导分化为标准巨噬细胞、T淋巴细胞、上皮细胞、神经元细胞、内皮细胞、或肝实质细胞(Zhao等，见前文)。这些分化可以在如前文所述的细胞扩增之前或之后诱导。

[0094] 下面的实施例仅被提供作为本发明多方面的说明，不应以任何方式分析为对本发明的限制。

[0095] 实施例1：具有环形构型的去除器单元和回收单元的TFF设备

[0096] 本发明的一个实施方案包括切向流过滤设备的一个结构：在一个环形结构中有去除器单元(1)和回收单元(2)(图1A)。去除器单元包括由微孔过滤器(5)分隔为两个室(交叉流室(3)和滤过物室(4))的构架(housing)，微孔过滤器(直径142mm)孔径约为1至约10微米。交叉流室包括流体入口(6)和流体出口(7)。滤过物室包括滤过物出口(8)。回收单元包括一个含有回流入口(10)、回流出口(11)、样品入口(12)和溶液入口(13)的构架(9)。在某些实施方案中，样品入口和溶液入口是同一个入口，但可以是分离的。样品(例如血液、血液制剂、或制备的白细胞群)由样品入口(12)引导进入回收单元，并在再循环泵(14)的作用下、经过回流出口(11)移回去除器单元。样品经过流体入口(6)被引导进入去除器单元，并流过微孔膜(5)，使流体的移动指向过滤方向的切线方向。流体入口(6)通常定位于与过滤器半径垂直的方向。相关的入口、过滤和出口速率引起涡流，涡流中心将血液制剂中没有通过过滤器的成分汲取到流体出口(7)并回到回收单元(2)。流体在回收单元和去除器单元之间的流动由再循环泵(14)控制。滤过物从去除器单元的去除由滤过物泵(15)控制。

[0097] 实施例2：TFF后白细胞的保留——再循环速率和过滤速率对保留效率的影响[0098] 在此实施例中，使用实施例1中描述的、提供直径142mm的聚酯膜的TFF装置富集白细胞得以证明。白细胞去除术产物的样品在多种条件下的设备中进行TFF，并对白细胞的选择性保留进行评价。在一组研究中，使用3微米过滤器，以15ml/min的过滤速率(持续17分钟)、在多种再循环(输入)速率下(例如1680、1380、1080、870和540ml/min)，对10ml白细胞去除术产物进行TFF。通常，大部分白细胞被保留于保留物中(即滤过物中的白细胞少于10％)，除非再循环速率低于1080ml/min(图2；注：相应的指定为Max、10、9、8、
7和6的实际再循环速率分别为1680、1380、1080、870和540ml/min)。

[0099] 在另一组研究中，使用3微米过滤器，以1080ml/min的再循环(输入)速率，在3种不同的过滤速率下(11、15和19.6ml/min)，在实施例1的TFF设备中，对10ml白细胞去除术产物进行TFF。每次研究收集滤过物约250ml。19.6ml/min或11ml/min的过滤速率基本都不比15ml/min的过滤速率更有利于白细胞的保留(图3)。

[0100] 实施例3：从白细胞去除术产物中选择性去除红细胞

[0101] 在这个实施例中，说明了红细胞的选择性去除，以及再循环速率、过滤速率和样品浓度对使用实施例1中TFF设备的分离效率的影响。白细胞去除术产物的样品在实施例2中建立的条件下进行TFF，并对红细胞的选择性去除进行评价。如实施例2，使用3微米过滤器，以15ml/min的过滤速率(持续17分钟)、在各种再循环(输入)速率下(例如1680、1380、1080、870和540ml/min)，对10ml白细胞去除术产物进行TFF。已经确定，通常，降低再循环速率促进更多红细胞进入滤过物中(图4；注：相应的指定为Max、10、9、8、7和6的实际再循环速率分别为1680、1380、1080、870和540ml/min)。可见尽管降低再循环速率确实增加红细胞从保留物中去除，但在低于1080ml/min的再循环速率下，保留物中白细胞的产量减少(图4)。

[0102] 同实施例2，使用3微米过滤器，以1080ml/min的再循环(输入)速率，在三种不同的过滤速率下(11、15和19.6ml/min)，在同样的TFF设备中，对10ml白细胞去除术产物进行TFF。每次研究收集滤过物约250ml。19.6ml/min或11ml/min的过滤速率基本都不比15ml/min过滤速率更有利于红细胞的选择性去除(图5)。19.6ml/min的过滤速率比15ml/min更多的减少了保留物中的红细胞，但是如实施例2所见，15ml/min的过滤速率在保留物中得到更高产量的白细胞(图3)。

[0103] 关于图6，增加样品中白细胞去除术材料浓度的效果也得到研究。1∶5稀释于PBS+肝素+DNase I的白细胞去除术材料50ml，使用具有3微米孔径过滤器的装置进行TFF。如果过滤速率约15ml/min或19.6ml/min，保留物中红细胞(指定为“RBC”)百分率接近相同，约为输入的100％。然而，如果白细胞去除术产物50mL以1∶2稀释于同样的缓冲液，仅仅40％的输入红细胞保留于保留物中，显示负荷更高的样品浓度，也可以促进红细胞与白细胞(指定为“WBC”)的分离。

[0104] 实施例4：从白细胞去除术产物中选择性去除红细胞——孔径对去除红细胞的影响

[0105] 为了确认实施例1中所述的TFF装置的实施方案在成比例放大时将相似的进行，比较120ml白细胞去除术产物(整个单位的1/2)在过滤器孔径为3微米和4.5微米的设备中进行的TFF。再循环(输入)速率为1680ml/min，过滤速率为15ml/min。关于图7，对于使用4.5微米过滤器进行的TFF，约80％的红细胞(指定为“RBC”；黑色阴暗带)从保留物中去除，而约62％的输入白细胞(指定为“WBC”；浅色阴影带)，或者多于70％的输入单核细胞得以保留。相反，使用3微米过滤器，约65％的输入白细胞在保留物中得以保留，但是仅有3％的红细胞被去除。

[0106] 关于图8，比较45ml白细胞去除术产物在过滤器孔径为4.5微米和8微米的设备中进行的TFF。再循环(输入)速率为1680ml/min，过滤速率为15ml/min，时间为60分钟。对于使用4.5微米过滤器进行的TFF，约99％的红细胞(指定为“RBC”；黑色阴暗带)从保留物中去除，而约90％的输入白细胞(指定为“WBC”；浅色阴影带)得以保留。对于8微米过滤器，约98％的输入红细胞被去除，但是仅有4％的白细胞得以保留，显示使用4.5微米过滤器与更大的8微米孔径过滤器，促进了相同的红细胞的去除，但是获得了更佳的白细胞(指定为“WBC”)保留。

[0107] 实施例5：选择性富集白细胞并去除血小板和血浆

[0108] 本实施例在实施例1中所述的设备中，在多种条件下对白细胞去除术产物样品进行TFF，并对血小板和血浆的去除进行评价。关于表1，实验1至6，使用4.5微米或8微米孔径过滤器对45ml白细胞去除术产物进行TFF，再循环速率(输入速率)为1690或1880ml/min，过滤速率为15ml/min。过滤进行所示的60或90分钟。TFF后，测定保留物的白细胞、血小板和血浆。在所有试验中，不依赖于孔径(4.5微米或8微米)、再循环(输入)速率(1690或1880ml/min)和时间(60分钟或90分钟)，92％-约100％的输入血小板以及约97％至约99％的输入血浆被从保留物中去除。对于实验7，使用4.5微米孔径、1690ml/min再循环(输入)速率、15ml/min过滤速率，对全部白细胞去除术产物(250ml)进行为期90分钟TFF。TFF后，测定保留物，发现具有约84％的输入白细胞，但是仅有2％的输入血小板和3％的输入血浆。

[0109] 表1：过滤器孔径对保留PBMC的影响

[0110]白细胞孔径再循环速度时间输入输入血输入血
去除术 WBC在小板在浆在保
输入保留物保留物留物中
中的％中的％的％
实验1 45ml 4.5μm 1690ml/min60min 88 2.0 2.0
实验2 45ml 4.5μm 1690ml/min60min 67 8.0 2.0
实验3 45ml 4.5μm 1690ml/min60min 79 3.0 1.0
实验4 45ml 4.5μm 1888ml/min60min 92 0.0 1.0
45ml 8μm 1888ml/min60min 4 0.0 1.0
实验5 45ml 4.5μm 1690ml/min60min 130 3.0 3.0
45ml 4.5μm 1880ml/min60min 47 3.0 2.0
实验6 45ml 4.5μm 1690ml/min60min 80 1.0 2.0
45ml 4.5μm 1690ml/min90min 72 0.2 2.0
实验7 250ml 4.5μm 1690ml/min90min 84 2.0 3.0

[0111] 这些实验显示，对于多样的孔径(4.5微米或者8微米)、再循环(输入)速率(1690或1880ml/min)、白细胞去除术样品体积(45ml-250ml)以及时间(60分钟至90分钟)，TFF去除了大部分血小板和血浆。

[0112] 实施例6：从全白细胞去除术产物中选择性富集白细胞

[0113] 为了确认按比例扩大至更大样品时此TFF实施方案将可重现地进行，对250ml白细胞去除术产物(完整单位)使用指定为5×设备的TFF设备，使用4.5微米孔径过滤器、1680ml/min的再循环速率以及15ml/min过滤速率，并且与较低的输入体积进行比较。关于图9，对三个不同的白细胞去除术产物在不同的天数执行TFF90分钟。80％至95％之间的红细胞得以从保留物中去除，但是约80％至约100％的输入单核细胞得以保留。对于图
9中实验1，在TFF后，也测定保留物并发现仅有约2％的输入血小板和3％的输入血浆(指定为表1中实验7)。这些数据证明TFF可以重现的富集白细胞，并且优先从保留物中去除红细胞、血小板和血浆。

[0114] 实施例7：选择性富集单核细胞血液制剂的TFF设备

[0115] 除富集白细胞之外，也测定了使用TFF设备从血液制剂中选择性富集单核细胞。该设备的这个特定实施方案包括一个反向(“IV型”)结构，该结构被设计通过更改越过膜的引力方向来改变流体动力学(图1C)。使用4.5微米孔径过滤器、1680ml/min的再循环(输入)速率、15ml/min过滤速率，对235ml白细胞去除术产物得以进行TFF 90分钟。经过60分钟的TFF后，为了增加有效的滤过物，无效体积减少到120ml。测定输入物、保留物和滤过物每个的细胞含量。尽管输入物具有32％单核细胞和65％淋巴细胞，发现保留物具有约71％的单核细胞和相对22％淋巴细胞。滤过物包含1.5％的单核细胞和相对83％淋巴细胞(见表2)。

[0116] 表2.使用IV型(反转)TFF构造富集单核细胞

[0117]输入保留物滤过物
9
单核细胞数(×10)2.85 1.37 0.861
9
淋巴细胞数(×10)5.67 0.428 4.86
9
粒细胞数(×10) 0.133 0.0571 0.0797
9
RBC数(×10) 64.6 1.37 78.9
WBC数(×109) 8.78 1.93 5.86
％单核细胞 32.46 71.1 14.7
％淋巴细胞 64.54 22.17 82.88
％粒细胞 0.0151 2.96 1.36
9
未裂解(×10) 73.4 3.30 84.8

[0118] 实施例8：从TFF分离的细胞中产生树突细胞

[0119] 在本实施例中，使用TFF分离纯化的细胞群在用于从单核树突前体细胞成熟为树突细胞的标准条件下培养。使用TFF分离的细胞群约含58.6％单核细胞、22％淋巴细胞以及12.5％粒细胞。此细胞混合物被引导进入组织培养袋X-Vivol 5培养基以及IL-4和GM-CSF各500U中。5天后，约50％的细胞被收获、对DC标志物染色并且使用流式细胞术分析。其他约50％的细胞暴露于成熟试剂、BCG(2.8×105pfu/ml)和IFNγ(1000U/ml)。24小时后，也收获那些细胞并且以同样的方式分析。表3显示了这些分析的结果。提供的数值代表树突细胞中阳性细胞即对大细胞分选(gating)后的百分率。

[0120] 表3.未成熟和成熟树突细胞的细胞表面标志检测

[0121]标志未成熟DC(％阳性)成熟DC(％阳性)
CD14 10 2
标志未成熟DC(％阳性)成熟DC(％阳性)
CD11c 99 96
CD1a 70 69
CD80 75 74
CD83 7 34
CD86 90 89
CD541 100 98
MHCII1 56 72

[0122] 1这些标志显示，成熟后阳性细胞的平均荧光强度(MFI)显著升高

[0123] 根据流式细胞术分析的前向光散射和侧向散射参数，确定了未成熟树突细胞群包含约71％活DC、21％淋巴细胞和7％其他细胞(主要为未知起源的死细胞)。成熟树突细胞群包含61％活DC、21％淋巴细胞和15％其他细胞。这些结果证实，使用使树突细胞成熟的标准培养条件，可以将由TFF直接从白细胞去除术材料纯化的单核细胞有效的转变成为DC。

[0124] 实施例8：在玻璃珠上分离单核细胞

[0125] 根据前面的任何实施例，通过TFF分离富集的白细胞群。在TFF过程中，用含1％热灭活自体同源血浆的AIM-V培养基(Gibco-LifeScience)(结合介质(media))取代缓冲液。玻璃珠(20克)经过在结合介质中洗涤2次而制备，继而置于60ml玻璃注射器中，保持珠子形成柱床。(作为选择，可以使用Plastic Plus微载体珠(来自SoloHill Engineering，Inc.经过处理的苯乙烯共聚物珠子)，或者HilleX microcarrier beads(来自SoloHill Engineering，Inc.的苯乙烯共聚物珠子))。结合介质随后通过重力流动从柱床干燥。将从TFF富集的白细胞群施加于柱上，收集任何流过液。加入结合介质来提供柱床上的液体薄层。带有细胞的柱子在37℃温育30分钟。

[0126] 温育后，打开柱子端口，收集流过液。柱床然后用结合介质洗涤6次(35ml/次)，结合介质通过柱子端口被多次给予和去除，来使珠子的温和重悬。这些洗涤后使用磷酸盐缓冲液(“PBS”)洗涤两次。对所有的洗涤以及最初的流过液进行细胞计数，并使用前向和侧向散射FACS分析对细胞计数进行分析，来测定单核细胞百分率。完成洗涤后，使用PBS/0.4％EDTA(w/v)将结合的单核细胞从珠子上洗脱，继之以再一次PBS洗涤。在这些级分中获得的细胞采用与洗涤得到的细胞同样的方式分析。合并富含单核细胞的级分。

[0127] 实施例9：从玻璃珠洗脱的单核细胞向树突细胞的分化

[0128] 单核细胞用30ml的PBS洗涤2次，重悬于培养基中(含有500UGM-CSF/ml和500U白介素-4/ml的X-VIVO 15(BiowhittakerCorp.))。一部分(2/3)细胞悬液然后转移入旋转生物反应器(Synthecon)中，在含有5％CO2的潮湿环境中，于37℃培养6天。培养后，根据细胞大小、粒度和细胞表面标志，细胞群包括70％未成熟树突细胞。

[0129] 实施例10：使用前列腺特异性抗原激活未成熟树突细胞

[0130] 如前面的实施例所述，从前列腺癌患者分离单核细胞。单核细胞于组织培养袋中在添加GM-CSF和白介素-4(各500U/ml)的X-VIV015组织培养基中，于37℃培养6天。然后得到的未成熟树突细胞暴露于加入培养基中的前列腺特异性抗原(PSMA)(按照U.S.Patent No.5,788,963所述分离)。然后使用成熟剂将未成熟树突细胞分化形成成熟树突细胞。将成熟(活化的)树突细胞加入到T细胞增殖实验。T细胞培养在补充5％CO23
的37℃潮湿孵育器中孵育5天，然后加入1μCi H-胸苷/微孔板孔。孵育24小时后，细胞在半自动细胞收获仪(Skatron，Stevina，Va.)中收获，测定收集细胞的放射活性。T细
3
胞增殖通过测量平均 H-TdR掺入评定。

[0131] 实施例11：培养的成熟树突细胞呈递抗原的能力

[0132] 为了评价培养的成熟树突细胞向来自同一个患者的自身T细胞呈递抗原并刺激自身T细胞的能力，如上所述进行T细胞增殖实验(实施例10)。在这些实验中，破伤风类毒素被选用为代表抗原，来测定患者的记忆T细胞是否可以在体外被激活。与患者树突细胞和破伤风类毒素培养的自身T细胞将以显著高于基础(缺乏树突细胞)的水平、以及显著高于与成熟(活化的)树突细胞且没有破伤风类毒素(即显示自身混合淋巴细胞反应)的水平增殖。因此，破伤风类毒素通过树突细胞的呈递有利于T细胞增殖。

[0133] 实施例12：刺激自体T细胞

[0134] 对前列腺癌特异的成熟(活化的)树突细胞被用于刺激前列腺癌患者的自身T细胞。通常按照U.S.Patent No.5,788,963(此处引用其公开内容作为参考)所述，在T细胞增殖实验中，使用转移性前列腺癌细胞系LNCaP细胞的粗细胞裂解液作为代表性前列腺癌3
抗原。当成熟活化树突细胞和LNCaP裂解液都包括在T细胞培养中的时候，观察到 HTdR掺入显著增加。

[0135] 实施例13：将刺激过的自体T细胞给予受试者

[0136] 从受试者通过白细胞去除术制备T细胞。将T细胞与成熟活化树突细胞接触。树突细胞与转移性前列腺癌细胞系LNCaP细胞的粗细胞裂解液接触后成熟。在接触后培养并7 9
扩增T细胞和树突细胞。扩增的活化T细胞以每剂约10 至5×10 个细胞的剂量给予受试者。

[0137] 实施例14：单核细胞向CD34+干细胞的转化

[0138] 外周血中CD34+细胞的百分率极低，范围约0.01％至约0.1％。CD34+细胞被公认为成功的造血功能移植所必须的细胞型。单核细胞可以使用上文所述的设备以及方法从外9
周血分离，产生1-2×10 单核细胞。这些细胞然后可以在含有50ng/ml M-CSF的含胎牛血+
清的培养基中培养，来产生CD34 细胞。培养必须在非粘附环境中进行，例如培养+
袋。在标准聚苯乙烯组织培养瓶中培养不会发育为CD34 细胞。对培养中的大细胞分析显+
示，于大的粒度范围内发现CD34 细胞。

[0139] 表4.M-CSF培养后CD34在单核细胞的表达

[0140]CD34+细胞百分比
培养袋中培养 21
分选大细胞 58
瓶中培养 6
分选大细胞 11

[0141] 使用此方法制备的CD34+细胞可以用于移植，来重建受者骨髓，或者可以进一步在其他细胞因子存在下培养，来产生内皮细胞用于治疗，例如心肌梗塞等。

[0142] 此处提供的实施例意在举例说明但不是限制本申请的发明的范围。本发明的其他变化对于本领域的普通技术是显而易见的，并包括在附加权利要求中。所有出版物、专利、专利申请和其他参考书目在此列出，并同样在此引用作为参考。

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