一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒及其应用
阅读：1029发布：2020-09-12
专利汇可以提供一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种猪线粒体基因组靶向序列捕获 试剂 盒 及其应用，该试剂盒包括靶向猪线粒体基因组序列的捕获探针，所述的捕获探针由 生物 素标记的核苷酸序列组成，核苷酸序列如SEQ ID NO：1-106所示，获取猪线粒体基因组序列的方法包括以下步骤：1）提取猪的基因组DNA；2）构建猪的全基因组文库；3）与捕获探针液相杂交、测序、序列拼接，即可获取猪线粒体基因组序列，该方法尤其适用于靶向捕获猪古DNA中线粒体基因组序列，其灵敏度高，特异性强，且 稳定性 好，与核酸文库结合捕获效率更高， 覆盖 度能达到99.99%，且检测成本低。，下面是一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒及其应用专利的具体信息内容。
1.一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒，其特征在于，包括猪线粒体基因组序列的捕获探针，所述的捕获探针由生物素标记的核苷酸序列组成，核苷酸序列如SEQ ID NO：
1-106所示。
2.一种靶向捕获猪线粒体基因组序列的新方法，包括以下步骤：
1)提取猪的基因组DNA；
2)构建猪的全基因组文库：
A.末端补平；
B.接头连接：将SOLiD接头1
5′-TGTAACATCACAGCATCACCGCCATCAGT CT-3′和接头2
5′-GACTGATGGCGCACTACGACACTACAATGT-3′与末端补平的DNA连接；
C.回收纯化含SOLiD接头的DNA；
D.采用切口平移法进行文库模板量的平衡线性扩增，正向引物：
5′-TGTAACATCACAGCATCACCGCCATCAGTCT-3′和反向引物
5′-GACTGATGGCGCACTACGACACTACAATGT-3′；
3)利用权利要求1所述的猪线粒体基因组靶向捕获探针进行捕获测序：
A.液相杂交：取制备好的猪基因组文库，先加入鲑鱼精子DNA、人胎盘Cot-1DNA进行封闭反应，然后与生物素化RNA探针杂交，磁珠分选和洗脱纯化；
B.捕获测序：取杂交捕获的DNA，进行PCR扩增反应，引物序列为：
正向引物5'-CGCTCAGCGGCCGCAGCATCACCGCCATCAGT-3'和
反向引物5'-CGCTCAGCGGCCGCGTCGTAGTGCGCCATCAGT-3'，纯化回收的DNA进行测序，对测序序列拼接，即得到线粒体基因组序列。
3.根据权利要求2所述的靶向捕获猪线粒体基因组序列的新方法，其特征在于，将古代猪遗留的牙齿或骨骼进行打磨，去除表面污染物后再提取基因组DNA。
4.权利要求1所述的猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒在获取猪古DNA线粒体基因组序列中的应用。
一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 一般说来，人类历史上的农业革命主要包括栽培作物的产生和驯化动物的起源。系统性探索家畜的起源，对于了解家畜的发展史、揭示家畜对人类生活方式的影响至关重要。众所周知，家猪(Sus scrofa)缘自野猪的驯化。目前，野猪分布区域集中在：1)欧亚大陆的南部，即分布于欧洲、北非和亚洲中部天山山脉的欧洲野猪；2)亚洲，即分布于中国大陆、台湾、爪哇、苏门答腊和新几内亚的亚洲野猪(胡耀武和王昌燧，2004年，家猪起源的研究现状与思考)。相比之下，家猪的分布范围要大得多，几乎遍及全世界，其品种也千差万别、多种多样。家猪与野猪在形态和习性上的差别明显，这引发了我们的思考：性情凶猛的野猪是如何驯化为形态、习性迥然不同的家猪呢？家猪起源于何时、何地？系单一起源，抑或多个起源呢？诸如此类，皆为学术界长期关注的问题。多年来，国内外学者从不同角度，孜孜以求地探索家猪的起源与驯化，业已取得颇为丰硕的成果，然而，诸如驯化之初，鉴别家猪和野猪等关键问题，至今仍茫然无绪。
[0003] 自考古学诞生以来，发掘成果日新月异、层出不穷，为探索家猪起源提供了颇为翔实的实物资料。猪的驯化是中国古代最伟大的创造发明之一。有报道指出，经过5年田野考察与研究，湖北省文物考古研究所罗运兵博士将中国家猪的起源时间，前推至距今9000年左右。其撰写的《中国古代猪类驯化、饲养与仪式性使用》一书，立足于猪骨遗存本身，运用动物考古学和考古学的理论与方法，并借助相关学科的手段和成果，侧重量化分析，对我国古代猪类遗存进行了多维视角的系统研究。
[0004] 通过与考古学结合，借助分子生物学方法，为研究家猪起源开辟了另一重要途径。分子生物学理论指出，长期的进化道路上，生物的DNA既保持稳定遗传，又容忍偶然变异产生。显然，DNA的遗传稳定性，保证了亲代与子代之间的遗传连续性；而DNA的变异，又使得子代与亲代出现差异，导致了物种的进化。研究表明：突变导致的DNA中核苷酸序列的改变，与时间的累积成正比，即时间越长，DNA中核苷酸序列的改变越大。这种变化的速率是恒定的，两种生物分离的时间越长，其分子的差异则越大，这就是所谓的“分子钟”。这样，若探明现存物种DNA的核苷酸序列，便可望估计它们共同祖先的分离时间，即其物种的起源。由于动物体内的线粒体(Mitochondrial DNA,mtDNA)具有母系遗传、变异速率快、拷贝数目多的特点，故常将其作为研究物种系统进化的首选。
[0005] 国内外对古代猪的线粒体DNA研究主要采用PCR扩增的方法，如王志等人通过提取DNA、PCR扩增和测序，结合现代不同品种家猪、野猪及黄河中下游猪古DNA序列信息，系统分析了我国黄河流域家猪的起源驯化关系(王志等，利用古DNA信息研究黄河流域家猪的起源驯化，2012年，科学通报)。其通过实验共获得5个古代猪样本mtDNAD-loop基因的179bp的DNA序列,包括2个湖北青龙泉遗址样本和3个青海喇家遗址样本。因为古DNA分子完整性受保存环境影响，容易出现碎片化，导致PCR技术难以扩增目的片段。如王志等人研究仅能获得179bp的基因片段。为获取尽可能长的猪古DNA线粒体基因组序列，本发明中，我们提供了一种可避免现代动物基因组污染的古DNA提取方法，其次是设计和合成了猪线粒体基因组捕获芯片，再利用基于核酸探针液相杂交捕获测序技术和生物信息学手段，可最大限度获得猪古DNA线粒体基因组的序列信息。通过实验证明，本发明提供的方法不受古DNA碎片化影响，其检测灵敏度高，获取的古DNA线粒体基因组全长序列覆盖度高。本发明的方法不仅可进行猪种起源和演化研究，而且可用于筛查现代猪线粒体基因组序列中核苷酸序列变异，也可为调查猪遗传资源分布和猪源性食品成分检测提供新的手段。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒，该试剂盒可靶向捕获完整的猪线粒体基因组序列，检测灵敏度高，样本起始量低至纳克级，采用高通量测序时，平均测序深度为300x，覆盖度高达99.99％，且检测成本低。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种获取猪线粒体基因组序列的新方法，利用捕获探针与猪的基因组文库液相杂交、测序，可最大限度获得猪线粒体基因组的全长序列。
[0008] 本发明的再一个目的在于提供一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒在获取猪古DNA线粒体基因组序列中的应用。
[0009] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 一种猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒，包括猪线粒体基因组序列的捕获探针，所述的捕获探针由生物素标记的核苷酸序列组成，核苷酸序列如SEQ ID NO：1-106所示，制备方法如下：
[0011] 1)从NCBI公共数据库下载174个不同品种或个体的猪线粒体基因组全长序列，对这些序列进行比对提取保守区共有序列，进而与非保守序列进行全长拼接；
[0012] 2)针对比对后保守和非保守区域设计特异RNA探针，每条探针长度为151bp，可靶向不同品种的猪线粒体基因组探针集合共有106条，序列如SEQ ID NO：1-106所示；
[0013] 3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚合酶链式反应或转录的方法扩增出大量带有生物素标记的探针，由此制作特异的猪线粒体基因组序列捕获探针。
[0014] 一种获取猪线粒体基因组序列的新方法，包括以下步骤：
[0015] 1)提取猪的基因组DNA；
[0016] A.取猪牙齿或骨骼的特定部位去除污染表层之后磨成粉末；
[0017] B.在上述骨粉中加入裂解液和蛋白酶K分别孵育30min，进行预消化之后离心去掉上清液，再加入裂解液和蛋白酶K进行正式消化24h，所述的裂解液含有0.5M EDTA和0.5％的SDS；
[0019] 2)构建猪的全基因组文库
[0020] A.末端补平；
[0021] B.接头连接：将SOLiD接头1(5′-TGTAACATCACAGCATCACCGCCATCAGTCT-3′)和接头2(5′-GACTGATGGCGCACTACGACACTACAATGT-3′)与末端补平的DNA连接；
[0022] C.回收纯化连接含SOLiD接头的DNA；
[0023] D.采用切口平移法进行文库模板量的平衡线性扩增，正向引物：5′-TGTAACATCACAGCATCACCGCCATCAGTCT-3′和反向引物5′-GACTGATGGCGCACTACGACACTACAATGT-3′；
[0024] 3)猪线粒体全基因捕获探针捕获测序
[0025] A.液相杂交：
[0026] 取制备好的猪基因组文库，先加入鲑鱼精子DNA、人胎盘Cot-1 DNA进行封闭反应，然后与生物素化RNA探针杂交，磁珠分选和洗脱纯化；
[0027] B.捕获测序：取杂交捕获的DNA，进行PCR扩增反应，正向引物：5'-CGCTCAGCGGCCGCAGCATCACCGCCATCAGT-3'和反向引物：5'-CGCTCAGCGGCCGCGTCGTAGTGCGCCATCAGT-3'，纯化回收的DNA进行测序，对测序序列拼接，即得到线粒体基因组序列。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0029] 1、本发明公开了一种获取猪线粒体基因组序列的新方法，并提供了适用于从古代猪遗留的牙齿或骨骼来源样品中提取DNA的方法。
[0030] 2、本发明提供的猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒可靶向捕获完整的猪线粒体基因组序列，该方法检测灵敏度高，样本起始量低至纳克级，采用高通量测序时，平均测序深度为300x，覆盖度高达99.99％，且检测成本低。附图说明
[0031] 图1.猪古DNA提取和线粒体捕获测序技术原理图
[0032] 图2.猪线粒体基因组捕获芯片探针设计序列来源
[0034] 图4.一例用1970年代的猪牙齿标本提取DNA和PCR扩增线粒体Cytb和D-loop基因电泳检测图，Sample-1为猪牙齿样品提取的古DNA，Sample-2为重复样品。
[0035] 图5.来自1970年代的猪牙齿标本的线粒体Cytb基因测序序列比对图(100％匹配)[0036] 图6.来自1970年代的猪牙齿标本的线粒体D-loop基因测序序列比对图(99％匹配，G-A变异)
[0037] 图7.一例来自1000年前的古代猪牙齿样本(编号Novgozod-1000AD)
[0038] 图8.一例来自1000年前的古代猪牙齿样本提取的DNA电泳检测图
[0039] 图9.以来自1000年前的古代猪牙齿样本提取的古DNA为模板PCR扩增线粒体D-loop基因电泳检测图
[0040] 图10.来自古代猪牙齿或骨骼的部分DNA样品浓度和总量
[0041] 图11.来自现代和古代猪样品的线粒体基因组序列捕获测序数据
[0042] 图12.现代猪线粒体基因组测序序列及组装图
[0043] 图13.古代猪线粒体基因组测序序列及组装图
[0044] 图14.古代猪同一个体不同牙齿线粒体基因组两次测序比较(样品1)
[0045] 图15.古代猪同一个体不同牙齿线粒体基因组两次测序比较(样品2)
[0046] 图16.古代猪同一个体不同牙齿线粒体基因组两次测序比较(样品3)
[0047] 图17.现代猪线粒体D-loop基因序列多态性分析
[0048] 图18.古代猪线粒体D-loop基因序列多态性分析
[0049] 图19.表征古代猪牙齿或骨骼样品来源的系统发育树
具体实施方式
[0050] 在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
[0051] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0052] 虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
[0053] 下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0054] 实施例1
[0055] 一种靶向猪线粒体基因组序列捕获探针的制备方法，其步骤是：
[0056] 1、从NCBI公共数据库下载174个不同品种或个体的猪线粒体全长序列(序列来源见图2)，对这些序列进行比对提取保守区共有序列，进而与非保守序列进行全长拼接；
[0057] 2、针对比对后保守和非保守区域设计捕获RNA探针，每条探针长度为151bp，可靶向不同品种的猪线粒体基因组探针集合共有106条，探针序列如SEQ ID:1-106所示，由安捷伦公司合成所述的RNA探针；
[0058] 3、基于安捷伦寡核苷酸合成技术的液相序列捕获系统的“SurePrint”原位合成技术，在芯片上大量合成上述106条151mer的寡核苷酸探针，再经PCR和转录后得到足够量的生物素标记的RNA“诱饵”，巧妙建立RNA-DNA的液相杂交系统，由此制作猪线粒体基因组靶向序列捕获试剂盒，具体实验步骤为：
[0059] 1)用100μL 0.1X TE buffer(10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA,pH 8.0)稀释106条151mer的寡核苷酸探针库并混合均匀，从中取4μL稀释的探针混合液，加入40nmol dNTP，PCR引物A：5′-CTGGGAATCGCACCAGCGTGT-3′和B：5′-CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3′各60pmol，以及5U的热启动酶(Taraka)，最后补水至总体积为100μL进行PCR反应，PCR反应条件如下：
94℃5min，然后94℃20s，55℃30s，72℃30s进行10-18个循环；72℃再延伸5min；最后4℃
2min；
94℃5min，然后94℃20s，55℃30s，72℃30s进行10-18个循环；72℃再延伸5min；最后4℃
2min；
[0060] 2)反应完成之后，对PCR产物进行超滤浓缩，凝胶电泳，并用QIAquick gel extraction试剂盒(Qiagen)进行切胶回收；
[0061] 3)为了引入T7启动子序列，取1μL上述纯化产物，将PCR引物A换成T7-A(5′-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGATCGCACCAGCGTGT-3′)，按照上述PCR反应体系和条件进行再次扩增，以及对产物进行纯化回收；
[0062] 4)取1μg纯化产物作为模板，在含有0.5mM ATP，CTP，GTP，0.4mM UTP和0.1mM Biotin-16-UTP(Roche)的100uL MAXIscript T7 transcription(Ambion)中进行转录，反应条件为：37℃，90min；
[0063] 5)通过凝胶过滤和TURBO DNase(Ambion)去除不能结合的核苷酸和DNA模板，剩下的即为生物素化的RNA诱饵，加入1U/μL SUPERase-In RNase inhibitor(Ambion)并储存在-80℃备用。
[0064] 实施例2
[0065] 一种获取猪线粒体基因组序列的新方法，包括以下步骤：
[0066] 1、从古代猪遗留的牙齿或骨骼中提取DNA，其步骤是：
[0067] 1)使用电钻等工具取下牙齿的牙根部分，并在其表面磨掉约1mm，以去除污染表层；
[0069] 3)放入铜质捣药罐中，用捣药杵均匀捣碎，将牙根磨成粉状；
[0070] 4)称取约500mg的粉末到2mL离心管中(此处应设环境对照)，加入1mL裂解液(0.5M EDTA，0.5％SDS)和20μL Proteinase K，在55℃恒温摇床中预消化30min之后取出；
[0071] 5)1000rpm离心8min，倒掉上清液，并在每管中重新加入1mL裂解液(0.5M EDTA，0.5％SDS)和20μL Proteinase K，在55℃恒温摇床中进行正式消化24h；
[0072] 6)1000rpm离心8min，吸取上清液到15mL离心管中，加入5倍体积的Buffer PB(QIAquick PCR Purification Kit)，上下颠倒，使其混合均匀，接下来的步骤按照QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)试剂盒的说明书进行；
[0073] 7)取750μL混合液加入到QIAquick硅离心柱中，13 000rpm离心1min，弃过滤液，重复数次，直至混合液全部通过离心柱；
[0074] 8)加入750μL Buffer PE到离心柱进行洗涤，13 000rpm离心1min，弃滤液；
[0075] 9)13 000rpm离心1min，进行空转，以除去残留的酒精；
[0076] 10)最后一步加入100μL Buffer EB，55℃孵育10min之后，用13000rpm离心1min进行洗脱，用1.5mL EP管收集DNA，保存于-20℃备用。
[0077] 2、构建猪全基因组文库
[0078] 1)末端补平：
[0079] 分别取100μL基因组DNA、8μL dNTPs、2μL End Polishing酶Ⅰ(100U/μL，Agilent)、16μL End Polishing酶Ⅱ(5U/μL，Agilent)，然后加灭菌水补齐到总体积200μL，在25℃恒温下孵育30min进行反应，然后用PureLink PCR纯化试剂盒(Invitrogen)纯化DNA；
[0080] 2)接头连接：
[0081] 取SOLiD接头1：5′-TGTAACATCACAGCATCACCGCCATCAGTCT-3′50μmol/L和接头2：5′-GACTGATGGCGCACTACGACACTACAATGT-3′50μmol/L各26μL(Applied Biosystems)，上一步已纯化的DNA 48μL，T4 DNA连接酶10μL(50U)，然后加灭菌水补齐至总体积200μL，在室温下孵育15min之后，用PureLink PCR纯化试剂盒(Invitrogen)纯化DNA；
[0082] 3)DNA片段回收：
[0083] 采用预制的2％SizeSelect Gel(Applied Biosystems)，放到E-Gel iBase上，取上一步已纯化的DNA分3份各20μL加入上样孔，分子量对照用0.2μg的50bp ladder，无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满，吸出进入样品回收孔的150～200bp之间的DNA片段；
[0084] 4)缺口平移：
[0085] 回收的纯化片段需要采用切口平移法进行文库模板量的平衡线性扩增，每100μL回收样品加400μL的Master Mix(Agilent)，正向引物：5′-TGTAACATCACAGCATCACCGCCATCAGTCT-3′和反向引物5′-GACTGATGGCGCACTACGACACTACAATGT-3′，按以下程序进行反应：72℃20min，95℃5min；然后95℃15s，54℃15s，70℃1min进行10-12个循环；70℃再延伸5min；最后4℃2min；反应完成之后用PureLink PCR纯化试剂盒(Invitrogen)纯化及定量，并取1μL样本产物进行Flash Gel(2.2％，Lonza公司)电泳10min，进行检测。
[0086] 3、利用猪线粒体基因组靶向捕获探针进行捕获测序
[0087] 1)液相杂交：
[0088] 取制备好的猪基因组文库500ng，加上2.5μg鲑鱼精子DNA(Stratagene)以及2.5μg人胎盘Cot-1 DNA(Invitrogen)，补水至总体积为7μL并混合均匀后，放入PCR仪中95℃5min，65℃5min进行孵育，然后加入已在65℃预热的13μL 2×hybridization buffer(10×SSPE,10×Denhardt's,10mM EDTA和0.2％SDS)和6μL 500ng生物素化RNA(实施例1所述的含有生物素标记的RNA探针，所述探针序列如SEQ ID:1-106所示)与20U SUPERase-In的混合物，在65℃恒温条件下使文库DNA和RNA探针充分杂交66h；反应完成之后，将杂交混合物加入到已经洗涤过3遍，并在溶液(200μl 1M NaCl,10mM Tris-HCl,pH 7.5,1mM EDTA)中重悬的500ng(50μl)M-280链霉素标记的磁珠Dynabeads(Invitrogen)中，20℃下吸附30min；
然后用0.5mL 1×SSC/0.1％SDS在20℃洗涤15min，随后用0.5mL预热的1×SSC/0.1％SDS在
65℃下洗涤3次(洗涤时将磁珠重悬)，每次10min；杂交选择的DNA用50μL 0.1M NaOH在20℃下洗脱10min，将上清液转移到含有70μL 1M Tris-HCl，pH＝7.5中进行中和，然后在QIAquick MinElute column(Qiagen)离心柱中脱盐浓缩，最后用20μL Buffer EB洗脱，保存待用；
然后用0.5mL 1×SSC/0.1％SDS在20℃洗涤15min，随后用0.5mL预热的1×SSC/0.1％SDS在
65℃下洗涤3次(洗涤时将磁珠重悬)，每次10min；杂交选择的DNA用50μL 0.1M NaOH在20℃下洗脱10min，将上清液转移到含有70μL 1M Tris-HCl，pH＝7.5中进行中和，然后在QIAquick MinElute column(Qiagen)离心柱中脱盐浓缩，最后用20μL Buffer EB洗脱，保存待用；
[0089] 2)捕获测序：
[0090] 取杂交捕获的DNA 4μL，在200μL Phusion polymerase master mix(Agilent)的作用下进行PCR扩增反应14-18个循环，正向引物：5'-CGCTCAGCGGCCGCAGCATCACCGCCATCAGT-3'和反向引物：5'-CGCTCAGCGGCCGCGTCGTAGTGCGCCATCAGT-3'各60pmol，以及5U的热启动酶(Taraka)，最后补水至总体积为100μL进行PCR反应，PCR反应条件如下：94℃5min，然后94℃20s，55℃30s，72℃30s进行10-18个循环；72℃再延伸5min；最后4℃2min；纯化回收的DNA按照lllumina的标准测序流程，在lllumina HiSeq2000测序仪上进行测序，获得高通量测序数据；
[0091] 3)生物信息学分析：
[0092] 所述的线粒体基因组序列组装分析流程具体包括如下步骤：(a)测序仪获得原始短序列(Raw data)；(b)先用FastQC进行质控，根据质量报告用Trimmomatic去除测序序列中的接头和低质量的测序数据；(c)将clean序列定位或拼接到猪的线粒体基因组相应位置；(d)统计测序结果短序列的数量，目标区域覆盖的大小和平均深度等。
[0093] 实施例3
[0094] 制定有效获取猪古DNA线粒体基因组序列的技术方案，用于比较传统PCR扩增方法与本发明的线粒体基因组靶向捕获新方法。
[0095] 古DNA是指古代生物遗体或遗迹中残存的DNA片段，目前古DNA研究主要使用考古学标本，一般选取保存完整、没有裂痕的牙齿和肢骨，注意防止污染。在实验室检测阶段，要经历样本评估、处理、DNA提取、PCR扩增、PCR产物的测序、数据真实性检验和数据处理分析等步骤。由于动物体内的线粒体(Mitochondrial DNA,mtDNA)具有母系遗传、变异速率快、拷贝数目多的特点，故常将其作为研究物种系统进化的首选。为了获取古代猪DNA线粒体基因组序列，我们分别设计和测试了两种实验方案，分别是：
[0096] 方案(一)：使用10％次氯酸钠洗涤猪牙齿，用电动工具打磨牙齿表层，放置于铜质捣药罐中研磨，称量和转移牙齿粉末加入裂解液，经过预消化和正式消化，然后通过柱离心法，经多次洗涤和吸附，最后洗脱即可获取微量的古DNA溶液，基因组DNA提取方法如实施例2步骤1所述(提取古DNA在专门的古DNA提取实验室进行，一次仅提取一个样品，提取完毕后，将实验室清扫干净，UV照射12h后再提取下一个样品，可最大限度减少现代DNA和不同实验样品的交叉污染)。之后通过核酸浓度测定仪，取1μL DNA样品测定核酸浓度，并制备1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。再采用常规的PCR扩增和Sanger测序技术，可获取猪古DNA线粒体目标基因部分序列。
[0097] PCR扩增的具体实验流程为：取已提取的DNA或古DNA 3μL，上下游引物各0.6μL(10μM)，rTaq 0.3μL(Taraka)，10xBuffer 3μL，dNTP 2.4μL，然后加入灭菌水20.1μL到PCR反应管并混合均匀，终体系为30μL。反应条件为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s进行32个循环；72℃再延伸5min；15℃2min。PCR反应完成之后，取PCR产物3μL，与1μL含有Gel Red染料的10xLoading buffer(Taraka)混合，在预制的2％SizeSelect Gel(Applied Biosystems)中上样，分子量对照用DL2000 DNA marker(Taraka)，120V恒压下电泳约20min，最后在照胶仪中查看条带信息。
[0098] 方案(二)：获取猪古DNA的实验流程与方案(一)相同，不同之处在于，在获得微量猪古DNA后，改用线粒体基因组靶向捕获测序技术，即通过实施例1设计和合成的靶向猪线粒体基因组的特异RNA探针，与基因组DNA进行杂交，将线粒体的DNA富集后，使用主流的Illumina,Life Technology等测序平台进行高通量测序，然后进行生物信息学策略即可获得猪古DNA线粒体基因组序列(图1)，具体方法参见实施例2。
[0099] 基于以上两种实验策略，通过设置对比实验，我们最终确定方案(二)可最大限度获取猪古DNA线粒体基因组序列，具体实验对比结果见下述实施例4、5。值得一提的是，目标区域捕获测序采用的是液相芯片捕获测序技术，其与核酸文库结合捕获效率更高，200X-1000X测序深度，平均覆盖度接近100％。探针参考了174条来自NCBI数据库的不同驯化猪和野猪的线粒体基因组全长序列(图2)，在综合考察不同猪的共有或特异序列基础上，再从热力学角度进行全基因组水平的猪线粒体探针设计和特异性评估，以及基于热力学的二级结构(如二聚体、发卡结构等)分析，还原真实生化反应环境，进而设计出特异性捕获探针。因此方案(二)采用的探针可靶向驯化猪或野猪不同品种，可最大限度获取未知来源的猪古DNA线粒体基因组序列。
[0100] 实施例4
[0101] 方案(一)用于获取近代及古代猪牙齿样品的线粒体基因组序列的效果：
[0102] 1、近代猪牙齿样品线粒体基因PCR扩增检测
[0103] 基于方案(一)的技术流程，我们首先测试了来自近代猪(约1970年)牙齿标本，值得一提的是，本方案提取猪牙齿DNA的过程在参考公开文献的基础上进行了改进，主要有两点：其一是采用电动工具用小砂轮打磨牙齿，不仅可除掉牙齿表面的污染物，而且可方便将坚硬的牙齿研磨成小碎片(图1c)；其次是采用铜质捣药罐，与传统的研钵相比，其内腹深，有盖，铜质锤头可方便敲破坚硬的牙齿或骨骼样品，而且在研磨过程中可方便将盖合上，使得样品在一个局部封闭的小空间中操作，可有效防止样品二次污染(图3)。为防止样品交叉污染，清洗铜捣药罐遵循如下流程：次氯酸钠浸泡→清水冲洗→高温高压灭菌→UV照射→锡箔纸包装。
[0104] 按照方案(一)的操作流程，在获得猪牙齿DNA样品后，取1μL DNA样品在1％的TAE琼脂糖凝胶上进行电泳，检测结果见图4A，我们分别做了两次重复实验，发现DNA条带为弥散型，表明提取的DNA不完整，已降解。通过PCR扩增检测线粒体基因Cytb和D-loop(引物序列为：Cytb-F：5'cggaacagacctcgtagaatg 3'和Cytb-R：5'ggtttcgtgcaggaatagga 3'；D-loop-F：5'tgctagtccccatgcatataa 3'和D-loop-R：5'cctgccaagcgggttgctgg 3')，在2.5％的TAE琼脂糖凝胶上电泳，发现可检测到特异大小的目的基因条带(图4B)。进一步，将PCR产物连接进常规TA克隆载体，转化细菌和挑取单克隆菌液进行Sanger测序，如图5和图6所示，扩增的Cytb基因测序序列与参考线粒体序列100％配对，而D-loop基因测序序列与参考线粒体序列存在单个碱基的突变(G-A变异)。一般认为，Cytb是稳定基因，而D-loop是高度变异区，测序结果符合预期，表明针对近代猪的牙齿来源DNA，策略(一)的实验方案可行。
[0105] 2、古代猪牙齿样品线粒体基因PCR扩增检测
[0106] 为了进一步测试方案(一)方法是否可用来检测古代猪的牙齿样本中的线粒体基因，取一例来自俄罗斯的距今1000年的样品(图7)，按照方案(一)方法提取微量古DNA，电泳检测发现，条带为弥散型，与来自1970年近代猪的牙齿提取的DNA带型一致(图8)。接着，我们采用PCR扩增技术，以古DNA为模板，扩增线粒体D-loop基因，如图9所示，阳性对照可以扩增出目的片段，而两个重复样品的古DNA无目的条带。采用相同的方法，对其它不同年代的古DNA样品进行PCR检测，电泳检测结果均未检测到目的条带。由此可见，采用方案(一)的策略无法检测来自1000年前古代猪牙齿提取的DNA进行线粒体基因。推测原因可能是：方案(一)主要采用PCR扩增技术，其对DNA的质量要求相对高，需要线粒体DNA完整，可能仅适合检测年代近的牙齿或骨骼样品。而对于古DNA，线粒体基因组可能早已出现碎片化，导致PCR引物无法与特定序列锚定，因此无法正常进行PCR扩增反应。
[0107] 实施例5
[0108] 方案(二)用于获取近代及古代猪牙齿样品的线粒体基因组序列的效果[0109] 鉴于实施例4中采用方案(一)的方法，未能成功检测到来自1000年前的古代猪牙齿样品中的线粒体DNA基因。我们继续测试实施例3中方案(二)的方法，分别提取来自俄罗斯的多种古代猪的牙齿样品的微量古DNA，通过核酸测定仪测定了古DNA浓度，由图10可见，样品浓度相对较低，大致为19～66ng/μL，每个样品总体积为100μL。通过实施例2所述的液相捕获测序，我们获得了4例现代猪和12例古代猪的线粒体基因组序列(图11)。现代猪的样品主要来自俄罗斯，越南和我国新疆地区。古代猪样品主要来自于俄罗斯，具体年代见图11。4例现代猪的测序结果显示，通过方案(二)的方法，均可获取99.9％的猪线粒体基因组序列。值得一提的是，古代猪的样品有3例分别进行了2次建库和测序，取的是同一样品不同牙齿。由图11可见，样品1第一次获取的线粒体基因组序列覆盖度为27.1％，而第二次测序仅为4.5％；样品2第一次获取的线粒体基因组序列覆盖度为61.82％，而第二次测序仅为
5.68；样品3第一次获取的线粒体基因组序列覆盖度为88.91％，第二次测序为99.9％，基本获取了该样品DNA线粒体基因组全长序列。另外我们还发现编号为mtgDNA-60样本也获得了全长线粒体基因组序列，由此可见，方案(二)的方法不仅可以获取近代猪样品的线粒体基因组序列，还可以获得猪古DNA的线粒体基因组全长序列。
5.68；样品3第一次获取的线粒体基因组序列覆盖度为88.91％，第二次测序为99.9％，基本获取了该样品DNA线粒体基因组全长序列。另外我们还发现编号为mtgDNA-60样本也获得了全长线粒体基因组序列，由此可见，方案(二)的方法不仅可以获取近代猪样品的线粒体基因组序列，还可以获得猪古DNA的线粒体基因组全长序列。
[0110] 实施例6
[0111] 现代和古代猪线粒体基因组测序及组装
[0112] 按照实施例3方案(二)的方法，我们分别获得了16例猪线粒体DNA基因组部分或全长序列(图11)。进一步，我们通过生物信息学分析，对其中一例现代猪的线粒体DNA基因组序列进行组装，发现可拼接成全长线粒体基因组序列(图11)。再选取一例古猪的线粒体DNA基因组序列进行组装，发现编号为aDNA-45的样品也可拼接成全长线粒体基因组序列。对古代猪同一个体不同牙齿线粒体基因组两次测序比较，3例样品(图14，15，16)中两次获取的古DNA的序列长度不一致，覆盖度不同。可见同一样品不同牙齿或部位提取的DNA可能影响获取的线粒体DNA基因组序列组成。
[0113] 测序数据具体分析流程为：获得测序数据之后，先用FastQC进行质控，根据质量报告用Trimmomatic去除接头并过滤掉低质量的数据，然后用猪的线粒体全长序列作为index用bowtie2进行比对并记录比对率，生成的bam文件用samtools进行排序并转成vcf文件，最后在IGV中查看，并将生成的consensus序列复制出来，转化成fasta格式，在Mega中进行注释并进行进化树分析。
[0114] 实施例7
[0115] 现代和古代猪线粒体D-loop基因序列多态性分析
[0116] 线粒体DNA(mtDNA)是核外遗传物质，呈共价闭合的环状双链结构。与核基因组相比，其基因组结构简单、进化速度快。线粒体基因组包括编码区和非编码区，线粒体控制区(D-loop)属于非编码区，是高突变区，其碱基替换率比mtDNA其他区域高5～10倍，位于mtDNA的tRNA-pro和tRNA-phe之间。检测D-loop这一区域DNA序列的变异，了解碱基颠换、转换、缺失/插入等造成的差异，有助于了解DNA复制、转录的机制和进化规律。利用实施例5中获取的现代猪和古代猪的线粒体基因组序列，我们对D-loop基因序列多态性进行了分析，如图17所示，4例现代猪的D-loop基因序列存在碱基变异。同样对12例猪古DNA的线粒体D-loop基因序列的多态性进行了分析，仅7例样品获得D-loop基因的部分或全长序列，而且序列比对发现碱基组成一致。由此可见，利用方案(二)可获取大部分古DNA的D-loop基因序列。
[0117] 实施例8
[0118] 古代猪牙齿或骨骼来源样品线粒体DNA基因组序列进化分析
[0119] 利用实施例4和方案(二)方法获取的12例古代猪线粒体DNA基因组序列，利用生物信息学策略，我们构建了进化树，由图19可见，来自俄罗斯的古DNA样品基本聚类在一起，中间仅含有一例瑞典猪的分支。从地理位置看，俄罗斯和瑞典均属于欧洲。由此可见，通过方案(二)方法获取的古代猪的线粒体DNA基因组部分或全长序列，通过进化分析属于欧洲猪分支，与来自中国地方品种猪显著不同，进一步表明该方法获取的序列可靠。
[0120] 古代猪起源与进化具体分析流程为：将所得的序列和公共数据库中的序列合并成一个fasta文件，在Mega中对齐(alignment)，然后以非洲疣猪作为外群，用GTRGAMMA模型，在raxml中计算进化树，并用MrBayes进行验证。最后，对进化树的结果进行分析。
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