技术领域
[0001] 本
发明属于南极磷虾加工领域，尤其是一种具有降血脂能力的南极磷虾多肽制剂及其制备方法。
背景技术
[0002] 近年来由于海产品的高蛋白、低脂及丰富的微量元素等特点而深受人们的推崇。而南极大磷虾具有
生物量大、分布广等特点，因而越来越多的研究者开始关注磷虾的开发利用研究。
[0003] 南极大磷虾虽然个体不大，但却具有很高的营养价值，其蛋白含量丰富，可达16.31％，而脂肪含量却相对较低，仅为1.3％，因而具有开发保健食品的潜力。同时南极大磷虾含有丰富的人体所需的微量元素，其总量可达整虾的2.76％，高于日本对虾(1.6％)、蛤蜊(2.2％)等多种日常食用的海产品。
[0004] 南极大磷虾的肌肉中富含多种蛋白，其
水解产物中
氨基酸种类有18种之多，谷氨酸含量大约可占干重的11％，明显高于虎纹虾、金枪鱼、
牛肉中的谷氨酸含量，并且其包括人体必需全部8种必需氨基酸(Essential amino acid,EAA)：其中代表营养学特征的赖氨酸含量也相当可观。此外，南极大磷虾全虾中的必需氨基酸(EAA)占氨基酸总量(TAA)的45％，与非必需氨基酸(NEAA)之比大于0.8，以上两个比值恰好满足FAO/WHO推荐的理想
蛋白质模式(EAA:TAA≈40％，EAA:NEAA≥60％)，因而更适于人体的吸收和利用。
[0005] 近几年，海洋生物活性肽是食品领域的研究热点。南极磷虾含有丰富的蛋白和必需氨基酸，是制备蛋白质及生物活性肽的优质蛋白原料，具有潜在的巨大商业价值。而目前关于南极磷虾生物活性肽的研究较少。因此，有必要对南极磷虾多肽的制备及其生物活性进行深入研究。
[0006] 天然生物活性肽包括在生物体各种系统、器官、组织及细胞中存在的活性肽及生物的一些
次级代谢产物，如肽类
激素、抗生素等。这些天然生物活性肽在生物体内含量极低，提取难度非常大。所以难以大规模的生产，形成产业化，而通过添加外源酶对组织蛋白进行酶解，然后从中筛选出具有特定功能的多肽却更加经济、简便，因而目前常采用酶解制肽的方法进行多肽的制备。
[0007] 通过酶制剂生产生物活性肽有许多的优点：(1)能够大量处理渔业、
畜牧业等产生的大量废弃物，而且经过酶制剂处理后产生的废料较其他加工方法要少，有利于保护环境。(2)因为酶制剂具有高度的专一性，能够较容易地鉴定产物的组成及各种物理、化学性质。
(3)酶解法需要的条件一般是常温常压的温和条件，既能够减少
能源消耗，安全性也较好。
(4)不需要昂贵的生产设备，成本较低，便于大规模、低成本、工业
化成产。(5)原料主要来自于低价值的鱼虾、动物内脏等，原料价格低廉成本较低，有利于提高市场竞争力。
[0008] 蛋白酶的选择是酶解法制备海洋生物活性肽的关键，每种蛋白酶都有特定的酶切位点，使用不同的蛋白酶酶解同种蛋白所产生的水解产物的理化和功能性质不尽相同。目前南极磷虾的酶解工艺均采用单酶酶解，用此法得到多肽结构往往较为单一且生物活性也相对有限。复合酶解是利用多种蛋白酶以此对蛋白质进行切割，因此能够获得更加丰富的目标肽段，提高其生物活性，同时获得的多肽分子量也更为短小，将更有利于被人体吸收利用。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种具有降血脂能力的南极磷虾多肽制剂及其制备方法，可以高效，快速地制备具有强降血脂能力的目标肽段。
[0010] 为实现上述技术目的，本发明采用技术方案如下：
[0011] 一种具有降血脂能力的南极磷虾多肽制剂，所述多肽制剂由南极磷虾粉经弹性蛋白酶与丝氨酸羧肽酶酶解产生的多肽组成，所述多肽分子量在7000Da以下。
[0012] 一种具有降血脂能力的南极磷虾多肽制剂的制备方法，是以冷冻南极磷虾粉为原料，经
粉碎、
电子束辐照-
超声波处理、复合酶解、
超滤、
冷冻干燥制得成品，具体包括以下步骤：
[0013] 1)粉碎：将冷冻南极磷虾粉用粉碎机粉碎成细微的粉末；
[0014] 2)电子束辐照-
超声波处理：将步骤1)得到的南极磷虾粉末置于电子直线
加速器中进行辐照处理，
辐射强度为1.5～3KGy，之后以料液重量比1:12～1:25的比例，将南极磷虾粉末溶于去离子水中，磁力搅拌15～35分钟，最后进行超声处理，超声条件为：300～500W，40～65℃，15～30分钟，得到南极磷虾溶液；
[0015] 3)复合酶解：调节步骤2)得到的南极磷虾溶液的pH至7.5～11.0，以2500～3500U/g南极磷虾的比例加入弹性蛋白酶，在25～40℃的条件下水浴酶解20～45分钟；冷却至室温后再次调节溶液的pH至7.5～9.5，以3000～4000U/g南极磷虾的比例加入丝氨酸羧肽酶，在30～45℃的条件下水浴酶解30～40分钟，最后在沸水浴中灭酶15～20分钟后离心取上清液，即得到南极磷虾酶解液；
[0016] 4)过滤：依次用截留分子量为10000Da、7000Da的超滤膜对南极磷虾酶解液进行超滤，得到分子量小于7000Da的南极磷虾多肽液；
[0017] 5)干燥：用
盐酸将步骤4)得到的南极磷虾多肽液pH调至2.7～3.2，过滤，收集过滤液，4℃静置过夜；用油水分离型高速管式离心机除去油脂，收集重液相(水相)，用NaOH将水相调pH至5.8～7.2，过滤，收集滤出液。用水将羟基
磷灰石调成糊状，装柱，装柱后用酸性
磷酸盐缓冲液清洗，再用酸性磷酸盐缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行
吸附，用酸性磷酸盐缓冲液洗脱；收集目标物，用滤膜进行超滤至
质量分数为40％，即得南极磷虾多肽浓缩液，将浓缩液冷冻结
冰后进行
真空冷冻干燥，得到南极磷虾多肽粉末。
[0018] 优选地，步骤2)中辐射强度为1.5KGy，料液重量比为1:14，磁力搅拌时间为17分钟，超声处理条件为350W，50℃，20分钟；步骤3)中先将步骤2)得到的南极磷虾溶液pH调至8.5，弹性蛋白酶的比例为2900U/g南极磷虾，水浴条件为28℃，25分钟，冷却后再次调节溶液pH至8.0，丝氨酸羧肽酶的比例为3000U/g南极磷虾，水浴条件为37℃，35分钟，灭酶时间为17分钟。
[0019] 优选地，步骤2)中辐射强度为2KGy，料液重量比为1:15，磁力搅拌时间为20分钟，超声处理条件为390W，45℃，20分钟；步骤3)中先将步骤2)得到的南极磷虾溶液pH调至8.5，弹性蛋白酶的比例为3000U/g南极磷虾，水浴条件为30℃，25分钟，冷却后再次调节溶液pH至7.5，丝氨酸羧肽酶的比例为3500U/g南极磷虾，水浴条件为35℃，36分钟，灭酶时间为18分钟。
[0020] 优选地，步骤2)中辐射强度为2.5KGy，料液重量比为1:20，磁力搅拌时间为30分钟，超声处理条件为400W，55℃，30分钟；步骤3)中先将步骤2)得到的南极磷虾溶液pH调至11.0，弹性蛋白酶的比例为3500U/g南极磷虾，水浴条件为37℃，30分钟，冷却后再次调节溶液pH至8.0，丝氨酸羧肽酶的比例为4000U/g南极磷虾，水浴条件为40℃，35分钟，灭酶时间为16分钟。
[0021] 优选地，步骤2)中辐射强度为3KGy，料液重量比为1:25，磁力搅拌时间为27分钟，超声处理条件为440W，45℃，25分钟；步骤3)中先将步骤2)得到的南极磷虾溶液pH调至10.5，弹性蛋白酶的比例为3500U/g南极磷虾，水浴条件为35℃，35分钟，冷却后再次调节溶液pH至9.0，丝氨酸羧肽酶的比例为3800U/g南极磷虾，水浴条件为39℃，35分钟，灭酶时间为20分钟。
[0022] 与
现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0023] (1)本发明采用复合酶解技术制备南极磷虾多肽，能够获得更加丰富的目标肽段，提高其生物活性，同时获得的多肽分子量也更为短小，将更有利于被人体吸收利用；酶解条件比较温和，可以很好地保存酶解产物的营养价值，安全性极高，无任何对人体有害的副产物产生；另外酶解
切除了蛋白中非功能区的肽段，可以有效地避免免疫排斥反应的困扰。
[0024] (2)本发明将电子束辐照-超声波处理与酶解法相结合应用于南极磷虾多肽的制备，不仅可以缩短酶解时间，提高酶解效率，还可以获得更加丰富的目标肽段，提高其生物活性。采用电子束辐照处理蛋白质，可以改变蛋白的结构特征，辅助增强蛋白质中的肽键断裂，使南极磷虾蛋白结构变得松散，从而提高蛋白的水解度；超声波对酶解反应的影响主要是
空化效应，即超声波可在液体介质中形成微泡，其破裂伴随
能量的释放，使南极磷虾蛋白结构变得软烂，以此提高许多化学反应的速度。
[0025] (3)本发明所制得的南极磷虾多肽分子量较小，均在7000Da以下，将更有利于被人体吸收利用。
[0026] (4)本发明应用冷冻干燥技术，能够尽量减少南极磷虾多肽在干燥过程中生物活性的损失，同时获得存储性能良好的南极磷虾多肽粉末。
[0027] (5)本发明所制得南极磷虾多肽粉末，有良好的降血脂功效。
具体实施方式
[0028] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0030] 一种具有降血脂能力的南极磷虾多肽制剂的制备方法，是以冷冻南极磷虾粉为原料，经粉碎、电子束辐照-超声波处理、复合酶解、超滤、冷冻干燥制得成品，具体包括以下步骤：
[0031] 1)粉碎：将冷冻南极磷虾粉用粉碎机粉碎成细微的粉末；
[0032] 2)电子束辐照-超声波处理：将步骤1)得到的南极磷虾粉末置于电子
直线加速器中进行辐照处理，辐射强度为1.5KGy，之后以料液重量比1～14的比例，将南极磷虾粉末溶于去离子水中，磁力搅拌17分钟，最后进行超声处理，超声条件为：350W，50℃，20分钟，得到南极磷虾溶液；
[0033] 3)复合酶解：调节步骤2)得到的南极磷虾溶液的pH至8.5，以2900U/g南极磷虾的比例加入弹性蛋白酶，在28℃的条件下水浴酶解25分钟；冷却至室温后再次调节溶液的pH至8.0，以3000U/g南极磷虾的比例加入丝氨酸羧肽酶，在37℃的条件下水浴酶解35分钟，最后在沸水浴中灭酶17分钟后离心取上清液，即得到南极磷虾酶解液；
[0034] 4)过滤：依次用截留分子量为10000Da、7000Da的超滤膜对南极磷虾酶解液进行超滤，得到分子量小于7000Da的南极磷虾多肽液；
[0035] 5)干燥：用盐酸将步骤4)得到的南极磷虾多肽液pH调至2.7～3.2，过滤，收集过滤液，4℃静置过夜；用油水分离型高速管式离心机除去油脂，收集重液相(水相)。用NaOH将水相调pH至5.8～7.2，过滤，收集滤出液。用水将羟基磷灰石调成糊状，装柱，装柱后用酸性磷酸盐缓冲液清洗，再用酸性磷酸盐缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用酸性磷酸盐缓冲液洗脱；收集目标物，用滤膜进行超滤至质量分数为40％，即得南极磷虾多肽浓缩液，将浓缩液冷冻结冰后进行真空冷冻干燥，得到南极磷虾多肽粉末。
[0036] 实施例2
[0037] 一种具有降血脂能力的南极磷虾多肽制剂的制备方法，是以冷冻南极磷虾粉为原料，经粉碎、电子束辐照-超声波处理、复合酶解、超滤、冷冻干燥制得成品，具体包括以下步骤：
[0038] 1)粉碎：将冷冻南极磷虾粉用粉碎机粉碎成细微的粉末；
[0039] 2)电子束辐照-超声波处理：将步骤1)得到的南极磷虾粉末置于电子直线加速器中进行辐照处理，辐射强度为2KGy，之后以料液重量比1～15的比例，将南极磷虾粉末溶于去离子水中，磁力搅拌20分钟，最后进行超声处理，超声条件为：390W，45℃，20分钟，得到南极磷虾溶液；
[0040] 3)复合酶解：调节步骤2)得到的南极磷虾溶液的pH至8.5，以3000U/g南极磷虾的比例加入弹性蛋白酶，在30℃的条件下水浴酶解25分钟；冷却至室温后再次调节溶液的pH至7.5，以3500U/g南极磷虾的比例加入丝氨酸羧肽酶，在35℃的条件下水浴酶解36分钟，最后在沸水浴中灭酶18分钟后离心取上清液，即得到南极磷虾酶解液；
[0041] 4)过滤：依次用截留分子量为10000Da、7000Da的超滤膜对南极磷虾酶解液进行超滤，得到分子量小于7000Da的南极磷虾多肽液；
[0042] 5)干燥：用盐酸将步骤4)得到的南极磷虾多肽液pH调至2.7～3.2，过滤，收集过滤液，4℃静置过夜；用油水分离型高速管式离心机除去油脂，收集重液相(水相)。用NaOH将水相调pH至5.8～7.2，过滤，收集滤出液。用水将羟基磷灰石调成糊状，装柱，装柱后用酸性磷酸盐缓冲液清洗，再用酸性磷酸盐缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用酸性磷酸盐缓冲液洗脱；收集目标物，用滤膜进行超滤至质量分数为40％，即得南极磷虾多肽浓缩液，将浓缩液冷冻结冰后进行真空冷冻干燥，得到南极磷虾多肽粉末。
[0043] 实施例3
[0044] 一种具有降血脂能力的南极磷虾多肽制剂的制备方法，是以冷冻南极磷虾粉为原料，经粉碎、电子束辐照-超声波处理、复合酶解、超滤、冷冻干燥制得成品，具体包括以下步骤：
[0045] 1)粉碎：将冷冻南极磷虾粉用粉碎机粉碎成细微的粉末；
[0046] 2)电子束辐照-超声波处理：将步骤1)得到的南极磷虾粉末置于电子直线加速器中进行辐照处理，辐射强度为2.5KGy，之后以料液重量比1～20的比例，将南极磷虾粉末溶于去离子水中，磁力搅拌20分钟，最后进行超声处理，超声条件为400W，55℃，30分钟，得到南极磷虾溶液；
[0047] 3)复合酶解：调节步骤2)得到的南极磷虾溶液的pH至11，以3500U/g南极磷虾的比例加入弹性蛋白酶，在37℃的条件下水浴酶解30分钟；冷却至室温后再次调节溶液的pH至8.0，以4000U/g南极磷虾的比例加入丝氨酸羧肽酶，在40℃的条件下水浴酶解35分钟，最后在沸水浴中灭酶16分钟后离心取上清液，即得到南极磷虾酶解液；
[0048] 4)过滤：依次用截留分子量为10000Da、7000Da的超滤膜对南极磷虾酶解液进行超滤，得到分子量小于7000Da的南极磷虾多肽液；
[0049] 5)干燥：用盐酸将步骤4)得到的南极磷虾多肽液pH调至2.7～3.2，过滤，收集过滤液，4℃静置过夜；用油水分离型高速管式离心机除去油脂，收集重液相(水相)。用NaOH将水相调pH至5.8～7.2，过滤，收集滤出液。用水将羟基磷灰石调成糊状，装柱，装柱后用酸性磷酸盐缓冲液清洗，再用酸性磷酸盐缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用酸性磷酸盐缓冲液洗脱；收集目标物，用滤膜进行超滤至质量分数为40％，即得南极磷虾多肽浓缩液，将浓缩液冷冻结冰后进行真空冷冻干燥，得到南极磷虾多肽粉末。
[0050] 实施例4
[0051] 一种具有降血脂能力的南极磷虾多肽制剂的制备方法，是以冷冻南极磷虾粉为原料，经粉碎、电子束辐照-超声波处理、复合酶解、超滤、冷冻干燥制得成品，具体包括以下步骤：
[0052] 1)粉碎：将冷冻南极磷虾粉用粉碎机粉碎成细微的粉末；
[0053] 2)电子束辐照-超声波处理：将步骤1)得到的南极磷虾粉末置于电子直线加速器中进行辐照处理，辐射强度为3KGy，之后以料液重量比1～25的比例，将南极磷虾粉末溶于去离子水中，磁力搅拌27分钟，最后进行超声处理，超声条件为440W，55℃，25分钟，得到南极磷虾溶液；
[0054] 3)复合酶解：调节步骤2)得到的南极磷虾溶液的pH至10.5，以3500U/g南极磷虾的比例加入弹性蛋白酶，在35℃的条件下水浴酶解35分钟；冷却至室温后再次调节溶液的pH至9.0，以3800U/g南极磷虾的比例加入丝氨酸羧肽酶，在39℃的条件下水浴酶解35分钟，最后在沸水浴中灭酶20分钟后离心取上清液，即得到南极磷虾酶解液；
[0055] 4)过滤：依次用截留分子量为10000Da、7000Da的超滤膜对南极磷虾酶解液进行超滤，得到分子量小于7000Da的南极磷虾多肽液；
[0056] 5)干燥：用盐酸将步骤4)得到的南极磷虾多肽液pH调至2.7～3.2，过滤，收集过滤液，4℃静置过夜；用油水分离型高速管式离心机除去油脂，收集重液相(水相)。用NaOH将水相调pH至5.8～7.2，过滤，收集滤出液。用水将羟基磷灰石调成糊状，装柱，装柱后用酸性磷酸盐缓冲液清洗，再用酸性磷酸盐缓冲液平衡，将上述滤出液上羟基磷灰石层析柱进行吸附，用酸性磷酸盐缓冲液洗脱；收集目标物，用滤膜进行超滤至质量分数为40％，即得南极磷虾多肽浓缩液，将浓缩液冷冻结冰后进行真空冷冻干燥，得到南极磷虾多肽粉末。
[0057] 实施例5
[0058] 采用
治疗型高血脂大鼠模型，对实施例4中所得的南极磷虾多肽进行了为期60天的调节血脂试验研究。以
基础饲料喂饲SD大鼠观察一周后，禁食18h，取尾血，用OLYMPUS AU400全自动生化分析仪测定受试动物试验前血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高
密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，根据TC水平兼顾TG将动物随机分为4组：高脂模型组和低、高、中剂量三个试验组。自正式试验开始，各组动物换用高脂饲料，同时试验组分别在饲料中给予0.25、1.0、2.0g/kg BW不同浓度的南极磷虾多肽，配制时分别取2.5g、10g、2g南极磷虾多肽粉末加蒸馏水定容至100ml，高脂模型组给予蒸馏水灌胃，灌胃体积均1.0ml/100gBW。连续
60天，每周称重一次。于试验结束禁食18h，
采血测定试验后血清TC、TG、HDL-C。检测结果如下所示。
[0059] (1)南极磷虾多肽对大鼠TC的影响
[0060] 由表1可见，1.0、2.0g/kgBW剂量组大鼠试验后血清TC水平均明显低于高脂模型组(P<0.05)；高脂模型组实验后血清TC水平明显高于实验前(P<0.05)。
[0061] (2)南极磷虾多肽对大鼠TG的影响
[0062] 由表2可见，1.0、2.0g/kgBW剂量组大鼠实验后血清TG水平均明显低于高脂模型组(P<0.05)；高脂模型组实验后血清TG水平明显高于实验前(P<0.05)。
[0063] (3)南极磷虾多肽对大鼠HDL-C的影响
[0064] 由表3可见，各剂量组大鼠血清HDL—C水平与高血脂模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。
[0065] 综上可得，以高脂饲料喂养大鼠60d，各组大鼠血清TC和TG水平明显升高，其中高脂模型组大鼠实验后血清TC和TG水平与实验前比较差异有显著性(P<0.05)，提示大鼠高脂模型建立成功。3个试验组在喂饲高脂饲料的同时给予不同剂量南极磷虾多肽，1.0g/kgBW、2.0g/kgBW组SD大鼠血清TC、TG水平明显低于高脂模型组(P<0.05)，证实南极磷虾多肽对SD大鼠具有辅助降血脂作用。
[0066] 表1实验前后各组血清TC水平
[0067]
[0068] 注：#表示与高脂模型组比较，P＜0.05；*表示实验后与实验前比较有显著性差异，P<0.05。
[0069] 表2实验前后各组血清TG水平
[0070]
[0071] 注：#表示与高脂模型组比较，P＜0.05；*表示实验后与实验前比较有显著性差异，P<0.05。
[0072] 表3实验前后各组血清HDL-C水平
[0073]
[0074] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
