用于将生物活性剂靶向递送到水生生物体的组合物和方法
阅读：432发布：2020-07-02
专利汇可以提供用于将生物活性剂靶向递送到水生生物体的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且将含有抗 微 生物 的或抗菌的化合物和/或微生物、具有生物粘附性和受控的浮 力 性质的可 生物降解 的且营养上有吸引力的组合物选择性地供给至处于开放或封闭的 水 体 中的水生生物体，并且在与所选的水生生物体的诸如鳃、 皮肤 或沿消化道的粘膜组织 接触 时释放生物活性组分。，下面是用于将生物活性剂靶向递送到水生生物体的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.用于在水生环境中递送生物活性剂的颗粒，所述颗粒中的每一个均包括聚合物基质、其中溶解或分散有至少一种生物活性剂的油滴、至少一种密度调节化合物和至少一种营养物，
其中所述至少一种密度调节化合物选自具有小于1g/cm-3的密度的蜡和具有大于1g/cm-3的密度的水不溶性盐；
且其中所述聚合物基质包含至少一种生物粘附性聚合物，且所述其中溶解或分散有至少一种生物活性剂的油滴包埋在所述聚合物基质中。
2.如权利要求1所述的颗粒，其中所述生物活性剂按重量计为0.05％到10％，所述生物粘附性聚合物按重量计为0.05％到10％，按重量计所述密度调节化合物为0.05％到30％以及所述营养物为0.05％到50％。
3.如权利要求1所述的颗粒，其中所述生物活性剂选自杀生物剂、治疗性物质和营养性物质以及它们的混合物，且其中所述生物活性剂溶解或分散在油和阳离子表面活性剂的混合物中。
4.如权利要求1所述的颗粒，其中所述生物活性剂是选自抗霉素A、胡椒基丁醚(PBO)、除虫菊素、鱼藤酮和除了鱼藤酮以外的立方体树脂、氯硝柳胺、氯硝柳胺的氨基乙醇盐、三氟甲基-4-硝基苯酚(TFM)，以及它们的混合物的杀生物剂。
5.如权利要求1所述的颗粒，其中所述生物活性剂是选自抗生素、抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物药、抗寄生虫药以及它们的混合物的治疗性物质。
6.如权利要求1所述的颗粒，其中所述生物活性剂包括一种或多种抗生素。
7.如权利要求1所述的颗粒，其中所述生物活性剂是选自蛋白质、肽、脂肪酸、氨基酸、维生素、胡萝卜素、激素以及它们的混合物的营养剂。
8.如权利要求1所述的颗粒，其中所述生物粘附性聚合物选自阳离子羟乙基纤维素和阳离子疏水改性的羟乙基纤维素、聚乙烯亚胺、二乙基氨乙基-葡聚糖、聚-L-赖氨酸(PLL)、壳聚糖、改性壳聚糖、阳离子瓜尔胶以及它们的混合物。
9.如权利要求1所述的颗粒，其中所述至少一种密度调节化合物包括一种或多种选自Ag、Ba、Ca、Mg和Zn的水不溶性碳酸盐(CO32-)、磷酸盐(PO43-)和硫酸盐(SO42-)的水不溶性盐。
10.如权利要求1所述的颗粒，其中所述至少一种密度调节化合物包括一种或多种主要通过使乙烯或α烯烃聚合而衍生的合成蜡以及它们的混合物。
11.如权利要求1所述的颗粒，其中所述营养物选自动物或植物膳食、蛋白质、鱼分离蛋白、大豆分离蛋白、豌豆分离蛋白、油菜籽分离蛋白、肽、氨基酸、脂肪酸、动物或植物油、淀粉以及它们的混合物。
12.如权利要求1所述的颗粒，其中所述生物活性剂是水不溶性的，所述油是蓖麻油，并且所述油滴还包含阳离子表面活性剂。
13.如权利要求1所述的颗粒，其中所述基质中的所述生物粘附性聚合物与基质形成聚合物混合，所述基质形成聚合物选自乙基-纤维素、甲基-纤维素和羧甲基-纤维素、琼脂、角叉菜胶、海藻酸盐、果胶、明胶和麸质。
14.如权利要求1所述的颗粒，其中所述至少一种密度调节化合物是磷酸三钙(TCP)与聚丙烯蜡(PPP)的混合物。
15.如权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒在被置于水中时保持完整并且保留生物活性剂至少2小时。
16.如权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒具有5-50微米的尺寸。
17.如权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒具有5-1000微米的尺寸。
18.如权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒具有1000-10000微米的尺寸。
19.制备任一项前述权利要求所述的颗粒的方法，包括以下步骤：
(i)制备生物粘附性聚合物溶液；
(ii)通过使一种或多种密度调节化合物以适于根据斯托克斯定律提供预定的所要求的颗粒密度的量乳化在所述聚合物溶液中而形成聚合物浆料，其中所述至少一种密度调节化合物选自具有小于1g/cm-3的密度的蜡和具有大于1g/cm-3的密度的水不溶性矿物质或金属盐；
(iii)使生物活性剂溶解或分散到油和阳离子表面活性剂的混合物中；
(iv)提供营养物；
(v)单独地或者以将步骤(iii)的产物涂覆于所述营养物上的形式同时地，将所述营养物和步骤(iii)的产物混入所述聚合物浆料中；
(vi)将步骤(v)的产物造粒或雾化成具有合适的大小和尺寸的颗粒；
(vii)通过物理或化学反应来使所述颗粒硬化。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述生物粘附性聚合物溶液包括海藻酸盐与壳聚糖的混合物。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述油-溶解或分散的生物活性剂和营养物被分别地添加到所述聚合物浆料中。
22.如权利要求19所述的方法，其中步骤(vii)包括空气干燥或冷却。
23.如权利要求19所述的方法，其中步骤(vii)包括化学反应。
24.如权利要求19所述的方法，其中步骤(vi)和步骤(vii)包括将步骤(v)的产物滴入或雾化到含有多价阳离子或具有引起硬化的pH的水浴中。
25.如权利要求19所述的方法，其中步骤(vi)和步骤(vii)包括雾化步骤(v)的产物以形成微滴并通过物理或化学反应使所述微滴硬化，其中所述颗粒是微粒。
26.如权利要求19所述的方法，其中步骤(vi)和步骤(vii)包括将步骤(v)的产物制成小丸并通过物理或化学反应使所述小丸固化，其中所述颗粒是小丸状颗粒。
27.控制水生生态系统中入侵生物体的方法，包括将颗粒分散到需要处理的水体中，所述颗粒包括：
(ⅰ)按重量计0.05％至10％的至少一种生物活性剂，所述生物活性剂选自抗霉素A、胡椒基丁醚(PBO)、除虫菊素、鱼藤酮和除了鱼藤酮以外的立方体树脂、氯硝柳胺、氯硝柳胺的氨基乙醇盐、三氟甲基-4-硝基苯酚(TFM)以及它们的混合物，其中所述至少一种生物活性剂溶解或分散在油滴中；
(ⅱ)基质，其包含至少一种生物粘附性聚合物，所述生物粘附性聚合物选自阳离子羟乙基纤维素和阳离子疏水改性的羟乙基纤维素、聚乙烯亚胺、二乙基氨乙基-葡聚糖、聚-L-赖氨酸(PLL)、壳聚糖、改性壳聚糖、阳离子瓜尔胶以及它们的混合物，其中所述至少一种生物粘附性聚合物按 重量计占所述颗粒的0.05％至10％，且所述油滴包埋在所述基质中；
(ⅲ)按重量计0.05％至30％的至少一种密度调节化合物，所述密度调节化合物选自具有大于1g/cm-3的密度的水不溶性金属盐、具有小于1g/cm-3的密度的蜡以及这些的任意混合物；和
(ⅳ)按重量计0.05％至70％的至少一种营养物，所述营养物选自动物或植物的蛋白质、肽、氨基酸、脂肪酸、动物或植物油、淀粉以及它们的混合物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述基质进一步包括被混入其中的基质形成聚合物。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述颗粒是通过包括雾化浆料以形成微滴并通过物理或化学反应使所述微滴硬化的方法制备的完整的微粒。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述颗粒是通过包括将浆料制成小丸并通过物理或化学反应使所述小丸固化的方法制备的完整的小丸状颗粒。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述颗粒是干的。
用于将生物活性剂靶向递送到水生生物体的组合物和方法
技术领域
[0002] 本发明涉及含有抗微生物的或抗菌的化合物和/或微生物、具有生物粘附性和受控的浮力性质的可生物降解的且营养上有吸引力的组合物，用于选择性地供给至处于开放或封闭的水体中的水生生物体，并且在与所选的水生生物体的诸如鳃、皮肤或沿消化道的粘膜组织接触时释放生物活性组分。
背景技术
[0003] 非本地的水生物种在全世界迅速地蔓延，既导致全球生物多样性的严重损失，又造成环境和经济的破坏[1，2，3]。除了对栖息地的质量的直接影响，预期的气候变化将促进入侵物种扩张到新的地区并且通过改变竞争优势、增加捕食和传染性疾病来放大已经存在的影响。被认为是入侵性的水生物种是非本地物种，因为它们不受天敌影响，繁殖快速且与本地物种侵略性地竞争。入侵的掠夺性物种捕食本地物种并且破坏它们的水生食物网。它们可以影响属性值，并且影响水-依赖性群落的经济。
[0004] 例如，自19世纪初以来，许多非本地的水生植物、动物和微生物已经被有意或无意地引入到五大湖中。它们中的许多过密地存在于五大湖以及周围的河流中。它们捕食本地鱼类和植物，并破坏了湖中的生态系统。它们还通过在该地区中破坏船和齿轮、水下电缆、石油钻机平台、浮标、渔网、堵塞水管和水电设施、阻塞淡水供应系统以及阻断灌溉系统，而损害休闲和农业活动。单在美国的损失每年估计达785亿[4]。最近遍及多个国家的工作已凸显了更严格和更广泛的管理程序以防止和控制非本地物种在全世界蔓延的迫切需要。
[0005] 斑马贻贝(Dreissena polymorpha)和亚洲蛤(Corbicula fluminea)的入侵引起了特别的关注，这是由于它们能够迅速覆盖硬的水下基质的表面、降低浮游植物生物质并且因此扰乱了浮游的食物网，以及作为主要的大量污染进水口结构和用在市政的、农业的、工业的和发电站的供水系统中的管路的物种[5，6]。在美国的36个相邻州以及夏威夷发现了亚洲蛤。斑马贻贝在1986年被引入美国，已经迅速地蔓延到五大湖、圣劳伦斯河和与密西西比河相关的水路。预计贻贝将在20-25年内侵扰从太平洋海岸到大西洋海岸的加拿大中部以南和佛罗里达走廊以北的大部分地区。随着斑马贻贝的发展，本地的淡水双壳类种群的前景是暗淡的，特别是那些被认为受到威胁和濒临灭绝的物种的种群[7]。
[0006] 另一种有害的入侵者是虾虎鱼(round goby,Neogobius melanostomus)，它是地球上最广泛入侵的鱼类之一。这种鱼已经在劳伦森五大湖流域、波罗的海和几个主要的欧洲河流内有大量引入的种群。虾虎鱼栖息于范围广泛的温带的淡水和微咸水生态系统中，并且如果没有建立严格的管理程序，它将可能通过压载水、意外的诱饵释放和自然的散布方式继续蔓延到全世界[8]。
[0007] 有很多控制入侵物种的蔓延的方法。这些方法包括诸如清淤、链条拖曳和手耙的机械清除、捕食者清除以及化学的、生物化学的和生物的控制。同样重要的是以安全的、环境负责的和成本有效的方式来治理入侵物种。例如，为了找到控制入侵贻贝的危害较小的方法，纽约州立博物馆(NYSM)实地研究实验室筛选了超过700种细菌菌株作为针对斑马和斑驴贻贝的潜在的生物防治剂。结果，他们发现了一种针对这些贻贝的荧光假单胞菌的高效且致命的菌株(CL145A)(美国专利号6,194,194)。这种无害的细菌存在于所有北美的水体中，乃至一般家庭厨房和冰箱中[9]。
[0008] 和有毒物质的应用是降低入侵物种的种群的有效的方法之一。然而，应用的技术尚未完善，且因此那些方法完全不能有效地根除入侵生物体。另一个缺点是，所用的许多有毒物质，例如次氯酸钠、表面活性剂、铵盐、N-三苯甲基-吗啉，要么毒性低，要么无选择性地影响整个水生态系统。例如，贝兹化工(Betz Chemicals)生产的Clam-Trol、卡尔冈公司(Calgon Corp)生产的H130以及以贝螺杀 (Bayer)为商品名销售的4-三氟乙 基-4-硝基苯酚对于鱼类和其它水生生物有剧毒，并且被认为在环境中是非常持久的[10]。
迄今为止，那些化学处理没有一个似乎有可能取代简单氯化作用成为治理斑马贻贝的标准方法。
迄今为止，那些化学处理没有一个似乎有可能取代简单氯化作用成为治理斑马贻贝的标准方法。
[0009] 两个在水生系统中使用最广泛的两种鱼类有毒物质是鱼藤酮和抗霉素A。鱼藤酮，是由EPA注册的用于杀死鱼类的植物源农药。该化学物质与来源于鱼藤属种(Derris spp.)、尖荚豆属(Lonchocarpus spp.)和灰叶属种(Tephrosia spp.)的根部的异黄酮化合物有关，并且主要在东南亚、南美和东非分别被发现。鱼藤酮产品，因急性吸入的、急性口服的和水生的毒性，被列为限制使用的农药(RUP)(见EPA738-R-07-005，2007年3月，鱼藤酮的注册合格决定)。鱼藤酮不溶于水。为了使其分散在水中以便它可以在低浓度下起作用，鱼藤酮必须与溶剂配制。有几种含有作为活性成分的鱼藤酮的市售液体乳液产品可以被用于治理水生系统。例如，一个产品被称为 另一个为CFT 这些杀鱼剂通常通过喷射乳液于水面上来应用。然而，这些乳液型杀鱼剂组合物有许多缺点，如下所述。
[0010] 抗霉素A是较新的鱼类毒性物，并且主要用作单一的治理工具。在过去的十年中，抗霉素A已经被联邦和州机构用以使受威胁/濒危鱼类复原到它们的原始栖息地(见EPA738-R-07-007，2005年5月，抗霉素A的注册合格决定)。抗霉素A也是由EPA注册的用于杀死鱼类的限制使用的农药。该化学物质由来自链霉菌(Streptomyces mold)的发酵产物所衍生，被直接应用于水以恢复休养的鱼群(recreational fish population)并且从鲶鱼鱼苗和食用鱼生产鱼塘移除有鳞鱼类。
[0011] 这种有毒物质以“Fintrol”的商品名销售。目前，有三种可得到的抗霉素A的已注册配方。Fintrol-5由涂覆在砂粒上的抗霉素A组成，其涂覆方式使得随着砂子下沉在前5英尺深的水中均匀地释放该有毒物质；Fintrol-15，在前15英尺的深度释放该有毒物质；一种液体的Fintrol浓缩物，被开发用在非常浅的活水和小溪中。自引进抗霉素A以来，它已经成为了一种引人注目的农药，这是由于其对鱼类的相对特异性，例如杀死鱼类的最小浓度被认为对其它水生生物和哺乳动物无害。它在非常小的浓度对所有生命阶段的鱼类，从卵到成熟，都是有效的。在致死剂量，它的呼 吸抑制特性是不可逆的，并且重要的是，它在开放的环境中会迅速地降解。
[0012] 为更好地控制该毒性物质的释放所做的努力，是众所周知的，特别是在农业产业中。例如，美国专利号3,851,053和4,400,374公开了具有延长的扩散路径长度的各种聚合物。典型地，被掺入的药剂是有机农药，并且基质类型是诸如天然橡胶、苯乙烯-丁基苯乙烯橡胶等的弹性体。然而，本领域熟知的是，几乎所有的有机和无机杀虫剂在那些塑料基质中溶解度都不足。
[0013] 其它已知的封装系统(encapsulating systems)包括：专利号3,059,379和4,428,457，其中核心-颗粒化肥料(core-granulated fertilizer)被封装在多孔薄膜中；美国专利号4,019,890，其中颗粒状肥料被形成果冻样凝胶涂层的防水层涂覆。美国专利号2,891,
355，其中涉及用肥料和营养物的溶液涂覆泡沫聚苯乙烯颗粒，加水以及在其中封装植物。
另外，Villamar等人[11]描述了由膳食组分和包埋在海藻酸盐和明胶的凝胶化的混合物的颗粒中的脂质壁的微胶囊(lipid-wall microcapsules，LWMs)组成的复合微胶囊(complex microcapsules，CXMs)的制备，以获得用于给滤食性动物(suspension feeders)提供膳食营养物的单一食物颗粒类型。其它肥料，如尿素，可按照美国专利号3,336,155中所教导的以颗粒的形式被涂覆，从而延迟在地下水中的溶解。美国专利号3,276,857教导了肥料可以用沥青或各种蜡来封装，并且因此减缓向环境的释放。然而，现有技术中没有公开一种颗粒，其中活性剂即使在暴露于水中之后也保持在完整的颗粒中，并且其中，它仅在被生物体食用后才被释放。
355，其中涉及用肥料和营养物的溶液涂覆泡沫聚苯乙烯颗粒，加水以及在其中封装植物。
另外，Villamar等人[11]描述了由膳食组分和包埋在海藻酸盐和明胶的凝胶化的混合物的颗粒中的脂质壁的微胶囊(lipid-wall microcapsules，LWMs)组成的复合微胶囊(complex microcapsules，CXMs)的制备，以获得用于给滤食性动物(suspension feeders)提供膳食营养物的单一食物颗粒类型。其它肥料，如尿素，可按照美国专利号3,336,155中所教导的以颗粒的形式被涂覆，从而延迟在地下水中的溶解。美国专利号3,276,857教导了肥料可以用沥青或各种蜡来封装，并且因此减缓向环境的释放。然而，现有技术中没有公开一种颗粒，其中活性剂即使在暴露于水中之后也保持在完整的颗粒中，并且其中，它仅在被生物体食用后才被释放。
[0014] 将有毒物质直接递送到入侵物种的一个方法是通过以干、半湿或湿软的形式作为粒状或片状饲料的常规水产饲料。然而，这些饲料在水中迅速恶化，伴随着饲料的物理分解(physical decomposition)和破碎(breakdown)，其在饲料递送到水中时就立即开始。当饲料变成被水浸透时，脆弱的生物活性剂开始浸出并且分解，并且有可能损害周围的生态系统中的内源性生物体。
[0015] 为了克服与在干的粒状饲料中递送有关的一些缺点，活性剂已经被封装在微胶囊中。几种类型的天然或合成的聚合物已经被建议用作结合活性剂以及控制活性剂的释放的基质。这样的聚合物的实例是聚(乙烯基吡咯 烷酮)、聚(乙烯醇)、聚(环氧乙烷)、纤维素及其衍生物、聚硅氧烷和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)。由于像多糖或淀粉的天然聚合物的降解在水生环境中自然地发生，可生物降解的基质引起了人们的兴趣。美国专利号4,239,754描述了一种体系，其中诸如游离氨基酸的营养组分和激素被包埋在脂质体中，并且该脂质体被进一步封装在水状胶体基质(hydrocolloid matrix)中。将所得的脂质凝胶微胶囊要么以冻干粉末的形成储存，要么悬浮在水中。这种类型的脂质体膜或屏障是脆弱的，可能昂贵且难以制造，并且当与其它材料结合时不大可能保持为分离的微胶囊，或者不太可能担当令人满意的水生入侵物种治理项目的合适的部分。
[0016] 本领域中所描述的封装的聚合物没有解决与在水生环境中递送活性剂有关的所有问题。脂质体中的活性剂的生产和它们随后的在水状胶体基质中封装是增加最终产品的成本的劳动密集过程。微囊化的活性剂的干燥导致活性组分的氧化和失活，并且更显著地使得活性剂难以溶解且因此无法被生物体生物利用。存储在干燥状态的微胶囊化的活性剂仍然具有一些与对干的粒状饲料所描述的相同的缺点，因为它们仍必须被再水化以及手动地引入到水生环境中。另外，现有技术中所描述的微囊化聚合物没有消除与在水环境中的应用相关联的分解和水浸出的问题。
[0017] 本发明的组合物的主要效用在于它的独特的受控的浮力和生物粘附性基质，其中活性剂以油性液滴的形式被分散。该油分散的活性剂被封在颗粒基质内，并且即使长期暴露于水中也不会浸出。该生物粘附性聚合物基质在水体中保持完整，其中目标水生生物的诸如鳃、皮肤和消化道的粘膜组织被用来摄取和释放活性剂。生产和递送该组合物的方法是经济的、环境安全的且适用于淡水和海水。本发明的应用在控制诸如鱼、贻贝和蛤的主要入侵物种方面特别有吸引力。
发明内容
[0018] 相应地，本发明提供了一种结合或粘附到粘膜组织并且当被水生生物体摄取时释放生物活性剂的可生物降解的和生物粘附性的组合物，以及制造该组合物和靶向递送该组合物到水生生物体的方法。
[0019] 在一些方面，本发明提供了一种可生物降解的和生物粘附性的聚合物 组合物，其中所述组合物包括天然的或合成的可生物降解的聚合物，且其中所述聚合物是核酸、氨基酸、脂肪酸和/或糖单体的生物聚合物或者改性生物聚合物，且其中合成的聚合物是塑料和/或弹性体。
[0020] 在一些方面，本发明提供了一种如上述的生物粘附性的聚合物组合物，其中所述聚合物包括聚-阳离子的或带正电荷的聚合物，例如壳聚糖和改性壳聚糖、聚-赖氨酸、聚-乙烯亚胺(PEI)、阳离子琼脂、阳离子塑料或乳胶(latex)和可聚合的阳离子表面活性剂等等。
[0021] 在一些方面，本发明提供了一种以干或湿的颗粒、大粒(macroparticle)或微粒(micro-particle)形式的可生物降解的聚合物组合物，其中活性化合物被包埋在颗粒聚合物基质(particle polymeric matrix)中。
[0022] 在一些方面，本发明提供了一种组合物，其具有可调节的密度以在各种水生环境中实现中性的或受控的浮力。
[0023] 在一些方面，本发明提供了一种当暴露在水中时在一段令人满意的时间内能保持完整的组合物，且其中被包埋的活性化合物溶解或分散在有机溶剂中并且不会在水中浸出。
[0024] 在一些方面，本发明提供了一种组合物，其中在被水生生物体摄取时，被包埋的生物活性化合物从该组合物释放。
[0025] 在一些方面，本发明提供了一种制备具有生物粘附性和可调节密度的性质的可生物降解的组合物的方法，包括：形成含有聚-阳离子聚合物和浮力调节材料的浆料；将活性化合物溶解在水不溶性有机溶剂和阳离子表面活性剂的混合物中；将溶解的活性化合物混入生物粘附性聚合物浆料中；添加诸如鱼粉(fish meal)、蛋白质、脂质或抗性淀粉的引诱性营养物到浆料中；将该浆料丸粒化(pelleting)、造粒(granulating)或雾化并且使颗粒状浆料或微滴硬化以形成具有合适的形状和大小分布的固体的湿或干的颗粒。
[0026] 在一些方面，本发明提供了一种递送诸如毒性的、治疗性的或营养性的化合物的生物活性剂到水生生态系统中的生物体的方法，包括：生产含有生物活性剂的生物粘附性组合物；调节所述组合物的大小和密度以最大化其对于目标水体中的水生生物体的可用性；以足够的量在水生环境中分散生物活性的颗粒状的组合物以获得对于水生生物体的预期效果。
[0027] 在本发明的一些方面，生物活性剂是水生的杀生物剂或生物防治剂(biological control agent)，其中该生物活性剂控制诸如鱼、贻贝、蛤、海螺等的各种不期望的脊椎和无脊椎水生生物体。
[0028] 在本发明的一些方面，生物活性剂是治疗剂，例如杀菌的抗生素或肽，其中治疗化合物能够治疗患病的养殖鱼(farmed fish)。
[0029] 在本发明的一些方面，生物活性剂是营养剂，例如必要的脂肪酸、胡萝卜素、氨基酸、蛋白质、肽、激素和维生素。
[0030] 在本发明的一些方面，聚合物组合物包含基质形成聚合物，例如海藻酸盐、果胶、明胶、琼脂、角叉菜胶，或它们的改性聚合物以及它们的混合物，其中混入生物粘附性聚合物，例如壳聚糖、阳离子瓜尔胶和/或其它聚-阳离子多糖。
[0031] 在本发明的一些方面，聚合物组合物包括基质形成聚合物，其中基质形成聚合物是生物粘附性聚合物本身，例如壳聚糖、阳离子瓜尔胶和/或其它聚-阳离子多糖。
[0032] 在本发明的一些方面，通过以各种比例并入水不溶性金属盐或矿物质与熔化的脂肪、蜡和/或聚丙烯蜡来调节组合物的密度。
[0033] 在本发明的一些方面，将组合物丸粒化、微粒化或雾化成预期的形状和粒径并通过交联盐或化学物质硬化。
[0034] 在本发明的一些方面，将丸粒化的或颗粒化的组合物以湿的形式进行递送或者以包括空气干燥或真空干燥在内的任何已知的干燥方法进行干燥并且以干的小丸或颗粒化的粉末的形式进行递送。
[0035] 在一些方面，本发明提供了一种用于在水生生物体的消化道中释放活性化合物的生物粘附性组合物。
[0036] 在一些方面，本发明提供了一种含有杀生物剂或杀生物剂的混合物的、以湿的或干的微粒的形式的、具有取决于目标入侵生物体的大小偏好的各种尺寸范围的生物粘附性组合物。例如，粒径可以是大约5-10微米以用于消除诸如斑马贻贝的入侵贻贝，或者是大约50-150微米以用于消除诸如亚洲鲤鱼的入侵鱼类物种。
[0038] 应当理解，公开的附图仅仅是可以以各种形式来具体实施的本发明的示例性代表。因此，本文中所公开的特定的功能细节不能被解释成限制性的，但仅仅作为权利要求的基础以及作为用于教导本领域技术人员多方面地使用本发明的代表性基础。
[0039] 图1为含有被包埋在本发明的生物粘附性聚合物的基质中的油滴的、密度经过调整的微粒的光学显微视图。上方图片示出的微粒具有为淡水应用而调整的密度，下方图片示出的微粒具有为海水应用而调整的密度。
[0040] 图2为含有被包埋在本发明的海藻酸聚合物和生物粘附性聚合物的基质中的油滴的、密度经过调整的小丸。左图示出了干的小丸，右图示出了湿的小丸，其具有为浸没在海水环境中而调整的密度。
[0041] 图3论证了本发明的组合物在各种水体中的受控浮力性质(下沉速率，以mm/sec为单位)与粒径和密度的关系。
[0042] 图4示出了在淡水的模拟环境中粒径和密度对下沉速率(mm/sec)的影响。
[0043] 图5阐明了本发明的组合物的沉降速度(Vs)符合如下述方程式所描述的斯托克斯定律(Stokes law)：
[0044] Vs＝(2/9)((ρp-ρf)/μ)(g*R2)。
具体实施方式
[0045] 定义
[0046] 在本发明的以下描述中，应当理解，除非另外指明，所使用的术语具有它们在本领域中的普通且惯常的含义。
[0047] 术语“活性剂”、“生物活性化合物”、“生物防治剂”旨在广义地指能够处理不同形式的活的生物体的、适用于诸如水生生态系统、农业和水产养殖业的领域的任何毒性的、治疗性的或营养性的物质。美国环境保护署(EPA)所定义的“毒性物质”是“旨在用于预防、破坏、驱赶或减缓任何害虫的任何物质或物质的混合物”。毒剂(toxic agent)可以是用来对抗包括水生入侵生物体在内的害虫的化学物质或生物剂(例如病毒或细菌)，其包括杀虫剂(pesticides)、杀鱼剂(piscicides)、杀真菌剂(fungicides)、 除草剂(herbicides)、杀昆虫剂(insecticides)、除藻剂(algaecides)和杀软体动物剂(moluscicides)。选择性杀虫剂杀死特定的目标生物体，而对所期望的物种相对无害。非选择性杀虫剂杀死它们接触到的所有物种。根据本发明的合适的水生杀生物剂是由EPA注册和管理的那些，例如抗霉素A、胡椒基丁醚(PBO)、除虫菊素、鱼藤酮和除了鱼藤酮以外的立方体树脂(cube resins)、氯硝柳胺、氨基乙醇盐(例如贝螺杀)、三氟甲基-4-硝基苯酚(TFM)等等。治疗性物质倾向于克服疾病和促进复原，且包括任何抗微生物物质或药物，例如杀菌剂(germicide)、抗生素(antibiotic)、抗菌剂(antibacterial)、抗病毒剂(antiviral)、抗真菌剂(antifungal)、抗原生动物药(antiprotozoal)、抗寄生虫药(antiparasitic)，以及治疗性的蛋白和肽。营养性物质倾向于提供健康和医疗益处，且包括诸如DHA、EPA和ARA的必需脂肪酸，诸如赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸等的必需氨基酸，诸如维生素A、C、D、E等的维生素，蛋白质和肽。
[0048] 术语“水生非本地生物体”和“水生入侵生物体或物种”旨在广义地指被引入到新的淡水或海水生态系统中的并且既危害这些生态系统中的自然资源又威胁到这些资源的人类利用的任何水生生物体。根据本发明的水生入侵生物体包括鱼类、甲壳类、贻贝、蛤和海蜇的任何物种。
[0049] 术语“可生物降解的聚合物”旨在广义地指容易受到生物活性降解的影响的任何聚合物，其中降解伴随着它的摩尔质量的下降。
[0050] 术语“阳离子多糖或聚-阳离子多糖”旨在广义地指任何天然存在的或改性的或合成的阳离子多糖，以及通过化学手段被制成阳离子性的多糖和改性的多糖衍生物。这包括，例如，用含有活性的氯化物或环氧化物位点的各种季铵化合物进行的季铵化作用(quarternization)。
[0051] 术语“生物粘附性的或粘膜粘附性的聚合物”旨在广义地指容易结合到诸如鳃或胃粘膜组织的带负电荷的组织或器官并且运输生物活性材料穿过细胞膜的任何合适的阳离子聚合物。阳离子多糖的例子包括，但不限于，阳离子羟乙基纤维素和阳离子疏水改性的羟乙基纤维素，诸如聚乙烯亚胺(例如由BASF生产的 )、聚-L-赖氨酸(PLL)或其它聚-阳离子氨基酸的线型大分子，壳聚糖，诸如二甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖的改性壳聚糖，阳离子瓜尔胶和/或其它聚-阳离子多糖，二乙基氨 乙基-葡聚糖(DEAE-dextran)和诸如聚(酰氨基胺)(PAMAM)树枝状聚合物和 430(由国际特品公司(International Specialty Products)生产)的支链聚合物。
[0052] 本发明的可生物降解的聚合物基质组合物包括在水生生态系统中容易受到生物活性降解的影响的聚合物。在本发明的最广义的方面，任何天然或合成的聚合物都被考虑成合适的，包括但不限于，淀粉和诸如乙基纤维素，甲基纤维素和羧甲基-纤维素等的改性纤维素；多糖和诸如琼脂、角叉菜胶、海藻酸盐、果胶、壳聚糖、改性壳聚糖、瓜尔胶等的胶(gums)；诸如明胶、乳蛋白、麸质、大豆和豌豆分离蛋白、玉米醇溶蛋白(Zein)等的蛋白质；以及诸如饱和或氢化脂肪的熔化的脂肪、蜡、长于12碳链的脂肪酸醇和石蜡油(paraffin oils)。合成聚合物的生物降解可以通过合成主链中带有水解不稳定链接的聚合物来完成，其一般通过使用诸如酯、酐、原酸酯(orthoesters)和酰胺(amides)的化学官能团来实现。
最常用的可生物降解的合成聚合物是聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(丙烯酸或甲基丙烯酸酯)和它们的共聚物，以及其它材料，包括聚(二氧环己酮)、聚(三亚甲基碳酸酯)共聚物和聚(e-己内酯)均聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基吡咯烷酮的衍生物，以及这些的共聚物。
最常用的可生物降解的合成聚合物是聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(丙烯酸或甲基丙烯酸酯)和它们的共聚物，以及其它材料，包括聚(二氧环己酮)、聚(三亚甲基碳酸酯)共聚物和聚(e-己内酯)均聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基吡咯烷酮的衍生物，以及这些的共聚物。
[0053] 通常，优选在水生环境中在至少几个小时内以颗粒形式保持完整的基质聚合物。基质的主链聚合物基本上可以是任何亲水性聚合物，且优选适合于交联的那些聚合物。优选的基质聚合物选自水凝胶聚合物及其组合，优选但不必要是交联的水凝胶聚合物，例如海藻酸盐、果胶、壳聚糖、琼脂、阳离子琼脂、角叉菜胶、明胶以及它们的组合。基质聚合物的优选用量按重量计为相对于组合物的总重量的0.01至20％。更优选的，该用量按重量计为相对于组合物的总重量的0.05至15％，以及更优选按重量计为1至10％。
[0054] 本发明的可生物降解的聚合物基质组合物包括用作生物活性剂的递送载体的生物粘附性的或粘膜粘附性的聚合物。在本发明的最广义的方面，任何阳离子的或带正电荷的聚合物都被考虑成合适的，包括但不限于，阳离子羟乙基纤维素和阳离子疏水改性的羟乙基纤维素、聚乙烯亚胺、二乙基氨乙基-葡聚糖、聚-L-赖氨酸(PLL)、壳聚糖、诸如二甲基壳聚糖、三 甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖的改性壳聚糖、阳离子瓜尔胶和/或其它聚-阳离子多糖。在本发明的一个更优选的方面，任何壳聚糖和/或改性壳聚糖都是适合的。
[0055] 在本发明的一个实施方案中，生物粘附性聚合物也用作基质聚合物，其中活性剂被包埋在基质中。
[0056] 在本发明的另一个实施方案中，生物粘附性聚合物被添加到基质聚合物中以给基质提供粘附性质。生物粘附性聚合物的优选用量按重量计为相对于组合物总重量的0.01至20％。更优选地，该用量按重量计为相对于组合物总重量的0.05至15％，以及更优选地，按重量计为1至10％。
[0057] 本发明的可生物降解的聚合物基质组合物包括金属或水不溶性盐与天然或合成的熔化的脂肪或蜡以特定的合适比例的混合物，以达到在目标水生生态系统中所需的颗粒浮力。在本发明的最广义的方面，任何具有大于1g/cm-3的密度的水不溶性盐被考虑成合适的，包括但不限于，Ag、Ba、Ca、Mg和Zn等的碳酸盐(CO32-)、磷酸盐(PO43-)和硫酸盐(SO42-)，以及任何具有小于1g/cm-3的密度的任何熔化的脂肪和天然或合成的蜡，包括但不限于来源于植物、昆虫和动物的那些，以及主要通过使乙烯或α烯烃聚合而衍生的合成蜡。在本发明的更优选的实施方案中，磷酸三钙(TCP)和聚丙烯蜡(PPP)的混合物是合适的。TCP和PPP的混合物的优选量按重量计为相对于组合物的总重量的0.01至40％。更优选地，该用量按重量计为相对于组合物的总重量的0.05至30％。TCP和PPP之间的优选比例是被要求在目标水生生态系统中实现特定的颗粒浮力的任何合适的比例。例如，应当理解，适于处理淡水生态系统的组合物会比适于处理海水生态系统的组合物具有更低的TCP/PPP比例。
[0058] 本发明的上下文中的活性化合物是杀生物剂、治疗性或营养性物质。杀生物物质是化学或生物防治剂，能够杀死、预防、破坏、驱赶或减缓诸如鱼类、贻贝、蛤等的各种不期望的水生生物。在本发明的最广义的方面，可以使用任何类型的杀生物剂或生物剂(例如干的有毒病毒或细菌)，包括但不限于杀虫剂、杀鱼剂、杀真菌剂、除草剂、杀昆虫剂、除藻剂、杀软体动物剂等。根据本发明的优选的水生杀生物剂是由美国环境保护署(EPA)注册并管理的那些，例如抗霉素A、胡椒基丁醚(PBO)、除虫菊 素、鱼藤酮和除了鱼藤酮以外的立方体树脂、氯硝柳胺、氨基乙醇盐(例如由BASF生产的贝螺杀)、三氟甲基-4-硝基苯酚(TFM)等。
[0059] 在本发明的一个实施方案中，生物活性物质是治疗剂，例如在目标水生生态系统中或在水产养殖系统中杀死传染性细菌的抗菌肽(bactericidal peptide)或抗生素。在本发明的最广义的方面，可以使用任何类型的抗生素，包括但不限于杀菌剂、抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物药和抗寄生虫药。特定抗生素物质包括磺胺类、二氨基嘧啶类、青霉素类、四环素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、氯霉素及衍生物、喹诺酮类和氟喹诺酮类、硝基呋喃类、硝基咪唑类和它们的混合物。在本发明的另一个实施方案中，生物活性物质是营养性化合物，例如蛋白质、肽、油、维生素或激素。在本发明的最广义的方面，可以使用任何类型的营养物，包括但不限于诸如DHA、EPA和ARA等的必需脂肪酸，诸如赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸等的必需氨基酸，诸如维生素A、C、D、E等的维生素，诸如β胡萝卜素、leutene、虾青素等的胡萝卜素。
[0060] 通常，在包埋在本发明的聚合物基质中之前，将生物活性剂溶解在有机溶剂中。在本发明的最广义的方面，任何类型的油、脂肪或油脂可以用于溶解，包括但不限于在室温下呈液体或固体形式的天然存在的或合成的油。在本发明的上下文中，合适的油包括所有种类的油体或油成分，特别是鱼油、诸如菜子油、葵花油、大豆油、橄榄油、可可脂、椰子油、棕榈油、蓖麻油等的植物油、诸如烷氧基化的葵花油或大豆油的改性植物油、诸如C6-C22脂肪酸的单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯的工艺混合物(technical mixtures)的合成(三)甘油酯，以及诸如植物油的甲基酯或乙基酯的脂肪酸烷基酯。优选地，通过使用诸如阳离子表面活性剂或非离子表面活性剂且最优选阳离子表面活性剂的表面活性剂来提高生物活性剂在油中的溶解度。阳离子表面活性剂的典型的非限制性实例是季铵盐，例如三甲基烷基铵、苯烷铵(benzalkonium)和烷基吡啶鎓离子的氯化物或溴化物和带有酰胺键的胺、聚氧乙烯基烷基胺和脂环胺等。该生物活性剂在油中的优选量按重量计为0.01至10％。更优选地，该量是生物活性剂在给定的油/表面活性剂体系中的最大所获得的溶解度。生物活性/油溶液优选的用量按重量计为相对于组合物的总重量的0.1至40％。更优选地，该量按重 量计为相对于组合物总重量的0.5至30％以及更优选地按重量计为5至30％。
[0061] 在本发明的一个实施方案中，将生物活性剂和油溶液涂覆到诸如蛋白质、脂质或淀粉的营养物的载体颗粒上。在本发明的上下文中，这些营养物也用作营养性引诱剂，使目标水生生物体主动地从水生媒介摄取该组合物。
[0062] 在本发明另一实施方案中，优选地，营养物被目标水生生物体摄取和消化。例如，已经表明，双壳贻贝，由于它们的大的鳃表面积以及经过它们的外套腔被泵送的大量的水，在摄取诸如游离氨基酸的某些有机物质方面成功地与其它无脊椎动物竞争[12，13]。在聚合物基质中包含营养物也提供了被生物体消化酶打开的位点和孔，这使得生物活性剂被更有效地摄取。在本发明的最广义的方面，可以使用任何类型的营养物，包括但不限于氨基酸、肽、酶、蛋白质、动物或植物来源的分离蛋白和膳食、脂肪酸、脂类和淀粉以及它们的衍生物。本发明的上下文中，合适的营养物包括所有种类的膳食、蛋白质和游离氨基酸和淀粉或它们的混合物，特别是鱼粉或者动物或植物来源的分离蛋白。本发明的组合物中的营养物的优选含量按重量计为相对于组合物总重量的0.1至70％。更优选地，该含量按重量计为相对于组合物总重量的5至60％，以及更优选地按重量计为10至50％。
[0063] 按照本发明的目的，针对水生生物体的可生物降解的和生物粘附性的组合物递送载体被制成干的或湿的，且具有从约2微米到约10,000微米范围的粒径。递送载体由上文所披露的组分的复合物制成，包括任何类型的可生物降解的聚合物，例如可溶的和抗性的淀粉，胶，例如琼脂、果胶、角叉菜胶、乙基纤维素、甲基纤维素或羧甲基纤维素、海藻酸盐、蜡、脂肪或蛋白质以及它们的混合物。颗粒的凝胶基质通过使该聚合物硬化或交联而形成，从而提供在水生环境中稳定且完整的颗粒。所提供的颗粒对于水生生物体来说是有吸引力且可摄入的。
[0064] 在制备方法的一个实施方案中，制备含有0.01-10％的诸如海藻酸盐或果胶的基质形成聚合物的溶液。单独地制备含有0.01-10％的诸如疏水改性的羟乙基纤维素、聚乙烯亚胺、二乙基氨乙基-葡聚糖、聚-L-赖氨酸(PLL)或壳聚糖的生物粘附性聚合物的溶液，并且将其与聚合物基质溶液进行均 质化。按聚合物溶液的重量计，以0.01-20％的量添加含有以合适比例混合的诸如TCP和PPP混合物的金属盐和疏水性蜡的混合物的浮力控制化合物，并且将其均质化直到获得平滑的浆料。可以添加约0.1-2％的诸如中长链饱和脂肪酸的单甘油酯、山梨酸酯、丙二醇酯、卵磷脂、聚山梨醇酯和蔗糖酯的乳化剂，以帮助疏水性蜡在浆料中的分散。
[0065] 在一个替代实施方案中，生物粘附性聚合物也用于形成基质溶液，如壳聚糖或阳离子琼脂溶液。在又一个替代实施方案中，颗粒基质由诸如海藻酸盐和果胶的带负电荷的聚合物组成，随后将预成型的微粒短暂浸泡在含有诸如壳聚糖、PLL或阳离子琼脂等的带正电荷的聚合物的溶液中。
[0066] 在一个优选的实施方案中，将生物活性物质溶解在有机溶剂和阳离子表面活性剂的混合物中。优选的有机溶剂是任何植物油或动物油，优选短碳链油，例如含有辛酸、癸酸或月桂酸的油。最优选的短碳链油是蓖麻油。优选的阳离子表面活性剂是季铵盐表面活性剂。通过将最大可溶解量的生物活性物质溶解在油和表面活性剂体系中来制备生物活性溶液。生物活性物质和油溶液可以直接以聚合物溶液重量的约0.01至约20％在聚合物基质溶液中进行均质化；或者先以生物活性物质和油混合物:营养物为0.5-1:1的比例涂覆到诸如鱼粉或者大豆或豌豆分离蛋白的营养物的微细颗粒(fine particles)上，然后将涂覆后的营养物混入聚合物基质溶液中。
[0067] 在以合适的粒径和形状形成凝胶小丸后，通过交联或冷却来使最终的浆料硬化，或者采用空气、超声波或旋转雾化器或本领域已知的任何其它雾化手段将最终的浆料雾化到含有0.1％-10％的交联化合物的水溶液中，上述交联化合物例如用于交联诸如果胶或海藻酸盐的聚合物的氯化钙、用于交联基于角叉菜胶的聚合物的柠檬酸钾或者用于交联壳聚糖聚合物的三聚磷酸盐等等。然后从交联溶液中收集硬化的基质颗粒，并可以将其湿润地包装用于以它们的湿润的形式应用于水生环境，或者通过诸如空气干燥、流化床干燥、冷冻/真空干燥等等任何本领域已知的方法来干燥并干燥地包装以备后用。在一个替代实施方案中，该浆料可以被喷雾干燥到热空气室中，并且将干的颗粒收集并存储以备后用。
[0068] 在本发明一个实施方案中，具有合适的粒径范围和密度的生物活性组合物被应用于任何淡水、半咸水或海水的水生生态系统中，从而在与水接 触时，所述组合物在水中在至少几个小时内保持完整并且生物活性物质被保留在组合物内。然后，该组合物被活跃地消耗且粘附到目标生物体的粘膜组织，在那里生物活性化合物被释放并且被水生生物体吸收。
[0069] 在另一个实施方案中，含有杀生物剂或杀生物剂的混合物的组合物被靶向递送到不期望的水生生物体。例如，在本发明的组合物中采用粒径范围为5至10微米的鱼藤酮和胡椒基丁醚(PBO)的1:1的混合物。用适当的TCP/PPP比例调整微粒的密度至略高于淡水密度，并且用该组合物处理淡水体以阻碍贻贝和七鳃鳗物种的栖息地的形成。
[0070] 在本发明的又一个实施方案中，在本发明的组合物中采用抗霉素A，并且形成粒径范围为50至100微米的微粒。为了控制有害的或入侵的水生动物物种，例如亚洲鲤或小龙虾，用适当的TCP/PPP比例调整微粒的密度以匹配水生河口(aquatic estuaries)的密度。
[0071] 在本发明的又一个实施方案中，在本发明的组合物中采用抗生素氧四环素，并且形成粒径范围为2000至5000微米的小丸。用适当的TCP/PPP比例调整小丸的密度以匹配海水环境的水密度，并且该小丸被用于治疗诸如鲑科鱼(salmonid)的水生养殖物种，以对抗细菌感染。
[0072] 在本发明的进一步的实施方案中，在本发明的组合物中采用含有虾青素的微生物细胞或油提取物，并且形成粒径范围为5000至10000微米的小丸。用适当的TCP/PPP比例调整小丸的密度以匹配海水环境的水密度，并在捕获前约30天给鲑鱼(salmon fish)喂养该小丸从而提供在鱼肉中的令人满意的色素沉着。
[0073] 本发明通过以下非限制性实施例进一步说明。
[0074] 实施例
[0075] 实施例1.用于淡水应用的含有鱼藤酮的生物粘附性组合物的制备
[0076] 在40L的不锈钢容器中，添加16L蒸馏水。在剧烈混合的条件(2000RPM，RS-02，Admix，Manchester，NH)下将海藻酸钠(约200g， DMB，FMC Biopolymer，Philadelphia，PA)缓慢地添加到不锈钢罐中的蒸馏水中，直到完全溶解。将液体大豆卵磷脂(约120g，Archer-Daniels-Midland Co.，Decatur，IL)和吐温80(约120g，Sigma) 添加到海藻酸盐溶液中，并且将该溶液在剧烈混合(2000RPM)下继续乳化15分钟。将聚丙烯蜡(约
1000g，Propylmatte-31，Micro Powders,Inc.，Tarrytown，NY)添加到海藻酸盐溶液中，并且将该溶液在剧烈混合下继续乳化15分钟。然后用1M冰醋酸将浆料的pH值调节到6.2。
1000g，Propylmatte-31，Micro Powders,Inc.，Tarrytown，NY)添加到海藻酸盐溶液中，并且将该溶液在剧烈混合下继续乳化15分钟。然后用1M冰醋酸将浆料的pH值调节到6.2。
[0077] 在一个单独的小的10L不锈钢容器中，添加4L蒸馏水且将其加热至50℃。将壳聚糖(约120g，高粘度壳聚糖90％脱乙酰度，MayPro，Purchase，NY)缓慢地添加到温水中。壳聚糖是甲壳类动物(蟹，虾等)的外骨骼中的结构单位，是生物粘附性的并且容易结合到带负电荷的实体。它是一种由随机分布的β-(1-4)-连接的D-葡萄糖胺(脱乙酰化单元)和N-乙酰-D-葡萄糖胺(乙酰化单元)组成的线性阳离子多糖。壳聚糖是通过甲壳素(chitin)的脱乙酰化来商业生产的(也可以从甲壳素来生产)。商业壳聚糖的脱乙酰度(％DA)在60-100％的范围内。将150g冰醋酸在剧烈混合(2000RPM)下小心地添加(伴随混合)到温水中，直到壳聚糖完全溶解。将壳聚糖溶液冷却至室温，并用50％氢氧化钠溶液调节pH至6.2。然后在剧烈混合下将壳聚糖溶液与海藻酸盐溶液合并。
[0078] 在通风橱中的1L玻璃烧杯中，将20g鱼藤酮(分析纯，Sigma)添加并溶解到等量的氯仿中。可选地，可以通过添加20g胡椒基丁醚(PBO，Sigma)到鱼藤酮来进一步增强鱼藤酮的毒性。添加约200g蓖麻油(Sigma)、20g阳离子表面活性剂(阳离子乳化剂-1，Abitec Corp.，Janesville，WI)和约200g橄榄油(购自本地商店)，并将其混合在一起以获得透明的油状溶液。将含有溶解的鱼藤酮的烧杯置于通风橱中的40℃水浴中和氮气流下约2小时，以使氯仿挥发。然后将溶解的鱼藤酮缓慢地与约1880g大豆蛋白水解物(SolaeTM，Solae LLC，St.Louis，MO)混合，直到粉末呈现均匀地湿润。然后将鱼藤酮涂覆的大豆蛋白缓慢地添加到海藻酸盐/壳聚糖浆料中，并温和地混合(500-1000RPM)直至得到平滑的浆料。或者，可以将大豆蛋白粉末单独地混入海藻酸盐/壳聚糖浆料中，然后将其混入油溶解的鱼藤酮中。
[0079] 微粒的形成：将含鱼藤酮的浆料在25psi的空气压力下雾化(空气雾化器1/4JAU-SS型，Spraying Systems Co.，Wheaton，IL)，并通过在含2％氯化钙的水浴中交联来形成微粒。将经分离筛分的粒径范围为50微米至150 微米的微粒均匀地撒在具有1000g/平方英尺的负载容量的托盘上并且置于冷冻干燥机(Model 25SRC，VIRTIS，Gardiner，NY)的搁板上。然后施加100mTORR的真空压力并且将搁板温度升至+40℃。24小时之内完成干燥。或者，可以将湿润的微粒在真空干燥器或流化床干燥器中进行干燥。在下表1中给出了微粒的组成。
[0080] 表1.鱼藤酮微粒的组成
[0081]
[0082] 图1示出了具有经过调整以用于淡水(上图)或海水(下图)应用的密度的本发明的粘膜粘附性微粒的光学显微镜图。按照当地和联邦的法规和注册要求，鱼藤酮或鱼藤酮/PBO微粒对于防止水生无脊椎动物和脊椎动物的入侵生物体是有用的。
[0083] 实施例2.用于淡水应用的含有抗霉素A的生物粘附性微粒的制备
[0084] 在20L的不锈钢容器中，添加10L的蒸馏水并加热至50℃。将壳聚糖(约300g，高粘度壳聚糖90％DA，MayPro，Purchase，NY)缓慢地添加到温水中。在剧烈混合(2000RPM)下将300g冰醋酸小心地添加(伴随混合)到温水中，直到壳聚糖完全溶解。将壳聚糖溶液冷却至室温，并用50％氢氧化钠溶液调节pH至6.2。将液体大豆卵磷脂(约60g，Archer-Daniels-Midland Co.，Decatur，IL)和吐温80(约60g，Sigma)添 加到海藻酸盐溶液中，并且将该溶液在剧烈混合(2000RPM)下继续乳化15分钟。将聚丙烯蜡(约500g，Propylmatte-31，Micro Powders,Inc.，Tarrytown，NY)添加到按照实施例1所述的方法制备的海藻酸盐溶液中，并且将该溶液在剧烈混合下继续乳化15分钟。
[0085] 在通风橱中的1L玻璃烧杯中，添加10g抗霉素A(分析纯，Sigma)并将其溶解在等量的氯仿中。添加约100g蓖麻油(Sigma)、10g阳离子表面活性剂(阳离子乳化剂-1，Abitec Corp.，Janesville，WI)和约100g鱼油(购自当地的维生素商店)，并将其混合在一起以获得澄清的油状溶液。将含有溶解的抗霉素A的烧杯置于通风橱中的40℃水浴中和氮气流下约2TM小时，以使氯仿挥发。然后将溶解的抗霉素A缓慢地与约940g大豆蛋白水解物(Solae ，Solae LLC，St.Louis，MO)混合，直到粉末呈现均匀地湿润。然后将抗霉素A涂覆的大豆蛋白缓慢地添加到壳聚糖浆料中并温和地混合(500-1000RPM)直至得到平滑的浆料。或者，可以将大豆蛋白粉末单独地混入壳聚糖浆料中，然后将其混入油溶解的抗霉素A中。
[0086] 微粒的形成：将含有抗霉素A的浆料缓慢地倒在旋转的涡流盘(spinning disc)(西南研究院 San Antonio，Texas)以形成50微米至100微米的微滴的窄粒径分布。通过在含有10％异丙醇(纯度70％)和10％三聚磷酸盐的水浴中交联壳聚糖聚合物来形成硬化的基质微粒。在约2小时的硬化阶段后从交联浴收集微粒，并将其在流化床干燥器(Fluid Bed System model 0002，Fluid Air，Aurora，IL)中干燥。表2中给出了微粒的组成。按照当地和联邦的法规和注册要求，抗霉素A微粒对于使受到威胁的/濒临灭绝的鱼复原到它们的天然的栖息地(选择性地杀死)和对于养殖鱼的疾病治疗是有用的。
[0087] 表2.抗霉素A微粒的组成(g干重/100g)
[0088]
[0089]
[0090] 实施例3.用于治疗被感染的养殖鱼的含有抗生素的生物粘附性微粒的制备[0091] 在40L的不锈钢容器中，添加16L蒸馏水。在剧烈混合的条件(2000RPM，RS-02，Admix，Manchester，NH)下将海藻酸钠(约200g，Manugel DMB，FMC Biopolymer，Philadelphia，PA)缓慢地添加到不锈钢罐中的蒸馏水中，直到完全溶解。将液体大豆卵磷脂(约120g，Archer-Daniels-Midland Co.，Decatur，IL)和吐温80(约120g，Sigma)添加到海藻酸盐溶液中，并且将该溶液在剧烈混合(2000RPM)下继续乳化15分钟。将磷酸三钙(TCP，工业级)和聚丙烯蜡(TPP，Propylmatte-31，Micro Powders,Inc.，Tarrytown，NY)的浮力控制混合物(含有330g TCP和260g TPP)加入到海藻酸盐溶液中，并且将该浆料在剧烈混合下继续乳化15分钟。然后用1M冰醋酸将该浆料的pH值调节到6.2。
[0092] 在一个单独的小的10L不锈钢容器中，添加4L蒸馏水且将其加热至50℃。将壳聚糖(约120g，高粘度壳聚糖90％脱乙酰度，MayPro，Purchase，NY)缓慢地添加到温水中。将150g冰醋酸在剧烈混合(2000RPM)下小心地添加(伴随混合)到温水中，直到壳聚糖完全溶解。将壳聚糖溶液冷却至室温，并用50％氢氧化钠溶液调节pH至6.2。然后，在剧烈混合下将壳聚糖溶液与海藻酸盐溶液合并。
[0093] 在通风橱中的1L玻璃烧杯中，加入40g氧四环素(OTC，Sigma)并将其溶解到等量的95％的异丙醇中。添加约200g蓖麻油(Sigma)、20g阳离子表面活性剂(阳离子乳化剂-1，Abitec Corp.，Janesville，WI)和约600g鱼油(购自本地维生素商店)，并将其混合在一起以获得透明的油状溶液。然后将溶解的OTC缓慢地与约1800g鲑鱼分离蛋白(Marine Bioproducts AS，挪威)混合，直到粉末呈现均匀地湿润。然后将OTC涂覆的鲑鱼蛋白缓慢地添加到海藻酸盐和壳聚糖的浆料中，并温和地混合 (500-1000RPM)直至得到平滑的浆料。
或者，可以将鲑鱼分离蛋白单独地混入海藻酸盐和壳聚糖的浆料中，然后将其混入油溶解的OTC中。
或者，可以将鲑鱼分离蛋白单独地混入海藻酸盐和壳聚糖的浆料中，然后将其混入油溶解的OTC中。
[0094] 小丸形成：将含有OTC的浆料滴下，并且通过在含有2％氯化钙的水浴中交联来形成小丸。收集小丸并将其在真空干燥箱(Shel Lab，Cornelius，OR)中于60℃下干燥。图2示出了具有经过调整以用于海水的密度的本发明的生物粘附性小丸的图片。左图显示冻干的小丸，且右图显示在海水中下沉的再水化的小丸。表3给出了小丸的组成。OTC小丸对于治疗养殖鱼中的广泛的细菌性疾病是有用的。
[0095] 表3.OTC微粒组成(g干重/100g)
[0096]
[0097] 实施例4.用于处理诸如管道、泵、电缆和其它水下的表面的水中基础设施的含有杀生物剂的混合物的生物粘附性微粒的制备
[0098] 如实施例-2中所述制备重的下沉的生物粘附性微粒，不同的是用等量的TCP替换PPP以及用等量的未改性的抗性淀粉(Hylon V，National Starch and Chemical，Bridgewater，NJ)替换大豆分离蛋白。通过在通风橱中的1L玻璃烧杯中混合10g鱼藤酮、10g胡椒基丁醚(PBO)和10g抗霉素A(均来自Sigma)并且将它们溶解在等量的氯仿中来制备杀生物剂的广谱混合物(broad mixture)。添加约200g蓖麻油(Sigma)，20g阳离子表面 活性剂(阳离子乳化剂-1，Abitec Corp.，Janesville，WI)和约200g可可脂(购自本地商店)，并将其在40℃的水浴中混合在一起以获得澄清的油状溶液。将含有溶解的杀生物剂的烧杯保持在通风橱中的40℃水浴中和氮气流下约2小时，以使氯仿挥发。然后将溶解的杀生物剂缓慢地与约1880g抗性淀粉混合，直到粉末呈现均匀地湿润。然后将杀生物剂涂覆的淀粉颗粒缓慢地添加到壳聚糖溶液中，并温和地混合(500-1000RPM)直至得到平滑的浆料。采用30"喷雾干燥器(S/S Mobile Minor，GEA Process Engineering Inc.，Columbia，MD)将溶液喷雾干燥。干燥的微粒大部分粒径在5微米到20微米的范围内，将其收集且存储供以后使用。重的下沉微粒对于防范诸如贻贝和蛤的食底泥入侵生物体来处理诸如管道、泵、电缆和其它水下的表面的水中基础设施是有用的。
[0099] 实施例5.用于处理水生入侵无脊椎动物的含有氯硝柳胺的生物粘附性微粒的制备
[0100] 按照实施例1中所述，采用提供慢下沉微粒的TCP/PPP的1:3的混合物，制备20L的海藻酸盐和壳聚糖的溶液。在通风橱中的1L玻璃烧杯中，添加40g氯硝柳胺(Sigma)并将其溶解在等量的丙酮中。添加约200g蓖麻油(Sigma)，20g阳离子表面活性剂(阳离子乳化剂-1，Abitec Corp.，Janesville，WI)和约200g可可脂(购自当地的维生素商店)，并将其在40℃的水浴中混合以获得澄清的油状溶液。将温的油状溶液与约1800g抗性淀粉在40℃下缓慢地混合，直到该粉末呈现均匀地湿润，然后在继续混合的同时将混合物冷却至室温。将粉末保持在通风橱和氮气流下约2小时，以使丙酮挥发。然后将溶解的氯硝柳胺缓慢地添加到海藻酸盐/壳聚糖溶液中，并且温和地混合(500-1000RPM)直到获得平滑且均匀的浆料。
[0101] 为了形成精细的几微米大小的液滴，在10000RPM剧烈均质化的条件下将浆料缓慢地添加到另一个含有50L冷的液体石蜡或氯仿的混合容器中。将乳液在低于10℃下冷藏以使可能的浸出和进入到液体石蜡中的氯硝柳胺最小化。在约500-1000RPM的温和混合条件下，将2L 10％的氯化钙冷溶液缓慢地添加到乳液中，并且使预成型的液滴交联和硬化约30分钟。然后将混合物静置，且将石蜡从容器中排出。湿润的完整的氯硝柳胺微粒 大部分在4微米至12微米之间的粒径范围，将其存储供以后使用。或者，将含有油溶解的氯硝柳胺的海藻酸盐/壳聚糖浆料挤出到含有2％的氯化钙的冷(约10℃)水浴中，并收集交联硬化的凝胶带状物，并且将其在对流烤箱(convection oven)、真空干燥箱或冷冻干燥机等等中干燥。然后，将干燥的带状物精细地研磨至粒径小于10微米。慢下沉微粒对于防治诸如海螺和七鳃鳗(sea lamprey)的无脊椎生物体的入侵是有用的。
[0102] 实施例6.为了在具有各种盐度的水体中应用而进行的微粒的密度调整
[0103] 根据实施例1制备具有各种密度和粒径范围的微粒。图3中示出了颗粒的下沉速率与它们的粒径和水密度的关系。平均粒径为约100微米的低密度微粒(具有低的TCP/PPP比例)保持在淡水体的上部1米深度中约30分钟，以及在海水体中保持约1小时。
[0104] 实施例7.为了在所期望的水体中应用而进行的微粒的下沉速率的调整
[0105] 根据实施例1制备具有各种密度和粒径范围的微粒。图4中示出了颗粒在淡水体中的下沉速率与它们的粒径和密度的关系。已经证明了，通过根据本发明的权利要求改变TCP/TPP比例，100微米的微粒在淡水体的上部1米深度中的存在时间从30分钟延长至约1小时。图5表明，微粒在给定的水体中的下沉速率符合斯托克斯定律，因此允许设计这样的具有合适的下沉速率的微粒以靶向水体中的特定生物体。
[0106] 实施例8.在暴露于水中的期间，组合物内的杀生物活性的保留
[0107] 根据实施例1制备含有10％干重的橄榄油的微粒。将干燥的微粒置于温的淡水(40℃)中，且在6小时的时间段内，测量浸出到水中的油的量。结果表明，即使在暴露于温水中6小时后，还有超过80％的油保留在微粒内。该实施例证明了微粒保留常用的杀生物剂(其大多数是水不溶性的)和防止它们暴露于非-靶向的本地的生物体的能力。同时，利用微粒的诸如粒径、下沉速率和营养吸引力的其它功能来选择性地仅靶向不需要的生物 体。
[0108] 实施例9.组合物的生物粘附性质
[0109] 按照实施例2中所述来制备不含有生物活性剂以及含有或不含壳聚糖的生物粘附性微粒。通过将它们与鼠李糖乳杆菌属(Lactobacillus rhamnosus sp.)的细菌培养物粘附来测试微粒的生物粘附性质。将500mg的粒径范围在100微米至150微米之间的干微粒置于小的50微米的网筛上。用100ml无菌PBS缓冲液温和地清洗颗粒，随后用100ml的在PBS缓冲液中含有10E8CFU/ml的活细菌培养物。然后用100ml无菌PBS缓冲液清洗微粒，并将其转移到含有添加了1％吐温-80的100ml无菌PBS缓冲液的烧杯中。采用实验室均质器以10000RPM对微粒溶液进行均质化，并且在涂覆到LMRS琼脂板上之前将其连续地稀释。在37℃下孵育72小时后，记录菌落形成单位(CFU)，并计算每mg干重颗粒的值。结果列于表4中。
[0110] 表4.微粒的生物粘附性质
[0111]
[0112] 该实施例示出了微粒由于在海藻酸盐基质内掺入诸如壳聚糖的生物粘附性聚合物而产生的生物粘附性质。因此，为了通过生物体的粘膜组织吸收杀生物活性剂，微粒可以作为粘附到水生生物体的粘膜组织(例如，鳃、皮肤、口腔和沿着消化系统)的生物粘合性装置来施用。
[0113] 实施例10.用鱼藤酮/PBO微粒控制诸如亚洲鲤的入侵生物体的过度生长
[0114] 按照实施例1中所述，制备含有鱼藤酮和PBO的1:1混合物的干微粒。向位于休闲河流中且亚洲鲤数目过多的开放水体中投入一定量的干颗粒，从而达到在水体的上部1米深度中活性杀生物剂为50ppm的浓度。杀生物剂的测量显示，鱼藤酮的浓度在几个小时内远高于20ppm，这表明大部分的颗粒在水体中保持漂浮，其允许杀生物剂有效地暴露于大量的鱼。处理 后的第二天观察到大量死亡和病态的鱼。24小时后的杀生物剂的测量显示鱼藤酮的浓度低于2ppm，表明大部分的颗粒从水体的上部1米深度中消失，并且要么被鱼消耗，要么沉入水体底部，在那里可以发生颗粒的自然生物降解。由于杀生物剂微粒的更有效的和选择性的应用，实现了大量成本节省。
[0115] 实施例11.用OTC微粒来治疗患病的鳟鱼(trout fish)
[0116] 鳟鱼的亲鱼(broodstock)以10kg每m3淡水并且在10℃温度下储放。采用机械和生物过滤系统通过迅速地交换水池的水来维持水的质量。以1％体重的总配给量，每天给鱼喂食4次商业饲料和0.5％(湿重)的如实施例3中所述的微粒。取血液样本用于OTC特征分析(profile analysis)并且将其与仅喂食含有0.5％OTC的标准商业饲料的鱼进行比较。结果表明，与从含OTC的饲料相比，鱼更有效地从本发明的微粒吸收OTC。
[0117] 实施例12.用虾青素小丸对鲑鱼肉着色
[0118] 将大西洋鲑鱼在开放的海网箱中喂养。在捕获前30天，以每天1％体重的总配给量喂养这些鱼，其中的20％为如实施例3所述的含有虾青素的小丸。分析血样和肉色获得虾青素含量，并与喂食含有虾青素的标准商业饲料的鱼进行比较。结果表明，与含有虾青素的商业饲料相比，鱼更有效地从本发明的小丸吸收虾青素。
[0119] 参考文献
[0120] 本文中引用的所有参考文献的内容在此通过引用的方式并入本文中，用于所有目的。
[0121] 美国专利文献
[0122] 6,194,194 Molloy,Daniel 2001年2月27日
[0123] 3,851,053 Cardarlleri,et al. 1971年11月1日
[0124] 4,400,374 Cardarlleri,et al. 1980年7月24日
[0125] 3,059,379 Attoe,Osborne J. 1962年10月23日
[0126] 4,428,457 Fikkers,et al. 1982年9月24日
[0127] 4,019,890 Fujita,et al. 1974年12月3日
[0128] 2,891,355 Nelson,Florian N. 1959年6月23日
[0129] 3,336,155 Rowe,Englebert L. 1967年8月15日
[0130] 3,276,857 Stansbury,et al. 1966年10月4日
[0131] 4,239,754 Sache,et al. 1977年10月25日
[0132] 其它文献
[0133] [1-13]
[0134] 1.Mack,R.N.,D.Simberloff,W.M.Lonsdale,H.Evans,M.Clout,and F.Bazzaz.2000.Biotic invasions:causes,epidemiology,global consequences,and control.Ecological Applications.10(3):689–710.
[0135] 2.Myers,J.H.,Simberloff,D.,Kuris,A.M.,&Carey,J.R.2000.Eradication revisited–dealing with non-indigenous species.Trends in Ecology and Evolution,15,316-320.
[0136] 3.Pimentel,D.,L.Lach,et al.(2000)."Environmental and economic costs of non-indigenous species in the United States."Bioscience 50(1):53-65.[0137] 4.Varney,R.W.2004.Fighting the Spread of Invasive Species in Connecticut/Vermont.U.S.Environmental Protection Agency(EPA).www.epa.gov/libraries/region1
[0138] 5.Joseph M.Caffrey,Stephanie Evers,Michael Millane and Helen Moran.2011.Current status of Ireland’s newest invasive species–the Asian clam Corbicula fluminea(Müller,1774).Aquatic Invasions(2011)Volume6,Issue3:291–
299.
299.
[0139] 6.Aldridge DC,Elliott P,Moggridge GD(2006).Microencapsulated BioBullets for the control of biofouling zebra mussels.Environmental Scientific Technology 40:975–979
[0140] 7.O'Neill,C.R.and MacNeill,D.B.1991.The zebra mussel (Dreissena polymorpha):an unwelcome north american invader.Coastal Resources Fact Sheet,November1991,Sea Grant,Cornell Cooperative Extension,State University of New York.
[0141] 8.Kornis MS,Mercado-Silva N,Vander Zanden MJ.2012.Twenty years of invasion:a review of round goby Neogobius melanostomus biology,spread and ecological implications.J Fish Biol.2012Feb；80(2):235-85.)
[0142] 9.Daniel P.Molloy and Denise A.Mayer,Overview of a Novel Green Technology:Biological Control of Zebra and Quagga Mussels with Pseudomonas fluorescens,Version 6:Updated August24,2007.
[0143] 10.Claudi and Macke,1994；Karen Perry JE John Lynn,Detecting physiological and pesticide-induced apoptosis in early developmental stages of invasive bivalves,Hydrobiologia(2009)628:153-164
[0144] 11.D.F.Villamar and C.J.Langdon.1993.Delivery of dietary components to larval shrimp(Penaeus vannamei)by means of complex microcapsules.Marine Biology,115:635.
[0145] 12.D.Siebers and A.Winkler.1984.Amino-acid uptake by mussels,Mytilus edulis,from natural seawater in a flow-through system.Helgoland Marine Search.Vol.38,189-199
[0146] 13.D.C.Sigee(Ed).Freshwater microbiology:biodiversity and dynamic interactions of Microorganisms in the Aquatic Environment.John Wiley and Sons,2005-524pages).
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种用于研究MBR中活性污泥物性的粘滞性模型 | 2020-06-16 | 692 |
| 一种基于流体吸力的透水混凝土自净化能力模型 | 2020-05-12 | 893 |
| 一种分时成像偏振图像的偏振角度误差校正方法 | 2020-05-11 | 146 |
| 一种用于纳米颗粒的聚焦磁场调控系统 | 2020-06-04 | 959 |
| 光学薄膜X射线反射率、荧光强度及光谱数据处理方法 | 2020-06-12 | 216 |
| 可压流体跨音速流动过程中的液滴雾化三维数值模拟方法 | 2020-05-24 | 776 |
| 一种基于欧拉-拉格朗日耦合方法的流体仿真方法 | 2020-05-27 | 718 |
| 一种基于三维可旋转全向无线电能传输发射器的系统 | 2020-06-09 | 333 |
| 一种基于增强现实的喷涂模拟方法及模拟系统 | 2020-06-11 | 704 |
| 一种PM2.5的检测装置及检测方法 | 2020-05-11 | 334 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈