本发明者先前的申请WO0069887，涉及蛋白质包被的微晶体。但是， 没有关于药物制剂或其它生物活性分子的具体的公开。公开于WO 0069887的包被的晶体通常是从饱和溶液中共沉淀而来，并且没有公开使 用不饱和溶液是有利的。
在WO 00/69887中，描述了通过将过量饱和水性溶液添加到溶剂中来 产生PCMCs。所述的PCMCs不适合于药学应用。WO 00/69887中的获得 有效混合的优选方法是向过量有机可混溶的溶剂中滴加水溶液，伴以剧烈 混合。但是，这种分批式方法有许多缺陷：
a)因为在整个过程中溶剂的水含量上升，所以沉淀条件是持续变化的。 已经发现不同的最初水含量导致晶体的不同大小和形状；
b)在混悬液中进行沉淀作用，所述混悬液包含增量的已经在混悬液中 的晶体。这将增加新生晶体熔合到已经形成的晶体上的可能性；和
c)如果需要大批量，使用没有过量剪切力的搅动分批反应器来获得高 效搅拌是困难的。通常需要高效搅拌来最小化晶体大小并且阻止晶体粘合 成聚集体。但是，高剪切力可以起始对生物活性分子的损伤，诸如蛋白质 变性或核酸产生切口。快速混合的备选方法诸如使水性流入物雾化从而提 供非常小的液滴也具有因剪切力和界面变性过程引起的潜在问题。
总之，需要开发大规模获得一致的并且可以复制的所述微粒的药物制 剂的方法从而能够支持临床实验和生产。
本发明者目前已经发现使用流式沉淀器可以解决许多上述问题。这项 操作通过将所述饱和水溶液的连续流和所述溶剂的连续流在一个小的混 合流动式室中混合在一起来进行，所述室类似于用于产生HPLC色谱法的 溶剂梯度的那些。在混合室中起始共沉淀过程，随后所述微粒作为在溶剂 流中的混悬液流出并在收集容器中被收集。令人惊奇的，发现所述过程如 关于这样的共沉淀方法所可以预期的，可以不封闭入口管进行延长时期的 操作。有利地，发现脱离混合室的微粒于整个操作循环中在大小，形状和 产量上是高度一致的，表明共沉淀条件保持稳定。另一个优势是所述流动 系统可以自动运行许多小时，并且在这样的操作中产生大量的微粒。
由于可以对整个系统进行封闭和灭菌，每个溶剂系统可以独立地经过 灭菌的滤器进行过滤，还可以如药物制剂的制备所要求的对整个过程进行 灭菌。
发明概述
按照本发明的第一个方面，提供一种形成微粒的连续方法，所述方法 包括下列步骤：
(a)提供包括共沉淀剂的分子和生物活性分子的水溶液，每个共沉 淀剂的分子基本上具有少于4kDa的分子量，其中所述水溶液能 形成包括共沉淀剂和生物活性分子的共沉淀物，所述共沉淀物 具有超过约90℃的熔点；
(b)快速将生物活性分子/共沉淀剂分子溶液与更大体积的实质上的 水混溶性有机溶剂混合从而使共沉淀剂和生物活性分子从形成 所述微粒的溶液中共沉淀出来；和
(c)任选地从有机溶剂中分离所述微粒。
在这里，连续法表示在一个时期内不断地重复的方法并且因此连续法 不同于分批法，即连续法意味着不间断地添加生物活性分子/共沉淀剂分子 溶液及水混溶性有机溶剂。连续法的特点是所述微粒在，例如，混合室中 的时间最短。这可以防止熔融并且还可以使蛋白质降解最小化。
在连续法中，将步骤(a)和(b)循环重复。
可以以固体，例如，粉末形式提供生物活性分子，其将溶解于共沉淀 物的水溶液中。或者，生物活性分子可以在与共沉淀物的水溶液混合之前 存在于溶液或混悬液中。典型地，所述共沉淀物可以作为实质上饱和的或 高度浓缩的溶液进行制备。与生物活性分子混合后，所述共沉淀剂将典型 地具有介于5和100％之间的水性饱和溶解度。优选地，其将具有介于20 和80％之间的饱和溶解度。
所述共沉淀剂必须是可以充分溶解于水溶液的从而在溶液中，相对于 生物活性分子，可以获得适当重量的部分。优选地，该共沉淀剂在可混溶 性有机溶剂中比在水溶液中具有实质更低的溶解度。理想的共沉淀剂的浓 度是溶液中生物活性分子数量和生物活性分子分子量的函数。
技术人员将理解应该对共沉淀剂进行选择从而使其基本上不与生物 活性分子反应和/或不导致与生物活性分子的不利反应。
将所述生物活性/共沉淀剂溶液与实质上的水混溶性有机溶剂或溶剂 的水混溶性混合物混合，优选其中溶剂或溶剂混合物是基本上充分混合 的。典型地，将生物活性分子/共沉淀剂溶液添加到过量水混溶性有机溶剂 中。所述过量的充分水混溶性有机溶剂如下：溶剂/水溶液的终水含量通常 是少于30％，典型地少于10-20vol％和适当地少于8vol％。照这样，所述 有机溶剂应该优选地开始包含少于0.5-5vol％的水或基本上是无水的，但 是其不必是完全无水的。
典型的水混溶性有机溶剂可以，例如，是：甲醇；乙醇；丙烷-1-醇； 丙-2-醇；丙酮，乳酸乙酯，四氢呋喃，2-甲基-2，4-戊二醇，1，5-戊二醇， 和各种大小的聚乙二醇(PEGS)和多元醇；或任何它们的组合。
在某些情况中，所述有机溶剂可以是用生物活性分子和/或共沉淀物进 行预饱和从而确保在添加水溶液后，两种成分一起沉淀出来。
应该理解术语“混合”指一种方法的步骤，其中当添加水溶液时，水 混溶性有机溶剂与水溶液混合或搅拌。需要有效的混合从而使生物活性分 子与中间组合物的混合物接触最短的时间，所述中间组合物的混合物即水 溶液和有机溶剂，例如，介于25％和60％之间的溶剂。因此，使用广泛范 围的方法，诸如连续的流动，喷淋或喷雾来添加水溶液。典型地，生物活 性分子和共沉淀物溶液的混合可以发生在一个其中生物活性分子和共沉 淀物的连续流与许多溶剂混合在一起的过程中。
本发明者目前已经发现，与分批式共沉淀方法相对，连续法是有优势 的，其可以通过将两种或更多连续流混合在一起进行操作。因此，可以将 水混溶性有机溶剂或溶剂混合物的连续流与包括生物活性分子/共沉淀剂 溶液的连续水流混合在，例如小的混合流动室中。该水混溶性溶剂流可以 包含至少5vol％的水和/或实质上用共沉淀剂进行饱和以辅助共沉淀。所 述水流或溶剂流还可以包含其它典型地使用在药物制剂中的赋形剂，诸如 缓冲剂，盐和/或表面活性剂。共-沉淀方法可以在混合室中开始，伴以形 成的微粒作为在混合的溶剂流中的混悬液流出并在收集容器中被收集。已 经发现脱离混合室的微粒在大小，形状和产量上是实质一致的。有利地， 这种连续法可以在包括介于0℃和室温之间的温度以及提高的温度的广泛 温度范围内进行。同样有利地，可以使用在包括大气压的各种压力下的收 集容器收集所述微粒。与形成药用微粒的传统方法诸如喷雾干燥法或超- 临界流体加工比较而言，在接近于环境的条件下运行连续法可以减少资金 和操作费用。例如，设想照这样在工业规模上可以生产大量生物活性分子 包被的微粒。
或者，可以从水流和用于形成不包被的微粒的方法中省略生物活性分 子或共沉淀剂。不包被的微粒可以，例如包括用于药物制剂目的的赋形剂 或药物。这可以提供在经济有效的过程中生产赋形剂或药物的微晶体的适 当方法。以微结晶形式产生的赋形剂或药物可以显示改良的特性诸如改善 的流动或可压缩特性。
在连续共沉淀系统中，一个泵可以连续传递包含浓缩的共沉淀剂和生 物活性分子的水溶液，而另一个泵可以传递共沉淀剂饱和的溶剂相。如果 需要第三种组分诸如微粒包被物质，可以使用更多的泵。这些泵可以是许 多不同的种类但是必须精确地以确定流速传递溶液，并且与使用的生物活 性分子相容。方便地，可以使用HPLC泵或其类似物，因为这些在流速范 围内最佳地进行水溶液和水混溶性溶剂的传递。典型地，将以介于0.1 ml/min和20ml/min之间的流速来传递水溶液。水泵的闸首和管路可以用 抗生物活性分子淤积的材料制作。通常传递溶剂的速度比传递水的速度快 4-100倍，因此可能需要更有利/有效的泵。典型地传递溶剂的速度可以介 于2ml/min和200ml/min之间。
混合装置可以提供将连续水流和连续水混溶性溶剂流快速而紧密地 混合的方法从而使沉淀几乎立即开始发生。
所述混合装置可以是使两种流动物快速混合的任何装置。因此，其可 以，例如，是通过使进入的液体流型成形/合并的静止装置或活跃地将两股 流体流搅拌在一起的动态装置。其优选地，是动态装置。通过使用许多种 方法诸如搅拌，声波振荡，摇动或相似方法来搅动两流。搅拌方法包括浆 式搅拌机，螺旋搅拌机和电磁搅拌器。如果使用电磁搅拌，可以使用具有 不同外形的搅拌棒诸如，例如单棒条或Maltese十字管。优选地可以选择 排列在混合装置内部的材料从而防止生物活性分子或微粒显著结合在其 上。适当的材料可以包括316不锈钢，钛，聚硅氧烷和特氟隆(已注册的商 标)。
根据需要的生产规模，可以生产不同大小和几何形状的混合装置。需 要的混合室的大小是两种溶剂流的流速的函数。对于大约0.025-2ml/min 的水流速和2.5-20ml/min的溶剂流速，适合使用0.2ml的混合室。
典型地，在连续法中，将生物活性/共沉淀剂溶液加入过量水混溶性有 机溶剂中。这需要将较小体积的生物活性分子/共沉淀剂溶液加入较大体积 的过量有机溶剂中从而使来自生物活性分子/共沉淀剂溶液中的水快速稀 释到有机溶剂中，所述稀释的发生伴随按照第一个方面的生物活性分子的 快速脱水和微粒的形成。进行沉淀作用的温度可以是变化的。例如，水溶 液和溶剂可以被加热或冷却。在生物活性分子是脆性的地方，冷却可以是 有效的。或者溶剂和水性混合物可以是不同的温度。例如，溶剂可以保持 在低于水性混合物凝固点的温度上。而且，压力也可以是变化的，例如， 更高的压力可以用于减少溶剂的挥发性。
将生物活性分子/共沉淀剂溶液混合到过量水混溶性有机溶剂中后，生 物活性分子和共沉淀剂的沉淀基本上瞬时发生。
典型地，通过使用包含低量水的新鲜有机溶剂进行漂洗，可以使沉淀 的微粒进一步脱水。这还可以用于去除残留的共沉淀剂饱和的溶剂。干燥 后，这种残余共沉淀剂可以另外用于将微粒胶粘在一起以形成聚集体。还 可以在干燥或贮藏之前使用赋形剂的溶液进行漂洗来将其它赋形剂引到 微粒上。
已经有利地发现可以将沉淀的微粒贮藏于有机溶剂中，并且生物活性 分子在持续时间周期内显示极端良好的活性和稳定性的保留。而且，贮藏 在有机溶剂中的沉淀的生物活性分子将典型地耐受细菌的侵袭，因此增加 了它们的贮藏期限。
随时间推移，共沉淀物将会沉降下来，这使浓缩的微粒混悬液的回收 通过滗去过量的溶剂容易地进行。但是，所述共沉淀物可以经过，例如， 离心和/或过滤以更快速地回收沉淀的微粒。可以将本领域已知的传统干燥 方法诸如空气干燥，真空干燥或流化床干燥用于蒸发任何残余溶剂以留下 无溶剂的微粒。
或者，使用超临界CO2可以在干燥程序中将溶剂从微粒中去除。典型 地，将在连续法和此外分批法中制备的溶剂中的微粒和如在WO 0069887 中详细说明的非-药物微粒装载到高压室中，伴随超临界CO2流经混悬液 直到溶剂(或尽可能)已经被去除。这项技术实质上从微粒中去除所有残余 溶剂。这对于药物制剂有着特别的好处，因为残余溶剂可能导致意外的生 理影响。混悬液的超临界流体干燥的另一优势是其可以用于生产粉末和药 物制剂，所述粉末和药物制剂与通过其它分离技术获得的相比，具有更低 的堆积密度。典型地，可以获得低于0.75g/ml的堆积密度。低堆积密度制 剂在生物活性分子的肺(pulmoary)传递中特别有效，因为它们通常包含更 少的强结合聚集体。可以在本领域已知的许多不同方法中进行临界点干 燥。
因此，建立连续共沉淀系统从而形成按照第一个方面的微粒和，事实 上任何其它类型的微粒，随后使用超临界CO2干燥这些微粒是可能的。
对于药物应用，在使用前，可以将干燥沉淀的微粒在灭菌条件下，典 型地引入灭菌传递装置中或小瓶中。或者，可以将微粒在灭菌条件下作为 溶剂中的混悬液转移到灭菌传递装置或小瓶中。然后，可以使用例如超临 界CO2干燥对它们进行任选地原位干燥。
本文所述的方法还可以将水溶液中存在的有机可溶组分从生物活性 分子中分离出来。例如，可以将缓冲液诸如Tris在沉淀过程中从生物活性 分子中分离出来，所述Tris其游离碱形式在有机溶剂如乙醇中是可溶的。 但是，通过将另一种有机可溶碱加入水溶液或有机溶剂中来将所有的缓冲 液转变成它们的游离碱形式可能是必须的。因此，本发明还公开了从生物 活性分子中去除不需要的组分的方法从而使不需要的组分不与生物活性 分子一起共沉淀，因此仍溶解在有机相中。这可以通过在非-吸湿性包被的 微粒的生物活性分子沉淀之前将添加剂诸如酸，碱，离子对和鳌合剂包含 在水性或有机溶剂中来实现。这些生物活性分子可以因此以高纯形式被包 被。
可以在许多剂量强度上典型地产生本发明所述的制剂。剂量可以通过 将每微粒的生物活性分子的百分重量从低于0.1wt％变化到高达约50wt％ 来合宜地进行变化。对于在水溶液中具有低溶解度或在高水性浓度上是不 稳定的生物活性分子来说，使用在低浓度形成饱和水溶液的载体是有利 的。然后，其通过使用低浓度的生物活性分子来获得高填充量。载体溶解 度可以提供产生在50wt％到＜0.1wt％的填充量上包含生物活性分子的可能 性从而使药物制剂的剂量强度可以合宜地进行变化。室温下，载体在水溶 液中的溶解度可以从2到200mg/ml并且更优选地在10-150mg/ml。
可以将在低于80mg/ml浓度上溶解的载体有利地用于产生包含自由 流动微粒的药物制剂，所述微粒跨过平均颗粒大小少于50微米的窄大小 分布范围。包含窄大小分布范围的包被晶体的制剂提供改良的传递再现性 和因此更好的临床表现。
通过将水溶液和有机溶液在混合进容纳的(contained)灭菌环境之前 经过0.2微米滤器进行预过滤来合宜地产生灭菌形式的所述药物制剂。药 物制剂应该基本没有有害残余溶剂，并且本发明在常规干燥程序后典型地 提供包含少于0.5wt％的3类溶剂的粉末。通过使超临界流体CO2流经在 干燥水混溶性和CO2混溶性溶剂中的晶体的混悬液可以获得基本较低的 溶剂水平。
使用比典型生物大分子小得多的水溶性生物活性化合物，还可以将本 方法用于制备适合于药物制剂的生物活性分子包被的微晶体。可以通过分 批法或连续法来制备这些制剂，并且可以方便地使用非-吸湿性的载体，诸 如D，L-缬氨酸。可以使用水可溶性抗生素药物诸如硫酸妥布霉素和其它水 可溶性生物活性分子。优选地，生物活性分子可以是极性的并且包含一个 或多个在用于共沉淀的pH上被离子化的官能团。该生物活性分子还优选 地具有最大的大小，其比由结晶体上的核心物质形成的晶胞具有更大的尺 寸。这将促使生物活性分子包被的微晶体的形成，并且使生物活性分子包 含在晶格中的可能性最小化。
按照本发明的第二个方面，本发明提供包含微粒的药物制剂，其中所 述微粒包括：
(a)包括共沉淀剂分子的基本非-吸湿性的内部晶核，其中所述共沉淀 剂分子具有少于4kDa的分子量；和
(b)包含一个或多个生物活性分子的外涂层
其中通过将核心形成共沉淀剂分子和所述生物活性分子一起共沉淀， 在一步中形成了所述微粒，并且其中所述微粒具有大于约90℃的熔点。
通过按照第一个方面的连续法或分批法可以制备所述微粒。
本文中的基本上非-吸湿性意为晶核不容易吸收和保留水分。典型地， 在室温下曝露于约80％相对湿度上时，所述微粒将不会聚集，并且核心也 不会在形态或结晶度上有显著改变。
就晶核来说，其意为将组成分子或离子构成重复对称的固体3-维的晶 格，所述晶格在加热时基本保持不变直到达到清晰的熔化转变温度。方便 地，所述分子形成具有高度结晶度的晶核。典型地，在差示扫描量热器(DSC) 上加热微粒时可以观察到清晰的熔化吸热(即，非玻璃化转变)。这是众所 周知的显示结晶度的特性，并且还显示晶核可以通常基本上由固体状态相 所组成，所述固态相在室温和环境湿度条件下是热力学稳定的。按照本发 明的微粒还可以显示双折射，双折射也是结晶度的特性。所述微粒还可以 显示X-射线衍射图案，其是结晶度的又一证据。
就一步来说，其意为将提供晶核的分子或离子和提供外涂层的生物活 性分子以包被的微粒形式直接一起沉淀出溶液。即，以一步法。因此，不 需要单独的涂布或研磨步骤。还应该理解微粒的形成不需要任何蒸发的方 法诸如，例如喷雾干燥法或冷冻干燥法。
可以将微粒用于医学应用诸如治疗或诊断方法中诸如以试剂盒形式 从而检测，例如，疾病的存在。疾病可以包括肺部的疾病诸如肺癌，肺炎， 支气管炎等，其中可以将所述微粒传递到肺部并且测试肺的容量/效率，或 鉴定致病试剂。可以将所述微粒用于兽医应用中。
典型地，生物活性分子的包被可以是基本连续的。或者，使药物制剂 包括具有生物活性分子的基本不连续包被的微粒可能是有利的。该包被还 可以在厚度上变化，并且可以在大约0.01-1000微米，大约1-100微米， 大约5-50微米或大约10-20微米范围内变化。
所述药物制剂可以理想地包括具有窄大小分布的微粒。典型地，因此， 药物制剂可以包括具有有效数目的微粒的基本均一的系统，这些微粒具有 通常相同或相似的大小。
通过连续法产生的微晶体和生物分子包被的微晶体典型地显示跨度 少于5，优选地少于2并且更优选少于1.5的窄大小分布。通过共沉淀产 生的生物活性分子包被的微晶体通常比通过纯载体物质沉淀产生的微晶 体要有利地更小。这与微晶体表面上生物分子的涂层相一致。如下计算跨 度值：
d(0.1)(μm)＝10％的微粒尺寸低于该颗粒大小。
d(0.5)(μm)＝50％的微粒尺寸高于和低于该颗粒大小。
d(0.9)(μm)＝90％的微粒尺寸低于该颗粒大小。
跨度＝d(0.9)-d(0.1)/d(0.5)。
微粒可以具有的最大截面尺寸少于80μm，优选地少于50μm或更优选 地少于20μm。最大截面尺寸是指在直径上相对的点之间可以测量的最大 距离。
组成晶核的分子可以典型地每个都具有少于2kDa的分子量。优选地， 组成晶核的分子可以典型地每个都具有少于1kDa的分子量。更优选地， 组成晶核的分子可以典型地每个都具有少于500道尔顿的分子量。优选的 分子是可以快速被核化从而在经过沉淀作用后形成晶体的那些。提供微粒 的分子因此通常不适合作为核心物质，所述微粒基本由非晶状的聚集体或 玻璃组成。
典型地，形成晶核的分子在水中的溶解度少于150mg/ml，优选地少 于80mg/ml。意外地，本发明者发现溶解度低于这些值的分子倾向于产生 具有改良的流动特性的晶体。通常优选自由流动的微粒用在许多药物制备 方法中，因为它们，例如有利于用精确剂量填充胶囊并且可以方便地用于 进一步的操作诸如包被中。通常自由流动的微粒具有规则的大小和尺寸， 以及低静电荷。具有高长宽比的针状晶体通常是，例如不自由流动的并且 因此在某些制剂中不是优选的。
组成晶核的分子可以，例如，是氨基酸，两性离子，肽，糖，缓冲成 分，水溶性药物，有机和无机盐，形成强氢键晶格的化合物或它们的衍生 物或组合。典型地，选择这些分子从而将在向受者使用后的不利生理反应 减到最小。
适合于形成晶核的氨基酸可以以纯的对应异构体或消旋体形式存在。 实例包括：丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，甘氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，赖 氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，D-缬氨酸，L-缬氨酸，D，L-缬氨酸 的混合物，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸和丝氨酸或任何它们的组合。特 别地，优选L-谷氨酰胺，L-组氨酸，L-丝氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸， L-缬氨酸或D，L-缬氨酸。对于其侧链在共沉淀条件下基本电离的氨基酸来 说，使用平衡离子是优选的，所述平衡离子产生具有低溶解度并且是非吸 湿性的结晶盐。形成晶核的其它分子和盐的实例可以包括，但不限于α- 乳糖，β-乳糖，甘露糖醇，碳酸氢铵，谷氨酸钠，磷酸精氨酸和甜菜碱。
典型地，形成晶核的分子在水中具有低溶解度，例如在约25℃，所述 溶解度介于约12-150mg/ml之间和优选地约20-80mg/ml之间。还可以将 溶解度超过约150mg/ml的分子用于获得自由流动的微粒，条件是它们是 从亚饱和的水溶液中共沉淀出来的。优选地，它们在150mg/ml或更低和 更优选地80mg/ml或更低的浓度上共沉淀。对于在25℃具有高水溶解度 的分子，使用较低共沉淀温度诸如10℃或4℃从而使它们在150mg/ml或 更低的浓度上接近饱和可能也是有利的。类似地，可以将更高的温度诸如 35℃或50℃用于形成核心的分子的共沉淀，所述分子在25℃具有较差溶 解度。
形成晶核的分子具有高于90℃的熔点，诸如高于120℃和优选地高于 150℃。具有高熔点意味着形成的晶体具有高晶格能。高晶格能增加了形 成的微粒具有在表面包被生物活性分子的晶核的可能性并且将倾向于使 所述微粒的非晶形内容物减到最少。当暴露于高湿度或温度时，包含非晶 形物质的微粒可以在物理特性上遭到不希望的改变，并且这可以导致在药 物制剂中不理想的生物活性和溶解度的变化。因此，利用会形成具有高熔 点的微粒的共沉淀物是有利的，因为它们将倾向于形成更稳定的药物制 剂。
新鲜形成的微粒的悬浮液中溶剂∶H2O∶载体∶生物活性剂的典型重量比 率可以在从约1000∶100∶5∶3到约1000∶100∶5∶0.03的范围内。溶剂∶H2O的重 量比率可以在从约100∶1到约4∶1的范围内。
合宜地，在晶核上形成涂层的生物活性分子可以选自任何能产生治疗 效应诸如例如活性药物成分(API)或诊断效应的分子。治疗效应意为任何效 应，其治愈，减轻，去除或减少人类或动物身体的任何疾病或功能失常的 症状，或预防或减少感染人类或动物身体的任何疾病或功能失常的可能 性，因此所述效应涵盖预防效应。
生物活性分子的涂层还可以包括常用于药物制剂中的赋形剂，诸如稳 定剂，表面活性剂，等渗改性剂和pH/缓冲剂。
生物活性分子可以，例如，是：任何药物，肽，多肽，蛋白质，核酸， 糖，疫苗成分，或任何它们的衍生物或任何产生治疗效应的组合。
生物活性分子的实例包括，但不限于药物诸如消炎药，抗癌药，抗精 神病药，抗细菌药，抗真菌药；天然或非天然肽；蛋白质诸如胰岛素，α 1-抗胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，白蛋白，干扰素，抗体；核酸诸如基因 片段，天然来源或合成寡核苷酸的DNA和反义核苷酸；糖诸如任何单糖， 二糖或多糖；和质粒。
一旦被引入受体，核酸可以，例如能够表达。因此核酸可以包括适当 的调节控制元件(例如启动子，增强子，终止子等)以控制核酸的表达。生 物活性分子还可以是天然或合成治疗试剂的化学修饰衍生物，诸如PEG- 蛋白质。
可以将核酸包括在载体诸如质粒，噬菌粒或病毒载体中。可以使用任 何本领域技术人员已知的适当载体。
疫苗包被成分可以，例如包括致病剂，例如细菌或病毒的抗原成分， 诸如白喉类毒素和/或破伤风类毒素。这些疫苗制剂的特别优势是在暴露于 高温时，与传统液体制剂相比，它们通常显示大大增加的稳定性。按照本 发明制备的这些制剂可以，例如，暴露于45℃以上的温度达48个小时， 并且体内测试时保持它们激发(illicit)免疫应答的能力，而发现标准液体样 品通常彻底失活。显示高温稳定性的疫苗不需要冷冻，因此特别是在发展 中国家就贮藏和易于销售来说提供了相当可观的节省费用。疫苗在预防和 /或治疗由病原微生物造成的感染中是有效的，所述感染包括病毒的感染， 真菌的感染，原生动物的感染，阿米巴感染和细菌的感染等。可以按照本 发明制备的疫苗制剂的实例包括亚单位的，减毒或灭活的生物疫苗，其包 括，但不限于，白喉，破伤风，脊髓灰质炎，百日咳(pertussus)和甲型、 乙型和丙型肝炎，HIV，狂犬病和流行性感冒。
示范性制剂包括白喉类毒素(taxoid)包被的D，L-缬氨酸或L-谷氨酰 胺晶体。例如，本发明者已经发现可以将白喉类毒素包被的L-谷氨酰胺晶 体的样品在不同条件下贮存，并且将其重构和接种后，在小鼠中可以发现 激发强烈的初次免疫应答反应和再次免疫应答反应。可以配制疫苗包被的 晶体以通过许多路径递送到受者，所述路径包括胃肠道外的，肺的和鼻的 施用。经过肺的递送对于非常年幼的儿童可以是特别有效的。
按照本发明的微粒还可以应用在多糖连接的蛋白质诸如 HiB(haemopholis流行性感冒B)和肺炎球菌疫苗和活病毒疫苗，诸如流行 性腮腺炎，麻疹和风疹的施用中。还可以将按照本发明的微粒与现代流感 疫苗成分诸如MV A导向(vectored)流行性感冒疫苗一起进行制备。
此外，可以将疫苗成分包被的微晶体用于疫苗的制剂，所述制剂针对 癌症，特别是人类癌症，其包括黑素瘤；皮肤癌；肺癌；乳腺癌；结肠癌 和其它癌症开发。如本文所述，肺用的制剂可以特别适合于肺癌的治疗。 应当指出，除了基于蛋白质的疫苗(即蛋白质/肽成分包被在内部基本非-吸 湿的晶核上)，还可以将基于核酸的疫苗制剂按照本发明进行制备，其中将 核酸分子包被在内部基本非-吸湿的晶核上。
已经发现的具有有利特性的非-吸湿包被的微粒的实例包括那些如下 的微粒：D，L-缬氨酸晶核和胰岛素涂层；L-甘氨酸晶核和抗胰蛋白酶涂 层；谷氨酸钠晶核和胰岛素涂层；L-甲硫氨酸晶核和胰岛素涂层；L-丙氨 酸晶核和胰岛素涂层；L-缬氨酸晶核和胰岛素涂层；L-组氨酸晶核和胰岛 素涂层；L-甘氨酸晶核和α-抗胰蛋白酶涂层；L-谷氨酰胺晶核和白蛋白涂 层；D，L-缬氨酸晶核和寡核苷酸DQA-HEX涂层；D，L-缬氨酸晶核和具有 另外的N-乙酰基半胱氨酸的抗氧化剂外涂层的α1-抗胰蛋白酶涂层；D，L- 缬氨酸晶核和卵清蛋白涂层；L-谷氨酰胺的晶核和卵清蛋白涂层，D，L-缬 氨酸晶核和白喉类毒素(diptheria taxoid)涂层；L-谷氨酰胺的晶核和白喉 类毒素涂层；D，L-缬氨酸晶核和白喉类毒素涂层；L-谷氨酰胺的晶核和破 伤风类毒素涂层；D，L-缬氨酸晶核和白喉类毒素和破伤风类毒素混合物涂 层；L-谷氨酰胺晶核和白喉类毒素和破伤风类毒素混合物涂层。
典型地，在精细控制条件下形成的一批微粒由基本都显示相同形态或 晶体形状的并具有窄大小分布的单独微晶体组成。这可以方便地在SEM 图像中观察到，并通过颗粒大小测量进行证实。按照本发明的微晶体典型 地具有最大截面尺寸，并且最大尺寸少于80微米。它们具有优选地少于 40微米的，更优选地少于20微米的最大截面尺寸。最优选最大截面尺寸 介于0.5和20微米之间的微粒。或者，可以形成相似大小的微晶体的球形 聚集体的自由流动的粉末，所述微晶体的最大截面尺寸少于50微米并且 优选地少于20微米。形成的具有优选共沉淀剂的微粒的显著方面是在暴 露于高湿度诸如高达80％RH时，它们的大小和形态基本保持不变。此外， 在再干燥后，它们的自由流动特性和空气动力学特性可以保持。
通过在共沉淀前改变起始水溶液中生物活性分子和核心分子的比率， 可以方便地改变包被在每个微粒上的生物活性分子的数量。典型地，生物 活性分子将组成介于0.1wt％和50wt％之间的每个包被的微晶体。更优选 地，生物活性分子在微粒中的填充量将介于1wt％和40wt％之间。
典型地，至少一些生物活性分子中，甚至在暴露于高湿度后仍旧保持 高水平的活性。
典型地，在暴露于高温时，非-吸湿形包被的微粒是稳定的(即，基本 保持它们的生物学活性)并且在高达60℃可以保持稳定超过1个星期。这 有助于储藏并且显示甚至在非-冷冻条件下，由非-吸湿性包被的微粒形成 的药物制剂可以期望具有延长的贮存期限。
典型地，非吸湿性包被的微粒的核心物质在高达80％的相对湿度上， 将吸收少于5wt％，优选地少于0.5wt％的水。取决于填充量，包括生物 活性分子的微粒将典型地吸收更多数量wt％的水。
典型地，包被在晶核上的生物活性分子保持天然或近-天然的构型，即 生物活性分子在生产过程中不会发生不可逆的变性。还有利地发现，晶核 上的生物活性分子上的涂层在环境温度或高温下导致微粒储藏的稳定性 增加。例如，在重构到水性介质后，生物活性分子典型地可以保持它的大 部分生物活性。优选地，在25℃储藏6个月后，生物活性分子将保持大于 50％的其起始生物活性。更优选地，生物活性分子将保持超过80％的生物 活性和最优选地超过95％的生物活性。
所述的微细自由流动的微粒或混悬液典型地不粘附于玻璃瓶的壁上。 微粒典型地快速且彻底地重新溶解于水，水溶液(包含缓冲剂和盐诸如常 用于重构的那些)或生理流体中。干燥粉末或混悬液的充分重新溶解将通 常发生在少于2分钟内，优选地在少于60秒内并且最优选地在少于30秒 内。在水性缓冲液中重构的制剂典型地是低浊度，无色的溶液，其透明度 好于15FNU并且优选地好于6FNU(FNU＝Formazine浊度单位)。
当溶解于水溶液时，常见生物活性分子需要赋形剂或稳定剂的存在， 诸如缓冲化合物，盐，糖，表面活性剂和抗氧化剂。可以将这些包括进起 始水溶液中并且在共沉淀过程中掺入微粒中。然后，它们将存在于微粒的 重构上，例如作为药物制剂出现。典型地，在所有的成分沉淀后，赋形剂 将在微粒的外表面上被浓缩并且将渗透到生物活性分子的涂层中。典型的 抗氧化剂可以，例如，是半胱氨酸诸如以N-乙酰基半胱氨酸形式存在的， 而典型的表面活性剂可以是Tween。在共沉淀中，由于溶解在溶剂中，赋 形剂和生物活性分子的相对比率可能变化。这可以通过预先将选择的赋形 剂添加到起始水溶液，共沉淀溶剂或漂洗溶剂中进行控制，从而在干燥后， 在微粒中获得理想的比率。因此，例如，通过包含在漂洗溶剂中，可以将 有机可溶的糖或聚合物包被在蛋白质包被的微粒表面，从而提供提高的储 藏稳定性。或者，可以将添加剂包括进漂洗溶剂中并且包被在微粒的外表 面上从而提高微粒本身的物理特性。例如，发现在干燥前，通过用在2- 丙醇中的异亮氨酸的溶液来漂洗形成的微晶体从而提供异亮氨酸包被的 胰岛素-甘氨酸微粒是有利的。与未包被的那些相比，这些微粒具有改良的 流动和空气动力学特性。
按照本发明的第三个方面，提供用于肺传递的药物制剂，其包括按照 第一个方面形成的微粒或在分批法中形成的微粒。
为了使用吸入法来将药物分子施用到血流中，必须将药物制作成能被 递送到深肺中的制剂。在干粉末的情况中，这通常需要物质平均(mass median)尺寸在1-5微米范围内的微粒，虽然已经证明可以使用具有特殊 空气动力学特性的更大微粒。按照本发明的微粒的某些制剂适合于形成肺 用的制剂，因为可以将它们用于产生微细自由流动的微粒，其良好地适合 于通过吸入法进行传递。如果生物活性分子在这些非-吸湿性包被的微粒表 面上，这些微粒通常非预期地显示低静电荷，并且应直接进行处理并将其 作为干粉末用在传递装置上。或者，例如，可以将它们用作在nebulisor 中的混悬液。
特别地，适合于形成肺用的药物制剂的生物活性分子可以包括但不局 限于任何如下物质：治疗用蛋白质诸如胰岛素，α1-抗胰蛋白酶，干扰素； 抗体和抗体片段和衍生物；治疗用肽和激素；合成性和天然DNA，其包 括基于DNA的药物；酶；疫苗成分；抗生素；止痛药(pain-killers)；水溶 性药物；水敏感性药物；脂质和表面活性剂；多糖；或它们的任何组合或 衍生物。可以将包括微粒的肺用的药剂直接用在吸入器装置上以提供高度 发散的剂量和高度微细的微粒部分。因此在MSLI(工作台(stage)1-5)上测 量发散剂量典型地大于70％。在MSLI(工作台3-5)上测量的微细微粒级分 典型地大于20％，并且优选地大于30％。将微细微粒级分定义为在多-工 作台液体碰撞取样器(Multi-Stage Liquid Impinger，MSLI)的下游工作台收 集的部分，并且其对应具有适合于通过吸入施用到深肺的空气动力学特性 的微粒，即少于约3.3微米。肺用的制剂可以不与任何另外的制剂一起在 干燥粉末递送装置中使用，所述另外的制剂具有例如，更大的载体微粒诸 如乳糖。
对于肺用的制剂，质量中位数气动粒径(mass median aerodynamic diameters)少于10微米，更优选地少于5微米的微粒是优选的。这些将 典型地具有与它们的质量中位数气动粒径相似的质量中位数气动粒径。典 型地优选最大截面直径在1-5微米范围内的自由流动的、非吸湿性低静电 的微粒。通过使用氨基酸诸如例如，L-谷氨酰胺来形成晶核可以获得这些。 但是，发明者已经令人惊讶地发现，以高长宽比薄片形式存在的生物活性 分子包被的微粒可以有利地具有比它们的最大截面直径小的质量中位数 气动粒径。适合的形状可以是，例如，叶状的或瓦状的。关于这些微粒， 最大截面直径的优选范围可以大于1-5微米并且可以例如是1-10微米。典 型地形成这种形状的生物分子包被的结晶微粒的共沉淀剂包括组氨酸和 D，L-缬氨酸。因此，对于干粉肺用制剂，还可以优选用产生高长宽比薄片 的共沉淀剂制备的微粒。
特别地，可以对肺用的制剂优选地进行选择使其具有由氨基酸组成的 晶核，所述氨基酸诸如缬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，甘氨酸或谷氨酰胺， 并且其，例如，包括：缬氨酸的晶核和治疗用蛋白质诸如胰岛素的涂层； 组氨酸的晶核和酶的涂层；缬氨酸的晶核和酶抑制剂诸如α-抗胰蛋白酶的 涂层；缬氨酸的晶核和DNA的涂层；缬氨酸的晶核和疫苗涂层；谷氨酰 胺的晶核和疫苗涂层；谷氨酰胺的晶核和白蛋白涂层。当形成用于制备制 剂的微粒时，优选使用产生在暴露于高湿度时不会聚集的离散微粒的共沉 淀剂。此外，优选共沉淀剂在施用后不会在患者口里留下令人不快的味道。 因此，高度优选谷氨酰胺，因为其可以暴露于高湿度并且具有清淡的味道。
按照本发明的第四个方面，提供肠胃的制剂，所述制剂包括按照第二 个方面的微粒或微粒的混悬液或在分批法中形成的微粒。这些制剂可以通 过多种方法包括静脉内的，皮下的或肌内的注射来进行递送，或可以使用 在持续释放剂或缓释剂中。可以以经济有效的方法来有利地生产这些微粒 从而提供在环境温度下显示延长的贮存寿命的灭菌胃肠道外制剂。可以优 选地将以粉末或混悬液形式存在的制剂在少于60秒内重构于水溶液中， 从而提供适合于注射的低浊度。生物活性分子特别地有毒或有效因此难于 作为干粉形式进行制备或操作时，可以优选混悬液的重构。或者，可以将 在溶剂诸如，例如乙醇中浓缩的微粒的混悬液不经重构直接用于胃肠道外 施用。这可以为需要以非常高剂型递送从而提供治疗效果的生物活性分子 提供便利。这些生物活性分子可以包括治疗用抗体及其衍生物。在重构后， 这些可以聚集或可以形成难于施用的高度粘性的溶液。因此可以将包含高 剂量生物活性分子的微粒的浓缩混悬液用于提供递送这些分子的备选的 更方便的和在治疗上有效的方法。生物活性分子包被的微粒特别地适合于 这种施用，因为它们非常快速地重构并且显示生物活性分子的最小限度的 聚集。聚集体的施用是不理想的，因为它可以起始不利免疫应答。
适合于通过胃肠道外递送施用的生物活性分子包括在本发明第三个 方面所述的那些。此外，胃肠道外施用可以用于递送更大的生物分子诸如 疫苗或抗体，所述疫苗或抗体因为不好的系统生物有效性而不适合于经过 肺施用到受试者的血流中。优选的晶核物质包括常用于胃肠道外制剂的赋 形剂诸如甘露糖醇和蔗糖。还优选天然氨基酸诸如L-谷氨酰胺，它们可以 用于形成快速重构的微粒，甚至在高温时也是稳定的，并且易于进行处理 和操作。还优选L-谷氨酰胺，因为已经将它以高剂量向患者施用而没有不 利的副作用。
按照本发明的第五个方面，提供持续释放或缓释的药物制剂(或长效制 剂)，其包括按照第一个方面或在分批法中形成的微粒或微粒的混悬液。对 于某些施用，优选产生在施用后，提供持续或延长治疗效应的胃肠道外制 剂或肺用的制剂或其它制剂。这可以，例如，用于限制在受试者血流中获 得的生物活性分子的最大浓度或用于延长重复施用之间需要的周期。或 者，可能需要改变微粒的表面特性以提高它们的生物有效性。可以将生物 活性分子包被的微粒方便地用于制备持续释放或缓释的制剂。这可以通过 包被微粒或将它们掺入另一种基质物质诸如凝胶或聚合物中或通过将它 们固定在传递装置内来实现。
例如，使用本领域已知技术，可以用改变微粒成分的释放或递送的物 质来对每个微粒进行均匀地包被。
可以用于包被微粒的物质，例如，是：难水溶性的可生物降解的聚合 物诸如，例如，聚交酯或聚乙醇酸交酯和它们的共聚物；聚氨基酸；水凝 胶；和其它本领域已知的物质，所述物质在响应对生理条件的暴露时改变 它们的溶解性或交联的程度。例如，通过使微粒的混悬液与包被物质的溶 液接触，然后干燥得到的微粒，可以进行涂层的施用。如果需要，可以重 复该过程以延长释放模式。发现包被的微粒可以提供生物活性分子向溶液 释放的基本不变的速率。或者，通过例如，粘合剂可以将多种微粒结合入， 例如，单片剂形式。粘合剂可以溶解在溶液中，随后当将片剂结合在一起 的粘合剂逐渐溶解时，微粒可以持续释放到溶液中。
那些本领域技术人员将理解使用上面教导的组合，可提供其它药物制 剂诸如例如鼻用制剂，口服制剂和局部用制剂。鼻用制剂和口服制剂可以 需要使用备选物质来包被微粒，所述备选物质提供对例如黏膜的粘附。
按照本发明第六个方面，提供包括微粒的肺递药装置，所述微粒按照 第二个方面或在分批法中形成。
肺递药装置可以，例如是液体雾化器，基于气溶胶的定量吸入器或干 粉分散装置。
附图简述
现在，通过实施例参考附图将描述本发明的实施方案，其中：
图1是沉淀于丙-2-醇的胰岛素/甘氨酸的颗粒大小分布的图示；
图2是沉淀于丙-2-醇的α-胰凝乳蛋白酶/L-丙氨酸的颗粒大小分布的 图示；
图3是沉淀于丙-2-醇的α-胰凝乳蛋白酶/D，L-缬氨酸的颗粒大小分 布的图示；
图4是沉淀于丙-2-醇的D，L-缬氨酸的颗粒大小分布的图示；
图5是沉淀于丙-2-醇的胰岛素/L-组氨酸的颗粒大小分布的图示；
图6是沉淀于丙-2-醇的D，L-缬氨酸的颗粒大小分布的图示；
图7是沉淀于丙-2-醇的L-谷氨酰胺的颗粒大小分布的图示；
图8是沉淀于丙-2-醇的L-谷氨酰胺的颗粒大小分布的图示；
图9是沉淀于丙-2-醇的白蛋白/L-谷氨酰胺的颗粒大小分布的图示；
图10是L-谷氨酰胺的差示蒸气吸着作用(DVS)的图表；
图11是L-甘氨酸的DVS图表；
图12是L-甘氨酸/胰岛素PCMCs的DVS图表；
图13是D，L-缬氨酸/胰岛素PCMCs的DVS图表；
图14是D，L-缬氨酸的DVS图表；
图15是白蛋白/L-谷氨酰胺的DVS图表；
图16是持续流动沉淀仪器的图示；
图17显示DQA-HEX和天然的寡核苷酸/D，L-缬氨酸在人造肺中的分 布；
图18是白喉类毒素(DT)PCMCs的图像；
图19显示由胰岛素/D，L-缬氨酸微粒提供的类似于USP胰岛素的生 物活性反应；
图20是金属丝肌动描记器(wire myograph)研究的图示，其再次显 示由胰岛素/D，L-缬氨酸微粒提供的类似于USP胰岛素的生物活性反应；
图21是胰岛素/D，L-缬氨酸PCMCs的SEM图像；
图22是胰岛素/D，L-缬氨酸PCMCs的SEM图像；
图23是白蛋白/L-组氨酸PCMCs的SEM图像；和
图24是胰岛素/L-组氨酸PCMCs的SEM图像；
图25是α-抗胰蛋白酶/D，L-缬氨酸PCMCs的SEM图像；
图26是按照分批法制备的理论抗生素装载量为9.1％w/w的妥布拉霉 素/D，L-缬氨酸晶体的SEM图像；
图27按照连续法制备的理论抗生素装载量为1.6％w/w的妥布拉霉素 /D，L-缬氨酸晶体的SEM图像；
图28是理论蛋白质装载量为0.7％w/w的枯草杆菌蛋白酶/谷氨酰胺晶 体从溶剂中干燥后直接上到SEM stub的SEM图像；
图29是理论蛋白质装载量为0.7％w/w的枯草杆菌蛋白酶/谷氨酰胺晶 体在Durapore 0.4微米滤器上过滤后在空气中干燥后的SEM图像；
图30是理论蛋白质装载量为6.4％w/w的枯草杆菌蛋白酶/谷氨酰胺晶 体从溶剂中干燥后直接上到SEM stub的SEM图像；
图31是理论蛋白质装载量为6.4％w/w的枯草杆菌蛋白酶/谷氨酰胺晶 体在Durapore 0.4微米滤器上过滤后在空气中干燥后的SEM图像；
图32是收集的沉淀于乙醇中10％理论蛋白质装载量的谷氨酰胺(底部 示踪)和白蛋白/谷氨酰胺(顶部示踪)的粉末X-射线衍射数据；
图33是2ml的小瓶，其包含50mg等重的通过临界点干燥的(A)或在 Durapore 0.4微米滤器上过滤并风干的(B)的枯草杆菌蛋白酶包被的D，L- 缬氨酸微晶体。
(应当指出，虽然在随后的实施例中，将包被的微粒称作PCMCs， 微粒不需要必须使用蛋白质进行包被并且可以具有任何生物活性涂层)。
实施例部分
实施例1
表1显示用于产生一类蛋白质包被的微晶体(PCMCs)的条件，其中形 成涂层的生物活性物质是胰岛素并且晶核由D，L-缬氨酸，L-缬氨酸，L- 组氨酸和L-甘氨酸形成。在玻璃小瓶或烧瓶中按照结晶过程下的表值 (entry)来制备微晶体并且通过电磁搅拌进行混合。
使用的胰岛素是牛胰脏胰岛素(Sigma I5500)和USP牛胰岛素(Sigma I8405)。
通过经过Durapore膜滤器(0.4微米)进行过滤来分离晶体，然后在通 风橱中进行风干。
使用Biorad蛋白质测定来确定装载的蛋白质。使用多-工作台液体碰 撞取样器来确定微细微粒级分(FPF)的百分比。
表1   生物活性   分子   生物活性分   子溶解于溶   剂中   溶剂/   H2O％   (v/v)   溶剂中生物   活性分子的   浓度(mg/ml)   赋形剂的添加   洗涤步骤   结晶方法   蛋白质回   收百分比   ％晶体中的蛋白质   ％FPF   80mg胰岛   素(I5500)   加入8ml   0.01M HCl，   然后400μl   1M NaOH   丙-2-醇   9.1％H2O   0.44   将8ml用D，L-缬氨   酸饱和的蒸馏水加   入胰岛素，得到8.6   的终pH和49％饱   和的D，L-缬氨酸   无   将14ml在D，L-缬氨酸   中的胰岛素滴加到   140ml丙-2-醇中，同时   在室温持续搅拌   -   18   40.0   10mg胰岛   素(I5500)   加入1ml   0.01M HCl，   然后50μl   1M NaOH   丙-2-醇   4.8％H2O   0.23   将1ml用D，L-缬氨   酸饱和的蒸馏水加   入胰岛素，得到8.68   的终pH和49％饱   和的D，L-缬氨酸   无   将1.75ml在D，L-缬氨酸   中的胰岛素滴加到   35ml丙-2-醇中，同时在   室温持续搅拌   -   14   32.1   20mg胰岛   素(I5500)   加入2ml   0.01M HCl，   然后100μl   1M NaOH   丙烷-1-醇   9.1％H2O   0.44   将2ml用D，L-缬氨   酸饱和的蒸馏水加   入胰岛素，得到8.61   的终pH和49％饱   和的D，L-缬氨酸   无   将3.5ml在D，L-缬氨酸   中的胰岛素滴加到   35ml丙烷-1-醇中，同时   在室温持续搅拌   -   33   32.0   20mg胰岛   素(I5500)   加入2ml   0.01M HCl，   然后100μl   1M NaOH   乙醇   9.1％H2O   0.44   将2ml用D，L-缬氨   酸饱和的蒸馏水加   入胰岛素，得到8.65   的终pH和49％饱   和的D，L-缬氨酸   无   将3.5ml在D，L-缬氨酸   中的胰岛素滴加到   35ml乙醇中，同时在室   温持续搅拌   -   18   27.0   20mg胰岛   素(I5500)   加入2ml   0.01M HCl，   然后100μl   1M NaOH   丙-2-醇   9.01％H2O   0.44   将2ml用D，L-缬氨   酸饱和的蒸馏水和   0.41ml无水丙-2-醇   加入胰岛素，得到   44％饱和的D，L-缬   氨酸(9.1％v/v丙   -2-醇在水相中   丙-2-醇   (9.1％   H2O v/v)   将3.85ml在D，L-缬氨酸   中的胰岛素滴加到   35ml丙-2-醇中，同时在   室温持续搅拌   -   20   31.0  20mg胰岛  素(I5500)   加入2ml   0.01M HCl，   然后100μl   1M NaOH   丙-2-醇   9.01％H2O   0.44   将2ml用D，L-缬氨   酸饱和的蒸馏水和   0.82ml无水丙-2-醇   加入胰岛素，得到   41％饱和的D，L-缬   氨酸(17％v/v丙   -2-醇在水相中   丙-2-醇   (8.9％   H2O v/v)  将4.2ml在D，L-缬氨酸  中的胰岛素滴加到  35ml丙-2-醇中，同时在  室温持续搅拌 -   23   49.7  20mg胰岛  素(USP)   加入2ml   0.01M HCl，   然后100μl   1MNaOH   丙-2-醇   9.1％H2O   0.44   将2ml用L-缬氨酸   饱和的蒸馏水加入   胰岛素，得到8.61   的终pH和49％饱   和的L-缬氨酸   无  将3.5ml在L-缬氨酸中  的胰岛素滴加到35ml  丙-2-醇中，同时在室温  持续搅拌 -   18   23.0  80mg胰岛  素(USP)   加入8ml   0.01M HCl，   然后400μl   1MNaOH   丙-2-醇   9.1％H2O   0.44   将8ml用L-组氨酸   饱和的蒸馏水加入   胰岛素，得到8.5的   终pH和49％饱和   的L-组氨酸   无  将14ml在L-组氨酸中  的胰岛素滴加到140ml  丙-2-醇中，同时在室温  持续搅拌 -   27.6   30.2  10mg胰岛  素(I5500)   加入1ml   0.01M HCl，   然后50μl   1M NaOH   丙-2-醇   4.8％H2O   0.23   将1ml用L-甘氨酸   饱和的蒸馏水加入   胰岛素，得到8.08   的终pH和49％饱   和的L-甘氨酸   用异亮氨   酸饱和的   丙-2-醇  将1.75ml在L-甘氨酸  中的胰岛素滴加到  35ml丙-2-醇中，同时在  室温持续搅拌 -   4.1   27.6
表1说明可以用一类不同的共沉淀剂制备具有适合于药物制剂的自由 流动物理特性的胰岛素包被的微粒。除了最后的表值，共沉淀作用都是在 低于80mg/ml的赋形剂浓度上进行的。在后种的情况中，使用修改的漂洗 方法来进一步用异亮氨酸包被晶体。一致地高微细微粒级分(FPF)和发散剂 量(未显示)举例说明微粒的自由流动性质并且说明显著的部分具有低于3 微米的有效气动尺寸。表1也清楚地说明改变方法条件从而改变胰岛素的 装载量和微粒的物理特性是可能的。
实施例2
表2显示如实施例1制备的一类另外的胰岛素包被的PCMCs，其中 晶核由L-甘氨酸，L-丙氨酸和L-精氨酸形成。
所用的胰岛素是牛胰脏胰岛素(Sigma I5500)和USP牛胰岛素(Sigma I8405)。
表2  生物活性  分子   生物活性分   子溶解于溶   剂中   溶剂/   H2O％   (v/v)   溶剂中生   物活性分   子的浓度   (mg/ml)   赋形剂的添加   洗涤步骤   结晶方法   蛋白质回收百分   比   ％晶体中的蛋白   质  ％FPF  20mg胰岛  素(I5500)   加入2ml   0.01M HCl，   然后100μl   1M NaOH   丙-2-醇   9.1％H2O   0.44   将2ml用L-甘氨   酸饱和的蒸馏水   加入胰岛素，得到   8.66的终pH和   49％饱和的L-甘   氨酸   无   将3.5ml在L-甘氨   酸中的胰岛素滴加   到35ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅   拌    -   5.4   7.2  80mg胰岛  素(I5500)   加入8ml   0.01M HCl，   然后400μl   1M NaOH   丙-2-醇   9.1％H2O   0.44   将8ml用L-丙氨   酸饱和的蒸馏水   加入胰岛素，得到   8.26的终pH和   49％饱和的L-丙   氨酸   无   将14ml在L-丙氨酸   中的胰岛素滴加到   140ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅   拌     -   7.0   10.5  20mg胰岛  素(USP)   加入2ml   0.01MHCl，   然后100μl   1M NaOH   丙-2-醇   9.1％H2O   0.44   将2ml用L-精氨   酸饱和的蒸馏水   加入胰岛素，得到   大于10的终pH   和49％饱和的L-   精氨酸   无   将3.5ml在L-精氨   酸中的胰岛素滴加   到35ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅   拌     -   1.3   1.1
表2显示从具有高溶解度的共沉淀剂产生的微粒在MSLI中具有较差 的特性。下面所述的颗粒大小测量也显示个别晶体的大聚集体的存在。举 例说明的另一点是当在近于饱和的浓度使用这些高溶解度的化合物时，不 能获得具有高装载量生物活性分子(胰岛素)的微粒。因此为了产生用于药 物制剂的微粒，使用更低溶解度的共沉淀剂和/或使用亚-饱和溶液来改良 WO 0069887所述的方法是优选的。
实施例3
表3显示具有D，L-缬氨酸晶核的一类胰岛素PCMCs。使用的水混溶 性溶剂是丙-2-醇。按照实施例1的方法来制备微晶体。
表3  生物活性  分子   生物活性分   子溶解于溶   剂中   H2O％   (v/v)   溶剂中生物   活性分子的   浓度(mg/ml)   赋形剂的添加  洗涤步骤   结晶方法   蛋白质回   收百分比   晶体中的蛋   白质最大百   分比  4mg胰岛  素(I5500)   加入6.4ml   0.01M HCl，   然后320μl   1M NaOH   9.1   0.028   将6.4ml用D，L-缬氨酸饱和   的蒸馏水加入胰岛素，得到   8.8的终pH和49％饱和的   D，L-缬氨酸  无水的丙-2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的   胰岛素滴加(0.1ml/min)到   7ml丙-2-醇中，同时在室温   持续搅拌   -   1.3  4mg胰岛  素(I5500)   加入3.2ml   0.01M HCl，   然后160μl   1M NaOH   9.1   0.055   将3.2ml用D，L-缬氨酸饱和   的蒸馏水加入胰岛素，得到   8.8的终pH和49％饱和的   D，L-缬氨酸  无水的丙-2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的   胰岛素滴加(0.1ml/min)到   7ml丙-2-醇中，同时在室温   持续搅拌   -   2.6  4mg胰岛  素(I5500)   加入1.6ml   0.01M HCl，   然后80μl   1M NaOH   9.1   0.11   将1.6ml用D，L-缬氨酸饱和   的蒸馏水加入胰岛素，得到   8.8的终pH和49％饱和的   D，L-缬氨酸  无水的丙-2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的   胰岛素滴加(0.1ml/min)到   7ml丙-2-醇中，同时在室温   持续搅拌   -   5.1  4mg胰岛  素(I5500)   加入0.8ml   0.01M HCl，   然后40μl   1M NaOH   9.1   0.22   将0.8ml用D，L-缬氨酸饱和   的蒸馏水加入胰岛素，得到   8.8的终pH和49％饱和的   D，L-缬氨酸  无水的丙-2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的   胰岛素滴加(0.1ml/min)到   7ml丙-2-醇中，同时在室温   持续搅拌   -   9.5  4mg胰岛  素(I5500)   加入0.4ml   0.01MHCl，   然后20μl   1M NaOH   9.1   0.44   将0.4ml用D，L-缬氨酸饱和   的蒸馏水加入胰岛素，得到   8.8的终pH和49％饱和的   D，L-缬氨酸  无水的丙-2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的   胰岛素滴加(0.1ml/min)到   7ml丙-2-醇中，同时在室温   持续搅拌   -   18  6mg胰岛  素(I5500)   加入0.4ml   0.01MHCl，   然后20μl   1M NaOH   9.1   0.67   将0.4ml用D，L-缬氨酸饱和   的蒸馏水加入胰岛素，得到   8.8的终pH和49％饱和的   D，L-缬氨酸  无水的丙-2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的   胰岛素滴加(0.1ml/min)到   7ml丙-2-醇中，同时在室温   持续搅拌   -   24
因此简单明了的是改变微粒中的蛋白质百分比从而提供具有不同剂 量强度的药物制剂。
实施例4
表4显示了一系列另外的具有D，L-缬氨酸晶核的胰岛素包被PCMCs。 按照实施例1制备微晶体。
表4   生物活性   分子   生物活性分子溶解   于溶剂中   H2O％   (v/v)   溶剂中生   物活性分   子的浓度   (mg/ml)   赋形剂的添加   洗涤步骤   结晶方法   蛋白质   的回收   百分比   晶体中的   蛋白质最   大百分比   4mg USP   胰岛   素(I8405)   加入0.4ml 0.01M   HCl，然后20μl 1M   NaOH   9.1   0.44   将0.4ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到8.8的   终pH和49％饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加(0.1ml/min)到7ml丙   -2-醇中，同时在室温持续搅拌   -   17   8mg USP   胰岛   素(I8405)   加入0.4ml   0.01MHCl，然后20   μl 1M NaOH   9.1   0.89   将0.4ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到8.8的   终pH和49％饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加(0.1ml/min)到7ml丙   -2-醇中，同时在室温持续搅拌   -   29   4mg USP   胰岛   素(I8405)   加入0.4ml 0.01M   HCl，然后20μl   1M NaOH   9.1   0.44   将0.4ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到8.8的   终pH和49％饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加(0.1ml/min)到7ml丙   -2-醇中，同时在室温持续搅拌   -   17   8mg USP   胰岛   素(I8405)   加入0.4ml 0.01M   HCl，然后20μl 1M   NaOH   9.1   0.89   将0.4ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到8.8的   终pH和49％饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加(0.1ml/min)到7ml丙   -2-醇中，同时在室温持续搅拌   -   29   4mg USP   胰岛   素(I8405)   加入0.4ml 0.01M   HCl，然后20μl   1M NaOH   9.1   0.44   将0.4ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到8.8的   终pH和49％饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加(0.1ml/min)到7ml丙   -2-醇中，同时在室温持续搅拌   -   16   8mg USP   胰岛   素(I8405)   加入0.4ml   0.01MHCl，然后20   μl 1M NaOH   9.1   0.89   将0.4ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到8.8的   终pH和49％饱和的D，L-缬氨   酸   无水的丙   -2-醇   将0.7ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加(0.1ml/min)到7ml丙   -2-醇中，同时在室温持续搅拌   -   30   20mg USP   胰岛   素(I8405)   加入2ml 0.01M   HCl，然后100μl   1M NaOH   9.1   0.44   将2ml用D，L-缬氨酸饱和的蒸   馏水加入胰岛素，得到8.8的终   pH和49％饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将3.5ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到35ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   -   17   20mg USP   胰岛   素(I8405)   加入2ml 0.01M   HCl，然后100μl   1M NaOH   9.1   0.44   将2ml用D，L-缬氨酸饱和的蒸   馏水加入胰岛素，得到8.8的终   pH和49％饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将3.5ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到35ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌 -   17   16mg USP   胰岛   素(I8405)   1.6ml 0.01M HCl   9.1   0.44   将1.6ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到49％   饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将2.8ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到28ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   17   12mg USP   胰岛   素(I8405)   加入1.2ml 0.01M   HCl，然后60μl 1M   NaOH   9.1   0.44   将1.2ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到49％   饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将2.1ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到21ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   17   12mg USP   胰岛   素(I8405)   加入1.2ml 0.01M   HCl，然后60μl 1M   NaOH   9.1   0.44   将1.2ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到49％   饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将2.1ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到21ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   17   12mg USP   胰岛   素(I8405)   1.2ml 0.01MHCl，   9.1   0.44   将1.2ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到49％   饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将2.1ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到21ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   17   12mg USP   胰岛   素(I8405)   加入1.2ml 0.01M   HCl，   9.1   0.44   将1.2ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到49％   饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将2.1ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到21ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   17   20mg USP   胰岛   素(I8405)   加入2.0ml 0.01M   HCl，然后100μl   1M NaOH   9.1   0.44   将2ml用D，L-缬氨酸饱和的蒸   馏水加入胰岛素，得到49％饱   和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将3.5ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到35ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   17   17mg USP   胰岛   素(I8405)   加入1.7ml 0.01M   HCl，然后85μl 1M   NaOH   9.1   0.44   将1.7ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到49％   饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将3.4ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到34ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   17   17mg USP   胰岛   素(I8405)   加入1.7ml 0.01M   HCl，然后85μl 1M   NaOH   9.1   0.44   将1.7ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到49％   饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将3.4ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到34ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   17
这些结果说明这些微粒的生产是可以再现的。
实施例5
颗粒大小分析
使用Mastersizer 2000在生物活性包被的微粒上进行激光衍射颗粒大 小分析。简而言之，将足量的PCMC加入包含60ml 2-丙醇的Mastersizer 2000样品固定器中以保证在10和20％之间的激光遮蔽(obscuration)。然后 使用前面建立的标准操作方法进行测量。
d(0.1)(μm)＝10％的微粒尺寸低于该颗粒大小。
d(0.5)(μm)＝50％的微粒尺寸高于和低于该颗粒大小。
d(0.9)(μm)＝90％的微粒尺寸低于该颗粒大小。
跨度＝d(0.9)-d(0.1)/d(0.5)
跨度提供了群体均一性的良好指示。因此，优选低于5的跨度值并且 特别优选低于2的跨度值。
当将甘氨酸和丙氨酸的饱和溶液用作核心赋形剂时，产生的典型大小 分布模式，显示于图1和图2。图1显示沉淀于丙-2-醇的胰岛素/甘氨酸的 颗粒大小分布。图2显示沉淀于丙-2-醇的α-胰凝乳蛋白酶/丙氨酸的颗粒 大小分布。
图1和图2说明了当将极易溶的赋形剂(例如，甘氨酸和丙氨酸)的饱 和溶液或浓缩溶液在按照WO 0069887进行的共沉淀过程中用作核心物质 时的大颗粒大小分布。特别地，可见有两个群体，一个由微粒组成，更大 的一个由更小微粒的附聚物组成。对于具有均一溶解度和生物有效性特性 的药物制剂的制备，这不是理想的。
相反地，图3-9显示当溶解度较低的赋形剂诸如D，L-缬氨酸，L-谷氨 酰胺和L-组氨酸组成微粒的核心时，获得了更窄的颗粒大小分布。它们还 说明形成了小的聚集体，或没有大的聚集体形成。可以意欲这些微粒提供 具有均一溶解度和生物有效性特性的药物制剂。
图3表示当15mg胰凝乳蛋白酶溶解于3ml 50％饱和的DL-缬氨酸溶 液时形成的PCMCs。使6ml水溶液沉淀于35ml D，L-缬氨酸饱和的2-丙醇。 使用微孔过滤系统来干燥微粒。
图4显示当在Mastersizer样品室中使用Hamilton注射器使0.2ml的饱 和D，L-缬氨酸溶液沉淀于60ml不饱和2-丙醇中时，伴随搅拌器速度 ＝2000rpm形成的PCMCs。微粒在Mastersizer内部形成并且直接进行测量。 据认为，在这个样品中观察到的更窄大小分布的出现是因为使用了高搅拌 速度和因为没有以干粉形式分离微粒。使用传统分离技术典型地导致更聚 集化的制剂。
图5表示使用电磁搅拌器，当14ml的饱和L-组氨酸沉淀于140ml L- 组氨酸饱和的2-丙醇时形成的PCMCs。使用微孔过滤系统来干燥微粒。
图6表示当在Mastersizer样品室中使0.2ml的饱和D，L-缬氨酸沉淀于 60ml不饱和2-丙醇时，伴随搅拌器速度＝1500rpm形成的PCMCs。在 Mastersizer内部形成了微粒，并且直接对其进行测量。
图7表示当在快速搅拌下，使用5ml吸移管使0.6ml的L-谷氨酰胺饱 和的溶液沉淀于6ml L-谷氨酰胺饱和的2-丙醇溶液中时形成的PCMCs。 使用微孔过滤系统来干燥微粒。
图8表示当在快速搅拌下，使用小的注射器泵使0.6ml的L-谷氨酰胺 饱和的溶液沉淀于6ml L-谷氨酰胺饱和的2-丙醇溶液中时形成的PCMCs。 使用微孔过滤系统来干燥微粒。
图9表示当5％装载量的白蛋白L-谷氨酰胺沉淀于丙-2-醇时，中度搅 拌形成的PCMCs。将1ml的白蛋白溶解于0.6ml的L-谷氨酰胺饱和的溶 液中。在中度搅拌条件下，使用注射器泵，将0.5ml的这种溶液沉淀于5ml 用L-谷氨酰胺饱和的2-丙醇中。使用微孔过滤系统来干燥微粒。
将图1-9显示的结果归纳于下面的表5中。
表5   制剂   d(0.1)μm   (SD)   d(0.5)μm   (SD)   d(0.9)μm   (SD)   跨度   (SD)   图1   5.719   (0.062)   19.790   (0.557)   317.870   (8.207)   15.777   (0.146)   图2   4.779   (0.092)   17.995   (1.567)   137.383   (9.808)   7.720   (0.139)   图3   10.823   22.243   42.241   1.412   (0.163)   (0.343)   (0.191)   (0.012)  图4   6.869   (0.097)   10.662   (0.168)   16.162   (0.268)   0.871   (0.003)  图5   4.917   (0.105)   9.940   (0.147)   21.156   (1.085)   1.431   (0.228)  图6   5.965   (0.076)   9.002   (0.125)   13.321   (0.197)   0.815   (0.005)  图7   11.914   (0.057)   23.227   (0.144)   42.006   (0.400)   1.292   (0.002)  图8   9.615   (0.160)   20.046   (0.245)   37.665   (0.462)   1.399   (0.001)  图9   13.485   (0.190)   26.281   (0.317)   48.044   (0.567)   1.314   (0.003)
d(0.1)，d(0.5)，d(0.9)和跨度平均值以及标准差(n＝3)。
表5中的结果显示可以通过选择优选的共沉淀剂来再现地获得具有相 对窄大小分布和显示最少聚集的制剂。还可见如通过mastersizer测定的这 些微粒的体积中径典型地少于30微米并且可以少于10微米。这些微粒的 SEM图像典型地说明平均最大截面尺寸定性地低于由Mastersizer测量的 平均物质尺寸。
由连续法产生的微晶体和生物活性分子包被的微晶体典型地显示跨 度少于5，优选地少于2并且更优选地少于1.5的窄大小分布。通过共沉 淀产生的生物活性分子包被的微晶体通常有利地小于通过纯载体物质的 沉淀产生的微晶体。这与微晶体表面上的生物活性分子涂层是一致的。
通过使用实施例9所述的持续流动沉淀器，进行异丙醇中的共沉淀来 制备都具有10％蛋白质装载量的D，L-缬氨酸(Cytc/val)、甘氨酸(Cytc/gly) 和L-谷氨酰胺(Cytc/gln)的细胞色素c包被的微晶体。大小分布表，显示获 得的平均大小和跨度。
大小分布表   样品   d(0.5)/微米   跨度   D，L-缬氨酸   21.810   1.32   Cytc/val   12.65   1.22   甘氨酸   58.370   1.72   Cytc/gly   31.949   2.07   L-谷氨酰胺   36.373   1.88   Cytc/gln   20.355   1.71
这些结果清楚地显示相对于未包被的微晶体，生物活性分子包被的微 晶体的大小减少。测量的跨度在每种情况中少于5并且可以少于1.5。可 以通过改变工艺操作条件诸如温度或通过提高混合效率来使颗粒大小进 一步减少。
实施例6
来自干粉吸入器中的剂量发射
使用Astra Draco多-工作台液体碰撞取样器(MSLI)，来确定干粉吸入 器的剂量发射。剂量的有效部分称为微细微粒级分(FPF)。如下面的表6 所示，微细微粒级分(FPF)通常在MSLI的下游工作台收集。将表6用于计 算重要工作台的截面尺寸。
表6  工作台   截面尺寸(μm)   流动速率(1min-1)  工作台4   ECD4＝1.7(Ω/60)1/2   30≤Ω≤100  工作台3   ECD3＝3.1(Ω/60)1/2   30≤Ω≤100  工作台2   ECD2＝6.8(Ω/60)1/2   30≤Ω≤100
在随后的实验中，使用了601min-1的流动速率，得到的工作台2，3&4 的截面尺寸分别为6.8，3.1和1.7微米。
在所有的MSLI实验中使用如下程序：
(a)对于在可通过商业获得的硫酸沙丁胺醇制剂(喘乐宁)的起初工作 上，将这些制剂用作标准。
(b)对于Size 3PCMC制剂，使用许多共同在10-20mg之间的干粉 PCMC来填充胶囊。
(c)在夹紧工作台1-4之前，将滤纸加入MSLI的工作台5。向工作台 1-4的每个都加入20ml水。将短管部分与工作台1的顶部连接后，将衔接 头部件连接于短管的末端。通过在diskhaler情况中的泡眼包装或aerohaler 情况中的Size3胶囊上穿刺孔来起始干粉吸入器的使用。随后，将干粉吸 入器置于衔接头上，并且接通泵达4秒以将制剂从吸入器传递到MSLI。 对于每个吸入器中的泡眼或胶囊进行刺激。
在每种情况中，使用aerohaler将PCMC制剂剂量发射递送到MSLI 上。
将制剂递送到MSLI后，如下进行样品收集：
(a)将装置从衔接头上移去后，移去胶囊并将其置于培养皿上，随后 加入20ml的水。
(b)将衔接头从MSLI的短管移去并置于培养皿上，随后加入10ml水。
(c)将短管从MSLI上移去，并用20ml水漂洗到培养皿中。
(d)将工作台1-4从过滤器平台上松开，用20ml的水漂洗工作台1的 开口。随后进行搅拌以溶解所有的粉末。
(e)将过滤器从MSLI上移去并且置于培养皿中，随后添加10ml水。
(f)将5ml等分试样从每个工作台移去，并且通过HPLC对其进行分 析以确定硫酸沙丁胺醇的浓度。使用Bio Rad蛋白质微量分析来确定 PCMC蛋白质的浓度。
使用硫酸沙丁胺醇制剂起始工作
下面显示自吸入器的硫酸沙丁胺醇制剂发射结果(表7和表8)和自 Aerohaler(inhalator)的硫酸沙丁胺醇制剂发射结果(表9和10)。
表7-diskhaler   工作台   总发射剂量的回收百分比   装置和泡眼包装   12.6   短管和衔接头   14.3  工作台1   41.9  工作台2   6.9  工作台3   7.5  工作台4   9.1  工作台5   7.9
FPF＝25％
剂量的回收总药物量为98％。
表8-diskhaler   工作台   总发射剂量的回收百分比   装置和泡眼包装   12.9   短管和衔接头   17.1   工作台1   37.8   工作台2   6.7   工作台3   8.3   工作台4   9.4   工作台5   7.8
微细微粒级分(工作台3，4&5)＝26％
剂量的回收总药物量为92％。
表9-Aerohaler   工作台   总发射剂量的回收百分比   装置和泡眼包装   11.3   短管和衔接头   25.2   工作台1   33.4   工作台2   7.2   工作台3   8.7   工作台4   8.3   工作台5   5.9
微细微粒级分(工作台3，4&5)＝23％
剂量的回收总药物量为92％。
表10-Aerohaler   工作台   总发射剂量的回收百分比   装置和泡眼包装   11.0   短管和衔接头   24.1   工作台1   33.1   工作台2   9.0   工作台3   8.5   工作台4   8.6   工作台5   5.7
微细微粒级分(工作台3，4&5)＝23％
Ventolin diskhaler在MSLI中提供大约26％的微细微粒级分(FPF)。大 约70％的剂量从ventolin吸入器被递送到冲击器(impactor)。 Inhalator(Atrovent)在MSLI中提供大约28％的微细微粒级分(FPF)。
这些数值与在关于这些制剂和装置的文献中报道的那些相符，并且说 明对MSLI进行了正确地校准和操作。
MSLI中的PCMC剂量发射
胰凝乳蛋白酶制剂
使用如下技术进行胰凝乳蛋白酶PCMCs的制备：
将胰凝乳蛋白酶溶解于饱和氨基酸溶液，从而得到10mg/ml浓度的水 溶液。水溶液沉淀于使用适当氨基酸(例如，L-甘氨酸，L-丙氨酸，D，L- 缬氨酸，DL-丝氨酸，L-亮氨酸和DL-异亮氨酸)预饱和的2-丙醇，其中2- 丙醇体积是水溶液的15倍。
表11-胰凝乳蛋白酶/L-甘氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   54.4   工作台2   5.6   工作台3   1.5   工作台4   2.5   工作台5   0.9   短管   10.4   衔接头   4.8   装置和胶囊   19.8
FPF＝5.0％
表12-胰凝乳蛋白酶/L-丙氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   47.6   工作台2   7.8   工作台3   5.4   工作台4   1.5   工作台5   1.4   短管   2.7   衔接头   0.7   装置和胶囊   32.8
FPF＝8.4％
表13-胰凝乳蛋白酶/D，L-缬氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比  工作台1   37.5  工作台2   13.4  工作台3   11.4  工作台4   4.5  工作台5   6.2   短管   15.5   衔接头   3.3   装置和胶囊   8.2
FPF＝22.1％
表14-胰凝乳蛋白酶/DL-丝氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   63.0   工作台2   6.4   工作台3   6.8   工作台4   6.9   工作台5   1.7   短管   5.3   衔接头   2.8   装置和胶囊   6.9
FPF＝15.4％
表15-胰凝乳蛋白酶/L-亮氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   73.3   工作台2   9.6   工作台3   0.4   工作台4   0.7   工作台5   0.3   短管   7.9   衔接头   3.5   装置和胶囊   2.4
FPF＝1.4％
表16-胰凝乳蛋白酶/DL-异亮氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   47.4   工作台2   11.3   工作台3   9.8   工作台4   5.7   工作台5   1.1   短管   14.7   衔接头   4.9   装置和胶囊   5.2
FPF＝16.6％
这些结果说明使用在25℃具有在20mg/ml到80mg/ml范围内水性溶 解度的晶核物质倾向于获得更高微细微粒级分。亮氨酸显示更低的微细微 粒级分，但是尽管如此，其产生相对较高的发射剂量。高发射剂量指示这 种和其它优选的氨基酸的自由流动性质。
胰岛素制剂
然后，以与胰凝乳蛋白酶PCMCs相似的方式制备胰岛素PCMCs。
表17-胰岛素/L-甘氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   64.2   工作台2   2.4   工作台3   4.3   工作台4   2.6   工作台5   0.3   短管   6.6   衔接头   0.8   装置和胶囊   18.7
FPF＝7.2％
表18-胰岛素/L丙氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   66.8   工作台2   7.7   工作台3   7.5   工作台4   2.4   工作台5   0.6   短管   5.0   衔接头   3.2   装置和胶囊   7.1
FPF＝10.5％
表19-胰岛素/D，L-缬氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   29.5   工作台2   11.7   工作台3   20.0   工作台4   14.2   工作台5   5.8   短管   8.6   衔接头   3.4   装置和胶囊   6.9
FPF＝40.0％
表20-胰岛素/谷氨酸钠  工作台   总发射剂量的回收百分比  工作台1   30.3  工作台2   10.5   工作台3   15.2   工作台4   10.5   工作台5   4.9   短管   15.2   衔接头   4.4   装置和胶囊   9.0
FPF＝30.6％
表21-胰岛素/L-精氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   53.9   工作台2   28.1   工作台3   0.5   工作台4   0.2   工作台5   0.4   短管   13.9   衔接头   1.3   装置和胶囊   1.9
FPF＝1.1％
表22-胰岛素/L-缬氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   48.3   工作台2   11.6   工作台3   10.4   工作台4   9.6   工作台5   3.0   短管   11.9   衔接头   1.6   装置和胶囊   3.6
FPF＝23.0％
表23-胰岛素/L-组氨酸   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   26.6   工作台2   19.0   工作台3   20.6   工作台4   5.6   工作台5   4.0   短管   7.8   衔接头   5.5   装置和胶囊   11.0
FPF＝8.4％
这些结果还说明使用在25℃具有在20mg/ml到80mg/ml范围内水性 溶解度的晶核物质倾向于获得更高级微细微粒级分和自由流动的粉末。谷 氨酸钠显示了比预期更高级的微细微粒级分，但是据认为这是因为蛋白质 对微粒的包被不足导致了单独的蛋白质微粒的形成。由于聚集体形成导致 的这种制剂的更差发射剂量证实了这点。
白蛋白制剂
将75mg的白蛋白溶解于15ml L-谷氨酰胺的饱和溶液中并且以 500rpm的速度在溶解容器中通过注射器泵分散到150ml的2-丙醇中。
表24-胰岛素/L-谷氨酰胺  工作台   总发射剂量的回收百分比  工作台1   46.0  工作台2   8.3  工作台3   12.8  工作台4   12.5  工作台5   3.8   短管   7.1   衔接头   2.9   装置和胶囊   6.6
FPF＝29.1％
从Mastersizer实验得到的这些结果都支持使用核心物质的极易溶赋形 剂(例如，甘氨酸，丙氨酸，精氨酸)的浓缩溶液导致了由于聚集而不适合 于药物制剂，特别地肺的药物递送的生物活性分子包被微粒的产生。另一 方面，还可见使用较低溶解的氨基酸(例如组氨酸，谷氨酰胺和缬氨酸)制 备的微粒产生自由流动的粉末。可以将这些用于提供适合肺的药物传递的 制剂。还意欲可以将这些生产方法的改进用于提供具有甚至更高级微细微 粒级分的微粒。
实施例7
控释实验
将聚-乳酸(PLA)包被的白蛋白L-谷氨酰胺PCMCs用在控释实验中。
采取随后的方法来使用PLA包被白蛋白/L-谷氨酰胺PCMCs。通过将 31mg的白蛋白溶解在6.2ml的50％饱和的L-谷氨酰胺溶液中来制备白蛋 白/L-谷氨酰胺PCMCs。然后将水溶液沉淀于40ml的L-谷氨酰胺饱和的 2-丙醇中。使用微孔过滤系统来干燥这些微粒。如下对白蛋白/L-谷氨酰胺 PCMCs进行包被：
ExptA：将20mg白蛋白/L-谷氨酰胺PCMCs悬浮在2ml丙酮/PLA溶液 中(50mg/ml)，随后蒸发丙酮。得到的制剂形成非常稠密的PLA溶液，其 在彻底干燥后形成胶粘的、易碎的沉淀物。
ExptB：将20mg白蛋白/L-谷氨酰胺PCMCs悬浮在2ml丙酮/PLA溶 液中(50mg/ml)，并且在剧烈搅拌下沉淀于20ml 2-丙醇中。得到的制剂形 成大的不溶的沉淀。
ExptC：将10mg白蛋白/L-谷氨酰胺PCMCs悬浮在10ml 2-丙醇溶液 中，随后在剧烈搅拌下添加0.4ml的丙酮/PLA溶液(50mg/ml)。
如下在干燥的包被PCMCs上进行蛋白质的释放研究：
将包被的PCMCs添加到15ml的水中并且搅拌。在限定的时间间隔上， 将0.8ml的水溶液的等分试样加到0.2ml的Bio Rad蛋白质微量试样中， 并且通过在595nm的UV分析来确定蛋白质释放的量。还测定了未包被 PCMC对照的蛋白质释放。这项研究的结果显示在下面的表25中。
表25   时间   (min)                            ％蛋白质释放   未包被的PCMC   包被的PCMC C  包被的PCMCA   包被的PCMC B   1   100   13.0  3.1   0.4   40   100   27.2  11.9   2.8   90   100   44.2  14.1   5.5   180   100   57.7  20.1   10.6   270   100   69.6  23.9   14.0   360   100   68.9  25.4   15.6
从表25清楚的是，与在一分钟内被释放到水溶液中的未包被的 PCMCs相比，PLA涂层提供了持续不变的释放模式。通过改变涂层，还 可能调整蛋白质的释放。因此为了特定用途，对从PCMC的蛋白质的释放 进行定制是可能的。
实施例8
动态蒸气吸着作用(DVS)
使用动态蒸气吸着作用1000(表面测量系统)通过动态蒸气吸着作用 (DVS)，在受控的湿润环境下，进行由本共沉淀方法产生的生物活性分子 包被的微粒的水吸收和单独沉淀的核心物质的水吸收。
实验如下进行安排：
DVS使用2完整-周期实验的特殊自动操作(SAO)流程，其包括在0％ 相对湿度(RH)的起始干燥阶段。其后是吸着阶段，其中每个时期的RH从 10％RH上升到90％RH逐渐递增，然后，最终跃到95％RH。其继续进行 到同等的解吸周期，RH落到0％RH。重复该周期。使用随后的标准来控 制DVS阶段变化：质量增加的变化速率，即dm/dt降到0.002，或最大周 期(stage)时间是2000分钟。
在引入样品之前，对天平进行配衡并且使仪器平衡直到观察到稳定的 基线。然后上载微粒并且记录起始重量，其随后接通SAO。进行实验直到 完成SAO。
图10-14分别是L-谷氨酰胺；L-甘氨酸；L-甘氨酸/胰岛素PCMCs；D，L- 缬氨酸/胰岛素PCMCs和D，L-缬氨酸的DVS图表。
图10-14显示核心共沉淀剂展示了在高达80％的相对湿度上的非常低 的吸湿性。高于80％RH时，更易溶的共沉淀剂如L-甘氨酸(图11)开始吸 收相当大量的水。发现在核心物质表面上的蛋白质涂层导致形成了与核心 物质单独吸收相比，吸收更多水的制剂。这是被期待的，因为蛋白质包被 在晶体的外部上。重要的是，样品典型地显示在经过完整周期后，它们的 蒸气吸着等温线的最小变化。即，通常第二个吸着周期与第一个非常相似。 那些本领域技术人员将认识到这举例说明微粒不经历明显的水蒸气诱导 变化诸如玻璃到晶体转换。因此期待在高湿度下微粒的储藏是稳定的。
在另一个实施方案中，在起始干燥阶段后，使用单一周期SAO(SAO2) 来使相对湿度从0％升到80％，随后是同等的解吸周期。其显示于图15。 按照前面所述的方法(MSLI部分)，样品在MSLI中收集并且运转。
将75mg白蛋白溶解于15ml的L-谷氨酰胺的饱和溶液中，并且通过 注射器泵以500rpm的速度将其分散到溶解容器中的150ml的2-丙醇中。 使用SAO2，在DVS的水合作用之前和之后，将10mg的干粉制剂在MSLI 中进行运转。
表26显示在DVS中温育之前。
表26  工作台   总发射剂量的回收百分比  工作台1   46.0  工作台2   8.3  工作台3   12.8  工作台4   12.5  工作台5   3.8   短管   7.1   衔接头   2.9   装置和胶囊   6.6
FPF＝29.1％
表27显示在DVS中温育之后。
表27   工作台   总发射剂量的回收百分比   工作台1   48.0   工作台2   8.8   工作台3   13.5   工作台4   14.9   工作台5   3.5   短管   7.8   衔接头   1.9   装置和胶囊   1.4
FPF＝31.9％
显示于表26和27的结果说明微粒的自由流动性质，微细微粒级分和 聚集的程度基本上不被在DVS中80％RH下的温育所影响。对于药物制剂 特别是肺用的药物制剂的生产，这有着重要的益处，因为在递送装置中可 能会发生暴露于湿度气氛中。
而且，与气动特性的保留相符，平衡于高湿度的生物活性分子包被的 微晶体的SEM图像显示微粒基本保留与储藏在干燥条件下的那些一样的 形状和大小。
实施例9
在流动沉淀器中的PCMCs的产生
图16是一个连续流动沉淀装置的图示，通常标明为10。流动沉淀装 置10包括溶剂A12(例如，包含浓缩共沉淀剂和生物活性分子的水溶液) 和溶剂B14(例如，共沉淀剂饱和的溶剂相)的来源。将溶剂12，14通过泵(未 显示)沿着生物适合的管16泵到混合装置18中。还显示了混合装置18的 截面，所述截面图显示溶剂12，14进入混合装置18，以及出口和排出管 20。使用混悬液收集容器22来收集形成的PCMCs。
一个泵连续地传递包含浓缩的共沉淀剂和生物活性分子的水溶液而 另一个泵传递共沉淀剂饱和的溶剂相。可以使用另外的泵，如果需要第三 种成分诸如微粒包被物质。
泵可以具有许多不同的种类，但是必须以限定的流速精确地传递溶液 并且与使用的生物活性分子是相容的。方便地，可以使用HPLC泵，因为 对于在一系列流速上传递水溶液和水混溶性试剂，它们是最优化的。典型 地，将在介于0.1ml/min和20ml/min的流速上来传递水溶液。水泵的闸 首和管路应该用抗生物活性分子淤积的物质制作。通常传递溶剂的速度比 传递水的速度快4-100倍，因此可能需要更有力的泵。典型地，传递溶剂 的速度可以介于2ml/min和200ml/min之间。
混合装置18提供将连续水流和连续水混溶性溶剂流快速而紧密地混 合的方法从而使沉淀几乎立即开始发生。图16中的图解仅是说明性的并 且可以使用许多不同的几何结构。
混合装置18可以是使两种流动物快速混合的任何装置。因此，其可 以，例如，是通过使进入的液体流带型成形的静止装置或主动地将两股溶 剂流搅拌在一起的动态装置。其优选地，是动态装置。通过使用许多种方 法诸如搅拌，声波振荡，摇动或相似方法来搅动两流。搅拌方法包括浆式 搅拌机，螺旋搅拌机和电磁搅拌器。如果使用电磁搅拌，可以使用具有不 同外形的搅拌棒诸如，例如单棒条或Maltese十字管。可以优选地，选择 排列在混合装置内部的物质从而防止生物活性分子或微粒显著结合在其 上。适当的物质可以包括316不锈钢，钛，聚硅氧烷和特氟隆(已注册的商 标)。
根据需要的生产规模，可以生产不同大小和几何结构的混合装置。需 要的混合室的大小是两种溶剂流的流速的函数。对于大约0.025-2ml/min 的水流速和2.5-20ml/min的溶剂流速，适合使用小的混合室，诸如0.2ml。
实验流程
持续流动共-沉淀器
使用两种HPLC泵和重新设计的动态溶剂混合室来开发持续共-沉淀 系统。使用的泵是Gilson 303HPLC泵，其提供从0.01到9.99ml min-1的 可变流速。对重新设计的混合室，以前是Gilson 811C动态混合器，进行 修改从而提供共沉淀剂的迅速混合和结晶。设计的目的是产生具有低内部 停留容积的流动室，其提供产物晶体的迅速流出。
从Gilson 811C混合室中移去内部静态混合器/滤器元件并且用从 PTFE加工定做的插入物取代。对这种插入物进行设计以使内部停留容积 大大减少并且增加内部流动湍流。预期增加的湍流减少晶体的大小和使晶 体粘合形成聚集体的可能最小化。通过修改内部动态混合器，还进一步控 制内部湍流。用备选的形状象Maltese十字管的电磁搅拌棒取代起初的元 件，然后将其与可变速的MINI MR标准电磁搅拌器元件偶联，其容许达 到0-1500rpm的速度。
排出管的内部尺寸约为0.5mm并且与封闭的玻璃广口瓶连接，其中对 混悬液进行持续收集并且容许其沉降。
药物有效物质的持续流动微晶体沉淀
在主要地水溶液中制备感兴趣的物质的饱和溶液，如果需要，所述水 溶液可以包含一些水混溶性试剂。在主要地水混溶性溶剂或溶剂的混合物 中制备相同物质的饱和溶液。将主要地水溶液通过一个泵传递到动态混合 器，并且将主要地溶剂溶液通过另一个泵进行传递。可以调节两个泵的流 动速率从而提供沉淀发生的最适当的条件。通常，一个泵的流动速率将至 少4倍大于另一个从而改变溶剂条件，使沉淀在混合室中足够快地开始发 生。换言之，需要快速发生成核作用以形成微晶体(即PCMCs)。
实施例：D，L-缬氨酸微晶体
通过用D，L-缬氨酸使两种选择的溶剂饱和来开始基本程序。在这个具 体实施例中，这两种溶剂是水和异丙醇。在室内从微孔水纯化系统获得水。 异丙醇(丙-2-醇/GPR)，产品号296942D，批号K30897546 227由BDH提 供以及D，L-缬氨酸，产品号94640，批号410496/1由Fluka Chemik提供。 通过向特定量的溶剂加入过量D，L-缬氨酸来使这两种溶液达到饱和。然后 将其在自动摇动机器上摇动过夜。室温摇动约12小时后，将溶剂通过 Whatman Durapore(0.45μm)膜滤器进行过滤。
制备溶液后，用蛋白质/D，L-缬氨酸水溶液灌注泵A。泵B用D，L-缬 氨酸溶液灌注。在开始共沉淀之前，将电磁搅拌器的速度设定在约750rpm 上。将泵A设定在0.25ml min-1，泵B设定在4.75ml min-1。一旦准备好， 同时启动泵，从而开始共沉淀。
通过重力过滤和搅拌进行微晶体(即PCMCs)的分离产生了自由流动 的干粉。这些晶体的SEM图像显示窄大小分散和一致的片状形态。
L-谷氨酰胺微晶体
通过用L-谷氨酰胺使两种选择的溶剂饱和来开始基本程序。在这个具 体实施例中，这两种溶剂是水和异丙醇。在室内从微孔水纯化系统获得水。 异丙醇(丙-2-醇/GPR)，产品号296942D，批号K30897546 227由BDH提 供以及D，L-缬氨酸，产品号94640，批号410496/1由Fluka Chemik提供。 通过向特定量的溶剂加入过量L-谷氨酰胺来使这两种溶液达到饱和。然后 将其在自动摇动机器上摇动过夜。室温摇动约12小时后，将溶剂通过 Whatman Durapore(0.45μm)膜滤器进行过滤。
制备溶液后，用L-谷氨酰胺水溶液灌注泵A。泵B用L-谷氨酰胺的 异丙醇溶液灌注。在开始共沉淀之前，将电磁搅拌器的速度设定在约 750rpm上。将泵A设定在0.25ml min-1，泵B设定在4.75ml min-1。一旦 准备好，同时启动泵，从而起始持续流动共沉淀过程。
通过重力过滤分离微晶体产生紧密的干粉。这些晶体的SEM图像显 示窄大小分散和一致的拉长片状形态。
还将相似的方法用于从饱和溶液中沉淀甘氨酸。
生物活性分子微晶体共沉淀(即PCMCs的形成)
下面介绍典型的共沉淀实验，其原理来自先前的蛋白质包被的微晶体 的微克分批制备。
作为实验平台，将由Europa Bioproducts Ltd供应的产品号EU122C， 批号LAY Y53-002，分离自Candida cyclindracea(rugosa)的蛋白质Europa酯 酶1(Cc/F5)沉淀到D，L-缬氨酸上，其由Fluka Chemika供应，产品号94640， 批号410496/1。然后通过过滤分离该共沉淀产物，随后通过扫描电子显微 镜和酶促试验来对它进行分析。
通过用D，L-缬氨酸使两种溶剂溶液饱和来开始基本程序。在这个具体 实施例中，这两种溶液是水和异丙醇。在室内通过微孔水纯化系统获得水。 异丙醇(丙-2-醇/GPR)，产品号296942D，批号K30897546 227由BDH提 供。通过向特定量的溶剂加入过量D，L-缬氨酸来使这两种溶液达到饱和。 然后将其在自动摇动机器上摇动过夜。室温摇动约12小时后，将溶剂通 过Whatman Durapore(0.45μm)膜滤器进行过滤。
然后将规定量的在缓冲液中配制的酯酶蛋白质加入过滤的饱和水溶 液中。
制备溶液后，用该蛋白质/D，L-缬氨酸水溶液灌注泵A。泵B用D，L- 缬氨酸溶液灌注。在开始共沉淀之前，将电磁搅拌器的速度设定在约 750rpm上。将泵A设定在0.25ml min-1，泵B设定在4.75ml min-1。一旦 准备好，同时启动泵，从而开始共沉淀过程。
在烧瓶中收集共沉淀晶体产物(即PCMCs)，并且使其过夜沉降。沉 降后，倾去90％的上清溶液。烧瓶用新鲜异丙醇重新装满，从而洗去过量 D，L-缬氨酸产物。洗涤后，使用Whatman Durapore(0.45微米)膜滤器对产 物重新进行过滤。
分析方法
在分离共沉淀晶体后，使用光学显微镜和扫描电子显微镜进行晶体的 表征。两种技术都提供对产生的晶体的大小和形状的确定。
共沉淀后，通过酶促试验对蛋白质的活性进行评估。使用特定试验， 其中酯酶蛋白质酶催化p-硝基苯基丁酸酯断裂形成丁醇和p-硝基苯酚。
在由Europa供应的纯酯酶和共沉淀到D，L-缬氨酸晶体上的酯酶之间 进行的平行研究说明了实质量的活性已经得以保留。
可以从沉淀的微晶体上移去溶剂。由上面持续流动系统或前面所述分 批法产生的混悬液可以在重力下进行沉降，倾去过量溶剂，得到大约5-20 重量％的最终混悬液。可以通过标准分离技术诸如过滤，离心或流化床对 它们进行进一步的浓缩和/或干燥。
对于非常低的残留溶剂，低堆积密度药物制剂和药学上有用的物质， 可以使用超临界CO2进行临界点干燥来将溶剂从上述混悬液中移去。已知 这种技术对于将残留的低水平溶剂从微粒上移去是有效的。我们已经意外 地发现，其还具有这样的优势，即与通过其它分离技术获得的相比，其可 以使粉末和药物制剂具有更低的堆积密度。对于生物活性分子的肺传递， 低堆积密度的制剂是特别有用的。可以以本领域已知的许多方式来进行临 界点干燥。
实施例
将25ml的在异丙醇中的D，L-缬氨酸晶体的2.5％w/v混悬液(如上制 备)装载到高压室中，并且使超临界流体CO2流经该混悬液，直到去除所 有的异丙醇。缓慢释放压力，并且将低残留溶剂，低堆积密度粉末转移到 封闭的容器中。超临界流体干燥过程没有影响窄大小分散。
实施例10
DNA包被的微晶体
检测的DNA的类型
·合成的寡核苷酸DQA-HEX(Dept of Chemistry，Strathclyde University，UK)
5′HEX(T*C)6GTG CTG CAG GTG TAA ACT TGT ACC AG
HEX＝2，5，′2′，4′，5′，7′-六氯-6-羧基荧光黄
T*＝5-(3-氨基丙炔基)-2′-脱氧尿苷
医学应用：常用于研究在HLA-DQ区域中的染色体6的等位基因特 异的寡核苷酸，其编码与免疫应答相关的II类主要组织相容性抗原，人类 白细胞抗原(D.Graham，B.J.Mallinder，D.Whitcombe，N.D Watson，和W.E Smith.Anal.Chem.2002，74，1069-1074)。
DNA包被的晶体在人造肺中的分布(MSLI)
已经制备了寡核苷酸包被的晶体并且显示形成了适合于肺施用的微 粒。使用纯的荧光标记的寡核苷酸DQA-Hex和其与来自鲱鱼精的天然寡 核苷酸制剂的混合物进行实验。混合实验使甚至在DQA-Hex的供应有限 时，寡核苷酸的装载量是变化的。
方法
1.OCMC的制备
样品1：DQA-HEX和天然寡核苷酸的混合物
4.6mg的天然寡核苷酸
来自鲱鱼精的DNA(Sigma D-3159，批号51K1281，被降解成“天然寡核 苷酸”，少于50bp，称为“天然寡聚物”)
加入300μl饱和的D，L-缬氨酸溶液，充分混合并且煮沸1分钟，然后 将其置于冰上。
加入100μl DQA-Hex(＝26.3μg)，在添加前将其煮沸1分钟(然后置于冰 上)。
将这种溶液滴加(Gilson移液器，黄色管尖)到6ml的2-prOH/用D，L- 缬氨酸饱和，同时在电磁搅拌器上以500rpm(Heidolph MR3000)的速度于 室温进行混合，让其沉降约30分钟，然后过滤(Durapore膜滤器， HVLPO4700型)，将晶体转移到玻璃小瓶中并且让其风干。
样品2：仅有DQA-HEX
100μl DQA-Hex(＝26.3μg)，在添加前将其煮沸1分钟(然后置于冰上)， 添加300μl饱和的D，L-缬氨酸溶液，充分混合。
如上沉淀。
2.粉末在人造肺中的分布
填充15.41mg的粉末(样品1)或13.52mg的粉末(样品2)的胶囊。
3.对在人造肺中收集的级分中的寡核苷酸浓度进行的测量
(a)UV260nm-寡核苷酸的总量
Perkin Elmer-Lambda 3-UV/VIS分光光度计，使用天然寡核苷酸作为 校准标准。
(b)在DQA-HEX上的荧光标记HEX(556/535nm)的荧光。
Perkin Elmer-LS45 luminiscene分光光度计，使用DQA-HEX作为校 准标准。
结果
图17显示微晶体在人造肺中的分布。对于用DQA-HEX和天然寡聚 物的混合物包被的微晶体，微细微粒级分(FPF)是29.9％，并且对于仅用 DQA-HEX包被的微晶体，微细微粒级分(FPF)是24.4％。该结果显示MSLI 流程是稳固的，因为使用两种不同的技术确定寡核苷酸的浓度获得了相似 的结果。相似地，可以推断两种类型的寡核苷酸紧密地混合并且如微粒上 的涂层均匀地分布。并且还从高剂量发射可见微粒是自由流动的，从高FPF 可见对于制备肺用的制剂它们是有用的。
使用DQA-HEX作为引物进行PCR，所述DQA-HEX通过将DQA-HEX 包被的微晶体重新溶解回水中而得到。扩增了正确的基因产物，对PCR 产物的测序显示DQA-引物的序列没有变化。该结果说明包被在微晶体上 的DNA保留了生物活性，并且没有观察到可检测的降解产物。这对于药 物制剂的制备是有利的。
实施例11
经常难于确定生物活性分子在微粒表面上的包被，因为涂层可能是非 常薄的诸如单分子层。如果涂层已经形成，一种检查的方法是将微粒再悬 浮回晶核物质的饱和溶液中。如果生物活性分子被基质俘获，它将不会重 新溶解，但是如果它是涂层，它将重新溶解，留下未包被的晶体。这个实 施例显示寡核苷酸包被在晶体的表面。
重新溶解实验
1.OCMC的制备：将2mg天然寡核苷酸溶解于50μl TRIS(10mM，pH＝7.8) 和150μl的D，L-缬氨酸的饱和水溶液中。使用Gilson移液器(黄色枪头， 0-200μl)将这种溶液加入3ml用D，L-缬氨酸饱和的2-PrOH中，同时用电 磁搅拌器搅拌。没有搅拌的情况下，将所述小瓶放置至少另外30分钟。
2.将OCMC混悬液的等分试样(160μl到180μl)转移到Eppendorf小瓶 中，并且以9000rpm转速旋转(除了A7/B7/C7，其是通过沉降分离的)。
将上清液小心去除，留下的晶体风干。
3.将晶体重新溶解于已知量的D，L-缬氨酸的饱和或接近饱和的水溶液中。
4.在重新溶解后，测量水相中的寡核苷酸浓度。
(寡核苷酸标准：10μg/ml∶OD260nm＝0.226或OD260nm＝1∶44.25μg/ml；溶解 于水(没有非常充分地溶解：约2mg/ml)或饱和的D，L-缬氨酸溶液。
将条件和结果归纳于表28。从其中晶体彻底溶解的样品1(A1/B1/C1) 和2(A2/B2/C2)，我们得到84±2％的最大回收率，对于样品3，4，6，7(D，L- 缬氨酸晶体没有溶解)我们得到80±4％的平均回收率。由此，我们可以得 出结论，即寡核苷酸彻底溶解于饱和D，L-缬氨酸溶液中。这有力说明了寡 核苷酸不在基质中，而是在晶体的表面上。相同的结论将适用于PCMCs。
表28总结了重新溶解实验和条件
表28   样品   D，L-缬氨酸 重新     注释   溶液的      溶解   饱和度      方式   通过UV260nm   由起始    ％DNA   测定的DNA浓度 重量计算  重新溶解   (μg/ml)      DNA浓度                 (μg/ml)   A1/   B1/C1   A2/   B2/C2   B3/C3   A4/   B4/C4   A6/   B6/C6   A7/   B7/C7   接近        涡流     晶体   饱和                 溶解   接近        涡流     晶体   饱和                 溶解   在40℃      摇动过夜   在40℃      涡流   冷却至室温   在40℃      摇动   冷却至室温  过夜   在40℃，    涡流   冷却至室温   82            100       82     85            100       85     779           1000      78   753           1000      75     1027          1250      82     353           417       85  
实施例12
表29显示形成α1-抗胰蛋白酶包被的-乳糖微晶体的一系列条件，其 中使用半胱氨酸(Cys)和N-乙酰基半胱氨酸(NA Cys)作为添加剂以在共沉 淀过程中防止氧化。
通过在丙醇中沉淀来制备α1-抗胰蛋白酶包被的-乳糖微晶体通常导 致生物活性的彻底丧失。结果显示于下面的表29中。
表29   溶剂   抗氧化剂   水(％)   Iu.mg-1   ％回收的   活性   蛋白质   mg.ml-1   ％回收的   蛋白质   丙-2-醇   半胱氨酸   10mg.ml-1   0   0.93   38   11.4   100   丙-2-醇   半胱氨酸   10mg.ml-1   1   0.6   25   11.7   100   丙-2-醇   半胱氨酸   10mg.ml-1   10   0.5   20   4.30   38   丙-2-醇   NA半胱氨酸   0.22mg.ml-1   0   0.0   0   3.92   46   丙-2-醇   NA半胱氨酸   10mg.ml-1   0   0.008   0.32   3.45   44
表29显示半胱氨酸和N-乙酰基半胱氨酸产生α-抗胰蛋白酶包被的微 晶体，其具有比在没有抗氧化剂情况下制备的那些更高的活性。
实验程序如下说明。
在沉淀和溶解过程中添加半胱氨酸
将16mg的α1-抗胰蛋白酶溶解于包含10mg.ml-1半胱氨酸的0.4ml TRIS缓冲液(20mM，pH8)中，和加入1.2ml包含10mg.ml-1半胱氨酸的乳 糖饱和的TRIS缓冲液(20mM，pH8)中。将0.4ml的该溶液滴加到6ml包 含不同量水的丙醇中。在将晶体溶解于包含10mg.ml-1半胱氨酸的0.8ml TRIS缓冲液中后，测量终产物中的活性和蛋白质浓度。
在沉淀和溶解过程中添加N-乙酰基半胱氨酸
将10mg的α1-抗胰蛋白酶溶解于包含0.22mg.ml-1N-乙酰基半胱氨酸 的1ml乳糖饱和的TRIS缓冲液(20mM，pH8)中。将0.4ml的该溶液滴加 到6ml包含0.22mg.ml-1或10mg.ml-1N-乙酰基半胱氨酸的丙-2-醇中。对于 活性和蛋白质浓度的测量，将晶体溶解于0.4ml包含相同浓度的N-乙酰基 半胱氨酸的TRIS缓冲液中作为沉淀混合物。
这些显示可以将赋形剂诸如添加剂或抗氧化剂有利地加到共沉淀中 从而提高和保持生物活性。
实施例13
疫苗PCMCs
使用卵清蛋白，Diptheria类毒素和破伤风类毒素，以D，L-缬氨酸或 L-谷氨酰胺作为核心结晶物质来制备PCMCs。
卵清蛋白、Diptheria类毒素(DT)和破伤风类毒素(TT)包被的微晶体
在所有的实验中，一半体积的水溶液由饱和的氨基酸溶液组成。卵清 蛋白以粉末形式提供。称出适当量的粉末以得到5，10，20和40％的核心 物质上的理论装载量。对于此，加入许多水得到50％的氨基酸饱和溶液， 或在2-甲基-2，4-戊二醇也结合到水相中的情况中，加入一定体积的二醇 取代等体积的水从而保持氨基酸的浓度不变。蛋白质和载体的共沉淀在10 倍大于水溶液体积的2-丙醇或2-甲基-2，4-戊二醇中进行，对没有添加二醇 的水溶液，得出沉淀溶剂中的H2O的终百分比为9.1％，而在水相中添加 20％的二醇时，得出沉淀溶剂中的H2O的终百分比为6.5％。
在电磁搅拌下，通过注射器泵将水溶液传递到包含在小瓶中的有机溶 剂中。
图18是具有10％填充量的DT PCMCs的图像。DT PCMCs具有L- 谷氨酰胺的晶核并且沉淀于丙-2-醇中。
混合的Diptheria类毒素(DT)，破伤风类毒素(TT)和卵清蛋白包被的微晶 体
对于混合的DT/TT PCMCs，将适当量的DT贮存溶液(浓度＝19.5mg/ml) 和TT贮存液(浓度＝27.5mg/ml)加入水溶液中从而进行沉淀以得到需要的 理论填充量。对于卵清蛋白/TT PCMCs，称出适当量的卵清蛋白，并且向 其中加入需要体积的TT以得到需要的理论填充量。然后，如上所述制备 晶体。
表30-卵清蛋白   编号   蛋白质填充量(％)   条件   晶体(mg)   1   卵清蛋白(10％)   溶解于饱和的D，L-缬氨酸/H2O溶液(终体积   ＝0.7ml)在2-丙醇(体积＝7ml)中沉淀   21   2   卵清蛋白(20％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/H2O溶液(终体积   ＝0.7ml)在2-丙醇(体积＝7ml)中沉淀   12   3   卵清蛋白(10％)   溶解于饱和的D，L-缬氨酸/Tris-HCl，pH 7.8   溶液(终体积＝0.7ml)在2-丙醇(体积＝7ml)中沉   淀   21   4   卵清蛋白(20％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl pH 7.8   溶液(终体积＝0.7ml)在2-丙醇(体积＝7ml)中沉   淀   13   5   卵清蛋白(10％)   溶解于饱和的D，L-缬氨酸/Tris-HCl，pH 7.8   溶液(终体积＝0.7ml)在2-甲基-2，4-戊二醇(体   积＝7ml)中沉淀   12   6   卵清蛋白(20％)   溶解于饱和的D，L-缬氨酸/Tris-HCl，pH 7.8   溶液+20％的2-甲基-2，4-戊二醇(终体积   ＝0.7ml)在2-丙醇(体积＝7ml)中沉淀   26
与起始水制剂中的卵清蛋白相比，共沉淀的卵清蛋白在结构或聚集水 平上没有显示变化。
表31-Diptheria  类毒素(DT)   编号   蛋白质填充   量(％)   条件   晶体(mg)   1   DT(10％)   溶解于饱和的D，L-缬氨酸/Tris-HCl，pH 7.8溶   液(终体积＝0.7ml)在2-丙醇(体积＝7ml)中沉淀   21   2   DT(5％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl，pH 7.8溶   液(终体积＝0.7ml)在2-丙醇(体积＝7ml)中沉淀   12   3   DT(20％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl，pH 7.8溶   液(终体积＝0.7ml)在2-丙醇(体积＝7ml)中沉淀   21   4   DT(40％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl pH 7.8溶   液(终体积＝0.7ml)在2-丙醇(体积＝7ml)中沉淀   23   5   DT(20％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl，pH 7.8溶   液(终体积＝0.7ml)在2-甲基-2，4-戊二醇(体积   ＝7ml)中沉淀   12   6   DT(20％)   溶解于饱和的D，L-缬氨酸/Tris-HCl，pH 7.8溶   液+20％的2-甲基-2，4-戊二醇(终体积＝0.7ml)在2-   丙醇(体积＝7ml)中沉淀   13
表32-破伤风类毒素(TT)   编号   蛋白质填充量   (％)   条件   晶体(mg)   1   TT(5％)   溶解于饱和的D，L-缬氨酸/Tris-HCl，pH 7.8   溶液(终体积＝1.4ml)在2-丙醇(体积＝14ml)中沉   淀   21   2   TT(20％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl，pH 7.8溶   液(终体积＝1.4ml)在2-丙醇(体积＝14ml)中沉淀   21   3   TT(40％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl，pH 7.8   23   溶液(终体积＝1.4ml)在2-丙醇(体积＝14ml)中沉   淀   4   TT(20％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl pH 7.8溶   液(终体积＝1.0ml)在2-甲基-2，4-戊二醇中(体积   ＝10ml)中沉淀   12   5   TT(10％)   溶解于饱和的D，L缬氨酸/Tris-HCl，pH 7.8溶   液+15％的2-甲基-2，4-戊二醇(终体积＝1.4ml)在   2丙醇(体积＝14ml)中沉淀   12   6   TT(10％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl，pH 7.8   溶液+15％的2-甲基-2，4-戊二醇(终体积＝1.4ml)   在2丙醇(体积＝14ml)中沉淀   14
表33-混合的晶体   编号   蛋白质填充量   (％)   条件   晶体(mg)   1   DT(10％)   TT(10％)   溶解于饱和的D，L-缬氨酸/Tris-HCl，pH 7.8   溶液(终体积＝1.4ml)在2-丙醇(体积＝14ml)中沉   淀   23   2   DT(10％)   TT(10％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl，pH 7.8溶   液(终体积＝1.4ml)在2-丙醇(体积＝14ml)中沉淀   12   3   DT(10％)   TT(10％)   溶解于饱和的L-谷氨酰胺/Tris-HCl，pH 7.8溶   液+15％的2-甲基-2，4-戊二醇(终体积＝1.4ml)在   2丙醇(体积＝14ml)中沉淀   13   4   DT(15％)   TT(15％)   溶解于饱和的D，L-缬氨酸/Tris-HCl pH 7.8   溶液(终体积＝1.4ml)在2-丙醇中(体积＝14ml)中   沉淀   14   5   TT(10％)   卵清蛋白(10％)   溶解于饱和的D，L缬氨酸/Tris-HCl，pH 7.8溶   液(终体积＝1.4ml)在2丙醇(体积＝14ml)中沉淀   21   6   TT(10％)   卵清蛋白(30％)   溶解于饱和的D，L缬氨酸/Tris-HCl，pH 7.8溶   液(终体积＝1.4ml)在2丙醇(体积＝14ml)中沉淀   26
配制Diptheria类毒素(DT)制剂进行小鼠研究
生产了具有5％的DT理论填充量的疫苗包被的微晶体。用L-谷氨酰 胺组成晶核物质并且将2-丙醇用作水混溶性有机溶剂。
以14.5mg/ml的浓度将DT作为水溶液提供。将276μl的DT溶液加 入2313μl饱和的L-谷氨酰胺溶液中。在其中加入2037μl H2O，并且在 电磁搅拌条件下，将4.5ml的混合物共沉淀于45ml的L-谷氨酰胺饱和的 2-丙醇中。回收大约80mg的DT-谷氨酰胺晶体，并且将50mg用于小鼠中 的疫苗试验。DT-谷氨酰胺晶体贮存于4℃。
施用前贮存条件的变化
将水性缓冲液中的DT可比较样品和干燥DT-谷氨酰胺微晶体的样品 贮存如下：
在4℃温育2个星期；
在室温温育2个星期；
在37℃温育2个星期；和
在45℃温育2天；
使用DT作为抗原进行体内免疫实验
向小鼠施用之前，将温育的微晶体悬浮于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。 将1350微克晶体(50微克DT)悬浮于500微升PBS中。在第一天，通过在 左后腿进行的肌内给药向每只小鼠施用50微升混悬液(即5微克的DT)。
在第21天对小鼠进行放血。第29天，小鼠接受DT的激发剂量-与以 前相同质量的DT。第42天，小鼠再度被放血。使用ELISA试验对血清 进行分析。
初次免疫应答和再次免疫应答显示DT-谷氨酰胺微晶体的样品无论在 那种贮存方案下都使抗体产生(体液免疫)。这证明疫苗包被微晶体的制备 方法使DT的生物活性得以较好的保留并且在重构和肌内给药后，DT是 可随意被生物利用的。
所有贮存于水性缓冲液中的DT样品也产生了初次和再次免疫应答， 除了贮存于45℃的样品没有显示生物活性以外。
贮存于45℃的DT-谷氨酰胺微晶体的初次免疫应答和再次免疫应答 的存在显示在高温，与在水溶液中相比，在微晶体中的DT制剂已经具有 明显提高的贮存稳定性。
在不利环境，紧急情况和发展中世界中，这些提高的稳定性对于疫苗 的分发和施用具有重要的优势。
因此可以得出结论，即形成具有疫苗涂层的PCMCs给予了疫苗特别 大的稳定性，其使疫苗易于贮存和运输。在热带国家中，这是有用的。
实施例14
体外测量胰岛素包被D，L-微晶体上的胰岛素的生物活性
部分1
在从12周龄的雄性Wistar大鼠中分离的阻力动脉(resistance artery) (＜200im尺寸)上进行胰岛素生物活性的试验，所述试验在加热(37℃)和 充气(95％O2/5％CO2)的pH为7.4的生理盐溶液(PSS)中进行。容许药物的 腔(lumenal)施用的压力肌动描记器提供敏感性的初始测量。开始试验之 前，在压力系统中，对固定在相对玻璃套管(外部尺寸80μm)上的动脉逐渐 加压，使其在15分钟内从＜5mmHg升到40mmHg，并且保持15分钟以上。 使用专有的显像分析软件(MyoView)对反应进行测量。压力肌动描记器能 在非常低的浓度上(1×10-10M)检测胰岛素的血管舒张效应。
表34  样品制备  生物活性  分子   生物活性分   子溶解于溶   剂中   H2O％   (v/v)   溶剂中生   物活性分   子的浓度   (mg/ml)   赋形剂的添加   洗涤步骤   结晶方法   蛋白质回收   百分比   晶体中的蛋白质最大   百分比  17mgUSP  胰岛  素(18405)   加入1.7ml   0.01M HCl，   然后85□1   1M NaOH   9.1   0.44   将1.7ml用D，L-   缬氨酸饱和的蒸   馏水加入胰岛素，   得到49％饱和的   D，L-缬氨酸   无水的丙-2-   醇   将3.4ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到34ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   17  微粒以在水中10nM蛋白质的浓度重构  17mgUSP  胰岛  素(I8405)   加入1.7ml   0.01M HCl，   然后85□1   1M NaOH   9.1   0.44   将1.7ml用D，L-   缬氨酸饱和的蒸   馏水加入胰岛素，   得到49％饱和的   D，L-缬氨酸   无水的丙-2-   醇   将3.4ml在D，L-缬氨酸中的胰   岛素滴加到34ml丙-2-醇中，   同时在室温持续搅拌   17  微粒以在水中10nM蛋白质的浓度重构
结果
表34显示胰岛素介导去甲肾上腺素预收缩的舒缓(100＝100％收缩)， 3(SD)的平均值，该值显示在微晶体和对照之间没有明显不同(P＞0.05)。
表35   Log M   商购胰岛素  胰岛素包被的D，L-缬氨酸微  晶体   -11   -10   -9   100(0)   84(7)   65(23)  100(0)  84(14)  68(22)
由图19所显示的胰岛素PCMC提供的舒缓的程度与USP胰岛素制剂 提供的相似，这表明在PCMC的制备或室温贮存过程中没有胰岛素的变 性。
部分2
金属丝肌动描记器研究
然后使用金属丝肌动描记器来提供更大的处理量进行随后的研究 (P110&P660，Danish MyoTech，Aarhus)。在金属丝系统中，将动脉固定于 两个40im的不锈钢金属丝之间，所述金属丝其中一个与测微计连接，另 一个与力传感器相连，并且将它们调整为已知的标准化尺寸，从而产生最 优化的药理学反应。力的产生被专有软件(MyoDaq)所俘获。所有的生物试 验开始用123mM的KCl洗涤两次，以刺激动脉中的收缩功能，随后通过 接触血管收缩激动剂，血栓烷模拟[U44169]，进行预收缩。然后在不变压 力(压力)下，使动脉与增加浓度的胰岛素接触，所述胰岛素直接进入浴器 (金属丝)或通过插入玻璃固定套管管尖的胎儿微套管(microcannulae)逐渐 直接灌注到腔里。
样品制备
使用的胰岛素是USP牛胰腺胰岛素(Sigma 18405)。始终通过电磁搅拌进行混合。
通过Durapore膜滤器(0.4微米)过滤来分离晶体，然后在通风橱中在风干。
蛋白质填充量基于从晶体产量测定的最大量。
表36  生物活性  分子   生物活性分   子溶解于溶   剂中   H2O％   (v/v)   溶剂中生   物活性分   子的浓度   (mg/ml)   赋形剂的添加   洗涤步骤   结晶方法   蛋白质回   收百分比   晶体中的蛋白   质最大百分比  20mg  USP胰岛  素(I8405)   加入2.0ml   0.01M HCl，   然后100□1   的1M NaOH   9.1   0.44   将2ml用D，L-缬氨酸饱和的蒸   馏水加入胰岛素，得到49％饱   和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将3.5ml在D，L-缬氨酸中的   胰岛素滴加到35ml丙-2-醇   中，同时在室温持续搅拌   17  微粒以在水中0.9mM蛋白质的浓度重构  16mg  USP胰岛  素(I8405)   加入1.6ml   0.01M HCl，   9.1   0.44   将1.6ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到49％   饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将2.8ml在D，L-缬氨酸中的   胰岛素滴加到28ml丙-2-醇   中，同时在室温持续搅拌   17  微粒以在水中1mM蛋白质的浓度重构  12mg  USP胰岛  素(I8405)   加入1.2ml   0.01M HCl，   然后60□1   的1M NaOH   9.1   0.44   将1.2ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到49％   饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将2.1ml在D，L-缬氨酸中的   胰岛素滴加到21ml丙-2-醇   中，同时在室温持续搅拌   17  12mg  USP胰岛  素(I8405)   加入1.2ml   0.01M HCl，   然后60□1   的1M NaOH   9.1   0.44   将1.2ml用D，L-缬氨酸饱和的   蒸馏水加入胰岛素，得到49％   饱和的D，L-缬氨酸   无水的丙   -2-醇   将2.1ml在D，L-缬氨酸中的   胰岛素滴加到21ml丙-2-醇   中，同时在室温持续搅拌   17  微粒以在水中0.9mM蛋白质的浓度重构 12mg USP胰岛 素(I8405) 加入1.2ml 0.01M HCl  9.1  0.44 将1.2ml用D，L-缬氨酸饱和的 蒸馏水加入胰岛素，得到49％ 饱和的D，L-缬氨酸 无水的丙 -2-醇 将2.1ml在D，L-缬氨酸中的 胰岛素滴加到21ml丙-2-醇 中，同时在室温持续搅拌 17 12mg USP胰岛 素(I8405) 加入1.2ml 0.01M HCl  9.1  0.44 将1.2ml用D，L-缬氨酸饱和的 蒸馏水加入胰岛素，得到49％ 饱和的D，L-缬氨酸 无水的丙 -2-醇 将2.1ml在D，L-缬氨酸中的 胰岛素滴加到21ml丙-2-醇 中，同时在室温持续搅拌 17 微粒以在水中0.9mM蛋白质的浓度重构
结果
图19显示肌动描记器的总结。
用血栓烷模拟[U44169]进行预收缩后，胰岛素-介导的血管舒张模式 是胰岛素的典型模式，并且主要通过氧化氮合酶的活化作用和随后的内皮 氧化氮释放来发挥其效果。
由胰岛素包被的D，L-缬氨酸微晶体提供的胰岛素介导的血管舒张模 式基本与USP胰岛素制剂相同。它特有的D，L-缬氨酸没有显示生物活性。 这些结果显示通过胰岛素包被的微晶体的共沉淀方法或长期室温贮存，胰 岛素的生物活性没有改变。这有力证实了在加工或贮存过程中，胰岛素没 有被化学修饰，聚集或经历任何不可逆的变性。HPLC分析显示降解的缺 乏，这说明在共沉淀和作为粉末于室温下贮存超过6个月后，紧接着D，L- 缬氨酸微晶体的重构，超过90％的胰岛素仍旧以相同形式存在。与此相 反，保存在用于共沉淀的相同的水溶液中的胰岛素则在少于30分钟内发 生了明显的变化。我们已经显示了，胰岛素包被的D，L-缬氨酸微晶体是 在多-工作台碰撞取样器测试中显示高微细-微粒级分的自由流动的粉末， 因此显然生物活性分子包被的微晶体非常适合于制备具有增强特性的药 物制剂。
实施例15
图20-24是按照本发明制备的PCMCs的选择的SEM图像。
图20是在1600倍放大下的沉淀于丙-2-醇中的胰岛素/D，L-缬氨酸 PCMCs的SEM图像。图21是在6400倍放大下沉淀于丙-2-醇中的胰岛 素/D，L-缬氨酸的另一个SEM图像。图20和图21显示晶体是片状的，在 形状和大小上是基本均一的，并且存在基本均一的胰岛素涂层。
图22是沉淀于丙-2-醇中的白蛋白/L-谷氨酰胺PCMCs的SEM图像。 在这种状况下的PCMCs还是均一的，但是是针状的。
图23是沉淀于丙-2-醇中的胰岛素/L-组氨酸PCMCs的SEM图像， 其是均一和片状的。
图24是沉淀于丙-2-醇的α-抗胰蛋白酶/D，L-缬氨酸PCMCs的SEM 图像。显示该PCMCs在形状和大小上是基本均一的并且是片状的。
实施例16
硫酸妥布霉素包被的微晶体
在这个实施例中，我们论证了，出人意料地，使用比典型生物大分 子小得多的水溶性生物活性化合物，还可以将共沉淀方法用于制备适于药 物制剂的生物活性分子包被的微晶体。这些制剂可以通过分批法或连续法 进行制备，并且有利地使用非吸湿性的载体诸如D，L-缬氨酸。该方法是 证实用于水溶性抗生素药物，硫酸妥布霉素，但是可以将其应用于其它抗 生素和其它水溶性生物活性分子。优选地，生物活性分子应该是极性的并 且携带一个或多个官能团，所述官能团在用于共沉淀的pH下是被离子化 的。这容易导致在水中更高的溶解度和在水混溶性有机溶剂中降低的溶解 度。该化合物还应该优选地具有比在结晶化时由核心物质形成的晶胞大得 多的最大的尺寸。这将有利于生物活性分子包被的微晶体的形成并且将生 物活性分子包合在晶格中的可能性最小化。
实验
分批法
通过使用3mg(4.8％w/w)，6mg(9.1％w/w)或12mg(16.7％w/w)的硫酸 妥布霉素(来自Sigma的T-1783)来进行制备包含生物活性分子在D，L-缬氨 酸载体晶体上的不同理论填充量的批次。在每种情况中，将称重量的硫酸 妥布霉素溶解于1ml的D，L-缬氨酸的蒸馏水溶液(以60mg/ml)。从其中 取出0.5ml，通过1ml移液器将其滴加到10ml用D，L-缬氨酸饱和的Pr2OH中，以1500rpm的速度混合。晶体立即在真空下通过Durapore0.4微米滤 器过滤，用10ml的Pr2OH(1％H2O v/v)洗涤并且在通风橱中风干。
连续法
理论填充量4.8％w/w
将30mg的硫酸妥布霉素(来自Sigma的T-1783)溶解于10ml的D，L- 缬氨酸的蒸馏水溶液(在60mg/ml)。如实施例9所描述的，使用750rpm 的动态混合速度，将5ml水溶液与用D，L-缬氨酸饱和的Pr2OH(100ml)在 连续共沉淀系统上混合，其中水泵的流速为0.5ml/min，溶剂泵的流速为 10ml/min。收集理论填充量为4.8％w/w的晶体，在真空下通过Durapore 0.4微米滤器过滤，使用50ml的丙-2-醇(包含1％H2O v/v)洗涤，并且在 通风橱中风干。
理论填充量1.6％w/w
将20mg的硫酸妥布霉素(来自Sigma的T-1783)溶解于20ml的D，L- 缬氨酸的蒸馏水溶液(在60mg/ml)。如实施例9所描述的，使用750rpm 的动态混合速度，将5ml水溶液与用D，L-缬氨酸饱和的丙-2-醇(100ml)在 连续共沉淀系统上混合，其中水泵的流速为0.5ml/min，溶剂泵的流速为 10ml/min。收集晶体，在真空下通过Durapore 0.4微米滤器过滤，使用50ml 的Pr2OH(1％H2O v/v)洗涤，并且在通风橱中风干。
结果
如上制备的妥布霉素包被的缬氨酸晶体是自由流动的，非吸湿性的， 并且非常适合于生产药物制剂。通过分批法制备的微粒的SEM图像显示 它们具有缬氨酸微晶体的典型片状形态，平均最大直径为少于5微米，因 此它们适合于肺的施用。当填充量改变时，在大小或形态上没有明显不同。 图26显示通过分批法制备具有9.1％w/w填充量的样品。通过连续法制 备的微粒也是自由流动的，其具有光滑完好的形态。在持续混合器中使用 较低的混合速率和较小的叶轮产生了比分批法制备的更大的微粒，如图 27中所显示的。
结论
令人吃惊地，可以获得和通过持续共沉淀方法生产生物活性分子包被 的微晶体，其中活性试剂不是生物大分子。
实施例17
改变生物活性分子包被的微晶体的形态和聚集特性的试剂
例如，具有针状形态的微晶体聚集形成更大球体微粒对于药物制剂 可以是有利的。针状的微粒流动性较差，而球体可以提供粉末以良好的加 工和药物传递特性。或者，如果可以改变微晶体针状体的生长从而产生更 短的棒状形态，也可以获得改良的加工。在这里，我们证明了以比共沉淀 剂的浓度低的多的浓度添加某些试剂，诸如无机，有机盐或缓冲盐可以用 来更改生物活性分子包被的微晶体的形状和聚集特性。特别的优势是具有 第二种功能诸如在重构的制剂中的pH缓冲或等渗的可药用添加剂。这种 类型的添加剂的使用使在最终制剂中要求的组分的数量减到最少。 枯草杆菌蛋白酶Carlsberg/L-谷氨酰胺微晶体的棒状和球状聚集体
实验
将5mg(0.7％w/w填充量，G7)或25mg(6.4％w/w填充量，G1O)的枯 草杆菌蛋白酶Carlsberg溶解于4ml的缓冲液(50mM柠檬酸钠，150mM 氯化钠，pH5.5)和6ml蒸馏水中。向0.25ml的上述组成物加入0.75ml的 L-谷氨酰胺蒸馏水溶液(以24.3mg/ml)。然后，用1ml的移液器将水溶液 滴加到10ml用L-谷氨酰胺饱和的EtOH中，以1500rpm的速度混合。将 晶体的等分试样直接应用到SEM stub上以在干燥前确定形态 (G7*，G10*)。残留的晶体立即在真空下在Durapore 0.4微米的滤器上过 滤，将其用5ml的无水Pr2OH洗涤，并且在通风橱中风干。
结果
通过从水中向乙醇中进行共沉淀产生的蛋白质包被的L-谷氨酰胺微 晶体典型地显示具有约5微米大小的针状形态。在低浓度的柠檬酸钠和氯 化钠存在时，共沉淀令人惊讶地导致了针状体长度的明显减少。当蛋白质 填充量增加时，长度上的变化可以由产生的具有更小棒状的蛋白质浓度来 进一步控制。图28和图30显示在柠檬酸钠和氯化钠存在时，共沉淀的典 型生物活性分子包被的谷氨酰胺晶体的SEM图像。在6.4％w/w，棒条体 的长度主要少于3微米并且平均少于2微米。对于药物制剂，这些生物活 性分子包被的微晶体在乙醇中的混悬液可以具有有利的特性。例如，使用 本领域已知的吸入装置通过肺路径，可以传递该混悬液。蛋白质填充量的 更多增加可以用于进一步减少微晶体的大小。通过临界点干燥，可以实现 作为组成个体晶体的干粉末形式的棒状体的分离。如果使用微晶体在滤膜 上的常规过滤，随后风干，显著的转化作用发生，并且产生组成针状体或 棒状体的球形聚集物的微粒。这些具有非常高的表面积的球形微粒有利地 形成了自由流动的粉末并且是非吸湿性的。还可以非常快速地诸如在少于 10秒到20秒的时间内将它们在水溶液中进行重构。显示球状聚集体的 SEM图像示于图29和图31。针状微晶体向球状聚集体的转化作用是非 常有利的，因为球状体更易于进行加工和用于药物制剂。对于其它蛋白质， 包括治疗用蛋白质，可以获得与本文显示的那些非常相似的结果。
结论
在共沉淀过程中使用低浓度的可药用试剂诸如缓冲剂和盐令人惊讶 地导致了在生物活性分子包被的微晶体的形态和聚集行为上的大的和有 用区别。使用的改性剂浓度应该是使其在最终制剂中以少于15％w/w， 优选地少于10％w/w的比例存在。如果改性剂的浓度过高，其将可以导 致来自大量载体晶体的相分离并且形成第二种类型的生物活性分子包被 的晶体。
实施例18
在通过连续法制备的载体微晶体和蛋白质包被的微晶体上进行的粉末X- 射线衍射测量
使用实施例9描述的连续法通过分别在乙醇、异丙醇和异丙醇中沉 淀制备L-谷氨酰胺，D，L-缬氨酸和甘氨酸的微晶体。也通过连续共沉淀 方法，使用相同的物质和溶剂制备10％w/w装载量的白蛋白包被的微晶 体。使用粉末X-射线衍射来比较用或不用蛋白质制备的干粉末样品。
实验
使用Bruker AXS D8Advance来分析样品，其具有PSD-检测器，仪 器参数如下：   辐射   CuK α辐射，λ＝1.5418Angstrom   Tube Power  40kV 40mA   扫描范围  3°-40°2θ   步长  0.014°2θ   时间/步骤  0.5秒   样品旋转  开   样品制备  没有研磨
结果
具有或不具有白蛋白的样品之间的比较：   样品   结果   JV272/1/2k2SO4-异丙醇   JV272/1/3K2SO4/白蛋白-异丙醇   具有和不具有白蛋白的样品的衍射模式   是一致的。微小的差异可能是由于取向效   应和样品的结晶程度。   JV272/2/2D，L-缬氨酸-异丙醇   JV272/2/3D，L-缬氨酸/白蛋白-异丙醇   具有和不具有白蛋白的样品的衍射模式   是一致的。微小的差异可能是由于取向效   应和样品的结晶程度。   JV272/3/2甘氨酸-异丙醇   JV272/3/3甘氨酸/白蛋白-异丙醇   在具有和不具有白蛋白的样品的衍射模   式中记录了明显的差异。最显著地，在大   约18和23.8°2θ的衍射线出现在包含白   蛋白的样品中，而在没有白蛋白的样品中   则不存在。   JV272/5/2谷氨酰胺-乙醇   JV272/5/3谷氨酰胺/白蛋白-乙醇   具有和不具有白蛋白的样品的衍射模式   是一致的。微小的差异可能是由于取向效   应和样品的结晶程度。
谷氨酰胺
发现谷氨酰胺与或不与蛋白质在乙醇中沉淀的PXRD数据彼此之间 以及和已知的单-晶体结构是高度一致的(正交的P212121，16.020，7.762， 5.119-见Koetzle等Acta Cryst.B 1973，29，2571)。图32显示获得的典 型数据。在12-18度区域观察到的宽峰可以是由于非晶形的物质或可以是 实验过程中的后生物。白蛋白样品的峰位于比纯谷氨酰胺的峰稍高的角度 处。
缬氨酸
具有或不具有蛋白质的PXRD模式是基本相同的。有两种可能的已 知多晶型物(单斜晶的P21/c 5.21，22.10，5.41，β＝109.2Acta Cryst B 1969，25，296和三斜晶的P-15.222，5.406，10.835，90.89，92.34，110.02 Acta Cryst C1996，52，1759)。由于一些因素，鉴定存在哪种多晶型物是复 杂的。样品的大的优选的取向给出了3个大峰-该模式所有余下的峰则相 对较小，并且难于与背景区分。因此这些峰的位置是相当不精确的。在 120K运行三斜晶的样品。因此，其将具有些许不同的晶胞，对所述晶胞 于室温进行PXRDs，并且将不会预期其给出与观察到的数据的较好的拟 合。这两种多晶型物具有一些相当相似的晶胞尺寸，并且相当紧密地关联 -它们因此给出相似的预期峰。样品在单斜晶多晶型物中是可能的，但这 是不确定的。
甘氨酸
与纯的甘氨酸的PXRD相比，与白蛋白共沉淀的甘氨酸的PXRD显示 了额外的峰。有三种已报道的甘氨酸的形式(单斜晶的P21/n，单斜晶的 P21&三角的-见Acta Cryst B 1972，28，1827；Acta Cryst 1960，13，35& Acta Cryst B 1980，36，115)。在任一样品中，没有证据显示三角形式的存 在。纯的甘氨酸PXRD是与P21/n多晶型物极好拟合的。可以将在甘氨酸 /Alb样品中的额外峰解释为一些P21多晶型物的存在。因此该样品是2种 多晶型物的混合物，两相以有意义量存在。
结论
PXRD数据显示在与10％w/w蛋白质共沉淀后，粉末微粒的核心仍 旧高度结晶。对于谷氨酰胺和D，L-缬氨酸，与纯物质的沉淀比较，蛋白 质涂层没有改变核心结晶载体的多晶型物。对于产生在高湿度和高温度条 件保持稳定的药物制剂，高度晶核是有利的。对于甘氨酸，蛋白质似乎促 进了不同多晶型物的部分形成。通过与生物活性分子的共沉淀来控制形成 的水溶性药物的多晶型物的种类对于药物制剂，可以是有利的，因为例如 生物活性和生物有效性可以被存在的多晶型物的种类所影响。
使用DSC来测量熔解温度。发现，缬氨酸和白蛋白包被的缬氨酸微 晶体样品，分别为JV272/2/2和JV272/2/3都在高于225℃的温度熔解。 发现，谷氨酰胺和白蛋白包被的谷氨酰胺微晶体样品，分别为JV272/5/2 和JV272/5/3都在高于160℃的温度熔解。
实施例19
通过微晶体在溶剂中的混悬液的临界点CO2干燥来制备生物活性分 子包被的微晶体的干粉
微晶体混悬液的过滤可以导致产物的结块和压实。这是可逆的，但 是需要另一个方法步骤。临界点干燥可以有利地用于直接从溶剂中的混悬 液获得无溶剂的，低密度的生物活性分子包被的微晶体的粉末。对于制备 肺用制剂，这些粉末具有非常有吸引力的性质，因为它们是非吸湿性的， 并且显示低静电荷。与传统过滤的样品相比，可以将通过临界点CO2干 燥制备的粉末用于制作药物制剂，所述药物制剂具有非常低的残留溶剂含 量和增加的微细微粒级分。对于组织样品，使用超临界CO2进行临界点 干燥是一项成熟的技术。其包括将次临界或超临界CO2泵送到或经过样 品，所述样品是被预浸渍的或悬浮在可混溶溶剂，诸如丙酮、异丙醇或乙 醇中的。溶剂溶解于CO2中，使样品浸于流体中，其可被加热到其临界 点以上，并通过排气口膨胀，而没有形成液-气界面。这使毛细力减到最 少，并且明显减少微粒间的聚集和压实。临界点干燥不适用于具有高水含 量的样品，因为水在CO2中不是充分可溶的。
实验
通过连续法使枯草杆菌蛋白酶Carlsberg与D，L-缬氨酸(60mg/ml)共沉 淀于2-丙醇(用D，L-缬氨酸饱和的)从而产生10％的理论蛋白填充量和 3.9％v/v的在溶剂中的水含量。使混悬液沉降，倾去过量溶剂，用丙酮连 续漂洗剩余的混悬液从而去除过量的2-丙醇，并且使溶剂中的水含量达 到0.5％v/v。一个等分试样的混悬液通过在Durapore 0.4微米滤器 (SC/DLVal 2)上过滤进行干燥，第二个样品通过临界点干燥(SC/DLVal 3) 进行干燥。
将每个样品称取50mg，进行最少处理，放入单独的小瓶中，随后通 过温和搅拌进行沉降，对两只小瓶进行拍照，照片显示于图33。通过临 界点干燥制备的样品位于左侧，粉末明显地比在右侧的过滤的样品更为松 散并具有更低的堆积密度。优选地，临界点干燥的样品具有比通过过滤制 备的样品少于0.1g/ml的堆积密度，并且是更为优选地。更低的粉末密度 是微粒-微粒相互作用减少的指示，并且对于药剂施用诸如传递到肺是特 别有利的。通过对生物活性分子包被的微晶体进行临界点干燥制备的干粉 制剂的有利气动特性意味着可以直接在吸气装置中使用它们。因此，它们 不需要与更大的载体微粒混合。特别优选的是生物活性分子包被的D，L- 缬氨酸微晶体。
使用Polaron E3000进行临界点干燥从而产生干粉。
使用Jeol JSM 6400扫描显微镜来捕获样品的SEM图像。这些显示， 从异丙醇中共沉淀后观察到的典型片状微晶体在经过丙酮漂洗和临界点 干燥后仍旧保持。通过UV光谱学在280nm处来确定重构的样品的蛋白 质含量。获得了接近于10％的预期值的填充量，如临界干燥表中所显示 的。偏差可能是由于去除了在280nm处有吸收的溶剂可溶性杂质或在处 理过程中损失了蛋白质。使用UV/vis光谱学，通过监测硝基苯基乙酸酯 的水解来确定枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的活性。下表显示在处理和干燥 后，保持的活性，作为干燥前蛋白质的起始活性百分比。起初获得直接从 异丙醇混悬液中分离的SC/DLVal 1样品。重复进行活性值的测定。可见， 相对于立即进行过滤和干燥的样品，临界点干燥导致了活性的减少。不过， 没有添加常用于蛋白质干燥的典型的稳定剂诸如糖，可以获得大于70％ 的活性。
临界干燥表   样品   蛋白质填充量％   保持的活性％   SC/DLVal 1，异丙醇漂洗，Millipore过滤3/12/03   9.3   91.5   SC/DLVal 2，丙酮漂洗，Millipore过滤3/12/03   8.9   88.0   SC/DLVal 3，丙酮处理，临界点干燥3/12/03   9.4   70.5
实施例20
ζ电势
由单一连续自-装法产生是蛋白质包被的微晶体的特点的核心微晶体 和蛋白质涂层。为了评估生物活性分子与预选形成的微晶体的静电结合在 这个方法的机制中是否是重要的，在非水性介质中测量微晶体的表面电势 引起了人们的注意。围绕带电微粒的液体层作为两部分存在；内区(Stern 层)，其中离子强烈结合和外(扩散)区，其中它们结合的没有那么紧密。在 扩散层中有一个抽象的边界，在其中离子和微粒形成了稳定的本体。当离 子移动时(例如由于重力)，在边界中的离子也移动。那些超过边界的离子 没有随微粒移动。在这个边界的(流体剪切力的表面)电势是ζ电势。ζ电 势正负和大小取决于微粒的表面电荷，例如，负的ζ电势指示具有总的负 电荷的微粒。将使用激光Doppler速度测量学的Malvern Zetasizer用于测 量微晶体的ζ电势的正负和大概的大小，所述微晶体通过在固定pH由各 种核心物质的沉淀产生。在预先制备的微晶体或作为乙腈中的稀释混悬液 悬浮的蛋白质包被的微晶体上进行测量。将聚苯乙烯胶乳用于校准机器。 数据显示于ζ电势表中。在缺乏蛋白质的情况下，沉淀于溶剂中的甘氨酸、 谷氨酰胺和缬氨酸微晶体都显示了负的ζ电势。如果静电结合对于形成机 制是重要的，将预期仅有具有总的正电荷的生物分子被期待在这些带负电 荷的物质上形成涂层。蛋白质上的电荷是pH的函数。其将在高于pI的 pH值上是负的而在低于pI的pH值上是正的。使用蛋白质，具有4.85的 报道pI的腺苷脱氨酶(ADM)，发现可以在高于pI上的pH上通过共沉淀 与上述载体物质直接制备蛋白质包被的微晶体。这些蛋白质包被的微晶体 的ζ电势见于ζ电势表。保留的负值与包被晶体的腺苷脱氨酶分子是一致 的，因为在共沉淀的pH上，蛋白质将是带负电荷的。由于在pH7.02上 制备的腺苷脱氨酶包被的缬氨酸晶体(ADM/缬氨酸)的负蛋白质涂层，在 ζ电势上有明显的增加。这些结果说明，通过共沉淀方法可以将带负电荷 的蛋白质包被在显示相同负表面电荷的物质的微晶体上。这说明，包被的 机制不能归因于生物活性分子对预先形成的微晶体的静电结合。缺乏静电 结合机制的进一步的证据是还可以将聚阴离子诸如核酸通过共沉淀有效 地用于包被微晶体。例如，尽管在未包被的缬氨酸晶体上观察到负的ζ电 势，但可以产生DNA包被的缬氨酸微晶体。因此共沉淀提供获得用生物 活性分子包被的微晶体的一般方法并且其可以有利地在广泛范围的pH和 盐条件下有效地进行。
ζ电势表   样品   沉淀pH   ζ电势   (mV)   宽度   甘氨酸   6.04   -49.7   11.5   谷氨酰胺   5.59   -54.8   9.2   缬氨酸   7.02   -19.6   10.5   ADMa/甘氨酸   6.04   -55.7   12.0   ADMa/谷氨酰胺   5.59   -56.4   13.6   ADMa/缬氨酸   7.02   -36.1   8.8
aADM＝腺苷脱氨酶
实施例21
比较在分批共沉淀器和持续流动沉淀器中制备的样品的生物活性
令人惊讶地，已经发现与通过以前报道的分批法制备的样品相比， 通过持续流动共沉淀制备的重构生物活性分子制剂可以有利地显示更高 的生物活性。本文证明了酶葡萄糖氧化酶和乳酸脱氢酶的这个效果，因为 使用标准酶试验，可以将它们的生物活性测量到高精密度。使用流动共沉 淀器，对于治疗用生物分子和其它生物活性分子，可以获得相似的提高。 通过连续流动方法制备的制剂中的生物活性分子还可以，例如在高温和增 加的湿度下，显示更高的稳定性，并且其在贮存中对于聚集、化学降解或 变性更具耐受性。在随后的实施例中，使用相同起始物质的组合物通过分 批共沉淀或连续流动沉淀方法制备样品，并且比较它们的生物活性。
该持续流动沉淀器系统与实施例9中的相似，但是通过补充反压调 节使其更完善。100psi的最小反压是有利的，因为其保证了HPLC泵单 向阀正确运行。可以通过许多如下方法引入反压，包括引入相当长的窄内 径管道(bore tubing)，作为管路上的收缩部；引入静止回流调节器，诸 如Upchurch In-line单向阀；补充测压组件，例如Gilson 302测压组件， 其监测通过泵产生的反压。测压组件可以使用在溶剂管路上而窄内径管道 可以使用在水性管路上。＜1％RSD的典型流动静密度应该是可以达到的。
葡萄糖氧化酶与甘氨酸共沉淀入异丙醇
在25℃，葡萄糖氧化酶(GO)，2.5mg/ml与甘氨酸一起共沉淀入作为 抗-溶剂的异丙醇。在分批法中，通过使用25mm搅棒以750rpm的速度搅 拌，将0.5ml的GO/甘氨酸水溶液逐滴加入在30ml小瓶中的9.5ml的甘 氨酸/异丙醇来进行共沉淀。在连续流动法中，GO/甘氨酸水溶液的流动是 0.25ml/min，甘氨酸/异丙醇的流动是4.75ml/min。流动池的叶轮速度是 750rpm。
分析前，样品保持为混悬液。使用标准葡萄糖氧化酶试验，通过监测 由经过过氧化物酶-偶联系统对邻联(二)茴香胺的氧化产生的在460nm 的吸光度的增加来进行酶活性的测量。反应条件：2.5ml邻联(二)茴香 胺-缓冲液混合物，300μl的18％葡萄糖溶液，100μl的0.2mg/ml过氧 化物酶溶液和100μl 0.01mg/ml GO制剂。
结果显示于表37葡萄糖氧化酶
表37：葡萄糖氧化酶   分批法(dAbs/min)   连续法(dAbs/min)   0.0123a   0.0188a
a％RSD＜2.5
乳酸脱氢酶/L-谷氨酰胺在乙醇中的共沉淀
来自乳杆菌(Lactobacillus sp.)的D-乳酸脱氢酶与L-谷氨酰胺一起共 沉淀。通过在恒温箱中于40℃搅拌过夜，冷却至室温并通过0.45μm的 Durapore(微孔)滤器进行过滤来制备L-谷氨酰胺在去离子水中(约150 mg/ml)的饱和溶液(约100ml)。用盐酸将该溶液的pH调节到pH 7.3。将 LDH，(3.15mg)和牛血清白蛋白(16mg)溶解于10ml的L-谷氨酰胺水溶液 中，温和回荡来辅助溶解。将白蛋白用作蛋白质稀释剂和与LDH的共沉 淀剂。在LDH/L-谷氨酰胺水溶液中的终LDH浓度是0.315mg/ml。在分 批法中，通过使用25mm搅棒以750rpm的速度搅拌，将0.5ml的LDH/L- 谷氨酰胺水溶液逐滴加入在30ml小瓶中的9.5ml的L-谷氨酰胺饱和的乙 醇中来进行共沉淀。在连续流动沉淀器中，LDH/L-谷氨酰胺水溶液的流 动是0.25ml/min，L-谷氨酰胺饱和的乙醇溶液的流动是4.75ml/min。流 动池的叶轮速度在25℃是750rpm。
LDH的活性于25℃在3ml反应混合物中进行测量，所述混合物由2.8 ml的0.2M Tris(羟甲基)-氨基甲烷缓冲液，100μl的6.6mM NADH溶液 和100μl的30mM丙酮酸钠溶液组成(NADH和丙酮酸钠都在0.2M Tris 缓冲液中制备)。将LDH制剂(100μl，0.0005mg/ml)加入反应混合物，将 比色杯翻转3次，然后使用Beckman Coulter DU 800分光光度计在340nm 处监测吸光度的增加约30分钟。共沉淀后，测量PCMCs的活性大约24 小时。结果显示于表38：乳酸脱氢酶。
表38：乳酸脱氢酶   分批法(dAbs/min)   连续法(dAbs/min)   0.031a   0.039a
a％RSD＜2.5
结论
在这些实施例中，令人惊讶地发现，尽管使用了相同的起始组合物， 在持续流动沉淀器中制备的蛋白质样品的生物活性比在分批反应器中制 备的那些要更高。导致这种结果的原因尚不确定。在混合步骤中，流动- 沉淀器中的空气-溶剂界面颇低并且生物活性分子和得到的包被的微晶体 也在更少的时间内暴露于混合引起的剪切力。这可以使共沉淀分子的百分 比最大化，并且保持在稳定的天然或近-天然构象。这与在使用流动共沉 淀器制备的生物分子制剂中观察到的贮存稳定性的提高是一致的。对提高 的温度和湿度，生物活性的更好保留和稳定性增加对于生物药剂制剂是非 常有利的特性。更高的生物活性可以产生提高的治疗效能，而在贮存中， 生物活性分子的稳定性增加将减少不利副作用诸如由小百分比的降解产 物的施用引起的免疫反应的风险。