技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，尤其涉及一种用于扫描电镜的植物幼嫩样品临界点干燥方法。
背景技术
[0002] 近年来,随着科学技术的不断发展,扫描
电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM)的发展日臻完善,在各个专业领域的应用越来越广。目前，SEM已成为一种研究微观世界的有
力工具，很多重大发现和研究成果都是通过SEM观察获得。虽然近年来出现了环境扫描电镜(Environment ScanningElectron Microscope，ESEM)和冷冻扫描电镜(Cryo-Scanning Electron Microscope，Cryo-SEM)，可以观察新鲜的含
水样品，但不足之处是
分辨率较低，因此目前使用最多的还是观察不含水样品的SEM。
[0003] 就植物样品而言，只有极少数如干
种子等
含水量极低的样品可以直接喷金用于扫描电镜观察。如果含水量高的样品直接放入样品室，水分
蒸发后样品会收缩
变形，破坏表面的微细结构，水蒸气引起电子束流大幅度
波动，使图像模糊，出现雾状，造成物镜、镜头、光阑等的污染，此外，
灯丝碰到水蒸气会
氧化变质乃至熔断（郭素枝，扫描电镜技术及其应用，厦
门大学出版社，2006:74-84）。所以绝大多数植物样品需干燥处理，干燥是生物样品制备中的关键环节，如果处理不好，会直接影响到观察的清晰度与准确度。大多数植物，特别是柔软的细胞和组织，如花器官、嫩芽、幼胚、幼根等，在干燥时由于体积
应力和表面
张力的作用，容易发生明显的皱缩、塌陷和变形，所以对干燥环节技术要求更高。
[0004] 常用的方法有自然干燥法，
冷冻干燥法，烘干干燥法，叔丁醇干燥法和临界点干燥法。
[0005] 临界点干燥被认为是目前生物学扫描电镜样品制备中最可靠、最理想的干燥方法（肖媛，实验室研究与探索，2013，32，45-53）。然而，关于植物样品临界点干燥方法的诸多细节报道较少，特别是幼嫩柔软、极易缩水变形的植物组织。
[0006] 每种物质在一个特定的
温度都可以进行相态转化，这个温度就是该物质的临界点。CO2的
临界温度为31.1℃，在临界点的压力为
临界压力。在
临界状态下，液体和气体的
密度相等，界面完全消失，液体的表面张力系数为零。临界点干燥虽然是一种非常好的干燥方法，但是操作时有诸多的细节，细小环节的操作不当会导致样品缩水，干燥失败。
[0007] 乙酸异戊酯是一种常用的临界点干燥中间液，因其可以与CO2充分混合，但是样品上残留的乙酸异戊酯如果略多一些，干燥后会残留下来或在排气管中
凝结，干燥结束后又会返流进入样品室，浸湿样品。或者导致临界点升高，干燥失败。而样品上残留的乙酸异戊酯过少时，乙酸异戊酯挥发会使样品在空气中干燥，从而导致样品收缩。
乙醇也可以作为中间液，但从乙醇中取出来直接用于临界点干燥，样品收缩要大于用乙酸异戊酯做中间液。也可以用丙
酮做中间液，但是丙酮易挥发，样品有在样品筐中发生空气干燥的可能性。
发明内容
[0008] 本发明提供了一种用于扫描电镜的植物样品临界点干燥方法。
[0009] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0010] 1）用
滤纸分别
覆盖在临界点干燥器的样品筐的顶部和底部，且在所述滤纸上设有若干便于乙酸异戊酯和CO2的交换的孔；将预处理植物样品放置于所述样品筐中，得到置有所述预处理植物样品的样品筐；
[0011] 所述预处理植物样品为将植物组织经固定、脱水和乙酸异戊酯置换后得到的含有乙酸异戊酯的预处理植物样品；
[0012] 2）将所述置有所述预处理植物样品的样品筐置于临界点干燥器样品室底部，关闭样品室，充CO2至达到所述样品室容积的60-70%，静置使CO2置换所述预处理植物样品中的乙酸异戊酯；放气同时充CO2、继续充CO2至达到所述样品室容积的60-70%，再次静置使CO2置换所述预处理植物样品中的乙酸异戊酯；再次放气同时充CO2、再次继续充CO2至达到所述样品室容积的70%，最后静置使CO2置换预处理植物样品中的乙酸异戊酯；
[0013] 3）调节临界点干燥器样品室的温度至35-40℃，放CO2，取出样品，即为干燥后样品。
[0014] 上述方法中，在步骤1）中，在所述将预处理植物样品放置于所述样品筐中的步骤前还包括如下步骤：将所述样品筐底部覆盖的滤纸用乙酸异戊酯润湿；
[0015] 步骤1）和步骤2）之间还包括如下步骤：在所述临界点干燥器样品室底部放置另一滤纸用于放置所述样品筐，再预冷所述样品室使温度为-10-0℃。
[0016] 上述方法中，步骤2）中，所述静置、所述再次静置和所述最后静置时间均为15-20分钟；
[0017] 所述最后静置的温度为20℃；
[0018] 步骤3）中，所述放CO2采用缓慢放CO2，使放CO2的时间为4-5小时。
[0019] 上述方法中，所述滤纸和所述另一滤纸均为定性滤纸，所述滤纸和所述另一滤纸使用时均为
单层；
[0020] 步骤1）中，所述预处理植物样品平铺一层放置在所述样品筐的底部；
[0021] 步骤2）中，所述放气同时充CO2的时间为3min。
[0022] 上述方法中，所述植物组织为柔软且易缩水变形的植物组织。
[0023] 上述方法中，所述植物组织为花器官、胚或幼根，也可以为其他幼嫩的部位。
[0024] 上述方法中，所述固定为将所述植物样品置于FAA固定液中
负压抽气，4℃固定24小时，得到固定后样品；
[0025] 所述脱水为将所述固定后样品依次浸泡在体积百分含量为70%乙醇水溶液、体积百分含量为80%乙醇水溶液、体积百分含量为90%乙醇水溶液、体积百分含量为95%乙醇水溶液、100%乙醇中进行梯度乙醇脱水，各处理20分钟，得到脱
水处理后样品；
[0026] 所述置换将上述脱水处理后样品依次浸泡在体积百分含量75%乙醇乙酸异戊酯溶液、50%乙醇乙酸异戊酯溶液、25%乙醇乙酸异戊酯溶液和100%乙酸异戊酯中进行乙酸异戊酯置换，各处理20分钟，得到预处理样品；
[0027] 所述75%乙醇乙酸异戊酯溶液由体积比为3:1的乙醇和乙酸异戊酯组成，[0028] 所述50%乙醇乙酸异戊酯溶液由体积比为1:1的乙醇和乙酸异戊酯组成，[0029] 所述25%乙醇乙酸异戊酯溶液由体积比为1:3的乙醇和乙酸异戊酯组成。
[0030] 在步骤3）的取出样品后，还包括将处理后样品进行喷金，得到干燥样品的步骤。
[0031] 本发明的实验证明，本发明方法中的临界点干燥的步骤中，在临界点干燥器的样品筐上下各附一层滤纸（防止市售CO2不纯，污染样品），用针扎出小孔（便于乙酸异戊酯和CO2的交换），用乙酸异戊酯将样品筐下层所附滤纸润湿（防止样品放入后滤纸
吸附乙酸异戊酯导致干燥）；该过程要防止乙酸异戊酯挥发，样品自然干燥，也要防止乙酸异戊酯过多导致临界点升高，干燥失败；而在临界点干燥器样品室底部放一张同样大小的圆形滤纸，防止干燥后回流的乙酸异戊酯重新浸湿样品，同时采用长时间置换（各20分钟）和两次放气可以保证乙酸异戊酯和CO2充分交换，且使最后CO2在样品室中的体积准确达到70%，此过程CO2的量是关键，过多或过少都会导致干燥失败，最后干燥完成后长时间放气，可以减少过大的CO2气流对样品的冲击导致样品变形。因此，采用本发明的方法，可以使样品不收缩变形且达到干燥的目的，尤其针对幼嫩柔软、极易缩水变形的植物组织，效果更明显。
附图说明
[0032] 图1为使用本发明方法及现有方法干燥的植物幼嫩样品扫描电镜观察具体实施方式
[0033] 下述
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] 实施例1、用于扫描电镜的植物幼嫩样品临界点干燥方法
[0036] 1、样品固定
[0037] 将植物幼嫩组织样品采集后立即投入FAA固定液中，
注射器负压抽气以去除样品表面的气体。方法是把样品和固定液一起倒入一个大的注射器中，将样品和液体推至上端直至没有空气，左手堵住针管口，右手拉注射器杆，松开左手，再往上推，再拉，反复几次，直到样品全部落到固定液底部。4℃固定24小时，得到固定后样品。
[0038] FAA固定液（100ml）:50%乙醇89ml、
冰乙酸6ml、甲
醛5ml。
[0039] 上述植物幼嫩组织样品为水稻花器官、浆片和幼根（种子萌发10天的根）、鸦胆子花器官、芒草的胚。
[0040] 2、样品脱水、置换
[0041] 1）脱水：
[0042] 梯度乙醇脱水：将固定后样品依次浸泡在体积百分含量为70%乙醇水溶液、体积百分含量为80%乙醇水溶液、体积百分含量为90%乙醇水溶液、体积百分含量为95%乙醇水溶液、100%乙醇中进行梯度乙醇脱水，各处理20分钟，得到脱水处理后样品；
[0043] 乙酸异戊酯置换：将上述脱水处理后样品依次浸泡在体积百分含量75%乙醇乙酸异戊酯溶液、50%乙醇乙酸异戊酯溶液、25%乙醇乙酸异戊酯溶液和100%乙酸异戊酯中进行乙酸异戊酯置换，各处理20分钟，得到预处理样品。
[0044] 上述75%乙醇乙酸异戊酯溶液配方如下：75%乙醇+25%乙酸异戊酯，
[0045] 50%乙醇乙酸异戊酯溶液配方如下：50%乙醇+50%乙酸异戊酯，
[0046] 25%乙醇乙酸异戊酯溶液配方如下：25%乙醇+75%乙酸异戊酯。
[0047] 3、临界点干燥
[0048] （1）将临界点干燥器（日立HCP-2）的样品筐顶部和底部分别覆盖一层定性滤纸（防止市售CO2不纯，污染样品），且用针在滤纸上扎出小孔便于乙酸异戊酯和CO2的交换，用乙酸异戊酯将样品筐底部所覆滤纸润湿（防止样品放入后滤纸吸附乙酸异戊酯导致干燥），放入上述2制备的预处理植物样品，每个筐内样品不宜过满，以平铺底部一层为宜，每次干燥不能多于6个筐。该过程要防止乙酸异戊酯挥发，样品自然干燥。得到置有预处理植物样品的样品筐。
[0049] （2）临界点干燥器样品室底部放一张同样大小的圆形滤纸，防止干燥后回流的乙酸异戊酯重新浸湿样品，放好刻度尺，预冷至-10℃（温度过高，CO2液体不易进入样品室），迅速将置有预处理植物样品的样品筐放置在样品室底部滤纸上，拧紧
盖子关闭样品室，防止漏气。打开进气
阀，向样品室中缓慢充进CO2，可以观察到压力表的压力缓慢上升。待2-3分钟后,CO2达到刻度尺6-7的
位置即可（使CO2达到所述样品室容积的60-70%），静置20分钟使CO2置换预处理植物样品中的乙酸异戊酯。
[0050] （3）打开放气阀门，同时充入CO2，注意不要让CO2液面低于样品筐，动态放气3分钟。关闭放气阀，继续充入CO2从样品室上面的玻璃窗查看CO2达到刻度尺6-7的位置（使CO2达到所述样品室容积的60-70%），关闭进气阀，再次静置20分钟使CO2置换预处理植物样品中的乙酸异戊酯。
[0051] （4）打开放气阀门，同时充入CO2，注意不要让CO2液面低于样品筐，动态放气3分钟。关闭放气阀，继续充入CO2从样品室上面的玻璃窗查看CO2达到刻度尺7的位置（使CO2达到所述样品室容积的70%），关闭放气阀，将温度调至20℃，此时压力60-70
大气压，最后静置20分钟使CO2置换预处理植物样品中的乙酸异戊酯。
[0052] （5）将温度调至40℃，打开放气阀缓慢放CO2，该过程约4-5小时；取出样品，完成样品干燥。
[0053] 该过程温度达到临界点31.1℃时（约4分钟；如样品多，带进的乙酸异戊酯多，临界点温度会略有升高），这时样品室的CO2界面消失，全部变成气体状态。
[0054] 4、样品粘台、喷金
[0055] 将干燥后的样品用双面胶粘在金属台上，离子溅射仪（日立E-1010）对金属台喷金110秒，得到干燥样品。
[0056] 5、以现有临界点干燥技术为对照，具体如下：
[0057] （1）将临界点干燥器（日立HCP-2）的样品筐顶部和底部两个表面各附一层定性滤纸，用乙酸异戊酯将滤纸润湿，放入样品。
[0058] （2）打开进气阀，向样品室中缓慢充进CO2，待2-3分钟后,CO2达到刻度尺6-7的位置，静置5分钟。
[0059] （3）打开放气阀门，同时充入CO2，动态放气3分钟。关闭放气阀，CO2达到刻度尺6-7的位置（使CO2达到所述样品室容积的60-70%），关闭进气阀将温度调至20℃，静置3分钟。
[0060] （4）将温度调至40℃，达到40℃后，打开放气阀放气，该过程约1小时；取出样品，样品干燥完成。
[0061] 6、扫描电镜观察
[0062] 在冷场发射扫描电镜（日立S-4800）下观察上述获得的干燥样品和上述
现有技术获得的干燥样品，拍摄图片。
[0063] 结果如图1所示，其中A为水稻花器官，B为水稻浆片，C为鸦胆子植物花器官，D为水稻幼根，E、F为芒草的胚，G和H分别为E和F红色框区域的放大观察。其中图1F和H是使用现有临界点干燥方法干燥的样品，其他为使用本
专利方法干燥的样品。从图中可以看出，A、B、C、D、E、G样品形态饱满，基本没有缩水，最大程度保持了样品原貌，而F、H样品细胞缩水、塌陷、变形，影响了样品观察。
