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由人类滋养层干细胞生成神经干细胞

阅读：114发布：2022-08-17

专利汇可以提供由人类滋养层干细胞生成神经干细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供经分离的神经干细胞。还提供使用包含该经分离的神经干细胞的适合的制剂来治疗神经退化疾病的方法。在一个实施方案中，此处所述的经分离的神经干细胞表达尾型同源框2(Cdx2)、Nanog同源框、巢蛋白、八聚物结合转录因子4(Oct-4)、神经丝、神经原素-3(Ngn3)、新霉素缺失基因(Neo-D)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、CD133、视黄酸受体β(RARJ3)、类视黄醇X受体α(RXRa)、类视黄醇X受体β(RXRJ3)、细胞视黄酸结合蛋白2(CRABP-2)、细胞视黄醇结合蛋白l(CRBP-I)、视黄醛脱氢酶2(RALDH-2)或视黄醛脱氢酶3(RALDH-3)中的一种或多种的转录物。，下面是由人类滋养层干细胞生成神经干细胞专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞衍生自从滋养层组织中所得到的干细胞。
2.一种经分离的神经干细胞，其中所述神经干细胞表达Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct-4、神经丝、Ngn3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一种或多种的转录物。
3.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述细胞是人细胞。
4.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述细胞具有正常的核型。
5.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述细胞具有一种或多种免疫豁免的特性。
6.如权利要求5所述的细胞，其中所述一种或多种免疫豁免的特性包括不存在CD33表达和/或CD133表达。
7.一种使权利要求1或2的经分离的神经干细胞分化成神经元的方法，该方法包括：
将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述经分离的神经干细胞分化成神经元。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述神经元是多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元、
5-羟色胺能神经元或GABA能(γ-氨基丁酸)神经元。
9.如权利要求7所述的方法，其中在所述施用之前，用诱导药物预诱导所述祖细胞。
10.如权利要求7所述的方法，其中该诱导期为至少1天。
11.如权利要求7所述的方法，其中在所述施用之前，未用诱导药物预诱导所述祖细胞。
12.如权利要求7所述的方法，其中在所述施用之前，所述哺乳动物的所述脑被损害或蒙受神经元缺失。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述损害是针对多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元、GABA能(γ-氨基丁酸)神经元的。
14.如权利要求7所述的方法，其中所述神经元缺失是针对多巴胺能神经元的。
15.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞用表达载体转染。
16.如权利要求7所述的方法，其中所述干细胞在被施用至所述个体的脑中之后，会移转至该个体的脑的黑质致密部(SNc)区域。
17.如权利要求7所述的方法，其中所述施用改善所述哺乳动物中的感觉运动功能。
18.如权利要求7所述的方法，其中所述施用导致所述哺乳动物的僵硬、运动失能症或平衡障碍的减轻。
19.一种使经分离的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的方法，该方法包括：将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述经分离的神经干细胞表达Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct-4、神经丝、NgN3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一种或多种的转录物，其中所述哺乳动物的所述脑被损害或已蒙受神经元缺失，其中所述经分离的神经干细胞中的一种或多种分化成多巴胺能神经元。
20.一种使经分离的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的方法，该方法包括：将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述分离的神经干细胞衍生自滋养层组织，其中所述哺乳动物的所述脑被损害或已蒙受神经元缺失，其中所述经分离的神经干细胞中的一种或多种分化成多巴胺能神经元。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述施用改善所述哺乳动物中的感觉运动功能。
22.如权利要求19或20所述的方法，其中所述施用导致所述哺乳动物的僵硬、运动失能症或平衡障碍的减轻。
23.如权利要求19或20所述的方法，其中在所述施用之前，用诱导药物预诱导所述祖细胞。
24.如权利要求19或20所述的方法，其中该诱导期为至少1天。
25.如权利要求19或20所述的方法，其中在所述施用之前，未用诱导药物预诱导所述祖细胞。
26.一种使经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，其包括：调节Cdx2、Nanog、巢蛋白、神经丝、Ngn-3、MAP-2、Neo-D、CD133、Oct4、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3基因的活性。
27.一种使经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，其包括：调节Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct4、神经丝、Ngn-3、MAP-2、Neo-D、CD133、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3转录物的水平。
28.一种使经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，其包括：调节Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct4、神经丝、Ngn-3、MAP-2、Neo-D、CD133、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3蛋白质的水平或活性。
29.一种筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，其包括：
a.使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及
b.检测所述人类滋养层干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性的改变。
30.如权利要求29所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的所述活性降低。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中的至少一种基因、转录物或蛋白质的所述活性增加。
32.如权利要求29至31所述的方法，其中所述疾病是神经退化性障碍。
33.如权利要求29至32所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和自闭症。
34.一种筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，其包括：
a.使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及
b.检测所述人类滋养层干细胞中至少一种转录物或蛋白质的水平的改变。
35.如权利要求34所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中至少一种转录物或蛋白质的所述水平降低。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中至少一种转录物或蛋白质的所述水平增加。
37.如权利要求34至36所述的方法，其中所述疾病是神经退化性障碍。
38.如权利要求34至37所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和自闭症。
39.一种针对诱导细胞中的改变的能力筛选化合物的方法，其包括：
a.使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及
b.检测对所述人类滋养层干细胞的分化的诱导。
40.一种针对诱导细胞中的改变的能力筛选化合物的方法，其包括：
a.使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及
b.检测对所述神经干细胞的分化的诱导。
41.一种筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，其包括：
a.使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及
b.检测所述神经干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性的改变。
42.如权利要求41所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的所述活性降低。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性增加。
44.如权利要求41至43所述的方法，其中所述疾病是神经退化性障碍。
45.如权利要求41至44所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和自闭症。
46.一种筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，其包括：
a.使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及
b.检测所述神经干细胞中至少一种转录物或蛋白质的水平的改变。
47.如权利要求46所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中至少一种转录物或蛋白质的所述水平降低。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中至少一种转录物或蛋白质的所述水平增加。
49.如权利要求46至48所述的方法，其中所述疾病是神经退化性障碍。
50.如权利要求46至49所述的方法，其中所述疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和自闭症。
51.一种用于治疗有需要的哺乳动物中的神经障碍的方法，其包括将至少一种神经干细胞施用至所述哺乳动物，其中该细胞是经免疫豁免的。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述哺乳动物是小鼠、大鼠、猪、犬、猴、猩猩或人猿。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
54.如权利要求51所述的方法，其中所述有需要的哺乳动物具有一种或多种与神经障碍有关的症状。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述一种或多种症状选自于由下列所构成的群组：僵硬、平衡障碍、震颤、步态障碍、不良性步态、痴呆、过度肿胀(水肿)、肌无力、下肢萎缩、运动障碍(舞蹈病)、肌肉僵直、物理运动的减慢(运动迟缓)、物理运动的缺失(运动失能症)、健忘、认知(智能)损伤、辨识的缺失(失识症)、受损的功能诸如决策与计划、单侧面麻痹、感觉缺失、麻木、刺痛感、四肢的疼痛感觉异常、虚弱、脑神经麻痹、语言障碍、眼球运动、视野缺损、失明、出血、分泌物、近端肌萎缩、运动困难症、四肢肌肉张力的异常、肌强直减少、动作失调、在手指-手指测试或手指-鼻测试中错误的指示、辨距不良、霍-斯二氏现象、不完全的或完全的全身性麻痹、视神经炎、视物显多症、眼球运动障碍如眼球震颤、痉挛性麻痹、痛苦的强直发作、莱尔米特综合征、共济失调、语言困难、膀胱直肠障碍、起立性低血压、运动功能的减退、尿床、贫乏的言语表达、不充足的睡眠型态、睡眠障碍、食欲障碍、体重改变、精神运动性激动或迟滞、减少的活力、无价值的感受或过度或不适当的内疚、思考或全神贯注困难、反复的死亡意图或者自杀的意念或企图、害怕、焦虑、兴奋增盛、沉思的或强迫性沉思、过度担心身体健康、恐慌发作以及恐惧症。
56.如权利要求51所述的方法，其中所述神经障碍是帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和自闭症。
57.如权利要求51所述的方法，其中该神经干细胞衍生自滋养层组织。
58.如权利要求51所述的方法，其中该经免疫豁免的细胞具有低水平的CD33表达。
59.如权利要求51所述的方法，其中该经免疫豁免的细胞具有低水平的CD133表达。
60.如权利要求51所述的方法，其中该神经干细胞表达Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct-4、神经丝、NgN3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一种或多种的转录物。
61.如权利要求51所述的方法，其中该方法进一步包括将所述一种或多种神经干细胞施用到哺乳动物的脑中，其中该细胞分化成神经元。
62.如权利要求51所述的方法，所述施用包括注射或植入。
63.如权利要求56所述的方法，其中所述神经元是多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元或者GABA能(γ-氨基丁酸)神经元。
64.如权利要求56所述的方法，其中在所述施用之前，用诱导药物进行预诱导所述祖细胞。
65.如权利要求56所述的方法，其中该神经祖干细胞不会引起免疫反应。
66.如权利要求56所述的方法，其中该神经祖干细胞不会形成肿瘤。
67.一种诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法，其包括：
a.使该干细胞与诱导药物接触；
b.在该干细胞中用诱导药物来调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括：Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRAT1、GSK3β、HDAC6、β-联蛋白、Gαq/11、Gβ、RXRα、RARβ、GLuR1、PI3K、AKt1、AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREB1、TH(酪氨酸羟化酶)、PLC-β、PIP2、CaMKII、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFAT1、输入蛋白、LEF1、Pitx2、MEF2A或EP300；以及
c.诱导或促进该干细胞分化成具有神经元特性的细胞。
68.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物滋养层干细胞。
69.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物胚胎干细胞。
70.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物经诱导的多能干细胞。
71.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞是内胚层、中胚层、外胚层或间质干细胞。
72.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞来自于小鼠、大鼠、人类、黑猩猩、大猩猩、犬、猪、山羊、海豚或牛。
73.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞来自于人类。
74.如权利要求67所述的方法，其中该干细胞是人类滋养层干细胞。
75.如权利要求第67所述的方法，其中该具有神经元特性的细胞具有与下列细胞相似的表型：神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元、GABA能(γ-氨基丁酸)神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞、GRP细胞、NRP细胞、MNS细胞、AST细胞或TGC细胞或中等棘细胞。
76.如权利要求67至75所述的方法，其中所述诱导药物包括：视黄酸、烟酰胺或β-巯基乙醇、维生素B12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羟基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素。
77.如权利要求67至75所述的方法，其中所述调节包括：增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。
78.如权利要求67至75所述的方法，其中所述调节包括：增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。
79.如权利要求78所述的方法，其中增加表达包括：增加编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或增加由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。
80.如权利要求67至75所述的方法，其中所述调节包括：降低该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。
81.如权利要求67至75所述的方法，其中所述调节包括：减少该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。
82.如权利要求81所述的方法，其中减少表达包括：减少编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或减少由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。
83.如权利要求67至75所述的方法，其中所述神经元特性包括：多巴胺、谷氨酸NMDA受体的亚基、突触蛋白I、α-钙通道标记、GAP-43、电压依赖的K+通道、电压依赖的Ca+通道或电压依赖的Na+通道的表达。
84.如权利要求67至75所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是Wnt2B。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被活化。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被去活化。
87.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被活化，并接着被去活化。
88.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B被去活化，并接着被活化。
89.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B促进该干细胞的分化或增殖。
90.如权利要求84所述的方法，其中所述Wnt2B促进或诱导多巴胺表达。
91.如权利要求67至75所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是GSK3β。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK3β被活化。
93.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK3β被去活化。
94.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK3β被活化，并接着被去活化。
95.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK3β被去活化，并接着被活化。
96.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK3β促进该干细胞的分化或增殖。
97.如权利要求91所述的方法，其中所述GSK3β调节微管装配。
98.如权利要求67至75所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是CREB1。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述CREB1被活化。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述CREB1被去活化。
101.如权利要求98所述的方法，其中所述CREB1被活化，并接着被去活化。
102.如权利要求98所述的方法，其中所述CREB1被去活化，并接着被活化。
103.如权利要求98所述的方法，其中所述CREB1促进该干细胞的分化或增殖。
104.如权利要求98所述的方法，其中所述CREB1促进或诱导多巴胺表达。
105.如权利要求67至75所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是CaMKII。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被活化。
107.如权利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被去活化。
108.如权利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被活化，并接着被去活化。
109.如权利要求105所述的方法，其中所述CaMKII被去活化并接着被活化。
110.如权利要求105所述的方法，其中所述CaMKII促进该干细胞的分化或增殖。
111.如权利要求105所述的方法，其中该CaMKII调节微管装配。
112.如权利要求67至75所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是MAPT。
113.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT被活化。
114.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT被去活化。
115.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT被活化并接着被去活化。
116.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT被去活化并接着被活化。
117.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT促进该干细胞的分化或增殖。
118.如权利要求112所述的方法，其中所述MAPT调节微管装配。
119.一种诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法，其包括：
a.使该干细胞与诱导药物接触；
b.在该干细胞中用诱导药物来调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括：Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRAT1、GSK3β、HDAC6、β-联蛋白、Gαq/11、Gβ、RXRα、RARβ、GLuR1、PI3K、AKt1、AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREB1、TH(酪氨酸羟化酶)、PLC-β、PIP2、CaMKII、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFAT1、输入蛋白、LEF1、Pitx2、MEF2A或EP300；以及
c.诱导或促进该干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞。
120.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物滋养层干细胞。
121.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物胚胎干细胞。
122.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞是哺乳动物经诱导的多能干细胞。
123.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞是内胚层、中胚层、外胚层或间质干细胞。
124.如权利要求119所述的方法，其中该具有降低的免疫原性的细胞具有与下列细胞相似的表型：神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元、GABA能(γ-氨基丁酸)神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞、GRP细胞、NRP细胞、MNS细胞、AST细胞或TGC细胞，或中等棘细胞。
125.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞来自于小鼠、大鼠、人类、黑猩猩、大猩猩、犬、猪、山羊、海豚或牛。
126.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞来自于人类。
127.如权利要求119所述的方法，其中该干细胞是人类滋养层干细胞。
128.如权利要求119至127所述的方法，其中该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应或可以抑制免疫反应。
129.如权利要求119至127所述的方法，其中该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应或可以抑制免疫反应。
130.如权利要求119至127所述的方法，其中该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应，或者可以通过T细胞、B细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、肥大细胞或NK细胞来抑制免疫反应。
131.如权利要求119至127所述的方法，其中所述诱导药物包括：视黄酸、烟酰胺或β-巯基乙醇、维生素B12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羟基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、
5-氮胞苷、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素。
132.如权利要求119至127所述的方法，其中所述调节包括：增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。
133.如权利要求119至127所述的方法，其中所述调节包括：增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。
134.如权利要求133所述的方法，其中增加表达包括：增加编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或增加由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。
135.如权利要求119至127所述的方法，其中所述调节包括：降低该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。
136.如权利要求119至127所述的方法，其中所述调节包括：减少该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。
137.如权利要求136所述的方法，其中减少表达包括：减少编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或减少由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。
138.如权利要求119至127所述的方法，其中该方法进一步包括：诱导或促进该干细胞分化成具有神经元特性的细胞，其中所述神经元特性包括：多巴胺、谷氨酸NMDA受体的亚基、突触蛋白I、α-钙离子通道标记、GAP-43、电压依赖的K+通道、电压依赖的Ca+通道或电压依赖的Na+通道的表达。
139.如权利要求119至127所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质是NFAT。
140.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT被活化。
141.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT被去活化。
142.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT被活化并接着被去活化。
143.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT被去活化并接着被活化。
144.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT促进该干细胞的分化或增殖。
145.如权利要求139所述的方法，其中所述NFAT调节微管装配。
146.一种诱导或促进人类滋养层干细胞分化成tNSC(滋养层神经干细胞)的方法，其包括：
a.使该人类滋养层干细胞与诱导药物接触；
b.在该干细胞中用诱导药物来调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括：Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRAT1、GSK3β、HDAC6、β-联蛋白、Gαq/11、Gβ、RXRα、RARβ、GLuR1、PI3K、AKt1、AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREB1、TH(酪氨酸羟化酶)、PLC-β、PIP2、CaMKII、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFAT1、输入蛋白、LEF1、Pitx2、MEF2A或EP300；以及
c.诱导或促进该人类滋养层干细胞分化成tNSC。
147.如权利要求146所述的方法，其中该诱导药物包括：视黄酸、烟酰胺或β-巯基乙醇、维生素B12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羟基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素。
148.如权利要求146所述的方法，其中该tNSC具有降低的免疫原性。
149.如权利要求146所述的方法，其中该tNSC不会诱导免疫反应，或可以抑制免疫细胞所引起的免疫反应。
150.如权利要求148所述的方法，其中该免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、肥大细胞或NK细胞。
151.一种诱导或促进人类滋养层干细胞分化成具有与神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元、GABA能(γ-氨基丁酸)神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞、GRP细胞、NRP细胞、MNS细胞、AST细胞或TGC细胞或中等棘细胞相似的表型的细胞的方法，其包括：
a.使该人类滋养层干细胞与诱导药物接触；
b.在该干细胞中用诱导药物来调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括：Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRAT1、GSK3β、HDAC6、β-联蛋白、Gαq/11、Gβ、RXRα、RARβ、GLuR1、PI3K、AKt1、AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREB1、TH(酪氨酸羟化酶)、PLC-β、PIP2、CaMKII、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFAT1、输入蛋白、LEF1、Pitx2、MEF2A或EP300；以及
c.诱导或促进该人类滋养层干细胞分化成神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞、GRP细胞、NRP细胞、MNS细胞、AST细胞或TGC细胞，或中等棘细胞。
152.一种通过使哺乳动物干细胞与LIF接触而维持其增殖能力的方法。
153.如权利要求152所述的方法，其中该LIF的浓度介于1-1000U/ML之间。
154.如权利要求152所述的方法，其中该LIF的浓度是大约125至大约250U/ML。
155.如权利要求152所述的方法，其中该LIF的浓度是大约125至大约500U/ML。
156.如权利要求152所述的方法，其中该LIF的浓度是大约125至大约1000U/ML。
157.如权利要求152至156所述的方法，其中该干细胞是滋养层、胚胎或经诱导的多能干细胞。
158.如权利要求152至156所述的方法，其中该干细胞是人类、小鼠、大鼠、人类、黑猩猩、大猩猩、犬、猪、山羊、海豚或牛干细胞。
159.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞表达高水平的HLA-ABC(MHC-I)。
160.如权利要求159所述的方法，其中所述水平高于人类胚胎干细胞所表达的水平。
161.如权利要求159所述的方法，其中所述水平与人类滋养层干细胞所表达的水平相似。
162.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞表达低水平的CD33。
163.如权利要求162所述的方法，其中所述水平低于人类胚胎干细胞所表达的水平。
164.如权利要求162所述的方法，其中所述水平低于人类滋养层干细胞所表达的水平。
165.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞不表达CD33。
166.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述分离的神经干细胞表达低水平的CD133。
167.如权利要求164所述的方法，其中所述水平低于人类胚胎干细胞所表达的水平。
168.如权利要求164所述的方法，其中所述水平低于人类滋养层干细胞所表达的水平。
169.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞表达低水平的CD34。
170.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞在施用至受体哺乳动物中之后不会形成畸胎瘤。
171.如权利要求1或2所述的经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞在施用至受体人类中之后不会形成畸胎瘤。
172.如权利要求51所述的方法，其中该经免疫豁免的细胞表达CD34。
173.一种抑制肿瘤细胞的方法，其包括：
a.使该肿瘤细胞与化合物接触；
b.调节该肿瘤细胞中的AhR；以及
c.通过该调节来抑制该肿瘤细胞。
174.一种减少肿瘤细胞生长的方法，其包括：
a.使该肿瘤细胞与治疗剂接触；
b.调节该肿瘤细胞中的AhR；以及
c.通过该调节来减少在该肿瘤细胞中的生长。
175.如权利要求173或174所述的方法，其中调节AhR包括：抑制所述细胞中的AhR蛋白质活性。
176.如权利要求173或174所述的方法，其中调节AhR包括：抑制所述细胞中的AhR基因表达。
177.如权利要求173或174所述的方法，其中该肿瘤细胞被杀死。
178.如权利要求173或174所述的方法，其中该肿瘤是肺、乳腺、结肠、脑、骨、肝、前列腺、胃、食道、皮肤或白血病肿瘤。
179.如权利要求173或174所述的方法，其中该肿瘤是实体或液态肿瘤。
180.如权利要求173或174所述的方法，其中AhR用AhR促效剂进行调节。
181.如权利要求173或174所述的方法，其中AhR用AhR拮抗剂进行调节。
182.如权利要求173或174所述的方法，其中AhR用具有抗雌激素活性的化合物进行调节。
183.如权利要求173或174所述的方法，其中AhR用具有抗雄激素活性的化合物进行调节。
184.如权利要求173或174所述的方法，其中该肿瘤细胞存在于哺乳动物中。
185.如权利要求173或174所述的方法，其中该肿瘤细胞存在于人类中。

说明书全文

由人类滋养层干细胞生成神经干细胞

技术领域

[0002] 人类滋养层干(human trophoblast stem，hTS)细胞能够在未分化的状态下在体外(in vitro)无限增殖。hTS细胞维持潜在的多谱系分化能力(potential multilineage
differentiation capabilities)。hTS细胞制剂在体外或在体内(in vivo)可以被诱
导分化成为滋养层谱系的细胞。进一步地，hTS细胞可以被诱导分化成为神经元，诸如多
巴胺能神经元(dopaminergic neurons)。hTS细胞可以被用来治疗在黑质纹状体途径
(nigrostriatal pathway)中多巴胺能神经元的功能异常或缺失，诸如人类中的神经退化
性障碍(neurodegenerative disorders)。
发明内容

[0003] 神经退化性障碍在人类族群中具有很深的社会经济影响(socio-economiceffects)。目前的药物通过减轻神经退化性障碍[诸如，帕金森氏症(Parkinson’s
disease)、阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease)、亨廷顿氏症(Huntington’s disease)等]的某些症状而仅提供有限的益处。帕金森氏症(PD)是由于黑质纹状体途径中多巴胺
能神经元的功能异常或缺失所造成的，并且是在人类中常见的神经退化性障碍。此处提供
了用于对哺乳动物中的神经退化性障碍[包括帕金森氏症、亨廷顿氏症、阿尔兹海默症、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、多系统萎缩(multiple system atrophy)、路易氏体痴呆(Lewy body dementia)、周边感觉神经病变(peripheral sensory neuropathies)或脊髓损伤(spinal cord injuries)]进行以细胞为基础的替代治疗的经
分离的神经干细胞(isolated neural stem cells)。

[0004] 在一个方面，此处提供了经分离的神经干细胞，其中所述经分离的神经干细胞衍生自滋养层组织(trophoblast tissue)。在一些实施方案中，该滋养层组织是人类滋养层
组织。

[0005] 在一个实施方案中，此处所描述的经分离的神经干细胞表达尾型同源框2(caudal type homeobox2，Cdx2)、Nanog同源框(Nanog homeobox)、巢蛋白(nestin)、
八聚物结合转录因子4(octamer-binding transcription factor4，Oct-4)、神经丝
(neurofilament)、神经原素-3(neurogenin-3，NgN3)、新霉素缺失基因(Neo-D)、微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein-2，MAP-2)、CD133、视黄酸受体β(retinoic
acid receptor beta，RARβ)、类视黄醇X受体α(retinoid Xreceptor alpha，RXRα)、类视黄醇X受体β(retinoid X receptor beta，RXRβ)、细胞视黄酸结合蛋白2(cellular
retinoic acid binding protein2，CRABP-2)、细胞视黄醇结合蛋白1(cellular retinol binding protein1，CRBP-1)、视黄醛脱氢酶2(retinaldehyde dehydrogenase2，RALDH-2)或视黄醛脱氢酶3(retinaldehyde dehydrogenase3，RALDH-3)中的一种或多种的转录物
(transcript)。

[0006] 在一个实施方案中，该经分离的神经干细胞是人类神经干细胞。在一个实施方案中，该细胞具有正常的核型(karyotype)。在另一实施方案中，该经分离的神经干细胞具有一种或多种免疫豁免的特性(immune-privileged characteristics)。在另一实施方案中，该一种或多种免疫-豁免的特性包含不存在CD33的表达和/或CD133的表达。

[0007] 此处进一步提供了将该经分离的神经干细胞分化成神经元(neurons)的方法，该方法包括：将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述经分离的神经干
细胞分化成神经元。在另一实施方案中，该神经元是多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元
(glutaminergic neuron)、5-羟色胺能神经元(serotonergic neuron)或GABA能(γ-氨
基丁酸)神经元。

[0008] 在一个实施方案中，该经施用的(例如，经移植的)经分离的神经干细胞在所述施用之前用诱导药物(induction drug)进行预诱导。在另一实施方案中，该经分离的神经干
细胞在所述施用之前不用诱导药物进行预诱导。

[0009] 在一个实施方案中，在所述施用之前，所述哺乳动物的脑被损害或已蒙受神经元缺失(neuronal loss)。在另一实施方案中，所述损害是针对多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元或GABA能(γ-氨基丁酸)神经元的。在另一实施方案中，所述
神经元缺失是针对多巴胺能神经元的。

[0010] 在一个实施方案中，用表达载体转染所述细胞。

[0011] 在另一实施方案中，该经分离的神经干细胞，在被施用至所述个体的脑中之后，移转至该个体的脑的黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNC)区域。在另一实施方案中，所述施用改善所述哺乳动物中的感觉运动功能(sensorimotor function)。在另一实施方案中，所述施用导致所述哺乳动物的僵硬(rigidity)、运动失能症(akinesia)或
平衡障碍(balance impairment)的减轻。

[0012] 此处提供了将经分离的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的方法，该方法包括：将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述经分离的神经干细胞表达
Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct-4、神经丝、NgN3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一种或多种的转录物，其中所述哺乳动物的脑被损害或已蒙受神经元缺失，其中所述经分离的神经干细胞中的一种或多种分化成多巴胺能
神经元。

[0013] 此处提供了将经分离的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的方法，该方法包括：将所述经分离的神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中所述经分离的神经干细胞衍生自
滋养层组织，其中所述哺乳动物的脑被损害或已蒙受神经元缺失，其中所述经分离的神经
干细胞中的一种或多种分化成多巴胺能神经元。

[0014] 在上面所述的方法的一个实施方案中，所述施用改善所述哺乳动物中的感觉运动功能。在上面所述的方法的另一实施方案中，所述施用导致所述哺乳动物的僵硬、运动失能症或平衡障碍的减轻。

[0015] 此处提供了将经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，该方法包括：调节Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct4、神经丝、Ngn-3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3基因的活性。

[0016] 此处提供了将经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，该方法包括：调节Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct4、神经丝、Ngn-3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3转录物的水平。

[0017] 此处提供了将经分离的人类滋养层干细胞分化成神经干细胞的方法，该方法包括：调节Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct4、神经丝、Ngn-3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3蛋白质的水平或活性。

[0018] 此处提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，该方法包括：使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及检测所述人类滋养层干细胞中至少一种基因、
转录物或蛋白质的活性的改变。在上面所述的方法的一个实施方案中，与未接触所述化合
物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中的至少一种基
因、转录物或蛋白质的活性降低。在上面所述的方法的另一实施方案中，与未接触所述化
合物的可比较的经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中的至少一种基
因、转录物或蛋白质的活性增加。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是神经退化性障碍。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、精神分裂症(schizophrenia)或肌萎缩侧索硬化症。

[0019] 此处提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，该方法包括：使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及检测所述人类滋养层干细胞中的至少一种转录
物或蛋白质的水平的改变。在上面所述的方法的一个实施方案中，与未接触所述化合物的
经分离的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中的至少一种转录物或蛋白质的
水平降低。在上面所述的方法的另一实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离
的人类滋养层干细胞相比，所述人类滋养层干细胞中的至少一种转录物或蛋白质的水平增
加。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是神经退化性障碍。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、精神分裂症或肌萎缩侧索硬化症。

[0020] 此处提供了针对在细胞中诱导改变的能力而筛选化合物的方法，该方法包括：使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触；以及检测对所述人类滋养层干细胞的分化
的诱导。

[0021] 此处提供了针对在细胞中诱导改变的能力而筛选化合物的方法，该方法包括：使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及检测对所述神经干细胞的分化的诱导。

[0022] 此处提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，该方法包括：使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及检测所述神经干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白
质的活性的改变。在上面所述的方法的一个实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的
经分离的神经干细胞相比，所述神经干细胞中的至少一种基因、转录物或蛋白质的活性降
低。在上面所述的方法的另一实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经
干细胞相比，所述神经干细胞中的至少一种基因、转录物或蛋白质的活性增加。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是神经退化性障碍。在特定的实施方案中，该疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、精神分裂症或肌萎缩侧索硬化症。

[0023] 此处提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法，该方法包括：使经分离的神经干细胞与所述化合物接触；以及检测所述神经干细胞中至少一种转录物或蛋白质的水
平的改变。在上面所述的方法的一个实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离
的神经干细胞相比，所述神经干细胞中的至少一种转录物或蛋白质的水平降低。在上面所
述的方法的另一实施方案中，与未接触所述化合物的可比较的经分离的神经干细胞相比，
所述神经干细胞中至少一种转录物或蛋白质的水平增加。在上面所述的方法的另一实施方
案中，该疾病是神经退化性障碍。在上面所述的方法的另一实施方案中，该疾病是帕金森氏症、阿尔兹海默症、精神分裂症或肌萎缩侧索硬化症。

[0024] 此处所提供的一个实施方案描述了一种治疗有此需要的哺乳动物中的神经障碍(neurological disorder)的方法，其包括：将至少一神经干细胞施用至所述哺乳动物，其中该细胞是经免疫豁免的。在另一实施方案中，所述哺乳动物是小鼠、大鼠、猪、犬、猴、猩猩或人猿。在另一实施方案中，所述哺乳动物是人类。

[0025] 在一个实施方案中，所述有此需要的哺乳动物具有一种或多种与神经障碍有关的症状。在另一实施方案中，所述一种或多种症状选自于由下列所构成的群组：僵
硬、运动失能症、平衡障碍、震颤(tremor)、步态障碍(gait disorder)、不良性步态
(maldispositional gait)、痴呆(dementia)、过度肿胀(excessive swelling)[水肿
(edema)]、肌无力(muscle weakness)、下肢萎缩(atrophy in the lower extremity)、
运动障碍(movement disorder)[舞蹈病(chorea)]、肌肉僵直(muscle rigidity)、
物理运动的减慢[运动迟缓(bradykinesia)]、物理运动的缺失(运动失能症)、健忘
(forgetfulness)、认知(智能)损伤[cognitive(intellectual)impairment]、辨识的缺
失(loss of recognition)[失识症(agnosia)]、受损的功能(诸如决策与计划)、单侧
面麻痹(hemifacial paralysis)、感觉缺失(sensory deficits)、麻木(numbness)、刺
痛感(tingling)、四肢的疼痛感觉异常(painful paresthesias in the extremities)、
虚弱(weakness)、脑神经麻痹(cranial nerve palsies)、语言障碍(difficulty
with speech)、眼球运动(eye movements)、视野缺损(visual field defects)、失明
(blindness)、出血(hemorrhage)、分泌物(exudates)、近端肌萎缩(proximal muscle
wasting)、运动困难症(dyskinesia)、四肢肌肉张力的异常(abnormality of tonus in
limb muscles)、肌强直减少(decrease in myotony)、动作失调(incoordination)、
在手指-手指测试或手指-鼻测试中错误的指示、辨距不良(dysmetria)、霍-斯二氏
现象(Holmes-Stewart phenomenon)、不完全的或完全的全身性麻痹(incomplete or
complete systemic paralysis)、视神经炎(optic neuritis)、视物显多症(multiple
vision)、眼球运动障碍(ocular motor disturbance)[诸如眼球震颤(nystagmus)]、
痉挛性麻痹(spastic paralysis)、痛苦的强直发作(painful tonic seizure)、莱尔米
特综合征(Lhermitte syndrome)、共济失调(ataxia)、语言困难(mogilalia)、膀胱直
肠障碍(vesicorectal disturbance)、起立性低血压(orthostatic hypotension)、运
动功能的减退(decrease in motor function)、尿床(bed wetting)、贫乏的言语表达
(poor verbalization)、不充足的睡眠型态(poor sleep patterns)、睡眠障碍(sleep
disturbance)、食欲障碍(appetite disturbance)、体重改变(change inweight)、
精神运动性激动或迟滞(psychomotor agitation or retardation)、减少的活力
(decreased energy)、无价值的感受或过度或不适当的内疚、思考或全神贯注的困难、反
复的死亡意图或者自杀的意念或企图、害怕(fearfulness)、焦虑(anxiety)、兴奋增盛
(irritability)、沉思的或强迫性沉思(brooding or obsessive rumination)、过度担
心身体健康(excessive concern with physical health)、恐慌发作(panic attacks)
以及恐惧症(phobias)。在另一实施方案中，所述神经障碍是帕金森氏症、阿尔兹海默
症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调(Friedreich’s ataxia)、路
易氏体症(Lewy body disease)、脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)、多系统
萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹(paralysis)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、脊
髓损伤、脑损伤(brain injuries)[例如，中风(stroke)]、脑神经障碍(cranial nerve
disorders)、周边感觉神经病变、癫痫(epilepsy)、朊病毒障碍(prion disorders)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、阿尔珀斯病(Alper's disease)、小脑/脊髓小脑退
化(cerebellar/spinocerebellar degeneration)、巴滕病(Batten disease)、皮质基底
核退化(corticobasal degeneration)、贝尔氏麻痹(Bell’s palsy)、格林-巴利综合征
(Guillain-Barre Syndrome)、皮克病(Pick's disease)以及自闭症(autism)。

[0026] 在一个实施方案中，此处还提供了一种治疗有此需要的哺乳动物中的神经障碍的方法，该方法包括：将至少一种神经干细胞施用至所述哺乳动物，其中该细胞是经免疫豁免的并且衍生自滋养层组织。在另一实施方案中，该经免疫豁免的细胞具有低水平的CD33表
达。在另一实施方案中，该经免疫豁免的细胞具有低水平的CD133表达。在另一实施方案
中，该神经元祖干细胞(neuronal progenitor stem cell)不会引起免疫反应。在另一实
施方案中，该神经元祖干细胞不会形成肿瘤。在另一实施方案中，该神经干细胞表达Cdx2、Nanog、巢蛋白、Oct-4、神经丝、NgN3、Neo-D、MAP-2、CD133、RARβ、RXRα、RXRβ、CRABP-2、CRBP-1、RALDH-2或RALDH-3中的一种或多种的转录物。

[0027] 在另一实施方案中，该方法进一步包括：将所述一种或多种神经干细胞施用至哺乳动物的脑中，其中该细胞分化成神经元。在另一实施方案中，所述施用包括注射
(injecting)或植入(implanting)。在另一实施方案中，所述神经元是多巴胺能神经元、谷氨酰胺能神经元、5-羟色胺能神经元或GABA能(γ-氨基丁酸)神经元。在另一实施方案
中，所述祖细胞(progenitor cell)在所述施用之前用诱导药物进行预诱导。

[0028] 在一个实施方案中，此处还提供了一种诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法，该方法包括：(a)使该干细胞与诱导药物接触；(b)在该干细胞中用该诱
导药物来调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质包括：无翅型MMTV整合位点
2B(Wnt2B)、卷曲蛋白家族受体6(Fzd6)、散乱蛋白3(dishevelled3，Dvl3)、晚期T细胞淋巴瘤常见重排蛋白1(FRAT1)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)、β-联
蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α11Gq类(Gαq/11)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β(Gβ)、类视黄醇X受体α(RXRα)、视黄酸受体β(RARβ)、谷氨酸受体1(GLuR1)、磷酸肌醇-3-激酶
(PI3K)、rac-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKt1)、rac-β丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKt2)、
rac-γ丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKt3)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、真核翻译起始
因子4E结合蛋白(EIF4EBP)、cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)、酪氨酸羟化酶(TH)、磷脂
酶Cβ(PLC-β)、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)、钙/钙调蛋白依赖型蛋白激酶II抑制剂
2(CaMKII)、真核翻译起始因子4B(EIF4B)、帕金蛋白(parkin)、α-突触核蛋白(SNCA)、微管蛋白(tubulin)、钙依赖磷酸酶(calcineurin)、脑衰蛋白反应调节蛋白2(CRMP-2)、活化的T细胞的核因子(NFAT1)、输入蛋白(importin)、淋巴样细胞增强子结合因子1(LEF1)、
垂体同源框2(Pitx2)、肌细胞增强因子2A(MEF2A)或E1A结合蛋白p300(EP300)；以及(c)
诱导或促进该干细胞分化成具有神经元特性的细胞。

[0029] 在一个实施方案中，该干细胞是哺乳动物滋养层干细胞。在另一实施方案中，该干细胞是哺乳动物胚胎干细胞。在另一实施方案中，该干细胞是哺乳动物经诱导的多能干细胞(mammalian induced pluripotent stem cell)。在另一实施方案中，其中该干细胞是内胚层、中胚层、外胚层或间质干细胞。在另一实施方案中，该干细胞来自小鼠、大鼠、人类、黑猩猩、大猩猩、犬、猪、山羊、海豚或牛。在另一实施方案中，该干细胞来自人类。在另一实施方案中，该干细胞是人类滋养层干细胞。在另一实施方案中，该具有神经元特性的细胞是神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞(dopamine producing cell)、多巴胺能神经元、单极神经元(unipolar neuron)、双极神经元(bipolar neuron)、多极神经元(multipolar neuron)、锥体细胞(pyramidal cell)、浦肯野细胞(Purkinje cell)以及前角细胞(anterior horn
cell)、篮状细胞(basket cell)、贝茨细胞(betz cell)、闰绍细胞(Renshaw cell)、颗粒细胞(granule cell)或中等棘细胞(medium spiny cell)。

[0030] 在一个实施方案中，该诱导药物包括：视黄酸(retinoic acid)、烟酰胺(nicotinamide)或 β- 巯基乙醇 (beta-mercaptoethanol)、维生素B12(vitamin
B12)、肝素(heparin)、腐胺(putrescine)、生物素(biotin)或Fe2+、丁基羟基苯甲
醚(butylated hydroxyanisole)、丙戊酸(valproic acid)、福司柯林(forskolin)、
5-氮胞苷(5-azacytidine)、吲哚美辛(indomethacin)、异丁基甲基黄嘌呤
(isobutylmethylxanthine)或胰岛素(insulin)。在另一实施方案中，该调节包括：增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。在另一实施方案中，该调节包括：增加该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。在另一个实施方案中，增加表达包括：增加编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或者增加由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中
的至少一种的量。在另一实施方案中，该调节包括：降低该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。在另一实施方案中，该调节包括：减少该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。
在另一实施方案中，减少表达包括：减少编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的
量，或者减少由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。

[0031] 此处还描述了诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法，其中该神经元特性包括多巴胺(dopamine)、谷氨酸N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体的亚基
(subunits of the glutamate NMDA receptor)、突触蛋白I(synapsin I)、α-钙离子通道标记(calcium channel marker)、生长相关蛋白43(GAP-43)、电压依赖的K+通道、电压依
赖的Ca+通道或电压依赖的Na+通道的表达。

[0032] 在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法包括：在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是
Wnt2B。在另一实施方案中，Wnt2B被活化。在另一实施方案中，Wnt2B被去活化。在另一
实施方案中，Wnt2B被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，Wnt2B被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，Wnt2B促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，Wnt2B促
进或诱导多巴胺表达。

[0033] 在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法包括：在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是
GSK3β。在另一实施方案中，GSK3β被活化。在另一实施方案中，GSK3β被去活化。在另一实施方案中，GSK3β被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，GSK3β被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，GSK3β促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，GSK3β调节微管装配(microtubule assembly)。

[0034] 在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法包括：在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是
CREB1。在另一实施方案中，CREB1被活化。在另一实施方案中，CREB1被去活化。在另一
实施方案中，CREB1被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，CREB1被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，CREB1促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，CREB1促
进或诱导多巴胺表达。

[0035] 在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法包括：在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是
CaMKII。在另一实施方案中，CaMKII被活化。在另一实施方案中，CaMKII被去活化。在另一实施方案中，CaMKII被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，CaMKII被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，CaMKII促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，CaMKII调节微管装配。

[0036] 在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有神经元特性的细胞的方法包括：在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是
MAPT。在另一实施方案中，MAPT被活化。在另一实施方案中，MAPT被去活化。在另一实施
方案中，MAPT被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，MAPT被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，MAPT促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，MAPT调节微管装
配。

[0037] 在一个实施方案中，此处提供了一种诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性(immunogenicity)的细胞的方法，该方法包括：(a)使该干细胞与诱导药物接触；(b)
在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一或多种蛋白质包括：Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRAT1、GSK3β、HDAC6、β-联蛋白、Gαq/11、Gβ、RXRα、RARβ、GLuR1、PI3K、AKt1、AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREB1、TH(酪氨酸羟化酶)、PLC-β、PIP2、CaMKII、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFAT1、输入蛋白、LEF1、Pitx2、MEF2A或EP300；以及(c)诱导或促进该干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞。

[0038] 在一个实施方案中，该干细胞是哺乳动物滋养层干细胞。在另一实施方案中，该干细胞是哺乳动物胚胎干细胞。在另一实施方案中，该干细胞是哺乳动物经诱导的多能干细胞。在另一实施方案中，其中该干细胞是内胚层、中胚层、外胚层或间质干细胞。在另一实施方案中，该干细胞来自小鼠、大鼠、人类、黑猩猩、大猩猩、犬、猪、山羊、海豚或牛。在另一实施方案中，该干细胞来自人类。在另一实施方案中，该干细胞是人类滋养层干细胞。

[0039] 在一个实施方案中，此处描述了诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法，其中该具有降低的免疫原性的细胞是神经干细胞(NSC)、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞或中等棘细胞。在另一实施方案中，该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应或者可以抑制免疫反应。在另一实施方案中，
该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应，或者可以通过T细胞、B细胞、巨噬细胞
(macrophage)、小神经胶质细胞(microglia cell)、肥大细胞(mast cell)或NK细胞来抑
制免疫反应。

[0040] 在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法包括：使该干细胞与诱导药物接触，其中该诱导药物包括视黄酸、烟酰胺或β-巯基乙
醇、维生素B12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羟基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素。

[0041] 在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法包括：在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该调节包括：增加该一
种或多种蛋白质中的至少一种的活性。在另一实施方案中，所述调节包括：增加该一种或
多种蛋白质中的至少一种的表达。在另一实施方案中，该增加表达包括：增加编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或者增加由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质
中的至少一种的量。在另一实施方案中，所述调节包括：降低该一种或多种蛋白质中的至少一种的活性。在另一实施方案中，所述调节包括：减少该一种或多种蛋白质中的至少一种的表达。在另一实施方案中，该减少表达包括：减少编码该一种或多种蛋白质中的至少一种的mRNA的量，或者减少由mRNA翻译而来的该一种或多种蛋白质中的至少一种的量。

[0042] 在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法进一步包括：诱导或促进该干细胞分化成具有神经元特性的细胞，其中该神经元特性包
括多巴胺、谷氨酸NMDA受体的亚基、突触蛋白I、α-钙离子通道标记、GAP-43、电压依赖的K+通道、电压依赖的Ca+通道或电压依赖的Na+通道的表达。

[0043] 在一个实施方案中，该诱导或促进干细胞分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法包括：在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一种或多种蛋白质是
NFAT。在另一实施方案中，NFAT被活化。在另一实施方案中，NFAT被去活化。在另一实施
方案中，NFAT被活化，然后被去活化。在另一实施方案中，NFAT被去活化，然后被活化。在另一实施方案中，NFAT促进该干细胞的分化或增殖。在另一实施方案中，NFAT调节微管装
配。

[0044] 此处还描述了诱导或促进人类滋养层干细胞分化成具有降低的免疫原性或者可以抑制免疫反应的tNSC(滋养层神经干细胞)的方法，该方法包括：(a)使该人类滋养层干
细胞与诱导药物接触；(b)在该干细胞中用该诱导药物调节一种或多种蛋白质，其中该一
种或多种蛋白质包括：Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRAT1、GSK3β、HDAC6、β-联蛋白、Gαq/11、Gβ、RXRα、RARβ、GLuR1、PI3K、AKt1、AKt2、AKt3、mTOR、ELF4EBP、CREB1、TH(酪氨酸羟化酶)、PLC-β、PIP2、CaMKII、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFAT1、输入蛋白、LEF1、Pitx2、MEF2A或EP300；以及(c)诱导或促进该人类滋养层干细胞分化成
tNSC。

[0045] 在一个实施方案中，该诱导或促进人类滋养层干细胞分化成具有降低的免疫原性或者可以抑制免疫反应的tNSC(滋养层神经干细胞)的方法包括：使该人类滋养层干细胞
与诱导药物接触，其中该诱导药物包括视黄酸、烟酰胺或β-巯基乙醇、维生素B12、肝素、腐胺、生物素或Fe2+、丁基羟基苯甲醚、丙戊酸、福司柯林、5-氮胞苷、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤或胰岛素。在另一实施方案中，该tNSC不会诱导免疫反应，或者可以通过免疫细
胞来抑制免疫反应。在另一实施方案中，该免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、肥大细胞或NK细胞。

[0046] 此处还描述了一种抑制肿瘤细胞的方法，其包括：使肿瘤细胞与化合物接触；调节肿瘤细胞中的芳基烃受体(AhR)；以及通过调节来抑制该肿瘤细胞。另外，此处描述了减少肿瘤细胞生长的方法，包括：使肿瘤细胞与治疗剂接触；调节肿瘤细胞中的AhR；以及通过调节来减少该肿瘤细胞的生长。在一个实施方案中，调节AhR包括抑制所述细胞中的AhR
蛋白质活性。在另一实施方案中，调节AhR包括抑制所述细胞中的AhR基因表达。在另一实
施方案中，肿瘤细胞被杀死。在另一实施方案中，肿瘤是肺、乳腺、结肠、脑、骨、肝、前列腺、胃、食管、皮肤或白血病肿瘤。在另一实施方案中，肿瘤是实体或液体肿瘤。在另一实施方案中，用AhR促效剂调节AhR。在另一实施方案中，用AhR拮抗剂调节AhR。在另一实施方
案中，用具有抗雌激素活性的化合物调节AhR。在另一实施方案中，用具有抗雄激素活性的化合物调节AhR。在另一实施方案中，该肿瘤细胞存在于哺乳动物中。在另一实施方案中，该肿瘤细胞存在于人类中。
援引并入

[0047] 本说明书中所提及的所有出版物和专利申请通过引用以同种程度并入本文，如同各个个别的出版物或专利申请被特定地以及个别地指明通过引用而并入。
附图说明

[0048] 本发明的新特征在随附的权利要求中被详细地描述。通过参考以下对在其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，可以获得对本文所述的特征
和优点的更好的理解，在附图中：

[0049] 图1显示hTS细胞中多能性(pluripotence)以及再生(renewal)的特性。(1a)通过RT-PCR分析所测量的，hTS细胞表达内细胞群(inner cell mass，ICM)与滋
养外胚层(trophectoderm)这两者的特定基因。(1b)说明如通过免疫细胞化学染色法
(immunocytochemical staining)所看见的特异性阶段胚胎抗原-1、-3及-4[specific
stage embryonic antigen(SSEA)-1,-3,and-4]的表达以及细胞内定位(暗化的斑点)。在
hTS细胞中(上区)，SSEA-1大部分在细胞质中表达(左上区)，SSEA-3在核中表达(中间
上面区)，而SSEA-4在细胞质以及膜这两者中表达(右上区)。这些SSEA-表达的细胞在组
织学上与异位绒毛细胞滋养层(ectopic villous cytotrophoblasts)相同(下区)。(1c)
通过末端限制片段Southern印迹分析[Terminal Restriction Fragment(TRF)Southern
blot analysis]所测量的、第3与第7代hTS细胞培养物的未改变的端粒(telomere)长度
(上区及下区)。(1d)文氏图(Venn diagram)说明在hTS(859基因)以及滋养层关联性胎
盘衍生的间质干细胞(placenta derived mesenchymal stem cells，PDMS cells)(2449基
因)中基因表达的微阵列分析(microarray analysis)。总数为2,140以及3,730的基因
在hTS细胞以及滋养层关联性PDMS细胞中表达(倍数变化＞2倍)。(1e)说明来自于对
不同浓度的白血病抑制因子(LIF)[即500、250、125U/ml；U：单位/ml，肌动蛋白(Actin)：
β-肌动蛋白作为对照样品]反应的转录因子表达的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析的
结果。LIF的撤除在hTS细胞中抑制Oct4以及Sox2，但是过度表达Nanog以及Cdx2。(1f)
LIF(125U/ml)促进hTS细胞中Nanog、Cdx2、Sox2以及Oct4的表达的流式细胞分析(左
区)。直方图显示在Nanog与Cdx2中负向剂量-依赖的方式(左区)以及在Oct4与Sox2
中正向剂量-依赖的方式(右区)。(1g)在妇女中输卵管(fallopian tubes)的不同节段
中LIF水平的生理学分布图，特别是输卵管中从壶腹(ampulla)朝向峡部(isthmus)的LIF
水平的生理学降低。Oct4、Nanog以及Sox2相对于Cdx2的相对比例各自在输卵管的3个
不同节段中显示剂量-依赖性(dose-dependency)。(1h)不同的siRNAs对于hTS细胞中
特定的转录物Nanog与Cdx2的效果通过RT-PCR(左边)以及流式细胞分析(右边)进行
分析，说明了在hTS细胞的多能性的维持方面Nanog与Cdx2之间的交互关系。数据表示3
次分析的平均值±SD。(1i)基因强度的直方图在hTS细胞中显示均质型，而在PDMS细胞
中显示二相的型态(biphasic pattern)。

[0050] 图2说明视黄酸(RA)诱导hTS细胞分化成为各种不同的表型的神经干细胞。(2a)各种不同的神经祖细胞亚型(neural progenitor subtypes)的分布，包括神
经胶质限制的前体细胞(glial restricted precursors，GRP)、神经元限制的前体细胞
(neuronal restricted precursors,NRP)、多能性神经干(multipotent neural stem,MNS)细胞、星形胶质细胞(astrocytes,AST)以及未定义的滋养层巨细胞(trophoblast giant
cells,TGC)。在随时间(例如，1、3、5及7天)的RA诱导期间以一致的比例所分布的hTS
细胞衍生的神经祖细胞亚型的频率，分别从第1至第4列显示。n:表示被计数的总细胞数。
(2b)在1天RA(10μM)诱导之前与之后hTS细胞的神经干细胞相关的基因的表达的RT-PCR
分析，包括由经RA(10μM)诱导的hTS细胞所生成的巢蛋白、Oct-4、神经丝、Ngn3、Neo-D、MAP-2以及CD133。(2c)如由流式细胞分析所观察到的，3天和5天RA-诱导的hTS细胞这
两者表达阳性的免疫反应性神经干细胞基因，包括神经丝蛋白、巢蛋白以及GFAP，它们在分布上维持相似的比例。(2d)该(神经干细胞)tNSCs所表达的免疫反应性巢蛋白、酪氨酸
羟化酶-2(TH-2)以及5-羟色胺(serotonin)的免疫细胞化学分析(Immunocytochemical
analysis)。(2e)通过流式细胞分析所进行的hTS细胞、tNSCs以及hES(人类胚胎干)细
胞中的免疫相关基因的比较性表达：HLA-ABC(MHC I型)在hTS细胞(99.4%)以及tNSCs
中高度表达但是在hES细胞中较低。HLA-DR(MHC II型)在该细胞中不表达。(2f)通过
流式细胞分析所进行的hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中的免疫相关基因的比较性表达：
在该细胞中CD14以及CD44的表达上未观察到差异。增殖因子(Proliferative factor)
CD73在hTS细胞以及tNSCs中高度表达，但是在hES细胞中阴性表达。(2g)通过流式细胞
分析所进行的hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中的免疫相关基因的比较性表达：跨膜受体
CD33(transmembrane receptor CD33)在hTS以及hES细胞中表达但未在tNSCs中表达。
CD45在所述细胞中不表达。(2h)通过流式细胞分析所进行的hTS细胞、tNSCs以及hES细胞
中的免疫相关基因的比较性表达：在hTS细胞、tNSCs以及hES中的间质干细胞标记CD105
的表达上没有发现强度上的差异，然而，相较于hTS细胞(93.6%)以及hES细胞(98.8%)，较
少的癌症干细胞标记CD133(11.8%)在tNSCs中表达。

[0051] 图3说明RA-诱导的基因表达。(3a)说明RA(10μM)在活化tNSCs中的c-Src/Stat3/Nanog途径上的效果。通过RT-PCR分析所测定的(n=3)，RA诱导c-Src的明显
的表达，波峰在第15分钟之时，然后维持在较低的水平。(3b)通过Western印迹分析
(western blot analysis)，显示RA在第30分钟、第1小时、第2小时以及第4小时之
时分别刺激RXRα、c-Src以及RARβ表达。RA诱导在30分钟内促进Gαq/11以及Gβ
这两者的表达，暗示G蛋白信号传递(G proteins signaling)的涉入。(3c)免疫沉淀
(Immunoprecipitation，IP)分析证明RXRα以及RARβ之间经RA诱导的直接结合；然而，
此交互作用被c-Src抑制剂PP1类似物阻断，显示c-Src涉及RXRα与RARβ的结合以形
成支架蛋白质复合体(scaffolding protein complex)。(3d)IP测定分析显示：RXRα具
有与Gαq/11的独立的结合交互作用而RARβ具有与Gβ的独立的结合交互作用。(3e)
说明在hTS中经RA诱导的c-Src的早期生成、Stat3在Tyr705位点明显的磷酸化以及
Nanog在第1小时之时的活化的Western印迹分析；对照样品使用β-肌动蛋白。(3f)根
据Western印迹分析，此c-Src蛋白质的快速生成接着诱导Stat3在Tyr705位点的磷酸
化以及Nanog的过度表达。根据Western印迹分析，c-Src抑制剂PP1类似物(4μM)抑制
RA-诱导的Stat3在Tyr705的磷酸化以及Nanog的表达。添加RA不能回复这种抑制作用。
(3g)说明RA刺激Stat3与Nanog启动子的结合交互作用的染色质免疫沉淀(chromatin
immunoprecipitation,ChIP)测定分析。输入：裂解产物，C：对照。

[0052] 图4说明双免疫金荧光透射电子显微术(double immunogold fluorescencetransmission electron microscopy，IEM)分析结果。显示了RA-诱导的在细胞质膜处小
的金粒子标记的RXRα(6μM)与大的金粒子标记的Gαq/11(20μM)之间的结合交互作用。
根据动态共焦免疫荧光显微术(dynamic confocal immunofluorescence microscopy)，经
免疫染色的RXRα以及Gαq/11在细胞质或核中主要呈现均质特征(图4，上区)。通过RA
处理5分钟，细胞溶质的RXRα强度在核周区域增加而核的强度减少(第1列)，显示在刺
激之后的细胞溶质转位(cytosolic translocation)。核的RXRα强度在第15分钟时变得
显著，而细胞溶质的强度减少。这些现象显示：核中活性的增加维持细胞中的稳定状态。在
30分钟内再次观察到明显的细胞溶质转位。另一方面，Gαq/11表达的区隔变化与RXRα
表达的区隔变化相似(第2列)。

[0053] 图5说明将GFP-标记的tNSCs(3×106)移植至帕金森氏症(PD)大鼠中的分析。(5a)经阿朴吗啡(apomorphine)诱导的旋转测试(rotation test)的分析；a组(深色阴
影的圆，n=4)，它是关于接受tNSCs移植的PD大鼠，显示从植入后的第3周至第12周在对
侧旋转上显著的减少；b组(浅色阴影的圆，n=4)，它是关于接受5天RA处理的hTS细胞的
PD大鼠，显示在植入后的第6周时最初的显著改善，但是此改善在经过第12周期间逐渐减
少；以及c组(三角形，n=4)，它是关于作为对照组的未经处理的PD大鼠，显示没有改善。
通过重复测量ANOVA所进行的统计学分析：p值=0.001，以及在重复测量ANOVA之后的2组
之间的LSD事后比较(LSD post hoc comparisons)：在第6周时p=0.037(a组对c组)以
及p=0.008(b组对c组)；在第9周时p=0.019(a组对c组)；在第12周时p=0.005(a组
对c组)以及p=0.018(a组对b组)。*表示p＜0.05。(5b)说明在植入后的第18周时
在a组的损伤的纹状体(lesioned striatum)中的TH-阳性免疫组织化学染色(上区)；
免疫荧光显微镜分析显示：免疫荧光的GFP-标记的tNSCs仍然存留在损伤的纹状体中，在
注射部位处具有斑点形成(下区)。(5c)说明在植入后的第18周时在a组的损伤的黑质
致密(substantia nigra compacta，SNC)中所再生的TH-阳性神经元(上区)；显示了末
端区域的放大(左下区)，比例尺：100μM；免疫荧光显微镜分析显示：免疫荧光的GFP-标
记的tNSCs呈散射分布(scattered distribution)存留(右下区，箭头表示GFP-标记的
tNSCs)。(5d)说明在植入后的第18周时b组的免疫组织化学染色：没有TH阳性细胞在左
边损伤的纹状体(str，上区)或丘脑下核(subthalamic nucleus)(stn，下区)中被发现。
(5e)说明在植入后的第18周时c组的免疫组织化学染色：没有TH染色的细胞在左边损伤
的纹状体(str，上区)或损伤的SNC(下区)中被发现；箭头表示植入针轨迹。

[0054] 图6说明在一个注射部位将tNSCs(1.5×106)移植到“老年(aged)”PD大鼠(n=16；体重，630-490gm)的损伤的纹状体中的结果。行为评估(Behavioral assessments)在植入
后每3周进行分析。结果显示：从植入后的第3周至第12周所评估的行为障碍(behavioral
impairments)有显著的改善。Student t检验(Student t test)：*p＜0.05作为统计学
显著性。**p＜0.01以及***p＜0.001。(6a)阿朴吗啡诱导的旋转测试的分析证明：与
作为对照组的未经处理的“老年”PD大鼠(i组；n=8，未经填充的圆)相比，接受tNSCs植入的老年PD大鼠(ii组，n=8，经填充的圆)从第3周至第12周显著地改善了旋转数。(6b)
说明有关运动失能症(秒)的行为评估结果。(6c)说明有关步伐长度(step length)(mm)
的行为评估结果。(6d)说明有关跨步长度(stride length)(mm)的行为评估结果。(6e)
说明有关步行速度(walking speed)(cm/秒)的行为评估结果。(6f)说明有关支撑的基
础(mm)的行为评估结果。(6g)说明针对行为评估所分析的步态：A与正常大鼠相关，B与
在细胞移植之前的偏侧帕金森氏症大鼠(hemiparkinsonian rats)相关，且C与在细胞移
植之后的偏侧帕金森氏症大鼠相关。

[0055] 图7说明在适当的诱导之后，hTS细胞表达全部3种原胚层(primary germlayers)的组分，包括外胚层(ectoderm)、中胚层(mesoderm)以及内胚层(endoderm)；各
个区的左列是关于在诱导之前的基因表达；各个区的右列是关于在诱导之后的基因表达。

[0056] 图8说明流式细胞分析结果，显示hTS细胞表达间质干细胞标记[CD90、CD44、CK7、波形蛋白(Vimentin)以及神经丝]并且对于造血干细胞标记(hematopoietic stem cellmarkers)[CD34、CD45、α6-整合蛋白(α6-integrin)、E-钙黏素(E-cadherin)以及L-选
择素(L-selectin)]是阴性的。

[0057] 图9显示在适当的诱导下，hTS细胞会被分化成为各种不同的特定的细胞表型(cell phenotypes)。

[0058] 图10说明将hTS细胞皮下移植至雄性严重联合免疫缺陷(severe combinedimmune deficiency，SCID)小鼠中在植入后的第6-8周仅造成与类黏液样奇异型细胞
(myxoid-like bizarre cells)的轻微嵌合反应(minor chimeric reaction)的组织学分
析(histological analysis)(经填充的、黑色的箭头标示奇异型细胞；未经填充的箭头标
示肌纤维；“NT”标示针轨迹)。

[0059] 图11染色体分析显示：hTS细胞不会改变核型的型态(46，XY)。为了检查世代中的细胞寿命，根据Southern印迹分析，在第3与第7代培养物之间未观察到端粒长度的显
著缩短(图1c)。

[0060] 图12说明用于细胞分化的某些培养基。

[0061] 图13说明用于RT-PCR的PCR引物。

[0062] 图14说明AhR在细胞质膜处作为信号分子的分析，包括通过Huh-7细胞中BBP(1μM)的导入，在细胞质膜处经转染的pGFP-C1-AhR的活性。(14a)所显示的图像是通
过TIRF显微镜分析所测量的GFP-标记的AhR的相对强度的表达。圆以及箭头表示随着时
间的推移所测量的区域：刺激前(第1区)、波峰处(第2区)以及静止时(第3区)。图
(第4区)显示在大约第2分钟时发现峰值，以箭头表示添加BBP的时间。(14b)对BBP有
反应的memAhR的定量RT-PCR分析显示在第5分钟时快速的上升，在第15分钟时达到波
峰，继而在第2小时之时逐渐的下降至较低的平台水平。误差条(Error bars)表示标准偏
差(standard deviation)。*，p＜0.05，t-检验(n=3)。(14c)Western印迹分析的分析显
示：BBP在第15分钟时促进AhR上升继而在第30分钟时轻微的下降并在第60分钟时再上
升。(14d)Western印迹分析的分析显示：BBP在第30分钟时诱导Gαq/11以及Gβ这两者
的生成。(14e)免疫沉淀(IP)分析显示在BBP刺激之后AhR与Gαq/11之间的交互作用，字
母C代表对照。(14f)通过Western印迹分析所测量的，由siRNA所造成的AhR的敲除证
明：BBP抑制Huh-7细胞中AhR与Gαq/11这两者的表达，字母S代表作为阴性对照的混杂的
siRNA。

[0063] 图15说明动态免疫荧光成像的结果。(15a)说明未经处理的对照细胞的免疫染色；观察到AhR以及Gαq/11主要在Huh-7细胞的核中表达并且微弱地在细胞溶质中表达；
带状比例尺(bar scale)：50μM。(15b)用BBP(1μM)处理5以及15分钟的细胞各自显示
AhR与Gαq/11这两者从核至细胞溶质隔室(cytosolic compartment)的转位。经免疫染色
的Gαq/11在第15分钟时特异性地聚集在细胞膜处。(15c)用AhRsiRNA转染的细胞强烈地
降低细胞溶质与核的隔室这两者中的AhR强度(上区)，而用混杂的siRNA转染不会改变
免疫染色强度(下区)。(15d)BBP在15分钟之后回复具有预转染的AhR siRNA的细胞中
AhR与Gαq/11这两者的强度。

[0064] 图16说明双免疫金透射电子显微镜分析的结果。(16a)免疫金染色的Gαq/11(白色箭头)会在作为对照的Huh-7细胞中的细胞膜处作为单一的或双重的或三重的实体存
在。(16b)在第20分钟时，经BBP(1μM)处理的细胞显示免疫金标记的AhR粒子(呈6nm
的大小，黑色箭头)与免疫金标记的Gαq/11粒子(呈20nm的大小，白色箭头)的交互作用，
其形成复合体，在细胞膜处作为不同的实体出现：单体的(monomeric)(未显示)、二聚体的(dimeric)(未显示)、三聚体的(trimeric)(左边)以及聚合的(polymeric)(右边)实体。
(16c)在细胞膜处所出现的AhR以及Gαq/11的三聚复合体。CM：细胞膜，N：核，以及带状比例尺：500nm。

[0065] 图17说明“拉与推”机制以及生化过程。(17a)说明在Huh-7细胞中对BBP处理有反应的Gαq/11信号级联(signaling cascades)的测量。Western印迹分析显示：
BBP(1μM)在第30分钟时触发Gαq/11与Gβ这两者的生成。经活化的Gαq/11导致PIP2减
少，造成IP3R水平增加。(17b)说明对免疫荧光的Fluo-4-标记的钙(immunofluorescent
Fluo-4-labled calcium)在Huh-7细胞中的反应性的分析。显示的是未经标记的细胞
(左上区)以及Fluo-4-标记的钙(绿色，左下区)。还显示了在BBP(1μM)刺激(箭
头)之后在BSS培养基(中上区)以及无钙培养基(中下区)中的相对钙水平的变化。
培养在具有预处理的IP3R抑制剂2-APB(100μM，1小时)的无钙培养基中的细胞(右上
区)显示在钙密集上的减少(右上区)，它以剂量反应方式(dose-response manner)发生
(y=-0.4x+2.5,R2=0.94)(右下区)。误差条表示平均值的标准偏差(n=5)。(17c)Western
印迹分析的结果指示：用2-APB(30μM，1小时)预处理抑制了经BBP诱导的COX-2表达，字
2+
母C表示对照。(17d)说明Western印迹分析的结果，显示BBP(1μM)经由AhR/Ca /ERK/
COX-2途径诱导COX-2的过度生产。ERK1/2在BBP处理之后第15分钟时被磷酸化并在第30
分钟时被去磷酸化。(17e)说明Western印迹分析的结果，显示用化学品PD98059(20μM，
1小时，Calciochem)预处理抑制了经BBP诱导的COX-2表达，字母C表示对照。(17f)说
明用BBP(1μM)进行处理显著地抑制了ARNT水平(隔夜所测量的)。数据表示为平均值
±SD，n=3，且*：Student t检验，p＜0.01。(17g)说明“拉与推”机制的示意图，该机制构成经由GPCRs-G蛋白信号传递的配体诱导的非基因组AhR信号传递途径的基础。

[0066] 图18说明LIF对Nanog表达的效果。(18a)说明LIF促进Nanog的表达。左区说明：根据hTS细胞中的流式细胞分析，Nanog表达是以负向剂量依赖的方式而显著地被抑
制。数据表示为3次分析的平均值±SD。*p＜0.01(Student t检验，n=3)。右区说明当
hTS细胞与RA(10μM)预孵育过夜接着用不同水平(即，各125、250以及500U/mL)的LIF
处理1天时的相对Nanog表达。(18b)说明根据流式细胞分析，RA诱导(1天孵育，10μM)
在hTS细胞中刺激Nanog以及Oct4的表达，但不刺激Cdx2以及Sox2的表达。

[0067] 图19说明在老年的PD大鼠中对行为改善的评估。(19a)说明在植入后第12周时对一系列的脑部切片(30μm)上的TH+神经元进行的免疫组织化学显示：大量重新再生的
TH-阳性神经元出现在损伤的黑质纹状体途径中(左边部分)。在SNC区域中，TH-阳性神
经元呈现具有从细胞体中突起的多重外生(multiple outgrowths)以与宿主组织一起形成
神经元回路(neuronal circuitries)的特征。在一只大鼠中的再生的多巴胺能神经元的
数目占相对的正常侧的28.2%(n=5)。(19b)与正常侧相比，大鼠的损伤的SNC中多巴胺能
神经元的数目再生至28.2%。

[0068] 图20：(20a)说明通过RT-PCR测得的ICM与滋养外胚层(TE)这两者的特定基因的表达；(20b)说明用F1B-GFP质粒构建体的DNA混合物转染hTS细胞以产生超过95%的
成功率；(20c)说明经RA诱导的eIF4B的生成的时程；(20d)说明使用eIF4B抑制了c-Src
的活化；(20e)说明IP分析显示：活性的c-Src直接结合至Stat3(信号转导及转录激活蛋
白)；(20f)说明c-Src siRNA抑制Stat3的表达；(20g)说明Stat3siRNA抑制Nanog的表
达；以及(20h)说明在hTS细胞中经由亚细胞c-Src mRNA定位的RA-诱导的c-Src/Stat3/
Nanog途径的方案。

[0069] 图21说明Gαq/11信号传递途径的活化：(21a)说明通过Western印迹法，在RA处理(10μM)之后Gαq/11途径相关的组分随着时间的表达；(21b)说明在被培养在无
钙培养基中并且在RA处理之前20分钟用配于BSS缓冲液中的Fluo4(1μM)预装填的
hTS细胞中的实时活细胞成像显微镜分析(real-time live cell imaging microscopy)
(Cell-Rsystem，Olympus，Tokyo)。(a)RA-诱导的细胞内钙的消耗通过以SOCE型态添加
CaCl2(2mM)而被回复。(b)RA-诱导的细胞内钙水平被2-APB(10分钟)以显著的剂量依赖
2
的方式抑制(R=0.8984)。(c)在ER钙的消耗之后，KCl(60mM)能够激活L-型钙离子通道
(L-type calcium channels)。(d)在ER钙消耗之后，KCl-依赖的L-型钙离子通道被抑
制剂硝苯地平(nifedipine)(5μM)阻断。n：被计数的总细胞；(21c)说明CaMKII直接与
CREB1以及eIF4B交互作用；(21d)说明通过Western印迹法，eIF4B siRNA抑制CaMKII、
钙依赖磷酸酶以及eIF4B的表达；(21e)说明根据Western印迹法，KN93(1μM，2小时)抑
制eIF4B表达；(21f)说明帕金蛋白直接与CaMKII以及MAPT交互作用；(21g)说明SNCA直
接与MAPT交互作用；(21h)说明MAPT与GSK3β以及α-微管蛋白(α-tubulin)交互作
用；(21i)说明根据Western印迹法，2-APB抑制钙依赖磷酸酶、NFAT1以及MEF2A的表达；
(21j)说明输入蛋白与NFAT1之间的直接交互作用；(21k)说明根据分离分析(fractional
assay)，RA刺激NFAT1核转位(nuclear translocation)。核纤层蛋白A/C：核的标记以及
α-微管蛋白：细胞质的标记；(21l)说明Akt2直接与GSK3β交互作用；(21m)说明在动态
变化中使用不同抗体所显示的，用RA处理4小时(空白的柱)和24小时(黑色的柱)的
细胞中GSK3β表达的流式分析(flow analysis)。数据显示平均值±SD，n=3；(21n)说明
流式细胞分析显示Akt2siRNA抑制RA-诱导的GSK3β表达。

[0070] 图22说明转录复合体(transcriptional complex)的形成：(22a)说明β-联蛋白与LEF1之间(上面)以及LEF1与Pitx2之间的交互作用；(22b)说明通过RA处理(4小
时)，LEF1转录基因Pitx2而不转录基因Pitx3；(22c)说明根据Western印迹法，MEF2A直
接与NFAT1、MEF2A、Pitx2、SNCA以及EP300交互作用；(22d)说明根据Western印迹法，RA诱导MEF2A、EP300以及Pitx2随着时间的生成；(22e)说明根据Western印迹法，NFAT1siRNA
抑制MEF2A的表达；(22f)说明CREB1靶向在MEF2A基因的启动子处；(22g)说明MEF2A转
录基因SNCA(上面)、TH(中间)以及MEF2A本身(下面)；(22h)说明根据Western印迹
法，MEF2A siRNA抑制EP300、Pitx2以及MEF2A的表达；(22i)说明EP300靶向在HDAC6(上
面)以及TH(下面)基因的启动子处；(22j)说明通过Western印迹法，在第4小时以及第
24小时时间点各种不同的分子活性的鉴定。缩写，IP：免疫沉淀分析；ChIP：染色质免疫沉淀分析。

[0071] 图23说明在hTS细胞中RA-诱导的神经生成(neurogenesis)的调节网路示意图(上区)。2种mRNA翻译的机制：帽盖依赖的(cap-dependent)(左下)和不依赖帽盖的
(cap-independent)(右下)。灰色的线：时空信号传递途径；黑色的线：转录途径；双向的箭头：分子连接至其它途径。

[0072] 图24说明RA信号传递促进Wnt2B/Fzd6/β-联蛋白途径：(24a)说明流式细胞分析显示：通过经预处理的Wnt2B siRNA的抑制作用过夜所证明，RA(10μM)显著地诱导
Wnt2B、Dvl3以及FRAT1的活化但是抑制GSK3β。数据显示平均值±SD；n=3；(24b)说明由
RART-PCR所造成的增加的Fzd6mRNA表达。数据显示平均值±SD；n=3，*：通过Student检
验p＜0.05；(24c)说明通过Western印迹法，RA诱导β-联蛋白以及HDAC6的表达随着时
间的改变；(24d)说明IP分析显示：与RA过夜孵育所造成的HDAC6与β-联蛋白之间的物
理交互作用；(24e)说明在过夜孵育之后，根据分离测定(fractionation assay)，RA诱导
β-联蛋白的核/细胞质转位。核纤层蛋白以及α-微管蛋白分别作为核的以及细胞质的
标记；(24f)说明共焦免疫荧光显微术显示：RA-诱导的β-联蛋白以及HDAC6的动态变化
显示β-联蛋白在第30分钟时的核转位，它被HDAC6siRNA抑制；(24g)说明细状的β-联
蛋白在RA处理的第5分钟出现在突触区域中(箭头)。

[0073] 图25说明共焦免疫荧光显微镜分析。在对抗HDAC6的siRNA的存在下，β-联蛋白的核定位被阻断。

[0074] 图26说明在细胞膜处的分子事件：(26a)说明根据Western印迹法，RA诱导Gαq/11、Gβ、RXRα以及RARβ随着时间的生成。β-肌动蛋白作为对照；(26b)说明实时
共焦免疫荧光显微镜分析，显示代表性GFP标记的RXRα在RA刺激之后的第0、4.5及13
分钟从核周区域朝向细胞膜(箭头)的移动。在核中没有RXRα是可见的。正常相差(左
上)和荧光图像(右上)。条(Bar)表示30μM；(26c)说明相对定量的GFP标记的RXRα
在时程上从核(N)至细胞膜(M)的强度上的动态移动与变化。正常相差以及荧光成像显示
在右上处；(26d)说明代表性成像显示RA在第5分钟时所造成的RXRα以及Gαq/11在细胞
膜处的共表达；(26e)说明在RA处理20分钟之后在细胞膜处所观察到的双免疫金标记的
RXRα(6μM；黑色箭头)以及Gαq/11(20μM；白色箭头)。N：核；(26f)说明RXRαsiRNA抑制RA-诱导的Gαq/11与RXRα的交互作用(24小时)；(26g)说明RARβsiRNA抑制RA-诱导的
Gβ与RARβ的交互作用以及Gβ与PI3K的交互作用(24小时)。IP：免疫沉淀分析；IgG：
阴性对照；C：阳性对照；(26h)说明IP测定分析显示：选择性c-Src抑制剂PP1类似物能够
防止RXRα-RARβ异型二聚物(heterodimer)的形成；(26i)说明通过双免疫金透射电子
显微术所观察到的RA-诱导的金粒子标记的RXRα在内质网(ER)中的锚定(anchorage)。

[0075] 图27说明通过RT-PCR，RA刺激典型Wnt2B途径；在hTS细胞中处理(10μM)过夜之后，RA诱导Wnt2B信号传递途径的组分的表达，显示统计学上显著的结果；在过夜处理之后，Wnt2B siRNA抑制RA-诱导的Wnt2B途径的组分。

[0076] 图28说明RXRα以及RARβ的局部合成：(28a)说明通过RT-PCR，RA(10μM)在第15分钟时快速地诱导RXRαmRNA与RARβmRNA这两者的短暂上升。数据显示平均值
±SD，n=3，t检验*：p＜0.05；(28b)说明根据Western印迹法，RA诱导PI3K以及Akt异
构型(isoforms)随着时间的表达；(28c)说明根据流式细胞术，PI3K抑制剂124005抑制
RA-诱导的Akt异构型(24小时)。数据显示平均值±SD，n=3；(28d)说明根据Western印
迹法，Akt3与mTOR交互作用，但是被Akt3siRNA抑制；(28e)说明根据Western印迹法，RA
诱导mTOR的暂时性表达；(28f)说明Akt3siRNA抑制RA-诱导的mTOR的磷酸化；(28g)说
明mTOR直接与4EBP1交互作用(4小时)；(28h)说明通过Western印迹法，对使用或未使
用mTOR siRNA或4EBP1siRNA预孵育的、用RA处理(4小时)的hTS细胞进行mTOR、4EBP1、
eIF4E以及eIF4B的表达分析；(28i)说明根据Western印迹法，eIF4E siRNA抑制RA-诱
导的RXRα与Gαq/11之间(上面)以及RARβ与Gβ之间(下面)的交互作用(4小时)。

[0077] 图29：(29a)说明通过RT-PCR，PI3K抑制剂在hTS细胞中过夜处理之后抑制RA-诱导的Akt异构型Akt1、2以及3的表达；(29b)通过RT-PCR，Akt2抑制剂抑制β-联蛋白
mRNA的表达；(29c)根据流式细胞术，Akt3siRNA抑制mTOR的表达。

[0078] 图30说明CREB1促进TH的转录：(30a)说明根据Western印迹法，CREB1直接与Akt1以及β-联蛋白交互作用；(30b)说明Akt1siRNA抑制CREB1的表达。β-肌动蛋白：
对照；(30c)说明CREB1靶向在TH基因的启动子处；(30d)说明根据Western印迹法，CREB1
siRNA抑制TH的表达；(30e)说明免疫荧光组织分析显示在tNSCs植入PD大鼠脑后的第12
周在治疗的SNC侧中的DA神经元(白色箭头)中TH-FITC(蓝色)以及TH-Cy-3(红色)
的共表达(右区)。在正常侧中(左上)以及在治疗侧中(左下)的经放大的DA神经元。
在核中发现阳性CERB1染色；(30f)说明直方图显示DA神经元中所表达的TH以及CREB1在
正常(左边；n=86)以及治疗侧(右边；n=114)中的相对平均强度。误差条：平均值±SD；
n：被计数的总细胞；p＜0.05：统计学上显著的。

[0079] 图31说明免疫组织荧光分析(immunohistofluoresence analysis)：对照组的SNC中TH(+)以及NeuN(+)运动神经元(motor neurons)(箭头)(左上)。在6-OHDA损伤
之后第1周减少的TH(+)(箭头)(右上)。在损伤后的第6周随着TH-阳性的神经末梢的
扰乱，在TH(+)神经元上明显的减少(绿色颗粒)，以及各种不同的退化性空腔形成(红色
爆炸性圆)(左下)。在移植之后，在退化性空腔的壁处(红色爆炸性圆；插图)的TH(+)神
经元(箭头)带有突出至空腔(右下)中的TH(+)神经末梢(绿色)。

[0080] 图32说明具有较少免疫反应的TH(+)以及GFAP(+)细胞的体内(in vivo)再生：(32a)说明在损伤后的第1与第6周时TH(+)细胞的数目分别减少为在损伤的SNC(深
灰色)中的48%和13%以及在损伤的纹状体(浅灰色)中的78%和4%。在移植之后，
TH(+)细胞在损伤的SNC以及纹状体中分别重新成长至67%以及73%(右区)。数据通过
Tissuequest2.0 软件(TissueGnostics Gmbh,Vienna,Austria)进行分析；(32b)说明在损
伤的SNC(下区)中(显示放大图(左上，插图a))与无损伤侧(右上，插图b)相比的多巴
胺能神经元的再生；(32c)说明相较于无损伤侧，在第12周时tNSCs的移植在损伤的SNC中
的TH阳性神经元(箭头)上产生78.4±8.3%(平均值±SEM；n=4)的复原率；(32d)说明在
损伤后的第6周时在损伤的纹状体中TH-FITC(+)以及GFAP-Cy-3(+)Wilson束(Wilson’s
pencils)(空白箭头)的退化(左列)。在植入后的第12周(右列)，数个GFAP(+)细胞
(箭头)出现在重新建立的Wilson束(空白箭头)的细纤维(fine fibers)内；(32e)说
明免疫组织荧光成像分析，在由细胞大小(8-10μm的直径)的位置及其对应的GFAP-Cy-3
强度所决定的门(gate)(左边的散布图)中的细胞被计数。门(红色散布图)：被计数的
神经胶质细胞(glial cells)；黑色散布图：排除具有异常大小的细胞；蓝色散布图：具有异常GFAP强度的细胞。在纹状体中，相较于无损伤侧，在损伤侧中的GFAP(+)细胞在处理
之前是65.5%，而在细胞治疗之后变成93.9%(右边的区)；(32f)说明hTS细胞植入至SCID
小鼠中仅引起轻微免疫反应并且未观察到肿瘤形成(tumorigenesis)。类黏液样奇异型细
胞(黑色箭头)，肌纤维(空白箭头)以及针轨迹(NT)。

[0081] 图33说明通过在慢性PD大鼠中的免疫组织荧光散布图所测量的，利用TH-FITC与NeuN-Cy-3之间的决定系数(coefficient of determination)，在细胞治疗之前以及之
2
后SNC中的TH(+)细胞的鉴定。(33左上)说明正常的SNC：R=0.72；(33右上)说明通过
2
6-OHDA损伤所造成的SNC(1周)：R=0.77；(33左下)说明通过6-OHDA损伤所造成的SNC(6
2 2
周)：R=0.25；(33右下)在tNSCs移植之后的SNC(12周)：R=0.66。被显示的结果代表2
只大鼠的平均值。

具体实施方式

[0082] 神经组织衍生的干细胞(Neural tissue-derived stem cells)、衍生自多能胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)的表型特化的祖细胞(phenotype-specified
progenitor cells)以及衍生自各种不同的经转分化的非神经干细胞(transdifferentiated non-neural stem cells)的神经细胞已全部在针对它们生成神经
元以及神经胶质(glia)的能力的临床前研究中得到探讨，并且神经干细胞在临床试验中
的用途已被描述。虽然胚胎干(ES)细胞已显示作为细胞治疗剂(cell therapeutics)的
可能性(Bjorklund,L.M.等人.Proc.Nat.Acad.Sci.2002,99,2344-49)，但使用所述治疗
是受限的并且与伦理关怀(ethical concerns)有关联。

[0083] 干细胞具有自我更新(self-renewal)以及生成定向祖细胞(committedprogenitors)( 包括神经干细胞 ) 的能力 (Reubinoff B.E. 等人 ,Nat.
Biotech.2001,19,1134-1140)。

[0084] 此处提供了衍生自滋养层组织的经分离的神经干细胞。此处进一步提供了在细胞培养中是稳健的且存活数代并且还具有多能性(pluripotency)以及免疫豁免(immune
privilege)的特性的经分离的神经干细胞(tNSCs)。在此处所描述的一个实施方案中，描
述了一种用于从衍生自人类滋养层干(hTS)细胞的tNSCs诱导多巴胺能神经元的方法。此
处进一步提供了容许经移植的tNSCs能存活并且生长成为多巴胺能神经元的方法，以及用
于评估受损的行为的复原以达到与目前的治疗方案相比具有降低的变异性的结果的方法。

[0085] 此处还提供了衍生自hTS细胞的经分离的神经干细胞，该hTS细胞没有使用小鼠胚胎饲养细胞(mouse embryonic feeder cells)进行培养，以防止可疑的污染。此处提供
了用于有效率地且可再现地生成hTS细胞衍生的tNSCs的方法，该方法导致产生均匀混合
的族群的子集合，可区别于其它用于从其它来源的细胞诱导多巴胺能神经元的方法。此处
提供了用于将多巴胺能tNSCs以细胞悬浮液(cell suspension)移植至脑内的方法，从而
防止与组织移植物有关联的不均匀的生长。

[0086] 此处提供了用诱导药物来调节干细胞以分化成具有神经元特性的细胞的方法。在一个实施方案中，该诱导药物调节该干细胞中的一种或多种蛋白质的表达或活性。在一个
实施方案中，该一种或多种蛋白质中的一种是Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRAT1、GSK3β、HDAC6、β-联蛋白、Gαq/11、Gβ、RXRα、RARβ、GLuR1、PI3K、AKt1、AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREB1、TH(酪氨酸羟化酶)、PLC-β、PIP2、CaMKII、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFAT1、输入蛋白、LEF1、Pitx2、MEF2A或EP300。在一个实施方案中，该干细胞可以是滋养层、胚胎的或经诱导的祖干细胞。在一个实施方案中，该具有神经元特性的细胞是NSC、多巴胺生成细胞、多巴胺能神经元、单极神经元、双极神经元、多极神经元、锥体细胞、浦肯野细胞以及前角细胞、篮状细胞、贝茨细胞、闰绍细胞、颗粒细胞或中等棘细胞。

[0087] 此处还提供了用诱导药物来调节干细胞以分化成具有降低的免疫原性的细胞的方法。在一个实施方案中，该诱导药物调节该干细胞中的一种或多种蛋白质的表达或活性。
在一个实施方案中，该一种或多种蛋白质中的一种是Wnt2B、Fzd6、Dvl3、FRAT1、GSK3β、HDAC6、β-联蛋白、Gαq/11、Gβ、RXRα、RARβ、GLuR1、PI3K、AKt1、AKt2、AKt3、mTOR、EIF4EBP、CREB1、TH(酪氨酸羟化酶)、PLC-β、PIP2、CaMKII、EIF4B、帕金蛋白、SNCA、微管蛋白、钙依赖磷酸酶、CRMP-2、NFAT1、输入蛋白、LEF1、Pitx2、MEF2A或EP300。在一个实施方案中，该干细胞可以是滋养层、胚胎的或经诱导的祖干细胞。在一个实施方案中，该具有降低的免疫原性的细胞不会诱导免疫反应，或者可以通过T细胞、B细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、肥大细胞或自然杀伤(NK)细胞来抑制免疫反应。
人类滋养层干细胞(hTS细胞)

[0088] 人类输卵管是妇女中受精的部位以及异位妊娠(ectopic pregnancies)的常见部位，其中有数种生物事件发生，诸如内细胞群(ICM)与滋养外胚层之间的区别化以
及具有主要的表观遗传改变(epigenetic changes)的从全能性(totipotency)转换
至多能性。这些观察提供有关输卵管在着床前的阶段作为用于获得囊胚关联性干细胞
(blastocyst-associated stem cells)的栖位储存处(niche reservoir)的支持。异位妊
娠在工业化国家中占全部怀孕的1%至2%，并且在发展中国家中高更多。鉴于在人类胚胎干
细胞(hES细胞)以及胎脑组织(fetal brain tissue)的可利用性上的不足，此处描述了
来源于异位妊娠的人类滋养层细胞(hTS细胞)作为针对几乎不可利用的hES细胞的替代
物以供生成祖细胞的用途。

[0089] 在一个实施方案中，来源于异位妊娠的人类滋养层细胞不涉及人类胚胎的破坏。在另一实施方案中，来源于异位妊娠的人类滋养层细胞不涉及活的人类胚胎的破坏。在另
一实施方案中，该人类滋养层细胞衍生自与不存活的异位妊娠有关联的滋养层组织。在另
一实施方案中，该异位妊娠不能被挽救。在另一实施方案中，该异位妊娠将不会导致产生活的人类胚胎。在另一实施方案中，该异位妊娠威胁母亲的生命。在另一实施方案中，该异位妊娠是输卵管的(tubal)、腹部的(abdominal)、卵巢的(ovarian)或子宫颈的(cervical)。

[0090] 在囊胚发育期间，ICM本身接触，或其衍生的可扩散的“诱导物(inducer)”会引起在极性滋养外胚层中的高速率的细胞增殖(cell proliferation)，而导致在整个囊胚期朝向壁区域(mural region)的细胞移动，并且甚至在ICM与滋养外胚层区别化之后可能会持
续。覆盖ICM的壁滋养外胚层细胞能够保留ICM的“细胞记忆(cell memory)”。通常地，在着床的起始阶段，在ICM对面的壁细胞由于来自子宫内膜(uterine endometrium)的机械
性限制而停止分裂。然而，没有此类限制存在于输卵管中，这致使极性滋养外胚层细胞持续分裂而在异位妊娠的停滞的囊胚中形成胚外外胚层(extraembryonic ectoderm，ExE)。在
一个实施方案中，ExE-衍生的TS细胞呈增殖状态存在至少4天的时间，这取决于ICM分泌
的成纤维细胞生长因子4(FGF4)与它的受体成纤维细胞生长因子受体2(Fgfr2)的相互作
用。在另一实施方案中，ExE衍生的TS细胞呈增殖状态存在至少1天、至少2天、至少3天、
至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少
12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至
少20天的时间。直到临床介入发生，这些细胞过程可能在着床前的胚胎中产生无限数目的
hTS细胞；此类细胞保留来自于ICM的细胞记忆，这通过ICM相关基因的表达而反映出来。

[0091] 此处所描述的一个方面是在子宫着床之前的hTS细胞以及绒毛膜细胞滋养层(chorionic cytotrophoblasts)。在一个实施方案中，hTS细胞具有内细胞群(ICM)(Oct4、Nanog、Sox2、FGF4)与滋养外胚层(Cdx2、Fgfr-2、Eomes、BMP4)这两者的特定基因(图1a)并且表达全部3种原胚层的组分(图7)。在另一实施方案中，所述hTS细胞表达hES细胞
相关的表面标记，诸如特异性阶段胚胎抗原(SSEA)-1、-3与-4(图1b)以及间质干细胞相
关的标记(CD44、CD90、CK7以及波形蛋白)，而造血干细胞标记(CD34、CD45、α6-整合蛋
白、E-钙黏素以及L-选择素)没有表达(图8)。在一个实施方案中，hTS细胞可依据诱导
而分化成为3种原胚层的各种不同的特定细胞表型(图9)。将hTS细胞皮下移植至雄性
严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中在植入后的6-8周仅造成组织学上轻微的嵌合反应(图
10)。在一个实施方案中，染色体分析显示hTS细胞不会改变核型的型态(46,XY)(图11)。
在另一实施方案中，细胞寿命在培养介于第3代与第7代之间的端粒长度上没有被显著地
缩短(图1c)。

[0092] 此处所提供的一个方面是使用AffymetrixTM平台以询问GeneChip Human GenomeU133plus2.0GeneChip有关hTS细胞与PDMS细胞之间的总体基因比较，来描述hTS细胞与
胎盘衍生的间质干(PDMS)细胞之间的区别。在一个实施方案中，该hTS细胞展现出要比在
PDMS细胞中的基因表达少大约10%、大约15%、大约20%、大约25%、大约30%、大约35%、大约
40%、大约45%、大约50%、大约55%、大约60%、大约65%、大约70%或大约75%的基因表达。在另一实施方案中，该hTS细胞展现出总数为2,140个的基因(倍数变化＞2倍)，它要比PDMS
细胞所展现的(3,730个基因)少大约40%(图1d)。在一个实施方案中，hTS细胞的基因强
度分布展现出与PDMS细胞中的基因强度分布有区别的均质型(homogenous pattern)。在
另一个实施方案中，该hTS细胞代表在着床前的阶段的细胞滋养层的特殊群组，从而使得
它们具有内细胞群(ICM)和/或滋养外胚层的分子肖像(molecular portraits)。在另一
实施方案中，该hTS细胞展现与hES细胞相似的多能性及自我更新的特性。
LIF的撤除调控Nanog在hTS细胞中的过度表达

[0093] 在人类中，细胞滋养层是融合细胞滋养层(syncytiotrophoblasts)的前体 (Benirschke,K.,Kaufmann,P.in Pathology of the human
placenta,39-51Spring-Verlag New York Inc.,1990)。当胚胎是桑椹胚(morula)时，滋
养层特化的区域被建立，这反映在该区域的细胞中的转录因子的特殊组合以及各种不同的
环境信号和生长因子对它们的影响。

[0094] 许多证据指出早期外胚层以及真实ES细胞的原始多能性(naive pluripotency)取决于3个转录组成体(transcriptional organizers)(Oct4、性别决定区Y-box(Sox2)
以及Nanog)的作用(Chambers I.等人,Oncogene,23:7150–7160(2004);Niwa H.Develo
pment,134:635–646(2007))。ES细胞经由具有不同的信号传递途径以及转录因子[包括
白血病抑制因子(LIF)、Nanog、Sox2以及八聚物结合转录因子3和4(Oct3/4)]的复杂相
互作用来维持多能性。转录因子Nanog在维持小鼠以及人类ES细胞的多能性上扮演关键
角色，而LIF与Oct4以及Nanog协调地作用，以支持多能性以及自我更新(Cavaleri,F.等
人.Cell113,551-552(2003))。

[0095] LIF[一种白介素-6型细胞因子(interleukin-6class cytokine)]会影响细胞生长以及分化。LIF结合至白血病抑制因子受体α(LIFR-α)，后者与膜糖蛋白130(GP130)
共同受体形成异型二聚物受体复合体(heterodimeric receptor complex)。LIF的结合导
致janus激酶(JAK)/信号转导与转录激活蛋白(STAT)信号传递途径以及丝裂原活化蛋白
激酶(MAPK)途径的活化。LIF通常被表达于发育中的胚胎的滋养外胚层中。LIF被认为在
维持未经分化的状态上发挥作用。从干细胞培养物中移除LIF通常会导致培养的干细胞的
分化。LIF也会影响Nanog(一种已知在干细胞维持上发挥重要作用的基因)的表达。

[0096] 多效性细胞因子—白血病抑制因子(LIF)通常在输卵管中要比在子宫内膜中以更高的浓度表达，这显示从壶腹至峡部节段(isthmic segment)的梯度降低(图1g)。而在
异位妊娠中，LIF水平可能在输卵管中会增加2至4倍( K.等人,Mol.Hum.
Reprod.2007,13,391-397)。LIF在功能上能整合其它信号以活化多能转录因子(例如，
Oct4以及Nanog)，以维持小鼠胚胎干(mES)细胞中的多能性以及自我更新。在撤除LIF时，
细胞增殖持续但是尾型同源框转录因子Cdx2(caudal-related homeobox transcription
factor Cdx2)被活化，从而在胚胎干(ES)细胞中引起滋养外胚层分化。

[0097] 在一个实施方案中，描述了一种用来确定hTS细胞如何维持多能性以及自我更新的特性的方法。在一个实施方案中，在hTS细胞中检测到LIF与多能转录
因子 [ 例如，在 Smith,A.G. 等人 ,Nature336,688-690(1998)；Williams,R.L. 等
人 ,Nature336,684-687,(1998)；Cavaleri,F. 等人 ,Cell113,551-552(2003)；
Chambers I.等人,Cell,2003;113:643–655；Boiani,L.A.等人,Nature Rev.Mol.Cell
Biol.6,872-884(2005)中所描述的因子]的缔合。

[0098] hTS细胞是从在妊娠的第5-8周已蒙受输卵管异位妊娠的妇女体内获得的，并且被视为细胞滋养层的特殊群体，具有ICM衍生的人类胚胎干(hES)细胞以及滋养外胚层的
特定基因标记(例如，在Adjaye,J.等人,Stem Cells,2005,23,1514-1525中所描述的标
记)(图1a)。

[0099] 在一个实施方案中，此处提供了一种通过调节所述细胞对LIF的暴露来影响hTS细胞分化的方法。例如，hTS细胞被分为3组并且被暴露于不同浓度的LIF。在一个实施方
案中，LIF的浓度是大约1000、大约750、大约600、大约550、大约525、大约500、大约450、大约400、大约350、大约300、大约250、大约200、大约150、大约125、大约100、大约75、大约50或大约25单位/mL。在另一实施方案中，LIF的浓度是500、250以及125单位/mL。
在一个实施方案中，LIF的浓度是500单位/mL。在另一实施方案中，LIF的浓度是250单
位/mL。在另一实施方案中，LIF的浓度是125单位/mL。

[0100] 在一个实施方案中，该hTS细胞暴露于不同浓度的LIF历时1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。在另一实施方案中，该hTS细胞暴露于不同浓度的LIF历时3、6、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96、
108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240或252小时。在另一实施方案中，该hTS细胞暴露于不同浓度的LIF大约1至30、大约1至28、大约1至26、大约1至24、大约
1至22、大约1至20、大约1至18、大约1至15、大约1至13、大约1至10、大约1至9、大
约1至8、大约1至7、大约1至6、大约1至5、大约1至4或大约1至2天。在另一实施方
案中，该hTS细胞暴露于不同浓度的LIF历时3天。

[0101] 此处所描述的一个方面是较低浓度的LIF会改变某些基因的表达，这些基因包括但不限于：Oct4、Sox2、Cdx2和Nanog。另一实施方案通过RT-PCR证明：LIF的撤除和/或
较低浓度的LIF会抑制Oct4以及Sox2表达，并且相反地，会促进Cdx2以及Nanog(图1e)。
在一个实施方案中，这些现象通过流式细胞分析进一步得到确认，其显示Oct4以及Sox2的
抑制是呈剂量依赖的方式(图1f)。

[0102] 在另一实施方案中，Oct4/Cdx2的相对表达比例暗示在早期胚胎分化中的细胞命运(cell fate)。在另一实施方案中，LIF暴露的撤除和/或减少导致Oct4的表达减少。在
另一实施方案中，LIF暴露的撤除和/或减少以剂量依赖的方式促进Cdx2、Nanog以及Sox2
转录因子的表达，这与定量PCR(qPCR)分析是一致的。

[0103] 此处所描述的另一个方面是，在hTS细胞中位于壶腹的高Oct4/Cdx2比例朝向峡部节段的梯度降低(图1g)与输卵管中LIF水平的趋势是相容的，从而暗示细胞命运选择
趋向hES细胞。在一个实施方案中，相对的Nanog/Cdx2比例的上调(2倍)进一步执行细
胞中的多能性。在一个实施方案中，相对的Nanog/Cdx2比例的上调(2倍)维持hTS细胞
中的多能性。在另一实施方案中，有关hTS细胞的Sox2/Cdx2表达比例不会改变以维持多
能性。在另一个实施方案中，Cdx2过度表达有利于hTS细胞维持滋养层的表型。

[0104] 此处所描述的一个实施方案是一种用以检测hTS细胞中Nanog与Cdx2之间的关系的方法。在另一实施方案中，通过使用siRNA所造成的Nanog以及Cdx2这两者的敲除研
究分别促进Cdx2以及Nanog表达(图1h)，这支持了在hTS细胞中Nanog与Cdx2之间的相
互关系类似于在ES细胞中Oct4与Cdx2对于细胞命运选择所具有的相互关系(Niwa,H.等
人,Cell123,917-929)。在另一实施方案中，Nanog的过度表达与升高的Nanog/Cdx2比例
相结合来补偿降低的Oct4/Cdx2比例并且足以维持在hTS细胞中决定细胞分化命运的多能
性和/或更新。

[0105] 此处所描述的一个方面显示：在LIF撤除时的Nanog的过度表达是至少一个在维持hTS细胞的多能性上发挥作用的因素。
视黄酸(RA)以及相关的途径

[0106] 视黄酸(RA)(一种维生素A的衍生物)在ES细胞的分化以及胚胎形成(embryogenesis)上发挥作用。在ES细胞中，RA通过结合至它的核受体并且诱导特定靶基
因的转录来发挥作用，以生成数种不同的细胞类型。在一个实施方案中，以RA诱导能够使
hTS细胞衍生的tNSCs维持具有特定图式形成的稳定地未分化的状态。

[0107] 在一个实施方案中，用全反式视黄酸(RA)处理hTS细胞会生成适合用于植入到大鼠疾病模型(例如，帕金森氏症模型)中的神经干细胞。在另一实施方案中，在hTS细
胞中LIF暴露的撤除和/或减少会调控Nanog(它负责hTS细胞的多能性以及自我更新的
维持)的过度表达。此处还描述了允许经RA诱导的hTS细胞分化成为神经干细胞的某些
分子途径，包括在可逆的上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和Wnt信号传递途径的相互作用
(cross-talk)以及触发靶基因Pitx2以供神经干细胞形成上发挥作用的途径。因此，一个
实施方案描述RA相关的途径的调节子用于由hTS细胞生成神经干细胞的用途。
RA诱导NSC亚型的一致复合体

[0108] 在一个实施方案中，hTS细胞被诱导以生成神经干细胞。在一个实施方案中，该hTS细胞暴露于诱导剂或用诱导剂进行处理。在一个实施方案中，诱导剂包括，但不
限于：视黄酸、神经生长因子(nerve growth factor)、碱性成纤维细胞生长因子(basic
fibroblast growth factor)、神经营养蛋白(neurotrophins)(例如，神经营养蛋白3)，和/或它们的组合。额外的示范性诱导剂包括，但不限于：促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、无翅型MMTV
整合位点(Wnt)蛋白质(例如，Wnt3a)、转化生长因子α(transforming growth factor
alpha,TGFα)、转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)、骨形态发
生蛋白(BMPs)、甲状腺激素(thyroid hormone，TH)(包括T3以及T4型这两者)、促甲
状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、甲状腺释放激素(thyroid releasing
hormone，TRH)、刺猬蛋白(hedgehog proteins)[例如，音猬因子(sonic hedgehog)]、血
小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、环AMP(cyclic AMP)、垂
体腺苷酸环化酶活化多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，
PACAP)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、生长激素(growth hormone，GH)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)(例如，IGF-1)、生长素释放激素(growth hormone releasing hormone，GHRH)、泌乳素(prolactin，PRL)、泌乳素
释放肽(prolactin releasing peptide，PRP)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、雌激素(estrogen)、5-羟色胺、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、促性腺素释放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)、睫状神经营养因
子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、粒细胞集落刺激因
子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因
子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、血管内皮生长因
子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、黄体生成素(luteinizing hormone，
LH)、人类绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)、信息素(pheromones){例如，2-仲丁基-4,5-二氢噻唑(2-sec-butyl-4,5-dihydrothiazole)、2,3-去氢-西
部松小蠹集合信息素(2,3-dehydro-exo-brevicomin)、α与β金合欢烯(alpha and
beta farnesenes)、6-羟基-6-甲基-3- 庚酮 (6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone)、
2-庚酮(2-heptanone)、反-5-庚烯-2-酮(trans-5-hepten-2-one)、反-4-庚烯-2-酮
(trans-4-hepten-2-one)、乙酸正戊酯(n-pentyl acetate)、顺-2-戊烯-1-基-乙酸
酯(cis-2-penten-1-yl-acetate)、2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine)、丙酸十二
烷酯(dodecyl propionate)以及(Z)-7-十二烯-1-基乙酸酯[(Z)-7-dodecen-1-yl
acetate]}，和/或它们的组合。在另一实施方案中，该诱导剂是具有天然诱导剂的活性的
类似物或变异体。

[0109] 作为非限制性实例，视黄酸被用来化学地诱导hTS细胞。多效性因子全反式视黄酸(RA)经由多重途径而在神经分化(neural differentiation)、图式形成(patterning)
以及运动轴突外生(motor axon outgrowth)上发挥体内功能，所述多重途径包括，但不限
于：ES细胞中的RA/RARs/RXRs信号传递、Wnt信号传递以及ERK途径(Maden,M.Nat.Rev.
Neuroscience8,755-765(2007),Lu J等人,BMC Cell Biol.2009,10:57,Wichterle H等
人,Cell.2002;110:385-397)。在mES细胞(Wichterle H等人,Cell.2002;110:385-397)、
hES细胞(Li,L.等人.Stem Cells22,448-456(2004))以及成人神经生成(Jacobs S等
人,Proc Natl Acad Sci2006,103(10):3902-7)中，RA诱导酪氨酸羟化酶(TH)(多巴胺能
神经元的特征酶)的表达以及轴突形成(neurite formation)。

[0110] 在一个实施方案中，描述了一种用于确定经RA处理的hTS细胞的命运的方法。在另一实施方案中，用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25、30、35、40、
45、50、55、60或65μM的RA处理hTS细胞。在另一实施方案中，用大约0.5-75、大约1-65、大约1-60、大约1-50、大约1-55、大约1-50、大约1-40、大约1-35、大约1-30、大约1-25、大约1-20、大约1-15、大约1-13、大约1-10、大约2-10、大约5-10或大约8-10μM的RA处理
hTS细胞。在另一实施方案中，用10μM的RA处理hTS细胞。

[0111] 在一个实施方案中，该hTS细胞暴露于RA历时1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时3、
6、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、
240或252小时。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时大约1至20、大约1至18、大
约1至15、大约1至13、大约1至10、大约1至9、大约1至8、大约1至7、大约1至6、大
约1至5、大约1至4或大约1至2天。在另一实施方案中，hTS细胞各自暴露于RA历时下
列不同的持续时间：1、2、3、4、5、6、7或8天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时1天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时2天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于
RA历时3天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时4天。在另一实施方案中，hTS
细胞暴露于RA历时5天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时6天。在另一实施
方案中，hTS细胞暴露于RA历时7天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于RA历时8天。

[0112] 在一个实施方案中，RA诱导hTS细胞分化成各种不同表型的神经细胞，其包括，但不限于：神经胶质限制的前体细胞(GRP)、神经元限制的前体细胞(NRP)、多能性神经干
(MNS)细胞、星形胶质细胞(AST)以及未定义的滋养层巨细胞(TGC)，它们免疫细胞化学地
表达神经干细胞标记巢蛋白(图2a)。在另一实施方案中，在1至5天的RA诱导期内，在经
混合的RA-诱导的神经祖细胞的分布上产生相似的比例。在另一实施方案中，在7天的RA
处理期间，细胞分化变为未定义的滋养层巨细胞。

[0113] 因此，在一个实施方案中，此处提供了衍生自hTS细胞的经RA-诱导的神经干细胞。在另一实施方案中，该RA诱导期是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、25、30、35或40天。在另一实施方案中，该RA诱导期是3、6、12、18、24、30、36、
48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240或252小时。在另一实施方案中，该RA诱导期是大约1至20、大约1至18、大约1至15、大约1至13、大约1
至10、大约1至9、大约1至8、大约1至7、大约1至6、大约1至5、大约1至4或大约1至
2天。在一个实施方案中，该RA诱导期是大约1天至大约7天。在另一实施方案中，该RA
诱导期是1天。在另一实施方案中，该RA诱导期是2天。在另一个实施方案中，该RA诱导
期是3天。在另一实施方案中，该RA诱导期是4天。在一个实施方案中，该RA诱导期是5
天。在一个实施方案中，该RA诱导期是6天。在另一实施方案中，该RA诱导期是7天。在
另一实施方案中，该RA诱导期是24小时。在一个实施方案中，该RA诱导期是12小时。在
另一个实施方案中，该RA诱导期是1小时至24小时。

[0114] 在一个实施方案中，此处描述了表达至少一种神经干细胞基因和标记的tNSC。在另一实施方案中，该tNSC表达至少2种、至少3种、至少4种或至少5种神经干细胞基因。
在另一实施方案中，该tNSC表达至少2种、至少3种、至少4种或至少5种神经干细胞标记。
神经干细胞基因和标记的非限制性实例包括：巢蛋白、神经丝、Ngn-3、MAP-2、Neo-D、CD133以及Oct4(图2b)。在一个实施方案中，该tNSCs也表达RA受体基因(其包括，但不限于：
RARβ、RXRα以及RXRβ)、细胞视黄酸结合蛋白(CRABP)-2、细胞视黄醇结合蛋白(CRBP)-1以及特别地，被发现不存在于ES细胞中的RA合成酶RALDH-2以及RALDH-3。

[0115] 因此，一个实施方案描述表达的神经干细胞基因和标记[包括巢蛋白、神经丝、Ngn-3、MAP-2、Neo-D、CD133和Oct4、RA受体基因(诸如RARβ、RXRα以及RXRβ)、CRABP-2、CRBP-1、RA合成酶RALDH-2和RALDH-3等，和/或它们的调节子]用以促进tNSCs的分化能
力的用途。在一个实施方案中，3天与5天RA-诱导的hTS细胞都以相似的比例维持神经干
细胞标记，包括巢蛋白、GFAP以及神经丝蛋白(图2c)。在另一实施方案中，这些tNSCs免
疫细胞化学地表达酪氨酸羟化酶(TH)以及5-羟色胺(5-HT)(图2d)，这暗示它们分化成多
巴胺能神经元以及5-羟色胺能神经元的能力。此处所描述的另一实施方案是将tNSCs分
化成多巴胺能神经元以及5-羟色胺能神经元。

[0116] 此处进一步提供了由一致地混合的神经上皮祖细胞(neuroepithelialprogenitor cells)[在细胞培养期间能在遗传上以及表型上以稳定状态(steady-state)
维持]所构成的tNSCs。这种在产物上的一致性对于任何包含以干细胞为基础的治疗的治
疗方案(treatment regimen)是一种理想的特性。
就Nanog表达而言LIF与RA之间的关联性

[0117] 在早期胚胎发育中，tNSCs典型地表达RALDH-2。此处所描述的一个实施方案是一种用以评估在hTS细胞中LIF如何影响RA-诱导的神经生成的方法。LIF在小鼠ES(mES)
细胞中抑制RA-诱导的神经元分化的能力使得移植更为困难(Martín- R等人,J.
Neuron.Res.85,2686-2710(2007);Bain G等人,Dev Biol168:342-357)。其它报道主张
LIF在ES细胞分化成神经元上的积极作用(Tropepe V,Neuron 2001,30:65-78)。

[0118] 在一个实施方案中，描述了一种用于评估hTS细胞中就Nanog表达而言LIF与RA之间的关联性的方法。在另一个实施方案中，tNSCs用LIF处理并且通过流式细胞术而进行
Nanog表达的测量(图18a)。在一个实施方案中，tNSCs用大约1000、大约750、大约600、
大约550、大约525、大约500、大约450、大约400、大约350、大约300、大约250、大约200、大约150、大约125、大约100、大约75、大约50或大约25单位/mL的LIF处理。在另一实施
方案中，tNSCs用1-1000、1-500、1-450、1-400、1-350、1-300、1-250、1-200、1-150、1-125、
1-100、1-75或1-50单位/mL的LIF处理。在另一实施方案中，tNSCs用500、250和/或
125单位/mL的LIF处理。

[0119] 在一个实施方案中，hTS细胞暴露于LIF历时1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于LIF过夜。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于LIF历时3、6、12、15、18、22、24、30、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、
216、228、240或252小时。在另一实施方案中，hTS细胞暴露于LIF历时大约1至20、大约
1至18、大约1至15、大约1至13、大约1至10、大约1至9、大约1至8、大约1至7、大约
1至6、大约1至5、大约1至4或大约1至2天。

[0120] 在一个实施方案中，用RA处理hTS细胞诱导Nanog过度表达。在另一实施方案中，LIF以剂量依赖的方式抑制RA-诱导的Nanog。在另一实施方案中，LIF对tNSC发育发挥
抑制作用。

[0121] 此处所描述的一个方面是在ES细胞的神经分化上LIF与RA相互作用。在一个实施方案中，LIF影响RA对hTS细胞中的多能性的效果。结果显示：在hTS细胞中，RA诱导
Nanog以及Oct4的过度表现，但不诱导Cdx2以及Sox2的过度表达(图18b)。在脑的峡部
区域中，观察到Nanog表达在LIF-诱导的细胞中为62.5%(图1f，左区和右区)，但在RA-诱
导的细胞中仅为26.9%(图18b)。还观察到：较高水平的LIF通常抑制RA-诱导的Nanog并
且LIF的撤除显著地增强RA-诱导的Nanog表达(图18a)。这些结果暗示hTS细胞朝向峡
部移动。在一个实施方案中，RA通过Nanog表达维持细胞多能性。

[0122] 在一个实施方案中，在一个RA富集的微环境(RA-enriched microenviroment)中植入tNSCs促进体内干细胞的连续增殖。在另一实施方案中，tNSCs被植入至脑内。在
另一个实施方案中，tNSCs被植入或被注射至海马(hippocampus)、大脑皮质(cerebral
cortex)、纹状体、间隔(septum)、间脑(diencephalon)、中脑(mesencephalon)、后脑
(hindbrain)或脊髓基底神经节(spinal cord basal ganglia)内。在另一实施方案
中，tNSCs被植入至脑的纹状体内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或被注射至中枢神
经系统的任何部位内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或被注射至在特定的神经退化
性障碍中退化的细胞的神经末梢区域内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或被注射至
中脑(midbrain)中的黑质致密部内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或被注射至前脑
(forebrain)中的神经末梢区域内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或被注射至脑室系
统(ventricular system)内。在另一实施方案中，tNSCs被植入或注射至侧脑室(lateral
ventricle)内。
在维持tNSCs中的多能性(multipotency)上的G蛋白信号传递

[0123] 此处描述的另一个方面是一种用以研究tNSCs如何维持它们的多能性状态的方法。在一个实施方案中，RA在大约第15分钟时诱导c-Src mRNA表达波峰(图3a)。此处所
描述的另一实施方案是基于RA刺激的RXRα、c-Src以及RARβ表达通过Western印迹分
析来评估GPCR信号传递途径(图3b)。在一个实施方案中，RA在30分钟内促进Gαq/11和
Gβ这两者表达。在另一实施方案中，免疫沉淀(IP)分析法的分析证明：RA诱导RXRα与
RARβ之间的直接结合；然而，此种交互作用被c-Src抑制剂PP1类似物阻断，这表示c-Src
参与到RXRα与RARβ之间以形成支架蛋白质复合体(图3c)。

[0124] 通过免疫沉淀(IP)分析(图3d)，我们独立地观察到RXRα展现出与Gαq/11的结合交互作用，而RARβ显示与Gβ的结合交互作用。这些结果与GPCR-G蛋白信
号传递的“拉与推(pull and push)”模型一致(Tsai等人,“The ubiquitin ligase
gp78promotes sarcoma metastasis by targeting KAI1for degradation.Nat.
Med.13,1504-1509,(2007))。

[0125] 在一个实施方案中，RARs与RXRs的异型二聚物对(heterodimeric pair)发挥核中的配体活化的转录因子(ligand-activated transcription factors)以及内
源性细胞表面信号分子(endogenous cell surface signal molecules)的作用。组
成型活化的RXRα破坏受体构型并且募集c-Src以与所缔合的Gαq/11交互作用和/或
活化所缔合的Gαq/11。在一种情况下，这种非基因组RA信号转导协助解释非视黄酸反应
元件(retinoic acid-response element，RARE)调控的基因表达(Maden,M.,Nat.Rev.
Neuroscience8,755-765(2007))。

[0126] 因此，此处提供了用于防止在移植此处所提供的神经干细胞之前以及之后的细胞过度生长的策略。一个实施方案描述调节RA相关的途径从而防止和/或减少和/或缓和
过度生长和/或移植物排斥(graft rejection)的试剂的用途。
原癌基因酪氨酸蛋白激酶(Src)以及Nanog

[0127] c-Src维持 ES细胞处于未分化的状态(Annerén C. 等人 ,J BiolChem.279,590-598(2004))。Nanog和Stat3协同地结合以活化Stat3依赖的启动子(Torres
J.等人,Nat Cell Biol.10,194-201(2008))。在一个实施方案中，c-Src诱导信号转导及
转录激活蛋白3(Stat3)在Tyr705位点的磷酸化，并且此作用被c-Src抑制剂蛋白磷酸酶
1(PP-1)类似物阻断，从而连结了c-Src与Stat3分子之间的关联性(图3f)。在另一实施
方案中，Stat3直接作用于Nanog启动子(图3g)。在另一实施方案中，Stat3不直接作用于
Nanog启动子。在另一实施方案中，RXRα直接作用于Nanog启动子。在另一实施方案中，
RXRα未直接作用于Nanog启动子。在另一实施方案中，RARβ直接作用于Nanog启动子。
在另一实施方案中，RARβ不直接作用于Nanog启动子。在另一实施方案中，RA在hTS细胞
中诱导c-Src、pStat3(图3e)以及Nanog(图1e)的过度表达。在另一实施方案中，RXRα
以及RARβ这两者经由GPCR-G蛋白信号传递响应于RA发挥转导作用。

[0128] 在一个实施方案中，此处描述了一种用以在tNSCs中维持多能性的方法，该方法包括活化c-Src/Stat3/Nanog转录途径。在另一实施方案中，c-Src与Gαq/11的交互作用
活化c-Src/Stat3/Nanog途径。为了进一步通过成像研究证实RXRα与Gαq/11之间的直接
交互作用，使用双免疫金荧光透射电子显微术(IEM)。RA诱导细胞质膜(plasma membrane)
处小的金粒子标记的RXRα(6μM)与大的金粒子标记的Gαq/11(20μM)之间的结合交互作
用(图4)。根据动态共焦免疫荧光显微术，经免疫染色的RXRα与Gαq/11这两者主要地呈
均质特征出现在细胞质或核中(图4)。通过用RA处理5分钟，细胞溶质RXRα强度在核周
区域处增加而核RXRα强度降低(图4，第1列)，这表示在刺激之后的细胞溶质转位。在
第15分钟时，核RXRα强度变得显著，而细胞溶质RXRα强度降低(图3a)。

[0129] 在一个实施方案中，细胞核中的活性增加在细胞中维持稳定状态。在30分钟内再次观察到明显的细胞溶质转位。另一方面，Gαq/11表达的区隔变化类似于RXRα表达的区
隔变化(图4，第2列)。在一个实施方案中，在刺激之后的第30分钟，在细胞膜处观察到
Gαq/11的明显聚集。在另一实施方案中，RA能够促进RXRα与Gαq/11这两者在hTS细胞中的组成性合成以及转位。

[0130] 因此，此处提供了RA在细胞质膜处经由G蛋白偶联受体(GPCR)-G蛋白信号传递而作用于hTS细胞(这与基因组RA/RXRs/RARs途径是可区别的)以供生成tNSCs的用途。
如此处所显示的，RA在使hTS细胞分化成为tNSCs方面是经由Nanog和Oct4，而非Cdx2和
Sox2途径来发挥作用的。此处还提供了RA-诱导的Nanog活化在维持tNSCs中的多能性
以及自我更新方面的用途。此处提供了G蛋白偶联受体(GPCR)-G蛋白信号传递的RA活化
以及伴随的RXRα/Gαq/11/c-Src/Stat3/Nanog途径活化在维持tNSCs中的多能性方面的
用途。此处提供了RXRα和RARβ的异型二聚物在细胞质膜处作为信号分子发挥功能以维
持tNSCs中的多能性的用途。此处还提供了RA通过Nanog的过度表达来诱导hTS细胞分
化成神经干细胞(NSC)以维持多能性以及再生的用途。

[0131] 此处所描述的tNSCs表达帮助神经生成的视黄醛脱氢酶(RALDH)-2以及RALDH-3。此处所描述的tNSCs中存在RALDH以及不存在CD33暗示tNSCs在分化成感觉运动神经元
(sensorimotor neurons)上要优于hES细胞。因此，此处提供了此处所描述的tNSCs用于
神经生成和/或再生医学(regenerative medicine)的用途。

[0132] 在发育的纹状体以及海马中，增加的Src激酶活性与神经元分化以及生长的尖峰期相一致。然而，RA可以通过24小时孵育来抑制核糖体S6激酶(ribosomal S6kinase)
及其下游真核起始因子4B(eukaryotic Initiation factor4B，eIF4B)的磷酸化，以造成
许多细胞类型的生长停滞(growth arrest)。RA诱导hTS细胞中的c-Src mRNA的快速瞬
时表达，在15分钟时达到峰值(图3a)，继而在第1小时生成c-Src蛋白质(图3e)。在一
个实施方案中，c-Src mRNA含有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site)。
在另一实施方案中，RA短暂地产生eIF4B，在第4小时达到峰值，但在第24小时消退(图
20c)。此作用通过使用eIF4B siRNA而被抑制(图20d)。排除了mTOR/eIF4EBP1信号传递
[雷帕霉素/真核起始因子4E结合蛋白1(rapamycin/eukaryotic Initiation factor4E
binding protein1)的机械靶标]的参与(图20b)。在另一实施方案中，RA活化eIF4B以
供亚细胞mRNA定位以生成c-Src。

[0133] 活性c-Src通过Tyr705位点的磷酸化而直接地结合至Stat3(信号转导及转录激活蛋白)(图20e)以生成蛋白质(图3e)。在一个实施方案中，此作用通过使用c-Src
siRNA而被抑制(图20f)。在另一实施方案中，此作用被选择性c-Src抑制剂PP-1类似
物抑制(图3f)。在另一实施方案中，通过染色质免疫沉淀(ChIP)分析而观察到Stat3对
Nanog基因启动子的直接作用(图3g)。在另一实施方案中，Nanog在4小时内生成(图3f
及20f)，它可通过使用PP1类似物(图3f)以及Stat3siRNA(图20g)而被阻断。

[0134] 在一个实施方案中，此处描述了一种用以维持tNSCs的多能性的方法，其包括使细胞暴露于诱导剂以调节非基因组eIF4B/c-Src/Stat3/Nanog信号传递途径所调控的
c-Src亚细胞mRNA定位(图20h)。在另一实施方案中，该诱导剂是RA。
RA及Wnt信号传递

[0135] 此处还提供了一种用以诱导hTS细胞成为神经干细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括调节Wnt2B/β-联蛋白信号传递途径。在另一实施
方案中，该方法包括调节RARs-Akt信号传递途径。在另一实施方案中，该方法包括调节
Wnt2B/β-联蛋白以及RARs/Akt信号传递途径。在另一实施方案中，通过用视黄酸(RA)
处理来诱导hTS细胞。在另一实施方案中，该用以诱导hTS细胞成为神经干细胞的方法
进一步包括活化转录因子Pitx2。在另一实施方案中，该用以诱导hTS细胞成为神经干
细胞的方法进一步包括活化转录因子导蛋白(netrin)(NTN)。在另一实施方案中，该用
以诱导hTS细胞成为神经干细胞的方法进一步包括活化转录因子Pitx2以及NTN。在另
一实施方案中，RAR以及RXR作为异型二聚物而存在，该异型二聚物经由它的DNA结合域
(DNA-binding domain，DBD)与视黄酸反应元件(RARE)DR-5结合。在另一实施方案中，
辅阻遏物(corepressors)结合至RAR并且募集组蛋白脱乙酰酶(HDAC)，造成转录抑制
(transcriptional repression)。在另一实施方案中，用以诱导hTS细胞成为神经干细胞
的方法进一步包括活化转录因子Pitx2和NTN。在另一实施方案中，向hTS细胞添加RA并
通过RA与RAR的结合来激活转录。在另一实施方案中，RAR与RA结合，接着募集共活化子
(coactivators)以及HAT。

[0136] RA-调控的Wnt信号传递途径在成人神经生成以及体内存活期间是重要的贡献者。存在于神经干细胞微环境中的Wnt蛋白质在早期胚胎形成中是细胞行为的关键调节
子，并且可维持神经干细胞潜力。在成人神经生成中，Wnt蛋白质结合至它们的受体卷曲蛋白(Frizzled)(例如，Fzd6)以转导许多信号级联(signaling cascades)，例如通过针对特
定的靶基因来活化β-联蛋白/LEF信号传递。

[0137] Wnt信号在神经发育(neurodevelopment)期间涉及细胞周期控制(cell cyclecontrol)以及形态发生(morphogenesis)。在它们之中，Wnt2B可抑制视网膜神经元的分
化，并且使用比较性integromics分析(comparative integromics analysis)已经提示是
有关NSC的干细胞因子。在一个实施方案中，Wnt2B调节卷曲蛋白家族受体6(Fzd6)的表
达。在另一实施方案中，Wnt2B诱导Fzd6的表达。在另一实施方案中，Fzd6在Wnt2B的存
在下过度表达。在一个实施方案中，RA调节针对hTS细胞中的多巴胺能分化的典型Wnt2B/
Fzd6/β-联蛋白信号传递途径。在一个实施方案中，RA诱导针对hTS细胞中的多巴胺能分
化的典型Wnt2B/Fzd6/β-联蛋白信号传递途径。

[0138] 此处所提供的一个实施方案将典型Wnt途径描述为诱导抑制性GSK3β，导致β-联蛋白稳定化以供在细胞中的核转位。在另一实施方案中，RA快速地诱导GSK3β在
Tyr216位点[Akt2的下游效应子(effector)]的磷酸化。在另一实施方案中，RA快速地诱
导GSK3β在Tyr216位点的磷酸化，导致在最初的数小时的β-联蛋白磷酸化，这发挥针对
随后的典型Wnt途径的“促发(priming)”效应。在另一实施方案中，这些经活化的Fzd6以
及Dvl3能够促进c-Jun N-末端激酶(JNK)与细胞骨架(cytoskeleton)的交互作用或增加
2+ 2+
细胞内的Ca 水平，接着在非典型Wnt/Ca 信号传递途径中活化用于突触功能的CaMKII。
随着时间的推移，发生从非典型至典型Wnt途径的转换，这归因于GSK3β在Ser9/21位点
处的磷酸化。在一个实施方案中，G蛋白在起始阶段调节非典型Wnt2B信号传递的转导。在
另一实施方案中，典型Wnt2B信号传递在早期发育的神经元分化中的后期阶段发生。
HDAC6

[0139] 此处还提供了一种用以诱导hTS细胞成为神经干细胞的方法，该方法包括调节组蛋白脱乙酰酶6(histone deacetylase6，HDAC6)。组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)(一种主要位
于细胞质中的酶)调节许多生物过程(biological processes)，包括细胞迁移、免疫突触
形成(immune synapse formation)、病毒感染以及错误折叠的蛋白质的降解。例如，HDAC6可使微管蛋白、Hsp90以及皮层蛋白(cortactin)去乙酰化，并与其它伙伴蛋白质(partner proteins)形成复合体。

[0140] HDAC6能运输β-联蛋白以供核定位。在一个实施方案中，根据细胞分离分析，HDAC6与β-联蛋白交互作用而导致β-联蛋白的核转位。在另一个实施方案中，RA诱
导新的典型Wnt2B/Fzd6/β-联蛋白信号传递途径，而允许在hTS细胞中的β-联蛋白的
核转位。在核内，β-联蛋白涉及调控关键的基因表达程序，或作为对接平台(docking
platform)以供各种不同的转录共活化子(transcriptional co-activators)来刺激转
录。
HDAC4

[0141] 组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)是功能性hTS细胞诱导的神经干细胞的一种重要表观遗传调节子(epigenetic regulator)。HDAC4抑制细胞周期进展并且保护神经元免
于细胞死亡。RARs所造成的转录调节涉及由HDACs[它们通过核的辅阻遏物(nuclear
co-repressors)被募集至RA靶基因]对染色质的修饰，这决定了对RA的差别反应。
LEF/TCF/Pitx2

[0142] Lef-1以及PITX2通过募集并且与β-联蛋白交互作用来活化靶基因而在Wnt信号传递途径中发挥作用。PITX2与Lef-1蛋白质内的2个位点交互作用。此外，β-联蛋白
与PITX2同源域(homeodomain)交互作用，而Lef-1与PITX2C-端尾部交互作用。Lef-1以
及β-联蛋白经由2个不同的位点同时地并且独立地与PITX2交互作用，以调节PITX2转
录活性。这些数据支持PITX2经由差异的Lef-1异构型表达以及与Lef-1和β-联蛋白的
交互作用而在细胞增殖、迁移和细胞分裂(cell division)中的作用。
导蛋白1(NTN1)

[0143] NTN1的分子机制被认为主要涉及轴突导引(axonal guidance)以及对神经元细胞迁移的控制。
Wnt/PS1/PI3K/Akt途径的活化以及RA所造成的GSK3-β的抑制

[0144] 由于增殖性祖细胞的数目增加及相应的经分化的神经元的减少，增加的Wnt信号传递扩张干细胞库(stem cell pool)并且强化稳定化的β-联蛋白的表达而致使产
生大的脑(Chenn,A.等人,Science297,365-369,(2002))。β-联蛋白作为接合蛋白
(junctional protein)起双重作用，并且在典型Wnt信号传递中，表型可能是由于增加的
Wnt信号传递(它与NSC自我更新有关联)或增加的接合稳定性(junctional stability)。
PI3K/Akt信号传递

[0145] 在一个实施方案中，此处描述了一种用于维持tNSCs的多能性的方法，该方法包括调节PI3K/Akt信号传递途径。G-蛋白β/γ异型二聚物也活化磷酸肌醇-3-激酶的调节
亚基5(Phosphoinositide-3-kinase，regulatory subunit5)[PI3K regclass IB(p101)]，后者导致磷酸肌醇-3-激酶催化γ多肽[PI3K cat class IB(p110-γ)]调控的磷脂酰
肌醇4,5-二磷酸[phosphatidylinositol4,5-biphosphate，PtdIns(4,5)P2]至磷脂酰肌
醇3,4,5-三磷酸[phosphatidylinositol3,4,5-triphosphate，PtdIns(3,4,5)P3]的转换
[3]。PtdIns(3,4,5)P3是直接地与3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶-1(3-phosphoinositide
dependent protein kinase-1)[PDK(PDPK1)]以及V-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物
1(V-akt murine thymoma viraloncogene homolog1)[AKT(PKB)]结合的第二信使(second
messenger)。PDK(PDPK1)磷酸化AKT(PKB)并且活化AKT信号传递[4]。

[0146] PI3K/Akt信号传递在下面的干细胞系统中调节自我更新以及分化能力。从原生殖细胞(primordial germ cells，PGC)到多能胚胎生殖(embryonic germ，EG)细胞的衍生在
PGC-特异的Pten-缺乏的小鼠(PGC-specific Pten-deficient mice)中得到增强(Kimura
T等人,Development130:1691-1700,(2003))。

[0147] 在一个实施方案中所显示的是：利用Akt信号传递的条件活化，PI3K/Akt信号传递在静息干细胞的活化上发挥作用。在另一实施方案中，PI3K/Akt信号传递在成人表皮中
的祖细胞的增殖上发挥作用。

[0148] 在一个实施方案中，PI3K/Akt信号传递在这些适应培养的干细胞中促进干细胞的自我更新，而不是定向祖细胞的生成。在一个实施方案中，RA在hTS细胞中调节Akt3/mTOR
信号传递的活化，而引起编码蛋白质RXRα以及RARβ的亚细胞mRNAs的翻译。在一个实
施方案中，RA在hTS细胞中诱导Akt3/mTOR信号传递的活化，而引起编码蛋白质RXRα以
及RARβ的亚细胞mRNAs的翻译。在另一个实施方案中，诱导剂抑制Akt3/mTOR信号传递
的活化。在另一实施方案中，RXRα/Gαq/11以及RARβ/Gβ信号传递途径的选择性移动与
交互作用被独立地启动。

[0149] 在另一实施方案中，RA调节有关细胞功能的遗传程序转录活性，这取决于多效性及细胞环境依赖的方式(cellular context-dependent manner)；即，产出表型(output
phenotype)是AP-1和/或β-联蛋白-LEF/TCF抑制以及RARE活化的效果的组合。
GSK3β调节微管装配

[0150] hTS细胞包括主要的GSK3β功能，在神经发育中GSK3β的起始活化促进神经元分化并且随后的失活促进祖细胞增殖。在静息细胞中，GSK3的基础活性通常是相对较高的，
而将细胞暴露于引导信号会在10分钟内降低其比活性(specific activity)达30-70%。
GSK3β对于其已磷酸化的底物具有强烈的偏好；因此，在典型Wnt2B信号传递中先前经促
发的β-联蛋白对于随后的抑制性GSK3β变成适合的。

[0151] 在一个实施方案中，快速时空活性的GSK3β对局限在轴突生长核心中的MAPT进行磷酸化，而导致促进微管装配、神经元极性(neuronal polarity)以及轴突外生的微管蛋白异型二聚物的活化(图21a以及21b)，这与GSK3β的活化参与轴突微管装配的概念是一
致的。此外，GSK3β也能够调节CRMP-2的磷酸化而促使微管装配，由此CRMP-2优先地与
微管蛋白异型二聚物结合，这明显地不同于MAPT。CRMP-2的突变体以显性阴性的方式抑制
轴突生长以及分支。

[0152] 在一个实施方案中，此处提供了一种用以帮助解释在体内GSK-3信号传递是稳态控制(homeostatic control)的重要调节物而在发育的脑中调节神经祖细胞的机制基础。
在另一实施方案中，PI3K/Akt途径的初始的局部活化诱导hTS细胞中的GSK3β在Tyr216
处的活化。在一个实施方案中，PI3K/Akt途径的初始的局部活化与通过从E18大鼠胚胎分
离的海马神经元(hippocampal neurons)中的Ser9/21磷酸化所诱导的GSK3β的失活是
有区别的。在一个实施方案中，在GSK3β中的不同位点上的磷酸化导致不同的细胞命运，
这取决于时间因素。磷酸化的GSK3β通过促进核输出来防止钙依赖磷酸酶诱导的NFAT1
的DNA结合。NFAT在促进基因转录(包括在免疫反应期间T细胞中的细胞因子基因)上发
挥核心作用。这些事实至少部分地解释了为何hTS细胞与tNSCs这两者具有促进PD大鼠
中的颅内移植(intracranial transplantation)的免疫优势。
G蛋白与神经元可塑性(Neuronal Plasticity)

[0153] 在NSCs中高度的自主性通过在神经生成期间mRNAs子集的选择性定位以及翻译而允许针对引导信号的快速局部反应，其中mTOR典型地在NSCs中经由对mRNA翻译以
及核糖体合成的关键调节子进行磷酸化来上调蛋白质合成。在hTS细胞中，活性Akt3/
mTOR信号传递触发mRNA翻译以独立地合成RXRα以及RARβ蛋白质，这两种蛋白质分别
活化Gαq/11以及Gβ信号传递途径，其中局部CREB1被活化并且发挥诱导型基因表达的作
用，该基因表达短暂地靶向TH基因以供转录，以生成神经递质多巴胺(neurotransmitter
dopamine)。已显示：RA促进树突RNA颗粒中的RARα表达并且活化局部的谷氨酸受
体1(glutamate receptor1，GluR1)合成，这意味着稳态的突触可塑性(homeostatic
synaptic plasticity)。因此，多巴胺D1/D5受体(CREB的上游增强子)的活化会诱导
GluR1嵌入神经元中的突触位点。

[0154] 在一个实施方案中，此处提供了一种分子模型以供研究RA信号相关的可塑性。用于多巴胺能神经生成的转录因子

[0155] 在一个实施方案中，β-联蛋白与CREB1在核中的交互作用代表了TH转录中的主流。在一个实施方案中，活性的β-联蛋白结合至淋巴样细胞增强因子1/T细胞因子
1(lymphoid enhancer factor1/T cell factor1)(LEF1)，而导致LEF1从转录的抑制子转
换为活化子。LEF1接着募集并且与Pitx2(bicoid相关因子超家族的成员)交互作用。在
一个实施方案中，LEF1促进Pitx2基因转录。在另一实施方案中，LEF1促进Pitx3基因转
录。在另一实施方案中，LEF1促进Pitx3和Pitx2这两者的基因转录。在一个实施方案中，
β-联蛋白、Pitx2以及LEF1协同地交互作用以调节LEF-1启动子。

[0156] 此外，短暂核活性NFAT1作为转录因子发挥作用以生成用于免疫反应的细胞因子以及TNF-α。然而，因为经磷酸化的GSK3β能够抑制钙依赖磷酸酶诱导的NFAT1在核中
的DNA结合并且促进核输出，此作用不太可能在本情况中发生。因此，由于此作用能够被
NFAT1siRNA抑制(图22e)，活性细胞质NFAT1将会交互作用并且活化细胞质转录因子肌细
胞增强因子2A(myocyte enhancer factor2A，MEF2A)(图22c以及22d)。特别地，快速诱导
型CREB1进入核内并且转录可生成MEF2A蛋白质的MEF2A基因(图22f)。MEF2A可能在基
因转录上以多种方式起作用(图22g)，包括经由自动调节的自身转录以生成更多MEF2A、转
录TH基因以供多巴胺能特化(dopaminergic specification)、转录SNCA基因以供SNCA/
MAPT/帕金蛋白复合体形成，以及与EP300和Pitx2交互作用(它被MEF2A siRNA抑制)
(图22h)。

[0157] 在一个实施方案中，活性的EP300靶向HDAC6基因以及TH基因。在一个实施方案中，活性的EP300靶向HDAC6基因。在另一实施方案中，活性的EP300靶向TH基因。在一
个实施方案中，活性的EP300促进HDAC6基因以及TH基因的转录。在另一实施方案中，活
性的EP300抑制HDAC6基因以及TH基因的转录。在另一实施方案中，HDAC6运输β-联蛋
白以供核转位。

[0158] 在一个实施方案中，此处提供了所形成的并且指定用于TH基因转录的执行性转录复合体的表征。例如，CREB1、EP300以及MEF2A能够靶向TH基因的启动子，而β-联蛋
白、LEF1以及Pitx2在转录过程期间作为增强子的共活化子行使功能。在一个实施方案
中，此处提供了用以了解这些基因如何在多巴胺能NSCs中的分化与增殖之间操纵平衡的
方法，这对于评估疾病机制(例如，PD)具有意义。
CaMKII的多面性

[0159] 在发育NSCs中，经由电压门控的钙离子通道(voltage-gated calcium channels)或神经递质受体(neurotransmitter receptors)的局部钙流入(local calcium influx)
导致CaMKII的活化，而向前传送数种信号。在一个实施方案中，针对兴奋-转录偶合
(excitation-transcription coupling)，时空CaMKII在hTS细胞中经由活化的eIF4B触发
c-SrcmRNA定位以合成c-Src蛋白质，导致Nanog的活化以供自我更新以及增殖。在另一实
施方案中，CaMKII触发局部CREB1的活化，而导致回向运输(retrograde trafficking)至
核内以靶向基因MEF2A以供转录。MEF2A不仅在神经元分化以及增殖上，而且在骨骼肌以及
心肌发育上调控细胞功能。在一个实施方案中，CaMKII活化MAPT来调控帕金蛋白蛋白质，
并且MAPT转而活化用于微管装配的微管蛋白异型二聚物(图22a以及22j)。这些结果暗
示：早期时空CaMKII信号对于微管蛋白的活化以在早期发育的NSCs中促进微管装配、神经
元迁移以及神经元极化(neuronal polarization)是足够的，这确保与脑内的纹状体靶标
(striatal targets)的适当连接性。

[0160] L型钙离子通道以另一种方式来调节细胞内钙以供体内稳态，这涉及成人NSCs中的兴奋-神经生成(excitation-neurogenesis)。升高的氯化钾(KCl)水平导致膜去极
化(membrane depolarization)，而导致钙经由L-型电压敏感的钙离子通道的流入，这足
以经由神经元中的ER以及粒线体之间的相互作用来诱导粒线体功能异常(mitochondrial
dysfunction)。在一个实施方案中，RA调节与L-型钙离子通道有关联的细胞内ER钙。

[0161] CaMKII{钙调蛋白(CaM)依赖的蛋白激酶II[calmodulin (CaM)-dependent2+
protein kinase II]}(L型Ca 通道的下游效应子)响应于短暂的低幅度钙离子峰
2+
(transient low-amplitude calcium spikes)展现出针对Ca /钙调蛋白的较低亲和力。
在一个实施方案中，RA调节CaMKII的时空活化。在另一实施方案中，RA诱导CaMKII的时
空活化。在另一实施方案中，RA抑制CaMKII的时空活化。

[0162] 根据IP分析，CaMKII直接地磷酸化并活化CREB1(图21c)，这与CaMKII在兴奋-转录偶合上局部地将L-型钙离子通道活性编码为针对核CREB的信号的先前研究是一
致的。因为轴突含有各种不同的局部地编码特定蛋白质合成的mRNA，包括在发育的神经元
中的CaMKII、钙依赖磷酸酶以及CREB1，这显示外来的RA触发的mRNA翻译机制发生在它们
身上，因为它们能被真核起始因子4B(EIF4B)siRNA抑制(图21d)。因此，此局部的CREB1
能够回向运输以供在核中负责末梢轴突的信号的特定转录过程。这些结果显示了基于细胞
外信号的快速诱导型基因转录。

[0163] 这些结果首次探究的是：Gαq/11信号衍生的CaMKII兴奋涉及tNSCs的自我更新的维持。同时，这些结果显示轴突行为(axonal behaviors)在早期神经生成中的重要性。
SNCA与磷脂膜(phospholipid membranes)交互作用并且在神经退化性障碍(包括PD以及
阿尔兹海默症)的致病机制(pathogenesis)上发挥重要作用。
钙依赖磷酸酶/NFAT1信号传递

[0164] 在一个实施方案中，RA调节钙依赖磷酸酶的生成。在一个实施方案中，RA诱导钙依赖磷酸酶的生成。在另一实施方案中，ER钙与钙依赖磷酸酶/NFAT1信号传递相关联，这
与先前的研究是一致的。在另一实施方案中，根据细胞分离分析，RA诱导NFAT1与输入蛋白[核质细胞质转运蛋白(nucleocytoplasmic transporter)]的短暂交互作用，导致NFAT1
核转位。这种NFAT1的短暂效应被认为是细胞由此辨别持续的以及短暂的钙信号的一种机
制。在一个实施方案中，RA-诱导的钙依赖磷酸酶/NFAT1信号传递涉及到早期神经生成。
在初始神经生成时的细胞重建(Cellular Remodeling)

[0165] 在一个实施方案中，此处提供了一种用于在hTS细胞向tNSCs转变期间诱导分子过程的方法。在一个实施方案中，该分子过程由RA来诱导。在一个实施方案中，在2个时
间点检测分子级联(molecular cascade)：第4小时(早期)以及第24小时(晚期)。在
一个实施方案中，分子事件发生于2个时期内。在特定的实施方案中，一个时期包括在形态发生中的时空反应(例如，图23；早期；灰线)。在另一个特定的实施方案中，一个时期包括在细胞分化以及增殖中的基因转录(例如，图23；晚期；黑线)。

[0166] 在一个实施方案中，表征了早期神经元形态发生中的机制。一旦干细胞感测到外来的引导信号，各种不同的特定亚细胞mRNA定位快速地启动，而作为反应在核中转录过程
的极远处局部地制造特定蛋白质。经由蛋白质-蛋白质交互作用以及“感觉经验(sensory
experience)”，这些局部蛋白质聚集在亚细胞区域处以在早期发育的NSCs中启动生长锥
(growth cone)形成。不对称分裂(asymmetric division)伴随着基因转录而开始。例如，
β-联蛋白的存在在RA处理5分钟之后于突触膜(synaptic membrane)处是可见的(图
23g)，并且局部活化的CREB1移动回到核内以靶向基因MEF2A以供转录。

[0167] 在一个实施方案中，一系列的分子过程协同地发生以调节粒线体功能(mitochondrial function)、膜的脂质代谢(lipid metabolism of membrane)、轴突生长
(axonal growth)、神经元迁移与可塑性(neuronal migration and plasticity)以及微管
装配，这些分子过程包括，但不限于：RXRα、RARβ、β-联蛋白、Akt、CREB1、mTOR、CaMKII、钙依赖磷酸酶、c-Src、GSK3β、SNCA以及MAPT。在另一实施方案中，通过MEF2A、EP300以及CREB1所造成的在TH基因上的转录代表诱导型基因表达，其从染色体区域诱导染色质环
(chromatin looping)，以促进之后的基因转录。在另一实施方案中，RA-诱导的G蛋白信
号传递的组分在神经元形态发生上发挥关键作用，并且在活化TH基因处的转录中也是不
可或缺的部分。

[0168] 此处描述了分化与增殖之间的平衡以在体外维持呈稳定状态的tNSCs。在一个实施方案中，神经分化是通过调节RA信号转导来控制的。在进一步应用于再生医学或药物发
现之前，通过对这些调节机制的了解，能够在体外更有效地进行hTS细胞的操作。
tNSCs具有免疫豁免

[0169] 此处提供的一个实施方案描述了一种使用至少一种tNSC治疗神经障碍的方法，其中该细胞是经免疫豁免的。在另一实施方案中，该tNSC不会引起免疫反应。在另一实施
方案中，该tNSC不会引起来自于T细胞、B细胞、巨噬细胞、小神经胶质(microglia)、NK细胞或肥大细胞的免疫反应。在另一实施方案中，该tNSC抑制免疫反应。在另一实施方案中，该tNSC具有降低的免疫原性。在另一实施方案中，该tNSC不会导致肿瘤形成。在另一实
施方案中，该tNSC被设计为经免疫豁免的。在此处所提供的另一实施方案中描述了一种使
用tNSC细胞的族群来治疗神经障碍的方法，其中所述细胞是经免疫豁免的。在另一实施方
案中，干细胞或它们的衍生物作为细胞治疗的应用得益于了解它们的免疫原性以帮助确定
免疫抑制剂(immunosuppression agents)植入后的应用。

[0170] 此处所描述的另一个方面是一种用以检测以及比较在hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中的免疫相关基因以及标记的表达的方法。在一个实施方案中，通过流式细胞分析来检
测表达。

[0171] 在hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中的免疫相关基因以及标记的实例包括，但不限于：HLA-ABC、HLA-DR、CD14、CD44、CD73、CD33、CD34、CD45、CD105以及CD133。在另一实施方案中，HLA-ABC在hTS细胞以及tNSCs中的表达在tNSCs中要比在hES细胞中更高。在一
个实施方案中，在全部3种干细胞中观察到HLA-DR的阴性表达(图2e)。在另一实施方案
中，HLA-ABC在hTS细胞(99.4%)以及tNSCs(99.7%)中的表达在tNSCs中要比在hES细胞
中(12.9%)高得多(图2e)。在另一实施方案中，在hTS细胞、tNSCs以及hES细胞中未观
察到CD14和CD44表达上的差异。在另一实施方案中，与hES细胞中的阴性表达水平相比，
高水平的CD73在hTS细胞以及tNSCs中表达(图2f)。在一个实施方案中，该tNSCs具有
间质干细胞的特性，其有利于神经胶质细胞的增殖。

[0172] 在另一实施方案中，CD33(它在细胞外部分处含有免疫球蛋白结构并且是跨膜受体)在hTS以及hES细胞中表达但在tNSCs中没有表达(图2f)。在另一实施方案中，在
tNSCs中的CD33的不存在有利于细胞治疗，因为它与免疫防御(immune defense)有关。因
此，此处提供了具有低水平的CD33表达并且因而具有低免疫原性的tNSCs。

[0173] 在一个实施方案中，在间质干细胞标记CD105的表达上没有发现它们之间在强度上的差异。在另一实施方案中，与hTS细胞以及hES细胞相比，在tNSCs中发现了癌症干细
胞标记CD133(cancer stem cell marker CD133)的低水平表达。在另一实施方案中，与
hTS细胞(93.6%)以及hES细胞(98.8%)相比，在tNSCs中发现了癌症干细胞标记CD133的
低水平表达(11.8%)(图2h)。因此，此处提供了具有低水平的CD133表达并且因而具有低
致肿瘤性(tumorigenicity)的tNSCs。

[0174] 此处进一步提供了CD133+tNSCs的选择性族群，它们可用于移植以及组织再生(tissue regeneration)以供干细胞治疗。此处还提供了具有免疫豁免状态的tNSCs，它们
对于以细胞为基础的治疗而言是可行的候选者。

[0175] 在一个实施方案中，RA诱导免疫相关的标记的表达上的改变，例如，具有CD34(+)的细胞增加但具有CD133(+)的细胞减少。在另一实施方案中，RA诱导CD34(+)hES细胞分化成为平滑肌祖细胞(smooth muscle progenitor cells)。在另一实施方案中，以CD34(+)免疫选择的移植物来进行tNSCs的自体移植(autologous transplantation)在具有高危
神经母细胞瘤(neuroblastoma)的儿童中是可行的。
植入后分化与增殖

[0176] 在神经生成上，RA与视黄酸反应元件(RARE)之间的关联是已知的(Maden,M.等人,Nat.Rev.Neuroscience.8,755-765,(2007))，然而对非RARE作用的存在知之甚少。在
一个实施方案中，RA经由G蛋白偶联受体(GPCRs)信号传递的“拉与推”机制诱导RXRα/
RARβ/c-Src复合体的活化。在另一实施方案中，在2小时内，RXRα通过与Gαq/11的交互
作用最先被活化，继而是c-Src以及之后的RARβ的活化，从而形成复合体(图3a以及3b)。
在它们之中，c-Src随后经由Stat3诱导Nanog过度表达以维持那些hTS细胞衍生的NSCs
的多能性和自我更新。

[0177] 这种信号传递途径暗示：RA没有必要进入细胞来触发典型RA/RXR/RAR/RARE途径，替代地，RA经由GPCR信号传递来活化G蛋白Gαq/11，这与信号转导(signal
transduction)的概念是相容的。因此，在一个实施方案中，此处提供了用于控制RA-调控
的NSCs的多能性以及自我更新的调节，以及在移植之前与之后操控hTS细胞和/或神经干
细胞的方法。在另一实施方案中，Wnt以及RA在近端启动子中分别经由非典型的RARE以
及Lef/转录因子(Tcf)-反应元件(LRE)而影响尾型同源框1(Cdx1)。

[0178] 在一个实施方案中，RA经由典型RA/RARE信号传递途径诱导hTS细胞分化成为多巴胺能NSCs以维持干细胞性质。在另一实施方案中，是非RARE信号传递途径经由Wnt/
β-联蛋白信号级联的活化而生成功能性多巴胺能NSCs。在另一实施方案中，非RARE信号
传递的损害造成多巴胺生成的功能异常或缺失，而导致多巴胺能神经元的进行性退化性变
化(progressive degenerative change)。因此，在另一实施方案中，此处提供了一种经由活化非RARE信号传递途径而分化为多巴胺能神经元的神经干细胞。

[0179] RA在诱导RAR-β表达之前于第6小时活化蛋白激酶C(PKC)途径。RA在第2分钟时引起细胞内二酰基甘油(diacylglycerol，DG)的短暂的1.3倍增加以及在5分钟之内的
PKC的γ同工酶(gamma isozyme)(PKC-γ)的转位(Kurie J.M.等人,Biochim Biophys
Acta.1993,1179(2):203-7)。这些发现显示：PKC途径活化是RA调控的人类TC分化中的
早期步骤，并且PKC-γ会加强RA对RAR转录活化的效果。因此，此处提供了用以控制hTS
细胞分化的方法。在一个实施方案中，PKC信号传递途径的调节控制hTS细胞分化。

[0180] 骨形态发生蛋白4(BMP4)与LIF一起来支持未分化的mES细胞的扩充。BMP4诱导hES细胞的滋养层分化(Qi X等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2004;101:6027–6032)。Id
蛋白质的BMP诱导与STAT3合作来抑制分化并且维持胚胎干细胞自我更新(Ying,Q.L.等
人,Cell.2003;115:281-292)。骨形态发生蛋白(BMPs)与LIF结合来作用以维持自我更
新并保持多谱系分化、嵌合体聚落形成(chimera colonization)以及种系传递(germline
transmission)性质(Xu RH等人,Nat Biotechnol.2002;20:1261-1264)。因此，在一个实
施方案中，此处提供了一种通过调节PKC和/或骨形态发生蛋白(BMP)来诱导此处所描述
的tNSCs的多巴胺能分化的方法。
疾病的治疗

[0181] 此处提供了一种用于治疗障碍的方法，其中该方法包括将神经元的纯族群或特定的神经干细胞族群的复合体移植至患者，其中该患者是有此需要的。在一个实施方案中，
该患者被诊断为患有神经疾病。在另一实施方案中，该患者被诊断为患有神经精神障碍
(neuropsychiatric disorder)。在另一实施方案中，该患者被诊断为患有神经退化性障
碍。在另一实施方案中，该神经元的纯族群包含多巴胺能神经元。

[0182] 此处所描述的任何方法可以用来治疗疾病(disease)或障碍(disorder)。在一个实施方案中，该疾病是神经疾病。在另一实施方案中，该疾病是神经退化疾病或障碍。神经障碍的非限制性实例包括：帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、肌萎缩侧索硬化症、弗里德赖希共济失调、路易氏体症、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化症、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、脑神经障碍、周边感觉神经病变、癫痫、朊病毒障碍、克雅氏病、阿尔珀斯病、小脑/脊髓小脑退化、巴滕病、皮质基底核退化、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病以及自闭症。

[0183] 因此，此处所描述的tNSCs适合用于治疗神经退化性障碍，包括但不限于：帕金森氏症、阿尔兹海默症、亨廷顿氏症、脊髓损伤、青光眼(glaucoma)等。

[0184] 此外，tNSCs也表达神经递质5-羟色胺。因此，一个实施方案描述tNSCs在治疗神经精神障碍中的用途。神经精神障碍的非限制性实例包括：忧郁(depression)、精神分裂
症、痴呆、自闭症、注意力缺陷伴多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder)以及躁郁症(bipolar disorder)。

[0185] 此处所描述的任何方法可以用来改善或改进神经疾病或障碍的症状。与神经疾病或障碍有关的症状的非限制性实例包括：震颤、步态障碍、不良性步态、痴呆、过度肿胀(水肿)、肌无力、下肢萎缩、运动障碍(舞蹈病)、肌肉僵直、物理运动的减慢(运动迟缓)、物理运动的缺失(运动失能症)、健忘、认知(智能)损伤、辨识的缺失(失识症)、受损的功能
(诸如决策与计划)、单侧面麻痹、感觉缺失、麻木、刺痛感、四肢的疼痛感觉异常、虚弱、脑神经麻痹、语言障碍、眼球运动、视野缺损、失明、出血、分泌物、近端肌萎缩、运动困难症、四肢肌肉张力的异常、肌强直减少、动作失调、在手指-手指测试或手指-鼻测试中错误的指
示、辨距不良、霍-斯二氏现象、不完全的或完全的全身性麻痹、视神经炎、视物显多症、眼球运动障碍(诸如眼球震颤)、痉挛性麻痹、痛苦的强直发作、莱尔米特综合征、共济失调、语言困难、膀胱直肠障碍、起立性低血压、运动功能的减退、尿床、贫乏的言语表达、不充足的睡眠型态、睡眠障碍、食欲障碍、体重改变、精神运动性激动或迟滞、减少的活力、无价值的感受或过度或不适当的内疚、思考或全神贯注困难、反复的死亡意图或者自杀的意念或
企图、害怕、焦虑、兴奋增盛、沉思的或强迫性沉思、过度担心身体健康、恐慌发作以及恐惧症。

[0186] 此处描述了具有下列某些所需特性的tNSCs：首先，该tNSCs是由具有表型一致性、稳定的基因表达以及多能特性的异质性亚型(heterogeneous subtypes)所组成的
混合的细胞族群；其次，它们含有实质上加强多巴胺能神经生成的神经胶质祖细胞(glia
progenitor cells)以及星形胶质细胞；第三，它们具有用于“挽救”功能异常的多巴胺能神经元的内在能力以及免疫豁免的性质；最后，来自宿主组织上的不同的神经前体的神经滋
养效果将会促进结构修复(structural repair)。

[0187] 在一些实施方案中，此处提供了具有允许在移植治疗中适当操作的下列某些所需特性的tNSCs：1)该独特的tNSCs在品质上的一致性以及充足的细胞来源方面被RA简单
且有效地诱导；2)经移植的tNSCs在损伤的黑质纹状体途径(nigrostriatal pathway)
中功能性地新生成多巴胺能神经元，它在植入后可以存活至少18周；3)感觉运动损伤
(sensorimotor impairments)早在植入后的第3周就得到显著地改善；4)该tNSCs具有免
疫豁免，促进干细胞治疗；5)如此处所描述的对细胞增殖的分子机制的操控允许发展用于
在移植之后预防肿瘤形成的策略；6)该tNSCs经由数个细胞传代能够在培养中生长；以及
7)该tNSCs能够在无小鼠胚胎饲养细胞的培养基中培养。

[0188] 在一个实施方案中，此处提供了一种用于治疗急性以及慢性疾病的方法，其中该方法包括植入hTS细胞衍生的tNSCs。在一个实施方案中，该tNSCs被植入到患有神经障碍
的患者的脑内。在另一实施方案中，该tNSCs被植入到患有神经障碍的患者的纹状体内。

[0189] 此处所描述的一个方面是一种用于治疗神经疾病的方法，其中该方法包括tNSCs的位点特异性整合(site-specific integration)。在一个实施方案中，该tNSCs衍生自
hTS细胞。在另一实施方案中，与hES细胞治疗相比，肿瘤形成的可能性是较低的。
通过多巴胺能神经元的再生来治疗神经退化疾病

[0190] 此处提供了用于在哺乳动物中诱导多巴胺能神经元的方法，其中此处所描述的神经元祖细胞作为细胞悬浮液进行移植，从而产生与组织块的移植物相比更均质的神经再支
配(reinnervation)。在一个实施方案中，如此处所描述的多巴胺能神经元的诱导降低运动失调(dyskinesias)的风险并且增加临床上有益的效果的可能性。在一个实施方案中，该
哺乳动物是人类。在另一实施方案中，该哺乳动物是大鼠、小鼠、猪、犬、猴、猩猩或人猿。

[0191] tNSCs的移植在黑质纹状体途径中诱导新生成的多巴胺能神经元并且实质上改善了帕金森氏症大鼠中的行为障碍。这些结果提供的证据证明了hTS细胞是适合在临床应用
中使用以治疗神经退化疾病的人类多能干细胞。

[0192] 进行第一实验以检测：1)用RA处理不同持续时间的tNSCs是否会影响改善PD大鼠中的行为缺陷(behavioral deficits)的效力；以及2)如此植入的tNSCs在脑中能存活
6
多久。根据阿朴吗啡诱导的旋转分析，将GFP标记的tNSCs(1.5×10)移植到损伤的纹状
体的2个部位内从第3周直到第12周显著地改善行为缺陷(图5a)。接受5天RA-诱导的
tNSCs的PD大鼠在植入后6周的开始时显著地改善，然而，此效果在第12周后消失而与对
照组相似。此原因可以被解释为大多数的神经遗传命运限制的GRP 在诱导超过5天
之后处于向未定义的滋养层巨细胞分化的脊(ridge)处。如有行为改善，大鼠在第18周时
处死以检测那些GFP标记的tNSCs的活力。脑部切片以免疫组织化学方式显示了在黑质纹
状体途径中大量新生成的多巴胺能神经元，它们具有从细胞体中突起的多重外生长，再支
配周围的脑区域(图5b)。然而，在接受5天RA-诱导的tNSCs(图5c)以及对照PD组(图
5d)的大鼠中，未观察到此现象。在第18周，免疫荧光显微术证明GFP标记的tNSCs仍然存
在于损伤的区域中，且呈散布的或斑点模式分布在注射部位。未发现畸胎瘤形成(teratoma formation)，也未使用免疫抑制剂。

[0193] 为了避免来自多巴胺能过度生长以及不均匀且不一致的神经再支配的不利影响，第二实验试图将较少的tNSCs(1×106)通过注射在一个部位上来移植至“老年”PD大鼠(n
＝16；体重630-490gm)的损伤的纹状体内。行为评估在植入后每3周进行分析。结果显示：
在阿朴吗啡诱导的旋转测试中，从植入后的第3周至第12周对侧的旋转得到显著改善(图
6a)。为了评估细胞治疗对姿势不平衡(postural imbalance)以及步态障碍(PIGD)(特征
为运动失能症、僵硬以及步伐与平衡障碍)的效果，进行数种测试(诸如步行速度、步伐长
度、跨步长度以及支撑的基础)。受影响的前肢在杠上的抓握时间显著地缩短了3周并且在
“杠测试(bar test)”中于第12周结束时持续改善(图6b)，这表明前肢的抓取力量得到非
常快速的改善。步伐长度(图6c)、跨步长度(图6d)、步行速度(图6e)以及支撑的基础
(图6f)的测量显示tNSCs的移植从第3周早期至第12周在功能上显著地改善感觉运动
障碍。在一个实施方案中，该tNSCs在再生医学上是合适的候选物，以用于在神经退化疾病(例如，帕金森氏症)患者中以干细胞为基础的治疗。在第12周结束时，处死大鼠并且对脑
部切片进行酪氨酸羟化酶(TH)免疫染色。实验显示在黑质纹状体途径中出现的新的多巴
胺能神经元的再生(图19)。新生成的多巴胺神经元使用密度测定法(densitometry)进行
评估，其显示28.2%的复原。在一个实施方案中，在神经退化疾病患者的治疗中，该tNSCs
是hES细胞以及胎儿中脑组织(fetal mesencephalic tissue)这两者的备选替代物。

[0194] 在一个实施方案中，此处提供了一种hTS细胞，它是除了hES细胞之外的人类多能干细胞，但在早期胚胎形成中具有多能性以及自我更新的相似特性。在体内，经移植的
tNSCs在损伤的黑质纹状体途径中功能性地新生多巴胺能神经元，它们在植入后能在PD大
鼠中存活至少18周。根据在年轻以及老年PD大鼠这两者中进行的一组行为评估，感觉运
动障碍早在植入后的第3周就得到显著的改善。将hTS细胞衍生的NSCs移植至脑的神经
毒素-神经切除的纹状体(neurotoxin-denervated striatum)中能够使缺失的多巴胺能
神经元再生，并改善患有PD的大鼠中的主要行为缺陷。

[0195] 在一个实施方案中，黑质纹状体途径中的DA神经元再生。在另一实施方案中，植入的tNSCs增加纹状体中的神经胶质细胞。在另一实施方案中，RA诱导GRAP以及GFAP-阳
性的祖细胞的表达，这产生遍及CNS的神经元以及少突胶质细胞(oligodendrocytes)。
阿尔兹海默症的治疗

[0196] 此处提供了用于治疗阿尔兹海默症的方法，其中该方法包括将神经元祖细胞移植到哺乳动物的脑中。在一个实施方案中，该哺乳动物是人类。在另一实施方案中，该人类是经诊断患有阿尔兹海默症或处于发展阿尔兹海默症的风险中的患者，例如，具有该疾病的
家族史或已被鉴定为具有关于该疾病的风险因子的人。在另一实施方案中，该哺乳动物是
猪、犬、猴、猩猩或人猿。在另一实施方案中，该哺乳动物是小鼠。在另一实施方案中，该哺乳动物是大鼠。在另一实施方案中，该大鼠或小鼠展现阿尔兹海默症的症状。在一个实施
方案中，神经元祖细胞被移植到该疾病的非人类动物模型(例如，其中AD7c-NTP过度表达
的小鼠模型、阿尔兹海默症大鼠模型、转基因小鼠模型等等)中。

[0197] 在一个实施方案中，用诱导剂处理hTS细胞以提供具有生物标记(biomarker)特征的神经元细胞族群。在一个特定的实施方案中，该诱导剂是RA。在一个实施方案中，调节分子机制或信号传递途径以维持多能性。在另一实施方案中，调节分子机制或信号传递途
径以预防在移植之后的肿瘤形成。

[0198] 在另一实施方案中，该tNSCs被移植或嵌入到哺乳动物的脑中。在一个实施方案中，该神经元祖细胞作为细胞悬浮液进行移植，从而产生更均质的神经再支配。在另一实施方案中，该神经元祖细胞被注射到所述哺乳动物的脑内。在另一实施方案中，衍生自hTS细胞的tNSCs被嵌入到脑的脑室下区(subventricular zone)。在一个实施方案中，该哺乳动
物是人类。

[0199] 在一个实施方案中，如此处所描述的神经元的诱导减少肿瘤形成的风险并且增加临床上有益的效果的可能性。在另一实施方案中，tNSCs的接受者显示与阿尔兹海默症有
关的症状得到改善。在另一实施方案中，脑中的神经元之间的连接得到增加并且加强。
精神分裂症的治疗

[0200] 此处提供了用于治疗精神分裂症的方法，其中该方法包括将神经元祖细胞移植到哺乳动物的脑中。在一个实施方案中，该哺乳动物是人类。在另一实施方案中，该人类是经诊断患有精神分裂症或处于发展精神分裂症的风险中的患者，例如，具有该疾病的家族史
或已被鉴定为具有关于该疾病的风险因子的人。在另一实施方案中，该哺乳动物是小鼠。在另一实施方案中，该哺乳动物是大鼠。在另一实施方案中，该哺乳动物是猪、犬、猴、猩猩或人猿。在另一实施方案中，该大鼠或小鼠展现精神分裂症的症状。

[0201] 在一个实施方案中，该神经元祖细胞被移植到该疾病的非人类动物模型(例如，精神分裂症大鼠模型、转基因小鼠模型等等)中。在一个实施方案中，模型小鼠具有改变的神经元系统的正常生理学调节。在另一实施方案中，该模型动物或组织可用于筛选在细胞
内水平上发挥作用的潜在的治疗剂和/或治疗性方案。

[0202] 在一个实施方案中，用诱导剂处理hTS细胞以提供具有生物标记特征的神经元细胞族群。在特定的实施方案中，该诱导剂是RA。在一个实施方案中，调节分子机制或信号传递途径以维持多能性。在另一实施方案中，调节分子机制或信号传递途径以预防在移植之
后的肿瘤形成。

[0203] 在另一实施方案中，tNSCs被移植或嵌入到哺乳动物的脑中。在一个实施方案中，该神经元祖细胞作为细胞悬浮液进行移植，从而产生更均质的神经再支配。在另一实施方案中，神经元祖细胞被注射到所述哺乳动物的脑内。

[0204] 在一个实施方案中，如此处所描述的神经元的诱导减少肿瘤形成的风险并且增加临床上有益的效果的可能性。在另一实施方案中，tNSCs的接受者显示与精神分裂症有关
的症状得到改善。
给药(Dosing)及施用(Administration)

[0205] 此处所描述的经分离的神经干细胞制剂的施用模式包括，但不限于：全身性静脉注射(systemic intravenous injection)以及直接注射到预期的活性位点。该制剂可通
过任何便利的途径[例如，通过输注(infusion)或浓注(bolus injection)]来施用，并且
可与其它生物活性剂(biologically active agents)一起施用。在一个实施方案中，施用
是全身性定位施用(systemic localized administration)。

[0206] 在一个实施方案中，神经干细胞制剂或组合物被配制为适用于静脉内施用至哺乳动物(包括人类)的药物组合物(pharmaceutical composition)。在一些实施方案中，用
于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液(sterile isotonic aqueous buffer)中
的溶液。在必要时，该组合物也包含局部麻醉剂(local anesthetic)以减轻注射部位处的
任何疼痛。当该组合物通过输注施用时，它可使用含有无菌药学级水或盐水(saline)的输
液瓶(infusion bottle)进行分配。当该组合物通过注射施用时，可提供用于注射的无菌
水或盐水的安瓿(ampoule)以使得所述成分在施用之前被混合。

[0207] 在一个实施方案中，适合的药物组合物包含治疗有效量的祖干细胞和药学上可接受的载体(carrier)或赋形剂(excipient)。此载体包括，但不限于：盐水、缓冲盐水
(buffered saline)、右旋糖(dextrose)、水及其组合。

[0208] 在一个实施方案中，此处所描述的分离的tNSCs通过适合用于将细胞靶向至特定组织的递送系统而被递送到靶部位(例如，脑、脊髓或任何其它神经损伤和/或退化的部
位)。例如，所述细胞被囊封在输送载体(delivery vehicle)中，其允许所述细胞在靶部位处缓慢地释出。该输送载体经修饰使得其特异性地靶向至特定的组织。靶向递送系统的表
面以各种不同的方式进行修饰。在脂质体靶向的递送系统的情况下，脂质基团被并入到该
脂质体的脂双层(lipid bilayer)中，以维持靶向配体与脂质体双层(liposomal bilayer)
稳定缔合。

[0209] 在另一个实例中，使用胶体分散系统(colloidal dispersion system)。胶体分散系统包括大分子复合体(macromolecule complexes)、纳米胶囊(nanocapsules)、微球体(microspheres)、珠粒(beads)以及以脂质为基础的系统，包括水包油乳液(oil-in-water emulsions)、微胞(micelles)、混合的微胞(mixed micelles)以及脂质体。

[0210] 此处所描述的tNSCs的施用任选地通过下列方式对个体进行定制：(1)增加或减少注射的细胞数量；(2)改变注射的数量；(3)改变所述细胞的递送方法；或(4)改变细胞
的来源，例如通过基因工程细胞或来自体外细胞培养物。

[0211] tNSC制剂以有效促进细胞植入接受者中的量来使用。在医师的裁量下，调整施用以满足最佳的效力以及药理给药。
筛选的方法

[0212] 此处提供了筛选用于治疗或预防疾病的化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物接触。在另一实施方案中，该方法包括
使经分离的神经干细胞与所述化合物接触。在另一实施方案中，该方法进一步包括检测所
述人类滋养层干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性改变。在另一实施方案中，该方法进一步包括检测所述人类滋养层干细胞中至少一种转录物或蛋白质的水平改变。在另
一实施方案中，该方法包括检测所述神经干细胞中至少一种基因、转录物或蛋白质的活性
改变。

[0213] 此处所提供的一个实施方案描述了一种针对诱导细胞中的改变的能力来筛选化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括使经分离的人类滋养层干细胞与所述化合物
接触。在另一实施方案中，该方法包括使经分离的神经祖干细胞与所述化合物接触。在另
一实施方案中，该方法进一步包括检测对所述人类滋养层干细胞的分化的诱导。在另一实
施方案中，该方法进一步包括检测对所述神经干细胞的分化的诱导。

[0214] 此处还提供了一种针对细胞毒性(cellular toxicity)或细胞的调节来筛选化合物的方法，该方法包括使本发明的经分化的细胞与化合物接触。在另一实施方案中，该方法进一步包括确定该细胞中任何起因于与该化合物接触的表型或代谢改变，以及将该变化与
细胞毒性或任何其它细胞功能或生物化学上的改变进行关联。在另一实施方案中，促进了
对分化的药剂(pharmaceuticals)、毒素或潜在调节子的筛选。可以向培养基添加这些物质(例如，药剂、毒素或潜在调节子)。

[0215] 此处所提供的一个实施方案描述了一种筛选增殖因子(proliferationfactors)、分化因子(differentiation factors)以及药剂的方法。在一个实施方案中，
人类滋养层干细胞或神经干细胞被用来筛选影响人类滋养层干细胞或神经干细胞在培养
中的特性的因子[诸如小分子药物、肽(peptides)、多核苷酸(polynucleotides)等]或
条件(诸如培养条件或操作)。在一个实施方案中，此系统具有不会被由测试化合物所造
成的饲养细胞的干扰而引起的次级效应(secondary effect)所复杂化的优点。在另一
实施方案中，测试了影响生长的物质。在另一实施方案中，从该培养物中撤除条件培养基
(conditioned medium)并用较单纯的培养基予以取代。在另一实施方案中，接着用不同的
可溶性因子的混合物(cocktails)(它们是用于取代该条件培养基的组分的候选物)处理
不同的孔。若经处理的细胞被维持并且以满意的方式增殖(最佳地与在条件培养基中一
样)，则每种混合物的效力得以确定。可以通过依据测试操作程序来处理细胞，并且接着确定经处理的细胞是否发展特定谱系的经分化的细胞的功能性或表型特性，来测试潜在的分
化因子或条件。

[0216] 在一个实施方案中，该人类滋养层干细胞或神经干细胞被用来筛选细胞分化的潜在调节子。在一个实施方案中，该细胞分化是神经分化。例如，在一个用于筛选细胞分化的调节子的分析中，该人类滋养层干细胞或神经干细胞可在无血清、低密度条件(根据情况
需要，在LIF的存在或缺少下、在调节子的存在下，以及在RA的存在或缺少下)下培养，并
且可检测对分化的效果。在另一实施方案中，此处所描述的筛选方法可用来研究与细胞发
育有关的条件以及筛选有关该条件的潜在治疗剂或矫正药物或调节子。例如，在一个实施
方案中，将正常的人类滋养层干细胞或神经干细胞的发育与具有该条件的细胞的发育相比
较。

[0217] 在一个实施方案中，基因以及蛋白质表达可在从人类滋养层干细胞或神经干细胞获得的不同细胞族群之间进行比较，并且被用来鉴定和表征在分化过程中上调或下调的因
子，并且生成受影响的基因的核苷酸拷贝(nucleotide copies)。

[0218] 在一个实施方案中，无饲养细胞的人类滋养层干细胞或神经干细胞培养物也可在药物研究中用于测试药学化合物(pharmaceutical compounds)。候选药学化合物的活性
的评估通常涉及将本发明的经分化的细胞与该候选化合物组合，确定任何所产生的改变，
并且接着将该化合物的效果与观察到的改变进行关联。在另一实施方案中，完成了筛选，例如，因为该化合物被设计成对某些细胞类型具有药理作用(pharmacological effect)，或
因为被设计为在别处具有效果的化合物具有非预期的副作用。在另一实施方案中，两种或
多种药物组合地(通过同时地或依序地与细胞组合)进行测试，以检测可能的药物-药物
交互作用效应(interaction effects)。在另一实施方案中，最初针对潜在的毒性筛选化合物。在另一实施方案中，根据对细胞活力(cell viability)、存活、形态学(morphology)，对某些标记、受体或酶的表达或释放，对DNA合成或修复的作用来确定细胞毒性。

[0219] 本文中的术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”用于指获得所需的药理和/或生理效果。在一些实施方案中，个体(例如，疑似患有神经退化性障碍和/或在遗传上有神经退化性障碍患病倾向的个体)用此处所描述的tNSCs制剂进行预防性治疗，并且该
预防性治疗完全地或部分地预防神经退化性障碍或者它的征兆或症状。在一些实施方案
中，个体接受治疗性治疗(例如，当个体患有神经退化性障碍时)，该治疗性治疗造成对于
障碍的部分或完全治愈(cure)，和/或逆转可归因于该障碍的副作用，和/或稳定该障碍，
和/或延缓该障碍的进展，和/或造成该障碍的消退。

[0220] 将tNSCs施用(例如，移植)至有治疗需要的区域是通过，例如并且不受限地，手术期间的局部输注、通过注射、通过导管(catheter)的方式，或通过植入物(implant)的方式来完成的，所述植入物是多孔性(porous)、非孔性(non-porous)或凝胶状材料，包括膜，诸如硅胶膜(silastic membranes)或纤维。

[0221] 将组合物“移植(transplanting)”至哺乳动物中意指通过本领域所建立的任何方法来将该组合物导入到该哺乳动物的体内。被导入的组合物是“移植物(transplant)”，并且该哺乳动物是“接受者(recipient)”。该移植物以及该接受者可以是同源的
(syngeneic)、同种异体的(allogeneic)或异种的(xenogeneic)。此外，该移植可以是自体移植。

[0222] “有效量(effective amount)”是足以达到预期目的的治疗剂的量。例如，用于增加hTS细胞或tNSCs数目的因子的有效量是足以在体内或在体外(视情况而定)导致神经干细胞数目增加的量。用于治疗或改善神经退化疾病或病况的组合物的有效量是足以减少
或消除神经退化疾病或病况的症状的组合物的量。给定的治疗剂的有效量将会随着诸如试
剂的性质、施用的途径、要接受治疗剂的动物的大小与物种以及施用的目的等因素而变化。

[0223] 在一个实施方案中，此处进一步提供了遗传修饰的tNSCs。操控改变了细胞的各种不同的性质，例如，使它更适应于或抵抗特定环境条件，和/或诱导由其生成一种或多种特定物质，所述物质可以例如改善细胞的活力。可以进行此类遗传改变以使该细胞更适
合在移植中使用，例如，以避免接受者对该细胞的排斥(有关基因治疗操作程序的综述，
参见Anderson,Science,256:808；Mulligan,Science,926；Miller,Nature,357:455；Van Brunt,Biotechnology,6(10):1149；以及Yu等人,Gene Therapy,1:13)。

[0224] “载体(vector)”意指重组DNA或RNA构建体，诸如质粒(plasmid)、噬菌体(phage)、重组病毒，或者其它的载体，当导入到适当的宿主细胞中会产生对此处所描述的祖细胞的修饰。适当的表达载体是本领域普通技术人员所熟知的，并且包括那些在真核和/或原核细胞中可复制的表达载体和维持游离型(episomal)的表达载体或整合至宿主细胞
基因组内的表达载体。

[0225] 载体的构建使用此处所描述的技术来完成，例如，如在Sambrook等人,1989中所描述的。在一个实施方案中，经分离的质粒或DNA片段以希望生成质粒的形式进行切割、
裁剪以及再连接。若需要，使用任何适合的方法执行用于确认所构建的质粒中的正确序列
的分析。用于构建表达载体、制备体外转录物、将DNA导入宿主细胞中以及执行有关评估基因表达及功能的分析的适合方法是已知的。基因呈现、扩增和/或表达直接在样品中进行
测量，例如，通过传统的Southern印迹法(Southern blotting)、用以定量mRNA的转录的
Northern印迹法(Northern blotting)、斑点印迹法(dot blotting)(DNA或RNA分析)或
原位杂交法(in situ hybridization)(使用可以此处所提供的序列为基础的适当标记的
探针)。

[0226] 如此处所用的，诸如“转染(transfection)”、“转化(transformation)”等术语意指将核酸以功能形式转移到细胞或生物体。此类术语包括各种不同的将核酸转移到细胞的方法，包括用CaPO4转染、电穿孔(electroporation)、病毒转导(viral transduction)、脂转染(lipofection)、使用脂质体和/或其它输送载体递送。

[0227] 通过亲和力技术(affinity techniques)或通过细胞分选(cell sorting)[诸如荧光活化细胞分选(fluorescence-activated cell sorting)]对细胞进行分选，其中它们
用适合的标记物进行标记，诸如偶联至例如反义核酸分子或免疫球蛋白或其一部分上的荧
光团(fluorophore)，或者内生性荧光蛋白质(intrinsically fluorescent protein)，诸
如绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)或它的变异体。如此处所用的，“分选(sorting)”意指第一细胞类型与第二细胞类型的至少部分物理分离。

[0228] 如此处所用的，术语“大约(about)”意指±15%。例如，术语“大约10”包括8.5至11.5。
实施例
材料

[0229] 抗体。用于免疫印迹法 (immunoblot) 以及免疫细胞化学法(immunocytochemistry)：第一抗体：SSEA-1、-2、-3、CD90以及巢蛋白(Chemicon)。神经丝以及GFAP(BioGenex)。Nanog、Oct4、Cdx2以及Sox2(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)。
Gαq/11(C-19,sc-392)、Gβ(T-20,sc-378)、RXRα、RARβ、c-Src、pStat3、Stat3、PP1类似物以及β肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)、TH(Sigma-Aldrich
St.Louis,MO and Temcoula,CA)以及5-羟色胺(Sigma-Aldrich St.Louis,MO)。

[0230] 第二抗体：

[0231] siRNAs：Nanog siRNA以及Cdx2siRNA(Sigma-Aldrich St.Louis,MO)。

[0232] 用于流式细胞术的第一抗体：HLA-ABC、CD9、CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CK7、波形蛋白、6-整合蛋白、E-钙黏素、L-选择素、Nanog、Oct4、Cdx2以及Sox2购自于BDBiosciences,San Jose,CA,USA；HLA-DR、CD33、CD44以及CD105来自于eBioscience,San
Diego,CA,USA；CD133来自于Miltenyi Biotec,Germany。

[0233] 为了进行TH-2以及5-羟色胺免疫染色，细胞用PBS洗涤之后在4℃下于0.1M PBS中孵育过夜。在室温下与封闭溶液(50mL0.1MPBS、0.05g叠氮钠、1%马
血清以及10%Triton X-100)孵育1小时之后，再次洗涤细胞。细胞与第一抗体，即
TH-2(1:200,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)以及5-羟色胺(1:100,Sigma-Aldrich,St.
Louis,MO)孵育2 小时并且用 PBS洗涤。通过与带有FITC 或PE的抗小鼠
IgG(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)孵育1小时，用PBS彻底地洗涤细胞并且进行免疫荧光
分析。
实施例1：分离、分化以及细胞培养

[0234] 胚胎绒毛膜绒毛(Embryonic chorionic villous)经由腹腔镜手术(laparoscopic surgery)从妇女体内的早期异位妊娠(孕龄：6-8周)的输卵管
获得，由人体研究及伦理委员会的机构审查委员会(Institutional Review Board
on Human Subjects Research and Ethics Committees)所批准。组织在无血
清的 α-MEM(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中被绞碎并且用0.025%胰蛋白酶 /
EDTA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)胰蛋白酶化15分钟，通过添加含有10%FBS的α-MEM
终止该消化。重复此操作程序数次。在离心之后，收集细胞并且在37℃下于5%CO2中用含
有20%FBS(JRH,Biosciences,San Jose,CA)和1%青霉素-链霉素的α-MEM培养。在培养
2代之后通过商业试剂盒(Dako,Carpinteria,CA)测量，培养基中的hCG表达变得无法检
测。

[0235] 细胞分化：hTS细胞在37℃下于5%CO2中被培养于含有20%FBS、1%青霉素-链霉素和10μg/mL bFGF的条件α-MEM(CytoLab Ltd,Rehovot,Israel)中。培养基每3天更
换。在5代之后，使用经过改良的已公开的操作程序启动向各种不同的特化表型的分化。
关于在Transwell板(Corning,New York,NY)中的细胞培养，上层小室涂覆有500μL的
4:1比例的含有PureCol的胶原蛋白凝胶(Inamed Biomaterials,Fremont,CA)以及条件
5
L-DMEM(Gibco,Grand Island,NY)(使用1M NaHCO3调整至pH7.4)。细胞(4×10)培养于
上层小室上的条件L-DMEM(1mL)中。下层小室含有条件H-DMEM(3mL)。初步的实验显示：
在这两个小室中的葡萄糖水平可能在4小时内达到平衡状态。

[0236] 亚表型的细胞分化：细胞在37℃下于5%CO2中被培养于含有20%FBS、1%青霉素-链霉素和10μg/mL bFGF的条件α-MEM(CytoLab Ltd,Rehovot,Israel)中。一般而言，
培养基每3天更新。在培养5代之后，通过如图12的表中所示的各种不同的策略进行向各
种不同的特定细胞表型的分化。对于成骨分化(osteogenic differentiation)，使用茜素
红S试验(Alizarin red S assay)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)来分析细胞化学矿物基
质(cytochemical mineral matrix)以检测钙矿物质含量。为了鉴定钙沉积物，将细胞固定并且在黑暗中与2%硝酸银溶液(w/v)孵育10分钟，接着用去离子水彻底地洗涤并暴露于
亮光下15分钟。使用商业试剂盒(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)以von Kossa染色处理细
胞，以检测碱性磷酸酶活性。在酸性pH水平下使用阿尔新蓝染色(Alcian blue staining)
(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)来确认成软骨分化(Chondrogenic differentiation)。
对于成肌分化(myogenic differentiation)，细胞与配于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的3%
过氧化氢孵育10分钟以消除内源性过氧化酶酶活性。非特异性位点用含有10%人血清
和0.1%Triton X-100的PBS封闭60分钟并且用封闭缓冲液洗涤5分钟。细胞在含有骨
骼肌肌球蛋白重链特异性单克隆抗体(skeletal muscle myosin heavy chain-specific
monoclonal antibody)的封闭缓冲液(Vector Laboratories,Burlingame,CA)中孵育1
小时，接着使用VectaStain ABC试剂盒(Vector Laboratories)进行染色。对于脂肪生
成性分化，用条件培养基诱导细胞，并且在含有1%钙的4%低聚甲醛(paraformaldehyde)
中固定60分钟，接着以70%乙醇洗涤。在暴露于2%油红O试剂(Oil red O reagent)
(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)5分钟之后，用70%乙醇继而通过水漂洗来移除过度的染
色。油红O染剂用作细胞内脂质积累的指示剂。神经干细胞用配于乙醇中的10μM全反式
视黄酸(all-trans retinoic acid)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)来诱导。
实施例2：质粒转染

[0237] 为了进行质粒转染，hTS细胞如先前所述用全反式视黄酸(10μM)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)诱导过夜，继而在F1B-GFP的DNA混合物中共转染
(Myers)。简言之，在4℃下将DNA混合物缓慢地添加到含有DOTAP(30μL)脂质体转染试
剂(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)和70μL HBSS缓冲液[含有NaCl(867g
配于80mLH2O中)]的DOTAP(100μL)溶液加2mL HEPES溶液(1M,pH7.4,Gibco)中，历时
15分钟。在用PBS洗涤之后，细胞与DNA混合物充分地混合。在孵育过夜之后，通过培养
2-3周直到集落形成为止经G418选择(400μg/mL,Roche Applied Science)而获得稳定
的细胞株。合并和裂解G418-抗性细胞并且通过使用单克隆抗GFP抗体(Stratagene,La
Jolla,CA)的Western印迹法(Western blotting)进行分析以定量表达GFP的转染子的百
分比。通过传代培养(subcultures)，经转染的hTS细胞用甲醇固定(10分钟)以通过免疫
荧光法(immunofluorescence)来检测GFP的表达。转染率获得超过95%的效力。
实施例3：RT-PCR及定量PCR(qPCR)

[0238] 为了进行RT-PCR，使用TRIZOL试剂(Invitrogen)提取来自于105-106个细胞的总RNA，并且使用Ready-To-Go RT-PCR Beads试剂盒(Ready-To-Go RT-PCR Beads kit)
(Amersham Biosciences,Buckinghamshire,UK)来测定mRNA表达。简言之，反应产物于
1.5%琼脂糖凝胶上解析并且用溴化乙锭(ethidium bromide)来显影。β-肌动蛋白或
β-2微球蛋白(β-2microglobulin)用作阳性对照。全部实验执行3个重复。关于qPCR，
基因表达用iQ5实时PCR检测系统(iQ5Real-Time PCR Detection System)(Bio-Rad
Laboratories)进行测量并且用Bio-Rad iQ5光学系统软件2.0版(Bio-Rad iQ5Optical
System Software,version2.0)(Bio-Rad Laboratories)进行分析。相对mRNA水平使用比
较Ct法(comparative Ct method)(Bio-Rad，使用手册)进行计算并且表示为相对于生物
对照的比例。全部引物对经确认在一个循环内大约使产物的量加倍并且产生预期大小的单
一产物。
实施例4：Western印迹法

[0239] 将细胞接种至具有无血清培养基的10cm皿中过夜，并且用或不用RA(10μM)处理如所指示的多个时间间隔。在刺激之后，细胞用冰冷的PBS洗涤两次并且用RIPA裂解
缓冲液(RIPA lysis buffer)(Minipore)裂解。蛋白质浓度通过BCA蛋白质检测试剂盒
(BCAprotein assay kit)(Thermo)来测定。等量(30μg)的蛋白质通过8%SDS-PAGE来解
析，转移至PVDF膜上并且在室温下用5%脱脂奶粉封闭1小时。在封闭之后，该膜在4℃
下与第一抗体孵育4小时。细胞用PBST洗涤3次，接着在室温下与HRP偶联的第二抗体
孵育1小时。在用PBST缓冲液洗涤6次之后，该膜与化学发光底物(chemiluminescent
substrate)(GE Healthcare)孵育1分钟。特定的条带使用增强化学发光试剂盒(enhanced
chemiluminescence kit，ECL)(Amersham)来显影。
实施例5：Southern印迹法

[0240] hTS细胞的端粒长度如先前所述在第3代和第7代通过Southern免疫印迹分析进行测量(Tsai)。简言之，将片段转移到Hybond N+尼龙膜(Hybond N+nylon membranes)
(Amersham Biosciences)并且在65℃下与使用Ready-To-Go标记珠粒(Ready-To-Go
32
labeling beads)(Amersham Biosciences)以α- P-dCTP标记的TTAGGG重复序列的探针
杂交。末端限制片段通过与互补于端粒重复序列的标记的寡核苷酸杂交进行显影。TRF的
大小分布与DNA长度标准进行比较。
实施例6：末端限制片段(TRF)Southern印迹法

[0241] 自细胞启动它的癌变以后，它的端粒将会变得非常短。端粒长度在hTS细胞的培养中于第3以及第7代进行测量。简言之，将片段转移到Hybond-N+尼龙膜(Amersham
Biosciences)并且在65℃下与使用Ready-To-Go标记珠粒(Amersham Biosciences)以
32
α-[ P]-dCTP标记的TTAGGG重复序列的探针杂交。末端限制片段通过与互补于端粒重复
序列的标记的寡核苷酸杂交进行显影。末端限制片段的大小分布与DNA长度标准进行比
较。关于电子显微术，hTS细胞衍生的葡萄样细胞群(hTS cell-derived grape-like cell mass)通过透射电子显微术(JEM-2000EXII,JEOL,Tokyo,Japan)进行检测以鉴定细胞的基
础结构。

[0242] Oct4、Sox2、NANOG、fgfr2、FGF4、BMP4、Cdx2以及内源性对照β-肌动蛋白(ACTB)在hTS以及用500单位LIF(Chemicon,Temecula,CA)处理的hTS细胞中的差异性
基因表达通过使用荧光素(fluorescein)作为用于标准化孔间光学偏差(well-to-well
optical variation)的内部被动参考染料(internal passive reference dye)的IQ5实
时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories)进行测量。在含有12.5μL的2X SYBR Green
supermix(Bio-Rad)、0.5μL的10μM的各个引物以及0.5μL的cDNA样品并与无菌水混
合的25μL总体积中进行PCR扩增。反应开始于95℃，3分钟；接着是60个由95℃下变性
(denaturation)30s、60℃下退火(annealing)30s、72℃下延伸(extension)15s所构成的3
步扩增循环。在最终解离阶段，运行以生成用于确认扩增产物特异性的解链曲线(melting curve)。通过Bio-Rad IQ5光学系统软件2.0版(Bio-Rad IQ5optical system software
version2.0)(Bio-Rad)监测并分析实时qPCR。相对mRNA水平使用比较Ct法(Bio-Rad使
用手册)进行计算并且表示为相对于生物对照的比例。ACTB转录物水平经确认与总RNA量
非常相关，因而始终用于标准化。全部使用的引物对经确认在一个循环内大约使产物的量
加倍并且产生预期大小的单一产物。Oct4、Sox2、NANOG、fgfr2、FGF4、BMP4、Cdx2以及内源性对照β-肌动蛋白(ACTB)的引物序列示于所附的数据表3中。

[0243] OCT4-F:CCATCTGCCGCTTTGAGG

[0244] OCT4-R:ACGAGGGTTTCTGCTTTGC

[0245] ACTB-F:GATCGGCGGCTCCATCCTG

[0246] ACTB-R:GACTCGTCATACTCCTGCTTGC

[0247] CDX2-F:GTGTACACGGACCACCAGCG

[0248] CDX2-R:GGTGGCTGCTGCTGCTGTTG

[0249] MIG7-F:TCCACTACCAAGAGACAGGCTT

[0250] MIG7-R:TCAAGCTGTGTTGCACCCAA

[0251] IPF-1-F:GGAGGAGAACAAGCGGACGC

[0252] IPF-1-R:CGCGCTTCTTGTCCTCCTCC表1.用于基因表达的各种不同的PCR引物
实施例7：免疫细胞化学法

[0253] 培养物在室温下用4%低聚甲醛固定30分钟，接着用PBS洗涤3次。如制造商所推荐的，LSAB试剂盒(Dako,CA)用于免疫细胞化学染色。为了进行SSEA-1与SSEA-4染色，
细胞用tris-磷酸盐缓冲盐水(tris-phosphate buffered saline，TBS)漂洗并用H2O2洗
涤10分钟。在使用山羊血清(1:200，Dako)阻断反应30分钟之后，细胞接着与第一抗体
孵育过夜。在用TBS洗涤细胞并用链霉抗生物素蛋白(streptavidin)处理20分钟之后，
将细胞用生物素(biotin)染色(20分钟)，再次洗涤，并用3,3’-二氨基联苯胺四氯化物
(3,3’-diaminobenzidine tetrachloride)(Boehringer-Mannheim,Mannheim,Germany)处
理10分钟。最后，细胞用苏木精染料(hematoxylin stain)进行复染色。为了进行SSEA-3
染色，遵循相似的操作程序，除了在用H2O2洗涤之前添加经回收的抗原(它是在柠檬酸盐缓冲液中使用高压锅历时15分钟获得的)之外。最后，用PBS彻底地洗涤细胞并进行免疫荧
光分析。
实施例8：免疫沉淀(IP)

[0254] 细胞经血清剥夺(serum-deprived)过夜并且用RA(10μM)处理30分钟。在用蛋白G-琼脂糖(protein G-agarose)(Minipore)预清除30分钟之后，添加特异性抗体或
IgG并且孵育过夜。通过与蛋白G-琼脂糖孵育2小时，用RIPA裂解缓冲液洗涤珠粒3次，
在缓冲液中煮沸，通过8%SDS-PAGE解析，并且针对如所示的各种不同的靶标进行免疫印迹
分析。
实施例9：流式细胞术

[0255] 细胞(5×106细胞/mL)与各种不同的第一抗体孵育30分钟，接着在4℃下在经调节的稀释下与适当的异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-、藻
红素(phycoerythrin，PE)-或Rho-偶联的第二抗体(Jackson ImmunoResearch，West
Grove,PA)孵育1小时。在彻底洗涤之后，使细胞再悬浮于PBS(1mL)中，接着进行流式细胞
术(FACScan,BD Biosciences,San Jose,CA)。数据用Cell-Quest软件(BDBiosciences)
进行分析。
实施例10：微阵列

[0256] 用或不用RA(10μM)各自处理hTS细胞1天和5天。总RNA使用TRIzol试剂提取，并依据制造商的操作程序(Santa Clara,CA,http://www.affymetrix.com)
使用 Affymetrix人类基因组U133plus2.0基因芯片 (Affymetrix Human Genome
U133plus2.0GeneChip)进行Affymetrix微阵列分析[在国立台湾大学医学院的基因组医
学研究中心(台北，台湾)执行]。
实施例11：双免疫金电子透射显微术(IEM)

[0257] 细胞(接受或未接受RA(10μM)处理)如先前所述(Tsai等人)进行检测。简言之，经固定的超薄切片用5%偏过碘酸钠(sodium metaperiodate)的水溶液进行预处理(10
分钟)并且用蒸馏水洗涤。载网与一小份抗RXRα(1:50)或Gαq/11(C-19;sc-392;1:50)的
IgG抗体(aliquot)孵育，继而用第二抗小鼠的6nm金粒子(1:10;AB Chem,Dorval,Canada)
或抗兔IgG的20nm金粒子(1:10;BB International,UK)来探测。载网在孵育步骤之间用
PBS洗涤并且通过将载网放置在1滴含有1%卵白蛋白(ovalbumin)的PBS上来封闭切片
(15分钟)。在IgG金之后，载网用PBS继而用蒸馏水予以喷射洗涤。全部步骤在室温下执
行。切片接着用乙酸双氧铀(uranyl acetate)以及柠檬酸铅(lead citrate)进行染色并
且在Hitachi H-700型透射电子显微镜(Hitachi Ltd.,Japan)上进行表征。
实施例12：共焦免疫荧光显微术

[0258] 细胞在涂覆有2%明胶(gelatin)的盖玻片上培养过夜并且用或不用RA(10μM)各自处理5、15以及30分钟。接着，用PBS漂洗细胞3次，用配于PBS中的4%低聚甲醛固定
5分钟，并用配于PBS中含有0.4%Triton X-100的2%FBS通透化(permeabilized)15分钟。
此反应在4℃下用5%FBS阻断过夜，继而在4℃下与配于PBS中的第一抗体RXRα(1:100)
或Gαq/11(1:100)孵育过夜。在洗涤之后，细胞与Dye Light488或Dye Light549偶联
的第二抗体(1:50;Rockland Immunochemicals Inc.,Gilbertsville,PA)孵育1小时。
通过与DAPI(1:5,000)孵育5分钟，将盖玻片风干并且密封以用于共焦免疫荧光显微术
(Olympus,Tokyo)。
实施例13：对被定义为hTS细胞的人类细胞滋养层独特族群的分析

[0259] 培养从异位绒毛膜绒毛(ectopic chorionic villi)获得的细胞；集落最初形成，并且随后增殖成为附着的成纤维细胞样细胞(fibroblast-like cells)(图1a)。在免
疫细胞化学上，这些细胞表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-1、-3以及-4[stage-specific
embryonic antigen(SSEA)-1,-3,and-4](图1b)。这些SSEA阳性细胞在组织学上呈现为
与异位绒毛膜绒毛中的细胞滋养层相同。然而，在术语胎盘绒毛(placental villi)中，它们主要出现在绒毛核心的隔室处。

[0260] 为了估计干细胞的特性，流式细胞分析显示：这些细胞表达高水平的间质干细胞标记：CD90、CD44、波形蛋白和神经丝，以及高水平的滋养层标记细胞角质蛋
白(cytokeratin)(CK)-7。它们不表达造血干细胞标记：CD34和CD45，以及上皮细
胞标记：E-钙黏素、α6-整合蛋白以及L-选择素。它们也微弱地表达巢蛋白以及
CD9。这些事实显示：这些细胞滋养层不同于从成熟的胎盘组织中分离的滋养层亚族群
(Aboagye-Mathiesen等人,1996;Baczyk等人,2006)。此外，其它的支持性证据包括：1)使
用全反式视黄酸(RA)处理这些细胞致使与先前所描述的(Yan等人,2001)相似的巨细胞
形成(图1d)；2)一系列染色体分析显示未改变的核型(见补充图1a)；3)随后的端粒长度
的测量证实染色体稳定性(见补充图1b)；以及4)细胞植入到重度联合免疫缺陷小鼠上产
生阳性免疫嵌合反应(positive immune chimeric reaction)(见补充图1c)。总而言之，
这些经分离的细胞可能代表高度同质性的细胞滋养层的族群，展现出间质干细胞的特性。
因此，这些细胞被视为hTS细胞。
实施例14：hTS与hES细胞之间的遗传以及生物学特性上的相似性

[0261] 为了研究hTS细胞的基因谱(gene profiling)，使用各种不同的引物执行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)(见补充表1)。结果显示hTS细胞不仅表达TS细胞标记(Cdx2、
BMP4、Eomes以及Fgfr-2)并且也表达ES细胞标记(Oct4、Nanog、Sox2以及FGF4)(图1a)。
通过比较使用Affymetrix人类基因组U133plus2.0基因芯片(Santa Clara,CA,http://
www.affymetrix.com)所分析的全基因谱(global gene profiles)，hTS细胞在基因分布
上不同于PDMS细胞(C.-P.Chen博士惠赠)(图2b)。

[0262] 有趣地，hTS细胞展现出ES细胞的3种胚层的基因表达，包括：中胚层的骨桥蛋白、骨钙素、基底膜聚糖(perlecan)、Π型胶原蛋白、肌细胞生成素、myo D1、PPARγ-2以及降脂蛋白；外胚层的神经丝、神经原素(Ngn)-3、CD133、MAP-2、Neo-D以及巢蛋白；以
及内胚层的胰岛素、Pdx-1、CK-19、生长抑素(somatostatin)、Isl-1、Nkx-2.2、Nkx-6.1以及Pax-6(图2c)。在功能上，通过使用经过修改(见补充表2)的适当的方案(In't
Anker等人,2004;Fukuchi等人,2004;Yen等人,2005)，hTS细胞能够分化成为具有中
胚层谱系的特化表型，如在hTS细胞中所看到的，它包括骨细胞(osteocyte)、软骨细胞
(chondrocyte)、肌细胞(myocyte)以及脂肪细胞(adipocyte)(图2d)。hTS细胞经选择
性地诱导分化成为多巴胺能NSCs以及可生成胰岛素的胰岛祖细胞(insulin-producing
islet progenitor cells)(参见下面)，作为分别衍生自外胚层以及内胚层的那些细胞的
代表。这些结果证明：hTS细胞具有hES细胞(它能分化成为3种胚层的特化表型)的遗
传以及生物学特性。
实施例15：Nanog通过LIF撤除维持人类滋养层干细胞的多能性

[0263] 由于hTS细胞表达胚胎干(ES)细胞以及滋养层干(TS)细胞这两者的多能基因标记(诸如Oct4、Nanog、Sox2以及Cdx2)(图1a)，检测了LIF撤除对人类滋养层干(hTS)细
胞的效果。hTS细胞用不同剂量的LIF[即500(模拟在壶腹处)、250(模拟在中部处)以及
125单位(模拟在峡部处)]处理各3天，显示：LIF以剂量依赖的方式促进Oct4表达但抑
制Cdx2、Nanog以及Sox2表达(图1b)。定量PCR分析支持这些发现(图1c)。因为Oct4
相对于Cdx2的相对表达比值能在早期胚胎分化中决定细胞命运(Niwa等人,2000)，Oct4/
Cdx2比值(0.4倍)在壶腹处似乎是最高的，它在中部处减少至0.2倍并且变得接近峡部
处的比值(图1d)。此Oct4/Cdx2比值的减少趋势实际上促进朝向滋养外胚层命运的分化
(Niwa等人,2005)。引人注目的是，较高的Nanog/Cdx2比值(2倍)出现于用125单位LIF
处理的细胞，而0.1倍则在500单位LIF下被观察到。这些结果强烈地暗示：作为相对减
少的Oct4表达的回复物(rescuer)的Nanog对于hTS细胞维持多能性而言是重要的决定
因子。与使用500单位的LIF的比例相比使用125单位的LIF的显著高的Nanog/Oct4比
例以及在使用125单位的LIF下Cdx2/Oct4比例的明显增加进一步支持了此回复物的作用
(图1e)。未发现Sox2/Cdx2明显的改变。

[0264] 共同地，这些结果证明：从人类输卵管的壶腹部向峡部的LIF浓度的逐渐撤除主要地诱导hTS细胞中Nanog的提升，由此使它维持hTS细胞的自我更新以及多能特性，模拟
在没有饲养细胞的小鼠ES(mES)细胞以及人类ES细胞生长中的自我更新和多能特性。结
果指示：Nanog在维持hTS细胞的多能性中发挥作用。
实施例16：RA增强Nanog表达

[0265] RA是神经元分化的有效调节子，通常是通过结合至与靶基因(Maden)的调控区中的视黄酸反应元件(RARE)交互作用的核受体。已显示的是：视黄醇(维生素A)(细胞中
RA生成的供给者)在ES细胞中抑制由Nanog的上调所调控的细胞分化(Chen)。检测了RA
在hTS细胞中对Nanog是否展现相似的效果。hTS细胞用RA处理1天接着进行流式细胞
术。结果显示：RA促进Nanog、Oct4以及Sox2的表达但不促进Cdx2的表达(图2f)，这与
通过Affymetrix基因芯片寡核苷酸微阵列生成的微阵列mRNA表达谱(microarray mRNA
expression profiling)是一致的。此外，使用siRNA敲除Nanog抑制RA-诱导的Nanog，
但增加Cdx2的表达。相反地，根据流式细胞术分析，Cdx2siRNA在RA-诱导的hTS细胞中
促进Nanog并抑制Cdx2(图2h)。综上所述，这些结果显示：RA诱导hTS细胞中Nanog的过
度表达，由此RA在决定细胞命运时不会改变Nanog/Cdx2比值。
实施例17：RA促进其受体RXRα活化

[0266] 根据Western印迹分析，RA在5分钟内首先促进其受体RXRα活化，然而，此作用仅持续30分钟。反而，在60分钟内观察到增加的RARβ生成(图2i)。通过免疫沉淀分析
观察到RA直接地与RXRα以及RARβ交互作用(图2j)。此外，根据免疫荧光显微术，活
化的RXRα向核转位，在第15分钟时呈现波峰，并且自此核强度(nuclear intensity)下
降(图2k)。蛋白质Gαq/11亚基在30分钟内也被活化(图21)。为此，可能RA在最初反
应阶段与RAR交互作用而没有细胞视黄酸结合蛋白2(cellular retinoic acid-binding
protein2，CRABP-2，图1d)的辅助。
实施例18：RXRα/RARβ可能属于G蛋白偶联受体(G protein-couple receptors，
GPCR)超家族的成员

[0267] 通过双免疫金电子显微术(double immunogold electron microscopy)观察RXRα与Gαq/11亚基之间的直接交互作用确认了这一观点(图2m)。然后，为了联系RXRα/
RARβ与Nanog之间的关系，免疫沉淀测定分析暗示：RXRα而非RARβ直接地作用于Nanog
的启动子(图2n)。此外，不同于ES细胞，hTS细胞含有主要的RA生成酶：2型及3型视网
醛脱氢酶(RALDH-2以及-3)(图1d)，它能够使hTS细胞将视黄醇(retinol)代谢为RA。被
证明的是：RA是通过与同GPCRs缔合的RXRα/RARβ复合体的直接交互作用以与Nanog的
启动子结合而作用于hTS细胞以生成Nanog。
实施例19：hTS细胞中的RA-诱导的Nanog表达受输卵管中的梯度LIF含量的影响

[0268] 根据流式细胞术，LIF的撤除在hTS细胞中能显著地增强RA-诱导的Nanog表达(图2i)，这暗示：hTS细胞衍生的NSCs处于在LIF的缺乏下能通过RA诱导起祖细胞作用
的地位，维持用于在适当的微环境条件下的神经亚型特化的多能特性。
实施例20：RA经由非RARE途径促进TH表达

[0269] 这些结果显示：通过Western印迹法所测量的，基于RA在5、120和5分钟内分别刺激hTS细胞中RXR-α、RAR-β以及c-Src表达的最初结果，RA诱导非基因组信号传递途
径(图3a)。为了确定RXR-α/RAR-β交互作用是否属于G蛋白偶联的受体(GPCRs)的超
家族，利用双免疫金电子显微术研究G-蛋白Gαq/11与RXR-α之间的交互作用。结果显示：
RXR-α具有与细胞膜处的Gαq/11的结合交互作用(图3b)，并且随后离解的Gαq/11刺激膜
结合的磷脂酶Cβ(membrane-bound phospholipase C beta，PLCβ)以切割PIP2[次要的
膜磷酸肌醇(membrane phosphoinositol)]成为2种第二信使：IP3以及二酰基甘油(DAG)
(图3b)。

[0270] 随后，通过免疫沉淀分析以及使用特定的c-Src抑制剂PP1类似物，RA诱导RXRα、RARβ以及[c-Src]的支架形成(图3c)。
实施例21：RA活化Wnt2B/Fzd6/β-联蛋白途径

[0271] Western印迹分析证明：根据Western印迹法，在4小时以及24小时孵育之后RA显著地上调Wnt2B以及原癌基因(proto-oncogene)FRAT1(图24a)。hTS细胞在使用或不
使用抗Wnt2B的siRNA的情况下与RA孵育过夜。流式细胞分析显示：RA显著地上调Wnt2B
以及它的下游靶标，包括介质蛋白质散乱蛋白3(Dvl3)以及原癌基因FRAT1，导致抑制性糖
原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)，它可以通过siRNA减弱Wnt2B
而被抑制(图24b以及24c)。通过RT-PCR分析也观察到相似的结果(图27)。RA也促进
Fzd6mRNA(7次跨膜受体的卷曲蛋白家族的成员)的过度表达(图24d)。为了证实RA在
Wnt2B调控的Fzd6表达中的作用，我们也分析了Dvl3以及它的下游效应子FRAT1的表达
水平，并且显示：抗Wnt2B的siRNA的存在伴随着GSK3β的减少可能取消RA-调控的Fzd6
的增强(图24b以及24c)。随后，Western印迹分析显示：RA在30分钟至24小时之间显
著地活化β-联蛋白(图24e)。RA在hTS细胞中诱导新的典型Wnt2B/Fzd6/β-联蛋白信
号传递途径，允许抑制性GSK3β稳定化并活化细胞质β-联蛋白。
实施例22：RA调节组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)

[0272] Western印迹分析显示：根据免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)(IP)分析，RA在2小时内促进组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)(一种转录调节酶)的上升，它在RA处理24
小时之后能够直接地与β-联蛋白交互作用(图24f)。此外，我们显示：根据细胞分离测
定，发生β-联蛋白的核转位(图24g)，这支持在RA处理24小时后hTS细胞中典型Wnt2B/
Fzd6/β-联蛋白信号传递途径的存在。这些观察通过共焦免疫荧光显微术得到进一步确
认。在抗HDAC6的siRNA的存在下，β-联蛋白的核定位被阻断(图25)。有趣地，我们发
现：非常早的β-联蛋白表达可能在RA处理之后的第5分钟内在hTS细胞衍生的神经元样
细胞中的细胞膜(突触)处出现。在核中，β-联蛋白通过与TCF/LEF家族的转录因子相
缔合而参与转录调节。细胞分离测定分析显示：此交互作用导致β-联蛋白的核转位(图
24e)。
实施例23：RARβ与Gβ之间以及RXRα与Gαq/11之间的交互作用

[0273] 在hTS细胞中的Western印迹分析证明：RA在第30分钟诱导Gαq/11以及Gβ这两者的快速生成，并且也分别在第30分钟以及第4小时诱导类视黄醇X受体α(RXRα)以
及视黄酸受体β(RARβ)的快速生成(图26a)。实时共焦荧光显微术的分析显示：GFP标
记的RXRα通过RA刺激在数分钟内从细胞溶质隔室快速地向亚细胞区域移动(图26b以
及26c)，在该处它与Gαq/11免疫细胞化学地共表达(图26d)。此现象通过双免疫金透射电
子显微术得到进一步支持，其中RA刺激小的金标记的RXRα与大的金标记的Gαq/11在细胞
膜处的结合(图26e)。根据IP分析，在生物化学上，RXRα物理地与Gαq/11交互作用，并
且使用RXRαsiRNA抑制了该作用(图26f)。根据IP分析，相似的事件在RARβ与Gβ之
间发生，并且使用RARβsiRNA也抑制了该作用(图26g)。IP分析显示选择性c-Src抑制
剂PP1类似物能防止RXRα-RARβ异型二聚物的形成(图26h)，暗示存在允许RXRα以及
RARβ单独地起作用的未知机制。通过双免疫金透射电子显微术所观察到的RA-诱导的金
粒子标记的RXRα在内质网(ER)中的锚定进一步支持了这一观点(图26i)。综上所述，数
据暗示：RA-诱导的RXRα以及RARβ在细胞膜上分别独立地与Gαq/11以及Gβ交互作用。
实施例24：Akt3/mTOR信号传递及mRNA翻译

[0274] 实时PCR(RT-PCR)分析发现：RA诱导RXRαmRNA以及RARβmRNA这两者仅历时15分钟的快速短暂的提升(图28a)，以及在1小时内RARβ以及RXRα的快速的生成(图
26a)。基于下面的事实：在轴突生长核心中存在mRNA的富集且它与神经元中mRNA定位存
在关联，并且RA增强的RARα水平调控树突RNA颗粒中的局部GluR1合成，促使有关神经
元膜处的突触形成的RARα修饰的翻译，着重于检测RXRα的亚细胞mRNA定位是否参与这
些细胞过程。随后，IP分析显示：根据Western印迹分析，RA诱导Gβ与磷脂酰肌醇3-激
酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)之间的结合(图26g)，并且活化PI3K与它的
下游效应子全部的Akt异构型，包括在30分钟至4小时内活化的Akt1和Akt2以及在1小
时内短暂活化的Akt3(图28b)。在用RA处理24小时之后，根据流式细胞术(图28c)以
及RT-PCR分析(图29a)，PI3K抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin)预处理抑制了Akt异构
型的全部表达，显示Gβ/PI3K/Akt信号传递的存在。值得注意地，Akt最近已作为用于促
进神经元存活的轴突外生(neurite outgrowth)的重要调节子出现，RA-诱导的Akt3(4
小时)可能结合至雷帕霉素的机械靶标(mTOR)，通过使用特异性抗体(Cell Signaling
Technology)所检测，它被抗Akt3的siRNA抑制(图28d)，导致在4小时内mTOR在丝氨
酸2448位点处的短暂的磷酸化。然而，此作用在孵育24小时之后消失(图28e)。根据
Western印迹法(图28f)以及流式细胞术(图29c)，使用siRNA的Akt3减弱(knockdown)
抑制了此功能。直接地，Western印迹分析显示：通过RA处理4小时，磷酸化的mTOR与真核
翻译起始因子-4E结合蛋白1(eIF4EBP1)直接地交互作用(图28g)并且活化eIF4EBP1(图
28h)。通过使用siRNA减弱磷酸化的mTOR，eIF4EBP1的磷酸化被抑制；反而延长起始因子
4E(elongation initiation factor4E,eIF4E)的磷酸化被活化(图28h)，这意味着：发生
了eIF4E自eIF4E/eIF4EBP1复合体的分离。eIF4E的磷酸化能导致mRNA的帽依赖的翻译。
总的说来，这些观察解释了RA如何能通过RXRαmRNA以及RARβmRNA的活化来诱导亚细
胞mRNA翻译以分别局部地生成RXRα以及RARβ，因为根据IP分析，通过siRNA所造成的
eIF4E的减弱，RXRα与Gαq/11之间以及RARβ与Gβ之间的交互作用都被抑制(图28i)。
这些结果支持Akt3/mTOR信号传递起到RXRα以及RARβ的局部合成的引发者的作用。虽
然RA刺激延长起始因子4B(eIF4B)的升高，但此作用不受抗mTOR或4EBP1的siRNAs的影
响，暗示在调节eIF4B表达上的另一种机制(图28h)。时空Akt3经由mTOR信号传递促进
用于RXRα以及RARβ生成的亚细胞定位。
实施例25：在多巴胺能特化的主流上的CREB1

[0275] Gβ/PI3K下游效应子Akt1通过丝氨酸133位点处的磷酸化直接地结合以及活化cAMP反应元件结合蛋白1(cAMP responsive element binding protein1,CREB1)(图
30a)。Akt1与CREB1的交互作用被Akt1siRNA抑制(图30b)。根据染色质免疫沉淀(ChIP)
分析，磷酸化的CREB1靶向并且转录多巴胺前体酪氨酸羟化酶(TH)基因(图30c)，它被
CREB1siRNA抑制(图30d)。为此，结果暗示：RA-诱导的RARβ/Gβ/PI3K/Akt1/CREB1途
径在多巴胺能神经生成(dopaminergic neurogenesis)中的TH转录中发挥作用。为了在
体内支持此观点，使用了在损伤的纹状体处接受hTS细胞衍生的滋养层NSCs(tNSCs)的颅
内移植的6-OHDA-诱导的PD大鼠模型。对植入后第12周的脑切片的检测显示：根据免疫
荧光组织分析，在黑质致密部中，在治疗侧中的新生多巴胺能(DA)神经元中观察到CREB1
与TH的共表达(图30e)，这与在正常侧所观察到的相匹配。再生的DA神经元中的TH以
及CREB1这两者的活性比正常的DA神经元中更高(图30f)。有趣地，在DA神经元的核
中观察到明显的CREB1表达。这些发现可以解释为何CREB1-缺失的小鼠易患神经退化
(neurodegeneration)。
实施例26：RXRα/Gαq/11在ER钙调节中的研究

[0276] 30分钟至4小时的Western印迹分析显示：RA诱导Gαq/11的逐渐活化，这触发膜结合磷脂酶C(PLC-β)的催化，导致膜磷酸肌醇PIP2的降解(图21a)以生成与先前所述的
常规Gα信号传递一致的第二信使肌醇(1,4,5)三磷酸[inositol(1,4,5)triphosphate，
IP3]。IP3活化其位于ER处的受体IP3R(图21a)，造成细胞内钙升高(图21b)。为了确
定细胞内钙的起源，将细胞培养于无钙培养基中，其中根据实时活细胞免疫荧光显微术，RA
2+
诱导短暂的细胞内Ca 释放(图21b-a)。ER钙水平的耗竭可能通过添加用于体内稳态
(homeostasis)以及细胞保护(cell protection)的外部CaCl2而回复，展现出钙池调控的
钙离子流入(store-operated calcium entry,SOCE)的图式。ER中的钙释放过程被IP3R
特异性抑制剂2-APB以剂量依赖的方式抑制(图21b-b)。这些结果显示：ER释放的细胞内
钙升高负责hTS细胞中RA-诱导的Gαq/11信号传递途径。

[0277] 在无钙培养基中RA-诱导的ER钙耗竭之后，KCl在hTS细胞中可活化L型钙离子通道(图21b-c)。L型钙离子通道拮抗剂硝苯地平能阻断此信号传递(图21b-d)。细胞内
ER钙的RA调节与L型钙离子通道有关联。
实施例27：CaMKII在激发-神经生成偶合中的研究

[0278] Western印迹分析显示：RA在1-2小时内诱导CaMKII的时空活化(图21a)。免疫沉淀测定分析证明：CaMKII直接地磷酸化并活化CREB1(图21c)，与先前研究是一致的：
CaMKII在激发-转录偶合中局部地将L-型钙离子通道活性编码成针对核CREB的信号。
Western印迹分析显示：真核起始因子4B eIF4B siRNA抑制CaMKII、钙依赖磷酸酶以及
eIF4B的表达(图21d)。轴突含有局部地编码特定蛋白质合成的各种不同的mRNA，包括发
育的神经元中的CaMKII、钙依赖磷酸酶以及CREB1。CREB1能够允许回向运输以用于核中负
责末梢轴突的信号的特定转录过程。外部RA触发的CaMKII的局部蛋白质合成可被hTS细
胞中的eIF4B siRNA抑制。因此，此局部活化的CaMKII信号作用与CREB1相似，暗示基于
细胞外信号的快速诱导型基因转录。

[0279] 短暂的CaMKII结合并活化真核起始因子4B(eIF4B)(图21c)以经由不依赖于帽的途径来启动mRNA翻译机制。Western印迹分析暗示：此作用在RA处理之后被选择性
CaMKII抑制剂KN93抑制(图21e)。此CaMKII/eIF4B信号传递接着整合eIF4B/c-Src/
Nanog信号传递途径以完成用于tNSCs的自我更新以及增殖的、从RXRα/Gαq/11至Nanog的
信号传递途径。这些结果首次探究了Gαq/11信号衍生的CaMKII激发参与tNSCs的自我更
新的维持。

[0280] Western印迹分析以及免疫沉淀测定分析证明：CaMKII结合至并且活化帕金森蛋白2(帕金蛋白)(图21a以及21f)。依次地，帕金蛋白直接地与微管相关蛋白tau(MAPT)交
互作用并且活化微管相关蛋白tau(图21a以及21f)，后者优先地位于轴突中并且刺激微管
装配。因此，MAPT直接地结合至SNCA(图21a以及21g)以形成帕金蛋白/MAPT/SNCA复合
体。当MAPT与微管蛋白交互作用并且活化它时(图21a以及21h)，微管元件(microtubule
element)仅在稳定并促进微管装配的神经元中表达。综合起来，这些结果暗示轴突行为在
早期神经生成中的重要性。
实施例28：钙依赖磷酸酶/NFAT1信号传递的活化

[0281] Western印迹测定分析证明：RA诱导钙依赖磷酸酶的生成(图21a)。用2-APB预处理抑制钙依赖磷酸酶、NFAT1以及MEF2A表达(图21i)，将ER钙与钙依赖磷酸酶分子联
系起来。钙依赖磷酸酶立即去磷酸化NFAT1(T细胞活化以及无反应性的一种关键调节子)，
显示30分钟至2小时的短暂方式(图21a)。如由免疫沉淀测定分析所证明的，此作用也被
2-APB抑制(图21h)，将ER钙与钙依赖磷酸酶/NFAT1信号传递联系起来。此外，根据细胞
分离测定，RA诱导NFAT1与输入蛋白(一种核质细胞质转运蛋白)的短暂的交互作用(图
21a以及21j)，导致NFAT1核转位(图21k)。此NFAT1的短暂效应被认为是细胞由此区别
持续以及短暂的钙信号的一种机制。
实施例29：Wnt以及G蛋白信号传递途径的研究

[0282] 典型Wnt信号传递的抑制性GSK3β(在丝氨酸/苏氨酸位点处)在RA处理过夜后维持细胞质β-联蛋白的稳定化，但在30-120分钟内具有稍微降低的水平(图24d)。意
外地，在Akt异构型中Akt2能在4小时内与GSK3β结合(图21l)；然而，流式细胞分析显
示：通过RA处理过夜，GSK3β最初在4小时内被活化但之后被转变成为抑制性的(图21m)。
使用Akt2siRNA进一步确认了此现象(图21n)。为了解释此功能性趋异，确认了GSK3β的
最初活化是由于由Akt2所造成的Tyr216位点处的磷酸化，接着抑制是由于丝氨酸/苏氨
酸位点处的磷酸化(图21m)。这些结果证明：由各种不同的蛋白激酶所造成的GSK3β的
位点特异性磷酸化决定下游效应子的命运。此外，活性GSK3β经由直接的交互作用磷酸化
MAPT(图21h)。依次地，MAPT与微管蛋白交互作用并且活化它(图21a以及21h)以促进
微管装配。特别地，Wnt2B、Gβ以及Gαq/11信号传递途径间的沟通桥梁在神经生成早期
建立。
实施例30：用于多巴胺能神经生成的转录因子的研究

[0283] 在核中，β-联蛋白与CREB1的交互作用代表了TH转录中的主流(图30a)。活性β-联蛋白依次地结合至淋巴样细胞增强因子1/T细胞因子1(LEF1)(图22a)，导致LEF1
从转录的抑制子转换至活化子。LEF1接着募集并且与Pitx2(bicoid相关因子超家族的成
员)交互作用(图22a)。而根据染色质免疫沉淀(ChIP)分析，LEF1促进Pitx2基因转录
但不促进Pitx3基因转录(图22b)，这与β-联蛋白、Pitx2以及LEF1交互作用以协同地
调节LEF-1启动子是符合的。

[0284] 此外，短暂核活性NFAT1作为转录因子起作用以生成用于免疫反应的细胞因子以及TNF-α。然而，因为磷酸化的GSK3β能够抑制钙依赖磷酸酶诱导的NFAT1在核中的DNA
结合并且促进核输出，此作用在本情况中不可能发生。因此，由于此作用被NFAT1siRNA抑
制(图22e)，活性细胞质NFAT1将会交互作用并且活化细胞质转录因子肌细胞增强因子
2A(MEF2A)(图22c以及22d)。特别地，快速诱导型CREB1进入核内并且转录可生成MEF2A
蛋白质的MEF2A基因(图22f)。MEF2A可能在基因转录上以多种方式发挥作用(图22g)，包
括经由自动调节的自身转录以生成更多MEF2A、转录TH基因以供多巴胺能特化、转录SNCA
基因以供SNCA/MAPT/帕金蛋白复合体形成，以及与EP300和Pitx2交互作用(它被MEF2A
siRNA抑制)(图22h)。

[0285] 根据ChIP分析，活性的EP300不仅靶向HDAC6基因而且靶向TH基因(图22i)。HDAC6然后能够携带β-联蛋白用于核转位(图24e以及24f)。综上所述，执行性转录复
合体得以形成并且指定用于TH基因转录。在它们之中，CREB1、EP300以及MEF2A能直接地
靶向TH基因的启动子，而β-联蛋白、LEF1以及Pitx2在转录过程期间作为增强子的共活
化子行使功能。Western印迹分析显示了第4小时以及第24小时的各种不同的分子活性
(图22j)。
实施例31：动物研究

[0286] 关于动物研究，通过将F1B(-540)-GFP以及pSV2neo质粒转染至hTS细胞中继而用G418进行选择来制备报道细胞。超过95%的hTS细胞显示F1B-GFP与TH-2的共表达。
其次，在“年轻的”Spraque-Dawley大鼠(Spraque-Dawley rats)(n＝12，体重，225-250gm)中如下所述通过将神经毒素6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)单侧地注射到大
鼠脑中来诱发帕金森氏症。

[0287] 全部实验都依据高雄医学大学附设医院的医院人体试验委员会伦理委员会(ethical board of the Institutional Review Boards of the Hospital,Kaohsiung
Medical University Hospital)和国立成功大学医学院伦理委员会(Ethical Committee
at Medical College of National Chung Kong University)(台南，台湾)的规范来实施
和执行。
帕金森氏症的诱发

[0288] 12只Spraque-Dawley大鼠[体重：560＋65g(前)、548＋46g(后)]被用作6-OHDA-损伤的偏侧帕金森氏症的模型(Javoy等人,BrainResearch,102:201-15,1976)。
关于手术，在用水合氯醛(chloral hydrate)(4%，1cc/100g体重)麻醉之后，通过将6-羟
基多巴胺(Sigma)以1μg/0.5μL/分钟的速率注入至右前脑内侧束带(right median
forebrain bundle)(AP2.8/Lat2.2/Dep8.0mm)中历时8分钟(注射泵：CMA100)来实施立
体定向损伤(stereotaxic lesions)。10分钟之后，将管移除。2周之后，在接受阿朴吗啡
皮下注射(25mg/kg)之后20分钟于塑料碗(36cm直径)中测试阿朴吗啡诱导的旋转。对
侧的转动旋转使用摄影机监测并记录20分钟。具有每5分钟超过25次旋转数的大鼠有资
格参与研究。关于细胞移植，将细胞移植至右边单侧的纹状体内的2个部位中(每个部位：
6
3×10/4μL)(第1部位：AP+1/Lat+2.7/Dep6.4mm;第2部位：AP+0/Lat+2.7/Dep6.4mm)。
对照组使用相同的方法给予PBS。阿朴吗啡诱导的旋转在细胞注射之后的第0、3、6、9和12周测量。结果表示成对侧的转动/5分钟(图5a)。

[0289] 为了检测由RA诱导不同时间的NSCs的效果，合格的大鼠被随机地分为3组：1天以及5天RA-诱导组以及对照组。在移植之前，hTS细胞用F1B-(-540)-绿色荧光蛋白
(GFP)以及pSV2neo重组质粒DNA转染，继而经G418选择达到超过95%的产率。各个大鼠
6
接受总共6×10 细胞的GFP-标记的NSCs，而对照组者接受作为载体的磷酸缓冲盐水。治
疗效果在植入之后每3周通过阿朴吗啡诱导的旋转测试进行评估(Iancu等人,2005)。

[0290] 实验1：成年的Spraque-Dawley大鼠(体重：225-250g)用作移植接受者并且在12h光/暗循环和任意地(ad libitum)获取食物及水的条件下饲养。损伤的大鼠(n=12)
首先被分为3组：(a)损伤的并且移植了1天RA-诱导的NSCs(n＝4)，(b)损伤的并且移植
了5天RA-诱导的NSCs(n＝4)，以及(c)损伤的并且未接受移植的对照组(n＝4)。大鼠
用舒泰(Zoletil)(50mg/kg，皮下，Virbac Lab.Carros,France)麻醉，并且损伤的大鼠按照以mm标出的前囟以及硬膜(bregma and dura)将6-OHDA(8μg/4μL，配于0.1%1-抗坏血
酸-盐水中；Sigma–Aldrich,Mo)单侧地注射至左边的MFB(AP2.8,Lat2.0,Dep8.0mm)和
6
SN(AP5.0,Lat2.2,Dep7.5mm)中并且在该部位等待10分钟。将hTS细胞衍生的NSCs(1×10
细胞/5μL/5分钟)移植至DA-耗竭的纹状体中的2个部位(AP+1.0,Lat+2.7,Dep6.4以
及AP+0,Lat+2.7,Dep6.4)并且插管在缓慢地收回之前留置在原处5分钟。细胞活力在植
入操作程序期间保持稳定在96%至98%。假手术组大鼠接受无细胞的载体。在6-OHDA损伤
之后每一周通过阿朴吗啡诱导的旋转的方式评估损伤，以达到稳定的偏侧帕金森氏症状态
(＞300次旋转/小时)。每3周通过阿朴吗啡诱导的旋转测试评估移植效果直到第12周
为止。在植入后的第18周，处死大鼠并对大脑切片进行TH-DAB免疫染色。

[0291] 实验2：PD大鼠体重控制为测试前560+/-65g及测试后548+/-46g。损伤的大鼠(n＝16)如在实验1中所建立，并且根据是否移植了1天RA-诱导的NSCs将其分为2组：
(a)损伤的并且移植了细胞(n＝8)，以及(b)损伤的并且未移植细胞的作为对照组(n＝
8)。通过注射在AP+1.0,Lat+2.7,Dep6.4处移植细胞。如下所述每3周进行行为评估直到
植入后的12周为止。在第13周，处死全部的大鼠并对大脑切片进行TH-DAB免疫染色，并
且通过密度测定法分析TH-阳性细胞。
行为评估

[0292] 运动行为分析(Locomotor Activity Assays)：对于大鼠，在环状通道(10cm宽，直径60cm，具有30cm高的壁；Med Associates Inc.,St Albans,VT)中监测自发性运动行
为。等距离地位于圆的壁周围的4个光电元件经由光束中断来检测动物的水平移动活动性
(horizontal ambulatory activity)。数据由配备有定制软件(Med Associates)的PC记
录。个别组的动物用10mg/kg(每组n＝6)以及20mg/kg(每组n＝12)可卡因(cocaine)
进行测试。动物被随机分为治疗组(HSV-LacZ以及HSV-RGS9-2)并且适应运动设备2小
时。第二天，动物在立体定位架(stereotaxic frame)上接受HSV载体于伏核壳(nucleus
accumbens shell)中。在恢复2天后，用可卡因测试动物的运动行为2小时。数据通过双
因素方差分析(two-way ANOVA)(HSV×时间)与邦弗朗尼事后检验(Bonferroni post hoc
test)进行分析。

[0293] 对于小鼠，运动行为在自动化系统中进行测定，其中活动室是具有10对将该室分为11个矩形范围的光电管光束(photocell beams)的塑料笼(12×18×33cm)(Hiroi
等人,1997)。由不知道小鼠的基因型的实验员于每天同一时间对小鼠进行测试。对于
急性实验，使动物适应该室30分钟，在此时间之后它们接受盐水或不同剂量的安非他命
(amphetamine)、可卡因或阿朴吗啡的腹膜内注射，并且对运动行为评估额外的30分钟。对于慢性实验，动物在前3天的腹膜内盐水注射之后被立即置放于室中。接着测量水平活动
10分钟。在第4-8天(C1-C5)，给予动物可卡因(7.5mg/kg，腹膜内)并且测量活动10分
钟。用于大鼠及小鼠的短时间周期已在先前研究中显示能够在移动运动行为的测量中避免
重复运动(stereotypy)的潜在混淆效应(confounding effects)。

[0294] 执行3种行为测试：(i)药物诱导的旋转来评估损伤以及移植效应，(ii)足迹分析来评估后肢步态模式，以及(iii)梯子横档步行测试(ladder rung walking test)来评估
熟练的步行表现(后肢/前肢协调和脚掌置放准确度)。

[0295] 阿朴吗啡诱导的旋转测试：简言之，大鼠在阿朴吗啡皮下给药(0.5mg阿朴吗啡/kg体重，配于含有0.01%抗坏血酸的0.9%生理盐水中，Sigma–Aldrich)之后被置放于大
的圆形室(直径16cm)中一段40分钟的时间。全部的旋转记录于录影带中并计算净旋转
不对称性。数据经计算为30分钟内的总旋转数。数据使用Matlab软件进行分析。

[0296] 在0.5mg/kg阿朴吗啡溶液(Sigma–Aldrich,0.5mg阿朴吗啡，配于含有0.01%抗坏血酸的0.9%生理盐水中)的腹膜内注射之后观察阿朴吗啡诱导的旋转(apo)历时60
分钟。如先前所述([59]；图2)，在损伤之后(LX后2周和3周)以及在移植之后(TX后
3周和6周)在旋转流量计箱中评估旋转偏移。LX后2周以及TX后3周药物诱导的旋转
的数据未显示。3天后，安非他命诱导的旋转(amph)在1mL/kg安非他命溶液(Sigma–
Aldrich,Steinheim,Germany：每1.0mL盐水2.5mg d-安非他命)的腹膜内注射之后执行
90分钟。5只动物从研究中排除，因为它们在阿朴吗啡注射之后显示＜4.0的损伤侧对侧
的全身转动，并且在安非他命注射之后显示＜6.0的损伤侧同侧的全身转动。阿朴吗啡诱
导的旋转呈现为负值的净旋转，而安非他命诱导的旋转呈现为正值的净旋转。

[0297] 在阿朴吗啡(A)注射以及安非他命(B)注射之后的药物诱导的旋转。旋转偏移显示为全身旋转的总量。美元符号($)表示假处理(sham)与tx大鼠之间的显著的差异。TX
前＝损伤后的6周，TX后＝移植之后的6周。注意到有显著的移植效应[阿朴吗啡注射之
后的旋转偏移减少；安非他命注射之后的过度补偿(overcompensation)]。

[0298] 针对运动失能症的杠测试：关于杠测试，以对侧及同侧前爪择一地置放于具有0.7×9cm大小的水平丙烯酸杠上的姿势，将大鼠轻轻地置放于台上。记录从置放前爪至它
们每一个从杠上首次完全移除的时间。如先前所述(Fantin)记录各个爪在区块上所花费
的总时间。

[0299] 足迹分析(时空步态分析)：如先前所述(Klein)执行足迹分析(包括步行速度、步伐长度、跨步长度以及支撑的基础)以评估后肢步行模式。大鼠必须在塑胶板上步行穿
过通道(50cm长，8cm宽)。参数[包括跨步长度、肢旋转(通过第3趾和掌心的虚拟线与
平行于步行方向的虚拟线之间的角度)以及5个连续步伐的脚之间的距离(介于左脚和右
脚步进循环之间的距离)]通过摄影机(Casio EX-F1,Japan)记录并通过Matlab软件进行
分析。

[0300] 踝关节僵硬度评估使用适合的方法进行评估。利用适合的电生理学分析(Electrophysiological assays)确定大脑中的多巴胺能神经元复原的%。
免疫组织化学

[0301] 关于TH免疫组织化学，动物腹膜内接受60mg/kg戊巴比妥钠(sodiumpentobarbitone)(Apoteksbolaget,Sweden)的终端剂量并且穿心脏地(trans-cardially)
灌注50mL盐水(0.9%w/v)，继而灌注200mL冰冷的低聚甲醛(4%w/v，配于0.1M磷酸盐
缓冲盐水中)。移除大脑，于4%低聚甲醛中固定2小时，并且在冷冻切片机(freezing
microtome)(Leica)上进行切片之前冷冻保护于蔗糖(25%w/v，于0.1M磷酸盐缓冲盐水中)
中过夜。冠状切片以20μm的厚度收集6个系列。

[0302] 免疫组织化学操作程序如下执行。自由漂浮的切片在室温下与第一抗体在含有5%正常血清(normal serum)及0.25%Triton X-100(Amresco,USA)的具有钾的0.1M磷酸盐
缓冲盐水的孵育溶液中孵育过夜。第二抗体在含有2%正常血清及0.25%Triton X-100的
具有钾的磷酸盐缓冲盐水中稀释，并且在室温下被施用于原溶液2小时。对第一抗体-第
二抗体复合体的检测通过过氧化酶驱使的二氨基联苯胺(di-amino-benzidine)的沉淀
或者荧光团(fluorophore)的偶联(直接与第二抗体偶联或者当必要时使用链霉抗生物
素蛋白-生物素扩增步骤)来实现。为了检测c-Fos，使用硫酸镍(nickel sulphate)
(2.5mg/mL)来增强染色。荧光标记物标记的载玻片封固的切片使用聚乙烯醇-1,4-二氮
杂双环[2.2.2]辛烷(polyvinyl alcohol-1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane)来盖上盖
玻片，而二氨基联苯胺标记的切片在醇以及二甲苯(xylene)中进行脱水并且使用DePeX
封固剂(DePeX mounting media)(BDH Chemicals,UK)来盖上盖玻片。第一抗体以及稀
释倍数如下：小鼠抗钙结合蛋白28KD(mouse anti-Calbindin28KD)(1:1000;Sigma)、兔抗
c-Fos(1:5000;Calbiochem)、鸡抗GFP(1:1000;Abcam)、兔抗GFP(1:20000;Abcam)、兔抗
GIRK2(1:100;Alomone Labs,Jerusalem,Israel)、兔抗PITX3(1:100;Invitrogen)以及小
鼠抗酪氨酸羟化酶(TH:1:4000;Chemicon)。第二抗体(在1:200的稀释下使用)如下：(i)
直接检测—花菁3或花菁5偶联的驴抗小鼠(cyanine3or cyanine5conjugated donkey
anti-mouse)、花菁2偶联的驴抗鸡(cyanine2conjugated donkey anti-chicken)、花菁5
偶联的驴抗小鼠(cyanine5conjugated donkey anti-mouse)(Jackson ImmunoResearch)；
以及(ii)使用链霉抗生物素蛋白-生物素扩增的间接检测—生物素偶联的山羊抗兔或马
抗小鼠(Vector Laboratories)继而是过氧化酶偶联的链霉抗生物素蛋白(Vectastain
ABC试剂盒,Vector laboratories)或花菁2/花菁5偶联的链霉抗生物素蛋白(Jackson
ImmunoResearch)。
在多巴胺能特化中CREB1表达的体内研究

[0303] 为了得到大脑切片，大鼠用戊巴比妥钠 (60mg/kg 腹膜内,Apoteksbolaget,Sweden)麻醉，并穿心脏地灌注盐水(50mL,0.9%w/v)继而是冰冷的低
聚甲醛(200mL,10%w/v，于0.02M PBS中)，分别在第18以及12周于急性以及慢性PD大鼠
中执行。大脑切片如所示地进行免疫细胞化学、免疫组织化学以及免疫荧光组织分析。

[0304] 检测在损伤的纹状体处接受hTS细胞衍生的滋养层NSCs(tNSCs)的颅内移植的6-OHDA-诱发的PD大鼠以研究CREB1表达。对植入后第12周的大脑切片的检测显示：根
据免疫荧光组织分析，在黑质致密部，在治疗侧中的新生多巴胺能(DA)神经元中观察到
CREB1与酪氨酸羟化酶(TH)的共表达，这与在正常侧中所观察到的相匹配(图30e，插图)。
再生的DA神经元中的TH以及CREB1这两者的活性比正常DA神经元中的更高(图30f)。
在DA神经元的核中观察到明显的CREB1表达。这些发现可以帮助解释为何CREB1缺失的
小鼠易患神经退化。
关于多巴胺能黑质纹状体途径的再生的体内研究

[0305] 为了进一步证实在细胞治疗之后多巴胺能黑质纹状体途径的再生，执行免疫荧光组织分析(TissueGnostics Gmbh,Vienna,Austria)。研究大脑切片，包括14只急性PD大
鼠(即，2只在损伤后的第1周以及2只在损伤后的第6周以及2只对照，6只在细胞移植
之后的第12周以及2只对照)以及4只慢性PD大鼠(即，2只在细胞治疗之后的第12周
以及2只对照)。在SNC中，6-OHDA造成进行性神经退化，在损伤后的第6周导致各种不同
大小的空腔(图31)。有趣地，在tNSCs治疗之后，许多DA神经元出现在空腔壁，带有突出
至空腔中的TH-阳性神经末梢(图31，插图)。定量分析显示：与无损伤侧相比，DA神经元
的数目在损伤后的第1周以及第6周在SNC中分别明显地减少至48%以及13%(图32a以
及33)。令人注目地，DA神经元的损失在tNSCs治疗之后可减少多达67%。

[0306] 而在纹状体中，DA神经元分别在损伤后的第1周以及第6周减少至78%以及4%(图32a)。相似地，损失的DA神经元在tNSCs治疗之后可能再生多达73%。与先前的观察相一
致(图6)，DA神经元回路在SNC的治疗侧中以免疫组织化学上类似于无损伤侧的方式被良
好地建立(图32b)。DA神经元的复原率在SNC中经计算为78.4±8.3%(平均值±SEM；n
＝4)(图32c)，与在免疫荧光分析中的67%是匹配的(图23a)。

[0307] 由于神经胶质细胞在引导神经元迁移至其目的地中作为介质或作为神经再生的来源发挥作用，6-OHDA不仅造成DA神经元以及GFAP(+)细胞这两者的退化，而且也造成纹
状体中的纹状苍白黑质体轴突(striato-pallido-nigral axons)的扰乱(Wilson束)。这
些现象在tNSC治疗之后得到明显改善，显示许多的GFAP(+)细胞被包埋于纤细的髓鞘神经
纤维(myelinated fiber)中(图32d)。如所观察到的，在损伤的纹状体中的GFAP(+)细胞
从损伤后第6周的65.5%再生至tNSC治疗之后的93.9%(图32e)。此事实可能反映出星形
胶质细胞活化(astrocytic activation)，可归因于植入的tNSCs亚型，即GRP以及星形胶
质细胞。这些结果显示：在慢性PD大鼠中tNSCs的移植使多巴胺能黑质纹状体途径再生，
从而解释了行为缺陷的改善。基于损伤的途径中tNSCs的滞留，优化DA神经元的再生将会
持续至少植入后18周(图5)。

[0308] 在体内，将hTS细胞肌肉内地植入到雄性严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中6-8周。组织学上，未发现畸胎瘤；但在肌肉纤维之间观察到与类黏液样奇异型细胞的轻微嵌合反应(图7H)。这些结果显示了hTS细胞及tNSCs在畸胎瘤形成方面与hES细胞相比在转
化医学上的优势。
统计学

[0309] 全部数据均表示为平均值±SEM。使用重复测量方差分析(ANOVA)检验(SPSSRelease12.0软件)以及对阿朴吗啡诱导的旋转分析在2组之间的重复测量ANOVA检验之
后应用最小显著差异检验(LSD)事后比较来评估差异。Student t检验、配对t试验在适当
时使用。p值＜0.05是被认为是显著的。

[0310] 动物实验显示：GFP标记的免疫荧光研究证明，被注射至损伤的纹状体中的tNSCs在植入后18周能经由黑质纹状体途径向上游迁移至黑质核(subnigral nucleus)。其次，
在改善行为缺陷上的效能要高于所预期的，例如，植入后第12周多巴胺能神经元的复原率
是28.2%。第三，未观察到免疫抑制或肿瘤形成。进一步地，在多巴胺能神经元以及行为缺陷上的28.2%改善在6-OHDA诱导之后在慢性PD大鼠中维持超过1年。这些结果指示：tNSCs
的移植能再生多巴胺能黑质纹状体途径并且功能上改善急性PD大鼠中的行为障碍。
慢性PD动物模型

[0311] 为了更接近地模仿PD患者的病理学进展性质，通过超过1年(平均12.3个月)的繁殖方法(breeding methods)发展慢性PD大鼠模型。每个月执行阿朴吗啡诱导的旋转
测试以确定实验中大鼠的PD状态。第I组(n＝6)接受tNSCs而第II组是对照组(n＝
6)。每3周执行行为评估，包括阿朴吗啡诱导的旋转测试、针对运动失能症的杠测试、针对僵硬的步进测试(stepping test)以及针对姿势不平衡以及步态障碍的足迹分析。

[0312] 在第I组中，在植入后的第3周至12周达到阿朴吗啡诱导的对侧旋转的显著改善，这与先前在急性PD大鼠中的研究相似(图6A)。杠测试显示：受影响的前肢的抓握时
间在第3周显著地缩短，并且在第12周持续改善(图6B)。对步伐长度(图6C)、跨步长度
(图6D)、步行速度(图6E)以及支撑的基础(图6F)的全部评估显示从植入后的第3周
至12周的显著的改善。这些研究是在良好设计的通道上执行的(图6G)。这些结果显示：
tNSCs的移植能够使多巴胺能黑质纹状体途径再生并且功能上改善慢性PD大鼠中的行为
障碍。
实施例32：拉与推机制

[0313] G蛋白偶联受体(GPCRs)在内部与外界环境之间沟通并且在细胞膜处与异型三聚G蛋白(heterotrimeric G proteins)偶联。然而，解释活化的GPCRs如何起始此过程的机
制还不太清楚。近来的报道显示：当引入配体时，Gα13及Gαq/11亚基这两者与AhR相互作用蛋白质(AhR-interacting protein)交互作用，其中Gα13导致细胞溶质AhR的去稳定化、转位以及泛素化(ubiquitination)。探究了G蛋白信号传递在非基因组AhR途径中的作用。
选择BBP作为外源性配体(exogenous ligand)并且COX-2作为活化的靶标，因为COX-2在
各种不同的人类细胞(包括肝癌细胞)中造成炎症、代谢和致癌作用(carcinogenesis)。

[0314] 由于免疫荧光研究具有捕获细胞中的分子变化的快照的能力，认为它们对于信号转导的动态研究是重要的。使用LT1转染试剂(Mirus Bio LLC,WI)以pGFP-C1-AhR
预转染人类肝Huh-7癌细胞，而利用全内反射荧光显微术(total internal reflection
fluorescence microscopy)选择性地观察在细胞质膜之下紧接的细胞质区域中的分子事
件。当引入BBP时，在亚细胞膜区域处发生GFP标记的AhR的快速但短暂的募集以及转
位，这显示AhR的快速升高，并于115秒达到波峰，继而逐渐减少，这发生在数分钟内(图
14a)。memAhR在亚细胞膜处的这种快速动态移动令人联想到软连线信号转导(soft-wired
signal transduction)的概念。已发现AhR通过它的生物转化酶(biotransformation
enzymes)调节以及细胞内定位的改变而发挥适应性功能(adaptive function)，这会触发
它自身的活化。

[0315] 然后，BBP与AhR之间的关联性通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)来检测。BBP在5分钟内显著地诱导mAhR表达，而在第15分钟达到波峰，并且逐渐地回到略高的组成性稳
定状态(图14b)。有趣地，Western印迹分析显示在第15分钟BBP-诱导的AhR生成的升
高，在第30分钟轻微地减少的生成，以及在第1小时的再升高(图14c)。在这两个分析中
所发现的在这些时间点上AhR表达的不同模式可以通过亚细胞mRNA活化和组成性合成之
间的差异来解释，这支持了“mRNA运输中的细胞骨架”的概念。因此，有可能Huh-7细胞含
21 21
有响应于外源性刺激 (stimulation )的局部蛋白质翻译所需要的mRNA的结构机制，并且
在之后被称为memAhR。较低的mRNA水平可能代表在细胞的差别稳定性的维持中的组成性
AhR活性。当配体活化时，异型三聚体G蛋白可解离成为Gβγ二聚物以及Gα亚基，包括
各自执行不同功能的Gs、Gi、Gq/11以及G12/13。BBP在30分钟内诱导Gαq/11以及Gβ这两者q/11
的生成(图14d)。Gαq/11的升高是由于memAhR与Gα 之间的直接交互作用(图14e)。
这些结果通过在细胞中使用siRNA敲除AhR而得到进一步确认(图14f)。这些数据清楚地
指出：通过BBP刺激，GPCR被激发并且致使异型三聚体Gαβγ解离成为Gα以及Gβγ
亚基，而使得Gαq/11能够去与它们的上游活化子memAhR交互作用。因为AhR已与Gα13以
及Gαq/11活性相关联，并且在肝细胞瘤(hepatoma)细胞中，AhR活性可以激发细胞命运过
程，从而AhR的持续表达可促进肿瘤细胞生长。该实验针对Gαq/11信号传递中所涉及的分
子事件。

[0316] 在一个实施方案中，AhR活性的调节可抑制或减少细胞生长。在另一实施方案中，AhR活性的调节可杀伤细胞。在一个实施方案中，调节包括细胞中AhR蛋白质活性的下调。在另一实施方案中，调节包括细胞中AhR蛋白质活性的抑制。在另一实施方案中，调节包括在细胞中抑制AhR蛋白质与G蛋白的缔合。在另一实施方案中，调节包括细胞中AhR基因
表达的下调。在一个实施方案中，该细胞是肿瘤细胞。在一个实施方案中，该肿瘤是肺、乳腺、结肠、脑、骨、肝、前列腺、胃、食道、皮肤或白血病肿瘤细胞。在一个实施方案中，该肿瘤是实体瘤。在另一个实施方案中，该肿瘤是液态肿瘤。在一个实施方案中，AhR活性用AhR
促效剂(agonist)来调节。在另一实施方案中，AhR活性用AhR拮抗剂(antagonist)来调
节。在另一实施方案中，AhR活性用具有抗雌激素活性的化合物来调节。在另一实施方案
中，AhR活性用具有抗雄激素活性的化合物来调节。在一个实施方案中，该肿瘤细胞存在于哺乳动物中。在另一实施方案中，该肿瘤细胞存在于人类中。在另一实施方案中，用于治疗存在于人类中的肿瘤的方法通过将抑制或降低肿瘤中AhR蛋白质的活性的化合物施用至
该人类来提供。在另一实施方案中，用于治疗存在于人类中的肿瘤的方法通过将抑制或减
少该肿瘤中AhR蛋白质的基因表达的化合物施用至该人类来提供。

[0317] 为了进行共焦免疫荧光成像显微术，用BBP处理细胞各5分钟及15分钟，继而进行AhR以及Gαq/11这两者的免疫荧光染色。在缺少BBP的情况下，观察到AhR以及Gαq/11
这两者在细胞质中比在核中更少的表达(图15a)。在用BBP刺激的细胞中，观察到在第5
分钟时在核以及核周区域中AhR的表达明显增加，此后在第15分钟时AhR向外扩散(图
15b，第1列)。这些结果显示组成性AhR活性以及细胞溶质转位。关于Gαq/11的表达，它
在第5分钟呈现出以与AhR相似的方式受刺激(图15b，第2列)。然而，Gαq/11已在第15
分钟从细胞溶质隔室向细胞膜转位，这支持了基于个体发生(ontogenetic)观点，GPCR-G
蛋白复合体的成熟能够实现向细胞膜的正确运输，虽然确切的机制尚不清楚。随后，AhR的siRNA敲除抑制核AhR但不是细胞溶质AhR的表达，这通过使用混杂的siRNA(scrambled
siRNA)来敲除AhR而得到确认(图15c)。然而，当添加BBP时，AhR表达在第5分钟时在核
以及核周区域这两者中增加，到第15分钟时在细胞溶质中达到稳态(homeostatic state)
(图15d，第1列)。明显地，Gαq/11被AhR siRNA抑制(图15d，第2列)，这种抑制通过
BBP的添加在第5分钟得到部分地恢复，并且在第15分钟得到全部地恢复，而在细胞膜处
显示出Gαq/11的明显累积(图15d，第2列)。这些结果显示：Gαq/11是memAhR的下游效应
子。AhR以及Gαq/11这两者的动态移动以及组成性活性进一步暗示补偿效应(compensatory effect)，这涉及它们在细胞中的活化、转位以及成熟。

[0318] 因为时空动力学(spatio-temporal dynamics)，双免疫金透射电子显微术(IEM)用于显示memAhR在细胞膜处的交互作用。细胞用BBP处理20分钟，并且使用大的金粒子
标记的Gαq/11(大小20nm)以及小的金粒子标记的AhR(大小6nm)的特异性第一抗体与
第二抗体来进行免疫细胞化学。将样品立即包埋于LR白色树脂(LR White Resin)(Ted
Pella,Redding,CA)中并且为IEM进行准备。在缺少配体的情况下，在细胞膜处显示出3种
个别的免疫金标记的Gαq/11实体(包括单、双以和三簇)(图16a)，这反映了GPCR-G蛋
白复合体的不同实体的存在。用BBP处理细胞，观察到数个小的金标记的AhR黏附于大的
金标记的Gαq/11上而在细胞膜处形成AhR-Gαq/11复合体(图16b)。除了典型单体以及近
来公认的二聚体之外，在细胞膜处还观察到聚合GPCR-Gαq/11的存在。这暗示了GPCRs的
各种不同的构型改变(conformational changes)，包括单体、二聚体以及多聚体(图16c)。
AhR-Gαq/11复合体主要在细胞质膜处被发现。在细胞溶质中有少数，但在核隔室(大量的
AhR以及Gαq/11独立地存在于其中)中没有。在对照细胞中没有看到此种AhR-Gαq/11交互
作用。数据显示：memAhR以及GPCRs-Gαq/11复合体的簇在配体活化之前没有预偶合。GPCRs的聚合作用[同型或异型多聚体(homo-or hetero-multimers)]是有意义的，因为它对于
调节交互作用分子的功能、亚细胞定位以及生物物理性质是有效的模式。它或许能够创造
更多的空间对接位点(spatial docking sites)以供外源性配体(诸如促效剂以及拮抗
剂)的筛选或细胞表面处的协同结合。或者，它为生物学影响的最困惑的方面之一提供线
索；特别是环境中的多环芳香烃化合物(polycyclic aromatic hydrocarbon compounds)
是如何与细胞中的毒性、代谢以及致癌反应相关联的。

[0319] 为了研究G蛋白信号传递的生化过程，证实了当用BBP活化时，memAhR可如先前所述与Gαq/11交互作用。随后，观察到磷脂酰肌醇(PIP2)水平的降低，这起因于PIP2被切割成下列2种第二信使：二酰基甘油(DAG)以及IP3(图17a，第1区)。已知IP3在内质网处
诱导细胞内钙通过其受体IP3R的释放(图17a，第2区)。因为G蛋白活化通常伴随着钙
2+
离子的流入，BBP引起的细胞内fluo-4-标记的Ca 水平的起源通过实时活细胞免疫荧光成
像显微术(real-time live cell immunofluorescence imaging microscopy)来检测(图
17b，中上区)。该细胞培养于无钙培养基中，并发现有细胞内钙的释放(图17b，中下区)，这显示来自于内部钙池(internal calcium store)的释放。此结果进一步通过添加IP3R
阻断剂2-APB进行确认，发现2-APB剂量依赖地抑制细胞内钙水平(图17b，右列)。然而，
4 4
异常的钙释放可诱导炎性反应 (inflammatory responses)以及肿瘤形成。因此，观察到
BBP在15分钟内诱导COX-2的生成，这可通过添加2-APB而被阻断(图17c)，这将细胞内
钙增加与COX-2的活化联系起来。此外，BBP诱导细胞外信号调节的蛋白激酶ERK的磷酸
化以及COX-2的活化(图17d)，这被化学品PD98059[MAPK途径的一种有效及选择性非竞争
性抑制剂(noncompetitive inhibitor)]阻断(图17e)，这显示ERK是COX-2的上游活化
子。为此目的，显示BBP在分子过程中经由memAhR-活化的Gαq/11信号传递来诱导COX-2
的活化。这显示了非基因组AhR途径的存在，因为BBP显著地抑制ARNT[一种编码AhR核
转位蛋白(AhR nuclear translocator protein)的基因]的表达(图17f)。此抑制作用
可以被解释为如先前所述的共活化的Gα13的作用。

[0320] 已证明了AhR可能是针对外部信号作出反应的信号转导物，导致GPCR-G蛋白信号传递的激发。已提出，信号将邻近的细胞溶质memAhR(作为活化子)“拉动”至细胞膜以结
合并且活化经解离的Gαq/11(作为效应子)，并“推动”下游分子级联以供在人类肝Huh-7癌细胞中发挥作用。如图17g中所例示说明的，这种“拉与推”模型有力地促进了理解GPCR-G蛋白信号传递的调控是如何启动的并且AhR调节的信号转导如何在典型AhR途径之外受到
控制。所述发现可进一步对集中于GPCRs和G蛋白的机制调节的治疗剂的研发产生影响。

[0321] 细胞培养物以及化学品：Huh-7细胞从台湾国家卫生研究院获得，培养于补充有10%胎牛血清(fetal bovine serum)(Gibco)、1%青霉素(100U/mL)、链霉素(10μg)、两性
霉素-B(amphotericin-B)(0.25mg)的DMEM(Gibco)中，并在37℃于5%CO2下生长。培养基
包括含有CaCl2(2mM)、D-葡萄糖(5.5mM)、NaCl(130mM)、KCl(5.4mM)、HEPES(20mM,pH7.4)以及MgSO4(1mM)的BSS。无钙培养基含有D-葡萄糖(5.5mM)、NaCl(130mM)、KCl(5.4mM)、
HEPES(20mM,pH7.4)以及MgSO4(3mM)。所包括的化学品是Fluo-4(Invitrogen)、邻苯
二甲酸苄丁酯(Benzyl butyl phthalate,BBP)(Sigma)、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯
(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)(Sigma)、ERK1/2抑制剂PD98059(Calbiochem)、
6-二氨基-2-苯基吲哚(6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(Sigma)。所包括的抗体
是AhR(Santa Cruz)、Cox-2(Minipore)、Gαq/11(sc-392)以及Gβ(sc-378,Santa Cruz)、β-肌动蛋白(Sigma)、p44/42MAPK(Erk1/2)(Cell Signaling)、磷酸-p44/42MAPK(Cell
Signaling)、辣根过氧化酶(HRP)标记的抗小鼠以及抗兔第二抗体[Horseradish
peroxidase(HRP)-labeled anti-mouse and anti-rabbit secondary antibodies](Santa Cruz)、Dye Light488-偶联的第二抗体(绿色)以及Dye Light549-偶联的第二抗体(红
色)(Rockland)。

[0322] 从早期输卵管异位妊娠(early tubal ectopic pregnancy)的妇女的着床前胚胎获得的hTS细胞先前已描述。附着的hTS细胞在37℃、5%CO2下培养于含有10μg/
mL bFGF(JRH,Biosciences,San Jose,CA)、10%FBS以及1%青霉素-链霉素的条件
α-MEM(conditioned α-MEM)中。细胞用RA(10μM)处理各种不同的时间间隔(视实验而
定)。

[0323] RNA分离以及RT-PCR：将Huh-7细胞(3×105)接种到6孔皿中并且孵育24小时。在无血清培养基中培养过夜的细胞用BBP(1μM)处理各种不同的时间间隔。在BBP刺激之
后，细胞用PBS洗涤2次。通过TRIzol方法(Invitrogen)提取总RNA。RNA(2μg)用于通
过反转录系统(Promega)合成cDNA。通过特异性引物扩增该c-DNA。引物对经设计如下：
AhR，正向5’-TACTCTGCCGCCCAAACTGG-3’，反向5’-GCTCTGCAACCTCCGATTCC-3’；β-肌动蛋白，正向5’-CTCGCTGTCCACCTTCCA-3’，反向5’-GCTGTCACCTTCACCGTTC-3’。PCR条件设定为：
95℃下5分钟，以及95℃30秒，54℃30秒，72℃1分钟，接着72℃10分钟(36个循环)。
产物通过2%琼脂糖凝胶分离并通过溴化乙锭显影。

[0324] Western印迹分析：将Huh-7细胞(1×106)接种至10cm皿中并培养过夜。将培养基更换为无血清培养基，再培养一夜。细胞用BBP(1μM)处理各种不同的时间间隔。为了
进行其它研究，细胞用化学品PD98059(20μM)或2-APB(30μM)预处理1小时继而用BBP
处理。细胞接着用冰冷的PBS洗涤2次并且用RIPA裂解缓冲液(Minipore)裂解。蛋白质
浓度通过BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo)进行测量。等量的蛋白质(30μg蛋白质)通
过8%SDS-PAGE进行解析，转移至PVDF膜上，并且在室温下用5%脱脂奶粉封闭1小时。在
封闭之后，该膜在4℃下与第一抗体[包括AhR(1:1000)、Cox-2(1:1000)、Gαq/11(1:100)、Gβ(1:100)、β-肌动蛋白(1:5000)、p44/42MAP激酶(1:1000)或磷酸-p44/42MAP激酶
(1:1000)]孵育过夜。细胞用PBST洗涤3次，然后在室温下与HRP偶联的第二抗体孵育1
小时。在洗涤之后，使用增强化学发光试剂盒(ECL)(Amersham)来对印迹进行显影。

[0325] ChIP：通过使用ChIP试剂盒(Upstate Biotechnology,Lake Placid,NY)，细胞经血清剥夺过夜并且用RA(10μM)处理4小时。为了分析，简言之，裂解产物(lysate)在冰
上进行超声处理以剪切DNA。交联的染色质与蛋白质G琼脂糖加抗RNA聚合酶II(阳性对
照)或者正常小鼠IgG(阴性对照)或所指明的第一抗体一起孵育。在用5M NaCl、RNase
A、EDTA、Tris以及蛋白酶K相继处理之后，通过旋转过滤器获得DNA混合物并且进行聚合
酶链反应(PCR)。

[0326] 免疫沉淀：Huh-7细胞经血清剥夺过夜并用BBP(1μM)处理30分钟。在用蛋白G-琼脂糖(Minipore)预清除30分钟之后，向培养物添加特异性抗体Gαq/11或兔IgG，并且
再次孵育过夜。在与蛋白G-琼脂糖孵育2小时之后，珠粒用RIPA裂解缓冲液洗涤3次，在
样品缓冲液中煮沸，通过8%SDS-PAGE解析并且进行AhR免疫印迹分析。

[0327] 细胞经血清剥夺过夜并用RA(10μM)处理4小时。所述细胞用RIPA裂解缓冲液(Millipore)裂解。裂解产物与蛋白A或蛋白G琼脂糖(Minipore)的混合物在4℃下摇动
孵育2小时。添加特异性第一抗体或兔IgG(对照)并孵育过夜。然后将免疫蛋白质复合
体捕获于具有蛋白A或蛋白G的珠粒上。抗体结合的蛋白质通过摇动沉淀过夜。经免疫沉
淀的蛋白质用RIPA裂解缓冲液洗涤，接着用SDS-PAGE进行分析，并使用另一种特异性抗体
来执行免疫印迹法以测量交互作用。

[0328] 免疫荧光：为了进行免疫细胞化学，细胞用配于PBS中的4%低聚甲醛进行固定，接着用配于PBS中的2%FBS/0.4%Triton X-100进行通透化(15分钟)。经5%FBS封闭溶液(2小时)和漂洗3次，细胞在4℃下与特异性第一抗体(配于PBS中)孵育过夜。添加适
当的FITC或PE或德克萨斯红(Texas Red)偶联的第二抗体1小时，继而针对核进行DAPI
染色(5分钟)并进行显微术。

[0329] 全内反射荧光(TIRF)显微术：使用LT1转染试剂(Mirus Bio LLC,Madison,WI)以pGFP-C1-AhR(H.Li的赠物)预转染Huh-7细胞24小时。为了进行TIRF显微术，将细胞
培养在盖玻片上的无血清培养基中过夜，继而通过BBP(1μM,Sigma)进行刺激。GFP标记的
AhR在细胞膜处的动态活性使用具有Axio Vision Rel.4.8软件的ZeissTIRF显微镜进行
观察以及分析。

[0330] 实时活细胞成像显微术：在用BBP(1μM)处理之前，细胞在37℃下用配于BSS缓2+
冲液中的Fluo-4(1μM)[一种Ca 特异性染料]预处理20分钟。对相对细胞内钙强度的
测量通过实时细胞成像显微术来执行并且通过Cell-R软件系统(Olympus)进行分析。无
钙培养基或者在各种不同的浓度下所使用的IP3R抑制剂2-APB用于测试细胞培养物中的
细胞内钙反应。

[0331] 共焦免疫荧光成像显微术：培养经或未经AhR siRNA转染的细胞并且用BBP(1μM)处理各5分钟及15分钟。在用针对AhR以及Gαq/11的第一及第二抗体处理之
后，对细胞进行共焦免疫荧光显微术，以分析细胞隔室中的动态移动。

[0332] 双免疫金透射电子显微术：通过微波固定以及加工处理24获得的经塑胶包埋的细胞的超薄切片用5%偏过碘酸钠预处理(10分钟)。载网与一小份抗AhR或
Gαq/11(C-19,sc-392,Santa Cruz)的IgG抗体孵育，继而分别用第二抗小鼠IgG金粒子(大
小6nm)或抗兔IgG金粒子(大小20nm)进行探测。在洗涤之后，通过将载网放置在1滴含
有1%卵白蛋白的PBS上来封闭所述切片(15分钟)。切片接着用乙酸双氧铀以及柠檬酸铅
进行染色并且通过透射电子显微术(Hitachi H-700型,Japan)来观察。

[0333] 本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请以相同程度通过引用并入本文，如同各个单独的出版物、专利或专利申请被特定地和单独地指明通过引用而并入。
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[0383] 虽然本文已显示和描述了一些实施方案，但对于本领域技术人员而言，很明显此类实施方案仅通过举例的方式来提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将
会想到许多变化、改变以及取代。应当理解：此处所描述的本发明实施方案的各种不同的替代方案可以在实施本发明中使用。以下权利要求旨在于限定本发明的范围并由此覆盖这些
权利要求范围内的方法和结构及其等效物。

标题	发布/更新时间	阅读量
可编程迟滞比较器	2020-05-14	267
一种迟滞型比较器	2020-05-14	323
迟滞比较器电路	2020-05-11	620
轨对轨输入迟滞比较器	2020-05-13	304
迟滞电路	2020-05-11	535
单边迟滞比较器	2020-05-12	292
一种电子油门迟滞机构	2020-05-13	776
迟滞比较器电路	2020-05-12	95
高速内部迟滞型比较器	2020-05-14	447
微能量迟滞装置	2020-05-14	700

由人类滋养层干细胞生成神经干细胞

由人类滋养层干细胞生成神经干细胞

技术领域

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：