具有仲醇官能团的细胞穿透性荧光染料
阅读：836发布：2021-01-26
专利汇可以提供具有仲醇官能团的细胞穿透性荧光染料专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及通式I-III和4的具有仲醇官能团的新型细胞穿透 荧光 染料；本发明还涉及这些化合物用于光学显微术和成像技术的用途。，下面是具有仲醇官能团的细胞穿透性荧光染料专利的具体信息内容。
1.荧光染料，其选自下列通式I-III和4的化合物：
其以开环两性离子形式(a)和闭合形式(b)之间的平衡状态存在，
其中在式I-III中，
X＝O、C(烷基)2、Si(烷基)2或Ge(烷基)2，并且烷基是C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基或仲丁基；
结构I和II中的R1和R2独立地为CF3CH2、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
结构I-III中的R3和R4独立地为
氢；C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；羧基或所述羧基的衍生物，例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基甲酰胺(CONHR′、CONR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被任意官能团取代；N-羟基琥珀酰亚胺基酯或另一种式CO2X的反应性酯，其中X是良好的离去基团，例如F、N3、SR′、OR′，R′＝芳基或杂芳基；CONHNH2或CONR′NR″R″′，R′、R″、R″′独立地为H、优选为C1-C6烷基的低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；CONHOH或CONR′OR″，R′、R″独立地为H、低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；COCHN2或COCR′N2，R′＝低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；氨基、低级烷基氨基或二烷基氨基，其烷基部分可任选地被任意官能团特别是羧基或所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯取代，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；叠氮基；N-马来酰亚胺基烷基、碘乙酰胺或适合与生物分子缀合的任意其他反应性基团；芳硫基或烷硫基，其芳基或烷基部分可任选地被任意不带电荷的基团取代，所述不带电荷的基团包括叠氮基-N3、羧基、所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；烷基、芳基或杂芳基酰胺
(NHCOR′、NHCOR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被任意官能团取代；
任选地，R1、R2、R3和R4中的碳链可含有双键或三键和/或环，和/或例如羟基的不带电荷的基团，以及一个、两个、三个或四个杂原子；
5
R＝H、F或Cl；
R6、R9、R10、R11＝H或OH，并且如果组R6、R9、R10、R11中的一个或多个取代基是OH，则以上结构I-III中的波形键(～～～)表示所有可能的异构体；
R7、R8独立地为H、C1-C4烷基、F、Cl、Br或I；
条件是(1)，所述式I、II和III表示的所有染料含有至少一个掺入荧光团的结构的取代
的3-羟基-1，2，3，4-四氢喹啉片段(具有元素-CH2CH(OH)CH2-)，其如式I、II和III和以下的结构式中所示，
对于结构III额外条件是(2)：R6、R9、R10或R11中的至少一个是羟基；
其中
结构4中的烷基是C1-C6烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、戊基、异戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、己基、异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基；
结构4中的R可以是氢、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基、羧基或所述羧基的衍生物，例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基甲酰胺(CONHR′、CONR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个任意官能团取代；N-羟基琥珀酰亚胺基酯或另一种式CO2X的反应性酯，其中X是良好的离去基团，例如F、N3、SR′、OR′，R′＝芳基或杂芳基；CONHNH2或CONR′NR″R″′，R′、R″、R″′独立地为H、C1-C6烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被一个或多个任意官能团取代；CONHOH或CONR′OR″，R′、R″独立地为H、低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被一个或多个任意官能团取代；COCHN2或COCR′N2，R′＝低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；氨基、低级烷基氨基或二烷基氨基，其烷基部分可任选地被任意官能团特别是羧基或所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯取代，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基酰胺(NHCOR′、NHCOR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个任意官能团取代；叠氮基；N-马来酰亚胺基烷基；碘乙酰胺或适合与生物分子缀合的任意其他反应性基团；
任选地，所述基团R中的碳链可含有双键或三键和/或环，和/或不带电荷的基团以及一
个、两个、三个或四个杂原子。
3 4
2.权利要求1的荧光染料，其中结构I-III中的R和R独立地为
氢；C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；羧基或所述羧基的衍生物，例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基甲酰胺(CONHR′、CONR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；N-羟基琥珀酰亚胺基酯或另一种式CO2X的反应性酯，其中X是良好的离去基团，例如F、N3、SR′、OR′，R′＝芳基或杂芳基；CONHNH2或CONR′NR″R″′，其中R′、R″、R″′独立地为H、低级烷基优选C1-C6烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；CONHOH或CONR′OR″，R′、R″独立地为H、低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；COCHN2或COCR′N2，R′＝低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；氨基、低级烷基氨基或二烷基氨基，其烷基部分可任选地被如下定义的官能团特别是羧基或所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯取
代，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；叠氮基；N-马来酰亚胺基烷基、碘乙酰胺或适合与生物分子缀合的任意其他反应性基团；芳硫基或烷硫基，其芳基或烷基部分可任选地被任意不带电荷的基团取代，所述不带电荷的基团包括叠氮基-N3、羧基、所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；烷基、芳基或杂芳基酰胺(NHCOR′、NHCOR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被如下定义的官能团取代；
任选地，R1、R2、R3和R4中的碳链可含有双键或三键和/或环，和/或例如羟基的不带电荷的基团，以及一个、两个、三个或四个杂原子；
R5＝H、F或Cl；
6 9 10 11 6 9 10 11
R、R、R 、R ＝H或OH，并且如果组R 、R、R 、R 中的一个或多个取代基是OH，则以上结构I-III中的波形键(～～～)表示所有可能的异构体；
R7、R8独立地为H、C1-C4烷基、F、Cl、Br或I；
条件是(1)，式I、II和III表示的所有染料含有至少一个掺入荧光团的结构的取代的3-
羟基-1，2，3，4-四氢喹啉片段(具有元素-CH2CH(OH)CH2-)，如式I、II和III以及以下的结构式中所示，
对于结构III额外条件是(2)：R6、R9、R10或R11中的至少一个是羟基；
其中
结构4中的烷基是C1-C6烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、戊基、异戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、己基、异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基；
结构4中的R可以是氢、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基、羧基或所述羧基的衍生物例如低
级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基甲酰胺(CONHR′、CONR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；N-羟基琥珀酰亚胺基酯或另一种式C02X的反应性酯，其中X是良好的离去基团，例如F、N3、SR′、OR′，R′＝芳基或杂芳基；
CONHNH2或CONR′NR″R″′，R′、R″、R″′独立地为H、C1-C6烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；CONHOH或CONR′OR″，R′、R″独立地为H、低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；COCHN2或COCR′N2，R′＝低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；氨基、低级烷基氨基或二烷基氨基，其烷基部分可任选地被如下定义的官能团取代，特别是被羧基或所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯取代，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基酰胺(NHCOR′、NHCOR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；叠氮基；N-马来酰亚胺基烷基、碘乙酰胺或适合于与生物分子缀合的任意其他反应性基团；
其中术语“如下定义的官能团”是指选自下列基团的基团：环烯基；烯基例如乙烯基、烯丙基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、1，3-丁二烯-1-基、1，3-丁二烯-2-基、1，2-丙二烯-1-基；炔基例如乙炔基、丙炔基、炔丙基；芳基例如苯基、1-萘基、2-萘基、9-蒽基-、芘-1-基、芘-2-基；
卤素原子如F、Cl、Br、I；叠氮基；亚硝基；重氮基；重氮羰基；羟基；保护的羟基OR，R＝例如甲酰基、乙酰基的酰基、四氢吡喃基、叔丁基、烯丙基、炔丙基、苯基、对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、全氟苯基、全氯苯基、苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、三烷基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基烷基甲硅烷基；巯基；保护的巯基SR，R为如上对于OR所定义；伯氨基和仲氨基；肼基；羟基氨基；醛和酮中的羰基；保护的羰基；腙；肟；硫酮；亚砜；砜；磺酸残基及其盐；羧酸基团COOH和酯基COOR，R＝例如CH3、C2H5、叔丁基的烷基、烯丙基、炔丙基、苯基、对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、全氟苯基、全氯苯基、苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、三烷基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基烷基甲硅烷基，特别是N-羟基琥珀酰亚胺基；伯、仲和叔酰胺基；亚磷酰二胺基团；C2H5；异丙基；烯丙基；叔丁基；苯基；亚磷酰胺基团[-OP(NR′2)(OR″)]，R′＝CH3、C2H5、异丙基、烯丙基、叔丁基、苯基，R″＝H、烷基、芳基、杂芳基；亚磷酰二胺基团[-OP(NR2)]，R＝CH3、C2H5、异丙基、烯丙基、叔丁基、苯基；磷酸残基-OP(O)(OR′)(OR″)，R′(R″)＝H、CH3、C2H5、烯丙基、叔丁基、苯基、NH2；膦酸残基-P(O)(OR′)(OR″)，R′(R″)＝H、CH3、C2H5、烯丙基、叔丁基、苯基、NH2；N-邻苯二甲酰亚胺基和杂环残基；
任选地，所述基团R中的碳链可含有双键或三键和/或环，和/或不带电荷的基团以及一
个、两个、三个或四个杂原子。
3.权利要求2的荧光染料，其中术语“如下定义的官能团”在每次出现时是指羟基。
4.权利要求1或2的结构III的化合物，其具有两个羟基，并且其中R6＝R9＝OH且R10＝R11＝H，或者R6＝R9＝H且R10＝R11＝OH。
5.权利要求1或2的结构III的化合物，其具有一个羟基，并且其中R6＝OH且R9＝R10＝R11＝H，或者R10＝OH且R6＝R9＝R11＝H。
6.权利要求1或2的荧光染料，其表示化合物5-R3之一，其中R1＝R2＝CH2CF3，R6＝OH且R3＝CO2H，其反应性酯或者具有带一个末端氨基或羧酸基团的连接基的酰胺，所述反应性酯优选为N-琥珀酰亚胺基氧基羰基、2，3，5，6-四氟苯氧基羰基或五氟苯氧基羰基，如以下结构式所示：
7.权利要求1或2的荧光染料，其表示化合物14a，b-R3之一，其中R1＝R2＝OH，或者R1＝OH且R2＝H，并且其中R3＝CO2H，其反应性酯或者具有带一个末端氨基或羧酸基团的连接基的酰胺，所述反应性酯优选为N-琥珀酰亚胺基氧基羰基、2，3，5，6-四氟苯氧基羰基或五氟苯氧基羰基，
8.权利要求1或2的结构4的荧光染料，其中烷基是直链或支链C1-C6烷基链，优选C1-C4烷基，最优选甲基；R是CO2H或反应性酯，优选N-琥珀酰亚胺基氧基羰基、2，3，5，6-四氟苯氧基羰基或五氟苯氧基羰基，或者是能够参与连接反应的官能团，例如叠氮化物、炔烃、张力较大的烯烃或四嗪反应性基团，所述官能团通过连接基与苯基连接，或者R是与关注的生物学靶点形成共价键的任意配体，或与关注的生物学靶点结合的非共价配体，例如多西紫杉醇或jasplakinolide衍生物。
9.权利要求8的荧光染料，其表示化合物4-R，其中R＝CO2H或其反应性酯，所述反应性酯优选为N-琥珀酰亚胺基氧基羰基、2，3，5，6-四氟苯氧基羰基或五氟苯氧基羰基，如以下结构式所示：
10.权利要求8的荧光染料，其表示如以下结构式所示的化合物33、33-NHS、33-卤代、
33-微管蛋白、33-溶酶体和34之一：
11.用于制备锗杂蒽酮和硅杂蒽酮的方法，其包括以下步骤：
a)使用亲电子溴化试剂优选N-溴代琥珀酰亚胺将二-O-TIPS-保护的双(3-羟基苯基)
硅烷或-锗烷区域选择性溴化成相应的二-O-TIPS-保护的双(2-溴-5-羟基苯基)硅烷或-锗烷；
b)由步骤a)得到的二溴化物上的双金属-卤素交换，然后与氨基甲酰氯优选N，N-二甲
基氨基甲酰氯反应；
c)任选进一步脱保护/再次保护步骤。
12.权利要求11的方法，其用于制备以下化合物24、37-OH或其O-保护的类似物，例如路
线4中的化合物25和路线5中的化合物37：
13.权利要求1-10的化合物作为用于缀合或生物缀合的试剂的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述缀合或生物缀合包括与化学实体或物质形成至少一
个共价化学键或至少一个分子络合物，所述化学实体或物质例如胺；硫醇；羧酸；醛；醇；芳族化合物；例如四嗪的杂环；炔烃；烯烃，其包括张力较大的烯烃和双环烯烃，例如反式环辛烯、环丙烯和降冰片烯衍生物；有机叠氮化物；染料；氨基酸；与任意化学实体偶联的氨基酸残基；肽；蛋白质，特别是酶和免疫球蛋白；抗体；单域抗体；碳水化合物，其包括结合至蛋白质的碳水化合物残基；核酸；毒素；脂质；病毒；病毒样颗粒。
15.缀合物或生物缀合物，其包含通过至少一个共价化学键或至少一个分子络合物与
化学实体或物质偶联的权利要求1-10中任一项的染料，所述化学实体或物质例如胺；硫醇；
羧酸；醛；醇；芳族化合物；例如四嗪的杂环；炔烃；烯烃，其包括张力较大的烯烃和双环烯烃，例如反式环辛烯、环丙烯和降冰片烯衍生物；有机叠氮化物；染料；氨基酸；与任意化学实体偶联的氨基酸残基；肽；蛋白质，特别是酶和免疫球蛋白；抗体；单域抗体；碳水化合物，其包括结合至蛋白质的碳水化合物残基；核酸；毒素；脂质；病毒；病毒样颗粒。
16.缀合物或生物缀合物，其包含通过共价键与如下所示的胃蛋白酶抑制剂A、
Jasplakinolide衍生物、多西紫杉醇衍生物、卡巴他赛衍生物和氨基鬼笔环肽偶联的权利要求1-10中任一项的染料：
17.权利要求1-10中任一项的化合物或者权利要求15和17的其缀合物用作细胞穿透物
质的用途，其穿透活细胞和固定细胞的膜。
18.权利要求1-10中任一项的化合物或者权利要求15和17的其缀合物用于跟踪和监测
样品中或物体中动态过程的用途。
19.权利要求1-10中任一项的化合物或者权利要求15和17的其缀合物在光学显微术、
成像技术、蛋白质追踪、核酸标记和流式细胞术中作为荧光标签、分析试剂和标记的用途。
20.权利要求19的用途，其中所述光学显微术和成像技术包括：共焦显微镜检查、结构
照明显微术、受激发射耗尽显微术[STED]、荧光相关光谱法[FCS]、STED和FCS的组合(STED-FCS)、光漂白后的荧光恢复[FRAP]、荧光寿命成像[FLIM]、单个分子返回的基态耗尽[GSD或GSDIM]、RESOLFT显微术、荧光共振能量转移[FRET]、如单分子定位显微术[SMLM]的单分子转换技术、光活化定位显微术[PALM、PALMIRA、fPALM]和随机光学重建显微术[STORM]。
具有仲醇官能团的细胞穿透性荧光染料
[0001] 发明背景
[0003] 具体地，细胞组分的敏感性和稳定成像取决于化学、生物和物理因素的有利组合。荧光染料的可用性和适当选择是整个标记和成像过程成功的关键因素。由于合成染料优异的亮度和光稳定性，其代表了荧光蛋白的有吸引力的其它选择。
[0004] 由于细胞透性的要求，可应用于活细胞的细胞内标记的荧光探针的多样性有限(参见例如Butkevich等人，Angew.Chem.Int.Ed.2016，55，3290-3294)。已知一些carbopyronine(参见例如Kolmakov等人，Eur.J.Org.Chem.2010，3593-3610)、硅-罗丹明(SiR)(参见例如Kushida等人，Analyst 2015，140，685-695)和光活化罗丹明染料(参见例如Belov等人，Angew.Chem.2010，122，3598-3602)穿透完整细胞的外质膜，并且近期已提出的用于改善其亮度的方法(Grimm等人，Nat.Meth.2015，12，244-250).
[0006]
[0007] 路线1.商业细胞穿透性 配体和SNAP-标签 配体由荧光染料的6′-羧基衍生物获得。吸收最大值和发射最大值在括号中给出。
[0008] 然而，这些染料在水性介质中的溶解度不太理想。此外，在许多情况下，亲脂性染料与靶结构不完全特异性结合，并因此产生荧光背景，这使得检测复杂化、降低了信噪比(对比度)，并且甚至使得成像不可能。另一方面，具有额外离子基团和增加极性的改性荧光染料通常具有其他缺点，例如较低或甚至可忽略的细胞膜穿透性(对于阴离子染料)、具有毒性或非特异性结合(对于阳离子染料)。另外，极性离子基团的存在限制了合成的灵活性，需要特殊的保护基，并对这些染料的合成后修饰造成严重限制。
[0009] 鉴于现有技术的荧光染料的缺点，本发明的主要目的是提供具有优异性能的新型荧光染料。特别地，必须改善在水性介质中的溶解度，同时保持细胞膜穿透能力以及与靶结构结合的特异性。另外，必须保持(或改善)比现有技术的细胞穿透性探针和细胞组分标记物更高的亮度(荧光量子产率和消光系数的乘积)。
[0010] 该目的通过提供如下来实现：根据权利要求1至10所述的具有仲醇官能团的新型细胞穿透性荧光染料、根据权利要求11所述的用于制备锗杂蒽酮和硅杂蒽酮的方法、根据权利要求15所述的包含所述染料的缀合物、以及根据权利要求13和17至19所述的所公开的新型荧光染料的应用。本发明的其他方面和更具体的实施方案是其他权利要求的主题。
[0011] 发明描述
[0012] 本发明的新型荧光染料的结构选自下列通式I-III和4的化合物：
[0013]
[0014] 路线2
[0015] 这些化合物以开环两性离子形式(a)(其通常是有色且荧光的)和闭合不带电荷形式(b)(其通常是无色且非荧光的)之间的平衡状态存在。
[0016] 在以上通式结构I-III中，
[0017] 烷基是C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基或仲丁基；
[0018] 结构I和II中的R1和R2独立地为CF3CH2、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
[0019] 结构I-III中的R3和R4独立地为
[0020] 氢；C1-C6烷基或(官能团)取代的C1-C6烷基；羧基或所述羧基的衍生物，例如C1-C6烷基酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基甲酰胺(CONHR′、CONR′R")，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个任意官能团取代；N-羟基琥珀酰亚胺基酯或另一种CO2X型反应性酯，其中X是合适的良好的离去基团(离核体)，其包括但不限于F、N3、SR′、OR′(R′＝芳基或杂芳基)；酰肼CONHNH2或取代的酰肼CONR′NR"R″′，其中R′、R″、R″′独立地为H、低级烷基(C1-C6)、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；异羟肟酸CONHOH或取代的异羟肟酸CONR′OR"，其中R′、R″独立地为H、低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；重氮酮COCHN2或取代的重氮酮COCR′N2，其中R′＝低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；氨基、烷基氨基或二烷基氨基(其中烷基＝C1-C10)，其烷基部分可任选地被任意官能团特别是羧基或所述羧基的衍生物例如低级烷基(例如C1-C6)酯、芳基酯或杂芳基酯取代，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；叠氮基；N-马来酰亚胺基烷基、碘乙酰胺或适合与生物分子缀合的任意其他反应性基团；芳硫基或烷硫基，其芳基或烷基部分可任选地被任意不带电荷的基团取代，所述不带电荷的基团包括叠氮基-N3、羧基、所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；烷基(C1-C10)、芳基或杂芳基酰胺(NHCOR′、NHCOR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个任意官能团取代；
[0022] R5＝H、F或Cl；R6、R9、R10、R11＝H或OH(参见以下条件1和2)，并且如果组R6、R9、R10、R11中的一个或多个取代基是OH，则结构I-III中所示的波形键(～～～)表示所有可能的异构体；
[0023] R7、R8独立地为H、C1-C4烷基、F、Cl、Br或I；
[0024] 条件是(1)，式I、II和III表示的所有染料含有至少一个掺入荧光团的结构的取代的3-羟基-1，2，3，4-四氢喹啉片段(具有元素-CH2CH(OH)CH2-)，其如路线2和以下的结构式中所示；
[0025]
[0026] 或者如以下所示的原理上等同但更详细的代表所示：
[0027]
[0028] 并且对于结构III额外条件是(2)：R6、R9、R10或R11中的至少一个是羟基。
[0029] 在以上结构式4中
[0030] 烷基是C1-C6烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、戊基、异戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、己基、异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基；
[0031] 结构4中的R可以是氢、C1-C6烷基或(官能团)取代的C1-C6烷基、羧基或所述羧基的衍生物，例如低级烷基(C1-C6)酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基甲酰胺(CONHR′、CONR′R")，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个任意官能团取代；N-羟基琥珀酰亚胺基酯或另一种CO2X型反应性酯，其中X是合适的良好的离去基团(离核体)，其包括但不限于F、N3、SR′、OR′(R′＝芳基或杂芳基)；CONHNH2或CONR′NR″R″′，其中R′、R″、R″′独立地为H、低级烷基(C1-C6)、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被一个或多个任意官能团取代；CONHOH或CONR′OR″，其中R′、R″独立地为H、低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被一个或多个任意官能团取代；COCHN2或COCR′N2，其中R′＝低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；氨基、烷基氨基(其中烷基＝C1-C10)或二烷基氨基，其烷基部分可任选地被任意官能团特别是羧基或所述羧基的衍生物例如低级烷基(优选C1-C6)酯、芳基酯或杂芳基酯取代，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被任意官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基酰胺(NHCOR′、NHCOR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个任意官能团取代；叠氮基；N-马来酰亚胺基烷基；碘乙酰胺或适合与生物分子缀合的任意其他反应性基团；
[0032] 任选地，所述基团R中的碳链可含有双键或三键和/或环，和/或不带电荷的基团以及一个、两个、三个或四个杂原子。
[0033] 本发明更具体的实施方案是如上定义的荧光染料，其中结构I-III中的R3和R4独立地为
[0034] 氢；C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；羧基或所述羧基的衍生物，例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基甲酰胺(CONHR′、CONR′R")，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；N-羟基琥珀酰亚胺基酯或另一种式CO2X的反应性酯，其中X是良好的离去基团，例如F、N3、SR′、OR′，其中R′＝芳基或杂芳基；CONHNH2或CONR′NR″R″′，其中R′、R″、R″′独立地为H、低级烷基优选C1-C6烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；CONHOH或CONR′OR″，其中R′、R″独立地为H、低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；COCHN2或COCR′N2，其中R′＝低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；氨基、低级烷基氨基或二烷基氨基，其烷基部分可任选地被如下定义的官能团特别是羧基或所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯取代，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；叠氮基；N-马来酰亚胺基烷基、碘乙酰胺或适合与生物分子缀合的任意其他反应性基团；芳硫基或烷硫基，其芳基或烷基部分可任选地被任意不带电荷的基团，所述不带电荷的基团包括叠氮基-N3、羧基、所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯取代，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；烷基、芳基或杂芳基酰胺(NHCOR′、NHCOR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；
[0035] 任选地，R1、R2、R3和R4中的碳链可含有双键或三键和/或环，和/或例如羟基的不带电荷的基团，以及一个、两个、三个或四个杂原子；
[0036] R5＝H、F或Cl；
[0037] R6、R9、R10、R11＝H或OH，并且如果组R6、R9、R10、R11中的一个或多个取代基是OH，则以上结构I-III中的波形键(～～～)表示所有可能的异构体；
[0038] R7、R8独立地为H、C1-C4烷基、F、Cl、Br或I；
[0039] 条件是(1)，式I、II和III表示的所有染料含有至少一个掺入荧光团的结构的取代的3-羟基-1，2，3，4-四氢喹啉片段(具有元素-CH2CH(OH)CH2-)，如式I、II和III以及以下的结构式中所示，
[0040]
[0041] 对于结构III额外条件是(2)：R6、R9、R10或R11中的至少一个是羟基；
[0042]
[0043] 其中
[0044] 结构4中的烷基是C1-C6烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、戊基、异戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、己基、异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基；
[0045] 结构4中的R可以是氢、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基、羧基或所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基甲酰胺(CONHR′、CONR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；N-羟基琥珀酰亚胺基酯或另一种式CO2X的反应性酯，其中X是良好的离去基团，例如F、N3、SR′、OR′，其中R′＝芳基或杂芳基；CONHNH2或CONR′NR″R″′，其中R′、R″、R″′独立地为H、C1-C6烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；CONHOH或CONR′OR"，其中R′、R″独立地为H、低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；COCHN2或COCR′N2，其中R′＝低级烷基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；氨基、低级烷基氨基或二烷基氨基，其烷基部分可任选地被如下定义的官能团取代，特别是被羧基或所述羧基的衍生物例如低级烷基酯、芳基酯或杂芳基酯取代，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分任选地被如下定义的官能团取代；伯或仲烷基、芳基或杂芳基酰胺(NHCOR′、NHCOR′R″)，其中所述烷基、芳基或杂芳基部分(R′、R″)任选地被一个或多个如下定义的官能团取代；叠氮基；N-马来酰亚胺基烷基、碘乙酰胺或适合于与生物分子缀合的任意其他反应性基团；
[0046] 其中术语“如下定义的官能团”是指选自下列基团的基团：环烯基；烯基例如乙烯基、烯丙基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、1，3-丁二烯-1-基、1，3-丁二烯-2-基、1，2-丙二烯-1-基；炔基例如乙炔基、丙炔基、炔丙基；芳基例如苯基、1-萘基、2-萘基、9-蒽基-、芘-1-基、芘-2-基；卤素原子如F、Cl、Br、I；叠氮基；亚硝基；重氮基；重氮羰基；羟基；保护的羟基OR，其中R＝例如甲酰基、乙酰基的酰基、四氢吡喃基、叔丁基、烯丙基、炔丙基、苯基、对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、全氟苯基、全氯苯基、苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、三烷基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基烷基甲硅烷基；巯基；保护的巯基SR，其中R为如上对于OR所定义；伯氨基和仲氨基；肼基；羟基氨基；醛和酮中的羰基；保护的羰基；腙；肟；硫酮；亚砜；砜；磺酸残基及其盐；羧酸基团COOH和酯基COOR，其中R＝例如CH3、C2H5、叔丁基的烷基、烯丙基、炔丙基、苯基、对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、全氟苯基、全氯苯基、苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、三烷基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基烷基甲硅烷基，特别是N-羟基琥珀酰亚胺基；伯、仲和叔酰胺基；亚磷酰二胺(phosphorodiamidite)基团；C2H5；异丙基；烯丙基；叔丁基；苯基；亚磷酰胺(phosphoroamidite)基团[-OP(NR′2)(OR″)]，其中R′＝CH3、C2H5、异丙基、烯丙基、叔丁基、苯基，R″＝H、烷基、芳基、杂芳基；亚磷酰二胺基团[-OP(NR2)]，其中R＝CH3、C2H5、异丙基、烯丙基、叔丁基、苯基；磷酸残基-OP(O)(OR′)(OR″)，其中R′(R″)＝H、CH3、C2H5、烯丙基、叔丁基、苯基、NH2；膦酸残基-P(O)(OR′)(OR″)，其中R′(R″)＝H、CH3、C2H5、烯丙基、叔丁基、苯基、NH2；N-邻苯二甲酰亚胺基和杂环残基；
[0047] 任选地，所述基团R中的碳链可含有双键或三键和/或环，和/或不带电荷的基团以及一个、两个、三个或四个杂原子。
[0048] 本发明的优选实施方案是如上定义的荧光染料，其中术语“如下定义的官能团”在每次出现时是指羟基。
[0049] 本发明的另一优选实施方案是上文结构III的化合物，其具有两个羟基，并且其中R6＝R9＝OH且R10＝R11＝H，或者R6＝R9＝H且R10＝R11＝OH。
[0050] 结构III的另一优选化合物具有一个羟基，并且R6＝OH且R9＝R10＝R11＝H，或者R106 9 11
＝OH且R＝R＝R ＝H。
＝OH且R＝R＝R ＝H。
[0051] 本发明的另一具体实施方案是表示化合物5-R3之一的荧光染料，其中R1＝R2＝CH2CF3，R6＝OH且R3＝CO2H，其反应性酯(优选N-琥珀酰亚胺基氧基羰基、2，3，5，6-四氟苯氧基羰基或五氟苯氧基羰基)或者具有带一个末端氨基或羧酸基团的连接基的酰胺如以下结构式所示
[0052]
[0053] 本发明的另一具体实施方案是表示化合物14a，b-R3之一的荧光染料，其中R1＝R2＝OH，或者R1＝OH且R2＝H，并且其中R3＝CO2H，其反应性酯(优选N-琥珀酰亚胺基氧基羰基、2，3，5，6-四氟苯氧基羰基或五氟苯氧基羰基)或者具有带一个末端氨基或羧酸基团的连接基的酰胺。
[0054]
[0055] 另一个优选实施方案表示结构4的荧光染料，其中烷基是直链或支链C1-C6烷基链，优选C1-C4烷基，最优选甲基；R是CO2H或反应性酯，优选N-琥珀酰亚胺基氧基羰基、2，3，5，6-四氟苯氧基羰基或五氟苯氧基羰基，或者是能够参与体外或体内化学连接反应的官能团，例如叠氮化物、炔烃、张力较大的(strained)烯烃(例如(E)-环辛烯、环丙烯或降冰片烯)或四嗪反应性基团。通常，官能团通过连接基(优选酯、酰胺、聚亚甲基(C2-C10)或聚(乙二醇)(PEG，[OCH2CH2]n，n＝2-6)连接基)与(三取代的)苯基连接。作为其它的选择，R是与关注的生物学靶点形成共价键的任意配体，或与关注的生物学靶点结合的非共价配体，例如多西紫杉醇或jasplakinolide衍生物。
[0056] 通常，配体通过连接基(优选酯、酰胺、聚亚甲基(C2-C10)或聚(乙二醇)(PEG，[OCH2CH2]n，n＝2-6)连接基)与(三取代的)苯基连接。
[0057] 更具体地，该荧光染料由如以下结构式所示的化合物4-R表示，其中R＝CO2H或其反应性酯(优选N-琥珀酰亚胺基氧基羰基、2，3，5，6-四氟苯氧基羰基或五氟苯氧基羰基)：
[0058]
[0059] 在另一具体实施方案中，该荧光染料由如以下结构式所示的化合物33、33-NHS、33-卤代、33-微管蛋白和34之一表示：
[0060]
[0061] 本文所用的术语“取代”通常是指存在一个或多个取代基，特别是选自以下的取代基：直链或支链烷基特别是C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基；异烷基，例如异丙基、异丁基(2-甲基丙基)；仲烷基，例如仲丁基(丁-2-基)；叔烷基，例如叔丁基(2-甲基丙基)。
[0062] 另外，术语“取代”包括如下定义的更具体的术语“官能团取代”。特别地，取代基可以是具有氟-、氯-或溴取代基代替氢原子的烷基，或甲氧基、乙氧基、2-(烷氧基)乙氧基(AlkOCH2CH2O)，并且在更一般的情况下，为Alk(OCH2CH2)nOCH2CH2-型的寡聚(乙二醇)残基，其中Alk＝CH3、C2H5、C3H7、C4H10，且n＝1-23。上文已经指出了特定结构中的其他合适或优选的取代基，但不应将其作为唯一可能的实施方案。
[0063] 本文所用的术语“官能团取代”通常是指存在一个或多个官能团，特别是包括环烯基；烯基例如乙烯基(ethenyl或vinyl)、烯丙基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、1，3-丁二烯-1-基、1，3-丁二烯-2-基、1，2-丙二烯-1-基(丙二烯基)；炔基例如乙炔基、丙炔基、炔丙基；芳基例如苯基、1-萘基、2-萘基、9-蒽基-、芘-1-基、芘-2-基；一个或多个卤素原子(F、Cl、Br、I)；叠氮基(-N3)；亚硝基(N＝O)；重氮基[＝N(+)＝N(-)]；重氮羰基[＞C＝N(+)＝N(-)]；羟基(OH)；保护的羟基(OR，R＝例如甲酰基、乙酰基的酰基、四氢吡喃基、叔丁基、烯丙基、炔丙基、苯基、对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、全氟苯基、全氯苯基、苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、三烷基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基烷基甲硅烷基)；巯基(SH)；保护的巯基(SR，R为如上文所定义)；伯氨基和仲氨基(NH2和NHR，R如上文所定义)；肼基(-NHNH2)；羟基氨基(-NHOH和H2NO-)；醛和酮中的羰基(-CHO和＞C＝O)；保护的羰基(＞C(OCH3)2、＞C(OCH2CH2O)以及其他缩醛和缩酮)；腙(＞C＝NNR′R″)；肟(＞C＝N-OR)；硫酮(＞C＝S)；亚砜(＞S＝O)；砜(-SO2-)；磺酸残基及其盐[-SO3H和-SO3(-)]；羧酸基团(COOH)和酯基(COOR，R＝例如CH3、C2H5、叔丁基的烷基、烯丙基、炔丙基、苯基、对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、全氟苯基、全氯苯基、苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、三烷基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基烷基甲硅烷基，特别是N-羟基琥珀酰亚胺基)；伯、仲和叔酰胺基；亚磷酰二胺基团[-OP(NR2)，R＝CH3、C2H5、异丙基、烯丙基、叔丁基、苯基]；亚磷酰胺基团[-OP(NR′2)(OR″)，R′＝CH3、C2H5、异丙基、烯丙基、叔丁基、苯基，R″＝H、烷基、芳基、杂芳基]；亚磷酰二胺基团[-OP(NR2)，R＝CH3、C2H5、异丙基、烯丙基、叔丁基、苯基]；磷酸残基[-OP(O)(OR′)(OR″)，R′(R″)＝H、CH3、C2H5、烯丙基、叔丁基、苯基、NH2]；膦酸残基[-P(O)(OR′)(OR″)，R′(R″)＝H、CH3、C2H5、烯丙基、叔丁基、苯基、NH2]；N-邻苯二甲酰亚胺基。
[0064] 本文所用的术语“官能团取代”还指任选存在一个或多个杂环残基，特别是包括环氧乙烷、氮丙啶、硫杂丙环、氮杂环丁烷、吡咯烷、四氢吡喃、四氢噻吩、1，3-噁唑啉、1，3-噁唑烷、噻吩、呋喃、吡咯、吡啶、喹啉、嘧啶、嘧啶-4-酮、嘧啶-2-酮、哒嗪、吡嗪、1，3，5-三嗪、1，2，4-三嗪、1，3-咪唑、噻唑、1，2，4-三唑、1，2，3-三唑、1，3-噁唑。所述杂环可以通过不同位置连接到取代基的碳骨架上(例如1-氮丙啶基、2-氮丙啶基、吡咯烷-1-基、吡咯烷-2-基、吡咯烷-3-基、噻吩-2-基、噻吩-3-基、吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基等)。
[0065] 如本文所用，术语“官能团取代”还指任选存在所述官能团彼此的任何组合(例如，2-重氮基酮基团，由-COCN2-表示)。如本文所用，术语“官能团取代”还指任选存在所述官能团与上述任何杂环残基的任何组合。
[0066] 如本文所用，术语“烷基”或“环烷基”通常包括任何未取代或取代(环)烷基，通常具有1-30个或更多个C原子，特别是还包括低级(环)烷基。如果没有更具体地定义，术语“低级烷基”是指C1-C10烷基，更优选C1-C6烷基或C1-C4烷基。其一些非限制性实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、戊基、异戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、己基、异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基等。
[0067] 如本文所用，术语“芳基”是指具有一个、两个或三个芳环的未取代或取代的单-、二-或三环碳环系统，其包括但不限于苯基、萘基、蒽基、薁基(azulyl)、四氢萘基，茚满基和茚基。
[0068] 如本文所用，术语“杂芳基”或“杂环”通常是指具有5至10个环原子的未取代或取代的环状芳基(残基)，其中至少一个环原子选自S、O和N；所述基团通过任意环原子与分子的其余部分连接。代表性但非限制性的示例是呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、喹啉基和异喹啉基。
[0069] 本发明提供的染料是不含分离的C＝C键的细胞穿透羟基化荧光染料，参见结构Ia/Ib、IIa/IIb、IIIa/IIIb和4a/4b；在非烯丙基和非苄基位置羟基化。
[0070] 所有这些染料(路线2)在“开环”形式(a)和“闭合”形式(b)之间存在平衡。它们属于如下组：罗丹明染料(X＝O)、碳罗丹明(carborhodamine)(X＝C(烷基)2)、硅-罗丹明(SiR；X＝Si(烷基)2)、或锗-罗丹明(GeR；X＝Ge(烷基)2)。
[0071] 通常，由式I、II和III表示的所有染料含有一个或两个掺入六元环中的元素-CH2CH(OH)CH2-，所述六元环与荧光团稠合并包含一个或多个氮原子，从而提供单-或二羟基化荧光团核心(例如，在结构I和II中，R6＝H或OH)，并且至少一个取代的3-羟基-1，2，3，4-四氢喹啉片段掺入到荧光团结构中。在两个-CH2CH(OH)CH2-元素的情况下，它们对称地连接到荧光团的二芳基甲烷核心的两个芳环上。在结构III中，R6、R9、R10或R11中的至少一个是羟基。
[0072] 在一个优选实施方案中，结构III的化合物具有两个羟基(R6＝R9＝OH且R10＝R11＝H，或者R6＝R9＝H且R10＝R11＝OH)。
[0073] 在一些优选实施方案中，所有烷基都是低级烷基。
[0074] 重要的是，所使用的合成方法(参见以下部分)对结构I-III中的残基R1-R5和结构4中的基团R的性质具有一些限制。特别地，R1和R2不能是氢原子。
[0076] US 6,828,159 B1公开了carbopyronine染料(例如，路线2的结构I-III中的X＝C(烷基)2)，包括具有掺入氮原子和一个或多个重键的环系的那些，但是该文献未提及连接到这些环的羟基。密切相关的WO2013/029650和WO2014/152298没有公开具有羟基化的五元或六元环(掺入荧光团的氮原子并与邻近这些氮取代基的位置稠合)的荧光染料(硅和锗罗丹明)。
[0077] 结构4表示锗原子和羟基化(在C-3处)氮杂环丁烷环(具有与C-3连接的羟基的饱和四元氮杂环)掺入到锗-罗丹明(GeR)结构中的新型组合。
[0078] WO2015/153813 A1请求保护具有掺入氮杂环丁烷环中的氮原子的多种荧光染料(请求保护羟基化的氮杂环丁烷但没有具体示例)，但该文献未提及锗-罗丹明。WO2014/152298请求保护GeR，但没有公开具有氮杂环丁烷环和掺入氮原子的羟基化氮杂环丁烷环的GeR。
[0079] 如在具有图像和光物理数据的实施例中证明的，路线2中结构I-III和4中羟基的存在是关键的，因为它能够赋予染料亲水性，减少它们与生物体中的疏水结构的非特异性结合，并改善其在光学显微术中的性能(通过减少非特异性结合和与其相关的荧光背景)，同时在超分辨率光学显微术中保持足够的光稳定性(例如在受激发射耗尽-STED-显微中使用非常高的光强度)。
[0080] 此外，在远离羧基的位置存在羟基(在路线2中，结构I-III中的R3或R4以及化合物4中的R＝OH)不排除形成氨基反应性酯，并且不降低它们的稳定性(与含有两个烯丙醇片段3
的染料的情况相比，所述两个烯丙醇片段紧邻掺入到R 中的羧基，其被证明在试图活化该羧基的过程中易于形成大环内酯；参见例如G.Y.Mitronova等人，在Eur.J.Org.Chem.2015，
337-349中)。此外，荧光团的高苄型(homobenzylic)而非苄基位置的羟基化确保了探针的化学和代谢稳定性的改善。总之，这些数据表明路线2中的染料的新颖性、创造性和潜在的工业应用。
的染料的情况相比，所述两个烯丙醇片段紧邻掺入到R 中的羧基，其被证明在试图活化该羧基的过程中易于形成大环内酯；参见例如G.Y.Mitronova等人，在Eur.J.Org.Chem.2015，
337-349中)。此外，荧光团的高苄型(homobenzylic)而非苄基位置的羟基化确保了探针的化学和代谢稳定性的改善。总之，这些数据表明路线2中的染料的新颖性、创造性和潜在的工业应用。
[0081] 本发明的新型荧光染料的一般合成
[0082] 式I和II的染料的合成
[0083]
[0084] 路线3 N，N′-双-(2，2，2-三氟乙基)-6′-羧基-Q-罗丹明-β，β′-二醇(5)、其氨基反应性N-羟基琥珀酰亚胺基酯(5-NHS)以及与HaloTag-胺的缀合物(5-卤代)的制备。
[0085] 路线3中示出了N，N′-双-(2，2，2-三氟乙基)-6′-羧基-Q-罗丹明-β，β’-二醇(5)(I型样品染料)的合成。该染料是基于Q-罗丹明荧光团核心(V.P.Boyarskiy，V.N.Belov，R.Medda，B.Hein，M.Bossi，S.W.Hell，Chem.Eur.J.2008，14，1784-1792)开发。母体化合物5(6)-羧基-Q-罗丹明在540nm处(在PBS水性缓冲液中)具有最大吸收，ε＝70000M-1cm-1，在561nm处具有发射最大值和0.79的荧光量子产率。5(6)-羧基-Q-罗丹明的光谱性质与普通染料罗丹明6G(在乙醇中，吸收和发射最大值分别为530nm和556nm(ε＝115000M-1cm-1)，荧光量子产率0.95)的光谱性质相似，这是相当亲脂的，并且没有在生命科学中广泛使用。
[0086] Q-罗丹明的仲氨基易于酰化反应；结果，5(6)-羧基-Q-罗丹明(路线3)不形成稳定的N-羟基琥珀酰亚胺基酯。5(6)-羧基-Q-罗丹明的另一个缺点是其在水和有机溶剂中的低溶解度(由于其高度对称的多环结构)。
[0087] 本发明人设计并制备了N，N′-双-(2，2，2-三氟乙基)-6′-羧基-Q-罗丹明-β，β’-二醇(路线3中的化合物5)，其具有Q-罗丹明的荧光团，但没有它的缺点。实际上，化合物5中的两个游离NH基团被2，2，2-三氟乙基取代基保护而免于N-酰化。因此，染料5形成稳定的NHS酯。这些基团既不是强电子受体也不是电子供体，并且具有与氢原子类似的诱导效应：与母体Q-罗丹明相比，它们不会改变吸收和发射带的位置。由于2，2，2-三氟乙基实质上增加了染料的亲脂性，因此结构5中存在两个羟基是抵消这种效应所必需的。所得染料5在水性缓冲液中是水溶性的并且是高荧光的。由氨基反应性染料5-NHS制备具有Halo-Tag-胺(5-卤代)的缀合物(路线3)。
[0088] 染料5(路线4)以3种非对映异构体的混合物的形式存在，这是由于在缩合步骤期间其两个羟基相互的顺式和反式位置的可能定位。化合物5的顺式异构体具有对称面，而反式-5具有C2旋转轴。由于侧苯环与荧光团核心之间的C-C单键的受阻旋转，顺式-5以两种非对映异构体的形式存在(其中羧基在苯环的邻位并且在与吨核心中的羟基在分子平面的同一侧，或在相反一侧)。通过HPLC分析检测5的所有3种非对映异构体，并分离出2种非对映异构体，并表现了相同的光学性质，使得对于任何成像应用都不需要分离非对映异构标记。
[0089]
[0090] 路线4反式-5和顺式-5的非对映异构形式。
[0091] 按照相同的方法，可以用较小变化的原料制备II型染料。
[0092] 式III的染料的合成
[0093]
[0094] 路线5羟基化ROX染料13a和13b的合成。
[0095] 路线5中示出了羟基化ROX染料(6′-羧基异构体)的合成。这些染料是罗丹明101(或X-罗丹明)的衍生物，其在有机溶液和水溶液中具有大于0.90的优异的荧光量子产率。罗丹明101及其衍生物的主要结构特征是存在久洛利定(julolidine)片段-三环系统掺入了氮原子并使荧光团硬化，这导致吸收和发射最大值两者红移，并降低非辐射衰变途径的贡献，两者都是期望的特征。罗丹明101的5′-羧基和6′-羧基衍生物可商购获得作为5-和6-ROX染料；路线5给出6-ROX的结构(化合物13c)。ROX染料的吸收和发射最大值分别为572nm和602nm，并且消光系数为约80000M-1cm-1。有趣的是，乙酸酯9和二苯甲酮12a之间的反应产生三种产物，在移除乙酸酯保护基后，得到三种染料：13a、13b和13c(最初仅预期到13a)。该结果可以通过如下来解释：12a的酸催化逆Friedel-Crafts酰化反应得到化合物10，然后进行Friedel-Crafts酰化，形成具有2-羟基化或2-乙酰氧基化久洛利定片段的新二苯甲酮。
[0096] 由于围绕侧苯环和荧光团核心之间的C-C单键的受阻旋转，染料13a以两种非对映异构体的形式存在(其中羧基在苯环的邻位并且在与久洛利定片段中的羟基在分子平面的同一侧，或在相反一侧；路线5)。染料13b以3种非对映异构体的混合物的形式存在，这是由于在缩合步骤期间其两个羟基可能相互以顺位和反位定位。与化合物5一样，化合物13b的顺式异构体具有对称面，并且反式-13b具有C2旋转轴。由于侧苯环和荧光团核心之间的C-C单键周围的受阻旋转，顺式13b以两种非对映异构体的形式存在(其中羧基在苯环的邻位且与吨核心中的羟基在分子平面的同一侧，或在相反一侧)。实际上，通过HPLC分析检测了13b的所有三种异构体(参见实验部分)。
[0097] 路线5中合成的显著特征是其在一个步骤中产生5种ROX类似物的可分离混合物。这可能是有利的，因为已知活体标本中的特异性和标记效率取决于荧光标记物的细微结构变化；然而，这些染料的相同光学性质使得能够使用羟基化ROX标记13a、b而不分离单个非对映异构体。
[0098]
[0099] 路线6染料13a、b的非对映异构形式。
[0100] 式4的染料的合成
[0101]
[0102] 路线7四甲基-Ge-罗丹明19的合成。
[0103] 用于与生物分子或小分子配体缀合的具有游离6′-羧基(19)的母体四甲基-GeR在文献中尚未报道。路线7中示出了染料19的合成。它是通过芳基锂中间体的亲核加成来制备的，其在-78℃下由2-溴对苯二甲酸18的双-OBO-酯产生(如A.N.Butkevich等人，在S.W.Hell，Angew.Chem.Int.Ed.2016，55，3290-3294中所述)，对应于10-锗杂蒽酮(2，7-双(二甲基氨基)二苯并[b，e]胚芽碱-10(5H)-酮)17。通过如下建立获得后者的便利方法：区域选择性双-对-溴化适当取代的二芳基二甲基锗烷15以得到二溴化物16，然后与叔丁基锂进行双锂-卤素交换以及二锂中间体与N，N-二甲基氨基甲酰氯的反应(3步收率49％)。四甲基-GeR 19表现出与SiR非常相似的特性(对于19，PBS 7.4中的吸收/发射最大值：634/
655nm，量子产率0.43，相比之下，对于SiR的吸收/发射最大值：645/666nm，量子产率0.41)。
小的蓝移(吸收为-11nm，最大发射为-6nm)可以通过较小的σ*-π*交叠来解释，这主要是由于与CAr-Si相比增加的CAr-Ge键长，这导致更高的LUMO能量。预计染料19显示出与SiR的荧光特性类似的荧光特性(对于19，D0.5在1，4-二氧杂环己烷/水中为65.2，对于SiR为64.5)，并且当应用于活细胞作为Halo-tag(19-卤代)或微管蛋白(19-微管蛋白)配体(参见实施例III)时确实显示出高对比度图像。
655nm，量子产率0.43，相比之下，对于SiR的吸收/发射最大值：645/666nm，量子产率0.41)。
小的蓝移(吸收为-11nm，最大发射为-6nm)可以通过较小的σ*-π*交叠来解释，这主要是由于与CAr-Si相比增加的CAr-Ge键长，这导致更高的LUMO能量。预计染料19显示出与SiR的荧光特性类似的荧光特性(对于19，D0.5在1，4-二氧杂环己烷/水中为65.2，对于SiR为64.5)，并且当应用于活细胞作为Halo-tag(19-卤代)或微管蛋白(19-微管蛋白)配体(参见实施例III)时确实显示出高对比度图像。
[0104]
[0105] 路线8羟基化Ge-罗丹明33的合成。
[0106]
[0107] 路线9羟基化Si-罗丹明JF64642的合成。
[0108] 制备双-(N-氮杂环丁烷基)-SiR(JF646)和未知的双-(N-氮杂环丁烷基)-GeR的亲水化类似物，其目的是评价羟基化荧光团的性能(路线8和9)。在氮杂环丁烷取代基的3-位上进行羟基的引入(在辅助氟化物(auxofluoric)基团上唯一可能的位置产生水解稳定的产物)。起始的10-硅杂蒽酮37和10-锗杂蒽酮24依据以下原始方法制备，该方法涉及保护的前体35和22的区域选择性溴化。前体35至36的关键溴化在混合溶剂(乙腈-CHCl3 3∶1，以确保均匀条件)在60℃下进行(与苯酚醚的反应明显慢于与苯胺的反应)。在二芳基二甲基锗烷22的情况下，在乙腈-吡啶(7∶1)中进行溴化以抑制bromodegermylation副反应。使用TIPS(三异丙基甲硅烷基)保护基是区域选择性溴化的先决条件；然而，发现得到的二-TIPSO-锗杂蒽酮太亲油而无法通过色谱法成功纯化，脱保护为24然后用TBSCl再次保护是获得纯10-锗杂蒽酮嵌段25所必需的。如Lavis等人在Nat.Meth.2015，12，244-2509中报道的，用turbo-格氏试剂(iPrMgCl·LiCl)进行亲核加成步骤(25或37+金属化26)不能用这些底物重现。相反，溴化物26适合于在混合溶剂(THF-戊烷2∶1)或2-MeTHF中低温锂-卤素交换(例如A.Nagaki等人，Chem.Eur.J.2010，16，11167-11177)，从而分别用10-硅杂蒽酮37和10-锗杂蒽酮25可重复地提供中等收率(40-50％)的目标内酯38和27。以下合成步骤遵循Lavis等人(同上)的方法，在Buchwald-Hartwig胺化步骤(29→31、39→40)中使用3-(叔丁基甲硅烷氧基)氮杂环丁烷30作为胺配体。最后，脱甲硅烷化和叔丁酯水解提供目标染料33和42。吸收/发射最大值在母体四甲基-SiR和四甲基-GeR类似物的5nm范围内(对于42为
641/662nm，对于SiR为645/661nm；对于33为631/651nm，对于GeR 19为634/655nm)。与母体N，N，N′，N′-四甲基染料(对于SiR为93000M-1cm-1，对于GeR 19为97000M-1cm-1)相比，42-1 -1 -1 -1
(51500M cm )和33(61000M cm )的较低消光系数是由于42和33更高倾向于闭合成无色螺内酯形式(例如，对于42，在1，4-二氧杂环己烷/水中D0.5为72.4，相比之下对于SiR为64.5)。
值得注意的是，与19(0.43)、SiR(0.41)和42(0.42)相比并且类似于JF646(0.54)、双(3-羟基氮杂环丁烷基)-GeR 33在PBS(0.60)中显示出改善的荧光量子产率。
641/662nm，对于SiR为645/661nm；对于33为631/651nm，对于GeR 19为634/655nm)。与母体N，N，N′，N′-四甲基染料(对于SiR为93000M-1cm-1，对于GeR 19为97000M-1cm-1)相比，42-1 -1 -1 -1
(51500M cm )和33(61000M cm )的较低消光系数是由于42和33更高倾向于闭合成无色螺内酯形式(例如，对于42，在1，4-二氧杂环己烷/水中D0.5为72.4，相比之下对于SiR为64.5)。
值得注意的是，与19(0.43)、SiR(0.41)和42(0.42)相比并且类似于JF646(0.54)、双(3-羟基氮杂环丁烷基)-GeR 33在PBS(0.60)中显示出改善的荧光量子产率。
[0109] 得到染料33和42的化学途径(在路线8和9中给出)具有通用特征，并且代表了用于制备10-锗-和10-硅杂蒽酮的新方法。这些途径基于常见的中间体，其不仅用于制备锗和硅荧光素，还用于制备对甲氨基酚(rhodol)和罗丹明，并包括以下步骤：
[0110] a)类似于转化22→23和35→36，使用亲电子溴化试剂(优选N-溴代琥珀酰亚胺)将二-O-TIPS保护的双(3-羟基苯基)硅烷或-锗烷区域选择性溴化成相应的二-O-TIPS-保护的双(2-溴-5-羟基苯基)硅烷或-锗烷；
[0111] b)类似于转化23→24(25)和36→37，在步骤a)得到的二溴化物上进行双金属-卤素交换，然后与氨基甲酰氯优选N，N-二甲基氨基甲酰氯反应。
[0112]
[0113] 因此，本发明的另一方面涉及用于制备锗杂蒽酮和硅杂蒽酮的方法，其包括以下步骤：
[0114] a)使用亲电子溴化试剂优选N-溴代琥珀酰亚胺将二-O-TIPS-保护的双(3-羟基苯基)硅烷或-锗烷区域选择性溴化成相应的二-O-TIPS-保护的双(2-溴-5-羟基苯基)硅烷或-锗烷；
[0115] b)由步骤a)得到的二溴化物上的双金属-卤素交换，然后与氨基甲酰氯优选N，N-二甲基氨基甲酰氯反应；
[0116] c)任选进一步脱保护/再次保护步骤。
[0117] 该方法特别有利地适用于制备以下化合物24、37-OH或其O-保护的类似物，例如路线4中的化合物25和路线5中的化合物37：
[0118]
[0119] 本发明的另一个相关方面涉及上述式I-III和4的化合物作为用于缀合或生物缀合的试剂的用途。更具体地，所述缀合或生物缀合包括与化学实体或物质形成至少一个共价化学键或至少一个分子络合物，所述化学实体或物质例如胺；硫醇；羧酸；醛；醇；芳族化合物；例如四嗪的杂环；炔烃；烯烃，其包括张力较大的烯烃和双环烯烃，例如反式环辛烯和降冰片烯衍生物；有机叠氮化物；染料；氨基酸；与任意化学实体偶联的氨基酸残基；肽；蛋白质(包括酶和免疫球蛋白)；抗体；“纳米抗体”(单域抗体)；碳水化合物(包括结合至蛋白质的碳水化合物残基)；核酸；毒素；脂质；病毒；病毒样颗粒。
[0120] 因此，本发明的密切相关方面表示所得的缀合物或生物缀合物，其包含通过至少一个共价化学键或至少一个分子络合物与化学实体或物质偶联的染料，所述化学实体或物质例如胺；硫醇；羧酸；醛；醇；芳族化合物；例如四嗪的杂环；炔烃；烯烃，其包括张力较大的烯烃和双环烯烃，例如反式环辛烯和降冰片烯衍生物；有机叠氮化物；染料；氨基酸；与任意化学实体偶联的氨基酸残基；肽；蛋白质，特别是酶和免疫球蛋白；抗体；单域抗体；碳水化合物，其包括结合至蛋白质的碳水化合物残基；核酸；毒素；脂质；病毒；病毒样颗粒。
[0121] 在本发明的更具体实施方案中，所述缀合物或生物缀合物包含通过共价键与如下所示的胃蛋白酶抑制剂A、Jasplakinolide衍生物、多西紫杉醇衍生物和卡巴他赛衍生物以及氨基鬼笔环肽偶联的如上文定义的染料：
[0122]
[0123] 上述式I-III和4的化合物及其缀合物特别适合且有利地用作细胞穿透物质的用途，其穿透活细胞和固定细胞的膜。
[0124] 因此，本发明的密切相关方面涉及该用途(体外或体内)以及这些化合物或其缀合物用于跟踪和监测样品(特别是组织或细胞样品)中或物体(包括生物体或动物体)中动态过程的用途(体外或体内)。
[0125] 更具体地，本发明涉及所述化合物或其缀合物在光学显微术、成像技术、蛋白质追踪、核酸标记和流式细胞术中作为荧光标签、分析试剂和标记的用途。
[0126] 其中可以有利地使用请求保护的化合物的光学显微镜和成像技术不受特别限制，并且例如包括共焦显微镜检查、结构照明显微术、受激发射耗尽显微术[STED]、荧光相关光谱法[FCS]、STED和FCS的组合(STED-FCS)、光漂白后的荧光恢复[FRAP]、荧光寿命成像[FLIM]、单个分子返回的基态耗尽[GSD或GSDIM]、RESOLFT显微术(RESOLFT-可逆饱和(可切换)光学线性荧光跃迁)、荧光共振能量转移[FRET](本发明的染料可用作FRET-供体和/或FRET-受体)、如单分子定位显微术[SMLM]的单分子转换技术(SMS：通过记录单分子的荧光信号实现的衍射无限光学分辨率，条件是它们在“黑暗”和“明亮”状态之间可逆或不可逆地切换)、光活化定位显微术[PALM、PALMIRA、fPALM]和随机光学重建显微术[STORM]。
[0128] 附图
[0129] 图1示出a)用5-卤代活标记的表达波形蛋白-HaloTag融合蛋白的转染HeLa细胞的STED图像，左下角是对应共焦图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。
[0130] 图2示出a)用14a-卤代活标记的表达波形蛋白-HaloTag融合蛋白的转染U2OS细胞的STED图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。
[0131] 图3示出a)用6-ROX-卤代活标记的表达波形蛋白-HaloTag融合蛋白的U2OS细胞的STED图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。
[0132] 图4示出了a)用19-微管蛋白活标记的转染的HeLa细胞的STED图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。
[0133] 图5示出a)用19-卤代活标记的表达波形蛋白-HaloTag融合蛋白的U2OS细胞的STED图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。
[0134] 图6示出了a)用33-微管蛋白活标记的转染的HeLa细胞的STED图像；(b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。
[0135] 图7示出a)用33-卤代活标记的表达波形蛋白-HaloTag融合蛋白的U2OS细胞的STED图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。
[0136] 图8示出a)同时用14a-卤代和33-微管蛋白活标记的表达波形蛋白-HaloTag融合蛋白的转染HeLa细胞的STED图像；b)和c)是来自al)的框定区域对于用14a-卤代标记的波形蛋白-HaloTag融合蛋白在STED(b)和共焦(c)模式下的特写；d)和e)是来自a2)的框定区域对于33-微管蛋白在STED(d)和共焦(e)模式下的特写。
[0137] 图9示出了具有胃蛋白酶或BSA的33-溶酶体探针的滴定图。
[0138] 一般材料和方法
[0139] 薄层色谱法
[0140] 正相TLC在硅胶60 F254(Merck Millipore，德国)上进行。对于反相的TLC，使用硅胶60 RP-18 F254s(Merck Millipore)。制备TLC在HPTLC硅胶60 F254上进行，其中浓缩区为10×2.5cm(Merck Millipore)。通过将TLC板暴露于UV-光(254nm或366nm)或用香草醛染色(6g香草醛和1.5mL浓H2SO4在100mL乙醇中)加热来检测化合物。
[0141] 柱色谱法
[0142] 粒度为40-63μm的硅胶60购自Merck Millipore。在 60-50 C18(Macherey Nagel GmbH&Co.KG，德国)上进行反相柱色谱法。减活化硅胶60购自MP
Biomedical。使用市售的筒采用自动化IsoleraTMOne系统(Biotage AG，瑞典)进行常规分离。
Biomedical。使用市售的筒采用自动化IsoleraTMOne系统(Biotage AG，瑞典)进行常规分离。
[0143] 吸收光谱法
[0144] 用Varian Cary 4000 UV-Vis双光束分光光度计(Agilent Technologies，美国)记录吸收光谱。为了测定吸收光谱，使用具有1cm路径长度的石英池。在Quantaurus-QY Absolute PL量子产率光谱仪C11347(Hamamatsu Photonics，日本)或Varian Cary Eclipse荧光光谱仪(Agilent Technologies，美国)上获得发射光谱和荧光量子产率。
[0145] 核磁共振(NMR)
[0146] 在Agilent 400MR DD2光谱仪上在室温(RT；25℃)下记录NMR波谱。使用CDCl3中CHCl3(7.26ppm)、CD3OD中CHD2OD(3.31ppm)、(CD3)2CO中CHD2COCD3(2.05ppm)或DMSO-d6中DMSO-d5的残留质子信号，所有波谱均参照四甲基甲硅烷作为内标(δ＝0.00ppm)。信号的多重性描述如下：s＝单峰，br.s＝宽单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰。耦合常数nJx，y以Hz形式给出，其中n是耦合的核x和y之间的键数。对于通过HSQC间接检测显示的13C信号，仅记录了与H原子连接的碳原子的共振。
[0147] 质谱(MS)
[0148] 在Varian 500-MS光谱仪(Agilent Technologies，美国)上获得具有电喷雾离子化(ESI)的低分辨率质谱(50-3500m/z)。在Bruker micro TOF(ESI-TOF-MS)光谱仪(Bruker公司，美国)上获得高分辨率质谱(ESI-HRMS)。
[0149] 高效液相色谱法(HPLC)
[0150] HPLC系统(Knauer，德国)：具有10mL泵头的Smartline泵1000(2x)，UV检测器2500，柱温箱4000，混合室，具有用于分析的20或50μL定量环(loop)以及用于制备柱的500μL定量环的注射阀；6通3通道切换阀；分析柱：Eurospher-100 C18 5μm(如果没有另外说明)，或Kinetex C18 100，5μm，250×4mm，1.2mL/min；制备柱：Kinetex C18 100，5μm，250×20mm，10mL min/mL，溶剂A：水+0.1％v/v三氟乙酸(TFA)；溶剂B：MeCN+0.1％v/v TFA(如果没有另外说明)。用于分离和纯化酸敏感染料或其衍生物，乙腈-含有0.05-0.1M Et3N*H2CO3缓冲液的水性体系(pH＝8；Sigma，或由1M Et3N水溶液以及通过蒸发固体CO2获得的CO2气体自行准备)。
[0151] 细胞培养和活标记
[0152] 使用HeLa或U2OS细胞。细胞在#1.5盖玻片上生长，并在37℃、5％CO2下，于DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)中培养，并且补充有10％FBS(胎牛血清)、1％丙酮酸钠和1％青霉素/链霉素。U2OS细胞系是稳定的细胞系，其具有稳定表达的波形蛋白-HaloTag融合蛋白(M.Ratz，I.Testa，S.W.Hell，S.Jakobs，Sci.Rep.2015，5，9592)。为了在HeLa细胞中TM
表达波形蛋白-HaloTag融合蛋白，使用TurboFect 转化试剂(Fermentas/Thermo
ScientificTM，生命技术商标)在6孔板中用3μg DNA/孔转染细胞。转染后24小时，将细胞与各个染料(通常为1μM)在生长条件下孵育20分钟，在HDMEM中在37℃下洗涤10-30分钟，并置于具有预热的HDMEM(37℃，DMEM缺乏酚红，10mM HEPES，pH 7.4 1％青霉素/链霉素)的成像室中。在室温下进行实时STED成像。
表达波形蛋白-HaloTag融合蛋白，使用TurboFect 转化试剂(Fermentas/Thermo
ScientificTM，生命技术商标)在6孔板中用3μg DNA/孔转染细胞。转染后24小时，将细胞与各个染料(通常为1μM)在生长条件下孵育20分钟，在HDMEM中在37℃下洗涤10-30分钟，并置于具有预热的HDMEM(37℃，DMEM缺乏酚红，10mM HEPES，pH 7.4 1％青霉素/链霉素)的成像室中。在室温下进行实时STED成像。
[0153] 实时STED成像
[0154] 使用来自Abberior仪器( 德国)的市售双色STED 775四扫描显微镜获得STED和共焦对应图像，所述显微镜配备有Olympus IX83显微镜支架和Olympus UplanSApo
100x/1.4 OIL物镜。
100x/1.4 OIL物镜。
[0155] 用脉冲561nm或脉冲640nm激光分别激发染料的激发最大值。STED激光在775nm处脉冲。
[0156] 荧光检测在如下两个光谱检测通道中进行：605-625nm和650-720nm。
[0157] 对于化合物5-卤代，激发激光在532nm脉冲，并且STED激光在631nm脉冲(图6)。荧光检测为从540-580nm。
[0159] 实施例1
[0160] 荧光罗丹明染料及其前体的合或
[0161] N，N′-双-(2，2，2-三氟乙基)-6′-羧基-Q-罗丹明-β，β′-二醇(5)
[0162] 化合物1-TBS.将3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)苯胺(根据M.S.Hossain等人，Org.Biomol.Chem.2015，13，5082-5085制备)(2.24g，10.0mmol)和环氧氯丙烷(0.94g，10.0mmol)在乙酸(20mL)中的混合物在RT下搅拌过夜。将混合物倒入NaHCO3水溶液(30g在
300mL水)中，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，并用MgSO4干燥。
将产物1-TBS通过快速柱色谱法(Biotage SNAP Ultra 100g；梯度0％至5％乙酸乙酯-
CH2Cl2)分离，得到淡黄色油，收率0.84g(27％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.02(t，J＝
8.0Hz，1H)，6.29-6.23(m，2H)，6.16(t，J＝2.2Hz，1H)，4.09-4.03(m，1H)，3.68(dd，J＝
11.3，4.5Hz，1H)，3.63(dd，J＝11.2，6.1Hz，1H)，3.35(dd，J＝13.3，4.4Hz，1H)，3.21(dd，J＝13.3，7.1Hz，1H)，0.98(s，9H)，0.19(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ156.8，149.1，
129.9，110.1，106.8，105.2，69.9，47.7，47.1，25.7，18.2，-4.4.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝316.3(100)[M+H]+.
300mL水)中，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，并用MgSO4干燥。
将产物1-TBS通过快速柱色谱法(Biotage SNAP Ultra 100g；梯度0％至5％乙酸乙酯-
CH2Cl2)分离，得到淡黄色油，收率0.84g(27％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.02(t，J＝
8.0Hz，1H)，6.29-6.23(m，2H)，6.16(t，J＝2.2Hz，1H)，4.09-4.03(m，1H)，3.68(dd，J＝
11.3，4.5Hz，1H)，3.63(dd，J＝11.2，6.1Hz，1H)，3.35(dd，J＝13.3，4.4Hz，1H)，3.21(dd，J＝13.3，7.1Hz，1H)，0.98(s，9H)，0.19(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ156.8，149.1，
129.9，110.1，106.8，105.2，69.9，47.7，47.1，25.7，18.2，-4.4.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝316.3(100)[M+H]+.
[0163] 化合物1-Me.将3-甲氧基苯胺(m-茴香胺；2.46g，20.0mmol)和环氧氯丙烷(2.03g，22.0mmol，1.1eq)在乙酸(7mL)中的混合物在RT下搅拌过夜。将混合物倒入NaHCO3水溶液(15g在200mL水中)中，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用MgSO4干燥。将产物1-Me通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 120g；梯度0％至5％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，得到淡黄色油，收率1.66g(38％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.10(t，J＝8.1Hz，1H)，6.32(ddt，J＝8.2，2.5，0.7Hz，1H)，6.27(ddt，J＝8.1，2.3，0.6Hz，1H)，6.22(t，J＝2.3Hz，1H)，4.0δ(ddtd，J＝7.2，6.1，4.5，0.5Hz，1H)，3.77(s，3H)，3.69-3.58(m，
2H)，3.36(dd，J＝13.3，4.4Hz，1H)，3.21(dd，J＝13.3，7.2Hz，1H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：
δ160.9，149.2，130.2，106.3，103.3，99.4，69.8，55.2，47.7，47.1.
2H)，3.36(dd，J＝13.3，4.4Hz，1H)，3.21(dd，J＝13.3，7.2Hz，1H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：
δ160.9，149.2，130.2，106.3，103.3，99.4，69.8，55.2，47.7，47.1.
[0164] 化合物2a-TBS和2b-TBS.将1-TBS(343mg，1.09mmol)和N，N-二乙基苯胺(810mg，5.43mmol，5eq)在1，2-二氯苯(15mL)中的溶液在140℃(浴温)于密封的容器中加热5天。冷却后，加入1M NaOH(10mL)，分离有机层，并将包含粘稠残渣的水层用CH2Cl2(20mL)萃取。将合并的有机层用1M NaOH、水洗涤，并用MgSO4干燥。TLC控制(SiO2/CH2Cl2中20％乙酸乙酯)：
Rf(产物)＝0.3。将产物通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 24g；梯度0％至
20％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，得到淡黄色油，收率0.84g(27％)，其为位置异构体2a-TBS和
2b-TBS的2∶1混合物，将其在未分离下在下一步骤中使用。主要7-异构体(2a-TBS)：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ6.81(d，J＝8.3Hz，1H)，6.23-6.17(m，1H)，6.04(d，J＝2.3Hz，1H)，4.23-
4.18(m，1H)，3.32-3.28(m，1H)，3.23-3.20(m，1H)，2.97(ddt，J＝16.1，4.3，1.3Hz，1H)，
2.75-2.67(m，1H)，0.97(s，9H)，0.18(s，6H)。次要5-异构体(2b-TBS)：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ6.87(t，J＝8.0Hz，1H)，6.23-6.17(m，2H)，4.27-4.22(m，1H)，3.28-3.24(m，1H)，
3.20-3.17(m，1H)，2.85(dd，J＝17.4，4.7Hz，1H)，2.80-2.73(m，1H)，1.00(s，9H)，0.23(s，
3H)，0.22(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3；2a-TBS/2b-TBS)：δ155.0，154.8，145.1，144.3，
131.1，126.9，111.5，110.3，108.1，107.3，105.5，63.6，63.4，47.6，47.3，34.9，30.7，25.8，+
25.7，18.3，18.2，-4.2，-4.4.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝250.2(100)[M+H] .[0165] 化合物2a-Me(7-异构体).将1-Me(1.61g，7.46mmol)和N，N-二乙基苯胺(5.56g，
37.3mmol，5eq)在1，2-二氯苯(50mL)中的溶液在160℃(浴温)于密封的容器中加热5天。冷却后，将挥发物在蒸发器(浴温75℃)上移除，将残渣在CH2Cl2(100mL)中溶解，用1M NaOH和水(各50mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥，过滤并在85℃下真空干燥以移除大部分的N，N-二乙基苯胺。TLC控制(SiO2/CH2Cl2中20％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.3。将产物通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 80g；梯度0％至30％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，得到淡黄色油，收率468mg(35％)的2a-Me(7-异构体，几乎不含5-异构体)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ
6.88(d，J＝8.3Hz，1H)，6.28(dd，J＝8.3，2.5Hz，1H)，6.10(d，J＝2.5Hz，1H)，4.22(qd，J＝
4.6，2.3Hz，1H)，3.74(s，3H)，3.31(dtd，J＝11.3，1.6，0.8Hz，1H)，3.22(ddd，J＝11.3，5.1，
2.0Hz，1H)，3.02-2.92(m，1H)，2.78-2.67(m，1H)，2.32(br.s，1H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：
δ159.2，144.6，131.4，111.1，104.2，99.6，63.7，55.3，47.7，34.9.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝180.2(100)[M+H]+.
Rf(产物)＝0.3。将产物通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 24g；梯度0％至
20％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，得到淡黄色油，收率0.84g(27％)，其为位置异构体2a-TBS和
2b-TBS的2∶1混合物，将其在未分离下在下一步骤中使用。主要7-异构体(2a-TBS)：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ6.81(d，J＝8.3Hz，1H)，6.23-6.17(m，1H)，6.04(d，J＝2.3Hz，1H)，4.23-
4.18(m，1H)，3.32-3.28(m，1H)，3.23-3.20(m，1H)，2.97(ddt，J＝16.1，4.3，1.3Hz，1H)，
2.75-2.67(m，1H)，0.97(s，9H)，0.18(s，6H)。次要5-异构体(2b-TBS)：1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ6.87(t，J＝8.0Hz，1H)，6.23-6.17(m，2H)，4.27-4.22(m，1H)，3.28-3.24(m，1H)，
3.20-3.17(m，1H)，2.85(dd，J＝17.4，4.7Hz，1H)，2.80-2.73(m，1H)，1.00(s，9H)，0.23(s，
3H)，0.22(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3；2a-TBS/2b-TBS)：δ155.0，154.8，145.1，144.3，
131.1，126.9，111.5，110.3，108.1，107.3，105.5，63.6，63.4，47.6，47.3，34.9，30.7，25.8，+
25.7，18.3，18.2，-4.2，-4.4.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝250.2(100)[M+H] .[0165] 化合物2a-Me(7-异构体).将1-Me(1.61g，7.46mmol)和N，N-二乙基苯胺(5.56g，
37.3mmol，5eq)在1，2-二氯苯(50mL)中的溶液在160℃(浴温)于密封的容器中加热5天。冷却后，将挥发物在蒸发器(浴温75℃)上移除，将残渣在CH2Cl2(100mL)中溶解，用1M NaOH和水(各50mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥，过滤并在85℃下真空干燥以移除大部分的N，N-二乙基苯胺。TLC控制(SiO2/CH2Cl2中20％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.3。将产物通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 80g；梯度0％至30％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，得到淡黄色油，收率468mg(35％)的2a-Me(7-异构体，几乎不含5-异构体)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ
6.88(d，J＝8.3Hz，1H)，6.28(dd，J＝8.3，2.5Hz，1H)，6.10(d，J＝2.5Hz，1H)，4.22(qd，J＝
4.6，2.3Hz，1H)，3.74(s，3H)，3.31(dtd，J＝11.3，1.6，0.8Hz，1H)，3.22(ddd，J＝11.3，5.1，
2.0Hz，1H)，3.02-2.92(m，1H)，2.78-2.67(m，1H)，2.32(br.s，1H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：
δ159.2，144.6，131.4，111.1，104.2，99.6，63.7，55.3，47.7，34.9.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝180.2(100)[M+H]+.
[0166] 化合物3-Me(方法A).将2a-Me(205mg，1.14mmol)和三乙胺(289mg，2.86mmol，2.5eq)在CH2Cl2(10mL)中的溶液在干冰-丙酮浴中冷却，并加入三氟乙酸酐(TFAA；365μL，
551mg，2.62mmol，2.3eq)。将所得的混合物搅拌10min，使其温热至RT，并搅拌1h。将混合物用CH2Cl2(10mL)稀释，用水、10％KHSO4水溶液、饱和NaHCO3水溶液、盐水(各15mL)顺序洗涤，并用MgSO4干燥。将滤液蒸发，并将残渣在THF(10mL)中溶解，加入BH3·THF(THF中1M，8mL，
8mmol)。将反应混合物在氩气下回流过夜，在冰-水浴中冷却，并通过小心加入甲醇来淬灭。
将溶液蒸发，向残渣中加入1N NaOH(15mL)，并将混合物在RT下搅拌30min。将反应混合物用乙醚(3×20mL)萃取，将有机层用饱和NaHCO3水溶液、盐水(各20mL)顺序洗涤，并用MgSO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Büchi Sepacore Silica HP 12g；梯度0％至10％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，得到230mg(2步77％)微黄色油形式的3-Me。
551mg，2.62mmol，2.3eq)。将所得的混合物搅拌10min，使其温热至RT，并搅拌1h。将混合物用CH2Cl2(10mL)稀释，用水、10％KHSO4水溶液、饱和NaHCO3水溶液、盐水(各15mL)顺序洗涤，并用MgSO4干燥。将滤液蒸发，并将残渣在THF(10mL)中溶解，加入BH3·THF(THF中1M，8mL，
8mmol)。将反应混合物在氩气下回流过夜，在冰-水浴中冷却，并通过小心加入甲醇来淬灭。
将溶液蒸发，向残渣中加入1N NaOH(15mL)，并将混合物在RT下搅拌30min。将反应混合物用乙醚(3×20mL)萃取，将有机层用饱和NaHCO3水溶液、盐水(各20mL)顺序洗涤，并用MgSO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Büchi Sepacore Silica HP 12g；梯度0％至10％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，得到230mg(2步77％)微黄色油形式的3-Me。
[0167] 方法B：将固体2，2，2-三氟乙基(均三甲苯基(mesityl))碘鎓三氟甲磺酸盐(T.Umemoto，Y.Gotoh，J.Fluorine Chem.1986，31，231-236；G.L.Tolnai，A.Székely，Z.Mak6，T.Gáti，J.Dam，T.Bihari，A.Stirling，Z.Novák，Chem.Commun.2015，51，4488-
4491)在2-3min内分批加入至2a-Me(90mg，0.5mmol)和2，6-二甲基吡啶(87μL，80mg，
0.75mmol，1.5eq)在干燥CH2Cl2(3mL)中的溶液，并将所得的澄清溶液在RT下搅拌1h。将混合物用饱和NaHCO3水溶液(10mL)稀释，用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的萃取物用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Büchi Sepacore Silica HP 12g；梯度20％至
100％乙酸乙酯-己烷)分离，将含有产物的流分蒸发并真空干燥以移除任何残留的2，6-二甲基吡啶。收率118mg(90％)粘稠微黄色油形式的3-Me。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ6.92(dt，J＝8.2，1.0Hz，1H)，6.33(dd，J＝8.2，2.4Hz，1H)，6.28(d，J＝2.3Hz，1H)，4.21(qd，J＝5.4，
2.7Hz，1H)，3.96-3.83(m，1H)，3.82-3.72(m，1H)，3.77(s，3H)，3.50(dt，J＝11.7，2.1Hz，
1H)，3.29(ddd，J＝11.7，5.7，1.8Hz，1H)，3.05-2.95(m，1H)，2.74(ddt，J＝15.9，5.6，
1.2Hz，1H)，2.14(br.s，1H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ159.5，144.3，131.4，125.6(q，J＝
283.3Hz)，112.0，103.4，98.6(q，J＝1.8Hz)，63.3，56.5，55.4，53.5(q，J＝32.8Hz)，
35.6.19F NMR(376MHz，CDCl3)：δ-69.8.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝262.1(100)[M+H]+.
4491)在2-3min内分批加入至2a-Me(90mg，0.5mmol)和2，6-二甲基吡啶(87μL，80mg，
0.75mmol，1.5eq)在干燥CH2Cl2(3mL)中的溶液，并将所得的澄清溶液在RT下搅拌1h。将混合物用饱和NaHCO3水溶液(10mL)稀释，用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的萃取物用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Büchi Sepacore Silica HP 12g；梯度20％至
100％乙酸乙酯-己烷)分离，将含有产物的流分蒸发并真空干燥以移除任何残留的2，6-二甲基吡啶。收率118mg(90％)粘稠微黄色油形式的3-Me。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ6.92(dt，J＝8.2，1.0Hz，1H)，6.33(dd，J＝8.2，2.4Hz，1H)，6.28(d，J＝2.3Hz，1H)，4.21(qd，J＝5.4，
2.7Hz，1H)，3.96-3.83(m，1H)，3.82-3.72(m，1H)，3.77(s，3H)，3.50(dt，J＝11.7，2.1Hz，
1H)，3.29(ddd，J＝11.7，5.7，1.8Hz，1H)，3.05-2.95(m，1H)，2.74(ddt，J＝15.9，5.6，
1.2Hz，1H)，2.14(br.s，1H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ159.5，144.3，131.4，125.6(q，J＝
283.3Hz)，112.0，103.4，98.6(q，J＝1.8Hz)，63.3，56.5，55.4，53.5(q，J＝32.8Hz)，
35.6.19F NMR(376MHz，CDCl3)：δ-69.8.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝262.1(100)[M+H]+.
[0168] 化合物3-H(由2a，b-TBS).将异构体2a，b-TBS(169mg，0.605mmol)和三乙胺(153mg，1.51mmol，2.5eq)在CH2Cl2(10mL)中的溶液在干冰-丙酮浴中冷却，并加入三氟乙酸酐(TFAA；193μL，292mg，1.40mmol，2.3eq)。将所得的混合物在-78℃下搅拌10min，使其温热至RT，并搅拌1h。将混合物用CH2Cl2(10mL)稀释，用水、10％KHSO4水溶液、饱和NaHCO3水溶液、盐水(各15mL)顺序洗涤，并用MgSO4干燥。将滤液蒸发，并将残渣在THF(10mL)中溶解，加入BH3·THF(THF中1M，4.5mL，4.5mmol)。将反应混合物在氩气下回流过夜，在冰-水浴中冷却，并通过小心加入甲醇来淬灭。蒸发溶剂，将残渣用1M NaOH(20mL)处理，用乙醚(10mL)萃取，抛弃有机层，并将水层用1M HCl小心地中和，然后用磷酸盐缓冲液中和至pH 7.5。将所得的水溶液用NaCl饱和，并用乙醚(3×20mL)萃取，将合并的萃取物用MgSO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Interchim Puriflash 15μm 25g；梯度0％至40％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，得到45mg(30％)微黄色油形式的3-H(较低极性的7-异构体，首先被洗脱)，伴随着12mg(～
8％)杂质5-位置异构体。
8％)杂质5-位置异构体。
[0169] 化合物3-H(由3-Me).将3-Me(650mg，3.0mmol)、苯硫酚(0.40g，3.6mmol)和K2CO3(20mg)在N-甲基吡咯烷酮中于180℃(浴温)下加热24h。将反应混合物冷却，用乙醚(100mL)稀释，并用1M NaOH(20mL)洗涤。抛弃有机层，并将水层用5％柠檬酸水溶液中和至pH～8。将标题产物(和部分的苯硫酚)用乙醚萃取(3×20mL)。将合并的有机溶液干燥(Na2SO4)并蒸发。将残渣在25cm3 SiO2(Isolera)上进行色谱法分离，并将标题化合物(0.4g，65％)通过用CH2Cl2-EtOAc混合物(10-50％EtOAc)洗脱来分离。1H NMR(400MHz，CD3CN)：δ6.78(dt，J＝8.0，1.0Hz，1H)，6.63(s，1H)，6.19(br.d，J＝2.6Hz，1H)，6.14(dd，J＝8.0，2.3Hz，1H)，4.05(dddd，J＝11.9，7.1，4.7，3.1Hz，1H)，4.00-3.81(m，2H)，3.42(ddd，J＝11.6，3.3，1.9Hz，
1H)，3.21-3.14(m，1H)，3.05(d，J＝5.1Hz，1H)，2.87(ddt，J＝15.5，4.7，1.3Hz，1H)，2.58(ddt，J＝15.5，7.1，1.2Hz，1H).19F NMR(376MHz，CD3CN)：δ-70.7.13C NMR(101MHz，CD3CN)：δ
157.2，145.7，131.9，127.2(q，J＝282.7Hz)，113.1，105.9，99.6(q，J＝1.6Hz)，63.7，57.3，
53.7(q，J＝32.2Hz)，36.3.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝248.1(100)[M+H]+.[0170] 根据公开的操作(G.Mudd，I.Pérez Pi，N.Fethers，P.G.Dodd，O.R.Barbeau，M.Auer，Methods Appl.Fluoresc.2015，3，045002)制备化合物4(路线2)。
1H)，3.21-3.14(m，1H)，3.05(d，J＝5.1Hz，1H)，2.87(ddt，J＝15.5，4.7，1.3Hz，1H)，2.58(ddt，J＝15.5，7.1，1.2Hz，1H).19F NMR(376MHz，CD3CN)：δ-70.7.13C NMR(101MHz，CD3CN)：δ
157.2，145.7，131.9，127.2(q，J＝282.7Hz)，113.1，105.9，99.6(q，J＝1.6Hz)，63.7，57.3，
53.7(q，J＝32.2Hz)，36.3.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝248.1(100)[M+H]+.[0170] 根据公开的操作(G.Mudd，I.Pérez Pi，N.Fethers，P.G.Dodd，O.R.Barbeau，M.Auer，Methods Appl.Fluoresc.2015，3，045002)制备化合物4(路线2)。
[0171] N，N′-双-(2，2，2-三氟乙基)-6′-羧基-Q-罗丹明-β，β′-二醇(5-OH)
[0172] 将化合物3(25mg，0.1mmol)、化合物4(15mg，0.072mmol)和对甲苯磺酸一水合物(5mg)在丙酸(1mL)中于80℃下加热过夜。将DDQ(16mg，0.07mmol)在室温下(RT)下加入至反应混合物，将其加热至40℃，并在该温度下搅拌1h。将所有挥发性物质真空移除，并将残渣在CH2Cl2(100mL)中溶解。将有机溶液用水和饱和NaHCO3水溶液洗涤。将合并的水溶液用CH2Cl2(20mL)萃取。将合并的有机溶液干燥(Na2SO4)，过滤，并将二氯甲烷真空蒸发。将残渣在MeOH(3mL)中溶解，并将2M NaOH水溶液(0.5mL)加入至甲醇溶液。将反应混合物在室温下保持过夜，并将所有挥发性物质真空蒸发。将残渣在MeCN水溶液中溶解，并用TFA水溶液酸化。溶剂系统MeCN/H2O＝1∶2(+0.3％HCOOH)中的反相TLC(VWR International，TLC Siliga gel 60 RP-18 F254s)显示亮荧光橙色点。将标题染料通过Polygoprep 60-50 C18(MachereyNagel)上的RP色谱法分离。用乙腈水溶液(MeCN/H2O＝1∶2+0.1％TFA)洗脱，随后将汇集的含有染料5的非对映异构体的流分直接冻干，得到8mg红色大量的固体(3个非对映异构体的混合物)。HPLC：分析柱：Kinetex C18 100，5μm，250×4.6mm，1.2mL/min；溶剂A：水+0.1％v/v三氟乙酸(TFA)；溶剂B：MeCN+0.1％v/v TFA.分析方法：20min内A/B：70/30→0/
100，用二极管阵列UV-VIS检测.tR＝5.4min(异构体1+2在这些条件下不可分离)，5.6min(异构体3)，比率为约2.5∶1.将tR＝5.4min和tR＝5.4min的物质通过制备型HPLC分离；制备柱：Kinetex C18 100，5μm，250×20mm，10mL min/mL，溶剂A：水+0.05％v/v三氟乙酸(TFA)；
溶剂B：MeCN。通过分析型HPLC，使用另一缓冲剂[溶剂A：水+0.05M Et3N*H2CO3缓冲剂，pH＝
8；溶剂B：MeCN；方法：20min内A/B：80/20→0/100，用二极管阵列UV-VIS检测]，发现tR＝
5.4min的物质(见以上)为两种异构体(1+2)(tR＝5.0min和5.2min(～2∶1))的混合物。在由Halo-Tag-胺(参见下文)制备NHS酯和酰胺中使用异构体1+2。异构体区别在于羟基的相互取向(顺和反)。对于顺式异构体，由于具有2个羧酸基团的苯基的受阻旋转，可能有另一对非对映异构体。异构体可通过重复的RP上的色谱法分离(使用含0.05M Et3N*H2CO3缓冲剂的乙腈水溶液；pH＝8)，随后在常规SiO2上的色谱法分离(使用具有升高的水含量(5-12％)的乙腈-二氯甲烷溶剂系统(10/1))来进行分离。1H NMR(400MHz，CD3OD，异构体3)：δ＝8.37(m，
2H)，7.93(d，J＝1.2Hz，1H)，7.22(s，2H)，6.95(s，2H)，4.58(dd，2JHH＝16.6，3JHF＝8.6Hz，
2H)，4.37(dd，2JHH＝16.6，3JHF＝8.6Hz，2H)，4.22(m，2H，CHOH)，3.79(m，2H)，3.55(ddd，J＝
10.6，5.8和3.1Hz，2H)，2.98(m，2H)，2.77(dd，J＝16.3，5.8，2H)ppm.19F NMR(376MHz，CD3OD，异构体3)：δ＝-70.2(t，3JHF＝8.8Hz)ppm。以下光谱数据仅在水溶液中获得。异构体
3：吸收λmax，nm(ε，M-1cm-1)＝532(56000)，发射λmax，nm(Φfl-荧光量子产率)＝553(0.89-绝对值；在488nm下激发).C31H24F6N2O7(650.1488).HR-MS，ESI(阳性模式)：m/z＝651.1549(实测值[M+H]+)，651.1560(计算值)；ESI(阴性模式)：m/z(rel.int.，％)＝649.1408(100)(实测值[M-H]-)；649.1415(计算值).
100，用二极管阵列UV-VIS检测.tR＝5.4min(异构体1+2在这些条件下不可分离)，5.6min(异构体3)，比率为约2.5∶1.将tR＝5.4min和tR＝5.4min的物质通过制备型HPLC分离；制备柱：Kinetex C18 100，5μm，250×20mm，10mL min/mL，溶剂A：水+0.05％v/v三氟乙酸(TFA)；
溶剂B：MeCN。通过分析型HPLC，使用另一缓冲剂[溶剂A：水+0.05M Et3N*H2CO3缓冲剂，pH＝
8；溶剂B：MeCN；方法：20min内A/B：80/20→0/100，用二极管阵列UV-VIS检测]，发现tR＝
5.4min的物质(见以上)为两种异构体(1+2)(tR＝5.0min和5.2min(～2∶1))的混合物。在由Halo-Tag-胺(参见下文)制备NHS酯和酰胺中使用异构体1+2。异构体区别在于羟基的相互取向(顺和反)。对于顺式异构体，由于具有2个羧酸基团的苯基的受阻旋转，可能有另一对非对映异构体。异构体可通过重复的RP上的色谱法分离(使用含0.05M Et3N*H2CO3缓冲剂的乙腈水溶液；pH＝8)，随后在常规SiO2上的色谱法分离(使用具有升高的水含量(5-12％)的乙腈-二氯甲烷溶剂系统(10/1))来进行分离。1H NMR(400MHz，CD3OD，异构体3)：δ＝8.37(m，
2H)，7.93(d，J＝1.2Hz，1H)，7.22(s，2H)，6.95(s，2H)，4.58(dd，2JHH＝16.6，3JHF＝8.6Hz，
2H)，4.37(dd，2JHH＝16.6，3JHF＝8.6Hz，2H)，4.22(m，2H，CHOH)，3.79(m，2H)，3.55(ddd，J＝
10.6，5.8和3.1Hz，2H)，2.98(m，2H)，2.77(dd，J＝16.3，5.8，2H)ppm.19F NMR(376MHz，CD3OD，异构体3)：δ＝-70.2(t，3JHF＝8.8Hz)ppm。以下光谱数据仅在水溶液中获得。异构体
3：吸收λmax，nm(ε，M-1cm-1)＝532(56000)，发射λmax，nm(Φfl-荧光量子产率)＝553(0.89-绝对值；在488nm下激发).C31H24F6N2O7(650.1488).HR-MS，ESI(阳性模式)：m/z＝651.1549(实测值[M+H]+)，651.1560(计算值)；ESI(阴性模式)：m/z(rel.int.，％)＝649.1408(100)(实测值[M-H]-)；649.1415(计算值).
[0173] N，N′-双-(2，2，2-三氟-乙基)-6′-羧基-Q-罗丹明-β，β′-二醇(5-NHS)的N-羟基琥珀酰亚胺基酯及其与Halo-Tag胺的缀合物(5-卤代)
[0174] 制备三个储备溶液(A、B和C)。溶液A：22mg HATU(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)在干燥DMF(0.10mL)中；溶液B：Et3N(10mg)在干燥DMF(0.10mL)中；溶液C：N-羟基琥珀酰亚胺(19mg)在干燥DMF(0.10mL)中。在氩气下，向染料5(1.7mg，2.6μmol)在干燥DMF(0.10mL)中的溶液顺序加入溶液A、B和C(各溶液14μL)，并将混合物在室温下搅拌30min。HPLC分析表明94-95％的转化度。(Eurospher-
100 C18 5μm 250×4mm，1.2mL/min；溶剂A：水+0.1％v/v三氟乙酸(TFA)；溶剂B：MeCN+
0.1％v/v TFA.A/B：30/70100/0，25min，tR＝6.7min(化合物5)，8.3/8.6min(单-NHS酯，非对映异构体的混合物)。产物(染料5的6′-NHS酯，稳定化合物5-NHS)可通过制备型HPLC(在真空移除DMF后)分离，或者原位使用。在后一种情况中，将Halo-Tag-胺(H2N(CH2)2O(CH2)2O(CH2)6Cl＝C10H22ClNO2，1.5mg，6.7μM)以DMF(20-40μL)中溶液的形式加入至反应混合物中，并将反应混合物在40℃下搅拌。数小时后，HPLC控制表明向新产物(tR＝11.9/12.2min，5-卤代，染料非对映异构体的混合物)的转化接近完成(93％；HPLC面积)。在真空移除DMF后，将酰胺5-卤代通过制备HPLC分离(～1mg，46％)，在DMSO(400μL)中溶解，并将该储备溶液(用PBS稀释至to 1-5μM后)在用活细胞的标记实验中(参见成像结果部分)使用。ESI-MS(C41H44ClF6N3O8，855.27)，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝856(100)[M+H]+.HR-MS，ESI(阳性模式)：m/z＝878.2591(实测值[M+Na]+)，878.2613(计算值).
100 C18 5μm 250×4mm，1.2mL/min；溶剂A：水+0.1％v/v三氟乙酸(TFA)；溶剂B：MeCN+
0.1％v/v TFA.A/B：30/70100/0，25min，tR＝6.7min(化合物5)，8.3/8.6min(单-NHS酯，非对映异构体的混合物)。产物(染料5的6′-NHS酯，稳定化合物5-NHS)可通过制备型HPLC(在真空移除DMF后)分离，或者原位使用。在后一种情况中，将Halo-Tag-胺(H2N(CH2)2O(CH2)2O(CH2)6Cl＝C10H22ClNO2，1.5mg，6.7μM)以DMF(20-40μL)中溶液的形式加入至反应混合物中，并将反应混合物在40℃下搅拌。数小时后，HPLC控制表明向新产物(tR＝11.9/12.2min，5-卤代，染料非对映异构体的混合物)的转化接近完成(93％；HPLC面积)。在真空移除DMF后，将酰胺5-卤代通过制备HPLC分离(～1mg，46％)，在DMSO(400μL)中溶解，并将该储备溶液(用PBS稀释至to 1-5μM后)在用活细胞的标记实验中(参见成像结果部分)使用。ESI-MS(C41H44ClF6N3O8，855.27)，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝856(100)[M+H]+.HR-MS，ESI(阳性模式)：m/z＝878.2591(实测值[M+Na]+)，878.2613(计算值).
[0175] 羟基化ROX染料(13a，b)
[0176] 路线2中7-(叔丁基-二甲基-甲硅烷基氧基)-1，2，3，4-四氢喹啉(6)根据S.M.Pauff和S.C.Miller(Org.Lett.2011，13，6196-6199)中公开的方法并进行修改
(Kolmakov等人，Chem.Eur.J.2015，21，13344-13356)下来制备。
(Kolmakov等人，Chem.Eur.J.2015，21，13344-13356)下来制备。
[0177] 化合物7.将化合物6(90mg)在纯环氧氯丙烷(1mL)中溶解，并将溶液在80℃下搅拌30h。将反应混合物装载至具有装在己烷-二氯甲烷混合物(3∶1)的SiO2(10g)的柱中。用己烷-二氯甲烷(3∶1→1∶1)洗脱以得到60mg的化合物7(油)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.80(dd，J＝8.1，0.9Hz，1H)，6.16(d，J＝2.3Hz，1H)，6.13(dd，J＝8.1，2.3Hz，1H)，4.15(m，1H)，
3.70(dd，J＝11.2，4.3Hz，1H)，3.62(dd，J＝11.3，5.4Hz，1H)，3.35(dd，J＝6.4，4.0Hz，1H)，
3.30(dd，J＝6.4，4.0Hz，1H)，3.30(td，J＝5.3，1.3Hz，2H)，2.70(t，J＝6.4Hz，2H)，2.49(d，J＝4.6Hz，1H)，1.92(m，2H)，0.98(s，9H)，0.20(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝156.8，
149.0，129.9，110.1，106.8，105.2，69.9，47.7，47.1，25.70，18.2，-4.4.MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝356(100)[M+H]+.
3.70(dd，J＝11.2，4.3Hz，1H)，3.62(dd，J＝11.3，5.4Hz，1H)，3.35(dd，J＝6.4，4.0Hz，1H)，
3.30(dd，J＝6.4，4.0Hz，1H)，3.30(td，J＝5.3，1.3Hz，2H)，2.70(t，J＝6.4Hz，2H)，2.49(d，J＝4.6Hz，1H)，1.92(m，2H)，0.98(s，9H)，0.20(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝156.8，
149.0，129.9，110.1，106.8，105.2，69.9，47.7，47.1，25.70，18.2，-4.4.MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝356(100)[M+H]+.
[0178] 醇8a和环氧乙烷8b(叔丁基-二甲基-[[1-(环氧乙烷-2-基甲基)-3，4-二氢-2H-喹啉-7-基]-氧基]硅氧烷.将胺6(1.60g，6.08mmol)在环氧氯丙烷(7.28g，79.1mmol，6.15mL)和1，2-二氯苯(15mL)的混合物中溶解。将混合物在140℃(油浴温度)下于厚壁螺帽盖(screw-cup)试管中加热18h。然后将所有挥发性物质在减压下蒸除(0.5-1mbar，浴温50-
100℃)，留下2.64g无色油。TLC(己烷-乙酸乙酯，3∶1，或二氯甲烷-乙酸乙酯，10∶1)表明原料(化合物6)的完全消耗以及两个新化合物的形成。将残留油在常规硅胶上进行色谱分离(Isolera，RediSep Rf含有40g SiO2的筒，己烷-乙酸乙酯，从95∶5至70∶30)。分离得到红色-褐色粘稠油形式的醇8a(1.02g，52％)；淡黄色粘稠油形式的环氧乙烷8b(0.52g，27％)。
100℃)，留下2.64g无色油。TLC(己烷-乙酸乙酯，3∶1，或二氯甲烷-乙酸乙酯，10∶1)表明原料(化合物6)的完全消耗以及两个新化合物的形成。将残留油在常规硅胶上进行色谱分离(Isolera，RediSep Rf含有40g SiO2的筒，己烷-乙酸乙酯，从95∶5至70∶30)。分离得到红色-褐色粘稠油形式的醇8a(1.02g，52％)；淡黄色粘稠油形式的环氧乙烷8b(0.52g，27％)。
[0179] 化合物8a.1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.70(dt，J＝8.1，0.9Hz，1H)，6.16(d，J＝8.1Hz，1H)，4.36(dddd，J＝14.4，7.7，6.8，4.9Hz，1H)，3.16-2.99(m，3H)，2.90-2.61(m，
4H)，2.37(d，J＝9.3Hz，1H)，2.10-1.92(m，2H)，0.99(s，9H)，0.20/0.21(2×s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝152.7，143.3，126.8，115.1，110.4，107.4，63.3，55.4，50.4，31.50，
27.1，25.8，25.6，22.3，18.2，-4.1.MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝320.2(100)[M+H]+.HR-MS(C18H29NO2Si)：320.2048(实测值M+H)，320.2040(计算值)；342.1864(M+Na实测值)，
342.1860(计算值).
4H)，2.37(d，J＝9.3Hz，1H)，2.10-1.92(m，2H)，0.99(s，9H)，0.20/0.21(2×s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝152.7，143.3，126.8，115.1，110.4，107.4，63.3，55.4，50.4，31.50，
27.1，25.8，25.6，22.3，18.2，-4.1.MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝320.2(100)[M+H]+.HR-MS(C18H29NO2Si)：320.2048(实测值M+H)，320.2040(计算值)；342.1864(M+Na实测值)，
342.1860(计算值).
[0180] 化合物8b.1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.77(ddt，J＝7.8，1.0，0.5Hz，1H)，6.16-6.03(m，2H)，3.52(dd，J＝12和3.2Hz，1H)，3.39-3.25(m，3H)，3.15(dddd，J＝4.6，4.0，3.2，
2.7Hz，1H)，2.81-2.75(m，1H)，2.68(t，J＝6.4Hz，2H)，2.58(dd，J＝5.0，2.7Hz，1H)，2.00-
1.80(m，2H)，0.97(s，9H)，0.19(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝154.9，146.1，129.5，
115.6，107.7，103.0，52.9，50.4，50.3，45.4，27.3，25.8，22.4，18.2，-4.4.MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝320(100)[M+H]+.HR-MS(C18H29NO2Si)：320.2041(实测值M+H)，320.2040(计算值).
2.7Hz，1H)，2.81-2.75(m，1H)，2.68(t，J＝6.4Hz，2H)，2.58(dd，J＝5.0，2.7Hz，1H)，2.00-
1.80(m，2H)，0.97(s，9H)，0.19(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝154.9，146.1，129.5，
115.6，107.7，103.0，52.9，50.4，50.3，45.4，27.3，25.8，22.4，18.2，-4.4.MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝320(100)[M+H]+.HR-MS(C18H29NO2Si)：320.2041(实测值M+H)，320.2040(计算值).
[0181] 8a-乙酸酯.在氩气气氛中，将醇8a(0.66g，2.1mmol)在具有搅拌棒的螺帽盖试管中的吡啶(2.22g，28.0mmol，2.26mL)中溶解。在室温下加入乙酸酐(1.19g，11.6mmol，1.10mL)，并将反应混合物搅拌18h。反应进程通过TLC(使用具有10％v/v乙酸乙酯的二氯甲烷-己烷混合物(3∶1))监测。将反应混合物真空浓缩至其初始体积的约3/10，并用乙酸乙酯(100mL)稀释。将有机溶液用饱和KHSO4(20mL)水溶液振荡；分离水层，并用EtOAc(100mL)萃取。将合并的有机溶液用水、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。将有机相用Na2SO4干燥，并将溶剂真空蒸发。将残渣-微红色-褐色粘稠油-在常规SiO2上进行色谱法分离。用二氯甲烷-己烷(1∶1至1∶0)洗脱得到红色-橙色粘稠油形式的9(0.564g，75％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝6.68(dt，J＝8.1，0.9Hz，1H)，6.11(d，J＝8.1Hz，1H)，5.26(mc，1H)，3.26(ddd，J＝11.3，
3.5，1.7Hz，1H)，3.17-2.92(m，4H)，2.76-2.62(m，3H)，2.07(s，3H)，2.02-1.91(m，2H)，0.99(s，9H)，0.21(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝170.8，152.1，143.0，126.8，114.6，
109.5，106.8，66.9，52.3，50.1，27.9，27.1，25.8，22.2，21.4，18.3，-4.1.MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝362.2(100)[M+H]+，HR-MS(C20H31NO3Si)：384.1964(M+Na实测值)，384.1965(M+Na计算值).
3.5，1.7Hz，1H)，3.17-2.92(m，4H)，2.76-2.62(m，3H)，2.07(s，3H)，2.02-1.91(m，2H)，0.99(s，9H)，0.21(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝170.8，152.1，143.0，126.8，114.6，
109.5，106.8，66.9，52.3，50.1，27.9，27.1，25.8，22.2，21.4，18.3，-4.1.MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝362.2(100)[M+H]+，HR-MS(C20H31NO3Si)：384.1964(M+Na实测值)，384.1965(M+Na计算值).
[0182] 苯酚9.在聚乙烯螺旋帽瓶中制备8a-乙酸酯(0.560g，1.55mmol)在乙腈(14mL)中的溶液，并将其用冰冷却。加入HF水溶液(0.2mL50-55％溶液)，移除冰浴，并将反应混合物在室温下搅拌20h。TLC(二氯甲烷/乙酸乙酯，10∶1)表明原料的完全转化。将微红色反应溶液用H2O(50mL)稀释，并用乙酸乙酯(50mL和3×25mL)萃取四次。将合并的有机溶液用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将溶剂在减压下移除，并将残渣(0.46g绿色粘稠半固体)进行色谱法(PuriFlash HC，25g SiO2，15μm，二氯甲烷/乙酸乙酯95∶5→80∶20)分离。收率-0.314g(82％)的白色固体形式的苯酚9。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.26(s，1H)，6.69(d，J＝8.0，1H)，6.07(d，J＝8.0Hz，1H)，5.26(tdd，J＝6.8，5.8，3.5Hz，1H)，4.48(s，1H)，3.28(ddd，J＝
11.4，3.5，1.7Hz，1H)，3.19-2.98(m，4H)，2.78-2.66(m，3H)，2.07(s，3H)，2.11-1.89(m，
2H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝170.7，152.0，142.9，127.1，114.3，105.2，103.3，66.6，
52.2，50.1，27.1，22.2，21.3.MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝248.1(100)[M+H]+.HR-MS(C14H17NO3)：270.1105(M+Na实测值)，270.1101(计算值).
11.4，3.5，1.7Hz，1H)，3.19-2.98(m，4H)，2.78-2.66(m，3H)，2.07(s，3H)，2.11-1.89(m，
2H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ＝170.7，152.0，142.9，127.1，114.3，105.2，103.3，66.6，
52.2，50.1，27.1，22.2，21.3.MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝248.1(100)[M+H]+.HR-MS(C14H17NO3)：270.1105(M+Na实测值)，270.1101(计算值).
[0183] 二苯甲酮12a.在螺旋帽瓶中，使8-羟基久洛利定10(0.60g，3.17mmol)和偏苯三甲酸酐11(1.83g，9.51mmol)在乙酸(15mL)中悬浮，并用氩气冲洗。加入浓H2SO4(1滴)，并将反应混合物在油浴中逐步加热(至100℃)，并搅拌2.5h。将沉淀在约80-90℃下溶解，并且形成红色溶液。在约0.5h，形成“新的”沉淀。在冷却至室温后，将紫色悬浮液转移至离心试管中，在超声浴中超声处理数秒，离心，并抛弃紫色上清溶液。将沉淀用乙酸(5mL)洗涤；将相同的超声处理-离心循环重复5-6次，直至上清溶液变得无色。将固体残渣真空干燥，以得到0.48g(40％)的二苯甲酮12a以及微量的12b(＞95：＜5)。浅褐色固体；TLC：ACN/H2O/DCM，9∶
1∶1.HPLC(Eurospher-100 C18 5μm 250×4mm，1.2mL/min；溶剂A：水+0.1％v/v三氟乙酸(TFA)；溶剂B：MeCN+0.1％v/v TFA).A/B：30/70-100/0，25min，tR＝9.7min(12a)，10.7min(12b).1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.82(s，1H)，8.09(dd，J＝8.1，1.7Hz，1H)，8.02(d，J＝
8.1Hz，1H)，7.76(d，J＝1.7Hz，1H)，6.39(s，1H)，3.24(td，J＝7.4，4.8Hz，4H)，2.58(t，J＝
6.4Hz，2H)，2.40(t，J＝6.2Hz，2H)，1.91-1.78(m，2H)，1.80-1.69(m，2H).C21H19NO6(381.12124).MS(ESI)：m/z(阴性模式，％)＝380(100)[M-H]-.
1∶1.HPLC(Eurospher-100 C18 5μm 250×4mm，1.2mL/min；溶剂A：水+0.1％v/v三氟乙酸(TFA)；溶剂B：MeCN+0.1％v/v TFA).A/B：30/70-100/0，25min，tR＝9.7min(12a)，10.7min(12b).1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.82(s，1H)，8.09(dd，J＝8.1，1.7Hz，1H)，8.02(d，J＝
8.1Hz，1H)，7.76(d，J＝1.7Hz，1H)，6.39(s，1H)，3.24(td，J＝7.4，4.8Hz，4H)，2.58(t，J＝
6.4Hz，2H)，2.40(t，J＝6.2Hz，2H)，1.91-1.78(m，2H)，1.80-1.69(m，2H).C21H19NO6(381.12124).MS(ESI)：m/z(阴性模式，％)＝380(100)[M-H]-.
[0184] 化合物13a-c.将二苯甲酮12a(23mg，0.060mmol)和乙酸酯9(15mg，0.061mmol)在2.3mL DMF中溶解，加入DMF(0.4mL)中的三甲基甲硅烷基聚磷酸酯(170mg)，并将反应混合物在氩气下于100℃下加热3h(或者在120℃下加热2h)。冷却至室温后，将反应混合物用
40mL半饱和盐水稀释，并转移入含有CH2Cl2(40mL)和5mL乙腈的分液漏斗。将有机层振荡并分离，将水相用CH2Cl2-乙腈混合物(40mL+5mL)以及用CH2Cl2(20mL)萃取。将合并的溶液用水(20mL)洗涤，并将水性萃取物用CH2Cl2(40mL)萃取。反应混合物的HPLC分析：柱-
Eurospher-100 C18 5μm，250×4mm，1.2mL/min；溶剂A：水+0.1％v/v三氟乙酸(TFA)；溶剂B：MeCN+0.1％v/v TFA 20min内A/B＝70/30-0/100，在580nm下检测。保留时间(tR)、min(峰面积，％，化合物)：10.2(30，13b)，11(46，13a)，12.3(24，13c)。将合并的有机溶液真空蒸发，并将残渣装载在具有常规SiO2(55g)的柱上。用乙腈-水混合物(10∶1→5∶1+5％v/v CH2Cl2)洗脱，得到红紫色流分；这些中首先含化合物13c，然后为染料13a和13b的单-和二乙酸酯的不可分离的混合物(TLC上显示单个点)。将这些流分合并，真空蒸发，并将残渣在
10mL 0.1M NaOH水溶液中溶解。在室温下保持过夜，然后将反应混合物用TFA(0.2mL)酸化。
然后将反应混合物用NH4Cl饱和，并用CH2Cl2-乙腈混合物(分别5∶1和5∶2，60mL和70mL)萃取两次。将合并的有机溶液真空蒸发，并将残渣进行常规SiO2上的色谱法分离(使用溶剂系统CH2Cl2-MeOH-H2O(75/30/2))。分离得到几乎相等量的染料13a和13b，并将其通过RP C18(Macherey Nagel，Polygoprep 60-50)上的RP色谱法进一步纯化(使用乙腈-水混合物(1/5→1/1；+0.2％v/v HCOOH))。将同类的流分汇集，蒸发并得到非对映异构体13a和7.7min(比率为约2∶3∶1；HPLC条件如上所述)。1H NMR(400MHz，CD3OD，13a，3个非对映异构体的混合物)：δ＝8.17(dd，J＝8.1和1.7Hz，1H)，8.06(d，J＝7.9Hz，1H)，7.78-7.71(m，1H)，6.85-
6.79(“m”，1H)，4.57(m，1H)，4.36(m，2H)，3.64(br.d，J＝13.0Hz，2H)，3.50(dq，J＝17.5，
6.1Hz，4H)，3.38(dd，J＝13.4，5.2Hz，1H)，3.21-3.13(m，1H)，3.08(t，J＝6.5Hz，1H)，2.70(s，4H)，2.12(m，2H)，1.99-1.89(m，4H).1H NMR(400MHz，CD3OD，化合物13b；主要的非对映异构体)：δ＝8.16(dd，J＝8.1和1.7Hz，1H)，8.04(d，J＝8.0Hz，1H)，7.73(m，1H)，6.85(s，2H)，
4.36(m，2H，CHOH)，3.65(br.d，J＝13.5Hz，2H)，3.48(m，J＝5.6Hz，4H)，3.38(dd，J＝13.3和
5.2Hz，2H)，3.18(m，4H)，2.71(m，4H)，1.96(m，4H)ppm.以下光谱数据仅在含有PBS缓冲剂的水溶液(pH 7.4)中获得。13a：吸收λmax，nm(ε，M-1cm-1)＝574(55000)，发射λmax，nm(Φfl-荧光量子产率)＝597(0.74-绝对值；在540-550nm下激发).13b：吸收λmax，nm(ε，M-1cm1)＝564(60000)，发射λmax，nm(Φfl-荧光量子产率)＝588(0.63-绝对值；在550nm下激发).13a(C33H30N2O6，M＝550).HR-MS(ESI)：m/z(阳性模式)＝551.2181(实测值[M+H]+)，551.2177-
(计算值).MS(ESI)：m/z(阴性模式，％)＝549(100)[M-H] .13b(C33H30N2O7，M＝566).HR-MS(ESI)：m/z(阴性模式)＝565.1976(实测值[M-H]-)，565.1980(计算值).
40mL半饱和盐水稀释，并转移入含有CH2Cl2(40mL)和5mL乙腈的分液漏斗。将有机层振荡并分离，将水相用CH2Cl2-乙腈混合物(40mL+5mL)以及用CH2Cl2(20mL)萃取。将合并的溶液用水(20mL)洗涤，并将水性萃取物用CH2Cl2(40mL)萃取。反应混合物的HPLC分析：柱-
Eurospher-100 C18 5μm，250×4mm，1.2mL/min；溶剂A：水+0.1％v/v三氟乙酸(TFA)；溶剂B：MeCN+0.1％v/v TFA 20min内A/B＝70/30-0/100，在580nm下检测。保留时间(tR)、min(峰面积，％，化合物)：10.2(30，13b)，11(46，13a)，12.3(24，13c)。将合并的有机溶液真空蒸发，并将残渣装载在具有常规SiO2(55g)的柱上。用乙腈-水混合物(10∶1→5∶1+5％v/v CH2Cl2)洗脱，得到红紫色流分；这些中首先含化合物13c，然后为染料13a和13b的单-和二乙酸酯的不可分离的混合物(TLC上显示单个点)。将这些流分合并，真空蒸发，并将残渣在
10mL 0.1M NaOH水溶液中溶解。在室温下保持过夜，然后将反应混合物用TFA(0.2mL)酸化。
然后将反应混合物用NH4Cl饱和，并用CH2Cl2-乙腈混合物(分别5∶1和5∶2，60mL和70mL)萃取两次。将合并的有机溶液真空蒸发，并将残渣进行常规SiO2上的色谱法分离(使用溶剂系统CH2Cl2-MeOH-H2O(75/30/2))。分离得到几乎相等量的染料13a和13b，并将其通过RP C18(Macherey Nagel，Polygoprep 60-50)上的RP色谱法进一步纯化(使用乙腈-水混合物(1/5→1/1；+0.2％v/v HCOOH))。将同类的流分汇集，蒸发并得到非对映异构体13a和7.7min(比率为约2∶3∶1；HPLC条件如上所述)。1H NMR(400MHz，CD3OD，13a，3个非对映异构体的混合物)：δ＝8.17(dd，J＝8.1和1.7Hz，1H)，8.06(d，J＝7.9Hz，1H)，7.78-7.71(m，1H)，6.85-
6.79(“m”，1H)，4.57(m，1H)，4.36(m，2H)，3.64(br.d，J＝13.0Hz，2H)，3.50(dq，J＝17.5，
6.1Hz，4H)，3.38(dd，J＝13.4，5.2Hz，1H)，3.21-3.13(m，1H)，3.08(t，J＝6.5Hz，1H)，2.70(s，4H)，2.12(m，2H)，1.99-1.89(m，4H).1H NMR(400MHz，CD3OD，化合物13b；主要的非对映异构体)：δ＝8.16(dd，J＝8.1和1.7Hz，1H)，8.04(d，J＝8.0Hz，1H)，7.73(m，1H)，6.85(s，2H)，
4.36(m，2H，CHOH)，3.65(br.d，J＝13.5Hz，2H)，3.48(m，J＝5.6Hz，4H)，3.38(dd，J＝13.3和
5.2Hz，2H)，3.18(m，4H)，2.71(m，4H)，1.96(m，4H)ppm.以下光谱数据仅在含有PBS缓冲剂的水溶液(pH 7.4)中获得。13a：吸收λmax，nm(ε，M-1cm-1)＝574(55000)，发射λmax，nm(Φfl-荧光量子产率)＝597(0.74-绝对值；在540-550nm下激发).13b：吸收λmax，nm(ε，M-1cm1)＝564(60000)，发射λmax，nm(Φfl-荧光量子产率)＝588(0.63-绝对值；在550nm下激发).13a(C33H30N2O6，M＝550).HR-MS(ESI)：m/z(阳性模式)＝551.2181(实测值[M+H]+)，551.2177-
(计算值).MS(ESI)：m/z(阴性模式，％)＝549(100)[M-H] .13b(C33H30N2O7，M＝566).HR-MS(ESI)：m/z(阴性模式)＝565.1976(实测值[M-H]-)，565.1980(计算值).
[0185]
[0186] 路线10.罗丹明染料13a-c的衍生物用作标记试剂：a)二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)，Et3N，DMF，CH2C12；b)DSC，Et3N，DMF，CH2Cl2，然后Cl(CH2)6O(CH2)2O(CH2)2NH2[0187] 获得单-NHS酯14a-c-NHS的一般方法.将量为约3.5mg(约6.3μM)的染料(13a、13b或13c)在DMF(1.5mL)和CH2Cl2(0.5mL)的混合物中溶解，并用Et3N(2.5μL的部分)和二琥珀酰亚胺基碳酸酯(5mg的部分)处理。加入各部分后，反应进程通过HPLC监测[柱-Eurospher-
100 C18 5μm，250×4mm，1.2mL/min；溶剂A：水+0.1％v/v三氟乙酸(TFA)；溶剂B：MeCN+
0.1％v/v TFA 20min内A/B＝70/30-0/100n，在580nm下检测]和/或TLC(常规SiO2，ACN/H2O，
5∶1)。当加入20mg DSC和15μL Et3N时，反应完成。还监测到双NHS酯的点(具有最高的Rf；蓝色)，以及空间位阻更大的羧基酸基团的单-NHS酯的点。后者具有最低的Rf-值(并给出微蓝色的点)。将反应混合物用等体积的干燥CAN稀释，并装载至含有常规SiO2(10g)的柱上。用ACN/CH2Cl2/H2O(10∶1∶1)，随后用ACN/H2O(5∶1)洗脱，得到所需的红紫色溶液形式的单-NHS酯14a-c-NHS。将它们浓缩，通过Rotilabo膜滤器(连接至注射器；以移除SiO2)过滤，并冻+
干。14a-NHS(C37H33N3O8，M＝647).MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝648(100)[M+H] ；14b-NHS(C37H33N3O9，M＝663.2217).HR-MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝664.2252(实测值[M+H]+)，
664.2290(计算值).
100 C18 5μm，250×4mm，1.2mL/min；溶剂A：水+0.1％v/v三氟乙酸(TFA)；溶剂B：MeCN+
0.1％v/v TFA 20min内A/B＝70/30-0/100n，在580nm下检测]和/或TLC(常规SiO2，ACN/H2O，
5∶1)。当加入20mg DSC和15μL Et3N时，反应完成。还监测到双NHS酯的点(具有最高的Rf；蓝色)，以及空间位阻更大的羧基酸基团的单-NHS酯的点。后者具有最低的Rf-值(并给出微蓝色的点)。将反应混合物用等体积的干燥CAN稀释，并装载至含有常规SiO2(10g)的柱上。用ACN/CH2Cl2/H2O(10∶1∶1)，随后用ACN/H2O(5∶1)洗脱，得到所需的红紫色溶液形式的单-NHS酯14a-c-NHS。将它们浓缩，通过Rotilabo膜滤器(连接至注射器；以移除SiO2)过滤，并冻+
干。14a-NHS(C37H33N3O8，M＝647).MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝648(100)[M+H] ；14b-NHS(C37H33N3O9，M＝663.2217).HR-MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝664.2252(实测值[M+H]+)，
664.2290(计算值).
[0188] 获得单-酰胺14a-c-NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)6Cl的一般方法.将量为约1mg(约2μM)的单-NHS酯14a-c-NHS在约200μL Cl(CH2)6O(CH2)2O(CH2)2NH2在DMF(20mg/mL)的溶液中溶解，在搅拌下加入Et3N(10μL)。反应进程通过TLC监测。当反应完成时(约2h)，将反应混合物用CH2Cl2-乙腈混合物(1∶3)稀释，并用等体积的饱和NaHCO3水溶液(下层相)萃取。将上面的有机层分离，并用半饱和的NH4Cl水溶液(用三氟乙酸(TFA；以移除过量的胺)酸化)萃取。将有机溶液真空蒸发，并将残渣装载在具有常规SiO2(5g)的柱上。用CH2Cl2-甲醇(10∶1→8∶1)洗脱，以得到标题酰胺，将其通过常规SiO2(5g)(使用MeCN-H2O混合物(10∶1→5∶1))上的色谱法纯化。将纯流分汇集，浓缩，通过Rotilabo注射器滤器(0.22μm)过滤，并冻干。14a-NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)6Cl(C43HS0N3O7Cl)：HR-MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝756.3384(实测值[M+H]+)，756.3410(计算值).HPLC[柱-Kinetex 5μm C18 100，250×4mm，1.2mL/min；溶剂A：0.05M Et3N*H2CO3缓冲液(TEAB)；溶剂B：MeCN，20min内A/B＝70/30-0/100，在600nm下二极管阵列检测]；tR＝9.7和10.5min(比率为1∶1)-2个非对映异构体，其区别在于OH和COOH基团的相互位置；参见正文。以下光谱数据在含有PBS缓冲剂的水溶液(pH 7.4)中获得。吸收λmax，nm(ε，M-1cm-1)＝578(55000)，发射λmax，nm(Φfl)＝601(0.74-用罗丹明101作为参比染料获得相对值，乙醇中Φfl＝0.96；在540nm下激发)。14b-NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)6Cl(C43H50N3O8Cl)：HR-MS(ESI)：m/z(阳性模式，％)＝772.3329(实测值[M+H]+)，772.3359(计算值)。HPLC[柱-Kinetex 5μm C18 100，250×4mm，1.2mL/min；溶剂A：0.05M Et3N*H2CO3缓冲剂(TEAB)；溶剂B：MeCN，20min内A/B＝70/30-0/100，在200-700nm的范围下进行二极管阵列检测]；tR＝8.0和8.0min(比率为1∶1)-2个非对映异构体，其区别在于OH和COOH基团的相互位置；参见正文。以下光谱数据在含有PBS缓冲剂的水溶液(pH 7.4)中获得。吸收λmax，nm(ε，M-1cm-1)＝575(63000)，发射λmax，nm(Φfl)＝598(0.55-用罗丹明101作为参比染料获得相对值，在乙醇中Φfl＝0.96；在540nm下激发)。14c-NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)6Cl.以下光谱数-1 -1
据在含有PBS缓冲剂的水溶液(pH 7.4)中获得。吸收λmax，nm(ε，M cm )＝582(55000)，发射λmax，nm(Φfl)＝605(0.64-用罗丹明101作为参比染料获得相对值，在乙醇中Φfl＝0.96；在
540nm下激发)。
据在含有PBS缓冲剂的水溶液(pH 7.4)中获得。吸收λmax，nm(ε，M cm )＝582(55000)，发射λmax，nm(Φfl)＝605(0.64-用罗丹明101作为参比染料获得相对值，在乙醇中Φfl＝0.96；在
540nm下激发)。
[0189] 实施例2
[0190] Ge-罗丹明染料的合成
[0191] 四甲基-Ge-罗丹明19的合成
[0192] 化合物15.将3-溴-N，N-二甲基苯胺(2.32g，11.6mmol，2eq)在无水THF(40mL)中的溶液在真空系统(Schlenkline)上脱气，并在氩气下冷却至-78℃。将正丁基锂(5.1mL己烷中的2.5M溶液，12.76mmol，2.2eq)用注射器快速逐滴注射，并将混合物在-78℃下搅拌1h。将溶解于无水THF(3mL)的二氯化二甲基锗(1.01g，5.8mmol)用注射器逐滴注射。使混合物温热至RT，并搅拌2.5h。然后加入盐水(50mL)，将混合物用乙酸乙酯(3×40mL)萃取，并将合并的有机层用Na2SO4干燥。TLC控制(SiO2/己烷中10％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.37。将产物
15通过快速柱色谱法(Biotage SNAP Ultra 50g，梯度1％至10％乙酸乙酯-己烷，15个柱体积)分离，得到无色油，收率1.56g(78％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.27(ddd，J＝8.3，7.1，
0.5Hz，2H)，6.93(br.d，J＝2.9Hz，2H)，6.90(dt，J＝7.1，1.0Hz，2H)，2.96(s，8H)，0.66(s，
6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ150.3，141.1，128.7，122.2，117.9，113.1，40.8，-2.7.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝345.2(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：345.1387[M+H]+(实测值)，345.1384(C18H27N2Ge计算值，[M+H]+)。
15通过快速柱色谱法(Biotage SNAP Ultra 50g，梯度1％至10％乙酸乙酯-己烷，15个柱体积)分离，得到无色油，收率1.56g(78％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.27(ddd，J＝8.3，7.1，
0.5Hz，2H)，6.93(br.d，J＝2.9Hz，2H)，6.90(dt，J＝7.1，1.0Hz，2H)，2.96(s，8H)，0.66(s，
6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ150.3，141.1，128.7，122.2，117.9，113.1，40.8，-2.7.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝345.2(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：345.1387[M+H]+(实测值)，345.1384(C18H27N2Ge计算值，[M+H]+)。
[0193] 化合物16.将N-溴代琥珀酰亚胺(NBS；1.69g，9.51mmol，2.1eq)分批加入至冰水浴中冷却的15(2.61g，4.34mmol)在乙腈(25mL)中的溶液。首先出现黄色，随后形成沉淀。当悬浮液的黄色突然变为褐色时，停止加入NBS，并将混合物在冰-水浴中搅拌1h。TLC控制(SiO2/CH2Cl2)：Rf(产物)＝0.65，Rf(原料)＝0.55。加入饱和NaHCO3水溶液(40mL)，将混合物用CH2Cl2(3×40mL)萃取，将合并的萃取物用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物16通过快速柱色谱法(Biotage SNAP Ultra 50g，梯度10％至100％CH2Cl2-己烷，15个CV)分离，得到黄色固体，收率2.00g(88％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.36(d，J＝8.7Hz，2H)，6.75(d，J＝13
3.2Hz，2H)，6.58(dd，J＝8.8，3.2Hz，2H)，2.87(s，12H)，0.87(s，6H). C NMR(101MHz，CDCl3)：δ149.1，141.5，132.8，120.9，116.8，115.0，40.7，-0.1.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝501.0(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：500.9590[M+H]+(实测值)，
500.9581(C18H25N2GeBr2计算值，[M+H]+).
3.2Hz，2H)，6.58(dd，J＝8.8，3.2Hz，2H)，2.87(s，12H)，0.87(s，6H). C NMR(101MHz，CDCl3)：δ149.1，141.5，132.8，120.9，116.8，115.0，40.7，-0.1.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝501.0(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：500.9590[M+H]+(实测值)，
500.9581(C18H25N2GeBr2计算值，[M+H]+).
[0194] 化合物17.将16(500mg，0.994mmol)在无水THF(20mL)中的溶液在真空系统上脱气，并在氩气下冷却至-78℃。逐滴加入叔丁基锂(2.4mL戊烷中的1.7M溶液，3.98mmol，4eq)，并将所得的亮黄色溶液在-78℃下搅拌1.5h。然后将二甲基氨基甲酰氯(100μL，
1.09mmol)用注射器逐滴注射。将混合物在-78℃下搅拌30分钟，使其温热至RT，并用饱和NH4Cl水溶液(10mL)淬灭。TLC控制(SiO2/乙酸乙酯：Rf(产物)＝0.50(亮黄色)，Rf(杂质)＝
0.71(无色)。将混合物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，并将合并的有机层用Na2SO4干燥。将产物
17通过快速柱色谱法(Sepacore Silica HP 12g；梯度10％至100％乙酸乙酯-己烷)分离，得到亮黄色固体，其快速变为微绿色，收率264g(72％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.42(d，J＝9.0Hz，2H)，6.80(dd，J＝9.1，2.8Hz，2H)，6.72(d，J＝2.8Hz，2H)，3.08(s，12H)，0.60(s，
6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ185.2，151.5，143.3，132.1，129.7，114.3，112.7，40.1，-+
1.3.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝371.1(100)[M+H] .HR-MS(ESI，阳性模式)：
371.1175[M+H]+(实测值)，371.1177(C19H25N2OGe计算值，[M+H]+).
1.09mmol)用注射器逐滴注射。将混合物在-78℃下搅拌30分钟，使其温热至RT，并用饱和NH4Cl水溶液(10mL)淬灭。TLC控制(SiO2/乙酸乙酯：Rf(产物)＝0.50(亮黄色)，Rf(杂质)＝
0.71(无色)。将混合物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，并将合并的有机层用Na2SO4干燥。将产物
17通过快速柱色谱法(Sepacore Silica HP 12g；梯度10％至100％乙酸乙酯-己烷)分离，得到亮黄色固体，其快速变为微绿色，收率264g(72％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.42(d，J＝9.0Hz，2H)，6.80(dd，J＝9.1，2.8Hz，2H)，6.72(d，J＝2.8Hz，2H)，3.08(s，12H)，0.60(s，
6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ185.2，151.5，143.3，132.1，129.7，114.3，112.7，40.1，-+
1.3.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝371.1(100)[M+H] .HR-MS(ESI，阳性模式)：
371.1175[M+H]+(实测值)，371.1177(C19H25N2OGe计算值，[M+H]+).
[0195] 化合物19.在100mL圆底烧瓶中，将化合物18(路线7；(223mg，0.54mmol，2eq)在无水THF(10mL)中的脱气溶液冷却至-78℃。逐滴加入叔丁基锂(0.32mL戊烷中的1.7M溶液，0.54mmol，2eq)，并将所得的黄色-橙色溶液在-78℃下搅拌1h。快速逐滴加入酮17(100mg，
0.27mmol)在THF(8mL)中的溶液，并使淡橙色混合物温热至室温(RT)，并搅拌3.5h。然后将混合物在冰-水浴中冷却，并加入乙酸(1.4mL)。将所得的蓝色溶液蒸发为粘稠残渣，加入6N HCl(16mL)，并将混合物在80℃(浴温)下搅拌过夜。将混合物用NaHCO3调节至pH 1-2，用CH2Cl2(4×50mL)萃取，用0.1HCl(2×50mL)、盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Sepacore Silica HP 12g；梯度0％至10％甲醇-CH2Cl2)分离，并由二氧杂环己烷冻干，以得到蓝色蓬松固体形式的19(47mg，
34％收率)。UV-Vis(PBS 7.4)：λmax(ε)＝634nm(97000M-1cm-1)；荧光(PBS 7.4)：λexcit＝
590nm，λem＝655nm；Φfl(相对于噁嗪1，乙醇中Φfl＝0.14)＝0.43.1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ
8.29(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，8.23(dd，J＝1.3，0.8Hz，1H)，8.05(dd，J＝8.0，0.7Hz，1H)，
6.98(d，J＝2.9Hz，2H)，6.86(d，J＝8.9Hz，2H)，6.52(dd，J＝8.9，2.9Hz，2H)，2.96(s，12H)，
0.81(s，3H)，0.80(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ170.4，169.5，153.4，149.6，140.4，
134.1，131.6，131.2，130.7，127.5，127.1，126.3，117.5，112.7，40.5，0.8，-2.2.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝519.1(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：519.1330[M+H]+(实测值)，519.1339(C27H28N2O4Ge计算值，[M+H]+).
0.27mmol)在THF(8mL)中的溶液，并使淡橙色混合物温热至室温(RT)，并搅拌3.5h。然后将混合物在冰-水浴中冷却，并加入乙酸(1.4mL)。将所得的蓝色溶液蒸发为粘稠残渣，加入6N HCl(16mL)，并将混合物在80℃(浴温)下搅拌过夜。将混合物用NaHCO3调节至pH 1-2，用CH2Cl2(4×50mL)萃取，用0.1HCl(2×50mL)、盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Sepacore Silica HP 12g；梯度0％至10％甲醇-CH2Cl2)分离，并由二氧杂环己烷冻干，以得到蓝色蓬松固体形式的19(47mg，
34％收率)。UV-Vis(PBS 7.4)：λmax(ε)＝634nm(97000M-1cm-1)；荧光(PBS 7.4)：λexcit＝
590nm，λem＝655nm；Φfl(相对于噁嗪1，乙醇中Φfl＝0.14)＝0.43.1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ
8.29(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，8.23(dd，J＝1.3，0.8Hz，1H)，8.05(dd，J＝8.0，0.7Hz，1H)，
6.98(d，J＝2.9Hz，2H)，6.86(d，J＝8.9Hz，2H)，6.52(dd，J＝8.9，2.9Hz，2H)，2.96(s，12H)，
0.81(s，3H)，0.80(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ170.4，169.5，153.4，149.6，140.4，
134.1，131.6，131.2，130.7，127.5，127.1，126.3，117.5，112.7，40.5，0.8，-2.2.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝519.1(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：519.1330[M+H]+(实测值)，519.1339(C27H28N2O4Ge计算值，[M+H]+).
[0196]
[0197] 路线11.Ge-罗丹明19的衍生物用作标记试剂
[0198] 化合物19-卤代.将PyBOP(30μL 20mg/100μL DMF储备溶液，11.6μmol，1.5eq)加入至19(4mg，7.74μmol)、HaloTag胺(O2)(2-(2-((6-氯己基)-氧基)乙氧基)乙胺；3.5mg，15.63μmol，2 equiv)和三甲胺(12μL)在DMF(100μL)中的溶液。1h后，将溶剂在室温下真空蒸发，并将产物通过制备型TLC(二氧化硅，3％甲醇-CH2Cl2，然后CH2Cl2)分离，得到不纯的物质，将其通过制备型HPLC(Kinetex 5μm C18 100，21mm×25cm，11mL/min，等度65/35 A/B，A-乙腈，B-水+0.05％TFA)纯化。收率3.8mg(68％)，纯度(HPLC)～95％.HPLC(20min内30/
70-100/0A/B，Kinetex 5μm C18 100 4.6×250mm，1.2mL/min，在254nm或636nm下检测)：τ＝12.50min.1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.99(dd，J＝7.9，0.7Hz，1H)，7.93(dd，J＝7.9，
1.4Hz，1H)，7.91(dd，J＝1.4，0.8Hz，1H)，6.96(d，J＝2.9Hz，2H)，6.84(d，J＝8.9Hz，2H)，
6.78(br.s，1H)，6.50(dd，J＝8.9，2.9Hz，2H)，3.71-3.63(m，6H)，3.59-3.55(m，2H)，3.49(t，J＝6.7Hz，2H)，3.41(t，J＝6.7Hz，2H)，2.96(s，12H)，1.71(m，2H+H2O)，1.57-1.25(m，
6H)，0.79(s，3H)，0.79(s，3H).ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝724.3[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：724.2572(实测值)，724.2571(C37H49ClGeN3O5计算值，[M+H]+).
70-100/0A/B，Kinetex 5μm C18 100 4.6×250mm，1.2mL/min，在254nm或636nm下检测)：τ＝12.50min.1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.99(dd，J＝7.9，0.7Hz，1H)，7.93(dd，J＝7.9，
1.4Hz，1H)，7.91(dd，J＝1.4，0.8Hz，1H)，6.96(d，J＝2.9Hz，2H)，6.84(d，J＝8.9Hz，2H)，
6.78(br.s，1H)，6.50(dd，J＝8.9，2.9Hz，2H)，3.71-3.63(m，6H)，3.59-3.55(m，2H)，3.49(t，J＝6.7Hz，2H)，3.41(t，J＝6.7Hz，2H)，2.96(s，12H)，1.71(m，2H+H2O)，1.57-1.25(m，
6H)，0.79(s，3H)，0.79(s，3H).ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝724.3[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：724.2572(实测值)，724.2571(C37H49ClGeN3O5计算值，[M+H]+).
[0199] 化合物20.将TSTU(N，N，N′，N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)-脲四氟硼酸盐；20μL 14mg/100μL DMSO储备溶液，9.1μmol，1.2eq)加入至19(4mg，7.74μmol)和DIEA(N-乙基二异丙基胺；12μL)在DMSO(200μL)中的溶液。搅拌5min后，加入8-氨基辛酸(20μL 15mg/100μL DMSO储备悬浮液，通过超声处理制备；18.2μmol，2.3eq)，将所得的悬浮液在室温下超声处理10min，随后剧烈搅拌15min。然后加入水(50μL)，并将混合物再搅拌30min。加入乙酸(50μL)，并将溶剂在室温下真空蒸发。将产物20通过制备HPLC(Kinetex 5μm C18 100，21mm×
25cm，11mL/min，等度50/50A/B，A-乙腈，B-水+0.05％TFA)分离。收率2.5mg(49％).HPLC(20min内30/70-100/0A/B，Kinetex 5μm C18 100 4.6×250mm，1.2mL/min，在254nm或
636nm下检测)：τ＝8.60min.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.75(t，J＝5.6Hz，1H)，8.11(dd，J＝8.0，1.4Hz，1H)，8.03(br.d，J＝8.2Hz，1H)，7.86(br.s，1H)，7.05(br.s，2H)，6.71(br.d，J＝9.0Hz，2H)，6.61(br.d，J＝8.1Hz，2H)，3.24(q，J＝6.7Hz，2H)，2.94(br.s，12H)，2.17(t，J＝7.4Hz，2H)，1.49(m，4H)，1.27(m，6H)，0.77(s，3H)，0.68(s，3H).ESI-MS，阳性模式：
m/z(rel.int.，％)＝660.4(100)[M+H]+.
25cm，11mL/min，等度50/50A/B，A-乙腈，B-水+0.05％TFA)分离。收率2.5mg(49％).HPLC(20min内30/70-100/0A/B，Kinetex 5μm C18 100 4.6×250mm，1.2mL/min，在254nm或
636nm下检测)：τ＝8.60min.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.75(t，J＝5.6Hz，1H)，8.11(dd，J＝8.0，1.4Hz，1H)，8.03(br.d，J＝8.2Hz，1H)，7.86(br.s，1H)，7.05(br.s，2H)，6.71(br.d，J＝9.0Hz，2H)，6.61(br.d，J＝8.1Hz，2H)，3.24(q，J＝6.7Hz，2H)，2.94(br.s，12H)，2.17(t，J＝7.4Hz，2H)，1.49(m，4H)，1.27(m，6H)，0.77(s，3H)，0.68(s，3H).ESI-MS，阳性模式：
m/z(rel.int.，％)＝660.4(100)[M+H]+.
[0200] 化合物19-微管蛋白.将TSTU(N，N，N′，N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸盐；10μL 17mg/100μL DMF储备溶液，5.7μmol，1.5eq)加入至20(2.5mg，3.8μmol)和DIEA(N-乙基二异丙基胺；10μL)在DMSO(200μL)中的溶液，并将反应混合物搅拌1h。加入DIEA(20μL)，随后加入3′-H2NXT·HCO2H(“3′-氨基多西他赛甲酸盐”(G. 等人，Nat.Methods 2014，11，731-733)；4.3mg，5.7μmol，1.5eq，在100μL DMF+100μL DMSO中溶解)，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将溶剂在RT下真空蒸发，并将产物通过制备型HPLC(Kinetex 5μm C18 100，10mm×25cm，梯度20min内30/70-80/20A/B；A-乙腈，B-水+0.05％TFA)分离。收率0.73mg(14％)，通过分光光度法测定(G. 等人，Nat.Methods
2014，11，731-733)。HPLC(20min内20/80-80/20A/B，Kinetex 5μm C18 100 4.6×250mm，
1.2mL/min，在650nm下检测)：τ＝14.90min.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝1371.5[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：1371.5111(实测值)，1371.5165(C73H86N4O16GeNa计算值，[M+Na]+).
2014，11，731-733)。HPLC(20min内20/80-80/20A/B，Kinetex 5μm C18 100 4.6×250mm，
1.2mL/min，在650nm下检测)：τ＝14.90min.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝1371.5[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：1371.5111(实测值)，1371.5165(C73H86N4O16GeNa计算值，[M+Na]+).
[0201] 羟基化Ge-罗丹明(33)
[0202] 化合物21.将3-溴苯酚(8.1g，46.8mmol)和咪唑(3.5g，51.5mmol，1.1eq)在CH2Cl2(55mL)中的溶液在冰-水浴中冷却。在约20分钟内，向冷却的混合物中滴加三异丙基甲硅烷基氯化物(TIPSCl；10.4mL，49.2mmol，1.05eq)在CH2Cl2(40mL)中的溶液。将所得的悬浮液从冰-水浴移除，并在RT下搅拌过夜。TLC控制(SiO2/己烷中10％EtOAc)：Rf(产物)＝0.70，Rf(3-溴苯酚)＝0.18。将混合物用水(150mL)稀释，用CH2Cl2(3×50mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物21通过快速色谱法分离(在1L玻璃Büchner漏斗上用～200g二氧化硅(3.5cm层)，用400mL部分的0％→5％→10％CH2Cl2-己烷洗脱)。将产物21通过
1L玻璃Büchner漏斗上的快速色谱法(用～200g二氧化硅(3.5cm层)，用400mL部分的0％→
5％→10％CH2Cl2-己烷洗脱)分离。无色油，收率15.07g(98％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ
7.08-7.06(m，2H)，7.05-7.03(m，1H)，6.84-6.77(m，1H)，1.32-1.18(m，3H)，1.10(d，J＝
7.2Hz，18H).
1L玻璃Büchner漏斗上的快速色谱法(用～200g二氧化硅(3.5cm层)，用400mL部分的0％→
5％→10％CH2Cl2-己烷洗脱)分离。无色油，收率15.07g(98％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ
7.08-7.06(m，2H)，7.05-7.03(m，1H)，6.84-6.77(m，1H)，1.32-1.18(m，3H)，1.10(d，J＝
7.2Hz，18H).
[0203] 化合物22.将TIPS保护的溴苯酚21(3.54g，10.76mmol，2eq)在无水THF(40mL)中的溶液在真空系统上脱气，并在氩气下冷却至-78℃。将正丁基锂(4.7mL己烷中的2.5M溶液，11.84mmol，2.2eq)用注射器快速逐滴注射，并将混合物在-78℃下搅拌1h，其变为稀悬浮液。将溶解于无水THF(2.5mL)中的二氯化二甲基锗(0.62mL，5.38mmol)用注射器逐滴注射。
使混合物温热至RT(固体溶解)，并将所得的溶液在RT下搅拌4.5h。然后加入盐水(40mL)，将混合物用乙酸乙酯(3×40mL)萃取，并将合并的有机层用Na2SO4干燥。TLC控制(SiO2/己烷中
10％CH2Cl2)：Rf(产物)＝0.34，Rf(杂质)＝0.50。将产物22通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 80g，纯己烷等度洗脱5个CV，然后梯度0％至20％CH2Cl2-己烷，持续8CV)分离，得到无色油，收率2.79g(86％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.23-7.17(m，2H)，7.01(dt，J＝7.1，1.1Hz，2H)，6.98-6.96(m，2H)，6.85(ddd，J＝8.1，2.6，1.1Hz，2H)，1.27-1.16(m，
6H)，1.08(d，J＝7.2Hz，36H)，0.60(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ155.9，141.6，129.1，
126.2，125.0，120.2，18.1，12.8，-3.0.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝625.3(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：625.2897[M+Na]+(实测值)，625.2930(C32H56O6Si2GeNa计算+
值，[M+Na]).
使混合物温热至RT(固体溶解)，并将所得的溶液在RT下搅拌4.5h。然后加入盐水(40mL)，将混合物用乙酸乙酯(3×40mL)萃取，并将合并的有机层用Na2SO4干燥。TLC控制(SiO2/己烷中
10％CH2Cl2)：Rf(产物)＝0.34，Rf(杂质)＝0.50。将产物22通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 80g，纯己烷等度洗脱5个CV，然后梯度0％至20％CH2Cl2-己烷，持续8CV)分离，得到无色油，收率2.79g(86％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.23-7.17(m，2H)，7.01(dt，J＝7.1，1.1Hz，2H)，6.98-6.96(m，2H)，6.85(ddd，J＝8.1，2.6，1.1Hz，2H)，1.27-1.16(m，
6H)，1.08(d，J＝7.2Hz，36H)，0.60(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ155.9，141.6，129.1，
126.2，125.0，120.2，18.1，12.8，-3.0.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝625.3(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：625.2897[M+Na]+(实测值)，625.2930(C32H56O6Si2GeNa计算+
值，[M+Na]).
[0204] 化合物23.将N-溴代琥珀酰亚胺(1.62g，9.11mmol，2.1eq)在5分钟内分批加入至22(2.61g，4.34mmol)在乙腈(60mL)和吡啶(8.5mL)的混合物的溶液中。将所得的混合物在
60℃(浴温)下搅拌过夜(22h)，其变为褐色溶液。TLC控制(SiO2/己烷中5％CH2Cl2)：Rf(产物)＝0.27，Rf(原料)＝0.19。将溶剂在旋转蒸发器上移除，将残渣在CH2Cl2(120mL)中再次溶解，并将溶液用饱和NaHCO3水溶液、水、盐水(各100mL)洗涤，并用Na2SO干燥。将产物23通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 80g，梯度0％至25％CH2Cl2-己烷，持续15个CV)分离，其为粘稠无色油，纯度～85％，收率2.64g(70％认为的纯度)。将该物质在未进一
1
步纯化下在下一步骤中使用。H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.35(d，J＝8.6Hz，2H)，6.85(d，J＝
3.0Hz，2H)，6.74(dd，J＝8.6，3.0Hz，2H)，1.23-1.12(m，6H)，1.05(d，J＝7.0Hz，36H)，0.84(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ155.1，142.4，133.5，127.5，122.5，120.9，18.0，12.8，-
0.3.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝783.1(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：
783.1103[M+Na]+(实测值)，783.1119(C32H54O2Si2GeBr2Na计算值，[M+Na]+).
60℃(浴温)下搅拌过夜(22h)，其变为褐色溶液。TLC控制(SiO2/己烷中5％CH2Cl2)：Rf(产物)＝0.27，Rf(原料)＝0.19。将溶剂在旋转蒸发器上移除，将残渣在CH2Cl2(120mL)中再次溶解，并将溶液用饱和NaHCO3水溶液、水、盐水(各100mL)洗涤，并用Na2SO干燥。将产物23通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 80g，梯度0％至25％CH2Cl2-己烷，持续15个CV)分离，其为粘稠无色油，纯度～85％，收率2.64g(70％认为的纯度)。将该物质在未进一
1
步纯化下在下一步骤中使用。H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.35(d，J＝8.6Hz，2H)，6.85(d，J＝
3.0Hz，2H)，6.74(dd，J＝8.6，3.0Hz，2H)，1.23-1.12(m，6H)，1.05(d，J＝7.0Hz，36H)，0.84(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ155.1，142.4，133.5，127.5，122.5，120.9，18.0，12.8，-
0.3.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝783.1(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：
783.1103[M+Na]+(实测值)，783.1119(C32H54O2Si2GeBr2Na计算值，[M+Na]+).
[0205] 化合物24.将23(2.9g，3.82mmol)在无水THF(60mL)中的溶液在真空系统上脱气，并在氩气下冷却至-78℃。逐滴加入正丁基锂(3.2mL己烷中的2.5M溶液，8.02mmol，2.1eq)，并将所得的淡黄色溶液在-78℃下搅拌5.5h。然后将二甲基氨基甲酰氯(0.36mL，3.82mmol)用注射器逐滴注射。将混合物在-78℃下搅拌30分钟，其变为接近无色，然后使其温热至RT，并再搅拌1.5h。TLC控制(SiO2/己烷中10％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.62(与NaOH加热后为黄色)，Rf(原料)＝0.72。将反应混合物用饱和NH4Cl(30mL)水溶液淬灭，用乙酸乙酯(3×30mL)萃取，并将合并的有机层用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 80g，梯度0％至100％A：B，A＝10％乙酸乙酯-己烷，B＝己烷)分离，得到淡黄色粘稠油，纯度～70％，收率2.13g(62％认为的纯度)。将不纯的物质直接用于脱保护。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.37(d，J＝8.7Hz，2H)，7.02(d，J＝2.6Hz，2H)，6.98(dd，J＝8.7，2.6Hz，
2H)，1.36-1.21(m，6H)，1.13(d，J＝7.3Hz，36H)，0.59(s，6H).ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝629.3(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：629.2898[M+H]+(实测值)，+
629.2903(C33H55GeO3Si2计算值，[M+H]).
2H)，1.36-1.21(m，6H)，1.13(d，J＝7.3Hz，36H)，0.59(s，6H).ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝629.3(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：629.2898[M+H]+(实测值)，+
629.2903(C33H55GeO3Si2计算值，[M+H]).
[0206] 将溶解于THF(20mL)中的氟化四丁基铵三水合物(2.68g，8.5mmol，2.5equiv)加入至在冰-水浴中冷却的来自前一步骤的粗品二TIPS醚在THF(25mL)中的溶液。将所得的亮黄色溶液在0℃下搅拌1h。TLC控制(SiO2/己烷中50％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.26(与NaOH为黄色)，Rf(杂质)＝0.48，Rf(原料)＝0.76。加入饱和NH4Cl水溶液(50mL)，随后加入溶解固体所需的少量水，并将混合物用乙酸乙酯(3×40mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 80g；梯度20％至80％乙酸乙酯-己烷)分离，以得到白色固体形式的纯24。收率475mg(2步39％).1H NMR(400MHz，丙酮-d6)：δ9.09(s，2H)，8.31(d，J＝8.7Hz，2H)，7.12(d，J＝2.6Hz，2H)，7.00(dd，J＝8.8，2.6Hz，2H)，0.60(s，6H).13C NMR(101MHz，丙酮-d6)：δ161.1，144.7，134.1，133.3，119.9，
117.6，-1.9.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝339.0(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：339.0052[M+Na]+(实测值)，339.0050(C15H14GeO3Na计算值，[M+Na]+).
117.6，-1.9.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝339.0(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：339.0052[M+Na]+(实测值)，339.0050(C15H14GeO3Na计算值，[M+Na]+).
[0207] 化合物25.将24(475mg，1.51mmol)和咪唑(308mg，4.53mmol，3eq)在CH2Cl2(30mL)和DMF(3mL)中的溶液在冰-水浴中冷却。向冷的混合物中快速滴加叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(TBSCl；684mg，4.53mmol，3eq)在CH2Cl2(5mL)中的溶液。将所得的白色悬浮液从冰-水浴中移除，并在RT下搅拌4h。TLC控制(SiO2/己烷中10％EtOAc)：Rf(产物)＝0.56，Rf(原料)＝0。将混合物用水(300mL)稀释，用CH2Cl2(3×50mL)萃取，将合并的有机层用水(200mL)、饱和NaHCO3水溶液、盐水(各100mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物25通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 40g；梯度0％至100％A：B，A＝10％乙酸乙酯-己烷，B＝己烷)分离。白色固体，收率817g(100％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.37(d，J＝8.7Hz，2H)，
6.98(d，J＝2.6Hz，2H)，6.95(dd，J＝8.7，2.6Hz，2H)，1.01(s，18H)，0.60(s，6H)，0.26(s，
12H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ186.2，158.8，143.8，134.8，132.7，123.9，121.3，25.8，+
18.5，-1.7，-4.2.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝545.2(100)[M+H] .HR-MS(ESI，阳性模式)：545.1958[M+H]+(实测值)，545.1962(C27H43O3Si2Ge计算值，[M+H]+).
6.98(d，J＝2.6Hz，2H)，6.95(dd，J＝8.7，2.6Hz，2H)，1.01(s，18H)，0.60(s，6H)，0.26(s，
12H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ186.2，158.8，143.8，134.8，132.7，123.9，121.3，25.8，+
18.5，-1.7，-4.2.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝545.2(100)[M+H] .HR-MS(ESI，阳性模式)：545.1958[M+H]+(实测值)，545.1962(C27H43O3Si2Ge计算值，[M+H]+).
[0208] 化合物27.在100mL圆底烧瓶中，将化合物26(路线9；1.04g，2.9mmol，2eq)在无水THF(10mL)和戊烷(5mL)中的脱气的溶液冷却至-100℃(浴温，乙醚-液体N2)。将正丁基锂(1.2mL己烷中2.5M溶液，2.9mmol，2eq)小心地通过沿烧瓶壁的针引入。澄清溶液快速变为橙色，然后变为褐色-橙色；将其在-100℃下搅拌10分钟，并将酮25(787mg，1.45mmol)在THF(8mL)中的溶液在1-2min内沿着烧瓶壁注射。然后将烧瓶置于-78°浴(干冰-丙酮)，并将褐色溶液搅拌10分钟。将冷却浴移除，使混合物温热至RT，并搅拌另外30分钟。TLC控制(SiO2/己烷中10％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.35(与NaOH加热后为黄色)，Rf(原料)＝0.47。将反应混合物用水(50mL)淬灭，用乙酸调节pH为约4，用乙酸乙酯(3×30mL)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Biotage SNAP Ultra 100g；梯度0％至100％A：B，A＝15％乙酸乙酯-己烷，B＝己烷)分离，并由二氧杂环己烷冻干，以得到白色固体形式的27(501mg，46％收率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.18(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，
8.08(dd，J＝1.3，0.7Hz，1H)，7.99(dd，J＝8.0，0.7Hz，1H)，7.10(d，J＝2.7Hz，2H)，6.96(d，J＝8.7Hz，2H)，6.65(dd，J＝8.7，2.7Hz，2H)，1.60(s，9H)，0.98(s，18H)，0.795(s，3H)，
0.790(s，3H)，0.19(s，12H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ169.4，164.5，155.5，153.0，140.6，
137.0，136.2，130.4，129.7，127.8，126.2，125.9，125.5，120.2，91.2，82.6，28.3，25.8，+
18.4，0.5，-1.9，-4.21，-4.23.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝749.3(100)[M+H].HR-MS(ESI，阳性模式)：749.2732[M+H]+(实测值)，749.2753(C39H55O6GeSi2计算值， [M+ H]+).
8.08(dd，J＝1.3，0.7Hz，1H)，7.99(dd，J＝8.0，0.7Hz，1H)，7.10(d，J＝2.7Hz，2H)，6.96(d，J＝8.7Hz，2H)，6.65(dd，J＝8.7，2.7Hz，2H)，1.60(s，9H)，0.98(s，18H)，0.795(s，3H)，
0.790(s，3H)，0.19(s，12H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ169.4，164.5，155.5，153.0，140.6，
137.0，136.2，130.4，129.7，127.8，126.2，125.9，125.5，120.2，91.2，82.6，28.3，25.8，+
18.4，0.5，-1.9，-4.21，-4.23.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝749.3(100)[M+H].HR-MS(ESI，阳性模式)：749.2732[M+H]+(实测值)，749.2753(C39H55O6GeSi2计算值， [M+ H]+).
[0209] 化合物28.将溶解于THF(5mL)中的氟化四丁基铵三水合物(850mg，2.68mmol，4eq)加入至在冰-水浴中冷却的27(500mg，0.67mmol)在THF(7mL)中的溶液。将所得的具有深红色荧光的蓝色溶液在0℃下搅拌30分钟。TLC控制(SiO2/CH2Cl2中10％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.31，Rf(原料)＝0.83。加入饱和NH4Cl水溶液(20mL)，随后加入溶解固体所需的少量水，并将混合物用乙酸乙酯(3×25mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf 24g；梯度0％至30％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，蒸发为粘稠无色油，由二氧杂环己烷冻干，以得到白色固体形式的28(393mg，每摩尔产物包含0.65mol二氧杂环己烷，100％收率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.18(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，8.03(dd，J＝1.3，0.8Hz，1H)，7.99(dd，J＝8.0，0.8Hz，1H)，7.08(d，J＝2.8Hz，
2H)，6.86(d，J＝8.7Hz，2H)，6.60(dd，J＝8.7，2.8Hz，2H)，6.40(d，J＝4.0Hz，2H)，1.59(s，
9H)，0.67(s，3H)，0.63(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ170.6，164.7，155.7，153.4，
140.8，137.2，134.9，130.5，129.4，127.9，126.3，125.8，120.9，115.9，92.1，83.1，28.3，
0.3，-1.9.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝543.1(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：543.0838[M+Na]+(实测值)，543.0839(C27H26GeO6Na计算值，[M+Na]+).
2H)，6.86(d，J＝8.7Hz，2H)，6.60(dd，J＝8.7，2.8Hz，2H)，6.40(d，J＝4.0Hz，2H)，1.59(s，
9H)，0.67(s，3H)，0.63(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ170.6，164.7，155.7，153.4，
140.8，137.2，134.9，130.5，129.4，127.9，126.3，125.8，120.9，115.9，92.1，83.1，28.3，
0.3，-1.9.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝543.1(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：543.0838[M+Na]+(实测值)，543.0839(C27H26GeO6Na计算值，[M+Na]+).
[0210] 化合物29.将三氟甲磺酸酐(Tf2O；155μL，0.92mmol，4eq)滴加至冰-水浴中冷却的28(133mg每摩尔28包含0.65mol二氧杂环己烷的物质，0.23mmol)和吡啶(150μL，1.84mmol，
8eq)在干燥CH2Cl2(5mL)中的溶液。在加入每一滴后出现粉色，并且立即消失。然后将烧瓶从冷却浴移除，并将混合物在RT下搅拌1h。TLC控制(SiO2/己烷中10％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝
0.18(与NaOH为粉色)。将混合物用冷水(20mL)稀释，用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法并冻干分离，并由二氧杂环己烷冻干，以得到白色蓬松固体形式的29，收率173mg(96％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.26(dd，J＝8.0，1.2Hz，1H)，8.16(dd，J＝1.3，0.7Hz，1H)，8.05(dd，J＝8.0，0.8Hz，1H)，7.54(d，J＝
2.7Hz，2H)，7.31(d，J＝8.8Hz，2H)，7.16(dd，J＝8.8，2.7Hz，2H)，1.62(d，J＝0.8Hz，9H)，
0.93(s，3H)，0.92(s，3H).19F NMR(376MHz，CDCl3)：δ-72.78.13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ
168.1，164.0，150.8，149.5，143.3，142.5，137.7，131.4，129.2，128.4，127.0，126.7，
125.7，122.1，118.8(q，J＝320.8Hz)，89.2，83.2，28.3，0.9，-1.7.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝807.0(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：806.9805[M+Na]+(实测值)，
806.9824(C29H24O10GeS2F6Na计算值，[M+Na]+).
8eq)在干燥CH2Cl2(5mL)中的溶液。在加入每一滴后出现粉色，并且立即消失。然后将烧瓶从冷却浴移除，并将混合物在RT下搅拌1h。TLC控制(SiO2/己烷中10％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝
0.18(与NaOH为粉色)。将混合物用冷水(20mL)稀释，用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法并冻干分离，并由二氧杂环己烷冻干，以得到白色蓬松固体形式的29，收率173mg(96％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.26(dd，J＝8.0，1.2Hz，1H)，8.16(dd，J＝1.3，0.7Hz，1H)，8.05(dd，J＝8.0，0.8Hz，1H)，7.54(d，J＝
2.7Hz，2H)，7.31(d，J＝8.8Hz，2H)，7.16(dd，J＝8.8，2.7Hz，2H)，1.62(d，J＝0.8Hz，9H)，
0.93(s，3H)，0.92(s，3H).19F NMR(376MHz，CDCl3)：δ-72.78.13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ
168.1，164.0，150.8，149.5，143.3，142.5，137.7，131.4，129.2，128.4，127.0，126.7，
125.7，122.1，118.8(q，J＝320.8Hz)，89.2，83.2，28.3，0.9，-1.7.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝807.0(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：806.9805[M+Na]+(实测值)，
806.9824(C29H24O10GeS2F6Na计算值，[M+Na]+).
[0211] 化合物31.将29(170mg，0.22mmol)、3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)氮杂环丁烷30(123mg，0.66mmol，3eq)、Pd2(dba)3(20mg，0.022mmol，10mol％)、XPhos(31mg，0.066mmol，
30mol％)和K2CO3(91mg，0.66mmol，3eq)在干燥二氧杂环己烷(2mL)中的混合物在真空系统上脱气，并在氩气下100℃(浴温)下在密封的烧瓶中搅拌2小时。TLC控制表明不完全转化(SiO2/己烷-CH2Cl2-乙酸乙酯70∶25∶5，通过与1M NaOH加热来染色：Rf(产物)＝0.2(蓝色)，Rf(单取代产物)＝0.33(紫色)，Rf(原料)＝0.38(粉色)。加入额外部分的Pd2(dba)3(20mg，
0.022mmol，10mol％)和XPhos(31mg，0.066mmol，30mol％)，将混合物脱气并在100℃下搅拌另外2h(4h总时间)。通过TLC验证原料以及单三氟甲磺酸酯的消耗，并且在冷却后，将褐色混合物用水(20mL)稀释，用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将滤液在Celite蒸发，并将产物通过快速柱色谱法(Interchim Puriflash 15μm
25g；以纯CH2Cl2等度洗脱，直至洗脱出第一个峰(6CV)，然后梯度0％至100％A：B，A＝CH2Cl2中10％乙酸乙酯，B＝CH2Cl2)分离，并由1，4-二氧杂环己烷冻干，以得到84mg(45％)的淡黄
1
色蓬松固体形式的31。H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.16(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，8.03(t，J＝
1.0Hz，1H)，7.97(dd，J＝8.0，0.7Hz，1H)，6.88(d，J＝8.6Hz，2H)，6.67(d，J＝2.6Hz，2H)，
6.26(dd，J＝8.7，2.6Hz，2H)，4.74(tt，J＝6.3，5.0Hz，2H)，4.15(td，J＝6.5，1.3Hz，4H)，
3.65(dd，J＝7.6，5.0Hz，4H)，1.59(s，9H)，0.89(s，18H)，0.78(s，3H)，0.78(s，3H)，0.07(s，
12H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ169.7，164.6，153.6，150.9，139.8，136.8，132.3，130.1，
130.0，127.2，125.94，125.92，116.6，112.0，92.2，82.4，62.5，62.2，62.1，28.3，25.9，
18.1，0.6，-1.8，-4.8.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝859.4(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：859.3586[M+H]+(实测值)，859.3599(C45H65N2O6Si2Ge计算值，[M+H]+).[0212] 化合物32.将溶解于THF(5mL)中的氟化四丁基铵三水合物(93mg，294μmol，
3equiv)加入至在冰-水浴中冷却的31(84mg，98μmol)在THF(10mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1h。然后加入水(20mL)、乙酸(0.5mL)和盐水(20mL)，并将混合物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，蒸发，并用乙酸乙酯(2×20mL)再次蒸发两次。将产物通过快速柱色谱法(Sepacore Silica HP 12g；梯度20％至100％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，并由1，4-二氧杂环己烷冻干以得到淡绿色蓬松固体形式的32。收率60mg
1
(97％).H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.16(dd，J＝8.1，1.3Hz，1H)，7.96(dd，J＝8.0，0.7Hz，
1H)，7.90(t，J＝1.0Hz，1H)，6.79(d，J＝8.7Hz，2H)，6.73(d，J＝2.6Hz，2H)，6.28(ddd，J＝
8.7，2.7，0.9Hz，2H)，4.85(s，2H+H2O)，4.63(tt，J＝6.4，4.8Hz，2H)，4.16-4.07(m，4H)，
3.67-3.56(m，4H)，1.55(s，9H)，0.76(s，3H)，0.70(s，3H).13C NMR(101MHz，CD3OD)：δ171.5，
165.6，155.7，152.5，140.3，138.3，133.0，131.1，130.5，128.1，126.9，126.5，117.6，
113.4，83.6，63.0，62.5，28.3，0.1，-1.7.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝631.2(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：631.1851[M+H]+(实测值)，631.1865(C33H37N2O6Ge计算值，[M+H]+).
30mol％)和K2CO3(91mg，0.66mmol，3eq)在干燥二氧杂环己烷(2mL)中的混合物在真空系统上脱气，并在氩气下100℃(浴温)下在密封的烧瓶中搅拌2小时。TLC控制表明不完全转化(SiO2/己烷-CH2Cl2-乙酸乙酯70∶25∶5，通过与1M NaOH加热来染色：Rf(产物)＝0.2(蓝色)，Rf(单取代产物)＝0.33(紫色)，Rf(原料)＝0.38(粉色)。加入额外部分的Pd2(dba)3(20mg，
0.022mmol，10mol％)和XPhos(31mg，0.066mmol，30mol％)，将混合物脱气并在100℃下搅拌另外2h(4h总时间)。通过TLC验证原料以及单三氟甲磺酸酯的消耗，并且在冷却后，将褐色混合物用水(20mL)稀释，用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将滤液在Celite蒸发，并将产物通过快速柱色谱法(Interchim Puriflash 15μm
25g；以纯CH2Cl2等度洗脱，直至洗脱出第一个峰(6CV)，然后梯度0％至100％A：B，A＝CH2Cl2中10％乙酸乙酯，B＝CH2Cl2)分离，并由1，4-二氧杂环己烷冻干，以得到84mg(45％)的淡黄
1
色蓬松固体形式的31。H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.16(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，8.03(t，J＝
1.0Hz，1H)，7.97(dd，J＝8.0，0.7Hz，1H)，6.88(d，J＝8.6Hz，2H)，6.67(d，J＝2.6Hz，2H)，
6.26(dd，J＝8.7，2.6Hz，2H)，4.74(tt，J＝6.3，5.0Hz，2H)，4.15(td，J＝6.5，1.3Hz，4H)，
3.65(dd，J＝7.6，5.0Hz，4H)，1.59(s，9H)，0.89(s，18H)，0.78(s，3H)，0.78(s，3H)，0.07(s，
12H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ169.7，164.6，153.6，150.9，139.8，136.8，132.3，130.1，
130.0，127.2，125.94，125.92，116.6，112.0，92.2，82.4，62.5，62.2，62.1，28.3，25.9，
18.1，0.6，-1.8，-4.8.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝859.4(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：859.3586[M+H]+(实测值)，859.3599(C45H65N2O6Si2Ge计算值，[M+H]+).[0212] 化合物32.将溶解于THF(5mL)中的氟化四丁基铵三水合物(93mg，294μmol，
3equiv)加入至在冰-水浴中冷却的31(84mg，98μmol)在THF(10mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1h。然后加入水(20mL)、乙酸(0.5mL)和盐水(20mL)，并将混合物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，蒸发，并用乙酸乙酯(2×20mL)再次蒸发两次。将产物通过快速柱色谱法(Sepacore Silica HP 12g；梯度20％至100％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，并由1，4-二氧杂环己烷冻干以得到淡绿色蓬松固体形式的32。收率60mg
1
(97％).H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.16(dd，J＝8.1，1.3Hz，1H)，7.96(dd，J＝8.0，0.7Hz，
1H)，7.90(t，J＝1.0Hz，1H)，6.79(d，J＝8.7Hz，2H)，6.73(d，J＝2.6Hz，2H)，6.28(ddd，J＝
8.7，2.7，0.9Hz，2H)，4.85(s，2H+H2O)，4.63(tt，J＝6.4，4.8Hz，2H)，4.16-4.07(m，4H)，
3.67-3.56(m，4H)，1.55(s，9H)，0.76(s，3H)，0.70(s，3H).13C NMR(101MHz，CD3OD)：δ171.5，
165.6，155.7，152.5，140.3，138.3，133.0，131.1，130.5，128.1，126.9，126.5，117.6，
113.4，83.6，63.0，62.5，28.3，0.1，-1.7.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝631.2(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：631.1851[M+H]+(实测值)，631.1865(C33H37N2O6Ge计算值，[M+H]+).
[0213] 化合物33.将三氟乙酸(1.6mL)加入至冰-水浴中冷却的32(50mg，79.5μmol)在CH2Cl2(8mL)中的溶液。移除冷却浴，并将反应混合物在RT下搅拌3h。蒸发溶剂，并将残渣用甲苯(2×20mL)再蒸发两次。将产物通过快速柱色谱法(20g二氧化硅，乙腈-CH2Cl2-水10∶1∶0.5，然后10∶1∶1)，随后反相色谱法(RP-C18 10g；梯度67％至33％水-乙腈)分离。将包含产物的流分蒸发，在1，4-二氧杂环己烷中溶解，加入少量水，将少量粘稠不溶性材料离心移除，将上清液通过微孔过滤，并冻干以得到51mg(79％)的蓝色蓬松固体(三氟乙酸盐，每摩尔染料包含1.4mol 1，4-二氧杂环己烷)。HPLC(25min镍10/90-100/0，柱4×250mm，1.2mL/min，在254nm下检测)：τ＝10.32min.UV-Vis(PBS 7.4)：λmax(ε)＝631nm(61000M-1cm-1)；荧光(PBS 7.4)：λexcit＝590nm，λem＝651nm；Φfl(abs.)＝0.60.1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.22(br.d，J＝7.0Hz，1H)，8.07(br.s，1H)，7.92(d，J＝7.0Hz，1H)，6.78(d，J＝8.6Hz，2H)，6.73(d，J＝2.5Hz，2H)，6.25(dd，J＝8.6，2.6Hz，2H)，4.63(tt，J＝6.2，4.8Hz，2H)，4.164.08(m，
4H)，3.62-3.57(m，4H)，0.74(s，3H)，0.71(s，3H).19F NMR(376MHz，CD3OD)：δ-76.95.13C NMR(101MHz，CD3OD)：δ171.7，154.1，152.5，141.4，133.4，130.1，128.3，126.4，117.7，112.9，+
94.8，63.0，62.5，0.5，-2.6.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝575.2(100)[M+H].HR-MS(ESI，阳性模式)：575.1225(实测值)，575.1238(C29H29N2O6Ge计算值，[M+H]+).[0214]
4H)，3.62-3.57(m，4H)，0.74(s，3H)，0.71(s，3H).19F NMR(376MHz，CD3OD)：δ-76.95.13C NMR(101MHz，CD3OD)：δ171.7，154.1，152.5，141.4，133.4，130.1，128.3，126.4，117.7，112.9，+
94.8，63.0，62.5，0.5，-2.6.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝575.2(100)[M+H].HR-MS(ESI，阳性模式)：575.1225(实测值)，575.1238(C29H29N2O6Ge计算值，[M+H]+).[0214]
[0215] 路线12.羟基化Ge-罗丹明33的衍生物用作标记试剂
[0216] 化合物33-卤代.将PyBOP(20μL 20mg/100μL储备溶液，7.41μmol，1.5equiv)加入至33(4mg，5.82μmol)、HaloTag胺(O2)(2-(2-((6-氯己基)-氧基)乙氧基)乙胺；2.0mg，8.73μmol，1.5equiv)和DIEA(N-乙基二异丙基胺；10μL)在DMF(100μL)中的溶液。1h后，将溶剂在RT下真空蒸发，并将产物33-卤代通过制备型TLC(二氧化硅，5％甲醇-CH2Cl2，然后10％甲醇-CH2Cl2)分离。收率4.3mg(95％)，纯度(HPLC)～95％.HPLC(25min内10/90-100/0A/B，柱4×250mm，1.2mL/min，在254nm或640nm下检测)：τ＝14.60min.UV-Vis(PBS 7.4)：λmax＝639nm；荧光(PBS 7.4)：，λexcit＝610nm，λem＝660nm.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝780.3[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：780.2471(实测值)，780.2470(C39H49ClGeN3O7计算值，[M+H]+).
[0217] 化合物33-溶酶体.在氩气下，向33(2mg，3.5μmol)在干燥DMSO(400μL)中的溶液加入DIEA(N-乙基二异丙基胺；16μL，91μmol)和TSTU(1.5mg，4.6μmol)。将反应混合物搅拌5min，然后加入1，6-二氨基己烷(1.6mg，13.3μmol)。将反应混合物超声处理15min，随后加入水(20μL)，并搅拌30min(HPLC控制)。将混合物通过加入乙酸(6.3μL，105μmol)淬灭，并冻干。将产物通过制备HPLC(柱Kinetex 5μm C18 100，10mm×25cm，梯度20min内20/80酯50/
50A/B，A-乙腈，B-水+0.05％TFA)分离，以得到1.5mg(64％)的蓝色固体形式的33a，将其如下在下一步骤中使用。HPLC(10min内20/80-100/0A/B，柱Kinetex 2.6μm C18 100 4.6×
75mm，1mL/min，在254nm或650nm下检测)：τ＝2.9min(33a)，3.6min(33).
50A/B，A-乙腈，B-水+0.05％TFA)分离，以得到1.5mg(64％)的蓝色固体形式的33a，将其如下在下一步骤中使用。HPLC(10min内20/80-100/0A/B，柱Kinetex 2.6μm C18 100 4.6×
75mm，1mL/min，在254nm或650nm下检测)：τ＝2.9min(33a)，3.6min(33).
[0218] 将胃蛋白酶抑制剂A(1.9mg，2.7μmol)在干燥DMSO(200μL)中溶解，加入DIEA(3.6μL，21.4μmol)，随后加入TSTU(3.2μmol；10μL DMSO中4.3mg/50μL储备溶液)，并将溶液在室温下搅拌80min。向所得的胃蛋白酶抑制剂A NHS酯的溶液加入DIEA(3.6μL，21.4μmol)和33a(1.5mg，2.2μmol)在DMSO(200μL)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌60min。将溶剂通过冻干移除，并将产物通过制备HPLC(柱Kinetex 5μm C18 100，10mm×25cm，梯度20min内
30/70至100/0A/B，A-乙腈，B-水+0.05％TFA)分离。HPLC(10min内20/80-80/20A/B，柱Kinetex 2.6μm C18 100 4.6×75mm，1mL/min，在254nm或650nm下检测)：τ＝6.3min(33-溶酶体).
30/70至100/0A/B，A-乙腈，B-水+0.05％TFA)分离。HPLC(10min内20/80-80/20A/B，柱Kinetex 2.6μm C18 100 4.6×75mm，1mL/min，在254nm或650nm下检测)：τ＝6.3min(33-溶酶体).
[0219] 化合物34.将TSTU(N，N，N′，N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)-脲四氟硼酸盐；20μL 18mg/100μL DMSO储备溶液，12μmol，1.2eq)加入至33(6mg，10μmol)和DIEA(N-乙基二异丙基胺；12μL)在DMSO(250μL)中的溶液。搅拌5min后，加入8-氨基辛酸(20μL 18mg/100μL DMSO储备悬浮液，通过超声处理制备；23μmol，2.3eq)，将所得的悬浮液在室温下超声处理
10min，随后剧烈搅拌15min。然后加入水(50μL)，并将混合物再搅拌30min。加入乙酸(50μL)，并将溶剂在室温下真空蒸发。将产物通过制备型HPLC(Kinetex 5μm C18 100，21mm×
25cm，11mL/min，梯度20min内20/75-70/30A/B，A-乙腈，B-水+0.05％TFA)分离。收率2.5mg(49％).HPLC(20min内20/80-70/30A/B，Kinetex 5μm C18 100 4.6×250mm，1.2mL/min，在
254nm下检测)：τ＝10.90min.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.75(t，J＝5.6Hz，1H)，8.11(dd，J＝8.0，1.4Hz，1H)，8.03(br.d，J＝8.2Hz，1H)，7.86(br.s，1H)，7.05(br.s，2H)，6.71(br.d，J＝9.0Hz，2H)，6.61(br.d，J＝8.1Hz，2H)，3.24(q，J＝6.7Hz，2H)，2.94(br.s，12H)，2.17(t，J＝7.4Hz，2H)，1.49(m，4H)，1.27(m，6H)，0.77(s，3H)，0.68(s，3H).ESI-MS，阳性模式：
m/z(rel.int.，％)＝716.2[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：716.2374(实测值)，716.2394(C37H44N3O7Ge计算值，[M+H]+).
10min，随后剧烈搅拌15min。然后加入水(50μL)，并将混合物再搅拌30min。加入乙酸(50μL)，并将溶剂在室温下真空蒸发。将产物通过制备型HPLC(Kinetex 5μm C18 100，21mm×
25cm，11mL/min，梯度20min内20/75-70/30A/B，A-乙腈，B-水+0.05％TFA)分离。收率2.5mg(49％).HPLC(20min内20/80-70/30A/B，Kinetex 5μm C18 100 4.6×250mm，1.2mL/min，在
254nm下检测)：τ＝10.90min.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.75(t，J＝5.6Hz，1H)，8.11(dd，J＝8.0，1.4Hz，1H)，8.03(br.d，J＝8.2Hz，1H)，7.86(br.s，1H)，7.05(br.s，2H)，6.71(br.d，J＝9.0Hz，2H)，6.61(br.d，J＝8.1Hz，2H)，3.24(q，J＝6.7Hz，2H)，2.94(br.s，12H)，2.17(t，J＝7.4Hz，2H)，1.49(m，4H)，1.27(m，6H)，0.77(s，3H)，0.68(s，3H).ESI-MS，阳性模式：
m/z(rel.int.，％)＝716.2[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：716.2374(实测值)，716.2394(C37H44N3O7Ge计算值，[M+H]+).
[0220] 化合物33-微管蛋白.将TSTU(N，N，N′，N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸盐；13μL 20mg/100μL DMF储备溶液，8.67μmol，1.5eq)加入至34(5.78μmol，在500μL DMSO中)和DIEA(N-乙基二异丙基胺；16μL)的溶液，并将反应混合物搅拌1h。加入DIEA(30μL)，随后加入3′-H2NXT·HCO2H(“3′-氨基多西他赛甲酸盐”；6.5mg，8.7μmol，1.5eq，在150μL DMF中溶解)，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将溶剂在RT下真空蒸发，并将产物通过制备型HPLC(Kinetex 5μm C18 100，10mm×25cm，等度50/50A/B，A-乙腈，B-水+0.05％TFA)分离。收率1.59mg(20％)，通过分光光度法测定。HPLC(2min内10/90-80/20A/B，柱4×250mm，1.2mL/min，在254nm下检测)：τ＝15.83min.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝1405.5(100)[M+H]+.HR-MS(EsI，阳性模式)：1405.5237(实测值)，1405.5244(C75H87N4O18Ge计算值，[M+H]+).
[0221] 羟基化Si-罗丹明JF646(42)
[0222] 化合物35.将TIPS保护的溴苯酚(21；5.27g，16.02mmol，2eq)在无水THF(60mL)中的溶液在真空系统上脱气，并在氩气下冷却至-78℃。将正丁基锂(7.05mL己烷中2.5M溶液，17.62mmol，2.2eq)用注射器快速逐滴注射，并将混合物在-78℃下搅拌1h，其变为粘稠悬浮液。用注射器滴加二氯二甲基甲硅烷(0.97mL，8.01mmol)。使混合物温热至RT(固体溶解)，并将所得的溶液在RT下搅拌2h。然后加入盐水(50mL)和水(20mL)，将混合物用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，并将合并的有机层用Na2SO4干燥。TLC控制(SiO2/己烷中10％CH2Cl2)：Rf(产物)＝0.36，Rf(原料)＝0.55。将产物35通过快速柱色谱法(90g二氧化硅，梯度0％至30％
1
CH2Cl2-己烷)分离，得到无色油，收率4.12g(93％)。H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.23-7.18(m，
2H)，7.06(dt，J＝7.2，1.1Hz，2H)，7.02-7.00(m，2H)，6.88(ddd，J＝8.1，2.6，1.1Hz，2H)，
1.29-1.16(m，6H)，1.08(d，J＝7.1Hz，36H)，0.51(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ155.7，
139.8，129.0，126.8，125.6，120.8，18.1，12.8，-2.3.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝595.3(100)[M+K]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：595.3215[M+K]+(实测值)，595.3220
(C32H56O2Si3K计算值，[M+K]+).
1
CH2Cl2-己烷)分离，得到无色油，收率4.12g(93％)。H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.23-7.18(m，
2H)，7.06(dt，J＝7.2，1.1Hz，2H)，7.02-7.00(m，2H)，6.88(ddd，J＝8.1，2.6，1.1Hz，2H)，
1.29-1.16(m，6H)，1.08(d，J＝7.1Hz，36H)，0.51(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ155.7，
139.8，129.0，126.8，125.6，120.8，18.1，12.8，-2.3.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝595.3(100)[M+K]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：595.3215[M+K]+(实测值)，595.3220
(C32H56O2Si3K计算值，[M+K]+).
[0223] 化合物36.将N-溴代琥珀酰亚胺(2.33g，13.07mmol，2.1eq)在5分钟内分批加入至35(3.46g，6.22mmol)在乙腈(85mL)和氯仿(25mL)的混合物的溶液中。将所得溶液在60℃(浴温)下搅拌过夜(16h)，其变为淡黄色。TLC控制(SiO2/己烷中5％CH2Cl2)：Rf(产物)＝
0.44，Rf(原料)＝0.36。将溶剂在旋转蒸发器上移除，将残渣在CH2Cl2(150mL)中再次溶解，并将溶液用饱和NaHCO3水溶液、水、盐水(各100mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物36通过快速柱色谱法(100g二氧化硅，梯度0％至15％CH2Cl2-己烷)分离，得到无色油，收率3.27g(74％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：67.34(d，J＝8.6Hz，2H)，6.97(d，J＝3.0Hz，2H)，6.76(dd，J＝8.6，3.0Hz，2H)，1.25-1.15(m，6H)，1.07(d，J＝7.3Hz，36H)，0.72(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ155.0，140.0，133.8，128.5，123.0，121.0，18.0，12.8，-1.0.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝737.2(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：737.1664[M+Na]+(实测值)，737.1673(C32H54Br2O2Si3Na计算值，[M+Na]+).
0.44，Rf(原料)＝0.36。将溶剂在旋转蒸发器上移除，将残渣在CH2Cl2(150mL)中再次溶解，并将溶液用饱和NaHCO3水溶液、水、盐水(各100mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物36通过快速柱色谱法(100g二氧化硅，梯度0％至15％CH2Cl2-己烷)分离，得到无色油，收率3.27g(74％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：67.34(d，J＝8.6Hz，2H)，6.97(d，J＝3.0Hz，2H)，6.76(dd，J＝8.6，3.0Hz，2H)，1.25-1.15(m，6H)，1.07(d，J＝7.3Hz，36H)，0.72(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ155.0，140.0，133.8，128.5，123.0，121.0，18.0，12.8，-1.0.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝737.2(100)[M+Na]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：737.1664[M+Na]+(实测值)，737.1673(C32H54Br2O2Si3Na计算值，[M+Na]+).
[0224] 化合物37.将36(4.06g，5.69mmol)在无水THF(80mL)中的溶液在真空系统上脱气，并在氩气下冷却至-78℃。滴加正丁基锂(5mL己烷中2.5M溶液，12.5mmol，2.2eq)，并将混合物在-78℃下搅拌3.5h，其变为澄清淡黄色溶液。然后用注射器逐滴注射二甲基氨基甲酰氯(0.53mL，5.69mmol，1eq)。将混合物在-78℃下搅拌30分钟，然后使其温热至RT，并再搅拌30min。TLC控制(SiO2/己烷中10％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.59(与NaOH加热后为黄色)，Rf(原料)＝0.67。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(30mL)淬灭，用乙酸乙酯(3×40mL)萃取，并将合并的有机层用Na2SO4干燥。将产物37通过快速柱色谱法(Teledyne Isco RediSep Rf
80g；梯度0％至100％A：B，A＝10％乙酸乙酯-己烷，B＝己烷)分离，得到淡黄色粘稠油，收率
2.46g(74％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.36(d，J＝8.7Hz，2H)，7.08(d，J＝2.5Hz，2H)，7.02(dd，J＝8.7，2.6Hz，2H)，1.36-1.25(m，6H)，1.13(d，J＝7.3Hz，36H)，0.45(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ186.1，159.3，141.2，134.5，132.4，123.6，121.8，18.1，12.9，-1.4.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝583.3[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：583.3428[M+H]+(实测值)，583.3454(C33H55O3Si3计算值，[M+H]+).
80g；梯度0％至100％A：B，A＝10％乙酸乙酯-己烷，B＝己烷)分离，得到淡黄色粘稠油，收率
2.46g(74％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.36(d，J＝8.7Hz，2H)，7.08(d，J＝2.5Hz，2H)，7.02(dd，J＝8.7，2.6Hz，2H)，1.36-1.25(m，6H)，1.13(d，J＝7.3Hz，36H)，0.45(s，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ186.1，159.3，141.2，134.5，132.4，123.6，121.8，18.1，12.9，-1.4.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝583.3[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：583.3428[M+H]+(实测值)，583.3454(C33H55O3Si3计算值，[M+H]+).
[0225] 化合物38.在50mL圆底烧瓶中，将26(路线9；427mg，1.2mmol，2eq)在无水THF(4mL)和戊烷(2mL)中的脱气的溶液冷却至-100℃(浴温，乙醚-液体N2)。将正丁基锂(0.48mL己烷中2.5M溶液，1.2mmol，2eq)小心地通过沿烧瓶壁的针引入。澄清溶液快速变为橙色，然后变为紫色；将其在-100℃下搅拌10分钟，并将酮37(349mg，0.6mmol)在THF(2mL)中的溶液在1-2min内沿着烧瓶壁注射。然后将烧瓶置于-78°浴(干冰-丙酮)，并继续搅拌10分钟。将冷却浴移除，使混合物温热至RT，并搅拌另外30分钟。TLC控制(SiO2/己烷中10％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.45(与NaOH加热后为紫色)，Rf(原料)＝0.62。将反应混合物用水(20mL)淬灭，用乙酸调节pH为约4，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Interchim Puriflash HP 15μm 25g；梯度0％至20％乙酸乙酯-己烷)分离；将包含产物的流分通过快速柱色谱法(Grace Reveleris HP 12g；梯度
30％至100％CH2Cl2-戊烷，持续20CV)再次纯化，并将产物由1，4-二氧杂环己烷冻干，以得到白色固体形式的38。收率186mg(39％).1H NMR(400MHz，丙酮-d6)：δ8.17(dd，J＝8.0，1.3Hz，
1H)，8.04(d，J＝8.0Hz，1H)，7.81(dd，J＝1.3，0.7Hz，1H)，7.35(d，J＝2.7Hz，2H)，7.05(d，J＝8.7Hz，2H)，6.93(dd，J＝8.8，2.7Hz，2H)，1.54(s，9H)，1.36－1.24(m，6H)，1.11(d，J＝
7.4Hz，36H)，0.74(s，3H)，0.61(s，3H).13C NMR(101MHz，丙酮-d6)：δ170.0，164.5，156.53，
156.52，138.4，137.7，137.0，130.9，130.0，129.0，128.7，126.7，125.7，125.0，122.6，
90.3，82.9，28.2，18.3，13.4，-0.3，-0.4.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝787.5(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：787.4224[M+H]+(实测值)，787.4240(C45H67O6Si3计算值，[M+H]+).
30％至100％CH2Cl2-戊烷，持续20CV)再次纯化，并将产物由1，4-二氧杂环己烷冻干，以得到白色固体形式的38。收率186mg(39％).1H NMR(400MHz，丙酮-d6)：δ8.17(dd，J＝8.0，1.3Hz，
1H)，8.04(d，J＝8.0Hz，1H)，7.81(dd，J＝1.3，0.7Hz，1H)，7.35(d，J＝2.7Hz，2H)，7.05(d，J＝8.7Hz，2H)，6.93(dd，J＝8.8，2.7Hz，2H)，1.54(s，9H)，1.36－1.24(m，6H)，1.11(d，J＝
7.4Hz，36H)，0.74(s，3H)，0.61(s，3H).13C NMR(101MHz，丙酮-d6)：δ170.0，164.5，156.53，
156.52，138.4，137.7，137.0，130.9，130.0，129.0，128.7，126.7，125.7，125.0，122.6，
90.3，82.9，28.2，18.3，13.4，-0.3，-0.4.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝787.5(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：787.4224[M+H]+(实测值)，787.4240(C45H67O6Si3计算值，[M+H]+).
[0226] 化合物39.将溶解于THF(3.5mL)中的氟化四丁基铵三水合物(290mg，0.92mmol，4eq)加入至在冰-水浴中冷却的38(180mg，0.23mmol)在THF(3mL)中的溶液。形成具有红色荧光的深蓝色溶液。将溶液在0℃下搅拌30分钟。TLC控制(SiO2/CH2Cl2中10％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.47(橙色；与NaOH为紫色)。加入饱和NH4Cl水溶液(20mL)，将混合物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将滤液蒸发为淡橙色油，将其在下一步骤直接使用。
[0227] 将三氟甲磺酸酐(Tf2O；155μL，0.92mmol，4eq)滴加至冰-水浴中冷却的脱保护步骤的粗品材料和吡啶(150μL，1.84mmol，8eq)在干燥CH2Cl2(5mL)中的溶液。在加入每一滴后出现粉色，并且立即消失。然后将烧瓶从冷却浴移除，并将黄色混合物在RT下搅拌1h。TLC控制(SiO2/己烷中10％乙酸乙酯)：Rf(产物)＝0.22(与NaOH为紫色)。将混合物用冷水(30mL)稀释，用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将产物通过快速柱色谱法(Sepacore Silica HP 12g；梯度0％至20％乙酸乙酯-戊烷)分离，并将纯流分蒸发以得到白色泡沫形式的39，收率153mg(90％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.21(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，8.04(dd，J＝8.0，0.8Hz，1H)，7.91(t，J＝1.0Hz，1H)，7.57(d，J＝2.6Hz，
2H)，7.28(d，J＝8.9Hz，2H)，7.21(dd，J＝8.9，2.7Hz，2H)，1.58(s，9H)，0.81(s，3H)，0.71(s，3H).19F NMR(376MHz，CDCl3)：δ-72.77.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝739.3(100)[M+H]+.
2H)，7.28(d，J＝8.9Hz，2H)，7.21(dd，J＝8.9，2.7Hz，2H)，1.58(s，9H)，0.81(s，3H)，0.71(s，3H).19F NMR(376MHz，CDCl3)：δ-72.77.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝739.3(100)[M+H]+.
[0228] 化合物40.将39(150mg，0.2mmol)、3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)氮杂环丁烷30(112mg，0.6mmol，3eq)、Pd2(dba)3(18mg，0.02mmol，10mol％)、XPhos(29mg，0.06mmol，30mol％)和K2CO3(83mg，0.6mmol，3eq)在干燥二氧杂环己烷(2mL)中的混合物在真空系统(真空系统)上脱气，并在氩气下100℃(浴温)下在密封的烧瓶中搅拌3小时。TLC控制(SiO2/戊烷-CH2Cl2-乙酸乙酯70∶25∶5，通过加热染色)：Rf(产物)＝0.50(蓝色)，Rf(原料)＝0.61(无色)。冷却后，将反应混合物用水(20mL)稀释，用CH2Cl2(3×20mL)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥。将滤液在Celite蒸发，并将产物通过快速柱色谱法
(Interchim Puriflash 15μm 25g；梯度0％至100％A：B，A＝己烷-CH2Cl2-乙酸乙酯70∶25∶
10，B＝己烷-CH2Cl2 70∶25)分离，并由1，4-二氧杂环己烷冻干，以得到145mg(89％)淡黄色蓬松固体形式的40。
(Interchim Puriflash 15μm 25g；梯度0％至100％A：B，A＝己烷-CH2Cl2-乙酸乙酯70∶25∶
10，B＝己烷-CH2Cl2 70∶25)分离，并由1，4-二氧杂环己烷冻干，以得到145mg(89％)淡黄色蓬松固体形式的40。
[0229] 1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.11(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，7.96(dd，J＝8.0，0.7Hz，1H)，7.81(s，1H)，6.85(d，J＝8.7Hz，2H)，6.69(d，J＝2.6Hz，2H)，6.33(dd，J＝8.8，2.6Hz，
2H)，4.78-4.69(m，2H)，4.19-4.12(m，4H)，3.69-3.62(m，4H)，1.55(s，9H)，0.89(s，18H)，
0.66(s，3H)，0.58(s，3H)，0.07(s，12H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ170.3，164.4，155.4，
150.7，137.3，136.1，132.7，129.9，129.0，127.7，125.7，125.1，116.3，113.3，82.3，62.5，
62.1，28.2，25.9，18.1，0.2，-0.6，-4.8.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝813.4(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：813.4120[M+H]+(实测值)，813.4145(C45H65N2O6Si3计算值，[M+H]+).
2H)，4.78-4.69(m，2H)，4.19-4.12(m，4H)，3.69-3.62(m，4H)，1.55(s，9H)，0.89(s，18H)，
0.66(s，3H)，0.58(s，3H)，0.07(s，12H).13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ170.3，164.4，155.4，
150.7，137.3，136.1，132.7，129.9，129.0，127.7，125.7，125.1，116.3，113.3，82.3，62.5，
62.1，28.2，25.9，18.1，0.2，-0.6，-4.8.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝813.4(100)[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：813.4120[M+H]+(实测值)，813.4145(C45H65N2O6Si3计算值，[M+H]+).
[0230] 化合物41.将溶解于THF(10mL)中的氟化四丁基铵三水合物(142mg，0.45mmol，3eq)加入至在冰-水浴中冷却的40(122mg，0.15mmol)在THF(15mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1h。然后加入水(20mL)、乙酸(1.5mL)和盐水(20mL)，并将混合物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，蒸发，并用乙酸乙酯(2×20mL)再次蒸发两次。将产物通过快速柱色谱法(13g二氧化硅；梯度10％至80％乙酸乙酯-CH2Cl2)分离，并由1，4-二氧杂环己烷冻干以得到淡绿色蓬松固体形式的41。收率84mg(96％).1H NMR
(400MHz，CD3OD)：δ8.12(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，7.97(dd，J＝8.1，0.7Hz，1H)，7.69(t，J＝
1.0Hz，1H)，6.77(d，J＝2.8Hz，2H)，6.76(d，J＝8.9Hz，2H)，6.35(dd，J＝8.9，2.8，2H)，4.63(tt，J＝6.5，4.8Hz，2H)，4.17-4.09(m，4H)，3.64-3.57(m，4H)，1.51(d，J＝0.8Hz，9H)，0.64(s，3H)，0.54(s，3H).13C NMR(101MHz，CD3OD)∶δ172.0，165.4，157.4，152.4，138.7，136.9，
133.4，130.9，129.7，128.5，126.7，125.6，117.3，114.6，93.2，83.5，68.1，63.0，62.5，+
28.3，-0.1，-0.5.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝585.3(100)[M+H] .HR-MS(ESI，阳性模式)：585.2429[M+H]+(实测值)，585.2415(C33H37N2O6Si计算值，[M+H]+).
(400MHz，CD3OD)：δ8.12(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，7.97(dd，J＝8.1，0.7Hz，1H)，7.69(t，J＝
1.0Hz，1H)，6.77(d，J＝2.8Hz，2H)，6.76(d，J＝8.9Hz，2H)，6.35(dd，J＝8.9，2.8，2H)，4.63(tt，J＝6.5，4.8Hz，2H)，4.17-4.09(m，4H)，3.64-3.57(m，4H)，1.51(d，J＝0.8Hz，9H)，0.64(s，3H)，0.54(s，3H).13C NMR(101MHz，CD3OD)∶δ172.0，165.4，157.4，152.4，138.7，136.9，
133.4，130.9，129.7，128.5，126.7，125.6，117.3，114.6，93.2，83.5，68.1，63.0，62.5，+
28.3，-0.1，-0.5.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝585.3(100)[M+H] .HR-MS(ESI，阳性模式)：585.2429[M+H]+(实测值)，585.2415(C33H37N2O6Si计算值，[M+H]+).
[0231] 化合物42.将三氟乙酸(2.8mL)加入至冰-水浴中冷却的41(84mg，144μmol)在CH2Cl2(14mL)中的溶液。移除冷却浴，并将反应混合物在RT下搅拌6h。蒸发溶剂，并将残渣用甲苯(2×20mL)再蒸发两次，并由1，4-二氧杂环己烷冻干，得到101mg不纯的物质。将产物通过反相色谱法(RP-C18 10g；梯度67％至33％水-乙腈)分离。将包含产物的流分蒸发，并由1，
4-二氧杂环己烷冻干，以得到70mg(92％)的蓝色蓬松固体形式的42(游离碱)。HPLC(25min内10/90-100/0，柱4×250mm，1.2mL/min，在254nm下检测)：τ＝9.98min.UV-Vis(PBS 7.4)：
λmax(ε)＝641nm(51000M-1cm-1)；荧光(PBS 7.4)：λexcit＝610nm，λem＝662nm；Φfl(相对于噁嗪1，在乙醇中Φfl＝0.14)＝0.42。1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.22(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，
8.00(d，J＝8.0Hz，1H)，7.83(d，J＝1.0Hz，1H)，6.78(d，J＝2.6Hz，2H)，6.74(d，J＝8.7Hz，
2H)，6.39(dd，J＝8.7，2.7Hz，2H)，4.66(tt，J＝6.4，4.8Hz，2H)，4.16(ddd，J＝7.4，6.4，
1.0Hz，4H)，3.66-3.60(m，4H)，0.64(s，3H)，0.54(s，3H).13C NMR(101MHz，CD3OD)：δ171.7，
156.3，152.5，137.8，133.5，131.3，130.5，128.9，126.8，126.6，117.5，114.3，63.0，62.5，+
0.1，-1.2.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝529.2(100)[M+H] .HR-MS(ESI，阳性模式)：529.1787(实测值)，529.1789(C29H29N2O6Si计算值，[M+H]+).
4-二氧杂环己烷冻干，以得到70mg(92％)的蓝色蓬松固体形式的42(游离碱)。HPLC(25min内10/90-100/0，柱4×250mm，1.2mL/min，在254nm下检测)：τ＝9.98min.UV-Vis(PBS 7.4)：
λmax(ε)＝641nm(51000M-1cm-1)；荧光(PBS 7.4)：λexcit＝610nm，λem＝662nm；Φfl(相对于噁嗪1，在乙醇中Φfl＝0.14)＝0.42。1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.22(dd，J＝7.9，1.3Hz，1H)，
8.00(d，J＝8.0Hz，1H)，7.83(d，J＝1.0Hz，1H)，6.78(d，J＝2.6Hz，2H)，6.74(d，J＝8.7Hz，
2H)，6.39(dd，J＝8.7，2.7Hz，2H)，4.66(tt，J＝6.4，4.8Hz，2H)，4.16(ddd，J＝7.4，6.4，
1.0Hz，4H)，3.66-3.60(m，4H)，0.64(s，3H)，0.54(s，3H).13C NMR(101MHz，CD3OD)：δ171.7，
156.3，152.5，137.8，133.5，131.3，130.5，128.9，126.8，126.6，117.5，114.3，63.0，62.5，+
0.1，-1.2.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝529.2(100)[M+H] .HR-MS(ESI，阳性模式)：529.1787(实测值)，529.1789(C29H29N2O6Si计算值，[M+H]+).
[0232]
[0233] 路线13.羟基化Si-罗丹明JF64642的衍生物用作标记试剂。
[0234] 化合物42-卤代.将PyBOP(20μL of 22mg/100μL储备溶液，8.52μmol，1.5equiv)加入至42(3mg，5.68μmol)、HaloTag胺(O2)(2-(2-((6-氯己基)-氧基)乙氧基)乙胺；1.9mg，8.52μmol，1.5equiv)和DIEA(N-乙基二异丙基胺；10μL)在DMF(100μL)中的溶液。1h后，将溶剂在RT下真空蒸发，并将产物42-卤代通过制备型TLC(二氧化硅，10％甲醇-CH2Cl2，然后
100％CH2Cl2)分离。收率3.0mg(72％)，纯度(HPLC)～96％。HPLC(25min内10/90-100/0，柱4×250mm，1.2mL/min，在254nm下检测)：τ＝14.98min.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝734.3[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：734.3011(实测值)，734.3023(C39H49ClSiN3O7计算值，[M+H]+).
100％CH2Cl2)分离。收率3.0mg(72％)，纯度(HPLC)～96％。HPLC(25min内10/90-100/0，柱4×250mm，1.2mL/min，在254nm下检测)：τ＝14.98min.ESI-MS，阳性模式：m/z(rel.int.，％)＝734.3[M+H]+.HR-MS(ESI，阳性模式)：734.3011(实测值)，734.3023(C39H49ClSiN3O7计算值，[M+H]+).
[0235] 实施例III
[0236] 使用本发明的示例性新型染料对细胞进行STED光学显微术
[0237] 染料5：为了提供合适的STED波长(STED＝受激发射耗尽，提供超出衍射极限的光学分辨率的超分辨率光学显微的方法)，可以有利地使用商用Leica STED显微镜的660nm STED激光，如Leica TCS SP8 STED 3X。实际上，发射最大值和STED波长之间的差异是100-170nm(对于具有小斯托克斯位移的染料)。图1示出了活细胞中的适用性和染料5-OH在共焦和STED显微术中的非常好的成像性能(施加作为与Halo- 胺的缀合物-在路线2中为化
合物5-卤代)。Q-罗丹明染料分别在540nm和561nm处具有吸收和发射最大值，而羟基化染料
5-OH-分别在532nm和553nm处。染料5-OH的荧光量子产率(0.89)高于Q-罗丹明的荧光量子产率(0.79)。与Q-罗丹明相比，染料5-OH更好地溶于醇、DMSO、DMF和水溶液中。与Q-罗丹明不同，它可以很容易地转化为各种衍生物，并形成稳定的NHS酯(5-NHS)。
合物5-卤代)。Q-罗丹明染料分别在540nm和561nm处具有吸收和发射最大值，而羟基化染料
5-OH-分别在532nm和553nm处。染料5-OH的荧光量子产率(0.89)高于Q-罗丹明的荧光量子产率(0.79)。与Q-罗丹明相比，染料5-OH更好地溶于醇、DMSO、DMF和水溶液中。与Q-罗丹明不同，它可以很容易地转化为各种衍生物，并形成稳定的NHS酯(5-NHS)。
[0238] 图1示出a)用5-卤代活标记的表达波形蛋白-HaloTag融合蛋白的转染HeLa细胞的STED图像(1μM，在37℃下20分钟，洗涤并在室温下成像)，左下角是对应共焦图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。用脉冲532nm激光激发5-卤代，其中荧光检测在560-580nm处。STED激光在631nm处脉冲。对于STED图像，累积每行5次扫描的荧光计数，其中像素停留时间为17μs。比例尺：1μm。
[0239] 染料13a：ROX染料属于所谓的“四大”染料组(FAM、JOE[6-JOE分别在520nm和548nm处具有吸收和发射最大值，ε＝75000M-1cm-1]、TAMRA和ROX)，其在DNA测序中占主导地位，并且可以用在488nm(和514nm)发射的氩离子激光有效激发。如本文所证明的，可以用775nm STED激光有效地关掉6′-羧基ROX染料(13a-c)的荧光。图2示出活细胞的适用性和染料13a的非常好的成像性能(共焦和STED)(施加作为与 胺的缀合物-在路线10中化合物14a.卤代)
[0240] 图2示出a)用14a-卤代活标记的波形蛋白-HaloTag融合蛋白的稳定表达的U2OS细胞的STED图像(1μM，在37℃下20分钟，洗涤并在室温下成像)，左下角是对应共焦图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。用脉冲561nm激光激发14a-卤代，并在如下两个检测窗口中检测到荧光：605-625nm和650-720nm。STED激光在775nm处脉冲。对于STED图像，累积每行3次扫描的荧光计数，其中像素停留时间为15μs。比例尺：1μm。
[0241] 比较单羟基化染料13a和市售6-ROX染料(13c；图1)，与Halo-Tag胺的缀合物-化合物14a-卤代(图2)和14c-卤代(图3)能够得出如下结论：单羟基化染料13a提供更亮的图像。
[0242] 图3示出a)用6-ROX-卤代活标记的波形蛋白-HaloTag融合蛋白的稳定表达的U2OS细胞的STED图像(路线10中为14c-卤代，1μM，在37℃下20分钟，洗涤并在室温下成像)，左下角是对应共焦图像；b)和c)来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。用脉冲561nm激光激发6-ROX-卤代，并在如下两个检测窗口中检测荧光：605-625nm和650-720nm。
STED激光在775nm处脉冲。对于STED图像，累积每行3次扫描的荧光计数，其中像素停留时间为15μs。用低通高斯滤波器(Imspector软件，Abberior仪器)平滑STED图像。比例尺：1μm。
STED激光在775nm处脉冲。对于STED图像，累积每行3次扫描的荧光计数，其中像素停留时间为15μs。用低通高斯滤波器(Imspector软件，Abberior仪器)平滑STED图像。比例尺：1μm。
[0243] 在含锗染料-19和33-的情况下，羟基化与氮原子掺入到氮杂环丁烷环中相结合。染料19(具有二甲基氨基辅助氟基团)和染料33(具有3-羟基氮杂环丁烷基团)的光谱性质非常相似。然而，染料33在水性缓冲液中的荧光量子产率(0.60)高于染料19的荧光量子产率(0.43)。该发现说明了羟基对GeR染料的荧光量子产率的积极影响。两种染料的缀合物(具有多西紫杉醇和HaloTag胺)能够清楚地观察活细胞中的微管蛋白丝和HaloTag融合蛋白(参见图4-7)。图6和图8的比较说明了羟基化含锗染料33的更好的成像性能(更高的亮度)。
[0244] 图4示出a)用19-微管蛋白活标记的转染HeLa细胞的STED图像(路线11，1μM，在37℃下20分钟，洗涤并在室温下在HDMEM中成像)，左下角是对应共焦图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。用脉冲640nm激光激发19-微管蛋白，并从650-720nm检测荧光。STED激光在775nm处脉冲。对于STED图像，累积每行4次扫描的荧光计数，其中像素停留时间为7μs。用低通高斯滤波器平滑STED图像。比例尺：1μm。
[0245] 图5示出a)用19-卤代活标记的波形蛋白-HaloTag融合蛋白的稳定表达的U2OS细胞的STED图像(路线11；1μM，在37℃下20分钟，洗涤并在室温下成像)，左下角是对应共焦图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。用脉冲640nm激光激发19-卤代，并从650-720nm检测荧光。STED激光在775nm处脉冲。以15μs的像素停留时间记录STED图像，并用低通高斯滤波器平滑。比例尺：1μm。
[0246] 图6示出a)用33-微管蛋白活标记的转染HeLa细胞的STED图像(5μM，在37℃下20分钟，洗涤并在室温下成像)，左下角是对应共焦图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。用脉冲640nm激光激发33-微管蛋白，并从650-720nm检测荧光。STED激光在775nm处脉冲。以15μs的像素停留时间记录STED图像。比例尺：1μm。
[0247] 图7示出a)用33-卤代活标记的波形蛋白-HaloTag融合蛋白的稳定表达的U2OS细胞的STED图像(路线12；1μM，在37℃下20分钟，洗涤并且在室温下成像)，左下角是对应共焦图像；b)和c)是来自a)的框定区域在共焦(b)和STED(c)模式下的特写。用脉冲640nm激光激发33-卤代，并从650-720nm检测荧光。对于STED图像，累积每行3次扫描的荧光计数，其中像素停留时间为5μs。STED激光在775nm处脉冲。比例尺：1μm。
[0248] 羟基化染料13a和33的组合使得能够在活细胞中实现双色STED显微(图8)。同时施加化合物14a-卤代(由13a制备)和33-微管蛋白(由33制备)，并用相同的STED激光(775nm)关掉它们两者的荧光。波形蛋白丝(用罗丹明染料13a标记)的光学分辨率比微管蛋白网络的光学分辨率(用羟基化的GeR 33染色)更差，因为STED激光对蓝移罗丹明13a的效率较低(由于其在775nm处的较小吸收截面)。然而，在单色成像中，染料13a可以提供与染料33一样好的光学分辨率。值得注意的是，染料13a代表最蓝移的染料，其仍然可以用775nm STED激光有效地耗尽。
[0249] 图8示出a)表达波形蛋白-HaloTag融合蛋白的转染HeLa细胞的STED图像，其用14a-卤代(波形蛋白染色，左下图像，1μM)和33-微管蛋白(右上图像，5μM，在37℃下20分钟，洗涤并在室温下成像)同时活化标记；b)和c)是来自a1)的框定区域对于用14a-卤代标记的波形蛋白-HaloTag融合蛋白在STED(b)和共焦(c)模式下的特写；d)和e)是来自a2)的框定区域对于33-微管蛋白在STED(d)和共焦(e)模式下的特写。用脉冲561nm激光激发14a-卤代，并从605-625nm检测荧光。用脉冲640nm激光激发33-微管蛋白，并从650-720nm检测荧光。对于STED图像，两个颜色通道的荧光按行记录，其中像素停留时间为15μs。STED激光在
775nm处脉冲。比例尺：1μm。
775nm处脉冲。比例尺：1μm。
[0250] 图9示出了具有胃蛋白酶或BSA的0.1μM 33-溶酶体探针的滴定图。如上述路线12所示，该探针是GeRH染料与胃蛋白酶抑制剂A通过α、ω-二胺连接基的缀合物，并且其Kd值为0.2*10E-6M，与SiR-溶酶体探针(Butkevich等人，pubs.acs.org/JACS(2017年8月))相当。胃蛋白酶抑制剂A是溶酶体蛋白酶组织蛋白酶D的已知有效非共价抑制剂。
[0251] 33-溶酶体探针在胃蛋白酶结合时显示高荧光增加，并且在与BSA非特异性结合时仅中等荧光强度改变。
[0252] 这表明33-溶酶体是在天然蛋白质背景存在下选择性染色溶酶体的酸性隔室的合适探针。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于测量荧光寿命的装置 | 2020-05-12 | 818 |
| 用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法 | 2020-05-16 | 91 |
| 一种高精度荧光寿命测量装置 | 2020-05-12 | 312 |
| 用于测量荧光寿命的装置和方法 | 2020-05-14 | 753 |
| 一种用于荧光寿命编码的量子点及其荧光寿命编码方法 | 2020-05-12 | 642 |
| 荧光寿命表观遗传学测定 | 2020-05-14 | 957 |
| 一种荧光寿命显微成像系统 | 2020-05-15 | 448 |
| 荧光寿命的测量方法 | 2020-05-11 | 395 |
| 用于流场诊断的快速荧光寿命成像系统及方法 | 2020-05-15 | 1019 |
| 超分辨荧光寿命相关光谱系统 | 2020-05-12 | 610 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈