本发明涉及一种用于产生光学截面图像的方法和装置。

本发明适用于对空间扩展物体(spatially extended object)的三 维、逐层扫描，主要应用于显微术，但不限于这个领域。为了产生物 体的三维图像或映射，通常使用光学层析(optical sectioning)的技 术。所谓的光学截面是包含一定范围深度的信息的图像。因此，用于 产生光学截面图像的光学系统对焦平面内的这些物体细节执行选择性 成像，然而焦平面外的物体细节在光学截面图像中被抑制。

通过记录位于不同聚焦位置的一系列光学截面图像，能够逐步地 扫描三维物体。因此，能够分析物体的三维表示(three-dimensional representation)或它的形貌。在下面，术语“物体”和“样本”被 可互换地使用。尤其在显微术，研究的物体经常被称为“样本”。

本发明允许以特别简单的方式产生光学截面图像，并且能够用于 例如生物、医学或材料科学中对物体的分析。

产生光学截面图像的第一种方法之一是Minsky的共焦显微镜 [1]。这里，通过设置共焦针孔来抑制对焦平面外的细节的成像。

用于产生光学截面图像的另一种方法是结构照明(structured illumination)，例如，如Wilson等人在[2]所描述的那样。这里， 例如光栅的结构被投影到将被成像的样本中。这样又产生对样本内的 光分布的调制。例如，如[2]中所示，调制深度在焦平面中具有其最 大值，并且在这种意义上标记焦平面。在结构照明中，第一步是对照 明光进行调制，然后记录投影结构的不同位置(相位跳跃(phase step))，最后根据记录的数据计算光学截面图像。

为了这个目的，提出了几种装置。在Wilson等人的专利[3]中， 光栅置于与样本共轭的平面中，并且垂直于光轴移动。在Gerstner 等人的不同设计[4][5]中，平行板被插入到光路中并倾斜，从而横向 地移动被投影到样本中的照明结构。对于透明或半透明的样品，投影 到样本中，而对于不透明的表面结构，投影到样本上。另一解决方案 由Neil等人提出[6]。这里，通过干涉在样本内直接产生照明结构。

所有的方法[2-6]具有这样的性质：它们需要记录至少三个独立的 图像。所有这些方法具有这样的共同之处：由于需要快速而准确地设 置机械元件，所以在结构的定位和投影期间，伪像和不准确度可能会 出现。例如，关于伪像及其补偿的细节可以在[7]中找到。用于实施 该方法的不同方案根据用于对照明结构的位置执行改变的装置(相位 设置)而不同之处。特别地，提出有不需要移动部件的装置，因此这 种装置允许对相位跳跃的固定对准(alignment)和非常好的再现。

在US专利5381236[11]中，描述了用于对三维物体测距的光学 传感器。这里，周期性结构被投影到物体上，其中能够使照明结构颠 倒(invert)，这对应于180度的相移。这里提出的方法也是基于按 照两步的对照明结构的改变，但与[11]相比，该方法具有下述的不 同：在[11]中，照明结构的各元件需要精确地与检测器(CCD像 素)的各元件对准。这是很强的限制，理由如下：在放大方面，光学 装置将需要非常准确以实现照明图案(illumination pattern)与检测 器的匹配。另外，这两个结构彼此对准将需要非常准确并具有子像素 精度。可能最重要的限制是因为这样的事实：即使光学图像中小的畸 变(例如，桶形畸变或枕形畸变)也会导致无法在整个视场以子像素 水平匹配照明图案的元件与检测器的元件。这一装置将需要高度校正 并良好调节的光学器件，这对于广泛的、耐用的应用而言是障碍。对 于提出的方法，与[11]相反，由于不需要照明图案和检测器的精确匹 配，所以可以根据类型和图案尺寸自由地选择照明图案。这允许调节 光学系统的深度鉴别(depth discrimination)，例如产生的光学截面 的厚度(在共焦显微镜系统中，这对应于共焦针孔的直径的调节)。 根据本发明，能够容易地实现这一点，而根据现有技术的状态，用 [11]中的设计不可能实现这一点。因此，能够避免[11]的特征缺点。 不需要移动部件的装置能够避免由于位置不准确而引起的缺点，并且 也没有在[11]中被公开。

眼下，为了清楚的定义和与其它方法区分开，参考了在文献中描 述的基于结构照明的测量表面的概念上不同的方法。存在与结构照明 结合的基于三角测量法的表面测量方法。作为示例，提到了[12]和在 该文献中引用的其它参考文献。三角测量法在投影到物体上的期间估 计照明图案(例如，条纹图案)的变形，其中，根据投影的图案的局 部相位来确定物体的轮廓。因此，测量的主要量是局部相位。其特征 还在于：使用分离的非同轴光学系统实现对图案的投影和检测，或者 物体相对于光轴倾斜。对于具有深度鉴别的光学再现的本方法，目的 是从与背景对应的图像信号之中分离(鉴别)源自焦平面的图像信 号。样本的深度轮廓能够通过使用聚焦设备(focussing device)通过 对样本的轴向扫描来获得，其中，轴向扫描的每个局部图像代表光学 截面图像。光学截面，有时也称为伪共焦图像，仅包含来自焦平面的 图像信号，而使用适当的方法抑制或去除背景信号。共焦显微镜[1] 也产生光学截面；然而，这一任务是通过不同的光学装置来实现的。 对于结构照明的方法，深度鉴别是基于作为测量的主要量的局部调制 的检测。

另外，在本发明中，优选地，对照明图案的投影和对来自样本的 光的检测通过面向样本的单一光学器件(物镜)来执行。与此形成对 照的是，三角测量法从不同方向执行投影和检测。实施具有深度鉴别 的结构照明的方法的另一重要方面是使用不同波长。当前已知的实施 方式(implementation)在波长改变时存在下述问题：由于残余的轴 向色差(这可能取决于使用的物镜和中间光学器件)，投影的结构 (通常为掩模)需要在轴向方向上重新定位。这需要在已知显微镜装 置内相对较大的移动，因此在机械元件的移动上花费很多时间(例 如，参见[4])。

本发明提出一种新型装置，该装置不再需要对投影掩模结构的机 械轴向运动，因此，由于针对不同波长的更快的时间顺序或者甚至同 时的成像，该装置在速度方面具有优势。另外，存在为了解决色彩校 正的问题而提出的新的装置，这些装置使用机械部件，但与现有技术 的状态相比具有较低的复杂性。

根据现有技术状态的结构照明的原理的另一版本使用连续移动的 照明掩模，该照明掩模分别被投影到样本中或投影到样本上[8，9]。这 里，移动掩模用于对照明结构的编码以及解码。对于这个处理，其特 征在于：源自样本的光穿过掩模。在[8]中，描述了一种适合用于宽 视场的显微镜的装置。[9]中的装置与行扫描器(line scanner)结合 使用特别有用。方法[8]和[9]二者的共同之处在于：两个不同的信号 在空间分辨检测器上结合(integrate)，其中，通过两个图像数据集 的简单减法获得希望的光学截面图像。[8]和[9]中的装置共有下述缺 点：源自样本的待检测的光在由检测器登记(register)之前被掩模 削弱。这一点在观测弱光信号(这尤其发生在荧光显微术中)时特别 有关。

在出版物[13]中，示出了结构照明的方法如何能够与荧光寿命测 量的方法结合。这里，使用根据现有技术状态的来自[2，3]的方法，该 方法需要记录三个照明步骤的序列。荧光寿命的测量是使用具有非常 高的时间分辨率的检测器(门控光学增强器(gated optical intensifier))和脉冲激光激发的组合来实施的。用于确定荧光寿命 的不同版本是“频域FLIM”，其中，激发光被周期性地调制，并且 根据检测信号相对于激发信号的相移来确定寿命。如果使用适当的检 测器和光源，则本发明还允许通过在计算的每个光学截面仅记录两个 独立图像来测量光学截面图像中的荧光寿命。

出版物[14]包括仅从一个图像产生光学截面图像的一种方法。这 里，如[2，3]中所示，实施使用照明图案的方法。在该处理中，使用不 同波长的光对投影到样本中或投影到样本上的三个照明图案以及来自 样本的相位跳跃进行编码。这允许同时投影和检测。这种技术在速度 方面有优势，但产生了其它问题。由于染料具有预定的光谱性质(激 发波长和发射波长)，所以在这里，使用荧光显微术是不可行的。另 外，当样本在反射模式中表现出不同质的光谱性质时会出现问题。因 此，出版物[14]被认为是方法[2，3]的特殊情况，其中，由于照明步骤 的波长编码而导致出现限制。对于本发明，由于不需要对照明步骤的 光谱编码，所以不存在这种限制。

本发明涉及一种基于结构照明产生光学截面图像的方法和装置， 并且用于逐层地对空间扩展物体进行光学扫描。与现有技术的状态相 比，通过把两个照明图案中的每一个投影并记录到样本上，可以获得 光学截面图像。另外，应该去除到目前为止必要的但难以实现的要 求：照明结构与检测器的以像素水平的对准。

该装置的目的在于：以相同数量的检测光子提供对样本的更快扫 描、更坚固的构造以及改善的光学截面图像的信噪比。

另外，提出了一种在不需要移动机械部件的情况下实施根据本发 明的方法的装置。这显著地降低了对准的成本、机械致动器的成本以 及由于定位不准确而导致的图像伪像。

本发明的另一方面涉及光学截面图像的产生，其中，使用多种波 长对样本进行扫描。这可能会导致光学器件的轴向色彩性质的问题， 这些问题到目前为止例如通过使用光学元件的机械重新定位已经得以 解决。而且，还公开解决了在不使用机械部件的情况下对结构照明的 轴向色彩校正的问题的装置，尤其是在被集成在普通的显微镜系统内 时。与现有技术的状态相比，这导致了在速度方面的进一步的优势。

另外，存在用于实施给定的结构照明的新的装置：该装置对于照 明图案的相移和轴向色彩校正的重新调节的这两项任务仅使用一个致 动器。

在独立权利要求中定义了对上述任务的解决方案。

通过投影两个照明图案来产生光学截面图像的方法被描述如下：

对于结构照明，投影到样品上的照明光在至少一个空间方向上需 要调制。根据现有技术状态的结构照明的方法分别需要至少三个照明 图案或周期性结构的至少三个相位位置的投影。

根据本发明，确切地说，对两个结构进行投影，其中，如果第二 结构的强度分布与第一结构互补并且两个照明图案的平均强度彼此相 差不太大，则是有利的。

即使也可以使用二维照明图案，为了简单起见，仍将使用光栅结 构来解释原理。在没有对通常情况的限制的情况下，假定正弦光栅结 构被投影到样本中/样本上。

投影到样本中/样本上的第一结构具有下面的形式：

G1(a，b)＝1+Acos(ωa+δ).                       <1>

然后，与第一结构互补的第二图案如下：

G2(a，b)＝1-Acos(ωa+δ)＝1+Acos(ωa+π+δ).    <2>

这里，a和b是投影图案的系统中的局部横向坐标，ω是光栅频率， δ是光栅的相位。从<2>中能够看出，互补的照明图案对应于周期性 图案偏移相位值π。必须注意的是，根据本发明，能够在不使用移动 机械部件的情况下实施图案及其互补图案的投影。这消除了由于设置 机械元件的位置时的不准确而导致的潜在的相位误差，稍后将对此进 行讨论。另外，如果在整个视场平均的样本处的两个投影的强度彼此 相差不太大，则是有利的。投影到样本中/样本上的光图案G1(a，b)和 G2(a，b)被样本散射、反射、透射、吸收，或者激发荧光或冷光。上述 相互作用的任意组合也是可以的，并且也可以在各种不同的波长处。 另外，通过对检测器的适当配置，能够确定荧光寿命。为了这个目 的，除了检测器的高时间分辨率以外，还需要激发光的脉冲激发或调 制。

在样本中产生的强度图案G1(a，b)的投影从样本的位置被成像到 空间分辨检测器(spatially resolving detector)上。强度分布G1(a，b) 和G2(a，b)以及物平面(样本)和检测器位于互为共轭的像平面中。 当在显微镜内实施时，如果正被投影的照明图案位于与视场光阑 (field stop diaphragm)共轭的平面中，则是有利的。

如果G1(a，b)被投影，则在检测器处测量下面的强度分布。

I1(x，y)＝K(x，y)+S(x，y)*cos[x*g(x，y)+α(x，y)]    <3>

第二互补结构G2(a，b)的投影导致在检测器处测量下面的互补强度分 布。

I2(x，y)＝K(x，y)-S(x，y)*cos[x*g(x，y)+α(x，y)]    <4>

这里，(x，y)是检测器的平面中的坐标，g(x，y)是x坐标方向上的调制 频率(光栅频率)，其中，g＝2π/T，T是x方向上的周期。常见的 空间分辨检测器(诸如，CCD或CMOS传感器)是基于像素的。因 此，坐标(x，y)也能够以离散的像素坐标指定。参数α(x，y)是周期性结 构的相位。量K(x，y)是传统的图像，它也包含来自焦平面外的各层的 图像信息。在显微术中，K(x，y)对应于样本的宽视场图像。

在方程<3>和<4>的帮助下，能够方便地计算传统的图像：

$K(x,y)=\frac{I_1(x,y)+I_2(x,y)}{2}---<5>$

量S(x，y)是待确定的光学截面图像，它也对应于由结构照明导致的调 制深度。对于具有坐标(x，y)的检测器的每个位置，由<3>和<4>组成 的方程组一共包含4个未知量：传统的图像K(x，y)、待确定的光学截 面图像S(x，y)、光栅频率g(x，y)和局部相位α(x，y)。在投影到样本中或 样本上的照明图案的理想(perfect)几何形状的情况下以及在理想成 像条件的情况下，光栅频率和相位将不依赖于坐标(x，y)。在实际条件 下以及在存在光学器件的稍微不理想的成像的情况下，这个假设仅是 一种近似。因此，这些局部参数的确定是有利的或者必要的。

根据现有技术状态的方法[2-7]假定局部恒定的光栅频率。因此， 剩下3个未知量，到目前为止的方法[2-7]仍需要测量投影结构的至少 三个相位跳跃α，以便计算光学截面图像。在根据本发明的方法中， 执行校准步骤，在该校准步骤中，根据测量的校准数据或者在检测器 的坐标系统中每个位置(x，y)的图像数据I1(x，y)和/或I2(x，z)确定局部相 位α(x，y)和(可选的)局部光栅频率g(x，y)。在这两种情况下，都能够 使用待讨论的相同的方法(例如，傅立叶变换或小波方法)来确定某 一区域中的局部相位和局部光栅频率。根据本发明，通过校准步骤或 者对局部相位α(x，y)和局部光栅频率g(x，y)的知晓以及使用在下面进 一步描述的算法，产生光学截面图像所需的投影步骤的数目能够减少 为仅两个。与根据现有技术状态的其它方法相同，在样本扫描模式中 的第三步骤或进一步的步骤不再使用。这导致减少了样本损伤和光漂 白(photo-bleaching)，尤其在荧光显微术的情况下。优选地，校准 测量使用平坦的、同质的校准物体，该校准物体反射并且/或者散 射，并且/或者具有荧光和/或冷光性质。可以使校准物体的插入和校 准过程自动化。校准物体可替代于样本而插入，或者可插入在与样本 的位置共轭的像平面。在校准物体的帮助下，由分别在图案G1(a，b) 和G2(a，b)的投影期间的C1(x，y)和(可选的)C2(x，y)组成的校准数据 集被记录，用于校准测量。根据校准物体的近似同质的性质，C1(x，y) 和C2(x，y)分别代表照明图案及其在检测器的坐标系统中的位置。如 果图像数据集I1(x，y)和I2(x，z)分别用于局部相位的确定，则这些数据 集包含在其上施加照明图案的样本信息。因为样本性质能够在整个视 场内变化，并且也在研究的不同的焦平面之间变化，所以局部相位和 光栅频率的确定的质量也可以变化，并且根据样本可能仅在某些区域 中是可行的。如果扫描了一系列的几个焦平面，则由于是共同的设 置，所以来自几个焦平面的信息能够用于校准步骤。例如，对于每个 检测器区域，可以分别选择允许具有局部相位和局部光栅频率的最高 质量的确定的焦平面。局部参数的确定的质量的示例性标准将在下面 进一步给出(参见<5c>中的度量(metric))。在一些区域中的确 定较为困难的情况下，对局部参数的知晓可通过插值(横向和/或轴 向)或通过周期性延伸来延伸至检测器的整个坐标系统。对于这个处 理，优选地，应该使用来自具有局部参数的确定的高质量的区域的数 据。

现在，将使用傅立叶方法的例子示出某一区域的局部相位α(x，y) 和局部光栅频率g(x，y)的确定。也可以使用小波方法或迭代程序。局 部光栅频率g(x，y)对于常见的装置而言是连续函数，并且仅在视场内 具有缓慢的变化。作为近似，局部光栅频率g(x，y)也可以通过由已知 的n个周期覆盖的图像内的距离E来确定；然后，得到g＝n2π/E。 为了更准确的确定，定义下面的量：

${\mathrm{FT}}_C(g,x,y)=\underset{F}{\int \int }L(x,y)\cos (g*x)\mathrm{dxdy}$ <5b>

${\mathrm{FT}}_S(g,x,y)=\underset{F}{\int \int }L(x,y)\sin (g*x)\mathrm{dxdy}.$

这里，L(x，y)表示待研究的数据集，可以是来自校准测量的数据集 (C1(x，y)或C2(x，y))或图像数据集(I1(x，y)或I2(x，z))。积分F的区域以坐 标(x，y)作为中心，并在良好的近似下覆盖图案的整数个周期。在离散 的坐标(x，y)的情况下，相应地，积分能够通过求和来代替。现在，让 我们定义度量：

$M(g,x,y)=\sqrt{{\mathrm{FT}}_C^2(g,x,y)+{\mathrm{FT}}_S^2(g,x,y)}---<5c>$

现在，确切地说，g(x，y)的值是度量M(g，x，y)提供最大值时的值。在g 是光栅频率的情况下，M(g，x，y)的值对应于由光栅引起的局部调制深 度。因此，M(g，x，y)是另外的可用于局部参数的确定的质量或准确度 的标准。局部相位α(x，y)也可以被确定，这是因为：

$\tan \left[\alpha (x,y)\right]=\frac{{\mathrm{FT}}_S[g(x,y),x,y]}{{\mathrm{FT}}_C[g(x,y),x,y]}---<5d>$

现在，能够通过对正切函数的反演(inversion)获得值α(x，y)，其 中，考虑FTS或FTC的符号以获得象限。由编程语言C提供的函数 atan2(.，.)自动执行这些处理。与校准测量相比，分别根据图像数据 I1(x，y)和I2(x，z)确定局部相位可能会导致稍微不太准确的局部相位的 结果；然而，这允许省略装置的校准测量和相应的元件。局部参数的 准确度和空间分辨率之间的平衡能够通过相应地选择区域F的尺寸 与物体的条件匹配。

在下面，假定根据所描述的校准步骤或根据现有技术的知识，局 部相位α(x，y)和局部光栅频率g(x，y)是已知的。

为了计算光学截面图像，使用<3>和<4>，引入下面的量：

$D_1(x,y)=\frac{\partial I_1(x,y)}{\partial x}=-g(x,y)*S(x,y)*\sin [x*g(x,y)+\alpha (x,y)]---<6>$

$D_2(x,y)=\frac{\partial I_2(x,y)}{\partial x}=+g(x,y)*S(x,y)*\sin [x*g(x,y)+\alpha (x,y)]---<7>$

现在，通过方程<3>、<4>、<6>和<7>能够方便地计算待确定的光学 截面图像：

$S(x,y)=S(x,y)\sqrt{{\cos }^2[x*g(x,y)+\alpha (x,y)]+{\sin }^2[x*g(x,y)+\alpha (x,y)]}$

$S(x,y)=\sqrt{{\left[\frac{I_1(x,y)-I_2(x,y)}{2}\right]}^2+{\left[\frac{D_1(x,y)-D_2(x,y)}{2*g(x,y)}\right]}^2}---<8>$

另外，两种图案的照明分布在检测器处可以是不同质的。这会是由于 投影结构自身的缺陷或者投影到样本中或样本上且随后成像到检测器 上的不同质的性质所导致的。根据本发明，可以把数据I1(x，y)和 I2(x，y)归一化以补偿不同质的性质：

$N_1(x,y)=\frac{I_1(x,y)}{\overline{C_1}(x,y)};$ $N_2(x,y)=\frac{I_2(x,y)}{\overline{C_2}(x,y)}.---<9>$

其中，

$\overline{C_1}(x,y)=\frac{\underset{F}{\int \int }{I}_1(x,y)\mathrm{dxdy}}{F};$ $\overline{C_2}(x,y)=\frac{\underset{F}{\int \int }{I}_2(x,y)\mathrm{dxdy}}{F}---<10>$

分别是在整个区域F的C1(x，y)和C2(x，y)的平均值，该区域F包含坐 标(x，y)，并且覆盖图案的整数个周期。由于照明图案的不均匀强度 (照明问题或掩模缺陷)或检测器的不同质性质而导致的不利影响能 够通过归一化量N1(x，y)和N2(x，y)而不是方程<5，6，7，8>中的记录量 I1(x，y)和I2(x，y)来补偿。这里，使用连续可变的、正弦的照明图案的 投影的简单例子，演示了在样本扫描模式期间通过针对每个光学截面 图像的两个照明分布的投影和检测来计算光学截面图像。但是，经常 使用二进制图案(binary pattern)，这是因为这种掩模能够以较低 成本制造。为了减少与使用二进制或其它掩模相关的成像伪像，对照 明结构的局部相位的知晓也是重要的，并且能够通过校准步骤来实 现。

上述方法能够在各种装置中实现，尤其能够在宽视场荧光显微镜 和用于EPI配置(反射模式)中对表面的研究和深度剖析 (profiling)的宽视场显微镜中实现。在下面，将讨论用于实施根据 本发明的方法的附图和装置。

图1示出用于实施该方法的简化装置。为了简单起见，未画出可 选的中间图像和中继光学器件。根据本发明，照明单元(1)产生两 个不同的照明图案。因此，照明掩模结构、照明DMD芯片(数字镜 设备，即称为Texas Instruments的DLP技术)或光分布的中间图像 位于平面(3)中，并在至少一个空间方向上受到调制。因为术语 “掩模”或“掩模结构”在本文中经常使用，所以应该对该术语进行 更严密地限定：掩模是这样的光学元件，在该光学元件中，在元件的 整个区域上物理性质(尤其是透射和/或反射和/或吸收和/或光程差) 被图案化。如果光程差被图案化，则指的是例如能够通过在玻璃基底 上蚀刻结构来制造的相位掩模。照明相位掩模由于衍射而能够产生某 一光分布，并且可以实现高的光学效率。这里提及的所有类型的掩模 在下面都被称为共同的术语“掩模”。

存在于平面(3)中的光分布经由分束器(7)和物镜(5)被投 影到物体(10)(样本)。这里，平面(3)和标称物平面(nominal object plane)(9)彼此共轭。分束器(7)可以是半透明的反射镜 或二向色分束器。也可以使用多带分束器。现在，使用物镜和另外的 中间光学器件，将被投影到样本中或样本上的光分布成像到检测单元 (11)上。平面(13)是像平面或中间像平面，它与平面(9)以及 平面(3)共轭。物体内的焦平面的位置可以使用聚焦单元来被设 置，聚焦单元通常实现物镜(5)或样本的轴向运动。在显微镜系统 中，如果包含待投影的光分布的平面(3)与视场光阑的平面共轭， 则是有利的。在检测单元(11)内，可包含空间分辨检测器，诸如 CCD或CMOS传感器。作为对此的另一种替代方案，单元(11)也 可以把平面(13)中的光进一步成像到一个或多个检测器上。

图2示出根据本发明的照明单元(1)的装置。光源(19)和 (23)被设置为使得能够使用分束器(21)从不同侧对平面(3)中 的掩模结构进行照明。能够控制由光源(19)和(23)发射的光的强 度和(可选的)光谱成分(spectral composition)。在同时从两侧对 平面(3)中的掩模结构进行照明的情况下，光源(19)和(23)也 可由单一光源代替，该单一光源通过分束器和适当的光路从两侧对掩 模进行照明。平面(3)中的掩模包含具有非常高的反射性的区域和 具有非常高的透射性的其它互补区域。这种掩模不仅可以包含二进制 结构(binary structure)，还可以包含连续的分布。图案化的镜表面 可以位于平面(3)中。因此，通过平面(3)中掩模结构处的透射 (光源(19))和反射(光源(23))，这两个光源产生两种彼此互 补的照明分布。

应该指出，这种装置提供两种不同的照明图案，在没有任何移动 机械元件的情况下，这两种照明图案分别允许两个结构的同时或时间 顺序投影或者同一结构的两种相位设置。这在实施根据本发明的方法 时导致了速度方面的优势并减少了为对准而付出的努力，与现有技术 的状态相比表现出了相当大的优势。

在时间顺序操作的情况下，光源(19)或光源(23)发光，其 中，使用检测单元(11)对样本图像的记录与其同步。

在本发明的另一方面，分别同时发射两种光分布或照明图案。为 了对这两种分布的编码，可以使用发射光的偏振或光谱成分。为此， 分别使用两个可选的偏振滤波器或光谱滤波器(20)和(24)(参见 图2)。在偏振滤波器的情况下，这些偏振滤波器彼此相交，以便沿 方向(22)发射的分别穿过滤波器(20)或(24)的光具有彼此正交 的两个偏振方向。作为对线性偏振光的另一替代方案，可以使用左旋 或右旋圆偏振光。如在本发明的上述实施例中一样，通过偏振或光谱 特性编码的两种照明图案的同时发射在速度方面还具有优势，并允许 实时产生光学截面图像，这一点尤其对于反射模式的材料显微术以及 对于微观或宏观的物体的表面测量系统的构造是希望的。

实施根据本发明的照明单元的另一选择示出于图(2b)，在该图 (2b)中，与图2一样，使用相同的附图标记。这里，装置了两个掩 模，两个掩模位于彼此共轭的平面(3)中。这两个掩模都在透射光 中工作。与图2相比，这里示出的装置具有稍微较高的光学效率，但 它也需要这两个掩模彼此对准，以便根据对光源的选择沿方向(22) 发射两种照明图案，其中，它们各自的相位彼此偏移180度。这种对 准仅需进行一次，并且，由于仅需要对分束器(21)进行对准而导致 可以忽略的图像的畸变，所以不存在任何问题。

图3示出用于实施光源(19)和(23)的根据本发明的有利装 置。这里，作为照明单元(1)的一部分的光源(19)和(23)由两 根光纤或光波导(37)和(39)的输出来代替。该装置还包含n个光 源，其中，在图3中，仅示出光源1(25)和光源n(27)。这些光 源也能够代表由单一光源产生并随后在空间和光谱上被分离的光的不 同光谱成分。不同的光源可具有不同的光谱成分。光纤(31)连接到 致动器(33)和(35)，并使用光学单元(29)进行耦合。根据本发 明，整个装置充当开关，允许任何光源与光纤的两个输出之一(19) 或(23)连接。这具有两个主要的优点：首先，仅使用了一个光源， 这降低了成本并在两个投影步骤中都保证了相同的光谱成分。第二， 输出(19)和(23)可以起到具有固定对准的点光源的作用，该点光 源相对于投影单元的其余光学器件保持对准。这减少了对准所需的努 力。

在图4中，示出了掩模的示例性设计，它可以是图2中示出的投 影单元的一部分，并位于平面(3)中。在最简单的情况下，以交替 方式在透明基底(41)上设置具有高反射率和低透明度的同质区域 (47)以及具有高透明度和低反射率的同质区域(49)。这里，所有 的透明区和不透明区的组合区域分别具有相同的尺寸。即使在这个例 子中使用了二进制图案，具有几种透射和反射的水平、或连续分布的 掩模设计也是可行的。

在图5中，示出了根据现有技术状态[2]的照明单元(1)的装 置，其中，掩模(52)在透射光中工作，并由致动器(51)沿与光学 器件垂直的方向移动。这种装置也能够用于实施根据本发明的从两个 投影步骤产生光学截面图像的方法。与使用三个投影步骤的现有技术 状态相比，这使得增加了样本扫描处理的速度并减少了光漂白。与图 2中根据本发明的使用固定掩模的实施方式相反，这需要致动器 (51)，需要致动器(51)为投影的两种光图案的设置提供良好的可 重复性。

在图6中，讨论校准测量和色彩校正的方面。这里，图1的图解 补充了附加的中间光学器件(55)。对于校准测量，根据要求，荧光 和/或反射和/或散射元件(53)可被旋转(swivel)到光路中。元件 (53)的平面对应于中间像平面，并且与(3)、(9)和(13)共 轭。中间图像和在平坦样本重新成像回到元件(53)的平面时形成的 中间图像的位置和性质可以是相同的。由此，把元件(53)旋转到光 路中可以与在物镜(5)前面安装校准物体互换。把元件(53)旋转 到光路中的操作可以在光学装置内部自动执行。这简化了使用，并允 许使用已知校准物体进行全自动的校准测量，例如，记录用于对于检 测器坐标系统内每个位置的局部相位α(x，y)和(可选的)局部光栅 频率g(x，y)的随后确定的数据。另外，这个物体不能被污染或者磨 损(lost)，因为它是光学装置的一部分。元件(53)可以是漫反射 或荧光物体，或者可以具有仅以某一波长反射的表面。在手动地置于 物镜(5)前面的样本空间中的校准物体的帮助下，可以在任何时间 与元件(53)独立地执行校准测量。

根据现有技术状态的装置的另一问题是投影期间的强度变化。尤 其是，高压水银灯由于其设计而可以具有光强的波动，这会在结构照 明的处理中导致伪像。如果与检测器(11)处的图像采集结合地测量 不同投影步骤的相对照明量(relative illumination dose)，则能够对 此进行补偿。关于相对照明强度的信息可随后用于计算光学截面图 像，并可以有助于减少伪像。对于相对照明量的测量，位于(3)或 成像到该位置的照明图案可包含在每个投影结构的边缘处的测试区 域。根据本发明，元件(该元件也可以位于校准元件(53)处)仅在 投影图案的中间图像的位置(例如，(53)的位置)处部分地插入到 光路中，以便它仅在视场边缘处成像到检测器(11)上。这个元件在 用于产生光学截面图像的整个投影过程期间保持在光路中。这允许了 独立于观察的样本及其性质而在检测器(11)上记录(log)投影步 骤的相对强度。

当执行利用几种波长的成像时，尤其在荧光显微术中，在应该实 现更高的系统速度时出现与根据现有技术状态的装置相关的另一问题 和障碍。由于色差(尤其是轴向色差)，导致图6中的平面(3)和 (13)不再彼此精确地共轭。根据现有技术状态[3、4、5]的装置通 过与图6中的平面(3)的轴向偏移相对应地对掩模重新聚焦来解决 了这个问题。出于此目的，当使用几种波长时，经常需要长距离，从 而导致长的总处理时间。尤其对于荧光显微术，经常需要同时记录或 者至少快速连续地记录图像。

根据本发明，这一任务通过光谱校正来得以解决，而不需要移动 正被投影的结构或掩模。因此，可选的校正元件被插入到平面(15) 和/或(17)中，并且可选地插入到检测单元(11)中(参见图6)。 例如，这些校正元件可包括：影响光学器件的光谱性质的、具有公知 的色散性质的透镜、或衍射光学元件或全息图。衍射光学校正元件能 够被制造为专门地用于某一光学配置的校正。当物镜改变时，校正元 件的改变也可能是必要的。

在下面的图10的帮助下进一步讨论可能是必要的用于检测单元 (11)内的校正的附加测量。如果校正元件(15)和(17)位于基本 上准直的光路的一部分中，则是有利的。这里，对轴向色差的校正能 够以两种不同的方式实施，其中，两种设计都能够避免被投影的结构 的轴向运动。

在部分色彩校正的第一版本中，校正元件确保平面(3)和 (13)对于用于成像的所有波长都是彼此共轭的。尽管平面(3)和 (13)保持彼此共轭的事实，但是这种校正仍然可能会导致样本 (10)中或样本(10)上的照明图案的轴向位置的波长依赖性。这一 点可通过使用软件容易地进行补偿。在样本的物理轴向扫描的处理期 间，在建立样本的3D数据集时，可以考虑并分配投影的稍微移位的 轴向位置。作为对此的另一种替代方案，样本自身可在波长改变期间 移动轴向移位的量。在大多数显微镜系统中，与在照明侧的结构(掩 模或DMD)的轴向移动相比，在样本侧能够更快地实现这一点。对 于第二版本，完整的轴向色彩校正确保样本中或样本上的投影结构 (9)的平面(3)和检测器上的平面(13)对于使用的所有波长都彼 此共轭。

图7示出根据本发明的照明单元(1)的另一实施方式。这里， 在平面(3)中，存在DMD芯片(数字镜装置，也被称为Texas Instruments的DLP技术)。光源(23)通过分束器(21)对DMD 芯片进行照明。现在，在该芯片上显示的待投影的照明图案通过元件 (21)发射。替代DMD芯片，也可以使用可行的LCD模块，LCD 模块安装在平面(3)中并能够使用图2中示出的光源(19)在透射 光中工作。这种装置具有这样的优点：待投影的图案能够通过使用软 件非常快速地被更新。对投影图案的调节能够容易而快速地实现，当 物镜改变时，这一点可能是必要的。

图8示出根据本发明的检测单元(11)的实施方式的例子。这 里，入射光通过分束器(57)被分割并传输到位于两个共轭平面 (13)中的两个空间分辨检测器(例如，CCD)。例如，分束器 (57)可以是二向色镜或偏振相关分束器。因此，能够同时且分开地 观察到图像的两个光谱区或偏振态。如果这两个投影的光图案根据图 2以光谱方式或通过偏振而被编码，则能够同时并实时地实现这两种 照明图案的投影和记录。与现有技术设计[2-6]的状态相比，这个原理 允许构造用于根据本发明的方法测量表面性质的快得多的设计。

图9示出检测单元(11)的实施方式的另一可能性，其中，使用 了分束器(59)和全反射镜(61)。分束器(59)可以是二向色镜或 偏振相关分束器。平行检测类似于在图8中显示的实施方式。然而， 平行观察利用位于平面(13)中的单一检测器来实现，这以降低了分 辨率为代价节省了成本。

图10讨论根据本发明的已有光学装置的变型例，其中，可以同 时产生不同光谱波道(channel)的光学截面图像而不需要轴向移动 投影的光分布(例如，掩模)。这一测量可以与图6中讨论的光谱校 正元件(15)和(17)结合应用，或者可以单独应用而不需要与光谱 校正元件(15)和(17)结合。根据现有技术的状态，存在这样的装 置：以不同的波道(诸如，光谱或偏振态)分割物体的图像，并在空 间分辨检测器(例如，CCD芯片[10])上同时形成彼此相邻的这些 波道的图像。在存在轴向色差的情况下，进入的中间图像(13)的轴 向位置可依赖于波长。光学单元(63)根据其光谱特性把图像分成几 个波道，其中，这里显示了四个波道。随后，在其中光束基本上准直 的布局的部分中，各波道可包含根据现有技术状态的光谱滤波器 (65)。光学单元(69)以这样的方式对平行波道进行聚焦：使它们 彼此相邻地成像到空间分辨检测器(71)。在图10中，四个波道彼 此相邻地线性排列，另一常见的配置也是投影到检测器的四个不同象 限。根据本发明，这个装置通过使用校正元件(67)来修改，校正元 件(67)优选地位于光路的准直部分中并优选地位于光谱滤波器 (65)之后。校正元件(67)可与各滤波器(65)形成组合单元。校 正元件优选地是衍射光学元件。这样校正确保：尽管中间输入图像 (13)的轴向位置具有波长依赖性，但是所有的光谱波道仍然同时并 平行地聚焦到检测器(71)上。衍射光学元件或全息图(67)也可彼 此相邻地设置于同一基底上。通过组合根据本发明的不需要移动机械 部件的对不同光谱波道的同时检测、以及根据本发明的不需要移动机 械部件的从两个照明步骤产生光学截面图像的方法和装置，能够设计 具有深度鉴别和高的光学效率的光学系统，与现有技术的状态相比， 这种光学系统操作速度快得多并且能够以更低的成本构造。

因为不同的光谱成像波道的光谱校正是根据现有技术状态的结构 照明系统的主要方面，并且对于利用几种波长的扫描妨碍了速度的增 加，所以下面将公开根据本发明的结构照明系统中用于光谱校正的另 一解决方案。光谱校正装置的目的在于针对不同波长实现样本中产生 的照明图案的焦平面和与检测器共轭的焦平面的匹配。

由于光学器件的光谱性质(例如，用于照明和检测的光路的光谱 性质的差别)，所以根据波长，投影到样本中的照明图案的轴向位置 可能不同于成像到检测器上的平面的轴向位置。因此，平面(3)和 (13)(参见图1)将不会根据需要彼此共轭。因此，光谱校正的任 务要确保平面(3)和(13)的共轭。例如，这可以通过照明图案的 轴向定位或通过管透镜(tube lens)的适当位移来实现。作为对此的 另一替代方案，如本发明的前述实施例中所述，可以校正光学器件的 光谱性质，以便图(1)中的平面(3)独立于波长地与平面(13)共 轭。根据现有技术的状态，通过步进电机(stepper motor)经由投影 结构(光栅)的轴向移动来实施色彩校正。另外，光栅必须被手动地 改变，以便针对不同的成像条件来调节设置各光栅周期。在下面，将 公开根据本发明的装置，在该装置中，解决了在增加速度时的色彩校 正以及照明图案(例如，光栅)的改变的问题。本发明的实施例示出 在图11中。投影到样本中或样本上的周期性照明图案优选地为掩模 的形式，并且能够通过部件更换器(changer)旋转到光路中。掩模 位于与平面(3)(参见图1)共轭的轴向位置。这里，部件更换器 为部件轮(component wheel)(73)的形式，线性装置也是可行 的。图11示出与光轴垂直的平面，图11b示出在与光轴平行的平面 (79)中通过部件轮(73)的旋转轴(81)的横截面。部件轮(73) 具有几个用于光学部件的部件槽(slot)(75)，其能够通过轮的旋 转(77)旋转到光路或调换。如果通过适当的锁定(lock-in)位置限 定部件轮的各位置，则是有利的。图11示出具有被粗画的6个部件 槽(75)的例子，但是槽的数量可以符合要求。根据本发明，部件轮 (73)被设计为位于部件轮(73)中的光学部件(87)的轴向位置可 以被对准在轴向方向(85)上。

在图11b的横截面中，示出了位于不同轴向位置的两个光学部件 (87)。沿轴向方向(85)对光学部件(87)的调节能够手动地进行 或通过电子致动器来进行。图11示出使用用于轴向方向对准的手动 调节把手(knob)(83)的实施例。这里，关键特征在于：部件轮 (73)的部件之间的改变可以很快。能够实现大约50毫秒的时间。 根据现有技术状态的通过步进电机投影的结构的直接轴向定位只有通 过很大的努力才能实现这一点。这里公开的装置在速度方面具有优 势，这是因为能够在不同部件(87)的预对准的轴向位置之间非常迅 速地改变，而实际的轴向对准是手动地进行的，或者是利用慢而廉价 的致动器来进行的。根据本发明，轮能够承载具有不同图案尺寸的掩 模。当部件槽(75)空的时候，这使得能够从结构照明的模式切换到 另外的传统模式。保持在部件槽(75)中的光学部件(87)可以是预 安装的单元，包括光谱滤波器(91)和待投影的结构(89)(参见图 11c中较大的显示)。这里，用于在样本的位置处产生照明图案的元 件(89)可以是其中透射和/或反射和/或相位性质被图案化的掩模， 以便在至少一个空间方向上存在周期性。一个或多个视场光阑(可变 光阑或固定直径)也可以分别安装在部件槽(75)中或安装在各部件 (79)中。

图11中描述和示出的装置能够同时实现几个任务：

根据安装的部件，部件轮(73)位置的改变能够在与装置的色彩 校正相对应的光学部件(87)的几个轴向对准之间切换；能够在掩模 的不同图案尺寸之间变化，适当的光谱滤波器能够被旋转到与相应的 色彩校正匹配的光路(轴向位置)，并且装置能够从结构照明的模式 切换到传统的照明图案。

在图12中示出了用于实施结构照明的另外的照明单元(1)。这 个照明单元(1)(先前在不同的实施例中已对这个照明单元进行了 描述)的任务在于为投影到样本中或样本上而提供具有不同相位设置 的照明分布。作为图12中示出的实施例的特定特征，在样本中产生 的照明结构的相移以及装置的光谱校正通过单一致动器来进行。用于 在样本内产生照明分布的元件位于先前描述的平面(3)中，平面 (3)与物平面(9)和中间像平面或检测器平面(13)共轭。平面 (3)、(9)和(13)彼此共轭的光学系统的具体配置可依赖于波 长。针对不同波长满足这个条件(共轭的平面)是色彩校正的任务。 装置使用可在光谱上切换的光源(19)。投影到样本中或样本上的照 明图案的相移通过反射镜(93)来实现。在图12中，光轴(99)相 对于反射镜具有45度的倾斜，然而，也可以选择其它角度。反射镜 (93)通过可基于压电技术的致动器来移动。反射镜直线地移动 (97)或倾斜(101)。倾斜(101)控制投影的图案的相位，而直线 移动(97)允许控制相位以及色彩校正的调节，下面将对此进行讨 论。反射镜(93)的直线运动导致投影到样本中或样本上的平面 (3)中的固定图案的图像(4)的运动(98)。图像(4)的运动 (98)具有两个分量：轴向和横向(垂直于光轴(99))。该运动的 横向分量影响样本中/样本上的照明图案的相位位置，该运动的轴向 分量影响光谱校正。用于照明图案的进一步成像的光学器件(可能具 有管透镜的形式)的特征在于，通常具有小的数值孔径，并因此具有 相应大的聚焦深度。因此，该装置能够被配置为使得照明图案的相位 位置对运动(98)比对色彩校正((4)的轴向位置)更敏感。

对于按成像的平面(3)中图案的周期性的次序的(97)的较小 的运动，主要是投影到样本中或样本上的光分布的相位改变，而 (98)的轴向运动分量的影响可以忽略。如果致动器(95)移动了较 大距离，则除了投影图案的几个周期的相位的改变之外，结构的图像 的轴向位置也改变，这能够用于装置的光谱校正。因此，单一致动器 (95)足以控制投影图案的相位以及样本中照明图案的轴向位置。由 于由单一致动器影响的这两个参数的不同敏感性，所以这基本上是可 行的。根据本发明的这种装置能够结合根据本发明的仅使用两个照明 步骤的结构照明的方法使用，或者能够结合根据现有技术状态的使用 三个或更多个步骤的结构照明的方法使用。

在图12中还显示的照明单元(2)是照明单元(1)的子单元。 它使用所提及的平面(3)中的掩模产生照明分布。与在几个实施例 中描述的照明单元(1)形成对照，单元(2)仅产生单一、稳定的照 明分布，并且不像装置(1)那样其特征在于具有控制照明分布的相 位的选择。

下面，将给出实现本发明的另外的实施例或根据现有技术状态的 结构照明的另一方法，其中，主要考虑简单的集成到现有显微镜系统 的问题以及轴向色彩校正的问题。

现在，再次参照图1。在波长改变期间样本(10)内由检测单元 (11)成像的平面和与平面(3)共轭的平面偏离的原因可能是照明 光学器件(103)和成像光学器件(104)的不同的波长依赖性质。这 个问题能够通过用于产生照明分布的掩模的轴向重新调节来得以解 决。

根据本发明，如果用于把照明图案成像到样本中的光学器件 (103)(照明管光学器件)以及用于把来自样本的照明分布成像到 检测单元上的光学器件(104)(检测器管光学器件)具有相同的性 质(即，设计相同)，则能够减少或完全避免光谱校正所需的努力。 在并非为了结构照明而设计的标准显微镜中，照明管光学器件和检测 器管光学器件经常具有不同的性质和直径，因为它们是为了不同的要 求而设计的。

在图13中，示出了用于在显微镜中实施结构照明的升级单元 (upgrade unit)，其中，升级单元(109)附着到原始显微镜 (110)的照相机端口(111)。这种照相机端口是用于安装空间分辨 检测器(诸如，CCD照相机)的标准化机械接口。通常的标准是 “C-mount”。中间像平面(113)对应于其中图像传感器(例如， CCD)被假定位于原始显微镜装置(110)中的平面。在图1中，检 测器平面(13)对应于图13的中间像平面(113)。

通过去除检测单元(11)、二向色镜(7)和(可选的)其它照 明器件能够升级图1中示出的显微镜装置，其中，图13中的升级模 块被附着为使得中间像平面(113)位于以前的图1中的检测器平面 (13)的位置。对于投影的照明图案的相位的改变，存在两种都分别 包含在图13内的可能性或配置。

第一配置结合固定的二向色镜或半透明反射镜(115)使用所描 述的照明单元(1)，该照明单元(1)包含用于改变相位设置的装 置。第二配置使用较不复杂的照明单元(2)，该照明单元(2)发射 静态的照明分布并通过致动器(95)控制投影到样本上或样本中的照 明图案，该致动器(95)移动二向色镜或半透明反射镜(115)以便 改变在样本中或样本上产生的照明图案的相位。

在图13中，照明单元(2)的图像通过与投影到样本中或样本上 的照明图案的相移相对应的二向色镜和/或半透明反射镜(115)的直 线(97)和/或倾斜(101)运动来移动。管透镜(105)对中间图像 (113)成像，而二向色镜或半透明反射镜位于其中光基本上准直的 光路的位置。光学单元(103)和(104)(管光学器件)优选地具有 相似的光谱性质，并且优选地以相同的方式构造。这种对称导致这样 的情况：独立于波长，平面(3)和(13)分别经光学器件(103)和 (104)彼此足够接近地成像到样本内的平面中，以便根据良好的近 似，它们能够被视为共轭平面。因此，可以不需要使用机械移动部件 的有效光谱校正(active spectral correction)，这使得装置更快、更 较不复杂。因此，这里公开了用于结构照明的装置，该装置尽管在使 用不同波长的情况下也可以工作而不需要移动机械部件。图13中示 出的显微镜装置(110)的截面使用结构照明进行升级，并且还显示 具有关联的管透镜(117)的照相机端口(111)，管透镜(117)原 来期望用于在平面(113)中产生样本的实像，其中，(119)是显微 镜的准直光路(无限光路)的一部分。因为平面(113)中的中间图 像对于提出的装置来说并非是严格必要的，所以图13中示出的装置 的光学效率能够通过图14中示出的另一变型例来得以提高。这里， 去除了显微镜的管光学器件(117)和升级模块(109)的(105)， 这导致了显微镜的无限光路的延长直到二向色镜或半透明反射镜 (115)并超出它。在有利的实施方式中，管光学器件(104)和 (103)与显微镜的原始管光学器件(117)具有相同的性质。

在另一实施例中，将示出把用于结构照明的装置集成到显微镜 中，其中，部件的附图标记与图14相同，并且该显微镜的特征在于 具有至少两个照相机端口(111)。

图15示出显微镜系统(110)的截面，其中，(119)是连接到 显微镜装置的物镜(5)的无限光路的一部分。在实际的装置中，该 光路可能通过反射镜或分束器折叠一次或几次，这里为了简单起见而 没有对此进行示出。在照相机端口(111)之一上，安装了检测单元 (11)，其中，由管光学器件(104)形成的实像成像到检测平面 (13)上，该检测平面(13)又与样本(10，未示出)内的平面 (9)共轭，照明单元(1)或(2)将周期性的照明图案投影在样本 中。检测单元(11)的特征在于可以具有几个空间分辨检测器。在最 简单的情况下，(11)是如通常一样安装在照相机端口(111)上的 照相机。照明单元(1)或(2)也安装在照相机端口(111)上。这 里，与样本上或样本中的平面(9)和检测单元上的平面(13)共轭 的平面(3)被正好调节到通常安装标准的空间分辨检测器的位置。 通常用于在空间分辨检测器上形成实像的管光学器件(103)现在用 于把照明单元和掩模或它在平面(3)中的图像成像到样本中。原始 的显微镜装置(110)替代被假定在两个照相机端口(111)之间分布 检测光的二向色分束器或半透明反射镜(115)来提供了分束器。安 装的元件(115)的功能是从源自样本的检测光中分解出来自照明单 元(1)或(2)的照明光。在使用先前描述的照明单元(1)的情况 下，使用固定的、不移动的二向色滤波器或半透明反射镜(115)， 并且省略致动器(95)，其中，该照明单元(1)的特征在于具有用 于控制投影到样本上或样本中的照明图案的相位的器件。如果使用没 有用于相位控制的特征的较不复杂的照明单元(2)，则元件(115) 可以在致动器(95)帮助下移动，致动器(95)允许通过横向运动 (97)和/或倾斜来控制投影到样本上或样本中的照明图案的相位。 在适合荧光的装置中，例如，元件(115)可以是多带二向色镜的形 式。应该指出的是，使用如图15中所示的装置需要去除显微镜装置 (110，图中未示出)的原始分束器或者用反射镜替代显微镜装置 (110)的原始分束器。使用两个照相机端口(111)具有这样的优 点：管光学器件(103)和(104)(可)具有相同的光谱性质，并且 根据现有技术状态的慢的、机械的色彩校正不是必要的。如果显微镜 装置具有两个以上的照相机端口(111)，则检测光路(121)可在穿 过元件(115)之后被分成两个或更多个路径，并且可以被引向安装 在适当的照相机端口上的检测单元(11)。

在图14和图15中，管光学器件(104)可以用图9中的用于同 时检测单一检测器上的不同(例如，光谱)波道的单元来代替。这 里，示出了分成两个波道的情况。图9中示出的检测单元的位置在紧 挨在从检测光中分离照明光的分束器之后的无限光路内。与在实的中 间图像之后的常见装置(诸如，在单元(11)内)形成对照，这种甚 至在中间图像之前的布置方式具有进一步提高光学效率的优点。

根据本发明的方法可以总结如下：

在第一步骤中，将稍后也用于产生光学截面图像的一个或多个照 明图案被投影到已知的校准物体上。根据用于计算光学截面图像自身 的这个数据或图像数据，针对检测器上的每个位置，确定投影图案的 局部相位和(可选的)结构的局部周期和/或投影步骤的强度分布。 如果投影的照明图案的局部相位和周期能够根据在处理中稍后记录的 图像数据来确定，则可以不需要校准测量来进行工作。

在可能重复多次以及针对几个波长和样本的不同轴向位置的处理 的其它步骤中，针对在检测器上的照明分布的局部相位和光栅频率的 帮助下计算的每个光学截面图像，存在两个投影到样本上的图案。根 据现有技术状态的结构照明的实施方式为了产生一个光学截面图像需 要至少三个投影步骤，因此效率比较低。另外，提出了甚至同时在一 个实施例中执行两个照明图案的投影而不需要移动机械元件的根据本 发明的装置。投影的光分布的选择可以通过光源和/或光学开关的电 子控制来实现。根据本发明的其它装置允许改变成像波长而不需要移 动机械元件。

用于确定局部相位和光栅频率的校准测量仅在光学系统发生改变 的情况下(诸如，物镜改变，以及也许在首次使用新的波长的时候) 才必须被执行。当可以根据记录的图像数据以足够的质量进行确定时 以及当可以容忍需要的计算时间时，可以省略校准测量。

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