技术领域：
[0001] 本
发明涉及
生物医药技术领域，确切的地说是一种新的脂质体制备方法。背景技术：
[0002] 脂质体是由磷脂双分子层形成的闭合囊泡状结构。脂质体根据其结构不同可分为
单层脂质体(unilamellar vesicles)、多层脂质体(multilamellar vesicles)和多囊脂质体(multivesicular liposomes)。脂质体由英国人Alec D.Bangham在1965年首先发现。此后，人们发现脂质体作为物质载体，尤其是药物载体，有着巨大的应用价值，于是便对脂质体进行了系统的研究。
[0003] 经过了二十多年的探索，科研人员已经提出了许多很有价值的脂质体制备方法。目前脂质体主要通过分散技术(dispersion technique)制备，其方法可分为三大类：1)以机械分散技术为
基础。如
薄膜分散法(filmdispersion)，即将用于形成脂质体的磷脂溶于有机溶媒中-通常是氯仿或氯仿和甲醇的混合物，之后在减压的条件下除去溶媒形成干燥的磷脂膜。将磷脂膜
水化即可形成多层脂质体(multilamellar vesicles)。该方法虽是最经典、应用最广的方法，但是却存在一些缺点。例如：使用毒性很大的有机溶媒；无法实现工业化生产；当用含药水溶液水化时，形成的多层脂质体(multtiamellar vesicles)层与层之间药物分布不均一，必须通过反复冻融处理等。2)以
表面活性剂分散技术为基础。
如
去污剂
透析法，该方法不但难以工业化生产，且不适合包封
水溶性药物。3)以
溶剂或共溶剂(cosolvent)分散技术为基础。例如，逆相
蒸发法(reverse evaporationvesicles，REV)，此种制备方法对水溶性药物的包封率及载药量相对较高；而复乳法制备多囊脂质体(multivesicular liposome)目前虽然可以实现大规模生产(请参见skyepharma的depofoam技术平台)，但是仅限于制备微米级具有缓释功能的多囊脂质体；
乙醇注入法(ethanol injection)，虽已经实现大规模生产(请参见alza公司的技术和polymun的erossflow技术)，并可采用被动载药法制备脂质体，但包封率较低，且需要在较高
温度下制备(60℃左右)，通常会引起易
氧化、易
水解和易变性的药物失去活性，而采用主动载药法制备脂质体，包封率虽有所提高，但不适用于对酸
碱敏感的药物，同时也容易引起磷脂分解变性。
[0004] 概括起来，目前脂质体制备方法主要存在如下
缺陷：
[0005] 1.
稳定性问题。通过已有方法得到的脂质体制剂通常为液体制剂，往往不够稳定，主要表现在如下三个方面：
[0006] (1)脂质体混悬于水相时，属于热
力学不稳定分散系，常常会出现聚集、融合等现象，导致粒径变大，严重的还可能出现分层。
[0007] (2)磷脂存在于水相时，通常容易出现水解、氧化等现象，可能会形成溶血磷脂，一方面增加制剂的毒性，另一方面也容易使脂质体解体，导致药物渗漏。
[0008] (3)脂质体混悬在水相中，在储存过程中，药物可能会渗漏，导致包封率改变，从而影响制剂疗效。如果药物本身容易水解，制剂的稳定性问题更显突出。
[0009] 2.包封率问题。通过已有方法得到的脂质体制剂，水溶性药物包封率往往较低。包封率低不但会造成原料浪费，还可能达不到有效剂量，不能够体现脂质体制剂优势。目前常用主动载药法(remote loading)来提高水溶性药物包封率。但无论是pH梯度还是
硫酸铵梯度主动载药法，均需要在脂质体膜内外提供较大差别的pH环境，这不仅不适用于对酸碱敏感的药物，也容易引起磷脂分解变性。此外，主动载药法仅适用于可
离子化的药物，应用范围相对有限。
[0010] 3.灭菌问题。由于磷脂本身的性质，一般不能够对最终脂质体制剂加热灭菌，从而要求整个生产过程必须采用无菌操作。这对某些脂质体制备工艺来说可能无法实现。
[0011] 4.脂质体的粒径控制问题。获得小粒径脂质体(小于200nm)通常有利于静脉
给药。这是因为：
[0012] (1)大粒径的脂质体很容易被体内的单核巨噬系统所吞噬，从而被迅速清除。
[0013] (2)小粒径的脂质体可以被动靶向
肿瘤组织和缺血心肌。为了获得小粒径脂质体，通常需要对已得到的脂质体进行超声、
研磨或挤出。这往往又会导致药物进一步渗漏，影响制剂
质量。发明内容：
[0014] 为了克服上述脂质体制备技术的不足，我们发明了一种新的脂质体制备方法。通过此方法，可以解决目前脂质体制剂所面临的一些难题。将该方法称为复乳冻干法(lyophilization of double emulsions)。
[0015] 该制备方法包括以下步骤：
[0016] a、将用于形成脂质体的脂类物质和待包封的亲脂性物质溶于
有机溶剂形成油相(0)，将待包封的亲水性物质溶于水形成内水相(W1)，将油相(0)、内水相(W1)按合适的比例混合并乳化得到W1/0型乳剂；
[0017] b、将W1/0型乳剂与适当的水溶液(外水相，W2)按合适的比例混合并乳化，得到W1/0/W2型复乳；
[0018] c、将W1/0/W2型复乳
冷冻干燥除去溶媒得到冻干产物；
[0019] d、将冻干产物水化形成脂质体。
[0020] 下面我们将就该技术的具体操作进行详细的描述。
[0021] 步骤a优选的有机溶媒为环已烷、氯仿、乙醚与水不混溶易挥发除去的有机溶剂，或其混合物，优选与水
凝固点接近的有机溶剂。用于形成脂质体的脂类物质主要包括磷脂，如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝
氨酸、磷脂酰甘油，和调节磷脂膜性质的胆固醇(cholesterol)；也可以为具有类似磷脂性质的其它两性物质，以及不同脂类适当配比的混合物；可用于形成脂类质体(niosome)。此外，为了提高特包封物质的包封率，可加入适量的荷电脂类物质：在包封荷负电物质时，可加入荷正电的脂类物质，如1，2-二酰基-SN-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱等。在包封荷正电的水溶性药物时，可加入荷负电的脂类物质，如磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸等。为了提高磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性抗
氧化剂如vitaminE等。
[0022] 本发明的成功实施，要求步骤a中必须得到稳定的W1/0型乳剂。步骤a中制备的W1/0型乳剂通常内水相与油相体积比小于1；步骤b中制备W1/0/W2型复乳通常初乳与外水相体积比小于1。步骤a和b中的乳化指的是搅拌，或振荡，或涡旋振荡，或匀乳，或高压匀乳，或超声机械做功操作，或为搅拌、涡旋振荡、匀乳、高压匀乳、超声组合操作，或为
处方成分自动乳化。W1/0型乳剂指的是澄明或乳白色均一稳定乳剂，如果环已烷溶液和水溶液的比例不合适，则乳剂不稳定，分层沉淀，可能会出现相反0/W1型乳剂，无法将待包封物质包封于内水相，从而导致形成的脂质体包封率大大下降。
[0023] 步骤c优选的去除溶媒的方法为冷冻干燥法，W1/0/W2复乳可以先置于液氮或低温度装置中迅速冻结，然后在冻干机中冻干。
[0024] 步骤d为水化冻干产物以形成脂质体，可采用蒸馏水或合适的缓冲液在适宜的温度下完成，为
加速水化，也可在机械力的作用下完成，如可以进行搅拌或振荡，如采用被动载药法时，水化时可以采用水或合适的缓冲液；如采用硫酸铵或
醋酸钠或醋酸
钙梯度法主动载药时，可以用水水化形成脂质体后，加入待包封的药物孵育形成含药脂质体。如采用PH梯度法主动载药时，用水水化形成脂质体后，再加入药物孵育得到含药脂质体。。
[0025] 为了得到无菌制剂，可将步骤b中得到的W1/0/W2复乳滤过灭菌，其它步骤在无菌条件下完成。
[0026] 实施本发明的时候，通过步骤a、b得到的W1/0/W2型复乳，内水相(W1)和外水相(W2)中可加入冻干保护剂，包括
二糖，如海藻糖、
蔗糖、乳糖、麦芽糖，或单糖，如
葡萄糖、半乳糖、甘露糖，或其它寡聚糖，如三糖、四糖、五糖，或甘露醇；或者为几种冻干保护剂的混合物。冻干保护剂与脂类物质的质量比通常大于1。加入这些物质，有如下几个作用：1、可以作为冻干保护剂，确保形成的脂质体具有合适的粒径及较高的包封率。2、使得到的冻干产物不易吸潮，可以长期储存，临用前再水化形成脂质体。3、显著加快冻干产物的水化速度，使冻干产物可以立即水化形成脂质体。4、使冻干产物具有良好的形态。
[0027] 本发明中提到的待包封物质，可以是药物也可以是其它物质，如核酸。若为水溶性药物，则将药物溶于内水相(W1)，冻干保护剂溶于内水相(W1)及外水相(W2)，脂类物质溶于有机相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，临用前水化形成脂质体制剂。
[0028] 待包封物质若为脂溶性药物，则与脂类物质溶于有机相，冻干保护剂 溶于内、外水相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，临用前水化形成脂质体制剂。
[0029] 本发明也可以采用主动载药法，待包封物质可以为硫酸铵、醋酸钠等物质。例如，采用硫酸铵梯度法进行主动载药时，可以将硫酸铵溶于内水相，冻干保护剂溶于内、外水相，脂类物质溶于有机相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，待到使用时，加水水化形成包封硫酸铵的脂质体，之后加入药物，即实现主动载药过程。
[0030] 采用PH梯度法进行主动载药时，可以将
柠檬酸溶于内水相，冻干保护剂溶于内、外水相，脂类物质溶于有机相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，临用前先加水水化形成包封柠檬酸的脂质体，之后加入生物碱类药物，孵育得到含药脂质体，实现主动载药过程。
[0031] 本发明的制备工艺具有如下优点：
[0032] 该制备工艺适用于大规模生产。脂质体工业化生产必须解决几个问题，例如：灭菌、除热源、生产工艺简单便于放大，保证脂质体在储藏期内稳定等。我们发明的制备工艺可以解决上述问题：1)可以将b步骤得到的W1/0/W2型复乳过滤灭菌，其他步骤采用无菌操作，得到无菌制剂；2)工艺相对简单，只需乳化、超声及冻干等常用设备，易于放大；3)为了保证脂质体在储藏期内稳定，可以将冻干物在使用前水化形成脂质体，实验表明得到的冻干物可以长期储存，使用时水化立即形成脂质体。
[0033] 本制备方法的显著特点是可以明显提高水溶性药物包封率。由于水溶性药物始终包含于复乳内水相、有序磷脂内部、形成的脂质体内部，因此有较高包封率。
[0034] 另外本发明可以有效地控制脂质体粒径。如前所述，通过调整冻干保护剂、脂类物质的比例及乳化过程等操作，可以有效地控制脂质体的粒径。由于可以得到粒度均一的小粒径脂质体，增加了本发明的应用价值。
[0035] 同时，我们的制备工艺可以充分保证某些敏感药物的活性。由于制备工艺在低温下完成，避免了药物的水解和氧化。水溶性药物在W1/0/W2型复乳中仅存在于内水相，不
接触有机溶剂，且存在的时间较短，可以避免有机溶媒使药物变性失活。脂溶性药物在W1/0/W2型复乳中虽存在于油相，但有机溶媒对于脂溶性药物一般无变性失活作用。
[0036] 可以彻底除去溶媒残留也是本发明的一个优点。由于冻干机的
真空度很低(小于10pa)，所以得到的冻干产物中几乎无溶媒残留。
[0037] 简而言之，本发明不同于传统的脂质体制备工艺(如REV)，其实质是通过冻干的手段去除W1/0/W2型复乳中的有机溶媒并得到冻干产物，再水化形成脂质体，从而具备了上述显著优势。
[0038] 通过下列实例举例说明本发明的具体制备方法，但本发明的保护范围，不局限于此。具体实施方式：
[0040] 冻干保护剂蔗糖与甘露醇合用对冻干特性的影响：以蔗糖(5％)-甘露醇(5％)水溶液为内、外水相，环已烷为油相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干，发现蔗糖与甘露醇的加入明显改善冻干产物的形态，加快水化速率。并且得到的冻干产物可以长期储存而不发生吸潮。
[0041] 实施例2：
[0042] 冻干保护剂蔗糖对脂质体粒径的影响：以蔗糖水溶液为内、外水相，环已烷为油相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干，冻干产物中磷脂/蔗糖的质量比分别为1：1，1：2.5，1：5，1：10。加水后形成磷脂浓度均为1％的脂质体。用LS 32(Beckmann公司)测定粒径。脂质体的平均粒径分别为198 nm，126 nm，108 nm(number mean diameter)。这说明添加冻干保护剂蔗糖可以改变脂质体粒径。
[0043] 实施例3：
[0044] 用透射
电子显微镜观察实施例1和2中得到的脂质体。采用负染法进行观察。即将脂质体用1％，PH为7的磷钨酸
染色。在电子显微镜下发现脂质体为近球体，大小与用粒度仪测定的结果相吻合。
[0045] 实施例4：
