一种从甘草废渣中提取降血糖活性成分的方法
阅读：452发布：2023-03-07
专利汇可以提供一种从甘草废渣中提取降血糖活性成分的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种从甘草废渣中提取降血糖活性成分的方法。其步骤是：取干燥甘草渣，加入浓度为65％ 乙醇 ，料液比1∶12，，在超声 温度 75℃，功率40KHz的条件下提取两次，每次提取1.5h，，过滤，合并滤液得浓缩液，回收 溶剂 ，得浸膏，将浓缩液浸膏通过30～60目过聚酰胺柱层析，依次用 水 、95％乙醇梯度洗脱，以 盐酸 -镁粉反应检测合并得总黄 酮 ，将产物合并得B，再将B经减压浓缩和 真空 冷冻干燥 得产物。本发明从甘草废渣中提取分离降糖有效成分，制备工艺简单，适宜工业化生产。，下面是一种从甘草废渣中提取降血糖活性成分的方法专利的具体信息内容。
一种从甘草废渣中提取降血糖活性成分的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种从甘草的废渣中提取降糖活性成分的方法。
背景技术
[0002] 中药甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)，胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根及根茎。我国是世界上认识和研究甘草最早的国家，东汉的《神农本草经》中即有记载。其味甘，性平，入心、肺、脾、胃经。用于治疗脾胃虚弱、中气不足、咳嗽气喘、痈疽疮毒、腹中挛及作痛等病症和缓和药物烈性、解药毒。科学研究实验表明：甘草中富含甘草酸、甘草次酸、黄酮、皂苷、生物碱和氨基酸等成分，具有抗病毒、抗菌、抗溃疡、抗氧化、抗肿瘤、解毒、保肝等功效。
工业化生产只把甘草中的甘草酸作为主要有效成分进行提取，而提取后的甘草废渣则被遗弃，造成了环境污染和资源浪费。为了和生产甘草酸的企业现有生产技术更好的衔接，更加有效的综合利用有限的甘草药材资源，本项目以提取完甘草酸的药材废渣为研究对象，进行了提取降糖有效成分的工艺路线研究。
工业化生产只把甘草中的甘草酸作为主要有效成分进行提取，而提取后的甘草废渣则被遗弃，造成了环境污染和资源浪费。为了和生产甘草酸的企业现有生产技术更好的衔接，更加有效的综合利用有限的甘草药材资源，本项目以提取完甘草酸的药材废渣为研究对象，进行了提取降糖有效成分的工艺路线研究。
发明内容
[0003] 甘草废渣中含有大量有医用价值和经济价值的黄酮类化合物。甘草黄酮在药理学方面的功效日趋显现，已证明有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，能发挥很好的降糖作用。本发明的目的旨在提供一种从提取过甘草酸的药渣中提取分离降糖活性成分的方法。为甘草废渣资源及甘草黄酮的开发利用提供一定的理论依据，有利于更加有效的综合利用有限的甘草药材资源，保护生态环境，具有较好的社会效益和经济效益。
[0004] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0005] 一种从甘草废渣中提取分离降糖有效成分的方法，其步骤是：
[0006] 取干燥甘草渣，加入加入浓度为65％～80％乙醇，料液比1∶12～1∶14，，在超声温度65℃～75℃，功率40KHz的条件下提取两次，每次提取1.5h，过滤，合并滤液得浓缩液，回收溶剂，得浸膏，将浓缩液浸膏通过30～60目聚酰胺柱层析，依次用水、95％乙醇梯度洗脱，以盐酸-镁粉反应检测合并得总黄酮，将产物合并得B4，再将B4经减压浓缩和真空冷冻干燥得产物。
[0007] 采用超声辅助乙醇热回流法产率达3.90％，含量达24.56％，α-葡萄糖苷酶抑制率达55.70％(见表1)。该结果证明了从甘草废渣中可以有效的提取出α-葡萄糖苷酶抑制活性较高的甘草黄酮组分。
[0009] 本发明的优点和产生的有益效果：
[0010] 本发明的特点是甘草废渣中提取甘草黄酮，就其产率和酶抑制活性方面都可接近从甘草饮片中提取具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的甘草黄酮的标准，从而可以逐步替代使用以甘草饮片为原料的提取方法，解决了甘草废渣资源的重复利用的问题。原料甘草废渣成本低廉，分离纯化工艺的操作步骤相对简单，所需成本低，适宜大规模工业化生产；甘草的降糖活性成分对糖尿病具有一定的防治作用，具有良好的药用前景。
[0012] 图1是有机溶剂热回流法流程图。
[0013] 图2是超声辅助有机溶剂热回流法流程图。
[0014] 图3是碱性溶剂提取法流程图。
[0015] 图4是超声辅助碱性溶剂提取法
具体实施方式
[0016] 实施例1
[0017] 实验1甘草废渣中甘草黄酮的提取工艺筛选
[0018] (一)有机溶剂热回流法两种技术路线：
[0019] 取干燥的甘草渣100g，加入浓度为95％乙醇溶液2000ml，水浴回流温度65℃，时间60min，过滤，共提取3次，合并滤液，减压浓缩得浓缩液；
[0020] a.将浓缩液用等体积石油醚萃取3次，弃去石油醚层，再加等体积乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯提取液A1。将A1用5％碳酸钠溶液洗涤(调至溶液PH8～9)，然后加入5％盐酸溶液(调至溶液PH5～6)，静置沉淀，溶液得A2，沉淀得A3；
[0021] b.将浓缩液浸膏通过30～60目聚酰胺柱层析，依次用水、95％乙醇梯度洗脱，以盐酸-镁粉反应检测，将产物合并得A4。
[0022] 流程简图见图1。
[0023] (二)超声辅助有机溶剂热回流法两种技术路线：
[0024] 取干燥甘草渣100g，加入浓度为80％乙醇1200ml，超声温度为65℃，功率40KHz，每次提取30min，共提取3次，过滤，合并滤液得浓缩液，
[0025] a.将浓缩液用等体积石油醚萃取3次，弃去石油醚层，再用等体积乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯提取液B1。将B1用5％碳酸钠溶液洗涤(调至溶液PH8～9)，然后加入5％盐酸溶液(调至溶液PH5～6)，静置沉淀，溶液得B2，沉淀得B3。
[0026] b.将浓缩液浸膏通过30～60目聚酰胺柱层析，依次用水、95％乙醇梯度洗脱，以盐酸-镁粉反应检测，将产物合并得B4。
[0027] 流程简图见图2。
[0028] (三)碱性溶剂提取法
[0029] 取干燥甘草渣100g，加入0.2mol/L的NaOH溶液620ml，于90℃下加热提取30min，过滤后滤渣。分别加入470ml和310ml的NaOH溶液，加热提取两次，合并3次提取液，浓缩得C1。将C1用5％盐酸(调至溶液PH5～6)洗涤并沉淀，得C2。
[0030] 流程简图见图3。
[0031] (四)超声辅助碱性溶剂提取法
[0032] 取甘草废渣100g，加入0.2mol/L的NaOH溶液620ml，于45℃下超声30min，功率40KHz，过滤后滤渣。分别加入470ml和310ml的NaOH溶液，再超声提取两次，合并3次提取液，浓缩得D1。将D1用5％盐酸(调至溶液PH5～6)洗涤并沉淀，得D2。
[0033] 流程简图见图4。
[0034] 将各组分所得产物产物合并得A4、B4、C2和D2冷冻干燥，分别过筛混合均匀得固体粉末，称重并计算产率，干燥密封保存，用于甘草黄酮含量及α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定。
[0035] (五)甘草黄酮含量的测定
[0036] 1对照品溶液的制备
[0037] 精密称定甘草苷对照品10mg，用50％甲醇溶解，定容于50mL容量瓶中，得浓度为0.2mg/mL的对照品溶液，备用。
[0038] 2供试液的制备：
[0039] 精密称取10mg甘草黄酮粉末，用50％甲醇溶解，定容于50mL容量瓶中，得浓度为0.2mg/mL的供试品溶液，备用。
[0040] 3检测波长的确定
[0041] 精确吸取甘草苷对照品溶液2mL，加入7％NaOH溶液2mL，室温放置5min，用甲醇定容至10mL，用甲醇做空白对照，于190～800nm波长处扫描，结果在399nm处有最大吸收。以同样的方法对辅料进行处理后扫描，发现辅料在此处无吸收；对甲醇和7％NaOH溶液进行扫描，结果发现二者均无明显的吸收。因而确定检测波长为399nm。
[0042] 4标准曲线的制作
[0043] 精确吸取0.2mg/mL甘草苷对照品溶液0.25、0.5、1、2、2.5mL，分别加入1mL甲醇，再加入7％NaOH溶液2mL，室温放置5min，用甲醇稀释至10mL，在399nm处测定其吸收值。以吸收度Y为纵坐标，浓度X为横坐标，得线性回归方程：Y＝18.222X+0.0782，r＝0.998，线性范围5～50μg/mL。
[0044] 5样品测定
[0045] 取供试液2mL，加入7％NaOH溶液2mL，室温放置5min，用50％甲醇定容至10mL，在399nm处测定其吸收值，计算百分含量。
[0046] (六)α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
[0047] 反应体系为：以PNPG为底物，在0.1mol/L的磷酸盐缓冲(PH＝6.86)1ml中，加适量待测样品溶液与PNPG溶液(终浓度为2mmol/L)，然后加α-葡萄糖苷酶0.05U，37℃反应15min后，加入0.1mol/LNa2CO3溶液4ml终止反应，在400nm处测定吸收值。
[0048] 本实验中酶活性抑制率的计算公式：
[0049] 酶活性抑制率＝[A空白-(A样品-A背景)]/A空白×100％
[0050] A空白：不加待测样品反应后的吸收值；
[0051] A样品：加入待测样品反应后的吸收值；
[0052] A背景：只加待测样品的吸收值。结果见表1。
[0053] 表1甘草废渣中甘草黄酮的提取工艺筛选结果
[0054] 实验所得各组分 产率 甘草黄酮百分含量 α-葡萄糖苷酶活性抑制率
[0055] A1 5.54％ 26.67％ 34.48％
[0056] A2 4.63％ 0.42％ 0％
[0057] A3 3.97％ 26.39％ 8.30％
[0058] A4 3.00％ 23.79％ 50.60％
[0059] B1 8.59％ 24.30％ 36.10％
[0060] B2 6.70％ 0.66％ 0％
[0061] B3 7.25％ 23.64％ 9.1％
[0062] B4 3.90％ 24.56％ 55.70％
[0063] C1 17.83％ 0.29％ 0％
[0064] C2 21.85％ 3.85％ 0％
[0065] D1 13.65％ 0.13％ 0％
[0066] D2 14.27％ 7.90％ 0％
[0067] 从表1可以看出：在甘草废渣中甘草黄酮的提取工艺筛选实验中，上述的四种方法均可从甘草废渣中提出一定量的黄酮类化合物，其中碱性溶剂C、D组的产率高，含量低，且无α-葡萄糖苷酶抑制活性。这一结果的原因可能是我们采用的原料是经氨水提取甘草酸工艺处理的甘草废渣，而碱性的氨水可能已经将该部分黄酮类化合物带走，所以再用碱提取效果不佳。
[0068] 在有机溶剂热回流法中，组分A2(产率4.63％，甘草黄酮百分含量0.42％，α-葡萄糖苷酶活性抑制率0％)和B2(产率6.70％，甘草黄酮百分含量0.66％，α-葡萄糖苷酶活性抑制率0％)是经碱提酸沉处理过的溶液部分，其中已不含黄酮类化合物，也无α-葡萄糖苷酶抑制活性。组分A3(产率3.97％，甘草黄酮百分含量26.39％，α-葡萄糖苷酶活性抑制率8.30％)和B3(产率7.25％，甘草黄酮百分含量23.64％，α-葡萄糖苷酶活性抑制率9.1％)是经碱提酸沉处理过的沉淀部分，其中含有部分黄酮类化合物，但是对比组分A4(产率3.00％，甘草黄酮百分含量23.79％，α-葡萄糖苷酶活性抑制率50.60％)和B4(产率3.90％，甘草黄酮百分含量24.56％，α-葡萄糖苷酶活性抑制率55.70％)表明直接采用聚酰胺柱层析分离的方法能有效分离出大量甘草黄酮，而且B4能够保留大部分具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的组分。而采用碱提酸沉的分离方法效果不佳。
[0069] 由于组分B4的甘草黄酮含量和酶抑制率均高于A4，说明有机溶剂热回流法结合超声辅助提取法可从甘草废渣中有效提取出具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的黄酮组分。
[0070] 实验2甘草废渣中提取分离降糖有效成分工艺路线的优化
[0071] (一)正交试验
[0072] 准确称取甘草废渣，每份50g，采用超声辅助有机溶剂热回流法，根据甘草黄酮的4
理化性质，选择乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度四个因素，进行4因素3水平L9(3)正交试验提取甘草黄酮粗提液(见表2)，在超声功率为40KHz的条件下提取两次，过滤，合并滤液，回收溶剂，得浸膏，将所得浸膏通过聚酰胺(30-60目)柱层析，依次用水、95％乙醇洗脱，以盐酸-镁粉反应检测合并得总黄酮。再将各组所得产物经减压浓缩和真空冷冻干燥得甘草黄酮粉末，测其产率、含量和酶抑制率。
理化性质，选择乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度四个因素，进行4因素3水平L9(3)正交试验提取甘草黄酮粗提液(见表2)，在超声功率为40KHz的条件下提取两次，过滤，合并滤液，回收溶剂，得浸膏，将所得浸膏通过聚酰胺(30-60目)柱层析，依次用水、95％乙醇洗脱，以盐酸-镁粉反应检测合并得总黄酮。再将各组所得产物经减压浓缩和真空冷冻干燥得甘草黄酮粉末，测其产率、含量和酶抑制率。
[0073] 表2.甘草黄酮分散片制备的因素水平表
[0074] Tab.2 The table of factor and level
[0075]
[0076] 实验结果通过对产率、含量和酶抑制率影响的综合评价获得，考虑三项指标的权重不同，将三项指标的结果做如下处理：用产率的各个结果除以产率的最大值，得到的比值4
用来做综合平均值X和极差R的分析，含量和酶抑制率结果同法处理(见表3 L9(3)试验表)。
用来做综合平均值X和极差R的分析，含量和酶抑制率结果同法处理(见表3 L9(3)试验表)。
[0077] 表3.L9(34)试验表
[0078] Tab.3 The table of L9(34)test
[0079]
[0080] 经上表分析可知，从甘草废渣中提取甘草黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度65％，料液比1∶12，提取时间1.5h，提取温度75℃。总黄酮提取率影响的主次顺序依次为乙醇浓度A＞提取时间C＞提取温度D＞料液比B。
[0081] (二)最佳条件重复性验证试验
[0082] 为证实上述筛选法提取工艺的稳定性，以优选工艺，重复进行3次实验，测定甘草黄酮平均产率为7.10％，含量为25.28％，酶抑制率63.49％，RSD为0.19％，提示该工艺稳定，重复性好。
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