一种短葶山麦冬多糖及其制备方法
阅读：440发布：2023-02-25
专利汇可以提供一种短葶山麦冬多糖及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种短葶山麦冬中多糖的制备方法，包括：取短葶山麦冬药材，75％浓度以上的 乙醇 提取，弃去提取液；取药材残渣加入 水 提取，提取液梯度加乙醇至醇浓度60％～95％，放置取沉淀，得乙醇沉淀多糖；将乙醇沉淀多糖过 纤维 素DE-52柱层析，依次用水、NaCl洗脱，收集水洗部分，浓缩后 冷冻干燥 ，得短葶山麦冬(粗)多糖；本发明还提供了上述方法得到的短葶山麦冬(精)多糖；本发明的方法提取精制得到的短葶山麦冬多糖具有明确的 治疗 心 血管 疾病 的作用。，下面是一种短葶山麦冬多糖及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种短葶山麦冬多糖的制备方法，该方法包括：
1).取短葶山麦冬药材，75％浓度以上的乙醇提取，得到提取液和药材残渣；
2).取药材残渣加入水提取，提取液浓缩，梯度加乙醇，至醇浓度为60％，以及至醇浓度为80％，放置，取60％和80％的沉淀部分，即得粗多糖浸膏，该粗多糖浸膏包括60％乙醇沉淀多糖和80％乙醇沉淀多糖；
3).将60％乙醇沉淀多糖和80％乙醇沉淀多糖分别过纤维素DE-52柱层析，依次用水、
0.1mol/lNaCl、0.2mol/lNaCl洗脱，收集水洗部分，浓缩后冷冻干燥，得多糖部位T1、T2，合计为短葶山麦冬多糖。
2.一种短葶山麦冬多糖的制备方法，该方法包括：
1)取短葶山麦冬药材，75％浓度以上的乙醇提取，得到提取液和药材残渣；
2)取药材残渣加入水提取，提取液浓缩，梯度加乙醇至醇浓度为80％，放置，取沉淀部分，得80％乙醇沉淀多糖，其为粗多糖浸膏；
3)将80％乙醇沉淀多糖过纤维素DE-52柱层析，依次用水、0.1mol/lNaCl、0.2mol/lNaCl洗脱，收集水洗部分，浓缩后冷冻干燥，得短葶山麦冬多糖。
一种短葶山麦冬多糖及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 麦冬始载于《神农本草经》，是常用滋阴中药，具有滋阴润肺、益胃生津、清心除烦的功效。《中国药典》2010年版(一部)收载的麦冬类药材包括麦冬和山麦冬，其中麦冬的来源为百合科沿阶草属麦冬(Ophiopogon japonicus(Thumb.)Ker-Gawl)的干燥块根；山麦冬的来源为百合科山麦冬属湖北麦冬(Liriope spicata(Thunb.)Lour.Var.prolifera Y.T.Ma)和短葶山麦冬(L.muscari(Decne.)Bailey)的干燥块根。麦冬类药材在中国有4大产区，分别是浙江、四川、湖北和福建。其中浙江慈溪、萧山等地主产杭麦冬；四川绵阳等地主产川麦冬；而湖北麦冬的主产区在汉水流域的襄阳、襄城、谷城、老河口等；短葶山麦冬主要分布在泉州、仙游、永泰等县市。
[0003] 化学成分上，山麦冬中除高异黄酮类未检出外，主要的化学成分类别与麦冬相似，也含有皂苷、氨基酸、多糖及铜、铁、镁、钴等微量元素。由于山麦冬的功效等同于传统药材麦冬，所以在实际应用中常作为麦冬同等入药。
[0004] 对麦冬类药材的早期研究主要集中在皂苷及黄酮部位，近年来发现麦冬类药材中的多糖也具有抗心肌缺血、降血糖、增强免疫、抗过敏等多方面的药理活性。目前对麦冬类药材中多糖成分的已有研究涉及单糖组成、多糖结构、药理活性、质量控制等方面，为麦冬类药材中多糖成分的开发利用奠定了基础，但也存在一些不足。比如，现有研究集中于麦冬，山麦冬相关研究较少，目前尚无短葶山麦冬多糖化学研究的报道。药理活性研究方面，集中于粗多糖，缺少对有效成分的确证。质量控制上多以比色法测定总糖含量为手段，方法选择性不高，容易受到杂质干扰，灵敏度有限，且测定结果随标准单糖选取的不同而有很大差异，不能保证方法的准确性，同时，由于多糖类的活性往往是与其分子量分布相关的，单纯测定总糖含量来控制药材质量，并不能做到真正的合理有效。因此，现有的质量控制方法有待进一步完善与提高。
[0005] 因此，本领域急需一种可以分离出短葶山麦冬多糖的制备分离方法，目的是可以得到具有相对明确的组成的、治疗效果明确的短葶山麦冬多糖，使多糖可以直接用于医药领域的治疗目的明确的各种制剂，明确规范该植物提取物的医学用途，降低含有短葶山麦冬多糖的产品的副作用以及降低其医药用途风险。
发明内容
[0006] 本发明经过大量的实验，研制出一种短葶山麦冬多糖及其提取和精制的方法，该方法简单高效，分离度高，使得多糖的活性更加有效、准确和针对性强，相对纯度高。
[0007] 本发明目的在于提供一种短葶山麦冬中多糖的制备方法，其在现有的常规技术得到的短葶山麦冬提取物，进一步经过精制，从而提纯了活性成分，使其有益的活性效果更加明确。
[0008] 麦冬类药材的早期研究主要集中在皂苷及黄酮部位，近年来发现其中的多糖也具有抗心肌缺血、降血糖、增强免疫、抗过敏等多方面的药理活性。已有对麦冬类药材中多糖成分的研究涉及化学结构、药理活性、质量控制等方面。其中药理活性研究结果表明麦冬多糖其具有良好的抗心肌缺血、降血糖、增强免疫、抗过敏等活性，是重要的功能性成分之一。三种药典收载的品种当中，短葶山麦冬多糖的研究较少，目前尚未见到其结构研究的报道。
已有的药理活性研究集中于粗多糖，缺乏有效部位的确证。在药材质量控制上多以比色法测定总糖为手段，由于比色法本身选择性不好、灵敏度有限、测定结果随单糖对照选取不同有很大差异，并且多糖的活性往往是分子量相关的，单纯测定总糖含量来控制药材质量，并不能真正的合理有效，现有的质量控制方法有待进一步提高与完善。本发明目的在于对麦冬类药材中多糖成分的研究涉及单糖组成、多糖结构、药理活性、质量控制等方面。
已有的药理活性研究集中于粗多糖，缺乏有效部位的确证。在药材质量控制上多以比色法测定总糖为手段，由于比色法本身选择性不好、灵敏度有限、测定结果随单糖对照选取不同有很大差异，并且多糖的活性往往是分子量相关的，单纯测定总糖含量来控制药材质量，并不能真正的合理有效，现有的质量控制方法有待进一步提高与完善。本发明目的在于对麦冬类药材中多糖成分的研究涉及单糖组成、多糖结构、药理活性、质量控制等方面。
[0009] 本发明目的还在于提供短葶山麦冬多糖抗心肌缺血活性方面的治疗作用。
[0010] 本发明提供了一种短葶山麦冬中多糖的制备方法，该方法包括：
[0011] 1).取短葶山麦冬药材，75％浓度以上的乙醇提取，得到提取液和药材残渣；
[0012] 2).取药材残渣加入水提取，提取液浓缩，梯度加乙醇至醇浓度为60％～95％，例如，梯度加乙醇至醇浓度20％、40％、60％、80％或更高，放置，取沉淀部分，得乙醇沉淀多糖，即粗多糖浸膏；
[0014] 上述步骤1)中得到的主要是皂苷部分，也是本发明主要想除去的部分，为了验证该部分主要是皂苷，可以采用进一步试验验证的方法，包括：提取液浓缩后过AB-8大孔树脂，依次用水和由10％到90％浓度的乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱部位，即可得到皂苷部位S；洗脱用乙醇溶液的浓度很重要，本发明优选10-90％wt的乙醇进行洗脱，收集60％乙醇洗脱部位。经过常规的皂苷验证方法验证，其为皂苷类成分。洗脱用乙醇溶液的浓度很重要，本发明优选10-90％wt的乙醇进行洗脱，收集60％乙醇洗脱部位。
[0015] 上述的步骤2)包括加乙醇至醇浓度为60％，以及至醇浓度为80％，放置，取沉淀部分，得60％乙醇沉淀多糖和80％乙醇沉淀多糖，合计为粗多糖浸膏。
[0016] 上述步骤3)为将60％乙醇沉淀多糖和80％乙醇沉淀多糖分别过纤维素DE-52柱层析，依次用水、0.1mol/lNaCl、0.2mol/lNaCl洗脱，收集水洗部分，浓缩后冷冻干燥，得多糖部位T1、T2，合计为短葶山麦冬多糖。
[0017] 常规对麦冬质量控制或有效部位的说明都是集中在皂苷，所以，本发明把皂苷和多糖都分别制备出来，用药理实验的方法明确有效部位不是皂苷而是多糖。
[0018] 本发明优选提供了一种短葶山麦冬中多糖的制备方法，该方法包括：
[0019] 1).除皂苷：取短葶山麦冬药材，75％浓度以上的乙醇提取，得到提取液；
[0020] 2).提取粗多糖：药材残渣加入水提取，提取液浓缩，加乙醇至醇浓度为60％，以及至乙醇浓度为80％，放置，取60％和80％的沉淀部分，即得粗多糖浸膏，该粗多糖浸膏包括60％乙醇沉淀多糖和80％乙醇沉淀多糖；
[0021] 也可将粗多糖浸膏加水溶解，冷冻干燥后，得粗多糖；该60％乙醇沉淀部分为T1，80％乙醇沉淀部分为T2，T1和T2合并为粗多糖；
[0022] 上述上述提取皂苷用的乙醇采用75％～95％浓度的乙醇提取，在本发明优选实施例中，优选95％浓度的乙醇。
[0023] 3).初级分离：将60％乙醇沉淀多糖和80％乙醇沉淀多糖分别过纤维素DE-52柱层析，依次用水、NaCl(0.1mol/lNaCl、0.2mol/lNaCl)洗脱，收集水洗部分，浓缩后冷冻干燥，得多糖部位T1、T2。
[0024] 本发明所述的短葶山麦冬多糖粗提物优选通过下述方法制得：
[0025] 1.除皂苷：步骤同上述步骤1)；
[0026] 2.提取粗多糖：步骤同上述步骤2)，得粗多糖浸膏；
[0027] 3.分级沉淀：取一定量粗多糖浸膏溶解于适量蒸馏水中，依次加乙醇至醇浓度20％、40％、60％、80％分级沉淀，每次都在4℃静置过夜，离心；20％、40％醇沉均无明显沉淀；取60％、80％乙醇沉淀，适量水溶解后冷冻干燥，得到60％、80％乙醇沉淀多糖；
[0028] 4.纤维素DE-52柱脱色以及初级分离：将60％乙醇沉淀多糖和80％乙醇沉淀多糖，分别过纤维素DE-52柱层析，依次用水、NaCl(0.1mol/lNaCl、0.2mol/lNaCl)洗脱，收集水洗部分，浓缩后冷冻干燥，得多糖部位T1、T2。
[0029] 本发明所述的“浸膏”为本领域公知，其相对密度约在1.25以上，例如1.3。
[0030] 本发明的原料可为短葶山麦冬或其中间产物短葶山麦冬粗多糖粗提物，后者可通过市售购得或按常规提取方法得到。
[0031] 经药理试验证明，该药理试验在本文后述部分将详细描述，多糖部位T2具有显著地抗心肌缺血活性，因此，本发明对T2做进一步的分离纯化，以期从中得到均一多糖并进行相关的结构研究。具体分离纯化过程如下：
[0032] 仪器Agilent 8453紫外-可见分光光度仪，Mettler AE-240电子天平，SB3200 Branson超声仪(上海必能信超声有限公司，220V，50kHz)，FD-1冷冻干燥机(北京博医康技术公司)， Rotavapar R-205旋转蒸发仪，美国Waters公司高效液相色谱系统：Waters 515高效液相色谱仪；717自动进样仪；2410示差折光检测器；Empower2工作站。
[0033] 试剂：DE-52纤维素(Whatman公司，北京欣经科生物技术有限公司分装)；SephadexG-25(Pharmacia Biotech公司)；无水乙醇、硫酸、氯化钠及蒽酮均为国产AR级试剂。
[0034] T2的分离纯化：取T21.266g，过SephadexG-25柱，水洗，流速1ml/min，5ml/瓶收集。硫酸-蒽酮显色后绘制多糖洗脱曲线，按洗脱曲线合并相同组分，浓缩，真空冷冻干燥后得白色粉末状多糖LMP(469.3mg)。
[0035] 本发明仅采用水，根据时间不同能洗脱下来不同的多糖，借助分子筛原理。
[0036] 纯度鉴定：多糖是大分子物质，其纯度标准不能用通常小分子的纯度标准来衡量。多糖的纯度只代表某一多糖的相似链长的平均分布。通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分，其微观是不均一的。测定多糖纯度的方法有功能团分析、比旋光度法、凝胶层析法、高效凝胶层析法、高压电泳、超滤离心分析法等。其中高效凝胶层析法采用多糖专用柱，配以示差检测器或激光光散射仪，具有高效、快速、重现性好等特点，是目前检测多糖均一性误差最小最常用的一种方法。在分子量不超出色谱柱的有效测试范围的前提下，在HPSEC谱中呈现单一对称尖峰的多糖组分可被认为是纯化的均一多糖。
[0037] 供试品制备：取样品6mg，溶2ml流动相中，经0.45um微孔滤膜过滤即得。
[0038] 色谱条件：Waters高效液相色谱系统(515泵，717自动进样器，2410示差折光检 测器)；TOSOH TSK gel 2500PWxl(7.8mm×300mm)column凝 胶柱；TOSOH TSK PWxl(6.0mm×4.0cm)column凝胶预柱；流动相：0.05mol/L硫酸钠；检测器温度：35℃；流速：0.4ml/min；运行时间：45min。测定结果表明，从短葶山麦冬中分离得到的水溶性多糖LMP为均一多糖。
[0039] 短葶山麦冬多糖LMP的结构分析：
[0040] 仪器：CAMAG半自动点样仪；CAMAG电加热板；CAMAG薄层照相系统；Agilent6890N-5975C气相色谱-质谱仪，配7683B自动进样器，带HP-5型毛细管柱；
Rotavapar R-205旋转蒸发仪；Nicolet5700型傅里叶变换红外光谱仪(美国热电公司)；
Centaurus傅里叶变换红外显微镜；MALDI-TOF-MS(Autoflex，Bruker)；VNS-500核磁共振分析仪。
Rotavapar R-205旋转蒸发仪；Nicolet5700型傅里叶变换红外光谱仪(美国热电公司)；
Centaurus傅里叶变换红外显微镜；MALDI-TOF-MS(Autoflex，Bruker)；VNS-500核磁共振分析仪。
[0041] 材料：样品LMP；单糖对照品：葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖均由中国药品生物制品检定所提供；山梨糖及木糖为Fluka公司出品。
[0043] 多糖完全酸水解常用的酸有硫酸、盐酸、硝酸、三氟乙酸等。一般中性糖的水解多采用硫酸或者三氟乙酸水解。硫酸可在0.005mol/l-100℃下快速水解果聚糖和其他五碳或六碳呋喃聚糖，在1mol/l-100℃条件下水解五碳或六碳吡喃聚糖；三氟乙酸水解，多用2mol/l-100～120℃封管加热数小时，得到水解后的单糖混合物。两种方法水解效果相当，但在后处理上存在差异。硫酸多采用加入过量碳酸钡的方法将酸中和，而三氟乙酸沸点较低，可以通过氮吹或减压蒸干的方法除去。盐酸水解多用于较难水解的糖苷，如在2mol/l～6mol/l，100～120℃加热数小时水解氨基糖苷，可得到彻底水解的氨基单糖，但会使中性糖和酸性糖破坏。硝酸水解糖苷键要求低浓度，如3％的稀硝酸条件下。如果存在氮的氧化物，由于其具有氧化性，就会同盐酸一样，使水解得到的游离单糖遭到破坏。
[0044] 本发明的实验采用比较温和的三氟乙酸水解法和硫酸水解法。样品在不同条件下水解后，经薄层色谱及GC-MS法检测，结果如下。
[0045] 三氟乙酸水解：
[0046] 薄层色谱法检测：
[0047] 展开系统：乙酸乙酯-乙醇-水(70∶22∶8)
[0049] 首先用总糖做水解条件的初步摸索，在2mol/lTFA-120℃分别水解1h、2h、4h，然后用TLC法检测。结果显示，在White R下，不同水解时间样品在单糖对照品相应位置上有对应的斑点；但在366nm下，不同水解时间样品在溶剂前沿有明显的单糖碎片斑点。说明上述水解条件(2mol/lTFA-120℃-1h/2h/4h)均不适用于本品的水解。
[0050] GC-MS法检测：
[0051] 进一步将LMP按上述条件水解，GC-MS检测进行验证。得到总离子流图后与本实验室自建的“糖类”谱库进行单糖种类的初步检索，结果显示第一个峰可能是葡萄糖/半乳糖/甘露糖，第二个峰可能是果糖/山梨糖，其余碎片谱库检索无对应单糖，表明它们都是酸水解产生的杂质碎片。因此，2mol/l TFA-120℃水解1h、2h均不适用于LMP。改用更加温和的条件(2mol/l TFA-100℃-2h、0.05mol/l TFA-110℃-5h)，仍有明显的杂质峰，但杂质峰的强度随酸水解条件的温和而有所降低。尝试改变酸的种类，采用硫酸水解，如下。
[0052] 薄层色谱法检测：
[0053] 展开剂：乙酸乙酯-吡啶-醋酸-水(5∶5∶1∶3)；
[0054] 显色剂1：苯胺-邻苯二甲酸显色剂；显色剂2：10％硫酸-乙醇显色剂；
[0055] LMP加入0.05mol/L H2SO4，分别在50℃和100℃下水解1h后，采用薄层色谱法检测。结果显示，LMP在50℃水解1h后的样品，在单糖相应斑点位置以下有明显条带，说明水解不完全；而LMP在100℃下水解1h的样品，斑点与单糖对照品斑点相近，且在溶剂前沿无碎片斑点出现，说明此水解条件合适，进一步用GC-MS法确证。
[0056] GC-MS法检测：由GC-MS检测结果可见，0.05mol/L硫酸-100℃水解1h的样品总离子流图中除溶剂空白峰外，只有峰1和峰2，无其他杂质碎片，表明LMP合适的水解条件为0.05mol/L硫酸-100℃-1h。
[0057] 单糖组成分析：LMP在0.05mol/L硫酸100℃水解1h后，采用GC-MS法分析单糖组成，得到的总离子流图与申请人自建“糖类”谱库进行谱库检索后，提示峰1可能是葡萄糖/半乳糖/甘露糖，峰2可能是果糖/山梨糖。取相应对照品衍生化产物进行GC-MS分析，通过保留时间比较，确定峰1为葡萄糖，峰2为果糖。因此，LMP主要由果糖组成，含极少量葡萄糖(两者峰面积之比约为32∶1)。
[0058] 糖残基连接方式分析：
[0059] 一般多糖糖苷键连接位点的分析，是将多糖完全甲基化后，通过酸水解、硼氢化钠还原、乙酰化处理后，得到部分甲基化的阿尔迪醇乙酰酯，再进行GC-MS分析。但单糖组成中同时含有果糖和葡萄糖的多糖使用此法可能会引入混淆。因为果糖是酮糖，经还原后生成相应的甘露糖醇和葡萄糖醇。如果样品中本身含有类似连接的葡萄糖，两者就会混淆。如1位连接的果糖和2位连接的葡萄糖，经还原乙酰化后，都产生了3，4，6-O-三甲基-1，2，
5-O-三乙酰基葡萄糖醇，这样就无法确定它们的组成比。
5-O-三乙酰基葡萄糖醇，这样就无法确定它们的组成比。
[0060] 而还原-裂解法是将完全甲基化的样品用硅烷直接进行还原，断裂糖苷键，仍保留糖环的结构，吡喃环的还原裂解产物仍是吡喃环，呋喃环的还原裂解产物仍是呋喃环，在气相色谱上能明显区分开。如1，2连接的葡萄糖经还原裂解后，产生的是3，4，6-O-三甲基-2-O-乙酰基-1，5-缩水葡萄糖醇，而1位连接的果糖产生的是相应的3，4，6-O-三甲基-1-O-乙酰基-2，5-缩水葡萄糖醇和甘露糖醇，两者能明显区分。
[0061]
[0062]
[0063] 由上图可见，1，2连接和6，2连接的果糖残基经甲基化、还原裂解、乙酰化后，都有相同的产物4(1-O-Acetyl-2，5-anhydro-3，4，6-tri-O-methyl-D-mannitol)生成。为了确定两种不同连接方式分别生成的化合物4的面积，我们用巴戟天五糖(只有1，2连接)为标准，进行甲基化、还原裂解、乙酰化后，计算1，2连接产生化合物4、5的比例，进而计算出LMP中1，2连接和6，2连接的量。
[0064] 对巴戟天五糖及LMP进行两次甲基化反应后，经IR检测，无明显的羟基吸收峰，说明甲基化完全。
[0065] GC-MS分析：完全甲基化的巴戟天五糖和LMP经过还原裂解及乙酰化后进行气相色谱-质谱联用分析，再结合参考文献，对其依次归属如下：
[0066] LMP的甲基化分析(1)
[0067]
[0068] LMP的甲基化分析(2)
[0069]
[0070] 通过计算得到巴戟天五糖(只有1，2连接)甲基化-还原裂解产物4和5(即甘露糖醇和葡萄糖醇)的比例为3.45，因此，样品LMP的峰6的面积乘以3.45，再加上峰6面积，即对应1，2连接果糖残基的数；峰4扣除1，2连接果糖残基产生的峰面积后，再加上峰5面积即对应于6，2连接果糖残基数。各种连接方式的比例见上述两表(1)和(2)。
[0071] 根据GC-MS分析结果可知，LMP中的果糖残基以2，1连接为主，有少数的2，6连接和1，2，6连接，并且有极少数末端葡萄糖残基。
[0072] 根据果聚糖的分类，由2，1连接的果糖残基组成的果聚糖称为inulin；由2，6连接的果糖残基组成的果聚糖称为levan；既有2，6连接的果糖糖残基又有2，1连接的果糖残基的果聚糖称为graminan。因此，LMP为graminan型的果聚糖。
[0073] 另外，根据文献，果聚糖中并不一定含有葡萄糖。根据葡萄糖的有无，可将果聚糖分为Fn型(不含葡萄糖)和G-Fn型(含果聚糖)。LMP的单糖组成分析及GC-MS分析都表明其葡萄糖含量很低，因此发明人推断其中既有Fn型的果糖链，也有G-Fn型的果糖链，其中葡萄糖残基连接在末端。
[0074] IR，NMR，MALDI-TOF-MS光谱测定：
[0075] 样品LMP红外光谱特征吸收谱带：3600～3200cm-1强宽峰为分子间及分子内羟-1 -1基吸收，3000～2800cm 为C-H键伸缩振动，1460～1200cm 为C-H的变角振动，1200～-1 -1 -1
1000cm 是C-O-H及C-O-C中C-O伸缩振动，931.5cm 为呋喃环对称伸缩振动，820.8cm-1 -1
为呋喃环C-H变角振动。图谱中无1775～1735cm 和1250cm 吸收峰，故不含乙酰基团。
由IR图谱看出，LMP是呋喃聚糖。
1000cm 是C-O-H及C-O-C中C-O伸缩振动，931.5cm 为呋喃环对称伸缩振动，820.8cm-1 -1
为呋喃环C-H变角振动。图谱中无1775～1735cm 和1250cm 吸收峰，故不含乙酰基团。
由IR图谱看出，LMP是呋喃聚糖。
[0076] 核磁共振图谱分析：从LMP的1H-NMR谱图中可见，质子信号在δ3.2至δ4.2间严重重叠，不易解析。而在δ5.43的质子信号为葡萄糖端基质子的化学位移，说明葡萄糖的糖苷键构型为α-构型。(一般α-构型糖苷的端基质子在δ5.0以上，而β-构型糖苷的端基质子在δ5.0以下)。
[0077] 有大量文献报道果聚糖的13C-NMR谱中各峰归属，一致认为果糖残基各个碳原子分别位于三个区域：105ppm左右为果糖端基碳C-2的峰；75-83ppm左右为果糖C-3、C-4、C-5的峰；62-65ppm左右为果糖C-1、C-6的峰。葡萄糖残基的各个峰与果糖的峰比较容易分开，分别是：92-94ppm左右为C-1的峰；70-74ppm左右为葡萄糖C-2、C-3、C-4、C-5的峰；小于62ppm区域为葡萄糖C-6的峰。
[0078] LMP的13C-NMR谱呈现明显的β连接的呋喃型果聚糖的特征。由于葡萄糖的含量很少，所以在碳谱中信号不明显。
[0079] 根据文献，对LMP的碳谱信号进行归属，列于下表中。13C-NMR谱图分析结果表明LMP含有各种连接方式的果糖残基，与GC-MS的分析结果相一致。
[0080] LMP的13C-NMR谱的化学位移归属(D2O，δ)
[0081]
[0082] a表示信号重叠
[0083] MALDI-TOF-MS测定：
[0084] MALDI-TOF-MS是一种软电离方式，灵敏度是各种电离方式中最高的，产生的分子离子稳定，不易裂解，且图谱没有ESI-MS中的多电荷特性，易于解析。
[0085] LMP的MALDI-TOF-MS图中主要是一组信号较强依次相差162的[M+Na]+峰，即851.239(五糖)、1013.316(六糖)、1175.372(七糖)、1499.472(八糖)、1661.522(九糖)、1823.574(十糖)、1985.623(十一糖)、2147.885(十二糖)、2309.691(十三糖)。
MALDI-TOF-MS结果表明LMP由5～13糖组成。从图中可以看出，LMP的MALDI-TOF-MS图符合单一单糖组成的寡糖或多糖图谱的鲜明特征，即呈现一组相邻m/z差值相等的质谱峰，且强度随m/z增大而降低。这可能是因为天然寡糖和多糖分子量有一定的分散度，较小离子对较大质量糖分子的解吸电离有抑制作用。
MALDI-TOF-MS结果表明LMP由5～13糖组成。从图中可以看出，LMP的MALDI-TOF-MS图符合单一单糖组成的寡糖或多糖图谱的鲜明特征，即呈现一组相邻m/z差值相等的质谱峰，且强度随m/z增大而降低。这可能是因为天然寡糖和多糖分子量有一定的分散度，较小离子对较大质量糖分子的解吸电离有抑制作用。
[0086] LMP主要由果糖组成，含极少量葡萄糖(两者峰面积比为32∶1)，果糖残基为β-型，葡萄糖残基为α-型；果糖以2-1连接为主，有少数2-6连接及2-1、2-6连接。
[0087] 本发明还提供了一种短葶山麦冬多糖，其为采用上述的方法得到，该短葶山麦冬多糖中，该短葶山麦冬多糖中，以HPLC-ELSD法测定水解后果糖含量计，所述短葶山麦冬多糖在药材中的含量为0.6％～6％(已测定不同批次药材多糖含量均值约为3％)；以(T1+T2)/粗多糖浸膏质量计，收率为2％。
[0088] 本发明还提供了短葶山麦冬多糖在治疗心血管疾病方面的作用，该心血管疾病包括心肌缺血、糖尿病、血管平滑肌增生等；尤其是短葶山麦冬多糖在制备治疗心肌缺血的药物中用途。其抗心肌缺血活性研究如下：
[0089] 1动物 清洁级SD大鼠，雄性，体重200～220g，购自北京维通利华实验动物技术有公司(动物合格证号：SCXK(京)2002-0003)。
[0090] 2药物 粗多糖、S、T1、T2；普奈洛尔为白色片剂，加入生理盐水溶液配成药物含量为0.8mg/ml混悬液；异丙肾上腺素(Isoprenaline，Iso)临用前用生理盐水配成8mg/ml溶液。
[0091] 3试剂及仪器 乌拉坦；ECG-6951E型心电图机；751型数显分光光度计(日本岛津)；生物机能信号系统(成都仪器厂)。
[0092] 4方法 对异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血损伤的影响
[0093] 4.1实验分组 SD大鼠56只，随机分为7组，每组8只，分别为正常对照组、模型组、粗多糖组(10mg/kg)、S组(10mg/kg)、T1组(10mg/kg)、T2组(10mg/kg)；阳性对照普奈洛尔组(8mg/kg)。
[0094] 4.2模型制备及给药、检测 正常对照组和模型组分别灌胃给予生理盐水溶液(1ml/100g)；粗多糖组、S组、T1组、T2组分别给予用生理盐水配制成1mg/ml浓度的溶液，1ml/100g；阳性对照组给予生理盐水配制成0.8mg/ml的普奈洛尔溶液1ml/100g。每天1次，连续给药5天。除正常对照组外其余各组分别于第2天和第3天给药1h后给予8mg/ml异丙肾上腺素(0.1ml/100g，皮下注射)，正常对照组给予等容量的生理盐水。
[0095] 分别记录给药前及第2次注射异丙肾上腺素后30min的心电图(标准II导联)，测量J点位移，计算注射Iso后各组大鼠J点位移改变的绝对值。
[0097] 5.结果：与正常对照组比较，模型组大鼠在皮下注射Iso后，心电图J点位移显著改变(P＜0.01)，血浆中LDH的活性明显升高(P＜0.05)，提示发生心肌缺血，造模成功。模型组皮下注射Iso后的心电图J点位移明显升高，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)；阳性药普奈洛尔组能明显抑制Iso所致大鼠心电图J点位移，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；T2组对心电图J点位移有明显抑制作用(P＜0.05)；T1组对心电图J点位移也有抑制作用，与模型组比较无统计学意义(P＜0.05)；粗多糖组、S组对Iso引起的心电图J点位移无明显的作用。
[0098] 表2-1对Iso所致大鼠心电图J点位移影响
[0099]* **
[0100] 注：与模型组比较，P＜0.05，P＜0.01
[0101] 以上结果说明：T2组具有抗心肌缺血作用，T1组从均值数据上看也有趋势，但统计学无显著性，其他2种成分没表现出抗心肌缺血作用。
[0102] 经HPLC-RI检测，T1包括A、B、C三部分，T2主要含B、C两部分，仅有很少量的A。结合药理活性试验结果，可以得出，短葶山麦冬中具有抗心肌缺血活性的部位是多糖。
[0103] 麦冬对诱导性血管平滑肌细胞增殖的拮抗作用
[0104] 1.1试剂D-Hanks缓冲液：RPMI-1640培养基(GIBCO，USA)(每升含20％小牛血清、L一谷氨酰胺0.33mg、青霉素100μ、链霉素100μ、pH：7.4)；消化剂为0.25胰蛋白酶；四甲基氮唑盐(MTT)；二甲基亚砜(DMSO)。
[0105] 1.2细胞培养VSMC取自幼年青紫兰兔主动脉中层。颈动脉放血后，在无菌操作下迅速将主动脉自体内取出置于D-Hanks(内含青霉素100IU/ml，链霉素lO0μg/ml)液中，除去动脉内血液和血块，剥去血管外膜的纤维脂肪层，纵向剪开血管，去除内皮细胞，在D-Hansk液中洗涤数次，横向撕下中层小条，剪成1～2mm的小块，接种于培养瓶的一侧壁，沿没有组织块培养瓶的侧壁缓慢加入含20％小牛血清的RPMI-1640后，将培养瓶直立于37℃，5％CO2的培养箱中3～4小时后，平放培养瓶使组织块完全浸泡于培养液中，待细胞生长并汇成片后，以0.25的胰蛋白酶消化传代培养(培养液含10的小牛血清)。光镜下观察细胞呈对数生长。实验用3～5代培养细胞。
[0106] 1.3实验分组取4x104密度的细胞于细胞培养板(Nunc Denmark)，待细胞生长达50％融合时，对照组加入3％小牛血清、100μl空白培养基；模型组加入3％小牛血清、5％HLS、Ins1000μ及100μl空白培养基；麦冬组在模型组的基础上再加入5％麦冬溶液
100μl。
100μl。
[0107] 1.4MTT比色测定：于原代VSMC培养的第24小时从96孔培养板中吸取100μl上清液，向各孔加入100μl的二甲基亚砜，振荡5min，等细胞代谢MTT后所形成的formazan充分溶解后，用酶联免疫检测仪测定490nm处吸光值。
[0108] 1.5统计学处理统计学采用t检验，以P＜0.05表示差异有显著性意义。
[0109] 2结果细胞增殖对照组、模型组及麦冬组与血管平滑肌细胞共同孵育24小时后，经MTT比色法测定，对照组为0.142±0.017；模型组为0.191±0.004；麦冬组为0.1774±0.004。结果显示：经高胰岛素、高脂血清造模后VSMC细胞明显增殖，与对照组比较，差异有显著性意义，P＜0.05。在造模基础上，加入麦冬药物后，可明显抑制高胰岛素、高脂血清所致的VSMC增殖，与模型组比较，差异有显著性意义，P＜0.05。
[0110] 结果显示：麦冬组有较明显的抗血管平滑肌细胞增殖作用，对生长刺激因素引起的细胞形态改变有一定的缓解作用。
[0111] 对大鼠糖尿病模型血糖的影响
[0112] 1.1动物：雄性Wistar大鼠(180～200g)，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2002-0003。
[0113] 1.2试剂及药品：拜唐苹，拜耳医药保健有限公司，(批号：108579)；链脲佐菌素，购自Sigma公司(批号：024k1220)；蔗糖试剂盒(批号：060631)；购自中生北控生物科技股份有限公司。
[0114] 1.3仪器：Bio-RAD，model-680酶标仪；SHZ82型气浴振荡器，江苏金坛中大仪器厂生产；LDZ0.8离心机，北京医用离心机厂产品；AT250电子天平，瑞士METTLER公司产品。
[0115] 取雄性Wistar大鼠50只，体重180-200g，以尾静脉注射链脲佐菌素50mg/kg(冰浴，pH4)，诱发大鼠糖尿病。注射链脲佐菌素7天后，禁食10h，剪尾采血测定血糖。选择空腹血糖值在11.1mmol/L以上的大鼠，确定为糖尿病模型大鼠，随机分为5组，分别为20μg·ml-1、50μg·ml-1、100μg·ml-1麦冬组；模型组，每组8只。每天上午定时ig给药1次，给药体积10ml·kg-1，连续给药7d。提前禁食10h，于末次给药后0.5h同法测定各组大鼠空腹血糖。
[0116] 1.5麦冬对大鼠糖耐量的影响：给药方法与剂量同上，连续给药7d，末次给药前禁食10h，末次给药后迅速ig蔗糖溶液(4g·kg-1)，剪尾采血，用蔗糖氧化酶-过氧化物酶法测定大鼠灌胃后0、0.5、1.0和2.0h的血糖值。
[0117] 2.结果
[0118] 2.1麦冬对大鼠糖尿病模型血糖的影响：大鼠在注射链脲佐菌素后7d，空腹血糖值显著升高，造模成功。用药1周后，不同给药组大鼠血糖值与模型组比较显著下降(P＜0.05)，给药组降糖作用与剂量呈正相关(r＝0.995)；结果见表1。
[0119] 表1麦冬对大鼠糖尿病模型 糖的影响(x±S，n＝8)
[0120]
[0121] 与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01
[0122] 2.2麦冬对大鼠糖耐量的影响
[0123] 各组动物ig蔗糖0.5h后血糖值达峰值，在ig蔗糖后0.5h开始至2.0h，三个剂量给药组与同时间点模型组比较血糖值有显著性降低(P＜0.05)，说明本实验条件下麦冬可提高糖尿病大鼠的蔗糖耐量，结果见表2。
[0124] 表2麦冬对大 糖耐量的影响(χ±S，n＝8)
[0125]
[0126] 与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01
[0127] 结果显示，连续给药1周后3个剂量的麦冬在负荷蔗糖后0.5h，匀可以显著性提高大鼠蔗糖耐量(P＜0.05)，降低负荷蔗糖后机体的血糖值；同时，麦冬还可以显著性降低链脲佐菌素诱发糖尿病模型大鼠的血糖值(P＜0.05)，且该作用呈剂量依赖性。由此可见，麦冬具有明显的降糖作用。附图说明
[0128] 图1：本发明得到的短葶山麦冬多糖的色谱图，横坐标是时间(分钟)，纵坐标是吸收度。
具体实施方式
[0129] 实施例1：
[0130] 取短葶山麦冬药材10kg，10倍95％乙醇浸泡过夜，提取2h，用8倍95％乙醇提取1h，提取液弃去，残渣加10倍量水，提取2h，再用8倍量水提取1h，合并，浓缩，加入适量乙醇至醇浓度为60％，醇沉24h，得粗多糖总糖浸膏。
[0131] 取粗多糖浸膏(相对密度1.34)192g，溶于640ml蒸馏水中，依次梯度加乙醇至醇浓度20％、40％、60％、80％，4℃静置过夜离心。取60％、80％乙醇沉淀真空冻干，得60％醇沉多糖1.065g(收率0.5546％)、80％醇沉多糖2.9774g(收率1.55％)。
[0132] 取60％乙醇沉淀1.0505g，溶解于13.5ml蒸馏水中，离心，上清液用过DE-52纤维素柱(2.6*32cm)，分别用蒸馏水、0.1mol/l、0.2mol/l的NaCl溶液洗脱。合并水洗脱部分，浓缩。冷冻干燥，即得到T10.9333g(收率87.63％)。
[0133] 取80％乙醇沉淀2.9774g，溶解于10.5ml蒸馏水中，离心，上清液DE-52纤维素柱(2.6*32cm)，分别用蒸馏水、0.1mol/l、0.2mol/l的NaCl溶液洗脱。合并水洗脱部分，浓缩。冷冻干燥，即得到T22.4955g(收率83.81％)。
[0134] 实施例2：
[0135] 取实施例1得到的粗多糖浸膏(相对密度1.34)1000g，溶解于2000ml蒸馏水中，依次加乙醇至醇浓度20％、40％、60％、80％，4℃静置过夜，离心。取60％和80％乙醇沉淀，真空冷冻干燥，得到60％醇沉多糖3.319g(收率0.33％)、80％醇沉多糖204.206g(收率20.4％)。其为短葶山麦冬多糖，色谱图参见图1
[0136] 取60％乙醇沉淀2g，溶解于10ml蒸馏水中，离心，上清液过DE-52纤维素柱(1.6*47cm)，分别用蒸馏水、0.1mol/l、0.2mol/l的NaCl溶液洗脱。合并水洗脱部分，浓缩，冷冻干燥，即得到T11.624g(收率81.2％)。
[0137] 取80％乙醇沉淀1.5g，溶解于10ml蒸馏水中，离心，上清液过DE-52纤维素柱(1.6*47cm)，分别用蒸馏水、0.1mol/l、0.2mol/l的NaCl溶液洗脱。合并水洗脱部分，浓缩，冷冻干燥，即得到T21.3328g(收率88.85％)。
[0138] 实施例3：短葶山麦冬多糖口服硬胶囊
[0139] 短葶山麦冬多糖 100克
[0140] 干淀粉 100克
[0141] 乳糖 50克
[0142] 羧甲基淀粉钠 5克
[0143] 上述组分混合后分别过80目筛，混合均匀，用适量1.5％的聚乙烯吡咯烷酮的70％乙醇溶液制成20～30目颗粒，50℃干燥，20目整粒，填充胶囊即得。
[0144] 实施例4：短葶山麦冬多糖片剂
[0145] 短葶山麦冬多糖 100克
[0146] 微晶纤维素 200克
[0147] 乳糖 150克
[0148] 羧甲基淀粉钠 15克+15克
[0149] 硬脂酸镁 1.5克；制成1000片。
[0150] 短葶山麦冬多糖、微晶纤维素、乳糖、1/2羧甲基淀粉钠分别过80目筛混匀，用3％聚乙烯吡咯烷酮的70％乙醇溶液制成20目颗粒，50℃干燥，18目整粒，加入过120目筛的硬脂酸镁、80目筛的另1/2羧甲基淀粉钠，混匀，压片，包衣。
[0151] 实施例5：短葶山麦冬多糖口服液
[0152] 短葶山麦冬多糖 100克
[0153] 苯甲酸钠 15克
[0154] 甜菊苷 10克
[0155] 水 加至10000ml；
[0156] 共制备1000支。
[0157] 将短葶山麦冬多糖用配液量60％的水完全溶解，将苯甲酸钠和甜菊苷用配液量20％的水完全溶解，合并上述两个溶液，补加水至全量，过0.8um的滤膜，按常规方法灌装、封口、灭菌等步骤制得短葶山麦冬多糖口服液。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种冷冻干燥筒 | 2020-05-12 | 577 |
| 新型冷冻干燥机 | 2020-05-12 | 821 |
| 新型冷冻干燥机 | 2020-05-12 | 672 |
| 用于冷冻干燥系统的装载和卸载设备 | 2020-05-11 | 790 |
| 冷冻干燥装置 | 2020-05-12 | 698 |
| 冷冻干燥装置 | 2020-05-13 | 589 |
| 具有装载和卸载装置的冷冻干燥设备 | 2020-05-11 | 900 |
| 用于冷冻干燥设备的装载和卸载装置 | 2020-05-11 | 571 |
| 新型冷冻干燥机 | 2020-05-13 | 590 |
| 一种真空冷冻干燥装置 | 2020-05-11 | 644 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈