本发明涉及培养悬浮动物或植物细胞系的连续方法，目的在于有 效的生产生物制品。本发明也涉及一些装置和仪器，通过它们可实现 按照本发明来培养悬浮动物或植物细胞系的方法。

细胞培养对生物活性物质和药物活性产品的生产都非常重要。特 别那些被频繁使用又自由地悬浮在营养培养基中的细胞的培养是困难 和复杂的，因为它们与微生物和粘附的细胞不同，它们对机械应力和 基质的不足供给都很敏感。出于这个原因，依照本发明所使用的装置 仪器和技术方法对于有效的生产方法是至关重要的。

在大多数培养悬浮动物或植物细胞系的技术方法中采用的是分批 法。该方法存在缺点，即细胞计数和营养培养基和代谢物的浓度在数 天或数周的批循环中不断变化，并且死细胞在发酵的后期聚积，形成 的产物会发生酶降解或自发降解。因此连续的发酵过程是值得推荐 的，特别对于不稳定活性化合物的生产。

如果高细胞密度在发酵罐中能被实现并且相应可以获得高生产 率，连续的方法是经济并有竞争力的。这需要

(1)在发酵罐中有充足的氧供给来满足处于高细胞密度的细胞的 高需氧量；

(2)允许细胞有效保留的在反应器系统中细胞保留系统。

(3)更可靠的长期操作，即稳定的操作条件(细胞，基质，代谢 物和产物浓度)和整个反应器系统的长期无菌状态，和

(4)一个稳固，简单和容易处理的方法。

该方法必须也要考虑细胞对于机械应力和基质供给不足的高敏感 性以及产物的不稳定性。

在先的技术中描述了很多培养细胞系的仪器、装置和方法。以下 装置和仪器的变体是已知的：

1、发酵罐

细胞培养发酵罐经常选用的氧供给手段是通过多孔或扩散膜的无 气泡氧供给方式，因为液体表面气泡的形成、上升和爆破使细胞经受 高应力度。为此目的所推荐的搅拌器为相对较小的、高速的和轴向转 运的搅拌器，其被安装在隔膜挡板中央(例如，Fenge，Fraune，Maier， 1992.BioTec，4：52-54)。这样的反应器的设计是不利的，既因为 高速、轴向转运的搅拌器会引起很高的应力度，也因为在容器壁和搅 拌器之间的膜上的相对低速和相应低的氧传输率。

这样一种反应器设计更合适，其中，通过安装的与整个隔膜高度 相当并离它有一轻微距离的大搅拌器，加强了反应器中氧的运输。尽 管由于在此种反应器的设计中使用的挡板，使得只能使用相对小的隔 膜挡板和相应小的传质表面。

由于按比例扩大该方法时，膜的表面面积与反应器体积的比与反 应器的直径成反比，因此上述的氧供给方法只适用于小反应器或低细 胞密度。

而且，采取大气泡充气的方法进行氧供给，用搅拌的方法使气泡 分散，这都限制了细胞密度和细胞培养的存活率，因为涉及到巨大的 机械应力强度。

2、细胞保留

对于连续的发酵过程，在过去许多不同的细胞保留系统被建议采 用，为了允许灵活处理，其被适当安装在发酵罐的外部。

当使用外部装置时，特别是在对细胞的氧供给不足和发酵罐外CO2去除不充分时，为了最小化发生的细胞损伤，特别需要操作体积小并 且细胞在其中停留时间相对较短的细胞保留系统。

除了膜滤器和带有固定和移动薄膜的交叉流动过滤装置外，也用 到了专用离心机和沉降装置。

然而在通过膜滤器发生细胞保留的地方，观察到了积垢效应，由 此致使不可能进行稳固的低维修要求的长期操作。通过在膜上的高流 速可获得积垢的减少。但由于在膜装置的泵、管道和通道中的高流速 产生了增加的应力，所以对高流速的需要是细胞低剪切处理所不允许 的。

为了用离心分离的方法移去细胞，开发了专用的离心机，但它们 的缺点是使细胞经受增加的机械应力，因为用来移去的加速度是重力 加速度的二百倍以上。另外，如果没有维修保养，离心机不会安全运 转超过几周或几个月，并且也会导致操作成本增加。

还有一种将细胞从细胞培养上清液中移去的手段就是用重力沉降 装置。在细胞培养中主要应用的重力沉降装置是沉积槽和倾斜通道系 统。与简单的沉降容器相比，倾斜通道系统具有容积显著更小的优点。

迄今为止所描述过的系统(J.Stevens，u.a.：Preprint Esact-Meeting 1993Würzburg；K.J.Thompson，J.S.Wilson： Preprint Esact-Meeting 1993Würzburg；J.A.Searles，u.a. Biotechnol.Prog.1994，10，188-206；WO 94/26384)是具有很小 的沉降面积的逆流系统(Ath＝zb1L cosα＜0.2m2；z：板数；b1： 宽；L：通道长度；α：与水平线之间的倾角)，因此不能用于生产规模。

逆流倾斜通道系统中的是按比例放大是个难题，因为在发酵罐体 积V增大时，沉降分离器所要求的浓缩物和清液相的收集室的体积， VSF，会超比例地增大(灌注速率恒定时，VSFαV1.5)，在灌注速率q/V 增加时甚至还要增大更多(恒定的发酵罐体积时，VSFα(q/V)2.15)。 由于不利的几何形状(流入和流出部分及通道长度)并造成大的操作 体积，大多数建议用于细胞培养的倾斜通道系统的几何形状确实阻止 它们用于大规模设备。在建议的变体中，引入其中的浓缩物和清液相 的收集室以及流入和流出的通道被不利地设计。采用的倾斜通道系统 的通道长度相对比较短，范围在100到300mm之间。最常被建议的长 度只有100mm。然而对于已知使用这些系统的用户，所建议的变体的特 征没有证实是负面的，因为仅是对小规模(发酵罐体积1-25L)系统 进行了试验。

对于高细胞浓度发酵，用高于1.5×107活细胞每毫升反应器体积 的细胞浓度，如果采用常规的沉降器设计，对于容积为100到200L的 发酵罐，则必须要有体积为70到550L或50到500L的沉降分离器(即 使用可相对快速沉降的BHK细胞)。在这样的装置中并经历较长的周 期也不能获得所期望的1.5×107活细胞每毫升反应器体积的细胞密 度，因为由于在沉降分离器中停留时间长并且相应供氧量不充分而不 能维持优选的μ≈0.4/d的生长率。

尽管Bayer AG的公报(1992，Chemie-Technik，21(3)，118) 中包含了关于0.2到2.5米的长倾斜通道系统的参考内容，但此论文 所描述的液体分布系统和浓缩物收集室不能满足关于操作体积小的要 求。由于这样的事实，即在所公开的装置中，培养基是被注射到杯状 装置中(为了减小在接收室(32)中的湍流)，接收室(32)本身的体积 必须相对较大。事实上，不可能构造这样一个带有杯状装置又具有完 全圆锥或金字塔几何形状的接收室。为了将这个杯状装置放进接收室 中，除了圆锥形或金字塔形的截面，接收室必须具有圆柱形截面，因 此接收室的体积增加了。在上述例子中，沉降分离器的工作体积是Vs＝ 50到100L，这远高于本发明中分离器的体积。

2.1冷却

为了降低沉降分离器中代谢的活性和细胞的沉降物，建议对沉降 分离器中的细胞培养液进行冷却。由于在沉降分离器的内部有温度梯 度(以及对应的密度梯度)形成，这个基本上正确的建议确实仍导致 了对流。这反过来对细胞分离的有效性有负面影响。这一点对使用分 离器表面积和分离器体积的比例相对较低的分离器时是至关重要的， 因为在这样的装置中，每单位分离器体积仅能获得相对较小容积的生 产量。

2.2振动

为了减少细胞在沉降分离器中的停留时间，建议对倾斜通道系统 采用不规律振动(Bayer AG，1992，Chemie-Technik，21(3)：118； Searles，等1994.Biotechnology Progress，10：188-206).

3.接种发酵罐

为了有效操作发酵过程，在发酵罐中需要有特定的起始细胞浓 度，因为起始细胞浓度不够充分会导致由于缺乏异源外激素而推迟细 胞的生长。(动物细胞的起始细胞浓度应近似为106个/ml)因此，根 据生产发酵罐的大小，几个预发酵罐是必要的。对于细胞培养，通常 使用可以获得5×106到8×106个/ml的细胞浓度的间断操作发 酵罐，这是由于它们有简单的操作模式。这意味着，例如接种200L的 生产发酵罐，从细胞保存开始，一个常规的种子链扩张要用许多T型 烧瓶，至少还需要60个滚瓶。

4.低剪切泵和管道：

此过程的操作需要泵和管道来连接储罐、发酵罐、外部沉降分离 器和收集容器。在已知的文献当中没有给出关于泵和管道的选择及设 计的详细内容。然而这方面对于无菌条件下的在高细胞浓度和活性的 长期培养是极为重要的。在该装置中必须重视从整体上泵的正确安 装。如专利WO94/26384中所描述的，在导入到发酵罐的浓缩物再循环 流中安装泵是不利的，因为其结果是浓缩的细胞悬浮液(也就是大量 的细胞)被暴露在泵中很高的机械应力下。

基于上面的考虑，这个技术问题引发了开发用于发酵剪切敏感性 细胞的装置、仪器和有效的方法，据此生物产品才能经济又高质量的 生产。

按照本发明，此难题通过一个发酵装置得以解决，该装置包括容 纳营养培养基的至少一个储罐、泵及管道、生产发酵罐、至少两个通 流热交换器和细胞保留沉降分离器(任选装配振荡器(5))。一种高 灌注率的连续发酵方法也有利于解决相关的技术问题。

发明概述

本过程装置由许多仪器和至少一个容纳营养培养基的储罐(1)、泵 及管道(7，8)、至少间歇的连续灌注的生产发酵罐(2)、至少两个通流 热交换器(3)和细胞保留沉降分离器(4)(任选装配振荡器)组成，装 置的零部件采用这种方式设计，即其中培养的细胞经受低机械应力度 的长期培养需要超过一个月以上的过程时间。在本发明装置的帮助 下，可以获得在细胞密度高于1.5×107个活细胞/每毫升反应器体积和 高于80％，优选90％的存活率时具有超过3-5个月的长期稳定培养。 本文中存活率被定义为细胞总数在含有活细胞的培养物里的相对百分 率。

然而依照有机体和所用的发酵步骤的类型，细胞密度、存活率和 培养时间可以较低/短。

在本发明的操作方法中，也可能采用特殊设计的和分批和/或连续 操作的接种发酵罐，其最大灌注体积小于生产发酵罐体积的6％，不过 在细胞计数上允许50到150倍的增加。

在本发明的帮助下获得了该方法的高生产率，尽管使用的是敏感 性细胞并且产物容易降解。

发明详述

本发明涉及一个发酵装置，其不同于以前的工艺，装置的多方面 存在有利的变体。虽然这些有利的变体也可单独地显示它们的有利方 面，但一个优选的变体应该是本发明装置的几个或所有的有利特征的 相互作用。因而，例如增加主发酵罐的氧传输能力就是特别有效的， 因为在沉降分离器中更有效的细胞再循环使得在培养物中建立了更高 的细胞密度。通过本发明装置的其他组件的相互作用，可以获得类似 的协同效应来提高发酵过程的总体生产率。

本发明也涉及在本发明的装置中实现高细胞密度发酵过程的有利 方法。根据本发明，该方法使有效使用发酵装置的变体的正面效应成 为可能。

该发酵装置的有利变体描述如下：

1、生产发酵罐

由于它对于搅拌所采用的最佳设计，该生产发酵罐(2)显著之处 在于在气/液相界面的传质速率高并且剪应力最小。

开发了三种不同的发酵罐类型可产生上述的效应。

在发酵罐类型A(图3)中，氧供给是通过扩散薄膜发生的。所用 的硅管膜具有较小的壁厚，被轴向缠绕到管状定片上并以同心的方式 将搅拌器围绕在里面(14)。将发酵罐和管状定片设计成细长的形状是 有利的，因为这样能获得较大的体积比传质表面(A/V[m-1])。搅拌器是 大面积、多桨叶桨式的搅拌器(13)，它与硅管只相距一小段距离，优 选是5到15mm，并且搅拌器桨叶延伸到超过管状定片的整个长度。 即使以低转速搅拌，搅拌器的功率小于10或20瓦每立方米发酵罐体 积，这种设计类型也会产生硅管的轻微振动，因此在操作过程中，额 外地加强了传质并且同时产生了对薄膜的清洗净化作用。

为了令人满意的悬浮细胞，搅拌器根据本发明以这样一种方式进 行改良，即它们可以延伸到接近容器底部的区域。这通过搅拌器在靠 近底部区域的渐缩端部(13a)而成为可能。

根据类型A，发酵罐不含任何挡板。这样的结果是管状定片可以很 大并且比传质表面面积可能达到A/V＞10/D(A：传质面积；V：发酵罐 体积；D：容器直径)。因此可以用d/D＞0.6的特别大的搅拌器(d： 搅拌器的外径)，这样可以产生格外低的剪切度。

与含挡板的系统相比，外围运动仍然占优势并惊人的产生了附加 的传质增强和额外的气泡充气。具有给定气泡尺寸的气泡进行切线运 动，在发酵罐中产生了更大的气体含量，因此也就产生了更大的相界 面。

除了硅管定片，又可以在发酵罐底部组装充气环(17)用于额外 的气泡充气。这就允许了氧的额外运输和可能需要的二氧化碳去除的 强化。

对于发酵罐类型A，在硅酮管中使用纯氧和过量的压力可以获得高 达2×107个活细胞每毫升的非常高的细胞密度。

在发酵罐类型B(图4)中，氧供给仅通过细气泡充氧来进行。

细气泡充气是通过具有很小尺寸(dL＜15μm)的孔或洞的特殊烧 结体、过滤板、陶瓷膜或激光穿孔板(20)来进行的。由于可以使用v ＜0.5m/h的低表面气体速度，这样就形成了很小的气泡，它们在低 速搅拌器的缓和搅拌下表现出仅仅轻微的聚结倾向。因此高细胞密度 发酵的氧需求可通过以小于通过机械穿孔孔洞(dL＞0.2mm)的大气泡 充气所必须的表面气体速度的1/10来获得，这样细胞的增长不会受到 充气过程的负面影响。

另外，根据本发明，搅拌用的大型低速多级叶片搅拌器(18)中， 搅拌器外直径对容器内直径的比d/D＞0.5，优选d/D＞0.6，因为 高速的搅拌器，尤其是轴向运动的高速搅拌器被意外地发现会导致气 泡的聚结。这些大的搅拌器产生非聚结低剪切的细小气泡的分布。同 时，延至接近底部的搅拌器和与容器底部有一定距离的挡板产生悬浮 液并使生物量均匀分布，由于在底部产生的切线运动，即使在很低的 搅拌功率，P/V＜5W/m3时也会产生这样的效果。

挡板(19)不是以径向辐射的方式安装，而是以倾斜的方式安装 的，其结果是得到高出40％的传质效率(搅拌器功率下每体积单位的 物质流量)和相应对细胞的应力额外减少。

因为这些挡板(19)没有被安装在容器壁上，不仅与容器底部有与 一定的距离，也没有伸出液体表面，因此顶端被液体覆盖，所以沉降 可以被充分地避免。这为原位清洗(CIP：“就地清洗”)创造了重要 的先决条件。

在发酵罐类型C(图5)中，氧供给是通过细泡氧充气进行的(如 同类型B)。与类型B不同的是使用不带挡板的反应器，其中有偏心安 装的多级叶片搅拌器(21)。

搅拌器(21)的这种偏心安装加强了轴向混合但却没有完全抑制 周围的流动组分，就像使用挡板一样，特别是壁挡板。如上面提到的， 周围仍然占优势的运动惊人地加强了在气/液相界面的传质。具有给定 气泡尺寸的气泡进行切线运动产生了更高的气体含量，相应的产生了 更大的相界面。

根据本发明，搅拌器的这种偏心安装有效的阻止了细胞沉降并为 发酵罐的就地清洗创造了理想的先决条件。

根据本发明，采用发酵罐类型B和C，当使用纯氧时，可以获得高 达5×107个活细胞/毫升的细胞密度，存活率大于90％。

2、接种发酵罐：

为了简化发酵过程，生产发酵罐的种子量是在单级预培养中产生 的。这是用培养基管直接接种而不带有任何额外的培养步骤。为了在 接种发酵罐(9)中获得50到150倍细胞量的增加，需要特别的发酵 罐几何形状和特别的预培养类型。有一点也是特别必要的，即培养物 要在小的操作体积中被接种，该体积尺寸通过加入营养培养基而在预 培养阶段增加。

特别的发酵罐几何形状是必要的，因为对于动物细胞的有效培养 要求大于105个细胞每毫升(优选大于5×105到106个细胞每毫升)的 细胞浓度。如果细胞浓度较低，对于所需要获得的高生长率来说，代 谢物和快速生长所需要的异源外激素的浓度过低。

依照本发明，发酵罐(图6)有一个向下渐缩的截面。一个特别的 变体中，上部分(27a)和下部分(27b)都是圆柱形状，下面的部分 直径较小。因此下部分大约只占总体积的1/6。特殊形状的过渡装置连 接容器的上下两部分。

根据本发明的其它反应器都有向下渐缩的圆锥形状。

将由几个带大面积叶片的搅拌器(23，23a)组成的多级搅拌系统 和靠近搅拌器的浸没的挡板用来搅拌。充气过程是通过安装在接近容 器底部的微型分布器进行的。根据本发明，搅拌系统是以这种方式设 计的：即引入反应器的每一个截面的动力对于细气泡的均匀分布和细 胞的运动都是足够的。出于这个目的，依照不同的反应器截面，所用 的桨叶搅拌器具有不同的直径和桨叶高度，并且彼此之间的距离不 同。

作为使用挡板的反应器系统的一个备选方案，可使用不带挡板并 装有偏心搅拌器的反应器系统(23)。

在预发酵罐(9)中的培养物可以以分批、补料分批和连续灌注的 方法被连续操作，带或不带细胞保留。连续的预培养操作是特别有好 处的，因为可以获得比分批发酵过程中高3-4倍的细胞密度，并且用 于生产发酵罐的接种物料可以被供给更长的时间，这样任何随后的生 产过程的快速启动才能发生。

在预培养方法的连续操作过程中，一种类似的技术过程被用于生 产培养物的过程。此过程的结构又包括很多仪器和至少一个装营养培 养基的储存罐、泵和管道、连续灌注的接种发酵罐(9)、通流热交换 器和带或不带振动器的细胞保留系统，此过程的所有组件被设计为可 以获得高于107个活细胞每毫升反应器体积的细胞密度和高于90％的 存活率的低剪切培养。

3、沉降分离器：

为此过程开发的外部沉降分离器(4)的特征在于以最小的体积来 达到某一有效的分离器表面积，其结果是发酵罐外面的细胞沉降时间 和相应的氧供给不足可以被降到最小。

用在本发明发酵装置中的沉降分离器包含带有矩形截面和平行安 装的管材或通道。依照本发明的仪器具有的管材直径或通道高度的优 选尺寸在10mm或更小，大致的长度在0.2到2.5m或大约0.2到1.5m， 与水平线的倾斜角α＝40-65°。

在装有平行通道并具有矩形截面的分离器中，装置包括压力稳定 矩形组件(29)，该组件被用螺丝固定在其下面的浓缩物回收容器(32， 44)上，并通过焊接的法兰盘固定在盖板上。矩形组件(29)内含有 很多凹槽，这些凹槽决定了通道的高度，其两边彼此相对以一定的间 距安装，并根据本发明在间隔中插入板来形成每个通道的边界。组件 的截面优选是矩形，高与宽的比例(a/b1)与组件倾斜角的正弦值相符 合(图15)。这样就使组件下面的浓缩物回收容器的表面面积和体积尽 可能的小。

该组件是从一整块材料中冲压出来的或是由预制的U形型材或四 块板无缝焊接到一起而成。

各种结构的元件被用螺丝固定在一起，如此在O环密封的帮助下 能保证长期无菌环境。

根据本发明的装置中使用的沉降分离器可以被拆卸，因此很容易 清洗和保养。有关带有平行通道具有矩形截面的分离器的考虑也应用 于形成通道的板(30)。如果需要外部清洗，它们可以在盖板被拧下以 后被拆下。

根据本发明，在大的沉降分离器中，总体上，该组件是被以可旋 转的方式安装在仪器的质量中心，这样板就可以轻松地从水平的位置 被拆下并插回组件的凹槽中。

为了减少发酵罐外细胞的滞留时间，沉降分离器面向上的表面被 制造为具有高度的表面光滑度，优选表面粗糙度Ra＜0.25um，如DIN 4768所规定的，这与ISO 3274和ASME B46.1-1995.是相当的。作 为一个可选方案，经过疏水涂敷的表面和具有莲花效应的表面经证明 是合适的。

莲花效应被理解为某些表面的防污染效应，由缘于被充分限定的 表面结构(粗糙度)和有关材料的特性的适当组合，就像在某些植物， 例如莲花上所观察到的。例如以适当材料制作的带有显微细小圆丘的 表面结构被认为是具有莲花效应的。适用材料经常是疏水材料。

3.1逆流沉降分离器

逆流沉降分离器(图8-12)由三部分组成：带通道的组件(31)、 浓缩物回收容器(32)和盖板(29)。

离开发酵罐(2)的悬浮液在倾斜的通道下面被引入圆锥形或金字 塔形的容器(32)中，清澈相在通道(38)的上面被除去。

浓缩物的再循环出口在它的最低点与接收室中心(36)结合在一 起，这样使细胞附聚物以向下的方向从板上滑下来，被接收室收集并 再循环进入发酵罐。由于在逆流沉降分离器的接收室(32)里，同时 发生流入的细胞悬浮液的澄清，以及分离出来的在通道中形成的细胞 附聚物的返回，并且根据本发明，此容器的体积应该最小化，因此容 器的流动特征和流入管道必须被设计成有利的方式。特别是为了大仪 器的使用而按比例放大时，任何流入物流所引起的速度上的波动的增 加(例如湍流的开始)都必须避免。只有这样，才可能保证在接收室 中分离出来的附聚物的主要部分不会重新悬浮和重新被引入通道中 (31)。这些仪器的不利设计会导致细胞的存活率降低到80％以下。

基于流体动力学的最基本的考虑，对可能适用于接收容器的设计 原理进行了选择，并且通过CFD(计算的流体动力学)计算和专门的实 验测试使其进一步最佳化。因此根据本发明采用了下面的设计原理：

·为避免接收室中潜在的环形运动，流入通道(34)采用对称安装；

·采用大流入截面以保证流入物流的速度低于0.1m/s；

·采用带有小顶角的流入分散器，其可降低速度同时湍流也少；

·采用带有小于4°或小于6°的半锥角的圆锥形扩散器，并在应 用扁平扩散器的地方，截面面积除以周长的纵向微分(1/P dA/ds)小于 0.1(P：周长[cm]；A：面积[cm2]；s：长度坐标[cm])。

·运用两个径向的，优选是切线方向的流入物流。

在径向流入物流的变体(图8)中，两个直接相对的流入物流(35) 在接收室中心只产生一个驻点流，流入物流的入口点被安置在与通道 和浓缩物再循环出口有一定距离处。该距离优选大于15倍的通道高度 和大于浓缩物再循环出口直径的10倍。流入发生在接收室底部以上高 于接收室的一半小于总高的0.8倍的几何高度。

其中流入物流被呈切线安排的流入物流变体的特征在于流入物流 相同(图9；图11)或相反方向(图10；图12)的安排。

在使用切线流入物流和圆锥形接收室的情况下，流入优选发生在 安装在容器外部的环形通道中(图9中的40)。

3.2交叉流动沉降分离器

在交叉流动沉降分离器中，依照本发明通道被设计为矩形通道。 装置具有包含通道、盖板和浓缩物回收容器的组件。

在该组件中，从发酵罐出来的流入物流被安排在通道的一侧，清 澈相出口在相对的另一侧。在流出和流入室里面可以构建板(49)来使 液体分布得到改善。板可以是平板或具有一定形状的板。这些板优选 被设计安装为接近并与流入和流出通道垂直。为了保证液体在所有通 道上的均匀分布，流入借助于圆形或扁平的扩散器在箱体中通道的上 游或下游发生。根据本发明，流动区利用专门的流体动力学试验采用 以下的方式设计，即在流速低于0.1m/s时得到无分离、层状流动， 并且在平行安装的通道上发生的是均匀分布。

除了从流入通道流入培养基以外，直接向圆锥形或金字塔形的接 收室(44)里供给一定量的发酵液可能是有利的。这一过程减少了细 胞在圆锥或金字塔形接收器(44)里的滞留时间。

在倾斜的通道下面安装了圆锥或金字塔形容器，在该容器中，浓 缩物再循环出口被装在其最低点的中心处。

交叉流动分离器具有以下有利特性：

·细胞的分离和再循环不受逆流流动的防碍，而在逆流系统的情 况下会发生。

·递减的浓缩物的平行流动促进了细胞从板上的下滑，特别是在 浓缩物返回流与清澈相流的比例qR/q大于2的情况下更是如此。

·在给定的同样的通道截面下，浓缩物的收集容器可以比用逆流 分离器的情况时更小，因为根据交叉流动分离器的设计，流入不在浓 缩物收集容器中发生。

·分离通道上游的接收室和其下游的流出室可以具有这样的外形 尺寸，即当按比例放大此过程时，随着分离器面积的增加，它们的体 积并不超比例地增加，这与逆流分离器相比代表了交叉流动分离器的 关键的优点。

·在这种分离器类型中，通道的长度可以比在逆流沉降分离器中 的更短。较小的通道长度，无逆流的存在和促进细胞下滑的返回流减 少了细胞在分离器中的滞留时间。

因此对于非常高的细胞密度，优选使用交叉流动分离器。

4、振动

为了加速细胞的再循环和防止通道结垢，可应用靠气动或电动操 作的振动器。它们优选安装在浓缩物回收容器的顶部或法兰盘上。

振动强度、振幅和频率与操作、培养条件和相关的细胞保留系统 相适合。振动强度优选在0.1到0.3g，振幅优选在0.1到1mm， 频率在20到50Hz。

5、旋风分离器、超声波分离系统和第二沉降装置的使用

为了初步的分离和减少沉降分离器中要被分离的细胞物质，可推 荐在沉降分离器的上游安装旋风分离器或超声波分离系统。这样的旋 风分离器可以分离细胞物质高达50％，多数是在低流速下进行的，也 就是对细胞只有较低的应力度。运用超声波分离系统也可获得类似的 效果，这种系统在市场上就可以买到(如Biosep来自Applikon， Schiedam，荷兰产)，它允许以技术上有利的灌注率进行部分分离。

由于较低的细胞浓度，在沉降分离器里，在随后的细胞分离过程 中可以获得改进的细胞再循环和较高的灌注率。因此这样才可能在较 高的细胞浓度下操作发酵罐并提高过程的生产率。

大的细胞附聚物的分离具有类似的正面效应，此分离通过安装在 沉降分离器的上游，优选下游，的较小的沉降装置实现。因为大的附 聚物包围了大量百分比的由基质供应不足(有限的扩散)造成的死细 胞，使这些死细胞比活细胞以更大的程度被去除，总的细胞计数被降 低同时存活率被提高。

6、泵、管道和热交换器：

发酵过程的连续操作需要三台泵。第一台泵是用来将基质引入发 酵罐，第二台泵是用来将细胞的悬浮液从发酵罐运输到沉降分离器 中，第三台泵则完成从分离器到收集容器的运输。对于运输细胞悬浮 液的这两台泵必须用低剪切泵，特别是第二台泵，这是为了不降低细 胞活力。依照本发明，使用低速正位移泵来以低脉动度运输悬浮液。 带有大泵管的真空胶管泵和非密封正位移泵导致的颗粒应力小于 0.01N/m2或小于0.004N/m2，被证明对无菌长时间操作是适合的。

允许在低滞留时间有效加热的螺旋热交换器被用于冷却细胞悬浮 液，使其温度在进入分离器之前低于发酵罐温度，并用于加热细胞悬 浮液，使其温度在再循环回发酵罐时达到发酵罐的温度。

装置的管道和连接件被设计为以下的方式，即只有细胞在管道中 流动的沉积极限以上的低流速，管中的弯管被减到最少并且截面逐渐 加宽。弯头件优选采用的是曲径与管直径的比例大于2。截面的加宽包 括带有半锥角达到6°的扩散器，优选达到4°。截面减小和相应的流 速增大必须加以限制，以便使得流速增加导致的惯性力保持很小。

本发明还涉及一套实现连续高细胞密度发酵的装置，其包括预培 养发酵罐(9)、基质储存罐(1)、生产发酵罐(2)、沉降分离器(4) 和收集容器(6)，其中沉降分离器具有的分离器面积基于分离器体积 之比Ath/Vs＞30m2/m3或更优选Ath/Vs＞70m2/m3。甚至更优选的分离 器表面积基于分离器体积之比为Ath/Vs＝50到100m2/m3。更优选沉 降分离器是逆流沉降分离器。在优选的实施方式中，分离器具有的绝 对表面积为Ath＝0.5m2到10m2并且仍然具有上述的高Ath/Vs比值。

本发明也涉及一套实现连续高细胞密度发酵的装置，其包括预培 养发酵罐(9)、基质储存罐(1)、生产发酵罐(2)、沉降分离器(4) 和收集容器(6)，其中沉降分离器具有圆锥形(32)或金字塔形接收 室(43)并且向沉降分离器的接收室的流入是借助于至少两个导管进 行的，这些导管成径向地(35)并在同一方向(39、42)或相反的方 向(41、43)成切线安装，它们被以矩形方式分布在截面上。

本发明也涉及到上面提到的装置，其中向沉降分离器的流入是借 助于导管进行的，这些导管在同一方向成切线安装并处于安装在接收 室外面的环形通道(40)里。

另外，本发明还涉及到高细胞密度发酵用的装置，其中向沉降分 离器的流入是借助于圆形扩散器(35)或扁平扩散器(39)进行的， 圆形扩散器具有最大为6°、更优选为4°的半锥角；扁平扩散器的周长 相关截面面积的纵向微分为0.1或更小，速度最大为0.1m/s。

另外，本发明还涉及一套实现连续高细胞密度发酵的装置，其包 括至少一个沉降装置，其中来自发酵罐(45、48)的流入入口和清澈 相(46)的出口被安装在沉降通道的各一边，浓缩物收集室(44)由 对称安装在沉降通道底部的金字塔形或圆锥形容器组成，其中在通道 中与滑下来的生物量相垂直地产生交叉流动。

另外，本发明所涉及的上面所述装置中，交叉流动沉降分离器的 组件宽(b1)和通道长(L)之比接近1。

另外，本发明所涉及的上面所述装置中，进入沉降分离器的接收 室的流入(35)发生在接收室底部以上大于接收室总高的一半并小于 接收室总高的0.8倍的几何高度。

此发明的一个变体包括由矩形组件(29)构成的沉降分离器，此 组件中个体通道(31)通过板(30)使其在空间上是彼此分开的，上 述板被制导安装在组件中的凹槽里，根据需要，它们可被装配或拆卸。

本发明也涉及上面所述装置，其中沉降分离器的矩形沉降通道或 沉降管路长为50cm或更长，相应的通道高度小于或等于10mm。

最优选的通道高度为4到6mm。据发现对于沉降特性和沉降器体 积，通道高度在4到6mm之间，为最佳高度。较小的通道高度导致了 更不利的沉降特性，同时大的通道高度导致了不适宜的高沉降器体 积。这些很小的通道高度不同于现有技术沉降器，例如，那些在废水 处理厂被用于淤渣再循环的沉降器。

本发明也涉及上面所述装置，其中沉降分离器的矩形通道或沉降 管道的长度，对于逆流分离器为50cm，对于交叉流动分离器为20cm 或更长，相应的通道高度小于或等于10mm。

另外，本发明还涉及上面所述装置，其中沉降分离器的平行板或 管道被安装在矩形组件里面，其截面高度(a)对截面宽度的(b1)的 比值近似地与装配状态组件的倾斜面(图15)和水平线的夹角的正弦 值相一致。

另外，本发明还涉及如上面所述装置，其中沉降分离器的平行板 或管道在其向上的表面上所具有的表面粗糙度小于Ra＝0.25um，或 这些表面被涂上疏水涂层或具有莲花效应的表面罩面层。

本发明也涉及到一套装置，其中沉降分离器的平行板或管道可被 施加特定频率和振幅的振动。

另外本发明也涉及一套实现连续高细胞密度发酵的装置，其包括 预培养发酵罐(9)、基质储存罐(1)、生产发酵罐(2)、沉降分离 器(4)和收集容器(6)，其中沉降分离器依照交叉流动原理操作(图 13、14)。

本发明也涉及实现连续高细胞密度发酵过程的装置，其中预培养 发酵罐(9)具有向下的渐缩的截面，预培养发酵罐(23)的搅拌器以 偏心的方式悬挂，预培养的充气是通过微喷射充气装置(25)实现的。

本发明也涉及实现连续高细胞密度发酵过程的装置，其中在生产 发酵罐中使用大面积的桨式搅拌器(13)和轴向充气的无气泡充气装 置(14)。充气装置(17)可被额外地结合到这些装置中，在靠近底 部(13a)的区域，桨式搅拌器的搅拌叶片可被渐缩。

除了桨式搅拌器，也可使用框式搅拌器。桨式或框式搅拌器具有 的优选直径最好大于容器直径的一半，更优选为容器直径的70％或80 ％。

本发明也涉及实现连续高细胞密度发酵过程的装置，其中安装了 大面积叶片搅拌器(18)和向外围方向倾斜的挡板(19)，它们与罐 壁，发酵罐底部和液体表面保持一定距离安装，在生产发酵罐中还安 装了进行微喷射的充气环(17)。

本发明最后也涉及实现连续高细胞密度发酵过程的装置，其中在 生产发酵罐中将大面积叶片搅拌器(21)以偏心的方式安装，又在生 产发酵罐中额外地结合了进行微喷射的充气环(17)。

本发明也涉及到一些装置，其中旋液分离器(11)或超声波分离 系统被安装在沉降分离器的上游，并且也涉及到一些装置，其中附聚 物分离器(12)被安装在沉降分离器(36)的再循环出口的下游。

本发明中所提到的附聚物分离器是将细胞附聚物从液体介质中移 除的装置，其操作例如依照沉降原理。附聚物分离器允许细胞附聚物 从连续流动的介质流中的分离。

本发明也涉及到一些装置，其中通流热交换器(3)于每种情况中 被安装在发酵罐的出口和沉降分离器的入口之间以及沉降分离器浓缩 物出口(36)和发酵罐再循环入口之间。

然而本发明也涉及实现连续高细胞密度发酵过程的方法，其中使 用了本发明的装置。该方法可通过使用单级预培养来实现，预培养通 过至少间歇地按分批进料过程来实现，由于分批进料，其中预培养物 体积至少增加到初始体积的5倍。预培养也可通过作为带有细胞再循 环的连续过程间歇地被实现。

在本发明的方法中，预培养也可能作为一个连续的过程来实现， 同时以细胞再循环作为生产培养基，以在相对长的时间内为下一个主 培养或同时平行进行的主培养提供种子。

(示意图的简要说明)

在下面，在示意图的帮助下，更具体地描述本发明的生产实例。

图1：过程装置，包括基质储存罐(1)、泵(8)、管道(7)、 生产发酵罐(2)、通流热交换器(3)、带有振动器(5)的细胞保留 系统(4)、和收集容器(6)，预培养发酵罐(9)和培养基管(10)。

图2：该过程装置的一部分，包括泵、通流热交换器、旋风分离器 或超声波分离系统和安装在装置中央并带有振动器的细胞保留系统， 安装在下游的沉降罐。

图3：A型搅拌发酵罐，包括桨式搅拌器和对硅酮管充气的充气笼。

图4：B型搅拌发酵罐，包括大面积桨叶搅拌器，浸没的、倾斜的 靠近搅拌器的挡板，被安装在靠近底部位置的微喷射装置。

图5：C型搅拌发酵罐，包括以偏心的方式安装的大面积桨叶搅拌 器和安装在靠近底部的微喷射装置。

图6：接种发酵罐。

图7：逆流沉降分离器，带有平行安装的管道，并且径向流入进入 锥形接收室

图8：逆流沉降分离器，带有平行安装的通道，并且径向流入进入 锥形接收室。

图9：逆流沉降分离器，带有平行安装的通道，切线方向流入以同 一流向进入到环形通道(40)中，此环形通道被安装在圆锥形接收室 的外侧。

图10：逆流沉降分离器，带有平行安装的通道，切线方向流入以 相反方向进入圆锥形接收室。

图11：逆流沉降分离器，带有平行安装的通道，两个分开的相反 方向的切线流入液流进入圆锥形接收室。

图12：逆流沉降分离器，带有平行安装的通道，两个分开的相反 方向的切线流入液流进入金字塔形接收室。

图13：交叉流动沉降分离器，带有平行安装的通道，来自发酵罐 的入流的入口(45)和清澈相出口(46)分别安装在通道的各一边， 金字塔形接收室(44)安装在通道的下面。

图14：交叉流动沉降分离器，带有平行安装的通道，来自发酵罐 的入流的入口(48)和清澈相出口(46)分别安装在通道的各一边， 圆锥形或金字塔形接收室(44)安装在通道的下面。挡板(49)安装在 接近流入通道(48)和流出通道(46)的位置，优选与流入通道和流出通 道相垂直安装。

图15：沉降分离器的几何形状。

实施例

实施例1

使用40升发酵罐，通过基于膜的氧供给和附加的喷射以及逆流细 胞保留，进行杂交瘤细胞连续培养。

该方法装置根据图1和图2，包括储存罐(1)，里面装有1g/L 人血清白蛋白(HAS)的营养培养基，三台泵速度为3-30l/h的泵， 其中至少那些接触细胞悬浮液的泵为低剪切管泵，管道(7)，具有40 升操作体积的连续灌注发酵罐(2)，根据图8的重力逆流沉降分离器 (4)，其理论分离表面积为Ath＝0.56m2(Ath＝zb1 L cosα；z：通 道数，b1：通道宽度，L：通道长度，α：通道与垂直方向的夹角)，其 中通道长度为L＝630mm，其它尺寸为z＝16；b1＝111mm；α＝60°，气动控 制振动器(5)，其向分离器施加加速度为b＝0.1g的振动。

因为沉降面积基于分离器体积的高比值(Ath/Vs 63m2/m3)，所以 逆流分离器是高效的。

根据图3，发酵罐为搅拌发酵罐，带有低速桨式搅拌器(13)和硅 酮管固定片(14)，其比表面积为65m2/m3。桨式搅拌器(13)的四个 桨叶与硅酮管(16)的距离为8mm，并且延伸至固定片(14)的整个 高度。根据图3，除了硅膜，带0.5mm孔的环形喷射器(17)被安装 在接近底部的位置。如果细胞浓度超过2·107细胞/毫升，将进行表面 气体速度最高达2m/h的附加氧喷射。

在试运行大约12天以后，细胞浓度可达30到50·107活细胞/毫 升。细胞发酵罐沉降系统的这一拟稳态条件在灌注率为6.9发酵罐体 积每天时获得。在此灌注率下，所用的细胞分离器所具有的活细胞平 均保留度为R＝94.5％，死细胞的平均保留度为Rd＝92％，这样正 好可以在长时间的长期操作中保证这样的细胞浓度，而细胞存活率(活 细胞数对总细胞数的比例)在75％和85％之间，抗体浓度在100mg/L。 70天以后培养结束。

实施例2

使用100升的发酵罐，通过膜基供氧和逆流细胞保留系统，进行 BHK细胞连续培养。

该方法的装置根据图1和图2，包括储存罐(1)，里面装有带有 1g/l HAS的营养培养基，三台泵速度为20-100l/h的泵，其中至少 那些接触细胞悬浮液的泵为低剪切管泵，管道(7)，其直径大于10mm， 具有100升填充体积的连续灌注发酵罐(2)，通流热交换器(3)， 其比热交换表面积大于300m2/m3，重力逆流沉降分离器(4)，其理论 分离表面积为Ath＝1.4m2，其中通道长度为L＝960mm，其它尺寸为 z＝20；b1＝148mm；α＝60°(参见图8)，气动控制的振动器(5)，其对分 离器施加加速度为b＝0.2g的振动。由于高比沉降面积 (Ath/Vs＝77m2/m3)，逆流分离器是高效的。从发酵罐出来的温度为37 ℃的发酵液被热交换器冷却到20℃再进入细胞分离器，然后进入发酵 罐之前再加热到37℃。

根据图3，发酵罐为搅拌发酵罐，带有低速桨式搅拌器(13)和硅 酮管固定片(14)，其比传质表面积为33m2/m3。桨式搅拌器(13)的 四个桨叶与硅酮管(16)的距离为10mm，并且延伸至固定片(14)的 整个高度。在搅拌器转速为20r.p.m.，相应的输入功率为15W/m3， 当使用纯氧并且内部管压为2bar时，对于1.5到2×107活BHK细胞 /m3的培养，可获得充分的氧输入。

对于1.5到2×107活BHK细胞/毫升的营养物的供给，10发酵罐 体积/d的灌注率是必要的。所用细胞分离器的平均活细胞保留度为R ＝97％，并且观察到的增长率为μ＝0.4/d时，正好可以在3个月时间 的长期操作中保证这样的细胞浓度，而细胞存活率大于Vi＝90％。

通过在细胞分离器里面的较低温度可以获得培养物的高细胞存活 率。大约10天以后可获得稳态培养条件。

实施例3

CHO细胞的连续培养，使用微喷射和逆流细胞保留，200L发酵罐。

此过程装置根据图1和图2包括储存罐(1)，里面装有带有1g/L pluronic的营养培养基，三台输送能力为20-100l/h的泵(8)，其 中至少那些接触细胞悬浮液的泵为低剪切排带泵(8)，管道(7)， 其直径大于15mm，具有200升填充体积的连续灌注发酵罐(2)，通 流热交换器(3)，其比热交换表面积大于300m2/m3，根据图14的重 力逆流沉降分离器，其理论分离表面积为Ath＝2.4m2，其中通道长度 为L＝960mm，其它尺寸为z＝26；b1＝194mm；α＝60°，根据图11，电驱 动的振动器(5)，其对分离器施加加速度为0.2g的振动。

由于沉降面积基于分离器体积的高比值(Ath/Vs＝84m2/m3)，所以 逆流分离器是高效的。

根据图4，发酵罐为搅拌发酵罐，被大面积装有多级叶片的叶轮 (18)搅拌，直径比为0.6，倾斜挡板(19)与罐壁、液面和底部没 有接触。环形分布器安装在接近底部的位置，分布器装有8个金属烧 结板，具有0.5微米的小孔尺寸和10毫米的直径。在表面氧速度仅为 0.2m/h，和搅拌器转速为25r.p.m.时，其相应的输入功率为9W/m3， 获得了足以培养4×107活BHK细胞/毫升的充分的氧输入。

对于4×107活CHO细胞/毫升的营养物的供给，4发酵罐体积/d 的灌注率是必要的。对于这一灌注率，所用细胞分离器的平均活细胞 保留度为R＝90％。观察到的细胞的增长率为μ＝0.4/d时，则在110 天的长期操作中保证这种细胞浓度是可能的。在整个培养时间里细胞 的存活率保持大于90％。起始阶段15天以后可获得高细胞密度的稳态 条件。

实施例4

HSK细胞在无HAS的培养基中的连续培养，使用微喷射和交叉流动 细胞保留，200L发酵罐。

该方法的装置根据图1和图2，包括储存罐(1)，里面装有带有 1g/L pluronic的营养培养基，三台输送能力为75-300l/h的泵(8)， 其中至少那些接触细胞悬浮液的泵为低剪切排带泵(8)，管道(7)， 其直径大于15mm，具有200升填充体积的连续灌注发酵罐(2)，通 流热交换器(3)，其比热交换表面积大于200m2/m3，根据图14的重 力交叉流动沉降分离器，其理论分离表面积为Ath＝2.8m2，其中通道 长度为L＝345mm，其它尺寸为z＝46；b1＝345mm；α＝60°，电驱动的振 动器，其对分离器施加加速度为0.1g的振动。

由于沉降面积基于分离器体积的高比(Ath/Vs＝75m2/m3)，并且如 实施例1-3所用的逆流系统，通道长度短很多，所以根据图14的交 叉流动分离器是高效的。

根据图3，发酵罐为搅拌发酵罐，被大面积装有多级叶片的叶轮 (18)搅拌，直径比为0.6，倾斜挡板(19)与罐壁、液面和底部没 有接触。环形分布器安装在接近底部的位置，分布器装有8个金属烧 结板，具有0.5微米的小孔尺寸和10毫米的直径。在表面氧速度仅为 0.15m/h，和搅拌器转速为25r.p.m.时，其相应的输入功率为9W/m3， 获得了足以培养3×107活BHK细胞/毫升的充分的氧输入。

对于3×107活BHK细胞/毫升的营养物的供给，15发酵罐体积/d 的灌注率是必要的。所用细胞分离器的平均活细胞保留度为R＝96.8 ％。观察到的细胞的增长率为μ＝0.5/d时，正好可以在100天的长期 操作中保证这样的这种细胞浓度。在整个培养时间里细胞的存活率保 持大于95％。起始阶段12天以后可获得高细胞密度的稳态条件。

灌注率越高，增长率越高，并且与实施例1-3相比，交叉流动分 离器原理导致了培养物的存活率增加，这导致细胞在分离器中的更短 的停留时间。

该方法包括一个特殊设计和根据图6操作的接种发酵罐，其填充 体积小于生产发酵罐体积的6％，其允许在两周里细胞计数大约增加 120到150倍。接种本身开始于用50毫升的小瓶接种，起始体积为2 升。2周以后体积添加到5L，4周以后添加到12L。在最初的4天里， 发酵罐以分批方式运行，5天以后以连续的方式运行。最终细胞浓度为 2到2.5·107活细胞/毫升，仅12天以后就足够满足200L发酵罐的接 种。用于接种发酵罐连续发酵的细胞保留系统被设计为，根据图9，理 论分离表面面积Ath＝0.12m2，其中通道长度为500mm。

实施例5

湍性剪切应力τ的测定。

低剪切泵被用于此过程中。泵是通过特殊的泵测试来选择的，其 中泵所产生的应力以一种模型实验中使用合适的模型颗粒系统来测 试，该模型颗粒系统具有与含水发酵培养基相关的已知界面表面张力 σ。经过长时间的泵送确定了均衡的颗粒直径dp，其给出了泵所施加的 最大湍性剪切应力τ＝σ/dp。如果此颗粒系统的均衡直径与发酵过程所 用的细胞或细胞附聚物的直径不同，则通过应用各向同性湍动理论原 理，就能测定泵所产生的应力。湍性剪切应力是根据分散范围定律来 计算的，即τ细胞/τ微粒模型＝d细胞/d微粒模型。