放疗(RT)是癌症患者频繁使用的治疗方式。RT的目的是对肿瘤递送细胞 毒剂量，同时使周围正常组织接触的辐射最小化。然而，放射性肺炎是一种严 重的并有可能致命的RT的治疗相关并发症，且RT诱导的肺炎是一种最严重 的剂量限制毒性，尤其是对于因肺癌而接受RT的患者。症状性放射性肺炎的 发病率大致占放疗或化放疗的10％到30％(Robnett TJ等(2000)Int J Radiat Oncol Biol Phys第48卷，89-94；Seppenwoolde Y等(2003)Int J Radiat Oncol Biol Phys第55卷，724-735)。肺炎症状通常直到治疗结束1-3个月后才出现。 治疗后数月到数年也可能出现晚期纤维变性。肺纤维化是肺组织响应最初的组 织损伤而逐步(历经数月到数年)发生的永久瘢痕形成，并导致氧气传递的永久 损伤。预计随RT进行的化疗能通过辐射敏化提供系统控制同时能增强局部控 制。尽管一些研究支持这种联合治疗的益处[Dillman等(1996)J.Natl.Cancer Inst.第88卷，1210-1215；Furuse等(1999)J.Clin.Oncol.第17卷，2692-2699]， 但不幸的是，这是以提高急性正常组织毒性为代价的[Byhardt等(1998)Int.J. Radiat.Oncol.Biol.Phys.第42卷，469-478；Bradley等(2005)Int.J.Radiat. Oncol.Biol.Phys.第61卷，318-328]。
目前还没有通常可被接受的方法来预测个体患上放射性肺炎的风险。因 此，需要有测定癌症患者是否可能对放射性肺炎易感的方法。这种方法将有助 于改进治疗以使放射损伤程度最小，同时提供可能的放射性肺炎早期预防性干 预。
发明概述
本发明提供了一种鉴定个体是否可能对放射性肺炎易感的方法。该方法包 括从个体获得包含红细胞的生物样品并测定样品中谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) 活性和/或超氧化物歧化酶(SOD)活性的量。相对于正常对照有低GPX或高 SOD活性表明个体可能对放射性肺炎易感。本发明还利用了以下发现，即 GPX/SOD活性之比是放射性肺炎易感性的有力预测指标。具体地说，GPX/SOD 之比低于正常对照表明个体可能对放射性肺炎易感。
本发明还能够确定癌症患者的治疗方案，这是由于正常的GPX和SOD水 平表明个体是侵袭性放疗的候选对象，而那些被鉴定为对放射性肺炎易感的个 体治疗时可采用较小的放射剂量、更加集中的辐射、不采用RT、或者本领域 技术人员已知的其他RT改进方案。
附图简述
图1A-1D提供了全身辐照后C3H/HeN小鼠中SOD、GPX和CAT活性以 及谷胱甘肽含量变化的图示。对于这些图，小鼠用10戈瑞(Gy)单次照射。在 照射后2、6和24小时时测量肺(左图)中SOD(总量、MnSOD和CuZnSOD)(图 1A)、GPX(图1B)和CAT(图1C)的活性。还在相同时间点测量了RBC(右图) 中SOD(图1A)、GPX(图1B)和CAT(图1C)的活性。肺组织和RBC的总谷胱 甘肽含量(图1D)表示为相当于GSH+2GSSG总和的GSH。结果表示为平均值± 标准差(n＝10)。标准差的显著性通过斯氏t检验测定。与未照射的对照(Con) 相比，*P<0.05，#P<0.05，或+P<0.05。
图2A和2B提供了未患肺炎的肺癌患者与患上肺炎的肺癌患者SOD和 GPX活性的比较。将未患肺炎与患有肺炎的患者的红细胞(RBC)的SOD(图2A) 和GPX(图2B)活性单独绘图。方框表示25％和75％(分别为下边缘和上边缘)， 方框内的线表示中值。各时间点评价的中值和患者数示于表2。虚线末端的点 为非逸出值的最大点或最小点。逸出值(圆圈)按照患者连续编号单独绘制。
图3A提供了肺癌患者GPX/SOD之比的分布的图示。将治疗前(Pre)和治 疗期间的GPX/SOD活性之比绘图(图3A)。空心圆圈，未患肺炎的患者；实心 三角，患有肺炎的患者。图3B提供了通过Western印迹分析探测到的SOD、 GPX和CAT蛋白含量的图示。从治疗前RBC样品取等量蛋白质(50μg用于分 析SOD，100μg用于分析GPX，80μg用于分析CAT)进行分析。Western印迹 总共采用30μg作为GAPDH加样对照。
发明详述
本发明提供了一种鉴定个体是否可能对放射性肺炎易感的方法。放射性肺 炎是一种熟知的病症，它可由本领域技术人员按照常规参数如由放射治疗肿瘤 学小组(RTOG，Radiation Therapy Oncology Group)建立的标准或欧洲癌症研究 和治疗组织(EORTC，European Organization for Research and Treatment of Cancer)指南进行诊断。本方法基于以下发现，即在人类患者以及肺炎敏感型 C3H/HeN小鼠模型中，SOD和GPX活性的差异能预测个体是否可能会响应 RT发生放射性肺炎。通过测量小鼠的肺组织和RBC以及已经用RT治疗的人 类RBC中这些酶的活性，已经发现这些酶的活性出现巨大差异则预示易患放 射性肺炎。具体地说，与那些未患放射性肺炎的人类患者相比，患上放射性肺 炎的那些人类患者在基线时显示出较高SOD和较低GPX活性。SOD和GPX 活性的这种不平衡在整个RT治疗期始终出现。对GPX/SOD活性之比进行分 析可进一步提高肺炎预测的灵敏度和特异性。因此，本发明提供了一种有力的 工具，包括监测SOD和GPX活性以确定患者是否可能对放射性肺炎易感。据 此，还可通过本发明的方法鉴定不大可能对放射性肺炎易感的个体。
该方法包括从个体获得包含红细胞的生物样品并测定GPX、SOD的酶活 性或其组合。测得相对于正常对照有低GPX活性或高SOD活性表明该个体如 果用RT治疗则可能易患放射性肺炎。测得GPX或SOD活性与正常对照相同， 或者SOD活性低于正常对照，或者GPX活性高于正常对照，表明该个体不大 可能对放射性肺炎易感。
可按照本领域技术人员熟知的常规技术测定GPX和SOD的酶值。这种技 术的一些例子描述于Park等(2001)J.Biol.Mol.Biochem.第34卷，544-550， 和Park等(1998)Free Radic.Biol.Med.第25卷，79-86，其中有关测定酶活性 的描述纳入本文作为参考。
为进行本方法，还可测量个体的GPX或SOD活性水平，或者其组合，并 将该活性与正常对照进行比较。“正常对照”是指从RT后未患放射性肺炎的个 体测得的GPX和SOD酶活性。正常对照可以各种形式提供，如标准曲线、从 RT后未患放射性肺炎的个体测得的平均SOD和GPX酶活性，或者RT后未患 放射性肺炎的个体特征性的各种酶活性。这些同样的测量值可用来建立 GPX/SOD酶活性之比的正常对照。患有或未患放射性肺炎的个体的GPX和 SOD活性的典型值示于本发明的实施例和图中。这种酶活性的一些例子包括但 不限于：GPX活性低于14.7mol/分/mg以及SOD活性为6.4单位/mg或更大， 它们各自表示个体可能对放射性肺炎易感。
在一个实施方式中，GPX/SOD活性之比被用作个体是否可能对放射性肺 炎易感的指标。在该实施方式中，GPX/SOD之比低于正常对照表明个体可能 对放射性肺炎易感。这种比例的例子包括但不限于GPX/SOD活性之比约为0.5 或更低。本领域技术人员将了解，测定反比(即，SOD/GPX活性)是本发明的一 种替代方法，其作用相同。
GPX和SOD的酶活性可从包含红细胞(RBC)的任何生物样品测得。RBC 可采用熟知的常规方法从个体分离。可以在RT之前、之中或之后由个体获得 包含RBC的生物样品，并进行分析。
由于已知放射性肺炎是由RT造成的，因此预计本发明适用于因任何类型 的癌症而要进行RT的个体，所述癌症可以是胸腔的原发癌或已转移到胸腔的 癌症。这种癌症的非限制性例子包括，例如，实体瘤，如肺肿瘤(小细胞和非 小细胞)、食管肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、卵巢肿瘤、黑 色素瘤、泌尿系统肿瘤、子宫肿瘤、子宫内膜肿瘤、胰腺肿瘤、头颈肿瘤、口 腔肿瘤、甲状腺肿瘤、胃肿瘤、脑和其他神经系统肿瘤、以及肝脏肿瘤，和/ 或血液癌，如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性及其他白血病、以 及骨髓瘤，包括那些有可能要对个体进行全身照射的血液疾病，如骨髓移植候 选个体。
在另一个实施方式中，通过确定个体可能或不可能对放射性肺炎易感将能 够确定可用于制订推荐疗法并用于治疗患者的治疗方案。例如，对于非小细胞 肺癌，常规的分次RT包括每天一次每次1.8-2.0Gy，每周进行5天，使总剂量 达到60-66Gy，同时进行化疗。尽管对肿瘤进行足够照射是成功治疗所必需的， 但用这种放射剂量治疗肿瘤的结果仍旧较差，曾经估计要高达80-100 Gy才能 根除肺癌的大肿瘤体(Fletcher G.(1973)Br J Radiol S46：1-12)。然而，造成放射 性肺炎的风险限制了采用这种剂量升高的尝试。因此，本发明提供了一种测定 放射性肺炎易感性的方法，预计采用这种方法肿瘤学家将能够定制放疗体积 (volume)、剂量、并选择合适的辅佐化疗。例如，根据本发明方法确定患者患 放射性肺炎的风险低则可将放疗剂量升高以提高根除肿瘤的可能性并提高患 者存活率。此外，目前，由于放射性肺炎造成的严重影响，通常需要中断治疗 或降低剂量，这就限制了RT的成功。还已知由于肺炎而中断RT将显著降低 肺癌患者的整体存活率(Jeremic B等(2003)Lung Cancer第40卷，317-323)。 此外，由于例如感染或吸烟史患放射性肺癌风险已知的患者，通常会被给予 30-60 Gy的较低辐射剂量，对于某些类型的癌症，如对于非小细胞肺癌，这种 剂量是适合控制肿瘤的次佳剂量。为解决这一问题，用本发明方法鉴定为可能 对放射性肺炎易感的患者可用诸如带有呼吸门控的强度可调放疗(IMRT)、立体 定向放疗、质子粒子束疗法或螺旋断层摄影疗法(helical tomotherapy)等放射技 术治疗，以便限制对正常肺组织的照射，同时维持类似的或改进的肿瘤覆盖 (Suit H.(2002)Int J Radiat Oncol Biol Phys第53卷，798-809)。另一种方法是 对正常肺组织进行照射但同时给予本领域技术人员已知的具有细胞保护活性 的放射保护药以减低辐射损伤的严重性。例如，数据显示，氨磷汀、血管紧张 素-转化酶(ACE)抑制剂、己酮可可碱或褪黑素能够使患者接受他们的预定放疗 剂量同时降低肺炎风险(Antonadou D等(2003)J Radiat Oncol Biol Phys第57 卷，402-408；Wang LW等(2000)Radiat Res第153卷，405-410；Ozturk B等 (2004)Int J Radiat Oncol Biol Phys第5卷，213-219；Vijayalaxmi等(2004)Int J Radiat Oncol Biol Phys第59卷，639-653)。因此，预计本发明能使医师为被 鉴定为对放射性肺炎可能易感或者不易感的患者定制疗法、修改治疗强度、或 给予放射保护剂。
以下实施例用来阐述而非限制本发明。
实施例1
该实施例比较了放射性肺炎-敏感型C3H/HeN小鼠中肺组织和RBC的抗 氧化剂防御系统
为获得该实施例中的数据，使用雄性C3H/HeN小鼠(5-6周龄)。自交 C3H/HeN小鼠表现出的肺损伤模式与照射时人的肺损伤类似[Franko等(1991) Radiat.Res.第126卷，349-356；Chiang等(2005)IntJ.Radiat.Oncol.Biol.Phys. 第62卷，862-871]。用4MV质子束(MeVatron，西门子(Siemens)，德国)进行 全身照射(10Gy)。按照标准方法并基本如前所述[Park等(2001)J.Biol.Mol. Biochem.第34卷，544-550]计算用0.2Gy/分的剂量率在40cm照射范围内小 鼠中等深度的辐射剂量。在照射后的规定时间将小鼠处死并取出肺。将组织洗 涤并立即用干冰冷却的钳子通过冻钳法(freeze-clamping)冷冻。通过心脏穿刺将 血液抽入含50μl抗凝血剂柠檬酸葡萄糖溶液(巴克斯特(Baxter)，迪菲尔德 (Deerfield)，伊利诺伊州)的试管中。在4℃通过离心(1800g，5分钟)将红细胞 与血浆分离并用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次。组织和RBC样品-80℃储存直至分 析。
为开始试验，让动物接受伪照射或单次10Gy全身照射，并在照射后2、 6和24小时处死动物。首先测量经照射的肺的SOD(总量、MnSOD和 CuZnSOD)、GPX和CAT活性。酶活性按照之前描述的方法[Park等(2001)J. Biol.Mol.Biochem.第34卷，544-550，和Park等(1998)Free Radic.Biol.Med. 第25卷，79-86]测量，尽量不要进行改变。简言之，总超氧化物歧化酶(SOD) 活性通过监测550nm下含50mM磷酸钾(pH7.5)、0.1mM黄嘌呤、0.5毫单位 (munit)/ml黄嘌呤氧化酶、0.1mM EDTA和10M细胞色素c的反应混合物中 细胞色素c的减少来测量。1单位SOD代表能抑制50％细胞色素c减少的酶活 性。取等份样品，加入5mM KCN抑制CuZnSOD活性以便测定MnSOD活性 [Spitz等(1989)Anal.Biochem.第179卷，8-18]。将总SOD活性减去MnSOD 活性来评价CuZnSOD活性。谷胱甘肽过氧化物酶活性通过监测340nm下含 50mM磷酸钾(pH7.4)、1mM EDTA、1mM NaN3、0.2mM NADPH，1单位/ml 谷胱甘肽还原酶和1mM GSH的反应混合物中NADPH的氧化来测量。加入 0.25mM H2O2以启动该反应。过氧化氢酶活性通过监测240nm下含50mM磷 酸钾(pH7.0)和10mM H2O2的反应混合物中H2O2的清除来测量。还原和氧化 的谷胱甘肽按照之前的描述[Baek等(2000)J.Cell.Physiol.第183卷. 100-107；Park等(1998)Free Radic.Biol.Med.第25卷，79-86]通过HPLC来 测量。总谷胱甘肽含量表示为相当于GSH+2GSSG总和的GSH。
如图1A-1D左图所示，MnSOD和CuZnSOD(图1A)、GPX(图1B)和CAT (图1C)活性早在照射后2小时时便升高，伴随的是总谷胱甘肽含量降低(图1D)。 图1A-1D右图显示了RBC中SOD、GPX、CAT和谷胱甘肽响应照射发生改变 的情况。由于成熟RBC缺乏线粒体，因此RBC的SOD活性主要是CuZnSOD 产生的。这就证明，除了CAT，肺和RBC中的变化相互极其类似。总之，肺 中的SOD和GPX活性以及谷胱甘肽水平高于RBC。CAT活性水平在肺和RBC 中是类似的。然而，RBC的CAT活性在试验过程中不响应照射而发生改变。
实施例2
该实施例阐述了与按照本发明方法对人类患者的分析结合使用的选择、治 疗和统计方法。
募集具有手术不可切除的IIIA-IIIB期非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。该研 究采用按照研究机构伦理委员会(IRB，Institutional Review Board)批准的临床程 序同时进行化放疗的患者的血样。登记前获得所有患者的知情同意书。为使潜 在的混淆因素最小化，仅包括那些同时接受确定放疗和紫杉醇系化疗的患者。 如果患者已经接受诱导放疗、化疗或之前的胸部放疗则被排除在外。具有不良 的东部协作肿瘤组织(ECOG，Eastern Cooperative Oncology Group)表现状态(2 或更高)或患有慢性阻塞性肺病(COPD)的患者也被排除。疾病分期评估包括病 史、身体检查、胸部X-射线照射、以及静脉内造影CT(包括胸部和从肝脏到肾 上腺的上腹部)。该研究分析了在2003年9月到2005年4月间募集的总共15 名符合条件的患者。
胸部放疗包括每天递送2Gy，每周5次，总治疗期为6周。在基线时收 集患者的血样，然后在6周的治疗期内每周收集一次。收集后1小时内，样品 在4℃ 1800g离心10分钟。细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，等分，并-80 ℃储存直至分析。处理结束时，将各患者的连续RBC样品一起分析。在治疗 后1和3个月时按照RTOG/EORTC指南诊断放射性肺炎[Cox等(1995)Int J. Radiat.Oncol.Biol.Phys.第31卷，1341-1346]。大致标准如下：0级，与基线 相比无变化；1级，轻微症状，具有轻微X光照片表现；2级，中等症状，具 有低度发热和X光照片中出现斑块；3级，严重症状，具有密集X光照片变化； 4级，严重的呼吸功能不全，需要辅助通气。分级肺炎时不了解抗氧化剂数据。
为评价各测试变量的预测值，进行了区别分析[Rao，C.R.Linear statistical inference and its applications(线性统计推理及其应用).纽约：威利出版社 (Wiley)；1973]，分析采用计算机软件包SAS(8.2版本)。计算后验概率时采用 广义平方距离(generalized square distance)和多元正态分布，每个变量的先验概 率为0.5。为评价该分类标准，基于已经建立的“省略一个(leave-one-out)”交 叉核实法[Lachenbrnch等(1968)Technometrics第10卷，1-10]获得差错率估 值。对每个观察结果重复这种省略一个过程，并对错误分类的观察结果进行计 数以得到差错率估值。灵敏度计算为通过交叉核实法正确分类的肺炎患者的比 例。特异性计算为通过交叉核实法正确归类的未患肺炎的患者的比例。
实施例3
该实施例提供了治疗前和治疗期间对患者RBC中GPX和SOD活性的分 析。
为测试是否可用放射性肺炎易感性校正RBC酶活性的差异，在治疗前和 治疗期间连续收集同时接受放疗和化疗的非小细胞肺癌患者的血液。总共15 名符合条件的患者之前未经治疗，患有III期疾病并具有良好表现状态(0，1) 和正常器官功能。这15名患者的特征总结于表1。基于RTOG/EORTC标准， 15名患者中的8人在治疗结束后3个月内出现肺炎症状。
表1

aIMRT：强度可调的放疗
当分析存在或不存在肺炎时的酶活性时，出现了显著差异(striking difference)。SOD活性在肺炎组较高(图2A)，对于GPX则相反(图2B)。如表2 所示，该表比较了有和没有肺炎的患者的SOD和GPX活性，SOD活性的治疗 前中值和范围在无肺炎组为3.7(3.4-5.0)，而肺炎组为6.8(6.4-7.1)(P＝0.0192)。 对于GPX，无肺炎和有肺炎患者的治疗前活性水平分别为16.5(14.7-20.6)和 10.7(10.2-14.8)(P＝0.0379)。这些差异在治疗的每一周都存在。
表2

aP值通过Wilcoxon双样本检验获得
第2、4和6周的SOD活性值以及第6周的GPX值刚好没有统计显著性。 由于高SOD水平和低GPX活性水平与肺炎发生有关，我们接下来检测了两组 之间的GPX/SOD活性之比。结果更加突出(治疗前P＝0.0046)。如图3A所示， 可以方便地看到两组之间的显著差异。由于从一开始便检测到两组之间SOD 和GPX活性的差异，我们检测了这是否还在这些酶的稳态蛋白质水平中得到 反映。治疗本身未对SOD或GPX活性造成任何明显改变。如图3B的Western 印迹数据显示，RBC中存在的SOD、GPX或CAT蛋白的量在有或没有肺炎的 患者中没有显著区别。这些Western印迹分析用患者RBC的蛋白质提取物，通 过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳采用标准技术和市售试剂一式两份进行分析。
谷胱甘肽是一种主要的小分子抗氧化剂。已知谷胱甘肽水平会影响动物和 人的急性辐射效果[Park等(2001)J.Biol.Mol.Biochem.第34卷，544-550； Bhattathiri等(1994)Int J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.第29卷，383-386]。我们 未发现两组之间的GSH或GSSG变化动力学或者CAT活性有统计学显著性差 异(数据未显示)。
实施例4
该实施例分析了本发明在预测用RT治疗的人类患者的肺炎易感性时中的 灵敏度和特异性。
为评价SOD和GPX活性或者GPX/SOD比值的分类(无肺炎和有肺炎)性 能，进行区别分析[Rao，C.R.线性统计推理及其应用.纽约：威利出版社； 1973]。为评价该分类标准，基于省略一个交叉核实法[Lachenbruch等(1968) Technometrics第10卷，1-10]获得差错率估值。每个变量的分类能力示于表3， 该表列出了SOD和GPX活性以及GPX/SOD活性相对比值的测试性能特征。 用似然比标准计算变量的统计学显著性。GPX/SOD之比的P值小于SOD或 GPX活性的P值，表明GPX/SOD之比的区别能力大于单独的SOD或GPX活 性。分类性能的灵敏度和特异性还示于表3。
表3

aP值通过基于Wilk λ的F统计(Fstatistics based on Wilk’s Lambda)获得。
由于SOD和GPX活性差异能在治疗开始前预测发生肺炎的风险，我们测 试了在治疗期间重复测量这些酶的活性能否改进预测价值。为此目的，采用逻 辑回归分析了直到规定周时与治疗前中值相比较高SOD水平的频率。类似地， 以单变量方式分析了相比治疗前中值较低GPX水平的频率。检测了叫做Akaike 信息标准(AIC，Akaike information criterion)的模型拟合统计量，其中较小的值 表示有较好的模型拟合[24]。发现SOD的AIC在第1周降低(从治疗前的18.7 降至15.8)，但在第2周(16.4)和第3周(17.4)略微升高。对于GPX，AIC直到 第3周都逐渐降低，但AIC降低程度在第2周之后较小(治疗前，21.4；第1 周，19.1；第2周，16.4；第3周，15.8)。当检测GPX/SOD比值时，在第1 周出现数据点的准完全分离；即，通过GPX/SOD比值能完全分开肺炎的发病 率，但单独的GPX/SOD值则不能。因此，在治疗开始后至多1或2周监测便 足以预测肺炎。
已经通过具体实施方式描述了本发明。然而，对组成、方法和装置的常规 修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的，且这种修饰应包含在本发明范围 之内。
本申请要求2006年5月31日提交的美国临时申请序列号60/810,072的优 先权，其内容通过引用纳入本文。
本工作受到国立卫生研究院(National Institutes of Health)第CA109480号 和第CA16056号基金支持。政府对本发明享有一定权利。