一种用于荧光成像介导的光热和化学联合肿瘤治疗的光热试
剂的制备方法及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 抗肿瘤药物(anti-tumor drug)为治疗肿瘤
疾病的一类药物。国际上临床常见的抗肿瘤药物约80余种，大致可分为以下6类：细胞毒类药物、
激素类药物、
生物反应调节剂、单克隆
抗体药物、其他类药物、辅助药。其中细胞毒类药物由分为作用于DNA化学结构的药物、影响核酸合成的药物、作用于核酸转录的药物、作用于DNA复制的拓扑异构酶Ⅰ
抑制剂和主要作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成的药物和其他细胞毒药，这六类药物。
[0003] 阿霉素是一种作用于核酸转录的药物，又称为多柔比星，可抑制RNA和 DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。恶性淋巴瘤，可作为交替使用的首选药物。
乳腺癌、肉瘤、
肺癌、膀胱癌等其他各种癌症都有一定疗效，多与其他抗癌药联合使用。此药物现主要为口服、腔内注射或者膀胱内注射。由于其过量使用易造成严
重心脏毒性、血小板及白细胞减少和肝功能损害，因此其使用剂量受到严格控制。
[0004] 靶向药物(也称作靶向制剂)是指被赋予了靶向(Targeting)能
力的药物或其制剂。其目的是使药物或其载体能瞄准特定的病变部位，并在目标部位蓄积或释放有效成分。靶向制剂可以使药物在目标局部形成相对较高的浓度，从而在提高药效的同时抑制毒
副作用，减少对正常组织、细胞的伤害。
[0005]
近红外光热治疗剂是指利用在近红外光区具有较高光热转换效率的试剂，将其通过血管注射入生物内部，利用靶向性识别技术聚集在肿瘤组织附近，并在近红外光的照射下将光能转化为
热能来杀死癌细胞的一种治疗试剂。但是目前的光热治疗剂的靶向性差、近红外区吸收能力差等特点，限制了光热治疗剂在临床中的应用。
[0006] 吲哚菁绿(ICG)是唯一被美国食品药品监督管理局(FDA)批准，可用于临床使用的近红外荧光
造影剂。在临床上，ICG被广泛应用于对肝功能、心输出量、
视网膜的脉管系统的辅助诊断。它还能作为荧光探针发射
波长为820nm 的近红外荧光，同时能作为感光剂，吸收光能并将其转
化成热能或产生单线态
氧，进而杀伤肿瘤细胞。然而，ICG在
水溶液中很不稳定、在血液循环中容易被快速清除，分子间容易形成二聚体导致荧光淬灭。这些不足严重限制了ICG在肿瘤诊断及治疗方面的应用。研究人员近年来尝试利用各类纳米载体搭载ICG，以期提高其
稳定性、延长其血液循环时间并赋予其肿瘤靶向性。
[0007] 脂质体作为药物载体，具有可
生物降解、无免疫原性、无毒性和特异性肿瘤靶向等优点，利用脂质体搭载药物可提高药物的治疗指数、降低药物剂量并降低毒副作用。近年来脂质体作为药物载体的研究已取得长足的进步，已有研究发现将HSA包覆于脂质体表面可降低微粒对巨噬细胞的亲和力，从而延长循环时间提高靶向性。
[0008]
碳点的特点为易溶于水、毒性低、绿色环保、研制成本低、可生物相容等优点，是一种新型碳基零维材料，也是一种制备新型光热治疗剂的理想材料，但由于碳点尺寸小，不能通过静脉注射有效的进入到肿瘤部位。
[0009] 但目前并未涉及将碳点和
荧光染料(ICG)双重靶向近红外光热治疗剂及其与
化学治疗联合使用治疗肿瘤的报道。
发明内容
[0010] 为了克服
现有技术中存在的
缺陷，本发明通过将小分子抗癌药物阿霉素、小分子荧光染料吲哚菁绿(ICG)和光热治疗试剂碳点共同包裹于具有靶向功能的热敏性脂质体中，实现了荧光成像介导的光热治疗和化疗联合肿瘤治疗；具体为提供一种用于荧光成像介导的光热治疗和化疗联合肿瘤治疗的热敏性脂质体包封小分子染料吲哚菁绿、光热治疗试剂碳点和小分子抗癌药物阿霉素的复合纳米颗粒的制备方法。
[0011] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：
[0012] 本发明的第一个目的是提供一种用于荧光成像介导的光热肿瘤治疗的光热试剂的制备方法，所述光热试剂为热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒，所述制备方法包括：
[0013] 步骤a)称量二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、氢化大豆磷脂(HSPC)、高纯胆固醇(CHO)、二硬脂酰基磷脂酰
乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、吲哚菁绿，于氯仿和甲醇混合溶液中溶解，旋转
蒸发除去
有机溶剂，并进一步干燥得到薄脂质膜；
[0014] 步骤b)将步骤a)得到的薄脂质膜在含有碳点的
硫酸铵溶液中水化，对水化溶液进行超声处理以形成均匀的悬浮液，将所述悬浮液通过脂质体挤出器挤出，使用凝胶层析柱除去游离的吲哚菁绿和碳点，获得中间液；
[0015] 步骤c)向步骤b)获得的中间液中加入含有碳点的硫酸铵溶液在
旋转蒸发仪里水化，水化结束后超声处理，使其充分分散，用脂质体挤出器将其挤出，将挤出后的溶液以
磷酸盐缓冲液为
透析液透析，获得脂质体溶液；
[0016] 步骤d)将阿霉素和步骤b)中获得的脂质体溶液共孵育过夜，采用凝胶分离柱分离去除游离的阿霉素，收集得到的洗脱液为热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点 -阿霉素复合纳米颗粒。
[0017] 为了进一步优化上述制备方法，本发明采取的技术措施还包括：
[0018] 进一步地，所述二棕榈酰基卵磷脂、氢化大豆磷脂、高纯胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、吲哚菁绿的摩尔比为40～60：20～30：10～20： 2～4：0.5～2，混合后总磷脂浓度为5～60mg/mL；所述氯仿和甲醇的体积比为3～5： 1；所述步骤d)中阿霉素和脂质体溶液的体积比为0.5～2：1。
[0019] 进一步地，所述步骤b)和所述步骤c)中，所述旋转蒸发
温度、水化温度、超声处理温度均为40～60℃，所述水化时间均为1～4小时，所述超声处理时间均为3～8分钟。
[0020] 进一步地，所述步骤b)中，所述碳点在硫酸铵溶液中的浓度为200 ～800μg/mL；所述步骤c)中，所述碳点在硫酸铵溶液中的浓度为1～4mg/mL。
[0021] 进一步地，所述步骤b)和所述步骤c)中，所述脂质体挤出器均为滤膜为 100nm的聚碳酸酯滤器，所述挤出次数均为20～60次。
[0022] 进一步地，所述步骤b)中，所述凝胶层析柱为sephadex G-150柱；所述步骤c)中，所述透析包括采用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)作为
透析液透析 0.5～2天，脂质体挤出器挤出的脂质体溶液与磷酸盐缓冲液的体积比为1： 150～300，透析液更换3次；所述步骤d)中，所述凝胶分离柱葡聚糖G-150凝胶分离柱，其采用磷酸盐缓冲液作为洗脱液分离，脂质体先于游离小分子阿霉素被洗脱。
[0023] 进一步地，所述中间液和脂质体溶液均需低温保存，保存温度为2～8℃。
[0024] 进一步地，所述制备方法具体包括以下步骤：
[0025] 步骤1)称量二棕榈酰基卵磷脂、氢化大豆磷脂、高纯胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、吲哚菁绿摩尔比为50:25:15:3:1，总磷脂浓度为 10～40mg/mL，加入4mL的氯仿和1mL的甲醇混合溶液中溶解，在55℃下旋转蒸发除去
有机溶剂，并进一步干燥得到薄脂质膜；
[0026] 步骤2)将步骤1)得到的薄脂质膜在10ml含有浓度为500μg/mL碳点和 200mM的硫酸铵溶液中于55℃水化2小时，在55℃下超声处理该水化溶液5 分钟以形成均匀的悬浮液，并通过滤膜为100nm的聚碳酸酯滤器挤出60次，使用sephadex G-150柱除去除游离的吲哚菁绿和碳点，获得中间液，并于4℃保存；
[0027] 步骤3)向步骤2)得到的中间液中加入5mL含有浓度为2mg/mL的碳点和200mM的硫酸铵溶液在旋转蒸发仪里水化1h，转速为100rpm，温度 55～60℃；水化结束后超声3～5min，使其充分分散，并用滤膜为100nm的聚碳酸酯滤器将其
挤压20次，将挤压后的溶液以pH＝7.4的磷酸盐缓冲液为透析液透析1天，脂质体溶液与磷酸盐缓冲液的体积比为1：200，透析液更换3次，去除游离的吲哚菁绿和碳点，获得脂质体溶液，并于4℃保存；
[0028] 步骤4)将1mL阿霉素和1mL步骤3)中合成的脂质体溶液在55～60℃下共孵育过夜，用葡聚糖G-150凝胶分离柱分离孵育液，用磷酸盐缓冲液洗脱，以除去游离的阿霉素(用PBS洗脱，脂质体将会优先洗脱下来，小分子阿霉素则会较晚洗脱)，收集得到的洗脱液为热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒。
[0029] 本发明的第二个目的是提供一种由任一上述的制备方法制得的热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒。
[0030] 本发明的第三个目的是提供一种任一上述的热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点- 阿霉素复合纳米颗粒在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
[0031] 进一步地，所述肿瘤包括但不限于：肺癌，胃癌，结肠癌，食管癌，肝癌，乳腺癌，
宫颈癌，
口腔癌、淋巴癌、
前列腺癌、恶性淋巴瘤等。
[0032] 可理解的是，上述碳点为本领域中任一合适的近红外一区和近红外二区响应的碳点。
[0033] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0034] 本发明为了提高抗肿瘤药物的靶向性和在体内的肿瘤抑制效率，设计了一种封装阿霉素的热敏脂质体包覆的碳
量子点纳米颗粒，其可作为高效的诊断治疗试剂用于荧光成像介导的化疗-光热
联合治疗。首先在制备脂质
薄膜时添加吲哚青绿荧光染料，随后将其与碳点一起包覆在热敏性脂质体中，并且使用硫酸铵梯度法，将阿霉素封装在其亲水核中，通过利用脂质体的被动靶向能力，不仅可以有效延长其血液循环时间，而且可以在肿瘤部位有效富集。到达肿瘤组织后,在激光的照射下，碳点可以吸收激光的
能量并转化为热能，随后热敏性脂质体温度升高后会释放出ICG和阿霉素，从而实现光热治疗和化疗的联合肿瘤治疗。
附图说明
[0035] 图1为本发明一
实施例中热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素的扫描电镜图；
[0036] 图2为本发明一实施例中碳点、热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点和热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素的吸收
光谱图；
[0037] 图3为本发明一实施例中在1064nm激光照射5分钟的条件下，热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒的红外热成像图。
[0038] 图4为本发明一实施例中a)游离DOX对Hela细胞存活率的影响的示意图； b)热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒对Hela细胞存活率的影响的示意图；c)热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒在0.8W/cm2 光照5分钟条件下对Hela细胞存活率的影响的示意图。
[0039] 图5为本发明一实施例中a)肿瘤治疗期间肿瘤体积的变化的示意图，通过静脉注射生理盐水、热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒，在功率
密度为0.6W/cm2的条件下用1064nm激光照射5min。肿瘤体积每隔一天测量一次，静脉注射生理盐水、游离的阿霉素和用相同功率激光照射肿瘤(无光热治疗碳点)作为阴性对照；b)肿瘤治疗期间裸鼠的体重变化的示意图；
[0040] 图6为本发明一实施例中热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素的长期毒性评估的示意图，各实验组后在治疗结束后取出主要器官进行
组织学分析。
具体实施方式
[0041] 本发明涉及一种用于荧光成像介导的光热肿瘤治疗的光热试剂的制备方法，所述光热试剂为热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点复合纳米颗粒，所述制备方法包括：步骤a)称量二棕榈酰基卵磷脂、氢化大豆磷脂、高纯胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、吲哚菁绿，于氯仿和甲醇混合溶液中溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，并进一步干燥得到薄脂质膜；步骤b)将步骤a)得到的薄脂质膜在含有碳点的硫酸铵溶液中水化，对水化溶液进行超声处理以形成均匀的悬浮液，将所述悬浮液通过脂质体挤出器挤出，使用凝胶层析柱除去游离的吲哚菁绿和碳点，获得中间液；步骤c)向步骤b)获得的中间液中加入含有碳点的硫酸铵溶液在旋转蒸发仪里水化，水化结束后超声处理，使其充分分散，用脂质体挤出器将其挤出，将挤出后的溶液以磷酸盐缓冲液为透析液透析，获得脂质体溶液；步骤d)将阿霉素和步骤b)中获得的脂质体溶液共孵育过夜，采用凝胶分离柱分离去除游离的阿霉素，收集得到的洗脱液为热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒。本发明还涉及上述复合纳米颗粒的应用。
[0042] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0043] 实施例1
[0044] 本实施例为碳点以及热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒的较佳制备方法。
[0045] 本实施例制备的碳点为近红二区响应碳点，其包括如下制备步骤：
[0046] 1)将4g芘加入到320mL浓
硝酸中，80℃冷凝回流32h，用去离子水不断稀释得到的混合物洗涤溶液中的酸，最后用220nm的滤膜除去大的颗粒物，然后烘干得到三硝基芘粉末。
[0047] 2)取第一步所得到的三硝基芘0.1g，将1.6g聚乙烯亚胺溶于10mL去离子水并且与三硝基芘搅拌混匀，放入
微波反应器，200℃反应1.5min。
[0048] 3)将步骤2得到的黑色液体通过220nm滤膜，将滤液转到二氯甲烷相，用中性氧化
铝层析柱进行过滤去除为反应的小分子有机物，然后烘干得到黑色粉末，即近红二区响应碳点，备用。
[0049] 本实施例制备的含有上述近红二区响应碳点的热敏性脂质体-吲哚菁绿-光热治疗碳点复合纳米颗粒的制备步骤包括：
[0050] a)称量二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、氢化大豆磷脂(HSPC)、高纯胆固醇 (CHO)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、吲哚菁绿摩尔比为 50:25:15:3:1，总磷脂浓度为10～40mg/mL，加入4mL的氯仿和1mL的甲醇混合溶液中溶解。然后在55℃下旋转蒸发除去有机溶剂，并进一步干燥所得的薄脂质膜。
[0051] b)将得到的薄脂质膜在含有碳点(500μg/mL)的(NH4)2SO4溶液(10mL， 200mM)中于55℃水化2小时。然后通过在55℃下浴超声处理该溶液5分钟以形成均匀的悬浮液，并通过聚碳酸酯滤器(100nm)挤出60次。最后，使用 sephadex G-150柱除去游离的吲哚菁绿和碳点，并保存在4℃，得到中间液；
[0052] c)将得到的薄脂质膜在5mL含有浓度为2mg/mL的碳点和200mM的硫酸铵溶液在旋转蒸发仪里水化1h，转速为100rpm，温度55～60℃。水化结束后超声3～5min，使其充分分散。然后用滤膜为100nm的脂质体挤出器将其挤压 20次。将挤压后的溶液以磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)为透析液透析1d，溶液与PBS的体积比为1：200，透析液更换3次。将透析好的溶液放入4℃
冰箱里保存，得到脂质体溶液(即热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点复合纳米颗粒)；
[0053] 步骤d)将1mL阿霉素和1mL步骤3)中合成的脂质体溶液在55～60℃下共孵育过夜，用葡聚糖G-150凝胶分离柱分离孵育液，用磷酸盐缓冲液洗脱(用 PBS洗脱，脂质体将会优先洗脱下来，小分子阿霉素则会较晚洗脱)，以除去游离的阿霉素，收集得到的洗脱液为热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒。
[0054] 实施例2
[0055] 本实施例为实施例1的热敏性脂质体-吲哚菁绿-光热治疗碳点复合纳米颗粒的另一较佳制备方法，其包括如下步骤：
[0056] a)称量二棕榈酰基卵磷脂(DPPC)、氢化大豆磷脂(HSPC)、高纯胆固醇 (CHO)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、吲哚菁绿摩尔比为 40:30:10:4:1，总磷脂浓度为10～40mg/mL，加入4.5mL的氯仿和1mL的甲醇混合溶液中溶解。然后在55℃下旋转蒸发除去有机溶剂，并进一步干燥所得的薄脂质膜。
[0057] b)将得到的薄脂质膜在含有碳点(600μg/mL)的(NH4)2SO4溶液(10mL， 200mM)中于60℃水化1.5小时。然后通过在60℃下浴超声处理该溶液8分钟以形成均匀的悬浮液，并通过聚碳酸酯滤器(100nm)挤出60次。最后，使用 sephadex G-150柱除去游离的吲哚菁绿和碳点，并保存在3℃，得到中间液；
[0058] c)将得到的薄脂质膜在5mL含有浓度为4mg/mL的碳点和200mM的硫酸铵溶液在旋转蒸发仪里水化1.5h，转速为100rpm，温度60℃。水化结束后超声6min，使其充分分散。然后用滤膜为100nm的脂质体挤出器将其挤压20 次。将挤压后的溶液以磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)为透析液透析1.5天，溶液与PBS的体积比为1：250，透析液更换4次。将透析好的溶液放入3℃冰箱里保存，得到脂质体溶液(即热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点复合纳米颗粒)；
[0059] c)将得到的薄脂质膜在5mL含有浓度为3mg/mL的碳点和200mM的硫酸铵溶液在旋转蒸发仪里水化1.5h，转速为100rpm，温度58℃。水化结束后超声4min，使其充分分散。然后用滤膜为100nm的脂质体挤出器将其挤压20 次。将挤压后的脂质体溶液以磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)为透析液透析1.5 天，脂质体溶液与PBS的体积比为1：300，透析液更换3次。将透析好的脂质体溶液放入3℃冰箱里保存，得到热敏性脂质体-吲哚菁绿-光热治疗碳点复合纳米颗粒；
[0060] 步骤d)将1.5mL阿霉素和1mL步骤3)中合成的脂质体溶液在55℃下共孵育过夜，用葡聚糖G-150凝胶分离柱分离孵育液，用磷酸盐缓冲液洗脱，以除去游离的阿霉素(用PBS洗脱，脂质体将会优先洗脱下来，小分子阿霉素则会较晚洗脱)，收集得到的洗脱液为热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒。
[0061] 实施例3
[0062] 对实施例1中制备的碳点、热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点、热敏性脂质体- 吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒的相关性能进行如下研究：
[0063] (1)热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒体外联合治疗性能评估：
[0064] 通过MTT法对经热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒处理后的细胞进行细胞活度的检测，将Hela细胞种到96孔板中，每孔的密度为5000 个，培养24小时，培养4小时后，用0.6W/cm2的1064nm
激光器照射5分钟，然后，将细胞再孵育24小时或48小时，进行MTT测定以测量细胞活力。
[0065] (2)热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒体内联合治疗性能评估：
[0066] 将100μL(100万)的4T1细胞皮下接种于3-5周的雌性裸鼠腋窝处，带肿瘤体积长到100-200mm3时，将裸鼠分为4组(每组5只)：(1)生理盐水、(2) 游离的阿霉素、(3)生理盐水+光照(0.6W/cm2、1064nm)；(4)热敏性脂质体 -吲哚菁绿-碳点-阿霉素(0.6W/cm2、1064nm)。
通过静脉注射(200μL)到荷瘤小鼠体内，每隔一天测量肿瘤的体积大小每天记录裸鼠的体重。
[0067] (3)体内长期毒性的评估：
[0068] 将Balb/c小鼠分为4组(每组5只)，每组分别注射(1)生理盐水、(2)游离的阿霉素、(3)生理盐水+光照(0.6W/cm2、1064nm)；(4)热敏性脂质体- 吲哚菁绿-碳点-阿霉素(0.6W/cm2、1064nm)。在第18天处死小鼠，将心、肝、脾、肺、肾等器官取出，
组织切片后
染色、拍照，进行组织学分析。
[0069] 对上述碳点、热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素经仪器检测进行表征、 MTT法测定其细胞毒性以及在体内通过静脉注射方式治疗肿瘤等相关实验，其结果如图1～图6所示，具体如下：
[0070] 由图1可知，热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素的粒径为100nm左右。
[0071] 由图2可知，热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素在可见光到近红外二区均有明显的吸收。
[0072] 由图3可知，热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒在0.6W/cm2功率下照射5分钟，肿瘤部位的温度明显升高。
[0073] 由图4可知，游离的阿霉素表现出明显的细胞毒性，而脂质体复合后的纳米颗粒没有表现出明显的细胞毒性；在1064nm激光照射的条件下，热敏性脂质体 -吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒表现出明显的细胞毒性。
[0074] 由图5可知，静脉注射热敏性脂质体-吲哚菁绿-碳点-阿霉素复合纳米颗粒后，在0.6W/cm2功率下照射5分钟，肿瘤增长比阴性对照组慢，肿瘤体积减小直至消失；在整个治疗过程中，单独静脉注射阿霉素的裸鼠体重明显下降，其他治疗组裸鼠体重基本保持不变。
[0075] 由图6可知，各治疗组对小鼠的主要器官均没有明显的病理性损伤。
[0076] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同
修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
