基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物及制备
专利汇可以提供基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物及制备专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了基于丝素蛋白用于 乳腺癌 靶向联合化疗的纳米药物及制备。以再生丝素蛋白为载体，用 溶剂 挥发法制备同时载有姜黄素（CUR）和五氟尿嘧啶（5-FU）的纳米药物，并在其表面修饰靶向分子透明质酸（HA）。该 纳米粒子 具有较小的 水 合粒径（198.0±1.8nm），较好的尺寸均一性（PDI：0.097），较高的载药量（CUR：2.1%；5-FU：1.7%），分散性好、不易团聚，方便构建多功能的载药丝素蛋白纳米粒子。本发明得到的基于丝素的靶向纳米药物能有效抑制 肿瘤 细胞增殖 ，提高抗癌药物在细胞内的浓度。表面修饰的透明质酸（HA），增强了单一药物对乳腺癌的 治疗 效果，在 癌症治疗 中实现了协同效应。，下面是基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物及制备专利的具体信息内容。
1.基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物，其特征在于，所述的纳米药物包含两种抗肿瘤药物、丝素蛋白和靶向肿瘤部位的药物，所述的两种抗肿瘤药物为姜黄素（Curcumin， CUR）和五氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU），所述的丝素蛋白为从新鲜蚕茧中提取出的再生丝素蛋白以及在纳米药物中作为具有良好生物相容性的载体材料，所述的靶向肿瘤部位的药物为透明质酸（Hyaluronan acid，HA）；所述的基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
（1）蚕茧经弱碱溶液脱胶后，用溴化锂溶液完全溶解，在经去离子水透析后得到再生丝素蛋白；
（2）将再生丝素蛋白溶解在二次水中，室温水化过夜，得到水化后的再生丝素蛋白；
（3）称取适量姜黄素（Curcumin， CUR）和五氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU），然后完全溶解在甲醇中，得到溶解有CUR和5-FU的甲醇溶液；
（4）在涡旋条件下将步骤（2）得到的水化后的再生丝素蛋白滴加到步骤（3）得到的溶解有CUR和5-FU的甲醇溶液中，此时溶液变浑浊成乳浊液，得到含CUR和5-FU的乳浊液；所述的水化后的再生丝素蛋白与溶解有CUR和5-FU的甲醇溶液的体积比为1:5；
（5）将步骤（4）得到的含CUR和5-FU的乳浊液涡旋3 min；
（6）将步骤（5）得到的乳浊液立刻放入冰浴中，探头超声1 min，超声10 s，暂停2 s；
（7）将步骤（6）得到的乳浊液旋转蒸发30 min，蒸发掉大部分有机溶剂甲醇；
（8）将步骤（7）得到的乳浊液在通风橱中搅拌3 h，使有机溶剂充分挥发完全；
（9）将步骤（8）得到的乳浊液低速离心后收集上清液；
（10）将步骤（9）得到的上清液高速离心后，弃去上清液，收集粒子；
（11）将步骤（10）收集的粒子重新悬浮在醋酸缓冲液中，加入透明质酸（Hyaluronan acid，HA）修饰液，室温搅拌反应2 h，然后探头超声1 min/次，超声3次，超声10 s，暂停2 s，得到HA修饰的丝素纳米粒子悬浮液；
（12）将步骤（11）得到的HA修饰的丝素纳米粒子悬浮液低速离心后收集上清液，上清液再次探头超声1 min，超声10 s，暂停2 s；
（13）将步骤（12）得到的上清液高速离心后，弃去上清液，收集粒子；
（14）将步骤（13）得到的粒子用二次水悬浮，加入0.1克/毫升的海藻糖（Trehalose）溶液，二次水和海藻糖溶液体积比为1:1；
（15）将步骤（14）的纳米粒子冷冻干燥后保存于-20℃，得到基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物。
2.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，溴化锂溶液浓度为9.5 M。
3.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，溶解有CUR和5-FU的甲醇溶液中CUR浓度为0.5 毫克/毫升，5-FU浓度为0.5 毫克/毫升。
4.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）、（11）和步骤（12）中，探头超声的振幅为60%。
5.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤（9）和步骤（12）中，低速离心的速率为6000 rpm ，低速离心的时间是10 min。
6.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤（10）和步骤（13）中，高速离心的速率为13000 rpm，高速离心的时间为20 min。
7.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤（11）中，醋酸缓冲液pH为6.0。
8.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤（15）中，冷冻干燥是按照以下方法进行：在-80℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24～36 h。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物。
10.根据权利要求9所述的基于丝素的靶向联合化疗纳米药物在治疗乳腺癌方面的医学应用。
基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物及制备
技术领域
背景技术
3. Xiao, B.; Zhang, M. Z.; Viennois, E.; Zhang, Y. C.; Wei, N.; Baker, M. T.; Jung, Y. J.; Merlin, D. Inhibition of MDR1 gene expression and enhancing cellular uptake for effective colon cancer treatment using dual-surface-functionalized nanoparticles. Biomaterials 2015, 48, 147-60.）。
275-284.; 3. Tian W, Liu J, Guo Y, et al. Self-assembled micelles of
amphiphilic PEGylated rapamycin for loading paclitaxel and resisting
multidrug resistant cancer cells[J]. J Mater Chem B Mater Biol Med, 2015, 3(7):1204-1207.）。为了克服这些难题，临床医生采用组合多种药物为基础的联合化疗方案，这是攻克肿瘤多药耐受性的一种有效途径。通过调节每种药物的剂量，多种药物同时给药不仅能够延缓癌症的适应过程和相关的肿瘤细胞突变、减少药物的副作用，还能达到协同治疗效果。
发明内容
（2）将再生丝素蛋白溶解在二次水中，室温水化过夜，得到水化后的再生丝素蛋白；
（3）称取适量姜黄素（Curcumin， CUR）和五氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU），然后完全溶解在甲醇中，得到溶解有CUR和5-FU的甲醇溶液；
（4）在涡旋条件下将步骤（2）得到的水化后的再生丝素蛋白滴加到步骤（3）得到的溶解有CUR和5-FU的甲醇溶液中，此时溶液变浑浊成乳浊液，得到含CUR和5-FU的乳浊液；所述的水化后的再生丝素蛋白与溶解有CUR和5-FU的甲醇溶液的体积比为1:5；
（5）将步骤（4）得到的含CUR和5-FU的乳浊液涡旋3 min；
（6）将步骤（5）得到的乳浊液立刻放入冰浴中，探头超声1 min，超声10 s，暂停2 s；
（7）将步骤（6）得到的乳浊液旋转蒸发30min，蒸发掉大部分有机溶剂甲醇；
（8）将步骤（7）得到的乳浊液在通风橱中搅拌3 h，使有机溶剂充分挥发完全；
（9）将步骤（8）得到的乳浊液低速离心后收集上清液；
（10）将步骤（9）得到的上清液高速离心后，弃去上清液，收集粒子；
（11）将步骤（10）收集的粒子重新悬浮在醋酸缓冲液中，加入透明质酸（Hyaluronan acid，HA）修饰液，室温搅拌反应2 h，然后探头超声1 min/次，超声3次，超声10 s，暂停2 s，得到HA修饰的丝素纳米粒子悬浮液；
（12）将步骤（11）得到的HA修饰的丝素纳米粒子悬浮液低速离心后收集上清液，上清液再次探头超声1 min，超声10 s，暂停2 s；
（13）将步骤（12）得到的上清液高速离心后，弃去上清液，收集粒子；
（14）将步骤（13）得到的粒子用二次水悬浮，加入0.1克/毫升的海藻糖（Trehalose）溶液，二次水和海藻糖溶液体积比为1:1；
（15）将步骤（14）的纳米粒子冷冻干燥后保存于-20℃，得到基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物。
具体实施方式
（1）蚕茧经弱碱溶液脱胶后，用溴化锂溶液完全溶解，在经去离子水透析后得到再生丝素蛋白；
（2）将再生丝素蛋白溶解在二次水中，室温水化过夜，得到水化后的再生丝素蛋白；
（3）称取适量姜黄素（Curcumin， CUR）和五氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU），然后完全溶解在甲醇中，得到溶解有CUR和5-FU的甲醇溶液；
（4）在涡旋条件下将步骤（2）得到的水化后的再生丝素蛋白滴加到步骤（3）得到的溶解有CUR和5-FU的甲醇溶液中，此时溶液变浑浊成乳浊液，得到含CUR和5-FU的乳浊液；所述的水化后的再生丝素蛋白与溶解有CUR和5-FU的甲醇溶液的体积比为1:5；
（5）将步骤（4）得到的含CUR和5-FU的乳浊液涡旋3 min；
（6）将步骤（5）得到的乳浊液立刻放入冰浴中，探头超声1 min，超声10 s，暂停2 s；
（7）将步骤（6）得到的乳浊液旋转蒸发30min，蒸发掉大部分有机溶剂甲醇；
（8）将步骤（7）得到的乳浊液在通风橱中搅拌3 h，使有机溶剂充分挥发完全；
（9）将步骤（8）得到的乳浊液低速离心后收集上清液；
（10）将步骤（9）得到的上清液高速离心后，弃去上清液，收集粒子；
（11）将步骤（10）收集的粒子重新悬浮在醋酸缓冲液中，加入透明质酸（Hyaluronan acid，HA）修饰液，室温搅拌反应2 h，然后探头超声1 min/次，超声3次，超声10 s，暂停2 s，得到HA修饰的丝素纳米粒子悬浮液；
（12）将步骤（11）得到的HA修饰的丝素纳米粒子悬浮液低速离心后收集上清液，上清液再次探头超声1 min，超声10 s，暂停2 s；
（13）将步骤（12）得到的上清液高速离心后，弃去上清液，收集粒子；
（14）将步骤（13）得到的粒子用二次水悬浮，加入0.1克/毫升的海藻糖（Trehalose）溶液，二次水和海藻糖溶液体积比为1:1；
（15）将步骤（14）的纳米粒子冷冻干燥后保存于-20℃，得到一种基于丝素蛋白用于乳腺癌靶向联合化疗的纳米药物。
受试材料 ：载两种药物的丝素蛋白纳米粒子；
实验方法 ：将处于对数生长期的4-T1细胞用胰酶消化后，用完全培养基调整细胞浓度
5
为1×10 /mL ，200μL/孔，加入96 孔板中，于 37度、5 % CO2的孵箱中培养12 h。过夜培养后（在倒置显微镜下观察，单个孔的底部60%-70%长满细胞）吸去培养基，用冷的含Ca2+、Mg2+ 的PBS洗一遍，将药物悬浮于基础培养基中，稀释成不同浓度(药物浓度设置为1.0 μM，2.0 μM，4.0 μM，8.0 μM，16.0 μM，32.0 μM，64.0 μM），每个药物的浓度设5组平行，每孔加200 μL 的药物悬液。此外每个孔板都需要设置两组对照组，Negative Control组，加200 μL基础培养基，Positive Control组，加200 μL用无菌水稀释的1%的Triton X-100。分别培养24 h 或48 h，用冷的含Ca2+、Mg2+ PBS洗一遍，加入100 μL 0.5 mg/mL MTT溶液继续避光孵育4 h后，去掉上清, 各孔分别加入50 μL DMSO，振荡器震荡150 rpm，15 min，酶标仪570 nm测定OD值，根据OD值分别计算肿瘤细胞的相对活性。
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