技术领域
[0001] 本
发明采用现代分析检测仪器检测中药制剂技术领域，涉及一种治疗银屑病的口服液的质量控制方法。
背景技术
[0002] 银屑病是一种反复发作的慢性
皮肤病，具有遗传倾向，感染、应激、压
力等多因素刺激诱导的以红斑鳞屑为皮损表现。目前全球已有银屑病患者1.25亿，我国至少有400万的银屑病患者，因其难治疗、易复发、具有遗传性，并能显著增加患者心脑血管等重大
疾病的发病率，导致患者出现严重的心理压力、自卑、失落，甚至自杀倾向，极大程度地影响了患者的生存质量。银屑病病因与发病机制非常复杂，目前尚无完全根治的手段，现代医学主要采用皮质类固醇
激素、维A酸类、甲
氨蝶呤(MTX)、糖皮质激素和
生物制剂等。大多数疗法毒
副作用严重，不宜长期使用；生物制剂价格昂贵，尚需进一步进行远期安全性评估。中医学在治疗银屑病方面占有重要的地位，积累了丰富的治疗经验，可有效缓解症状、减少复发率、控制发展，且毒副作用低、价格适宜、适合长期使用。
[0003] 治疗银屑病的中药银屑灵方是广东省中医院临床治疗银屑病的专用药物(批号：粤Z20080123)，是国医大师禤国维教授经验之方。银屑灵优化方(PSORI-CM01)是
发明人由银屑灵方化裁，由土茯苓、赤芍、肿节
风、甘草等7味药材组成，方以活血化瘀，凉血消斑，除湿止痒为主要功效。
申请发明人通过大量临床
基础研究发现：PSORI-CM01具有调剂免疫、抗
细胞增殖和止痒的功效，还能降低银屑病患者皮损面积、改善皮损严重程度。(卢传坚，刘凤年.银屑灵片中药提取液对
肿瘤坏死因数-α刺激后
角朊细胞分泌细胞因子IL-8的影响[J].辽宁中医杂志，2009，36(11)：1862-1863；卢传坚，闫玉红.银屑灵止痒作用的实验研究[J].中国药房.2008，19(6)：409-410；余靖宏，赵瑞芝，卢传坚.银屑灵优化方对银屑病豚鼠及炎性刺激角质形成细胞增殖的影响[J].中华中医药杂志，2013，05：1531-1534；
Lu Chuan-jian，XIANG Yu，XIE Xiu-li，etc.A Randomized Controlled Single-Blind Clinical Trial on 84Outpatients with Psoriasis Vulgaris by Auricular Therapy Combined with Optimized Yinxieling Formula(PSORI-CM01)[J].Chinese Journal of Integrative Medicine，2012，03：186-191.)。
[0004] 随着科学的发展，分析仪器的普及应用，使中药复方检测分析和质量控制不断提高和完善。其中高效液相色谱检测分析技术在中药质量控制中发挥越来越重要的作用。它是通过
光谱色谱等分析手段对中药或复方进行成分检测，利用不同成分特有的化学图谱，反映中药或复方所含的内在化学成分的种类和含量。
[0005] PSORI-CM01由赤芍、肿节风、土茯苓等7味药材组成，其活性成分较多，依据2010版中国药典，各组分药材的色谱条件与系统适用性试验方法各不相同，逐一测定复方中各药材的目标成分含量，不利于整体上评价和控制复方中药的质量，难以保证其药效成分的
稳定性和数量。
发明内容
[0006] 本发明目的在于根据现代技术，提供一种治疗银屑病的中药口服液的快速、高效质量控制方法，从整体上评价和控制口服液质量，保证治疗银屑病中药的疗效更加稳定、可靠。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现：
[0008] 一种治疗银屑病中药口服液的质量控制方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
[0009] (1)用薄层色谱法
鉴别该药物中药材赤芍，包括：
[0010] a.供试样品的制备：取本品口服液10mL倒入分液漏斗，加
乙醇10mL，振摇提取3次，合并提取液，
水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，取上清液作为供试品溶液；
[0011] b.对照药材溶液的制备：取赤芍对照药材粉末0.1g，加乙醇10mL，超声提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为赤芍对照药材溶液；
[0012] c.赤芍薄层色谱鉴别：照薄层色谱法试验，分别吸取对照药材溶液和样品溶液各2μL，分别点于同一
硅胶G薄层板上，以三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、
甲酸的质量比例为40∶5∶10∶0.2作为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草
醛溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰，白光下检视；
[0013] (2)用薄层色谱法鉴别该药物中药材土茯苓，包括：
[0014] a.供试样品的制备：取本品口服液10mL，放入分液漏斗，加乙醇10mL，振摇提取3次，合并提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，取上清液作为供试品溶液；
[0015] b.对照药材溶液的制备：取土茯苓对照药材1mg，加甲醇20mL，超声提取30min，提取液滤出，挥干，加甲醇1mL溶解作为对照药材溶液。取落新妇苷对照品1mg，甲醇溶解制成1mg/mL对照品溶液；
[0016] c.土茯苓薄层色谱鉴别：依照薄层色谱法试验，分别吸取土茯苓对照药材溶液-落新妇苷对照品溶液-供试样品3种溶液2μL，0.5μL，1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以
甲苯、乙酸乙酯、甲酸的质量比例为13∶32∶9作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％AlCl3溶液，放置20分钟后，置紫外光灯下检视；
[0017] (3)用高效液相色谱法测定药物中
绿原酸、异嗪皮啶、芍药苷、落新妇苷和黄杞苷的含量，包括：
[0018] a.高效液相色谱条件：Inertsil ODS-3色谱柱，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇A-甲酸水，梯度洗脱为0～10min 30％A→35％A、10～45min 35％A→45％A、45～60min 45％A→75％A，平衡时间15min，流速0.8mL/min，进样量10μL，柱温24℃，PDA检测器采集范围：190～400nm；检测
波长330nm和230nm；
[0019] b.供试品溶液的配制：取PSORI-CM01
处方剂量，常规水煎提取，前2次，每次1小时，第3次45分钟，合并提取液，用纱布过滤，减压回收得粗提液，加去离子水定容至每毫升药液含1g原药，用去离子水稀释5、10和15倍；
[0020] c.对照品溶液的制备：精密称取绿原酸、异嗪皮啶、芍药苷、落新妇苷和黄杞苷5种对照品各2mg，分别加甲醇配制不同倍数质量浓度的对照品溶液；
[0021] d.线性关系考察：分别精密吸取上述不同浓度的5种混合对照品溶液，高效液相色谱仪进样10μL，以测得的响应
信号和浓度进行线性回归，得到5种标准品的回归方程；
[0022] e.测定法：分别精密吸取对照品和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪测定。
[0023] 作为优选的，治疗银屑病中药口服液的质量控制方法的供试品溶液为水提液，具体方法为：取PSORI-CM01处方剂量，常规水煎提取，前2次，每次1小时，第3次45分钟，合并提取液，用纱布过滤，减压回收得粗提液，加去离子水定容至即每毫升药液含1g原药，用去离子水稀释5、10、15倍。
[0024] 优选的，所述的治疗银屑病中药口服液的质量控制方法用于提取方法相同的PSORI-CM01片剂，颗粒剂或药物组成含有肿节风、赤芍、土茯苓药材的复方。
[0025] 优选的，所述的提取液用II型ZTC 1+1天然
澄清剂澄清。它是一种以天然多糖为原料制成的天然高分子物质，由A、B两个组分组成，A组分为黄褐色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含
淀粉酶，配成1％的水溶液使用；B组分为浅黄色可溶性固体粉末或浅褐色液体，主要含淀粉酶的复合酶，用1％
醋酸配成1％浓度的溶液使用。
[0026] 优选的，在治疗银屑病中药口服液的质量控制方法的含量测定方法中：供试品稀释5倍，过0.22μm滤膜，10μL进液相色谱仪、绿原酸的含量为：17.31μg/ml、异嗪皮啶的含量为：9.96μg/mL、芍药苷的含量为：438.45μg/mL、落新妇苷的含量为：157.07μg/mL、黄杞苷的含量为：71.42μg/mL。
[0027] 优选的，所述的薄层色谱法鉴别赤芍和土茯苓中，赤芍以三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸为40∶5∶10∶0.2作为展开剂，5％香草醛溶液显色，土茯苓以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸为13∶32∶9作为展开剂，3％AlCl3显色。
[0028] 本发明以赤芍药材的鉴定成分芍药苷，肿节风的鉴定成分异嗪皮啶及土茯苓的鉴定成分落新妇苷和黄杞苷的含量测定为指标，该方法避免了药物组成药材中药物成分在同一色谱条件下响应(峰)的重叠，以5种活性成分的含量测定为控制标准，更加合理、真实地反映一种治疗银屑病的中药口服液的药品质量。
[0030] 图1是赤芍对照药材图。
[0031] 图2是土茯苓对照药材图。
[0032] 图3是330nm波长下绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷和黄杞苷5种对照品的色谱图。
[0033] 图4是230nm波长下芍药苷的色谱图。
[0034] 图5是银屑灵优化方(PSORI-CM01)330nm波长下HPLC色谱图。
[0035] 图6是银屑灵优化方(PSORI-CM01)230nm波长下HPLC色谱图。
[0036] 图7是土茯苓330nm波长下HPLC色谱图。
[0037] 图8是绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷和黄杞苷对照品光谱图。
[0038] 图9是芍药苷对照品光谱图。
[0039] 图10是银屑灵优化方中绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷和黄杞苷对照品光谱图。
[0040] 图11是银屑灵优化方中芍药苷对照品光谱图。
[0041] 图12是阴性样品330nm波长下的HPLC色谱图。
[0042] 图13是阴性样品230nm波长下的HPLC色谱图。
具体实施方式
[0043] 如图1-13所示，本发明一种治疗银屑病中药口服液的质量控制方法，该方法按如下步骤进行：
[0044] (1)供试品溶液的配制：取PSORI-CM01处方剂量，常规水煎提取(前2次，每次1h，第3次45min)，合并提取液，用纱布过滤，减压回收得粗提液，加去离子水定容至每毫升药液含1g原药。同时，用去离子水稀释至5、10、15倍备用。
[0045] (2)对照品溶液的制备精密称取绿原酸、异嗪皮啶、芍药苷、落新妇苷和黄杞苷5种对照品各2mg，分别加甲醇配制不同倍数质量浓度对照品溶液。
[0046] (3)线性关系考察：分别精密吸取上述不同浓度的5种混合对照品溶液，高效液相色谱仪进样10μL，以测得的响应信号(峰面积)和浓度进行线性回归，得到5种标准品的2
回归方程。绿原酸Y＝29901x+5698.6(R＝0.9992)，浓度在1.79～115μg/mL范围线性
2
良好；芍药苷Y＝17281x+117236(R＝0.9997)，浓度在5.84～750μg/mL范围线性良好；
2
异嗪皮啶Y＝25094x+34497(R＝0.9989)，浓度在0.54～87.5μg/mL范围线性良好；落
2
新妇苷Y＝5272.8x+60778(R＝0.9994)，浓度在7.81～1000μg/mL范围线性良好；黄杞
2
苷Y＝6986.4x+37074(R＝0.9992)，浓度在3.91～500μg/mL范围线性良好。
[0047] (4)测定方法：照高效液相色谱条件测定，色谱条件和系统适用性和Inertsil ODS-3色谱柱，流动相见表1，平衡时间15min，流速0.8mL/min，进样10μL，柱温24℃，PDA检测器采集范围：190～400nm；检测波长330nm和230nm。
[0048] 表1 流动相梯度洗脱表
[0049]
[0050] (5)对上述确定的测定方法进行有效性评价，其中包括精
密度、重复性、稳定性等。
[0051] 2.银屑灵口服液中赤芍和土茯苓用薄层色谱法鉴别：
[0052] (1)样品溶液的配制
[0053] 供试样品溶液的制备：取本品口服液10mL，放入分液漏斗，加乙醇10mL，振摇提取3次，合并提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，取上清液作为供试品溶液。
[0054] 取赤芍对照药材0.1mg，加乙醇10mL，超声提取30min，提取液滤出，挥干，加乙醇1mL溶解作为赤芍对照药材溶液。
[0055] 取土茯苓对照药材1mg，加甲醇20mL，超声提取30min，提取液滤出，挥干，加甲醇1mL溶解作为对照药材溶液。取落新妇苷对照品1mL，制成1mg/mL对照品溶液。
[0056] (2)赤芍薄层色谱鉴别
[0057] 依照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取对照药材溶液和样品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷5％香草醛溶液显色，在105℃烘箱加热至斑点显色清晰，白光下检视。如图1所示，供试品色谱中，在与对照品溶液色谱相应的
位置上，显相同
颜色的斑点。
[0058] (3)土茯苓薄层色谱鉴别
[0059] 依照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取土茯苓对照药材溶液-落新妇苷对照品溶液-供试样品3种溶液2μL，0.5μL，1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(13∶32∶9)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％AlCl3溶液，放置20min后，置紫外光灯(365nm)下检视。如图2所示，供试品色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0060] 本发明一种治疗银屑病中药口服液的质量控制方法，优选的供试品溶液的制备：该方法公示品溶液的制备：取PSORI-CM01处方剂量，常规水煎提取(前2次，每次1h，第3次45min)，合并提取液，用纱布过滤，减压回收得粗提液，加去离子水定容至每毫升药液含
1g原药。
[0061] 本发明一种治疗银屑病中药口服液的质量控制方法中，优选的测定方法：高效液相色谱条件测定，色谱条件和系统适用性试验：Inertsil ODS-3色谱柱，流动相梯度见表1，平衡时间15min，流速0.8mL/min，柱温24℃，PDA检测器采集范围：190～400nm；检测波长330nm和230nm，进样10μL。
[0062] 本发明所述的质量控制方法，由于芍药苷的最大吸收波长为230.2nm，绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷、黄杞苷的最大吸收波长分别为327.4nm，342.9nm，290.4nm，292.8nm，芍药苷在大于290nm处吸收很少，故选择230nm和330nm双波长分别测定芍药苷与绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷、黄杞苷含量。
[0063] 3.澄清工艺及各成分含量
[0064] (1)澄清剂的配制：II型ZTC1+1天然澄清剂由A，B两组分组成。A组分：精密量取1.0g A组分中加入少量在蒸馏水，搅拌成糊状，再加入蒸馏水配制至100mL的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤即得。B组分：精密量取1.0g B组分中加入少量体积分数为1％的醋
酸溶液，搅拌成糊状，再加体积分数为1％的醋酸溶液配制成100mL的粘胶液，溶胀24h，用双层纱布过滤，即得。
[0065] (2)澄清剂A、B加入顺序：根据说明书，ZTC天然澄清剂主要是根据溶液的性质选择不同的添加顺序，一般中药复方相对于
蛋白质等电点(pH＝4.8)为酸性环境，添加顺序为先B后A组分，B组分用量为A组分2倍。
[0066] (3)评价指标：分别选取绿原酸含量保留率(X1)、芍药苷含量保留率(X2)、异嗪皮啶苷含量保留率(X3)、落新妇苷含量保留率(X4)、黄杞苷含量保留率(X5)、固形物去除率(X6)作为评价指标进行综合评分，将化合物保留率权重定为0.7，固形物去除率X2权重定为0.3，即OD％＝(0.7X1+0.7X2+0.7X3+0.7X4+0.7X5)/5+0.3X6。计算公式如下：
[0067] 化合物保留率＝澄清后提取
液化合物的含量/提取液中化合物的含量×100％[0068] 固形物去除率＝(澄清前固形物含量-澄清后固形物含量)/澄清前固形物含量×100％
[0069] (4)工艺考察：以澄清剂加入量，料液比，
温度，时间为考察因素，各选取最佳的34
水平，以L9(3)
正交表进行试验，以化合物保留率和固形物去除率计算综合评分，进行方差分析，结果见表2。由正交试验的方差分析可以看出，澄清剂加入量及提取液料液比对综合评分有显著影响，温度和时间对提取液的澄清效果无统计学意义。试验中发现，澄清剂B组分为4％时PSORI-CM01水提液澄效果好，确定II型ZTC 1+1天然澄清剂澄清PSORI-CM01提取液的最佳工艺条件为澄清剂加入量B组分4％，B组分为2％料液比为1∶5，温度为
60℃，反应时间1h。
[0070] 表2 L9(34)正交试验结果
[0071]
[0072] (5)各成分含量：以II型ZTC 1+1天然澄清剂澄清PSORI-CM01提取液的最佳工艺条件：澄清剂加入量B组分4％，B组分为2％料液比为1∶5，温度为60℃，反应时间1h，制备样品。高效液相色谱条件：Inertsil ODS-3色谱柱，流动相梯度见表1，平衡时间15min，流速0.8mL/min，柱温24℃，PDA检测器采集范围：190～400nm；检测波长330nm和230nm，进样10μL。选择230nm和330nm双波长分别测定芍药苷与绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷、黄杞苷含量。样品连续进针3次，取平均值。按本发明质量控制方法测得每克生药，绿原酸的含量为：17.31μg/ml，异嗪皮啶的含量为：9.96μg/mL，芍药苷的含量为：438.45μg/mL，落新妇苷的含量为：157.07μg/mL，黄杞苷的含量为：71.42μg/mL。
[0073] 本申请发明人经考察获知，当采用乙腈-水，乙腈-甲酸水，甲醇-
水体系作为流动相梯度洗脱时，药物成分分离不理想，运用甲醇-甲酸水体系洗脱，药物各成分没有重叠，且峰形优异。本实验方案通过对药物活性成分含量的质量控制，从整体上评价和控制口服液质量，更加合理、真实地反映一种治疗银屑病的中药口服液的药品质量。
[0074] 4.实验研究
[0075] 银屑病典型组织病理特点为表皮角化过度和角化不全，表皮突向下延伸，真皮
乳头延长、水肿，毛细血管扩张、扭曲。棘层增厚、颗粒层消失，角层内或角层下可见Munro微脓疡(由中性粒细胞构成)，周围有淋巴细胞及组织细胞浸润等。本实验目的以观察中药银屑灵和PSORI-CM01对小鼠鼠尾鳞片表皮颗粒层形成的影响。
[0076] (1)实验材料
[0077] a.动物：昆明种小鼠，SPF级，体重(18～22)g，雌雄各半。
[0078] b.药物：银屑灵方组成土茯苓、赤芍、肿节风、甘草等药材，购自康美药业股份有限公司，经广东省中医院黄志海主任中药师鉴定均符合《中华人民共和国药典》(2010版)标准；迪银片(国药准字：H50021778)重庆华邦制药股份有限公司；甲氨蝶呤(国药准字：H32026443)，江苏恒瑞医药股份有限公司；0.9％
氯化钠注射液，广东大冢制药有限公司生产，批号：080202。
[0079] c.仪器：Nikon Eclipse E2000光学
显微镜。
[0080] (2)实验方法
[0081] 银屑灵方与PSORI-CM01常规水煎提取(前2次，每次1h，第3次45min)将煎煮液混合，按本发明质量控制方法制备工艺制成水煎液，每毫升含生药2g，使用时用蒸馏水配成实验所需浓度。
[0082] 将健康昆明种小鼠50只，按SPSS
软件处理所得随机数字表分为5组，即银屑灵方组，PSORI-CM01组，甲氨蝶呤组，迪银片组和空白对照组，每组10只，雌雄各半。空白对照组给予等容积生理盐水，
给药剂量按照不同种属动物间等效剂量的公式换算，银屑灵、PSORI-CM01、甲氨蝶呤、迪银片给药量为30g/kg，30g/kg，迪银片组0.026g/kg。给药容积为0.2mL/10g，小鼠灌胃给药，每日1次，连续灌胃14d。甲氨蝶呤组以小鼠质量1mg/kg
腹腔注射给药3次，隔日一次，用药期间，每次给药前称重调整给药量。末次给药后24h，脱椎处死小鼠，取背面距尾根2cm处皮肤长条，甲醛固定，
石蜡包埋，HE
染色，光镜下观察鼠尾鳞片颗粒层形成。凡是一个鳞片有连接成行的颗粒层细胞者，称为有颗粒层的鳞片，计数连续100个鳞片中有颗粒层鳞片数，统计处理结果。
[0083] (3)实验结果
[0084] 银屑灵方、PSORI-CM01等四组与空白对照组比较差异显著(P＜0.01)；银屑灵方组及PSORI-CM01组统计学上无明显差异(P＞0.05)，两组分别与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；与迪银片组比较优于迪银片组，且有显著性差异(P＜0.01)。
[0085] (4)结论 通过给药造模，镜下观察PSORI-CM01与银屑灵方及中西药物对促进颗粒层形成的作用。结果发现PSORI-CM01可明显诱导小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成，提示PSORI-CM01同原方一样，对小鼠鼠尾鳞片颗粒层的形成有明显的促进作用，PSORI-CM01可能是通过改善银屑病角化不全等病理状态来发挥药效作用。
