一种载有抗肿瘤血管生成药物的多肽修饰的隐形纳米粒及其应用
阅读：749发布：2023-01-19
专利汇可以提供一种载有抗肿瘤血管生成药物的多肽修饰的隐形纳米粒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种载有抗 肿瘤 血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒，所述的隐形纳米粒由抗肿瘤血管生成药物、K237多肽和隐形纳米粒组成。本发明还提供了一种载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒的制备方法和应用。本发明选择性靶向肿瘤新生血管，大幅度提高血管内皮细胞内抗肿瘤血管生成药物浓度(例如紫杉醇浓度)，最大限度降低抗肿瘤血管生成药物在正常组织器官中的浓度，克服药物全身分布带来的 副作用 ；由于 治疗 靶为肿瘤血管内皮细胞，因此又避免耐药性产生，还潜在性的对已经发生的抗肿瘤血管生成药物(例如紫杉醇)的多药耐药肿瘤有效；本发明旨在实现肿瘤抗血管生成治疗，因此还可抑制肿瘤的转移和复发。，下面是一种载有抗肿瘤血管生成药物的多肽修饰的隐形纳米粒及其应用专利的具体信息内容。
1.一种载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒，其特征在于，所述的隐形纳米粒由以下方法制备得到：
(a)、采用复乳法制备装载环磷酰胺的隐形纳米粒
将10mg环磷酰胺溶于0.5mlPBS缓冲溶液中，加入3ml含有30mg醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸混合物的二氯甲烷溶液中，其中醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸的比例为1∶20，连续超声160w，25s后，缓慢加入3ml1％w/v胆酸钠溶液，160w超声25s后，加入40ml 0.5％胆酸钠水溶液，室温下温和搅拌过夜，挥去有机溶剂，得到的纳米粒溶液在11,000×g下离心45min，用蒸馏水洗两遍即得到装载环磷酰胺的隐形纳米粒(CTX-NP)；
(b)、CTX-NP表面K237多肽的修饰
取12ml 1×PBS，加入上述离心后的装载环磷酰胺的隐形纳米粒沉淀中，用移液器吹打分散，混匀后转入小烧杯，按醛基与K237多肽摩尔比例1∶3加入K237多肽和还原剂NaCNBH3，磁力搅拌过夜，4℃下，11,000g离心45min，沉淀即为含K237多肽修饰的CTX-NP(K237-CTX-NP)。
2.一种载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒，其特征在于，所述的隐形纳米粒由以下方法制备得到：
(a)、采用复乳法制备装载阿霉素的隐形纳米粒
将10mg阿霉素溶于0.5mlPBS缓冲溶液中，加入3ml含有30mg醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸混合物的二氯甲烷溶液中，其中醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸的比例为1∶5，连续超声160w，25s后，缓慢加入3ml1％w/v胆酸钠溶液，160w超声25s后，加入40ml 0.5％胆酸钠水溶液，室温下温和搅拌过夜，挥去有机溶剂，得到的纳米粒溶液在11,000×g下离心40min，用蒸馏水洗两遍即得到装载阿霉素的隐形纳米粒(DOX-NP)；
(b)、DOX-NP表面K237多肽的修饰
取12ml 1×PBS，加入上述离心后的DOX-NP沉淀中，用移液器吹打分散，混匀后转入小烧杯，按醛基与K237多肽摩尔比例1∶3加入K237多肽和还原剂NaCNBH3，磁力搅拌过夜，
4℃下，11,000g离心40min，沉淀即为含K237多肽修饰的DOX-NP(K237-DOX-NP)。
3.一种载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒，其特征在于，所述的隐形纳米粒由以下方法制备得到：
(a)、采用复乳法制备装载Endostatin的隐形纳米粒
将2mg Endostatin pDNA溶于0.5mlHEPES缓冲溶液中，加入2ml含有50mg醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸混合物的二氯甲烷溶液中，其中醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸的比例为1∶5，冰浴上，连续超声160w，25s后，缓慢加入3ml 1％w/v胆酸钠溶液，160w超声25s后，加入35ml 0.5％胆酸钠水溶液，室温下温和搅拌过夜，挥去有机溶剂，得到的纳米粒溶液在11,000×g下离心40min，用蒸馏水洗两遍即得到装载Endostatin的隐形纳米粒(Endostatin-NP)；
(b)、Endostatin-NP表面K237多肽的修饰
取12ml 1×PBS，加入上述离心后的Endostatin-NP沉淀中，用移液器吹打分散，混匀后转入小烧杯，按醛基与K237多肽摩尔比例1∶3加入K237多肽和还原剂NaCNBH3，磁力搅拌过夜，4℃下，11,000g离心40min，沉淀即为含K237多肽修饰的Endostatin-NP(K237-Endostatin-NP)。
4.一种载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒，其特征在于，所述的隐形纳米粒由以下方法制备得到：
(a)、采用复乳法制备装载Kringle 5蛋白的隐形纳米粒
将1mg Kringle 5蛋白溶于0.5mlHEPES缓冲溶液中，加入2ml含有50mg醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸混合物的二氯甲烷溶液中，其中醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸的比例为1∶5，冰浴上，连续超声160w，25s后，缓慢加入3ml1％w/v胆酸钠溶液，160w超声25s后，加入35ml 0.5％胆酸钠水溶液，室温下温和搅拌过夜，挥去有机溶剂，得到的纳米粒溶液在11,000×g下离心40min，用蒸馏水洗两遍即得到装载Kringle 5蛋白的隐形纳米粒(K5-NP)；
(b)、K5-NP表面K237多肽的修饰
取10ml 1×PBS，加入上述离心后的K5-NP沉淀中，用移液器吹打分散，混匀后转入小烧杯，按醛基与K237多肽摩尔比例1∶3加入K237多肽和还原剂NaCNBH3，磁力搅拌过夜，
4℃下，11,000g离心40min，沉淀即为含K237多肽修饰的K5-NP(K237-K5-NP)。
5.权利要求1-4任一项所述的载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒在制备治疗实体肿瘤疾病药物中的应用。
一种载有抗肿瘤血管生成药物的多肽修饰的隐形纳米粒及
其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种隐形纳米粒，具体地说，是关于一种载有抗肿瘤血管生成药物的多肽修饰的隐形纳米粒及其制备方法和应用。【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，探索安全有效的抗肿瘤治疗策略是当今生命科学研究领域极富挑战性的课题。研究表明，肿瘤血管生成(angiogenesis)与肿瘤的生长、侵袭、转移、复发及预后密切相关，肿瘤组织中微血管密度已被认为是预测肿瘤转移，复发和预后的重要指标。二十世纪七十年代，Folkman等提出了通过抑制血管生成治疗肿瘤的设想。在这一理论的指导下，2004年2月，世界上第一个抗血管生成药物Avastin(基因工程重组抗VEGF单克隆抗体)获美国FDA批准上市，用于同化疗药物联合治疗转移性结直肠癌。随后，治疗肾癌的多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼(Nexavar)和舒尼替尼(Sutent)分别于2005年12月和2006年1月获FDA批准上市。2006年5月，用于治疗肺癌的重组人血管内皮抑素恩度(Endostar)或我国SFDA批准在国内上市。肿瘤抗血管生成治疗(antiangiogenic cancer therapy)被认为是治疗恶性肿瘤最具发展前途的策略之一。
[0003] 对大多数实体瘤而言，肿瘤血管靶向治疗在多方面优于直接针对肿瘤细胞的细胞毒药物的普通化疗，主要表现为：(1)治疗“靶”是增殖过程中的肿瘤血管内皮细胞，因此对不同类型实体肿瘤，包括原发性肿瘤、转移性肿瘤和多药耐药肿瘤的治疗均有效；(2)肿瘤新生血管内皮细胞遗传性状稳定，产生肿瘤耐药的机会较小；(3)肿瘤细胞的生长和新陈代谢的维持需要肿瘤血管提供养料和氧气，某一根毛细血管塌陷，使血流中断，会产生抗血管作用放大的“旁观者(bystander)”效应，使依赖它支持的周围肿瘤细胞死亡。理论上推算，每杀死一个肿瘤血管内皮细胞，能够抑制50-100个肿瘤细胞的生长；(4)肿瘤血管本身是药物作用的靶部位，药物易于到达并在局部形成较高浓度。
[0004] 肿瘤血管生成主要由血管内皮生长因子(VEGF)与肿瘤新生血管内皮细胞表面上的VEGFR-2(KDR)受体相互作用介导。通过噬菌体展示技术研究发现，含有12个氨基酸的名为K237的多肽(序列为HTMYYHHYQHHL)能够特异性的与肿瘤新生血管上的KDR受体结合。研究表明，K237与KDR结合后，可剂量依赖性的抑制内皮细胞的生长，显著抑制鸡胚尿囊膜上的血管生成。小鼠抑瘤实验表明，K237可在体内显著抑制肿瘤的生长和转移。这一机制提示K237多肽可作为靶向配体特异性地向肿瘤血管内皮细胞递送药物。目前，国内外未见以K237为靶向头基，介导纳米给药系统(纳米粒、脂质体等)或分子复合物肿瘤血管靶向系统的研究报道。
[0005] 紫杉醇(paclitaxel，PTX)是临床首选用于乳腺癌和卵巢癌等妇科肿瘤治疗的一线和二线化疗药物。由于紫杉醇水溶性低，口服几乎不吸收，临床应用的主要是紫杉醇注射液，目前在国外以及国内上市的注射剂是以聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)与无水乙醇作为混合溶媒。紫杉醇注射液中含有的聚氧乙烯蓖麻油易引起机体较为严重的过敏反应，临床使用前通常需要预先给予病人甾体类激素或抗阻按药以预防过敏反应的发生。当前，寻找不含聚氧乙烯蓖麻油的紫杉醇制剂是紫杉醇新制剂开发的方向。
[0006] 现有报道的不含聚氧乙烯蓖麻油紫杉醇新剂型主要有脂质体、微球、纳米粒、微乳等制剂。这些制剂克服了聚氧乙烯蓖麻油给机体造成的严重过敏反应，并且体内借助“EPR”效应可以实现肿瘤部位的被动靶向。但这些制剂治疗肿瘤的方法是杀伤肿瘤细胞本身，研究表明，另外，患者经紫杉醇化疗后，体内残存的肿瘤细胞对紫杉醇产生极度耐药(extreme drug resistance)的风险很高，为下一阶段治疗带来巨大困难。紫杉醇耐药的机理相对较多，主要包括，多药耐药MDR-1基因的高表达(P-gp)、微管蛋白分子靶点的改变和有丝分裂节点蛋白的改变等。目前克服PTX耐药的主要方法是逆转P-gp，但此法对于其他原因导致的PTX耐药无效。当前，探求一种能够降低副作用和减小耐药性发生的紫杉醇临床用药方法对治疗乳腺癌和卵巢癌等妇科肿瘤具有重大临床意义。研究表明，紫杉醇具有直接破坏肿瘤新生血管的活性，能够抑制肿瘤新生血管内皮细胞的增殖、迁移和抑制血管内皮细胞形成血管形态。紫杉醇破坏肿瘤新生血管的机理主要有抑制微管的解聚，使纺锤体失去正常功能，终止细胞的有丝分裂；减少细胞VEGF和HIF-α的表达量；触发线粒体凋亡信号通路等。鉴于紫杉醇具有破坏肿瘤新生血管内皮细胞的活性，最近国外有研究报道通过紫杉醇低剂量、节率性化疗方法治疗小鼠正位移植卵巢癌。该方法旨在通过紫杉醇破坏肿瘤血管抗肿瘤而不是直接杀伤肿瘤细胞，然而紫杉醇单独使用对耐药肿瘤疗效有限，需联合使用EGFR和VEGFR抑制剂以提高抗肿瘤疗效。该低剂量、节率性化疗方法体内紫杉醇靶向性不高，紫杉醇在靶点部位-肿瘤血管内皮细胞中的药物浓度较低，仍无法实现紫杉醇在肿瘤部位的选择性分布，分布在其他组织器官的药物仍可能带来严重毒副作用。【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒。
[0008] 本发明的再一的目的是，提供一种载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒在治疗肿瘤疾病药物中的应用。
[0009] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒由抗肿瘤血管生成药物、K237多肽和隐形纳米粒组成。
[0010] 所述的隐形纳米粒中载有抗肿瘤血管生成药物，所述的K237多肽修饰在隐形纳米粒表面上。
[0012] 所述的抗癌化学药物选自烷化剂(如环磷酰胺等)、抗代谢物(如氟尿嘧啶等)、抗肿瘤抗生素(如阿霉素等)、拓扑异构酶抑制剂(如喜树碱等)、泰素类(紫杉醇、多西紫杉醇等)、长春碱类(如长春碱等)、杂类(如顺铂等)。生物技术药物选自基因药物(Agiostatin、Endostatin、Kringle 5、Tumastatin等)和蛋白药物(上述基因药物的表达产物)。
[0013] 所述的抗癌化学药物选自紫杉醇。
[0014] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0015] 一种载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。
[0016] 所述的肿瘤疾病是实体肿瘤。
[0017] 本发明优点在于：
[0018] 1、选择性靶向肿瘤新生血管，大幅度提高血管内皮细胞内抗肿瘤血管生成药物浓度(例如紫杉醇浓度)，最大限度降低抗肿瘤血管生成药物在正常组织器官中的浓度，克服药物全身分布带来的副作用；
[0019] 2、由于治疗靶为肿瘤血管内皮细胞，因此又避免耐药性产生，还潜在性的对已经发生的抗肿瘤血管生成药物(例如紫杉醇)的多药耐药肿瘤有效；
[0021] 附图1是aldehyde-PEG-PLA的合成路线。
[0022] 附图2是aldehyde-PEG-PLA的IR图谱。
[0023] 附图3是aldehyde-PEG-PLA的1H-NMR图谱。
[0024] 附图4是PTX-NP的制备过程。
[0025] 附图5是K237-PTX-NP制备过程。
[0026] 附图6是XPS C1s元素分析：(A)Aldehyde-PEG-PLA∶CH3O-PEG-PLA(1∶9)混合物，(B)未修饰K237的NP，(C)K237-NP；O1s元素分析：(D)混合物，(E)未修饰K237的NP，(F)K237-NP；N1s元素分析：(G)混合物，(H)未修饰K237的NP，(I)K237-NP。
[0027] 附图7是体外纳米粒在PBS(pH4.0和pH7.4)中的释放图。
[0028] 附图8是隐形纳米粒与HUVEC孵育2h后的共聚焦显微镜图。图中(a)载有6香豆素的无K237修饰的纳米粒；图中(b)载有6香豆素的K237修饰的纳米粒；图中(c)细胞预先用0.15μg/ml K237孵育1h，而后加入载有6香豆素的K237修饰的纳米粒；图中(d)细胞预先用0.35μg/ml K237孵育1h，而后加入载有6香豆素的K237修饰的纳米粒。
[0029] 附图9是各处理组细胞内6-香豆素的平均荧光强度。与PTX-NP比较*p＜0.05，** # ##p＜0.01；与0.15μg/ml+K237-PTX-NP比较 p＜0.05；与K237-PTX-NP比较 p＜0.01。
[0031] 附图11是HUVEC细胞迁移抑制率。不同紫杉醇处方， PTX-NP和K237-PTX-NP，和空白纳米粒NP和K237-NP对HUVEC细胞迁移作用的影响。空白NP和K237-NP浓度与所有对应的载有紫杉醇的纳米粒的浓度相等。mean±SD(n＝4)。与* ** *** # ###
K237-PTX-NP相比，p＜0.05，p＜0.01， p＜0.001；与PTX-NP相比，p＜0.05， p＜0.001。
K237-PTX-NP相比，p＜0.05，p＜0.01， p＜0.001；与PTX-NP相比，p＜0.05， p＜0.001。
[0032] 附图12是HUVEC细胞迁移图片。其中，A(对照)，B( PTX浓度为0.5nmol/l)，C(PTX-NP，PTX浓度为0.5nmol/l)和D(K237-PTX-NP，PTX浓度为0.5nmol/l)。
[0033] 附图13是HUVEC毛细小管形成抑制率。不同紫杉醇处方， PTX-NP和K237-PTX-NP，和空白纳米粒NP和K237-NP对HUVEC毛细小管形成作用的影响。空白NP和K237-NP浓度与所有对应的载有紫杉醇的纳米粒的浓度相等。mean±SD(n＝4)。与* ** *** # ###
K237-PTX-NP相比，p＜0.05，p＜0.01， p＜0.001；与PTX-NP相比，p＜0.05， p＜0.001。
K237-PTX-NP相比，p＜0.05，p＜0.01， p＜0.001；与PTX-NP相比，p＜0.05， p＜0.001。
[0034] 附图14是毛细小管形成图片。其中，A(对照)，B( PTX浓度为0.5nmol/l)，C(PTX-NP，PTX浓度为0.5nmol/l)和D(K237-PTX-NP，PTX浓度为0.5nmol/l)。
[0035] 附图15是不同紫杉醇处方大鼠体内血药浓度时间曲线图。【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图对本发明提供的一种载有抗肿瘤血管生成药物的K237多肽修饰的隐形纳米粒及其制备方法和应用的具体实施方式作详细说明。
[0037] 实施例1
[0038] aldehyde-PEG-PLA合成方法及其鉴定
[0039] 一、aldehyde-PEG-PLA合成方法
[0040] 将Hydroxy-PEG-Aldehyde与丙交酯置于干燥烧瓶中，加入甲苯溶解，在辛酸亚锡(stannous octoate)催化下，70℃真空条件下搅拌1.5h，在140℃反应6h。冷置室温，加入CH2Cl2溶解，用乙醚沉淀，30℃真空干燥即得。aldehyde-PEG-PLA的合成路线见图1。
[0041] 二、aldehyde-PEG-PLA鉴定
[0042] 采用IR，1H-NMR，13C-NMR，GPC(凝胶渗透色谱)技术确证结构，见图2和图3。-1
图2中，1643.67cm 处(箭头所示)可见aldehyde-PEG-PLA聚合物末端醛基(HCO)特-1
征吸收峰，1757.87cm 处可见聚合物中酯键羰基(C＝O)的强吸收峰，由于末端HCO占整个aldehyde-PEG-PLA高分子的质量比很小，因此末端HCO峰强度相对较弱。对照-1
aldehyde-PEG的IR图谱在1632.16cm 处可见末端HCO特征吸收峰。图3中，a，b，c，d分别为聚合物aldehyde-PEG-PLA中不同环境H原子的峰位。9.79ppm(d)处为末端CHO中H
1
吸收峰，对照CHO-PEG的 H-NMR图谱CHO中H的吸收峰在9.80ppm处，以上表明CHO-PEG中CHO基团在CHO-PEG-PLA高分子合成过程中未被破坏。3.47ppm和1.20ppm处分别为聚
1
合物残留溶剂乙醚结构中的CH2和CH3的H吸收峰。根据 H谱中化学位移3.64ppm(a)和
1.55ppm(c)峰面积，计算CHO-PEG-PLA分子量(Mn)。计算方法如下：
图2中，1643.67cm 处(箭头所示)可见aldehyde-PEG-PLA聚合物末端醛基(HCO)特-1
征吸收峰，1757.87cm 处可见聚合物中酯键羰基(C＝O)的强吸收峰，由于末端HCO占整个aldehyde-PEG-PLA高分子的质量比很小，因此末端HCO峰强度相对较弱。对照-1
aldehyde-PEG的IR图谱在1632.16cm 处可见末端HCO特征吸收峰。图3中，a，b，c，d分别为聚合物aldehyde-PEG-PLA中不同环境H原子的峰位。9.79ppm(d)处为末端CHO中H
1
吸收峰，对照CHO-PEG的 H-NMR图谱CHO中H的吸收峰在9.80ppm处，以上表明CHO-PEG中CHO基团在CHO-PEG-PLA高分子合成过程中未被破坏。3.47ppm和1.20ppm处分别为聚
1
合物残留溶剂乙醚结构中的CH2和CH3的H吸收峰。根据 H谱中化学位移3.64ppm(a)和
1.55ppm(c)峰面积，计算CHO-PEG-PLA分子量(Mn)。计算方法如下：
[0043]
[0044] -1.55ppm峰面积：23.66；
[0045] -3.64ppm峰面积：4.38；
[0046] Mn(PEG)-聚合物中CHO-PEG嵌段的分子量为5000；
[0047] 72-聚合物中乳酸单元-O-CH(CH3)-CO-分子量；
[0048] 44-聚合物中乙二醇单元-O-CH2-CH2-分子量。
[0049] 计算得到CHO-PEG-PLA的Mn为63929，与GPC法测定结果(Mn＝64054)
[0050] 本发明亦进行了aldehyde-PEG-PLA的13C-NMR测定。对照aldehyde-PEG(Mn＝13
5000)的 C-NMR中在200.97ppm处有较弱的HCO信号，而由于aldehyde-PEG-PLA的分子
1
量更高(H-NMR图谱计算方法Mn＝63929)，HCO在aldehyde-PEG-PLA中的相对含量很低，
13
因此，CHO信号在 C-NMR中不显著。
5000)的 C-NMR中在200.97ppm处有较弱的HCO信号，而由于aldehyde-PEG-PLA的分子
1
量更高(H-NMR图谱计算方法Mn＝63929)，HCO在aldehyde-PEG-PLA中的相对含量很低，
13
因此，CHO信号在 C-NMR中不显著。
[0051] 上述对aldehyde-PEG-PLA进行的IR、1H-NMR、13C-NMR和GPC等全面、系统的表征和鉴定表明，末端aldehyde在聚合物合成过程中未被破坏，合成得到的新型两亲性高分子聚合物可用于制备纳米粒和进行多肽或蛋白NH2末端PEG化的连接，聚合物合成成功。
[0052] CH3O-PEG-PLA的表征方法与CHO-PEG-PLA相同，测得Mw＝59260，Mn＝34564，PI＝1.71，分散度符合要求。
[0053] 实施例2
[0054] 载有紫杉醇的K237多肽修饰的隐形纳米粒的制备
[0055] 一、采用乳化溶剂挥发法制备装载紫杉醇的隐形纳米粒
[0056] 将1.5mg紫杉醇溶于1ml含有30mg醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸一定比例(该比例为500∶1，需要说明的是该比例可以是1000∶1-1∶1000)混合物的二氯甲烷溶液中，缓慢加入3ml 1％(w/v)胆酸钠溶液，160w超声25s后，加入40ml0.5％胆酸钠水溶液，室温下温和搅拌过夜，挥去有机溶剂。得到的纳米粒溶液在11,000×g下离心45min，用蒸馏水洗两遍即得到装载紫杉醇的隐形纳米粒(简写为PTX-NP)。PTX-NP的制备过程见图4。
[0057] 二、PTX-NP表面K237多肽的修饰
[0058] 取6ml 1×PBS，加入上述离心后的NP沉淀中，用移液器吹打分散，混匀后转入小烧杯。按醛基与K237多肽摩尔比例1∶1-1000加入K237多肽和还原剂NaCNBH3，磁力搅拌过夜。4℃下，11,000g离心45min，沉淀即为含K237多肽修饰的NP(K237-PTX-NP)。K237-PTX-NP制备过程见图5。
[0059] 实施例3
[0060] 纳米粒理化参数测定
[0061] 采用动态光散射测定粒径和Zeta电位，用原子力显微镜观察表面形态，纳米粒理化参数见表1。
[0062] 表-1纳米粒的理化参数
[0063]a b
[0064] 动态光散射法测定粒径，PI为多分散指数；原子力显微镜法测定粒径[0065] 实施例4
[0067] 选用Aldehyde-PEG-PLA和CH3O-PEG-PLA(1∶9)混合制备NP和K237-NP，冷冻干燥。另制备Aldehyde-PEG-PLA和CH3O-PEG-PLA(1∶9)的混合物，充分混匀。XPS分析NP和K237-NP冻干样品以及高分子材料混合物表面的元素组成(C，N，O)：采用铝/镁靶，高-8压14.0kv，功率250W，真空优于1×10 Torr。采用美国RBD公司的RBD147数据采集卡和AugerScan3.21软件分别采集样品的0～1200eV的全扫描谱，而后采集各元素相关轨道的窄扫描谱。并采用AugerScan3.21软件进行数据分析。以C1s＝284.6eV为基准进行结合能校正。采用XPSPeak4.1软件进行分峰拟合。
[0068] 由XPS分析可以推测Aldehyde-PEG-PLA∶CH3O-PEG-PLA(1∶9)混合物、NP和K237-NP表面元素的组成。通过曲线拟合发现，C1s能谱可以分为5个峰，其中1代表C-C或C-H；峰2代表醚键中C-O-C，与峰1比较其化学位移为1.5eV；峰3和峰4分别代表酯键中C-O和羧酸键中C＝O，相对峰1的化学位移分别为2.1和4.2eV。峰5代表醛基中C＝O，相对峰1化学位移为-8.1eV。O1s能谱可以分为2个峰，其中峰6代表O-C(533.9eV)；峰7代表O＝C(532.5eV)。K237-NP所产生的N1s能谱为峰8(399.5eV)；而Aldehyde-PEG-PLA∶CH3O-PEG-PLA(1∶9)混合物和NP无N1s能谱所产生的峰8。
[0069] 利用XPS技术对纳米粒进行表面元素分析，可以测定纳米粒表面以下5-10nm深处的元素组成。分析结果显示，以Aldehyde-PEG-PLA∶CH3O-PEG-PLA为1∶9制备的K237-NP，表面N元素约占C，O，N的0.2-1.0％(XPS检测限为0.1％)。由于PEG-PLA材料的元素组成中不含有N元素，未经多肽修饰的NP表面也没有N元素。由此可知，K237-NP表面元素来源于K237，从而证明纳米粒表面连接有K237。详见图6。
[0070] 实施例5
[0071] 体外释放研究
[0072] 将装有PTX-NP和K237-PTX-NP溶液的离心管，置于37℃恒温气浴中、140次/分震荡下进行释放实验。在释放开始后的0.5、1、3、6、10、18h和1、2、3、4、6、7、10、14和20d取出离心管，于11,000g离心30min，收集1ml上清，同时补加1ml新鲜PBS溶液。采用有机溶剂萃取法提取释放PBS溶液中的紫杉醇，具体方法如下：取500μl释放PBS上清，加入500μl二氯甲烷溶液，充分混匀。混匀后溶液在室温下静置30min，溶液分为分上下两层，其中下层即为含紫杉醇的有机相。吸出下层置干净EP管中，放置室温下蒸发至干燥，再加入500μl流动相，同上法用HPLC测紫杉醇含量。由图7可见，经过最初的突释后，纳米粒呈现出明显的缓释特征。
[0073] 实施例6
[0074] 细胞摄取实验
[0075] 以6-香豆素为探针，将其装载在K237修饰的隐形纳米粒(K237-NP)中，以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型，观察经K237多肽修饰的隐形纳米粒对肿瘤新生血管血管内皮4
细胞的靶向性。方法为：将HUVEC以每孔5×10 个细胞的密度接种在盖玻片覆盖的24孔板上，待细胞长满致80％融合后，加入终浓度为0.25mg/ml的载有6-香豆素的K237修饰的隐形纳米粒，孵育2h后，用PBS溶液冲洗细胞2次，用乙醇固定20分钟，用碘化丙啶(PI)染色1分钟，置激光共聚焦显微镜下观察细胞对纳米粒的摄取情况。为考察K237-NP的细胞摄取行为是否由K237多肽和内皮细胞表面表达的KDR受体介导的内吞。我们另设了两组对照，分别为在加入K237-NP之前，分别用低浓度(0.15μg/ml)和高浓度(0.3μg/ml)游离K237多肽事先与HUVEC细胞孵育1h，然后再加入K237-NP。本实验通过比较细胞内绿色荧光(来自6-香豆素)的强度以考察HUVEC对K237-NP的摄取吞噬情况。实验结果见图
8和图9。由图可见隐形纳米粒经K237修饰后可显著提高其对靶细胞的靶向性和结合摄取能力。
细胞的靶向性。方法为：将HUVEC以每孔5×10 个细胞的密度接种在盖玻片覆盖的24孔板上，待细胞长满致80％融合后，加入终浓度为0.25mg/ml的载有6-香豆素的K237修饰的隐形纳米粒，孵育2h后，用PBS溶液冲洗细胞2次，用乙醇固定20分钟，用碘化丙啶(PI)染色1分钟，置激光共聚焦显微镜下观察细胞对纳米粒的摄取情况。为考察K237-NP的细胞摄取行为是否由K237多肽和内皮细胞表面表达的KDR受体介导的内吞。我们另设了两组对照，分别为在加入K237-NP之前，分别用低浓度(0.15μg/ml)和高浓度(0.3μg/ml)游离K237多肽事先与HUVEC细胞孵育1h，然后再加入K237-NP。本实验通过比较细胞内绿色荧光(来自6-香豆素)的强度以考察HUVEC对K237-NP的摄取吞噬情况。实验结果见图
8和图9。由图可见隐形纳米粒经K237修饰后可显著提高其对靶细胞的靶向性和结合摄取能力。
[0076] 实施例7
[0077] 内皮细胞增殖抑制实验
[0078] 每孔6×103接种于96孔板上，孵育24h后，分别加入PTX浓度为5×10-5-50nmol/l的市售紫杉醇 PTX-NP和K237-PTX-NP纳米粒的细胞培养溶液，同时设不载有PTX的空白纳米粒(NP)和空白K237多肽修饰的纳米粒(K237-NP)对照组。孵育36h后，加入10ul CCK-8溶液，混匀后，继续孵育2h，在450nm处测定光吸收度。并计算细胞生长抑制率，计算方法为：细胞生长抑制率(％)＝[(A对照-A样本)/(A对照1-A空白)]×100％。其中A对照为只加培养液不加任何纳米粒或药物的培养孔的吸光度值，A空白为不加细胞的培养孔的吸光度值。不同紫杉醇处方对HUVEC活力的影响见图10。
[0079] 实施例8
[0080] 内皮细胞迁移抑制实验
[0081] 采用Corning的24孔板Transwell小室进行细胞迁移实验，上下小室间为聚碳酯5
滤膜。将HUVEC细胞用PBS洗3次，消化后重悬于培养基中，取100μl浓度为2×10/ml HUVEC细胞加入至上室，下室加入添加了补充液的HUVEC专用培养液。设置不加LSGS的阴性对照和加LSGS不加药的阳性对照，然后将0.01，0.1，1，10，100nmol/L不同浓度的PTX-NP和PTX-K237-NP的PBS溶液加入上室。培养8h后取出滤膜，乙醇中固定，结晶紫染色，在光镜下计数迁移到滤膜下室面的HUVEC数，以穿膜的HUVEC数作为评价。
滤膜。将HUVEC细胞用PBS洗3次，消化后重悬于培养基中，取100μl浓度为2×10/ml HUVEC细胞加入至上室，下室加入添加了补充液的HUVEC专用培养液。设置不加LSGS的阴性对照和加LSGS不加药的阳性对照，然后将0.01，0.1，1，10，100nmol/L不同浓度的PTX-NP和PTX-K237-NP的PBS溶液加入上室。培养8h后取出滤膜，乙醇中固定，结晶紫染色，在光镜下计数迁移到滤膜下室面的HUVEC数，以穿膜的HUVEC数作为评价。
[0082] 染色及计数：置于CO2培养箱中作用8小时后弃去孔中培养液，用4％多聚甲醛的PBS溶液常温固定15分钟，0.1％结晶紫(双蒸水配置)常温染色25分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，正置显微镜(Olympus，DP50，Japan，×100)下观察并拍照，最后用10％乙酸100μl/孔抽提15分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率(％)＝[(OD值无刺激阴性对照-OD值给药组)/(OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照)]×100％。由图11和图12可见，K237-PTX-NP可剂量依赖性的抑制HUVEC的迁移，其作用显著由于PTX-NP。
[0083] 实施例9
[0084] 内皮细胞毛细小管形成实验
[0085] 采用CHEMICON in vitro angiogenesis assay(ECM625)试剂盒检测PTX对HUVEC血管形成情况的影响。步骤如下：(1)在冰上融化ECMatrix溶液和稀释缓冲液；(2)取100μl 10×的稀释缓冲液加入到900μl的ECMatrix溶液中(灭菌EP管)，混匀(保证冰上操作，避免ECMatrix聚合)。(3)取50μl稀释好的ECMatrix溶液加入到96孔培养板上，
3
与37℃至少孵育1h，使胶固化。(4)收集HUVEC细胞，用100μl培养基悬浮，以5×10 ～
4
1×10 接种于包被好ECMatrix胶的培养板，同时加入PTX-NP，于37℃培养。(5)10h后在倒置光学显微镜下观察血管形成(20×-100×放大倍率)。设置空白纳米粒和PTX-NP对照组，对比PTX-NP和PTX-K237-NP对血管形成的抑制作用。由图13和图14可见，K237-PTX-NP抑制血管形成的能力显著强于PTX-NP和 具有最强的抗血管生成活性。
3
与37℃至少孵育1h，使胶固化。(4)收集HUVEC细胞，用100μl培养基悬浮，以5×10 ～
4
1×10 接种于包被好ECMatrix胶的培养板，同时加入PTX-NP，于37℃培养。(5)10h后在倒置光学显微镜下观察血管形成(20×-100×放大倍率)。设置空白纳米粒和PTX-NP对照组，对比PTX-NP和PTX-K237-NP对血管形成的抑制作用。由图13和图14可见，K237-PTX-NP抑制血管形成的能力显著强于PTX-NP和 具有最强的抗血管生成活性。
[0086] 实施例10
[0087] 动物体内药动学实验
[0088] 实验方案：18只雄性SD大鼠(180-200g)，分为3组，每组6只。每组分别给与PTX-NP，和PTX-K237-NP。生理盐水稀释 PTX-NP和PTX-K237-NP，浓度为0.048mg/ml(12ml)。每只尾静脉注射注射2ml(即0.096mg)，剂量16mg/kg。给药后1，
5，10，30min，1，2，4，12，24，36，48h大鼠眼眶取血0.5ml，5000rpm离心10min，取血浆，采用液-液提取紫杉醇：取50μl血浆，加入500ml叔丁基甲醚，再加入5μl内标多烯紫杉醇(0.2mg/ml)，斡旋30s，2,000g离心15min。沉淀再萃取一次，合并两次上清后，室温下过夜浓缩挥干，然后用200μl流动相重悬浮，高效液相分析。绘制血药浓度时间曲线图，见图15。计算各处方紫杉醇的血浆半衰期分别为： (5.08h)，PTX-NP(19.04h)，K237-PTX-NP(21.85h)，结果表明，隐形纳米粒表面修饰有K237多肽后，其体内长循环行为仍可保持，具备体内顺利靶向肿瘤新生血管内皮细胞的条件。
5，10，30min，1，2，4，12，24，36，48h大鼠眼眶取血0.5ml，5000rpm离心10min，取血浆，采用液-液提取紫杉醇：取50μl血浆，加入500ml叔丁基甲醚，再加入5μl内标多烯紫杉醇(0.2mg/ml)，斡旋30s，2,000g离心15min。沉淀再萃取一次，合并两次上清后，室温下过夜浓缩挥干，然后用200μl流动相重悬浮，高效液相分析。绘制血药浓度时间曲线图，见图15。计算各处方紫杉醇的血浆半衰期分别为： (5.08h)，PTX-NP(19.04h)，K237-PTX-NP(21.85h)，结果表明，隐形纳米粒表面修饰有K237多肽后，其体内长循环行为仍可保持，具备体内顺利靶向肿瘤新生血管内皮细胞的条件。
[0089] 实施例11
[0090] 载有环磷酰胺的K237多肽修饰的隐形纳米粒的制备
[0091] 一、采用复乳法制备装载环磷酰胺的隐形纳米粒
[0092] 将10mg阿霉素溶于0.5mlPBS缓冲溶液中，加入3ml含有30mg醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸一定比例(1∶20)混合物的二氯甲烷溶液中，连续超声160w，25s后，缓慢加入3ml 1％(w/v)胆酸钠溶液，160w超声25s后，加入40ml 0.5％胆酸钠水溶液，室温下温和搅拌过夜，挥去有机溶剂。得到的纳米粒溶液在11,000×g下离心
45min，用蒸馏水洗两遍即得到装载环磷酰胺的隐形纳米粒(简写为CTX-NP)。
45min，用蒸馏水洗两遍即得到装载环磷酰胺的隐形纳米粒(简写为CTX-NP)。
[0093] 二、CTX-NP表面K237多肽的修饰
[0094] 取12ml 1×PBS，加入上述离心后的NP沉淀中，用移液器吹打分散，混匀后转入小烧杯。按醛基与K237多肽摩尔比例1∶3加入K237多肽和还原剂NaCNBH3，磁力搅拌过夜。4℃下，11,000g离心45min，沉淀即为含K237多肽修饰的NP(K237-CTX-NP)。
[0095] 实施例12
[0096] 载有阿霉素的K237多肽修饰的隐形纳米粒的制备
[0097] 一、采用复乳法制备装载阿霉素的隐形纳米粒
[0098] 将10mg阿霉素溶于0.5mlPBS缓冲溶液中，加入3ml含有30mg醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸一定比例(1∶5)混合物的二氯甲烷溶液中，连续超声160w，25s后，缓慢加入3ml 1％(w/v)胆酸钠溶液，160w超声25s后，加入40ml 0.5％胆酸钠水溶液，室温下温和搅拌过夜，挥去有机溶剂。得到的纳米粒溶液在11,000×g下离心
40min，用蒸馏水洗两遍即得到装载阿霉素的隐形纳米粒(简写为DOX-NP)。
40min，用蒸馏水洗两遍即得到装载阿霉素的隐形纳米粒(简写为DOX-NP)。
[0099] 二、DOX-NP表面K237多肽的修饰
[0100] 取12ml 1×PBS，加入上述离心后的NP沉淀中，用移液器吹打分散，混匀后转入小烧杯。按醛基与K237多肽摩尔比例1∶3加入K237多肽和还原剂NaCNBH3，磁力搅拌过夜。4℃下，11,000g离心40min，沉淀即为含K237多肽修饰的NP(K237-DOX-NP)。
[0101] 实施例13
[0102] 载有Endostatin pDNA的K237多肽修饰的隐形纳米粒的制备
[0103] 一、采用复乳法制备装载Endostatin的隐形纳米粒
[0104] 将2mg Endostatin pDNA溶于0.5ml HEPES缓冲溶液中，加入2ml含有50mg醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸一定比例(1∶5)混合物的二氯甲烷溶液中，冰浴上，连续超声160w，25s后，缓慢加入3ml 1％(w/v)胆酸钠溶液，160w超声25s后，加入35ml 0.5％胆酸钠水溶液，室温下温和搅拌过夜，挥去有机溶剂。得到的纳米粒溶液在11,000×g下离心40min，用蒸馏水洗两遍即得到装载阿霉素的隐形纳米粒(简写为Endostatin-NP)。
[0105] 二、Endostatin-NP表面K237多肽的修饰
[0106] 取12ml 1×PBS，加入上述离心后的NP沉淀中，用移液器吹打分散，混匀后转入小烧杯。按醛基与K237多肽摩尔比例1∶3加入K237多肽和还原剂NaCNBH3，磁力搅拌过夜。4℃下，11,000g离心40min，沉淀即为含K237多肽修饰的NP(K237-Endostatin-NP)。
[0107] 实施例13
[0108] 载有Kringle 5蛋白的K237多肽修饰的隐形纳米粒的制备
[0109] 一、采用复乳法制备装载Kringle 5蛋白的隐形纳米粒
[0110] 将1mg Kringle 5蛋白溶于0.5ml HEPES缓冲溶液中，加入2ml含有50mg醛基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基封端的聚乙二醇聚乳酸一定比例(1∶5)混合物的二氯甲烷溶液中，冰浴上，连续超声160w，25s后，缓慢加入3ml 1％(w/v)胆酸钠溶液，160w超声25s后，加入35ml 0.5％胆酸钠水溶液，室温下温和搅拌过夜，挥去有机溶剂。得到的纳米粒溶液在11,000×g下离心40min，用蒸馏水洗两遍即得到装载阿霉素的隐形纳米粒(简写为K5-NP)。
[0111] 二、K5-NP表面K237多肽的修饰
[0112] 取10ml 1×PBS，加入上述离心后的NP沉淀中，用移液器吹打分散，混匀后转入小烧杯。按醛基与K237多肽摩尔比例1∶3加入K237多肽和还原剂NaCNBH3，磁力搅拌过夜。4℃下，11,000g离心40min，沉淀即为含K237多肽修饰的NP(K237-K5-NP)。
[0113] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
超声治疗热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈