技术领域
[0001] 本
发明涉及一种基于罗丹明衍
生物的二硫苏糖醇荧光探针及其应用，属于分析化学技术领域。
背景技术
[0002] 二硫苏糖醇（DTT），是一种合成硫醇，已被广泛应用于细胞生物学、生物化学和生物医学应用领域。DTT常被用作强还原剂，用于保护细胞和组织解毒剂，
辐射防护剂等等。DTT可将巯基（SH）基保持在还原态，常被用来还原蛋白和多肽中的二硫键，以及在
疫苗制剂中普遍用于防止蛋白半胱
氨酸残基形成分子内和分子间的二硫键。DTT还具有抗
氧化作用，对一些隐藏的二硫键，可借助变性条件下来还原二硫键，如高温或钠离子变性剂。此外，DTT是一种有毒的物质，例如，过渡金属存在时，DTT会引起生物分子的氧化损伤，同时DTT还可强化一些含砷和汞的化合物毒性。因此，实时检测生物及细胞内DTT含量，对于研究DTT的毒理具有重要意义。
[0003] 在检测DTT的各种方法中，荧光分析法通常由于其的操作简单和高灵敏度得到广泛应用。然而，目前多数人研究显示，荧光探针检测生物硫醇中DTT的选择性较差。因此，研制一款可以在生物硫醇有效中检测DTT的荧光荧光探针就更为重要。尽管一些对特定硫醇的检测和
鉴别的检验据报道，据我们所知，极少有特异性检测和鉴别二硫苏糖醇分子荧光探针。
发明内容
[0004] 针对缺少特异性检测和鉴别二硫苏糖醇分子的荧光探针等问题，本发明提供一种基于罗丹明衍生物的检测生物体内二硫苏糖醇的荧光探针。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种简便的上述二硫苏糖醇的荧光探针的合成方法。
[0006] 本发明的再一目的是提供一种上述二硫苏糖醇的荧光探针在检测生物体内二硫苏糖醇的应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
[0008] 一种二硫苏糖醇荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：式（I）。
[0009] 一种上述二硫苏糖醇荧光探针的制备方法，包括以下步骤：（1）4-二乙氨基
酮酸和1,6-二羟基
萘在浓
硫酸中加热回流；然后将反应液冷却，加入高氯酸使其析出沉淀，抽滤、烘干并纯化，得化合物1：
；
（2）在三乙胺存在下，化合物1与2,4-二硝基苯磺酰氯在
溶剂中低温反应至化合物1反应完全，除溶剂后得固体，纯化，得二硫苏糖醇荧光探针：
。
[0010] 4-二乙氨基酮酸和1,6-二羟基萘的摩尔比为1-1.2:1。
[0011] 所述步骤（1）中加热回流
温度为90 ℃，冷却温度为-5-0 ℃。
[0012] 步骤（1）中纯化为柱层析纯化：将固体溶于甲醇，层析柱填充
硅胶粉，以二氯甲烷:甲醇=10:1的混合溶剂为洗脱液，洗脱后的溶液除溶剂得化合物1的固体。
[0013] 化合物1与2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1.2。
[0014] 步骤（2）中溶剂优选为二氯甲烷。
[0015] 步骤（2）中反应温度为0-10 ℃。
[0016] 作为优选，步骤（2）中纯化为柱层析纯化：固体溶于甲醇，层析柱填充硅胶粉，以二氯甲烷:甲醇= 50:1的混合溶剂为洗脱液，洗脱后的溶液除溶剂得二硫苏糖醇的荧光探针粉末。
[0017] 一种上述二硫苏糖醇荧光探针在检测溶液与细胞中二硫苏糖醇中的应用。
[0018] 上述应用中荧光检测条件为：单
光子激发
波长为580 nm，双光子的激发波长为800 nm，发射波长为638 nm，检测波段为520-800 nm，优选为600-700 nm。
[0019] 本发明的荧光原理如下：本发明的荧光探针在二硫苏糖醇存在的条件下，荧光探针分子结构中的2,4-二硝基苯磺基可脱去，生成具有荧光发射能
力很强的化合物1，此时荧光探针发射强烈红色荧光（峰值约为638 nm）；一定浓度范围内，荧光强度与二硫苏糖醇呈正相关，通过检测不同的荧光强度来测定二硫苏糖醇的浓度。
[0020] 本发明具有以下优点：本发明的二硫苏糖醇的荧光探针具有高特异性，在进行相应二硫苏糖醇检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内二硫苏糖醇药物的用量检测，具有广阔的应用前景。本发明的二硫苏糖醇的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射
光谱特性（600- 800 nm），通过绘制标准曲线进行生物及细胞内-二硫苏糖醇测定，可以实现对活细胞内二硫苏糖醇的快速准确检测。本发明的二硫苏糖醇的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。
附图说明
[0021] 图1是荧光探针的1H NMR图谱；图2是荧光探针在不同浓度的DTT条件下的荧光光谱；
图3是荧光探针在638 nm处随DTT浓度变化线性关系图；
图4是荧光探针在固定浓度的DTT条件下随时间变化的荧光光谱；
图5是荧光探针在638 nm处随时间变化关系图；
图6是荧光探针与不同相关物质反应后的荧光光谱；
图7是荧光探针在活细胞中的成像应用。
具体实施方式
[0022] 下面结合
实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
[0023] 实施例1 二硫苏糖醇荧光探针的制备。
[0024] 4-二乙氨基酮酸（1 mmol）和1,6-二羟基萘（1 mmol）在浓硫酸（4 mL）中90℃加热回流；然后将反应液冷却至0℃，加入高氯酸（4 mL）使其析出沉淀，抽滤、烘干得固体，将固体溶于甲醇，层析柱填充硅胶粉，以二氯甲烷:甲醇=10:1的混合溶剂为洗脱液，洗脱后的溶液除溶剂得化合物1的固体。
[0025] 将化合物1 (1 mmol)、2、4-二硝基苯磺酰氯（1 mmol）、三乙胺（0.2 mmol）和二氯甲烷（10 mL）加入到50 mL单口烧瓶中，0℃下搅拌2h，反应完全，旋干后将所得固体进行柱层析纯化，得到淡红色产物即为本发明所述检测二硫苏糖醇(DTT)的荧光探针。将所得固体进行柱层析（二氯甲烷:甲醇=50:1）纯化，得到385 mg淡红色产物，即为本发明所述检测生物体及细胞内二硫苏糖醇荧光探针，产率42%，荧光探针的1H NMR图谱如图1所示。
[0026] 实施例2 二硫苏糖醇荧光探针对不同浓度二硫苏糖醇的响应。
[0027] 将实施例1中制备的二硫苏糖醇荧光探针溶于甲醇，再以
磷酸盐缓冲生理盐
水（pH 7.4）配制成10 μM的探针溶液，溶液中甲醇含量为20wt%；配制二硫苏糖醇溶液，其浓度依次为0，10，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300 μM；然后分别将
5mL荧光探针溶液与不同浓度的二硫苏糖醇溶液混合反应30 min，进行荧光检测（λex =
580nm，λem= 638nm），测定各体系中荧光强度。
[0028] 以波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，作荧光探针对不同浓度二硫苏糖醇的响应如图2所示：荧光强度的峰值在638nm左右，随着硫苏糖醇的浓度升高，荧光强度的峰值逐渐升高；以二硫苏糖醇浓度为横坐标，以638nm处的荧光强度为纵坐标，荧光强度与二硫苏糖醇浓度的线性关系如图3所示：在二硫苏糖醇的浓度10-300 μM间，荧光强度与二硫苏糖醇浓度呈线性正相关。
[0029] 实施例3 不同反应时间对二硫苏糖醇荧光探针荧光强度的影响。
[0030] 将实施例1中制备的二硫苏糖醇荧光探针溶于甲醇，再以磷酸盐缓冲生理盐水（pH 7.4）配制成10 μM的探针溶液，其中甲醇含量为20wt%；以磷酸盐缓冲生理盐水（pH 7.4）配制300 μM二硫苏糖醇溶液。然后将5 mL荧光探针溶液与300 μM二硫苏糖醇溶液混合反应30 min，进行荧光检测（λex = 580nm，λem= 638nm），每隔2min测定体系中荧光强度，测定40min。
[0031] 以波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，作荧光探针对不同反应时间二硫苏糖醇的荧光强度如图4所示：荧光强度的峰值在638nm左右，随着反应时间的延长，荧光强度的峰值逐渐升高；以反应时间为横坐标，以638nm处的荧光强度为纵坐标，分析荧光强度与反应时间的关系如图5所示：反应0-30 min时，荧光强度迅速增长，30-40 min增长较为平缓，接近饱和状态。
[0032] 实施例4 二硫苏糖醇荧光探针的抗干扰性。
[0033] 将实施例1中制备的二硫苏糖醇荧光探针溶于甲醇，再以磷酸盐缓冲生理盐水（pH 7.4）配制成10 μM的探针溶液，其中甲醇含量为20wt%；
将5 mL荧光探针溶液与分别与300 μM的干扰物质与二硫苏糖醇的PBS溶液混合反应30 min，进行荧光检测（λex = 580nm，λem= 638nm）。
[0034] 不同物质的荧光强度的柱形图如图4所示，其中，CuSO4、MgSO4、CaCl2、CoCl2、NaNO2、Na2SO3、Na2SO4、ZnSO4、过氧叔丁基、过氧叔丁醇、HClO、H2O2、NO、Na2S、SnSO4、KI、HgCl2、Vc、Hcys、Cys、GSH、二硫苏糖醇编号为1-22。由图可知，本二硫苏糖醇荧光探针可抗多种干扰性物质的影响，特异性强。
[0035] 实施例5二硫苏糖醇荧光探针对细胞中DTT的检测。
[0036] 将Hela细胞放在培养基(DMEM培养液和10%胎
牛血清)中，放置于条件为37 ℃、5% CO2和20% O2的
培养箱中培养48h。用微量进样器吸取本发明所述检测细胞内二硫苏糖醇(DTT)的荧光探针(10 μM)注入含有Hela细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。之后用PBS（磷酸缓冲生理盐水）冲洗培养细胞3次，然后进行荧光成像。
[0037] 结果如图7所示，其中A表示探针（10 μM）分别加了0、50 μM、100 μM DTT在细胞分别在明场、561 nm激发的红色通道细胞图片、明场和红色通道
叠加的细胞图以及800 nm激发的双光子荧光细胞图，B表示探针在浓度在0、50 μM、100 μM DTT中单光子红色通道荧光强度柱状图，C是探针在分析物浓度在0、50 μM、100 μM DTT分析物中双光子红色通道荧光强度柱状图。
[0038] 结果如图7所示，其中，A表示探针（10 μM）在细胞分别在单光子荧光检测的明场、红色通道和两者叠加图像及双光子荧光通道图，B表示探针在浓度在0、50 μM、100 μM DTT中单光子红色通道荧光强度柱状图，C是探针在分析物浓度在0、50 μM、100 μM DTT分析物中双光子红色通道荧光强度柱状图。
