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一种荧光染料探针

阅读：943发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种荧光染料探针专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种荧光染料探针。所述荧光染料探针具有式(I)的结构：MGVADLIKKFESISKEE?GGGGK(R1)?GG?rRrRrRRR式(I)，其中，MGVADLIKKFESISKEE为肌动蛋白识别基团的氨基酸序列；GGGGK为第一连接基团；R1为荧光染料基团；GG为第二连接基团；rRrRrRRR为细胞穿膜肽的氨基酸序列，r为D型精氨酸，R为L型精氨酸。本发明提供的荧光探针染料能够特异性标记到活细胞内源性的肌动蛋白，实现活细胞内源性肌动蛋白荧光成像之后，得到具有更高分辨率的超分辨显微成像。，下面是一种荧光染料探针专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种荧光染料探针，其特征在于，所述荧光染料探针具有式(I)的结构：
MGVADLIKKFESISKEE-GGGGK(R1)-GG-rRrRrRRR
式(I)，
其中，MGVADLIKKFESISKEE为肌动蛋白识别基团的氨基酸序列；GGGGK为第一连接基团；
R1为荧光染料基团，所述荧光染料基团R1为罗丹明类染料、荧光素类染料或光开关荧光染料；GG为第二连接基团；rRrRrRRR为细胞穿膜肽的氨基酸序列，r为D型精氨酸，R为L型精氨酸。
2.如权利要求1所述的荧光染料探针，其特征在于，所述罗丹明类染料为罗丹明B。
3.如权利要求1所述的荧光染料探针，其特征在于，所述荧光素类染料为异硫氰酸荧光素。
4.如权利要求1所述的荧光染料探针，其特征在于，所述光开关荧光染料为光开关罗丹明B，具有式(II)的结构，

说明书全文

一种荧光染料探针

技术领域

[0001] 本发明属于显微成像领域，更具体地，涉及一种荧光染料探针。

背景技术

[0002] 活细胞中肌动蛋白的荧光标记目前有两种可实现形式，荧光蛋白标记及荧光染料标记。其中，荧光蛋白的应用最为广泛。以荧光染料标记的肌动蛋白，需要克服特异性标记以及活细胞内源性标记的难题，目前被成功运用的标记手段很少。然而，荧光染料普遍亮度更高，有更优秀的抗漂白能力及光稳定性，而且有着更宽广的发射光谱覆盖区域，可以轻易地满足各种颜色的普通荧光成像。不仅如此，在普通光学成像无法突破分辨率极限的领域，即超分辨显微成像领域，荧光染料有着更加明显的优势：染料的高亮度直接反应在更高的超分辨成像的定位精度上，因而可以获取更高的空间分辨率；稳定的光物理性质及抗漂白能力，更有着时间分辨率上的潜在优越性。因此从显微光学成像，包括普通荧光成像及超分辨显微荧光成像角度，荧光染料标记的活细胞内源性肌动蛋白都有着广泛的应用前景。

[0003] 目前可实现活细胞标记的方式有两类：一类在体外将肌动蛋白与荧光染料连接并纯化，通过微注射等方式将这部分标记蛋白导入到活细胞内，利用肌动蛋白在活细胞内动态组装的特性，达到活细胞肌动蛋白标记目的。这种方式虽然可以整合到内源性蛋白，但它需要依赖特殊的设备及技术支持，很难广泛被采用。另外，这种方式受到技术本身的应用限制，例如微注射时需要选择尺寸比较大的细胞系，因此只能在部分细胞中成功实现。另一类即标签蛋白/肽技术，技术的实现需要将两个部分分别以不同方式导入到活细胞内：首先将一段标签蛋白/肽与肌动蛋白形成融合基因，通过转染方式将此部分导入到细胞内。再将一个特定的小分子与荧光染料共价结合，此部分与活细胞孵育后自行透膜。后一部分的特殊的小分子可以与前一部分的的标记蛋白/肽特异性结合，以此达到以荧光染料标记肌动蛋白的目的。然而，这种方式的应用范围很受限制。因为实际应用中，后一部分的透膜能力受到染料种类和细胞系的限制，只有少数的几个荧光染料与小分子共价结合后的复合物能够自行穿透细胞膜，而且对于不同的细胞系，复合物透膜能力的差别比较大。另外，以这种方式标记的肌动蛋白是外源性的肌动蛋白，即细胞内本身的内源性肌动蛋白并没有被标记上。

[0004] 目前，并没有出现一种普适性的荧光染料标记方法，能够解决荧光染料在标记肌动蛋白时特异性标记以及活细胞内源性标记的技术问题，用以活细胞的内源性肌动蛋白的荧光成像，包括普通的荧光成像以及进一步提高光学成像分辨率的超分辨显微成像。

发明内容

[0005] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种荧光染料探针，其目的在于通过将穿膜肽、肌动蛋白识别基团以及荧光染料以特定的连接基团及连接方式组合在一起形成具有穿膜能力的荧光染料探针，由此解决荧光成像领域中荧光染料对活细胞内源性肌动蛋白标记的技术问题。

[0006] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种荧光染料探针，所述荧光染料探针具有式(I)的结构：

[0007] MGVADLIKKFESISKEE-GGGGK(R1)-GG-rRrRrRRR

[0008] 式(I)

[0009] 其中，MGVADLIKKFESISKEE为肌动蛋白识别基团的氨基酸序列；GGGGK为第一连接基团；R1为荧光染料基团；GG为第二连接基团；rRrRrRRR为细胞穿膜肽的氨基酸序列，r为D型精氨酸，R为L型精氨酸。

[0010] 优选地，所述荧光染料探针，其荧光染料基团R1为罗丹明类染料、荧光素类染料或光开关荧光染料。

[0011] 优选地，所述荧光染料探针，其所述罗丹明类染料为罗丹明B。

[0012] 优选地，所述荧光染料探针，其所述荧光素类染料为异硫氰酸荧光素。

[0013] 优选地，所述荧光染料探针，其所述光开关罗丹明B，具有式(II)的结构，[0014]

[0015] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

[0016] (1)由于解决了荧光染料特异性与荧光探针透膜性的问题，能够特异性标记到活细胞内源性的肌动蛋白；

[0017] (2)由于将荧光染料的应用范围扩大到光开关的荧光染料，能够在实现活细胞内源性肌动蛋白荧光成像之后，得到具有更高分辨率的超分辨显微成像；

[0018] (3)实验证实，本发明提供的光开关罗丹明B标记的荧光探针，具有优秀的免激活及抗漂白的超分辨显微成像能力。附图说明

[0019] 图1是实施例4异硫氰酸荧光素标记的探针以不同时间进入细胞的标记状况，其中图1a为探针进入5分钟的标记状态，图1b为探针进入10分钟的标记状态，图1c为探针进入15分钟的标记状态，图1d为探针进入30分钟的标记状态；

[0020] 图2是实施例5罗丹明B标记的探针进入细胞的标记状况，其中图2a为含细胞穿膜肽的探针进入细胞的状况，图2b为不含细胞穿膜肽的探针进入细胞的状况；

[0021] 图3是实施例6罗丹明B标记的探针与标准肌动蛋白标记物的在活细胞内的共同标记状况，其中图3a为罗丹明B探针在BSC-1细胞中的标记成像，图3b为标准肌动蛋白标记物在BSC-1细胞中的标记成像,图3c为图3a为图3b的图像叠加，图3d为罗丹明B探针在HeLa细胞中的标记成像，图3e为标准肌动蛋白标记物在HeLa细胞中的标记成像,图3f为图3d为图3e的图像叠加，图3g为罗丹明B探针在NIH/3T3细胞中的标记成像，图3h为标准肌动蛋白标记物在NIH/3T3细胞中的标记成像,图3i为图3g为图3h的图像叠加；

[0022] 图4是实施例7光开关的罗丹明B标记的探针、罗丹明B标记的探针以及硫氰酸荧光素标记的探针在超分辨显微成像时的稀疏发光检测，其中图4a为光开关的罗丹明B标记，图4b为罗丹明B标记，图4c为硫氰酸荧光素标记；

[0023] 图5是实施例8光开关的罗丹明B标记的探针抗漂白能力检测图，其中图5a～f分别为光开关的罗丹明B标记的探针连续照射时间为0、8、16、22、28、35分钟时的成像效果，图5g～j分别为对照探针连续照射时间为0、2、4、6分钟时的成像效果；

[0024] 图6是光开关的罗丹明B标记的探针标记的活细胞内源性肌动蛋白的超分辨显微成像图，其中图6a为普通荧光成像结果，图6b为超分辨显微成像结果。

[0025] 在所有附图中，除图5以外的标尺均为10μm，图5的标尺为2μm。

具体实施方式

[0026] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0027] 本发明提供的荧光染料探针，具有式(I)的结构：

[0028] MGVADLIKKFESISKEE-GGGGK(R1)-GG-rRrRrRRR

[0029] 式(I)

[0030] 其中，MGVADLIKKFESISKEE为肌动蛋白识别基团的氨基酸序列；GGGGK为第一连接基团；R1为荧光染料基团；GG为第二连接基团，rRrRrRRR为细胞穿膜肽的氨基酸序列，r为D型精氨酸，R为L型精氨酸。

[0031] 肽链的N端为肌动蛋白识别基团MGVADLIKKFESISKEE，这是目前所知最短的肌动蛋白标记物，由于其长度短且能够特异性地结合上肌动蛋白，并在结合之后不改变肌动蛋白本身的动力学。识别基团位于N端时，与肌动蛋白结合最优，我们的设计延续识别基团MGVADLIKKFESISKEE置于N端的结论。细胞穿膜肽rRrRrRRR位于C端，它的作用是携带不能透膜的其它部分(MGVADLIKKFESISKEE-GGGGK(R1)-GG)进入细胞中。这是一种高效的细胞穿膜肽，它的特殊之处在于，能够在很低的浓度下穿透细胞膜并在细胞质中形成均匀分布。我们的设计中，考虑到肌动蛋白大部分定位在细胞质中，细胞穿膜形成的直接的细胞质分布有利于识别基团MGVADLIKKFESISKEE与肌动蛋白的结合。而目前大多数的细胞穿膜肽透膜后分布于内涵体中，不利于识别基团MGVADLIKKFESISKEE对肌动蛋白的识别。在这两个部分之中的是荧光染料分子，为了便于化学合成，我们将荧光染料连接到赖氨酸K的侧链上。

[0032] 考虑到多肽合成时的空间位阻，我们在穿膜肽rRrRrRRR和赖氨酸K之间加入了两个甘氨酸G作为缓冲序列。在化学合成上，Gn是常用的用以减少空间位阻的序列。另外，考虑到多肽合成时的空间位阻，以及识别序列MGVADLIKKFESISKEE与肌动蛋白结合时的空间位阻，我们在赖氨酸K和识别基团MGVADLIKKFESISKEE之间加入了四个甘氨酸G作为缓冲序列。

[0033] 述荧光染料基团R1为罗丹明类染料、荧光素类染料或光开关荧光染料。罗丹明类染料，如罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明123、四甲基罗丹明等，这里选用的罗丹明B价格低廉，成本比较低。荧光素类染料，如异硫氰酸荧光素、羧基荧光素等，这里选用的异硫氰酸荧光素是常的生物标记染料，具有较高的光量子产率。所述光开关荧光染料具有两个状态，包括发光的亮态及不发光的暗态，在不同于激发光源的第二激活光源照射下，具备暗态到亮态之间转换的性质。其中具有光开关性质之一的染料光开关的罗丹明B具有式(II)的结构，[0034]

[0035] 采用的光开关荧光染料，是由于它特殊的发光性质，当给定一个强度的激活光时，所有的荧光分子中只有一小部分同时发光，对这部分分子成像后，再令其它的小部分分子发光。如此得到一幅幅在时间上分开成像的荧光分子，通过算法确定荧光分子的更精确定位，最后将多幅图像的成像结果叠加，最终得到肌动蛋白的整体超分辨显微成像图。由于每单幅图中发光的荧光分子在空间上并不密集，因此以超分辨的显微成像算法可以对其作精确定位，从而提高了肌动蛋白成像的光学分辨率。

[0036] 本发明提供的荧光探针可采用固相肽的合成方法得到。

[0037] 以下为实施例：

[0038] 实施例1

[0039] 一种荧光染料探针具有如下的结构：

[0040] MGVADLIKKFESISKEE-GGGGK(R1)-GG-rRrRrRRR

[0041] 其中，MGVADLIKKFESISKEE为肌动蛋白识别基团的氨基酸序列；GGGGK为第一连接基团，荧光染料基团为罗丹明B，R1结构为 GG为第二连接基团；rRrRrRRR为细胞穿膜肽的氨基酸序列，r为D型精氨酸，R为L型精氨酸。

[0042] 所述荧光染料探针由上海翱博生物科技有限公司合成，其合成方法采用固相肽合成法。

[0043] 实施例2

[0044] 一种荧光染料探针具有如下的结构：

[0045] MGVADLIKKFESISKEE-GGGGK(R1)-GG-rRrRrRRR

[0046] 其中，MGVADLIKKFESISKEE为肌动蛋白识别基团的氨基酸序列；GGGGK为第一连接基团，荧光染料基团为异硫氰酸荧光素，R1结构为GG为第二连接基团；rRrRrRRR为细胞穿膜肽的氨基酸序列，r为D型精氨酸，R为L型精氨酸。

[0047] 所述荧光染料探针由上海翱博生物科技有限公司合成，其合成方法采用固相肽合成法。

[0048] 实施例3

[0049] 一种荧光染料探针具有如下的结构：

[0050] MGVADLIKKFESISKEE-GGGGK(R1)-GG-rRrRrRRR

[0051] 其中，MGVADLIKKFESISKEE为肌动蛋白识别基团的氨基酸序列；GGGGK为第一连接基团，荧光染料基团为光开关罗丹明B，R1结构为GG为第二连接基团；rRrRrRRR为细胞穿膜肽的氨基酸序列，r为D型精氨酸，R为L型精氨酸。

[0052] 所述荧光染料探针由上海翱博生物科技有限公司合成，其合成方法采用固相肽合成法。

[0053] 实施例4

[0054] 异硫氰酸荧光素标记的荧光探针穿膜时间梯度实验：

[0055] 细胞准备：生长状态良好的BSC-1细胞(1.5x104cells/well)溶液200μl接种于无菌的圆皿(glass bottomΦ15mm,NEST Biotechnology Co.,Ltd.,China)中。37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的MEM溶液中培养过夜，至细胞重新贴壁。

[0056] 将实施例2中提供的异硫氰酸荧光素标记的探针用纯水配成高浓度(1mM)的溶液，并用PBS稀释到终浓度15μM。实验前，取出细胞吸去培养基，用PBS溶液洗掉残余血清。各取200μl上述的探针溶液加入到四个圆皿中，分别于37℃、5％CO2环境中避光孵育5分钟、10分钟、15分钟及30分钟。去掉探针溶液，加入200μl的1mg/ml的台酚蓝溶液，静置一分钟后去掉台酚蓝，用PBS溶液小心清洗细胞三次，加入含有10％血清的MEM溶液，上镜观察。

[0057] 成像条件：通过激光扫描共聚焦显微镜FV1000(Olympus,Japan)观察。异硫氰酸荧光素于488nm激发，在510-530nm接收。

[0058] 异硫氰酸荧光素探针标记细胞后激光共聚焦成像的结果见附图1。图1显示，探针进入细胞以均匀分布的方式出现(5分钟)，之后随着孵育时间增加，类似肌动蛋白骨架的结构从细胞边缘开始往中心区域累积，直到丝状结构铺满整个细胞。这个过程中探针以细胞质内均匀分布的方式出现，证明细胞穿膜肽rRrRrRRR携带货物(MGVADLIKKFESISKEE-GGGGK(R1)-GG)后并不影响本身的透膜性质。本发明提供的荧光探针在细胞质中定位的优势得到体现。

[0059] 实施例5

[0060] 罗丹明B标记的荧光探针穿膜性实验：

[0061] 细胞准备：生长状态良好的BSC-1细胞(1.5x104cells/well)溶液200μl接种于无菌的圆皿(glass bottomΦ15mm,NEST Biotechnology Co.,Ltd.,China)中。37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的MEM溶液中培养过夜，至细胞重新贴壁。

[0062] 将实施例1中提供的罗丹明B标记的探针用纯水配成高浓度(1mM)的溶液，并用PBS稀释到终浓度15μM。实验前，取出细胞吸去培养基，用PBS溶液洗掉残余血清。取200μl上述的探针溶液加入到圆皿中，分别于37℃、5％CO2环境中避光孵育30分钟。去掉探针溶液，加入200μl的1mg/ml的台酚蓝溶液，静置一分钟后去掉台酚蓝，用PBS溶液小心清洗细胞三次，加入含有10％血清的MEM溶液，上镜观察。

[0063] 成像条件：通过激光扫描共聚焦显微镜FV1000(Olympus,Japan)观察。罗丹明B于543nm激发，在580-630nm接收。

[0064] 罗丹明B探针标记细胞后激光共聚焦成像的结果见附图2。图2显示，将荧光染料更换成罗丹明B后(图2a)，标记结果依然与异硫氰酸荧光素探针的标记结果一致。而不含细胞穿膜肽rRrRrRRR的对照探针则无法进入细胞(图2b)。证明本发明提供的活细胞内源性肌动蛋白标记的探针不受荧光染料种类的限制，探针的有效性透膜是由于细胞穿膜肽有效性携带。

[0065] 实施例6

[0066] 实施例1提供的探针标记与标准肌动蛋白标记物GFP-actin的共定位的实验：

[0067] 生长状态良好的BSC-1细胞(准备方法如实施例4及实施例5)接种于24孔板，37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的MEM溶液中培养过夜，至细胞重新贴壁，铺满率为80-90％。按照转染试剂LipofectamineTM2000(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)的标准步骤，将质粒GFP-actin转入细胞中。24小时后去掉上清，细胞用含0.25％EDTA的胰酶消化，以
1.5x104cells/well接种于无菌的圆皿(glass bottomΦ15mm,NEST Biotechnology Co.,Ltd.,China)中继续培养12-24小时。将实施例1中提供的罗丹明B标记的探针用纯水配成高浓度(1mM)的溶液，并用PBS稀释到终浓度15μM。实验前，取出重新贴壁的细胞吸去培养基，用PBS溶液洗掉残余血清。取200μl探针溶液加入到圆皿中，于37℃、5％CO2环境中避光孵育半小时。去掉探针溶液，加入200μl的1mg/ml的台酚蓝溶液，静置一分钟后去掉台酚蓝，用PBS溶液小心清洗细胞三次，加入含有10％血清的MEM溶液，上镜观察。HeLa细胞及NIH/3T3细胞以同样的实验过程分别得到对应的共定位结果。

[0068] 成像条件：细胞样品通过激光扫描共聚焦显微镜FV1000(Olympus,Japan)观察。双通道同时成像，罗丹明B于543nm激发，在580-630nm接收；GFP于488nm激发，在508-532nm接收。

[0069] 激光共聚焦成像的结果见附图3。绿色通道(图3b、图3e、图3h)显示，经过转染后，肌动蛋白标记标准物GFP-actin在BSC-1、HeLa及NIH/3T3细胞中成功表达；红色通道(图3a、图3d、图3g)是罗丹明B标记探针的标记结果，类似肌动蛋白骨架的形状与图1及图2a的结果保持一致。经过双通道成像的共定位(图3c、图3f、图3i)，黄色部分为同个部位两个通道共同检测到的信号。黄色部分的高覆盖率表明上述(图1和图2)类似肌动蛋白骨架的结构确实是肌动蛋白，充分证明了本发明提供的探针可以有效地标记活细胞的内源性肌动蛋白，并对多个细胞系有效。

[0070] 实施例7

[0071] 实施例3提供的探针超分辨显微成像的稀疏发光情况观测：

[0072] 生长状态良好的BSC-1细胞(准备方法如实施例4及实施例5)(1.5x104cells/well)溶液200μl接种于无菌的圆皿(glass bottomΦ15mm,NEST Biotechnology Co.,Ltd.,China)中。37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的MEM溶液中培养过夜，至细胞重新贴壁。

[0073] 将实施例1提供的罗丹明B标记的探针、实施例2提供的异硫氰酸荧光素标记的探针，以及实施例3提供的光开关的罗丹明B标记的探针分别用纯水配成高浓度(1mM)的溶液，并用PBS稀释到终浓度15μM。实验前，取出细胞吸去培养基，用PBS溶液洗掉残余血清。分别取200μl不同的探针溶液加入到圆皿中，37℃、5％CO2避光孵育半小时。去掉探针溶液，加入200μl的1mg/ml的台酚蓝溶液，静置一分钟后去掉台酚蓝，用PBS溶液小心清洗细胞三次，加入含有10％血清的MEM溶液，上镜观察。

[0074] 成像条件：细胞样品通过全内反射成像系统观察。该系统由倒置光学显微镜(IX 71,Olympus)、数值孔径为1.49的100倍全内反射物镜(UAPON100XOTIRF,Olympus)、iXon
897EMCCD探测器(Andor Tech.)、561nm的二极管泵浦固体激光器(CNILaser,China)、473nm的二极管泵浦固体激光器(CNILaser,China)以及405nm的激光二极管(CNILaser,China)组成。

[0075] 其稀疏发光的结果见附图4。实施例3提供的光开关的罗丹明B标记的探针只在激发光(561nm)单一光源的照射下便可以在活细胞中形成稀疏发光(图4a)。这与大多数需要第二光源作为激活光的超分辨成像不同。减少了第二光源，避免了短波长的紫外光对活细胞形成的光损伤。实施例1提供的罗丹明B标记的探针(图4b)可以在活细胞内形成一定程度的稀疏发光现象，但图像的信噪比太差，不利于获取高质量的图像；实施例2提供的异硫氰酸荧光素(图4c)标记的探针不能在细胞内稀疏发光。由于形成稀疏发光是超分辨显微成像的基础，因此普通染料标记的探针，即罗丹明B标记的探针和异硫氰酸荧光素标记的探针不适合用来做超分辨显微成像。本组实验证明，光开关的罗丹明B标记的探针有着优秀的免激活的超分辨显微成像能力。

[0076] 实施例8

[0077] 实施例3提供的光开关罗丹明B探针抗漂白实验：

[0078] 用实施例3提供的光开关罗丹明B探针进行标记及成像，并用文献中报导的抗漂白的肌动蛋白探针tdEosFP-Lifeact作为对照，比较二者的抗漂白能力。探针标记及成像步骤如实施例7。

[0079] 实施例3提供的光开关罗丹明B标记的探针形成的稀疏闪烁现象在半小时之内没有明显的被漂白迹象。这种现象有利于长时间成像，在活细胞超分辨显微成像中很少被报导。我们用文献中报导的抗漂白的肌动蛋白探针tdEosFP-Lifeact作为对照，结果见附图5。光开关的罗丹明B标记的探针在激光器最大光功率幅射下(样本上的功率密度为0.33kWcm-2)连续照射半小时后，探针依然没有被明显漂白(图5a)；而tdEosFP-Lifeact转染的细胞，在激活光(405nm)辅助成像下，以最大光功率一半(样本上的功率密度为0.165kWcm-2)辐射到细胞样品上时，依然在4分钟内被完全漂白(图5b)。本组实验证明，光开关的罗丹明B标记的探针有着优秀抗漂白的超分辨显微成像能力。

[0080] 依据样本的稀疏发光密度，选择高密度定位重建算法PALMER来处理图像。显然，超分辨显微成像(图6a)比起普通成像(图6b)获取了更高的空间分辨率。证明光开关的罗丹明B标记的探针作为一个优秀的超分辨显微成像的探针，能够获取结构更加精细的活细胞内源性肌动蛋白图像。

[0081] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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