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高密度 荧光染料簇

阅读：459发布：2020-05-12

专利汇可以提供高密度荧光染料簇专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及模块空间增强发射染料(SEED)簇，其中将多个SEED分子附加到单一聚合物链上。，下面是高密度荧光染料簇专利的具体信息内容。

权利要求

1. 一种簇，所述簇包含：
包含两个或更多个任选被取代的单体单元的聚合物骨架；
增溶剂；
缀合部位；和
沿着所述聚合物骨架布置的多个空间增强发射染料分子。
2. 权利要求1的簇，其中将至少两种空间增强发射染料连接到一个或多个所述单体单元。
3. 权利要求1的簇，其中所述聚合物包含3至100个单体单元。
4. 权利要求3的簇，其中所述聚合物包含10至40个单体单元。
5. 权利要求1的簇，其中所述簇的流体动力学直径小于100nm。
6. 权利要求5的簇，其中所述簇的流体动力学直径为2-15nm。
7. 权利要求1的簇，其中各单体单元由独立选自以下的基团形成：烯基、丙烯酸酯、醚和胺或它们的组合。
8. 权利要求7的簇，其中所述单体单元由选自以下的基团形成：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯(methylacyrylate)、乙烯基、氨基甲酸酯和环氧化物或它们的组合。
9. 权利要求1的簇，其中所述增溶剂选自包含以下的基团：亲水空间排斥基团、带阳离子的基团、带阴离子的基团和带两性离子的基团或它们的组合。
10. 权利要求1的簇，其中各空间增强发射染料独立地直接或通过连接基连接到所述一个或多个单体单元。
11. 权利要求1的簇，其中所述簇内各空间增强发射染料是相同的。
12. 权利要求1的簇，其中至少两种或更多种不同的空间增强发射染料在所述簇内。
13. 权利要求12的簇，其中不同的空间增强发射染料具有不同的吸收和/或发射波长。
14. 权利要求13的簇，其中所述波长在300和850nm之间。
15. 权利要求14的簇，其中各簇中不同空间增强发射染料之间的比率受控制。
16. 权利要求1的簇，其中各空间增强发射染料独立选自若丹明、荧光素、曙红、菁、硼联吡啶、吨、碳吡啶(carbopyrinins)、吖啶、苯并吡啶 (benzopyriniums)或吖啶。
17. 权利要求1的簇，其中各簇中空间增强发射染料和增溶剂之间的比率受控制。
18. 权利要求1的簇，其中所述缀合部位为选自以下的反应性基团：生物素、羧基、琥珀酰亚胺基酯、磺基-琥珀酰亚胺基酯、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、尸胺、异硫氰酸酯、异氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰胺(例如，溴乙酰胺)、酰卤、酰肼、肼、乙烯基砜、二氯三嗪、亚磷酰胺、磺酰卤、烷基酰亚胺基酯、芳基酰亚胺基酯、碳二亚胺、酐和酰叠氮；或选自以下的官能团：伯胺、仲胺、肼衍生物、羟胺衍生物、吡唑啉酮、巯基、羧基、羟基、硫醇、咪唑、硫代磷酸酯和包括醛和酮的羰基。
19. 权利要求18的簇，其中所述缀合部位在所述聚合物的末端或沿着所述聚合物的骨架。
20. 权利要求18的簇，其中所述缀合部位可结合到靶。
21. 权利要求20的簇，其中所述靶为生物分子。
22. 权利要求21的簇，其中术语“生物分子”包括核酸(例如，DNA或RNA)；核苷酸；包含或衍生为包含一个或多个氨基、巯基、羰基、羟基、羧基和硫代磷酸酯基团的核苷酸；包含或衍生为包含一个或多个氨基、巯基、羰基、羟基、羧基和硫代磷酸酯基团的含氧聚核酸或脱氧聚核酸；微生物细胞，外膜囊泡；病毒；药物；激素；细胞；细胞膜；毒素；寡核苷酸；适配子；蛋白质；蛋白质片段；抗体；抗原；抗体片段(例如，Fab)；糖类、蛋白聚糖、凝集素、脂类、肽、小分子(例如，生物素、生长因子、激素、维生素、治疗剂、药物)；聚合物颗粒或玻璃珠粒。
23. 一种持续发射高密度发光簇，所述发光簇包括：
包含两个或更多个任选被取代的单体单元的聚合物骨架；
增溶剂；
缀合部位；和
多个空间增强发射染料分子，所述染料分子沿着所述聚合物骨架布置，以便抑制旋转衰减，并且使发射持续。
24. 一种持续发射高密度发光簇，所述发光簇对应于：
[B]v[S-B-F]w[B-F]x[B-S]y[B-C]z, 其中
B为任选被取代的单体单元；
S-B-F为连接有空间增强发射染料和增溶剂的单体单元；
B-F为连接有空间增强发射染料的单体单元；
B-S为连接有增溶剂的单体单元；
B-C为连接有缀合部位的单体单元；
v+w+x+y+z为3-100，w+x大于或等于3。
25. 权利要求24的簇，其中任选被取代的单体B包括光稳定部分，例如自由基清除剂、三线态猝灭剂或单线态氧清除剂。
26. 权利要求24的簇，其中任选被取代的单体B包括环境感测体，例如荧光pH感测体、温度感测体或离子感测体。
27. 一种标记靶分子的方法，所述方法包括在一定条件下培育要用权利要求1或权利要求23的簇标记的靶分子，所述条件使得所述簇变得与所述靶分子结合。
28. 权利要求27的方法，其中所述靶分子为生物分子。

说明书全文

高密度 荧光染料簇

技术背景

[0001] 荧光染料广泛用于生物分析(例如，DNA和蛋白质微阵列、DNA/RNA/蛋白质印迹等)、成像(共焦、外荧光、病理学、活的和固定的体外细胞、体内全体等)和诊断(例如，体外诊断、夹心分析、侧流分析)。增强荧光染料的信号强度对荧光的这些用途是有益的，用于增强灵敏度(例如，发现低丰度靶分子)或增加通过量(例如，减少的成像积分时间)。提高信号强度的最简单方法是增加荧光团浓度。然而，这种方法对于常规荧光染料通常是不可能的，因为染料分子在高浓度下电相互作用并猝灭信号。这是对于溶液中游离染料和结合到生物分子或表面的染料二者的情况。因此，由于在足够高局部浓度(例如，多个染料在单一抗体上)猝灭，任何信号增益被信号损失抵消。传统荧光染料的另一个缺陷包括染料通过光源光漂白或光氧化成非荧光形式，这导致染料降解和荧光信号损失。光漂白的速率和方式通常受与溶剂分子(例如，水)相互作用的影响。在照明下光漂白限制染料寿命，在多个时间点需要长积分时间或图像时，这不利地影响底物的成像或检测。

[0002] 因此，由于传统荧光染料的这些缺点，需要能够产生强的长持续信号的新荧光染料。

[0003] 发明概述本发明涉及模块空间增强发射染料(SEED)簇，其中将多个SEED分子附加到单一聚合物链上。本发明的簇围绕在高染料密度下猝灭的染料，因此允许较高染料密度和作为附加到链的染料数的函数的较高信号强度(例如，>1Ox单独荧光团)。通过限制染料-溶剂相互作用的水溶性染料簇的核-壳结构，也使光漂白和氧化破坏最大限度地减小。

[0004] 附图简述图1为用于细胞标记的SEED簇(左)的一个实施方案的示意图，显示缀合到与共同骨架(右)结合的SEED荧光团链的生物分子(抗体，中)。

[0005] 图2为水溶性链-结合SEED簇的荧光光谱(左)，和归一化吸收(峰)和发射(峰)的比较，显示浓度和发射之间线性相关，表明在结合到各簇的分子之间正在发生SEED效果，并且在高浓度下没有浓度介导的猝灭。

[0006] 发明详述本文所述的本发明的簇避免常规荧光染料的几个关键缺点。一个优点是增加每簇亮度，因为多个染料分子结合到单一簇。簇包含用于连接到生物分子或其它主体的缀合部位，使得簇可按与常规荧光团相同的方式连接。另外，本发明的簇的光稳定性以两种方式改善。
首先，本发明的染料分子相对疏水，并以聚集状态存在于水溶液中，这使染料分子不易受溶剂介导的光氧化反应影响。其次，在单一簇中结合多个染料分子保证在簇内单一染料随机闪烁或光漂白的情况下，簇整体上亮度仅仅略微下降，而不是完全消失(完全消失是常规荧光团的情况)，使得用簇标记的靶能够对于成像或检测保持可见。

[0007] 本发明的染料簇的另一个优点包括其模块性质，这使得能够以控制方式整合不同的功能性，以产生多功能探针。例如，结合光稳定部分增加寿命，结合环境响应部分能够感测，小分子靶向剂提高特异性。预料结合多种染料产生分化，并提高信号强度，同时保持那些染料的已知光学和化学性质。这些模块簇的所得性质促进工作流，并改善分析结果。

[0008] 在本发明中使用的染料分子包括可以“空间增强发射染料”(SEED)或者“聚集诱导发射体”(AIE)为特征的任何染料。SEED是一类染料，其显示随增加染料浓度，荧光量子产额的非线性增加，而没有如常规染料中见到的由于猝灭导致的信号损失(见Y. Hong, J. Lam, B. Z. Tang, "Aggregation-Induced Emission: Phenomenon, Mechanism and Applications"(聚集诱导发射：现象、机理和应用), ChemComm, 2009, 4332-4353, 其教导全文通过引用结合到本文中)。不希望受理论限制，SEED分子一般包含缀合到分子的荧光中心但能够围绕键轴旋转的取代基。作为溶液中的游离染料，这种旋转对于染料吸收的能量产生非辐射衰减通道，从而导致染料在溶液中游离时实质上为非荧光性。当通过与相邻染料分子相互作用或包封在刚性基质来阻止分子内旋转时，分子的荧光量子产额显著增加，同时侧基防止与相邻染料的电子作用，使得染料分子能够发射而不猝灭。除非另外说明，在本文中对“染料”的引用是指能够归类为SEED分子的染料。

[0009] 本文所述的簇包括结合到聚合物的一些单体单元上的多个SEED分子。由于SEED分子的疏水性，在水性条件下，它们倾向于避免与水相互作用，从而形成由疏水相互作用结合在一起的簇。簇形成使SEED分子相互分子接触，这抑制染料的旋转(非辐射)衰减方式，并产生密集的染料分子簇，各簇在(或接近)其峰量子效率下独立发射。多个SEED分子连接到单一聚合物骨架使得能够达到很高的局部染料密度，因此例如允许数十个染料分子结合到生物分子。相反，在染料猝灭开始限制信号增益前，常规技术一般限于每个生物分子有1-3个染料分子。

[0010] 本发明的簇相对于至今合成的SEED-聚合物是有利的。SEED聚合物一般为非水溶性的高分子量聚合物。另外，这些SEED-聚合物的荧光性质需要通过以下诱导：首先使SEED-聚合物溶于溶剂(例如，非水溶剂，例如THF)，然后通过增加其中SEED-聚合物不可溶的非溶剂(例如，水)的浓度诱导SEED-聚合物聚集。这样聚集成颗粒产生SEED-聚合物的荧光(见C-T. Lai, J-L. Hong, "Aggregation Induced Emission in Tetraphenylthiophene-derived organic molecules and vinyl polymer"(四苯基噻吩衍生有机分子和乙烯基聚合物中的聚集诱导发射) J. Phys. Chern. B, 2010, 114,10302-10310 和 A. Qin et al."Luminogenic polymers with aggregation-induced emission characteristics,"(具有聚集诱导发射特性的发光聚合物), Progress in Polymer Science, 37 (2012) 182-209, 二者的全部教导通过引用结合到本文中)。相反，本发明的簇为低分子量，水溶性，并且能够在不改变溶剂混合物下发荧光。

[0011] 本发明的一个实施方案包括一种簇，所述簇包括：包含两个或更多个任选被取代的单体单元的聚合物骨架；增溶剂；缀合部位；和沿着聚合物骨架布置的多个空间增强发射染料分子。

[0012] 本发明的一个实施方案包括一种持续发射高密度发光簇，所述发光簇包括：包含两个或更多个任选被取代的单体单元的聚合物骨架；增溶剂；缀合部位；和多个空间增强发射染料分子，所述染料分子沿着聚合物骨架布置，以便抑制旋转衰减，并且发射在水溶液中持续。

[0013] 本发明的一个实施方案包括一种持续发射高密度发光簇，所述发光簇对应于：[B]v[S-B-F]w[B-F]x[B-S]y[B-C]z, 其中
B为任选被取代的单体单元；
S-B-F为连接有空间增强发射染料和增溶剂的单体单元；
B-F为连接有空间增强发射染料的单体单元；
B-S为连接有增溶剂的单体单元；
B-C为连接有缀合部位的单体单元；
v+w+x+y+z为3-100，w+x大于或等于3。

[0014] 在一个优选的实施方案中，v+w+x+y+z为5-80，w+x大于或等于3，在一个更优选的实施方案中，v+w+x+y+z为15-50，w+x大于10。“持续发射”是指保持荧光性质，而不由于漂白或氧化而显著损失信号。

[0015] “簇”是指包括至少两个SEED分子、增溶剂和连接到聚合骨架的生物缀合部位的化合物。

[0016] “高密度”是指簇包括多于一个SEED分子。在至少一个实施方案中，簇包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个染料分子。在至少一个实施方案中，簇包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个染料分子。在至少一个实施方案中，簇包括10-50个染料分子。染料分子可相同或不同。“发光簇”是指簇通过荧光或磷光发光。

[0017] “聚合物”为包含可相互相同或不同的单体单元的化合物。在至少一个实施方案中，聚合物包含3至100个单体单元。在一个具体实施方案中，聚合物包含10至50个单体单元。也可用流体动力学直径限定聚合物的大小。本文所用聚合物的“流体动力学直径”为液体(优选含水)环境中聚合物的有效直径，假定聚合物在溶液中形成球形物体。流体动力学直径可通过本领域的技术人员已知的不同技术测定，包括动态光散射(DLS)和/或荧光相关光谱(FCS)。聚合物的流体动力学直径随组成聚合物的单体的类型和次序而变化。因此，即使具有相同单体数的聚合物也可根据组成而具有不同的流体动力学直径。在至少一个实施方案中，化合物的流体动力学直径小于100nm。在一个具体实施方案中，化合物的流体动力学直径为2-15nm。

[0018] 聚合物可包括相同的单体单元，或者可包括不同的单体单元。在任一情况下，单体单元由选自以下的基团形成：烯基(例如，乙烯基)、丙烯酸酯(例如，丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸烷基酯)、醚(例如，环氧化物等)、胺(例如，氨基甲酸酯、尼龙类型聚合等)或它们的组合。在一个具体实施方案中，单体单元由选自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基、氨基甲酸酯、环氧化物或它们的组合的基团形成。

[0019] 在至少一个实施方案中，染料和增溶剂连接到相同的单体单元。或者，染料和增溶剂连接到不同的单体单元。在至少一个实施方案中，形成的聚合物可由以下形成：包括染料和增溶剂二者的单体单元、分别包括染料和增溶剂的单体单元或它们的组合。在另一个实施方案中，聚合物也任选包括取代基。

[0020] 包括由[B]表示的那些的单体单元可任选用一个或多个取代基取代。这些任选取代基可连接到也包括增溶剂、染料或二者的单体单元。用于单体单元的适合取代基包括烷基(例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基)、醇(例如，羟甲基、羟乙基、羟丙基、低聚(烷基醇)等)、低聚醚(例如，低聚(环氧乙烷)、低聚(环氧丙烷)等)、盐(例如，氯化铵、溴化铵、磺酸钠等)、胺(氨基甲基、氨基乙基、氨基丙基等)、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯、羧酸酯、酮、醛、叠氮、硫醇、胺(伯、仲或叔)、烯烃、炔烃、酯或它们的组合。可离开单体单元或在簇的末端之一处结合的另一类任选的取代基包括光稳定剂、环境响应部分和/或小分子靶向剂。这些取代基可作为单体单元的唯一连接存在，或者可连接到包括本文所述其它单体连接(例如，染料、增溶剂等)的单体单元。

[0021] 光稳定剂，其用于通过防止产生光反应性物类(例如，自由基或单线态氧)或减小其浓度而防止光漂白。本文所用“光稳定剂”包括自由基清除剂、单线态氧清除剂等。在此类中包括自由基清除剂(例如，(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧自由基，TEMPO)和单线态氧清除剂(例如，α-生育酚等)。在一个具体实施方案中，任选被取代的单体B包括光稳定部分，例如自由基清除剂、三线态猝灭剂或单线态氧清除剂。在一个具体实施方案中，任选被取代的单体包括光稳定部分，例如自由基清除剂、三线态猝灭剂或单线态氧清除剂。

[0022] “环境响应部分”使得能够感测簇环境中的化学分析物或物理变量，例如pH或温度。

[0023] “小分子靶向剂”提高簇的特异性。

[0024] “水性增溶剂”或“增溶剂”为提高它连接到的基质的水溶解度的部分。在至少一个实施方案中，增溶剂在聚合物的一个或多个单体单元连接(具体地讲，共价连接)到聚合物。

[0025] 在所给簇内，增溶剂可相同或可不同。增溶剂选自亲水空间排斥基团(例如，低聚(乙二醇)、低聚糖等)、带阳离子的基团(例如，胺)、带阴离子的基团(例如，磺酸盐、羧酸、膦酸盐、磷酸盐等)和带两性离子的基团(例如，氨基-膦酸盐、氨基-磺酸盐，例如，N,N-二甲基-N-丙烯酰氧基乙基-N-(3-磺基丙基)-铵甜菜碱、N,N-二甲基-N-丙烯酰胺基丙基N-(3-磺基丙基)-铵甜菜碱、2-(甲基硫基)乙基甲基丙烯酰-S-(磺基丙基)-硫甜菜碱、2-[(2-丙烯酰基乙基)二甲基铵基]乙基2-甲基磷酸盐、2-(丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵)乙基磷酸盐、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰基胆碱(MPC)、2-[(3-丙烯酰胺基丙基)二甲基氨基]乙基2'-异丙基磷酸盐(AAPI)、1-乙烯基-3-(3-磺基丙基)氢氧化咪唑、1-(3-磺基丙基)-2-乙烯基吡啶甜菜碱、N-(4-磺基丁基)-N-甲基-N,N-二烯丙基胺铵甜菜碱(M DABS)、N,N-二烯丙基-N-甲基 N-(2-磺基乙基)铵甜菜碱、N,N-二甲基-N-(3-甲基丙烯酰胺基丙基)-N-(3-磺基丙基)铵甜菜碱、N,N-二甲基-N-丙烯酰氧基乙基-N-(3-磺基丙基)铵甜菜碱、N,N-二甲基-N-丙烯酰胺基丙基-N-(2-羧基甲基)-铵甜菜碱、N,N-二甲基-N-甲基丙烯酰氧基乙基-N-(3-磺基丙基)铵甜菜碱和N,N-二甲基-N-(3-甲基丙烯酰氨基丙基)-N-(3-磺基丙基)铵甜菜碱)或它们的组合。

[0026] 在至少一个实施方案中，各空间增强发射染料独立地直接或通过连接基连接到所述一个或多个单体单元。连接基部分可以为任何能够使染料部分共价连接到单体的双或多官能基团。具体地讲，连接基部分可包含烷基链、环氧烷链(例如，环氧乙烷/乙二醇)和用于染料缀合的适合官能基团(例如，胺、硫醇、烯烃、炔烃、叠氮、生物缀合化学基团等)。在一个优选的实施方案中，连接基化学性质为双官能(即，对单体和对染料为反应性)，并且疏水。在一个供选的实施方案中，连接基为多官能(例如，三官能或四官能)，包含用于SEED分子连接的多个结合部位和用于单体连接的至少一个部位。在另一个供选的实施方案中，连接基为多官能，并且包含用于SEED分子和单体二者的多个结合部位，使得单体能够在SEED簇合成后交联。用于使染料分子连接到聚合物的单体的连接基可与用于使缀合部位连接到聚合物的连接基相同或不同。在另一个供选的实施方案中，多官能连接基包含多个不同配位化学组成，使得不同的SEED分子能基于使用特定化学组成以特定比率(2:1、
1:1、3:1等)连接，以使各类型的染料分子共价连接到SEED簇。

[0027] 可通过改变所用染料-单体单元数调整每簇亮度和大小(即，流体动力学直径)，可通过适当选择染料调节吸收和发射波长。在至少一个实施方案中，簇内的各空间增强发射染料是相同的。或者，在簇内有至少两种或更多种不同的空间增强发射染料。在一个具体实施方案中，不同的空间增强发射染料具有不同的吸收和/或发射波长。

[0028] 波长是指染料的吸收或激发波长。波长范围可包括单一染料或多种染料的吸收或激发波长二者，或者可以指单一染料或多种染料的仅吸收波长或激发波长。包括单一染料或多种染料的吸收或激发波长二者的代表性波长包括300至800nm。具体地讲，单一染料或多种染料的吸收或激发波长为400至750nm。包括单一染料或多种染料的吸收波长的代表性波长包括450至750nm。具体地讲，单一染料或多种染料的吸收或激发波长为450至650nm。包括单一染料或多种染料的激发波长的代表性波长包括380至420nm。包括单一染料或多种染料的激发波长的代表性波长包括450至520nm。包括单一染料或多种染料的激发波长的代表性波长包括500至550nm。包括单一染料或多种染料的激发波长的代表性波长包括600至650nm。具体地讲，单一染料或多种染料的吸收或激发波长为650至800nm。

[0029] 簇的总体性质可通过控制不同组分之比来调节。在一个实施方案中，控制各簇中不同空间增强发射染料之间的比率。在一个具体实施方案中，在簇内存在等量(1:1比率)的两种不同染料。或者，两种染料以例如但不限于1:2、1:3、1:4或1:5的比率存在。在本发明的另一个实施方案中，簇包括二、三、四或五种不同的空间增强发射染料。在本发明的另一个实施方案中，簇包括四种不同的空间增强发射染料。在本发明的另一个实施方案中，簇包括三种不同的空间增强发射染料。在本发明的另一个实施方案中，簇包括两种不同的空间增强发射染料。当簇中存在多于两种染料时，也可控制这些染料的比率。例如，簇可包含均为等量(例如，1:1:1)或不同量(例如，1:2:1)的三种不同染料。因此，预期在包含多于两种染料的簇中染料比率的类似控制。

[0030] 类似地控制各簇中空间增强发射染料(无论相同还是不同)和增溶剂(无论全部相同还是不同)之间的比率。在一个具体实施方案中，空间增强发射染料和增溶剂以等量(1:1比率)存在于簇内。或者，可在簇内存在不等量的空间增强发射染料和增溶剂。例如，空间增强发射染料和增溶剂可以例如但不限于1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10的比率存在。染料与增溶剂之比取决于很多因素，例如簇的总体大小、染料的大小、单体的疏水性或簇中的染料分子数。

[0031] 可在本发明中使用包含具有SEED分子性质的任何染料。用于制备SEED分子的基本荧光团分子可选自任何已知的有机荧光团种类，例如菁、吨(若丹明、荧光素)、硼-二吡咯亚甲基、硼联吡啶、萘、香豆素、吖啶、吖啶、四吡咯、四苯基乙烯、噁嗪、芘、噁二唑、亚酞菁、碳吡啶(carbopyridin)、苯并吡啶 (benzopyridinium)、酞菁等，并且用多个能够分子内旋转的悬垂缀合基(例如，苯基)适当官能化。

[0032] 代表性SEED分子包括以下：本领域的技术人员应了解，以上SEED分子可以多种不同的方式连接到单体。例如，染料可通过苯基部分连接到单体，如下式所示：
普适染料(Dye)可通过任何附加苯基环的邻、间或对位连接到聚合物骨架，其中苯基环结合到母体荧光团，以产生SEE性质。在一个优选的实施方案中，普适染料(Dye)通过苯基环上的对位结合到聚合物骨架，以便能够围绕Dye 苯基-聚合物轴自由旋转。另外，特定染料种类可通过其它基团(例如，荧光素、曙红和若丹明上的羧酸酯；香豆素的芳核；菁的芳族端基等)结合到聚合物骨架。

[0033] 代表性SEED簇本发明的簇为模块，并且可通过将具有所需特征的部分连接到一个或多个单体单元引入另外的特征，或者可在聚合物的一个或两个末端增加所需的特征，或者，在一个或多个单体单元的组合处或一个或两个末端处向聚合物引入所需的特征。

[0034] 在一个实施方案中，向聚合物骨架引入多官能单体，其中可产生非线性聚合骨架。例如，可用乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯产生具有其它丙烯酸酯共聚单体的支化或交联聚合物链。基于EGDMA的代表性支化SEED簇结构由以下结构表示：
其中'Dye'为SEED分子或SEED分子的连接基团，'Sol'为水性增溶基团，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为
可通过这种模块方法结合的特征包括缀合部位，以便能够连接生物分子(例如，用于靶向的抗体)，或者包含作为光稳定剂、感测体、靶向剂或释药剂的部分。可向聚合物引入这些特征的任何一个或其组合，以产生多官能染料簇。

[0035] 簇包括用于缀合到靶的部位。在一个具体实施方案中，靶为生物分子。因此，簇包括可结合到靶(或者，具体地讲，生物分子)的配位体和/或可结合到靶(或者，具体地讲，生物分子)的靶向结合基团。配位体为特异结合到另一生物分子的生物分子。例如，为了使簇靶向结合到特异抗原，可将抗体连接到簇。备选或附加地，簇可包括“靶向结合基团”，靶向结合基团允许在没有配位体存在下使簇缀合或结合到靶，或具体地讲，生物分子。例如，靶向结合基团包括可与生物分子和/或配位体的官能基团反应的反应性基团，或者包括可与生物分子和/或配位体上的反应性基团反应的官能基团。反应性基团和官能基团之间的反应在簇和生物分子之间形成键或相互作用，从而用SEED簇标记生物分子。

[0036] 在至少一个实施方案中，用于缀合的部位作为结构-L--Q存在，其中L为键或连接基，Q为靶向结合基团。“靶向结合基团”为与靶上的官能基团反应的反应性基团，或者为与靶上的反应性基团反应的官能基团，从而靶变得与簇共价或非共价连接。在一个具体实施方案中，靶为生物分子。

[0037] 在L为键时，靶向结合基团Q直接连接到聚合物。在L为连接基时，靶向结合基团Q与聚合链分离，以提高生物利用率和反应性。

[0038] 在至少一个实施方案中，L为连接基，连接基可包含选自C、N、O、S和P的1-60个链原子，例如，其中结合一个或多个N、O、S或P原子的1-30个碳原子的直链。例如，连接基可以为-(CH2)x-
-((CH2)p-O- (CH2)q)-y
-((CH2)p-CONH- (CH2)q)-y或
-((CH2)p-Ar- (CH2)q)-y, 其中
x为1-30，优选1-10，
p为1-5，
q为0-5，并且
y为1-5。

[0039] 优选的连接基包括亲水且不带电荷的那些连接基，例如聚(乙二醇)连接基。

[0040] 在一个实施方案中，靶结合基团Q可以为适用于在簇和靶组分之间形成共价键的基团，例如以上限定的反应性或官能基团。在备选方案中，靶结合基团Q为亲和标记物，例如，生物素、脱硫生物素或亚氨基生物素，簇通过非共价缔合结合到靶。

[0041] 缀合部位可包括一个或多个反应性和/或官能基团。

[0042] 适合的反应性基团包括但不限于生物素、羧基、琥珀酰亚胺基酯、磺基-琥珀酰亚胺基酯、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、尸胺、异硫氰酸酯、异氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰胺(例如，溴乙酰胺)、酰卤、酰肼、肼、乙烯基砜、二氯三嗪、亚磷酰胺、磺酰卤、烷基酰亚胺基酯、芳基酰亚胺基酯、碳二亚胺、酐和酰叠氮。

[0043] 适合的官能基团包括但不限于伯胺、仲胺、肼衍生物、羟胺衍生物、吡唑啉酮、巯基、羧基、羟基、硫醇、咪唑、硫代磷酸酯和羰基(包括醛和酮)。

[0044] 生物缀合化学为本领域的技术人员所了解。这些技术的代表性说明可见于 Bioconjugate Chemistry：Greg T. Hermanson，"Bioconjugate Techniques, 2nd edition"(生物缀合技术，第2版) Academic Press，2008；和Fluorophores：Joseph Lakowicz, "Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edition"(荧光光谱原理，第3版)，Springer，2006，二者的全部教导通过引用结合到本文中。

[0045] 在一个具体实施方案中，根据靶向生物分子中存在的官能(或反应性)基团，选择在缀合部位存在的反应性(或官能)基团。例如，反应性和官能基团配对包括：反应性基团官能基团
琥珀酰亚胺基酯；磺基-琥珀酰亚胺基酯伯胺；仲胺
酐；酰卤伯胺；仲胺；羟基
异硫氰酸酯，乙烯基砜；二氯三嗪伯胺基
卤代乙酰胺；马来酰亚胺硫醇；咪唑；羟基；胺；硫代磷酸酯
碳二亚胺羧基
肼，酰肼羰基，包括醛和酮
亚磷酰胺羟基
在另一个实施方案中，Q可以为能够与其互补特异结合配偶体特异并且非共价结合的亲和标记物。特异结合配偶体对的实例包括但不限于：生物素/抗生物素蛋白、生物素/链
2+
霉抗生物素、多聚组氨酸标记物-金属离子络合物与次氮基乙酸(例如Ni :NTA)。互补特异结合配偶体可以为用于检测靶分子的标记络合物的一种组分。因此，在一种优选的标记形式中，链霉抗生物素，具有用于生物素标记的四个连接部位，可用作将靶组分上生物素基团与本发明的SEED簇连接的桥，其中Q基团为生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素。应了解，在本发明背景下，可利用相互具有特异结合亲和性的任何两种原子或分子。亲和标记物的优选实例选自生物素、亚氨基生物素和脱硫生物素。另外的优选亲和标记物包括对于DNA/RNA靶序列互补的单链DNA/RNA链。

[0046] 在一个具体实施方案中，缀合部位在聚合物的末端，或者沿着聚合物的骨架，或它们的组合。在一个具体实施方案中，缀合部位在聚合物的末端。在一个具体实施方案中，缀合部位沿着聚合物的骨架。

[0047] 本文所用“生物分子”包括核酸(例如，DNA或RNA)；核苷酸；包含或衍生为包含一个或多个氨基、巯基、羰基、羟基、羧基和硫代磷酸酯基团的核苷酸；包含或衍生为包含一个或多个氨基、巯基、羰基、羟基、羧基和硫代磷酸酯基团的含氧聚核酸或脱氧聚核酸；微生物细胞、外膜囊泡；病毒；药物；激素；细胞；细胞膜；毒素；寡核苷酸；适配子；蛋白质；蛋白质片段；抗体；抗原；抗体片段(例如，Fab)；糖类、蛋白聚糖、凝集素、脂类、肽、小分子(例如，生物素、生长因子、激素、维生素、治疗剂、药物)；聚合物颗粒或玻璃珠粒。

[0048] 使用簇的方法本发明的一个实施方案包括标记靶分子的方法，所述方法包括在一定条件下培育要用一定量染料簇标记的靶分子，所述条件使得簇变得与靶分子结合。在一个具体实施方案中，靶分子为生物分子。

[0049] 本发明也涉及标记生物分子的方法，所述方法包括使SEED簇与生物分子接触的步骤，其中簇包含以下至少之一：反应性和/或官能基团和/或由Q表示的亲和标记物，从而给予生物分子荧光性质。

[0050] 在至少一个实施方案中，本发明的SEED簇可用于本文所述生物分子的单一或多重标记和检测。因此，在第二个方面，本发明提供一种标记生物分子的方法，所述方法包括1)使生物分子与本发明的簇接触；并且2)在适合条件下用生物分子培育簇，其中簇结合到生物分子，从而标记生物分子。

[0051] 与靶分子形成染料缀合物或络合物的方法为本领域的技术人员所熟知，并且可适于形成靶生物分子和簇的络合物。例如，蛋白质的共价标记一般在含水缓冲介质(适合地为碳酸氢盐)中在pH 9.0在环境温度进行通常为1小时的时段。反应一般在暗处进行。标记的蛋白质可通过尺寸排阻色谱法与未反应簇分离，例如，用Sephadex™作为固定相，磷酸盐缓冲剂pH 7.0作为洗脱剂。对于靶生物分子的多重标记，应相应调节簇与靶物质的量或浓度之比。

[0052] 除了前述一步标记方法外，本发明还涉及二步标记方法，其中在第一步，本发明的簇结合到初级靶分子(例如抗体、蛋白质、DNA探针等)从而将其标记。在标记方法的第二步中，然后用荧光标记的初级靶分子作为探针检测二级靶分子，例如抗体对其有特异性的抗原。

[0053] 也可用本发明的簇测定系统中具体蛋白质或其它组分的浓度。如果知道蛋白质上能够与簇反应的反应性基团的数目，则可知道每分子的荧光，并且可通过系统的总荧光强度测定系统中这些分子的浓度。使用微量滴定板读数器或其它已知免疫荧光检测系统，可用这种特定方法检测不同标记分析物的浓度。使用例如荧光偏振检测仪，也可测定荧光标记物质的浓度。

[0054] 本发明的簇也可用于检测方法，其中多个簇共价连接到多个不同的初级靶分子，例如抗体，各初级靶分子对不同的二级靶分子例如抗原有特异性，以鉴定二级靶分子混合物中多种二级靶分子的每一种。根据此使用方法，与标记其它初级靶分子所用的簇分子比较，用具有不同光吸收和发射波长特征的簇单独标记各初级靶分子。然后，将标记的初级靶分子加到包含二级靶分子(例如抗原)的制备物中，并使初级靶分子连接到对其为选择性的相应二级靶分子。可通过例如洗涤从制备物去除未反应的簇，以防止干扰分析。然后使制备物经过一系列激发波长，包括特定荧光化合物的吸收波长。荧光显微镜或其它荧光检测系统，例如流式细胞仪或荧光分光光度计，具有滤光器或单色仪，以选择激发波长和选择荧光发射波长，接着用其测定在对应于所用荧光化合物的波长下的发射强度，荧光强度指示已与特定的经标记初级靶分子结合的二级靶分子的量。进行多参数荧光研究的已知技术包括例如多参数流式细胞法。在某些情况下，可用单一激发波长从混合物中的两种或更多种物质(其中各自在不同波长下发荧光)激发荧光，并且，通过在其相应发射波长下检测其单独荧光强度，可检测各标记物类的量。如果需要，也可使用光吸收方法。

[0055] 本发明的检测方法可用于其中可能产生荧光初级靶分子的任何系统。例如，适合反应性荧光化合物可缀合到DNA或RNA片段，然后，使所得缀合物结合到DNA或RNA的互补靶链。然后，可用适合的荧光检测设备检测结合的荧光缀合物的存在。

[0056] 合成方法不同种类SEED染料的代表性合成。

[0057] 以下方案为制备SEED染料的代表性合成方案。通过改变各方案中描绘的原料或反应条件，可制备代表性SEED染料的变体。

[0058] SEED分子连接到簇或聚合物。

[0059] SEED分子可以两种方式连接到簇。在方法A中，用附有SEED分子的单体单元形成簇。在方法B中，通过SEED分子和聚合物链二者上的反应性部分，可将SEED分子加到预形成的聚合链。

[0060] 合成缀合部位。

[0061] 也可以多种方式合成包括缀合部位的簇的合成。在一个方案中，当正在形成时，反应性(或官能)基团可作为共聚单体引入到聚合物链，因此，单一聚合物可结合多个反应性(或官能)基团。在此实施方案中，单体必须包含两种官能性，首先是能够在聚合(例如，丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、环氧化物等)形成聚合物时与骨架反应的化学组成，以及选自本文限定的反应性(或官能)基团列举的第二反应性基团。

[0062] 或者，缀合部位可作为链终止剂引入，其中在与缀合部位的反应性(或官能)基团反应时终止链增长。此实施方案保证包含反应性(或官能)基团的各聚合物只包含一个反应性(或官能)基团，这在防止交联反应中为重要的，在交联反应中单一聚合物与多个生物分子反应，这可导致在使用中生物分子的失活或其它不需要或不非预期的行为。

[0063] 或者，可在合成中使用包含反应性基团的链引发剂。同样，使用适当控制的自由基聚合技术，例如可逆加成-断裂链转移(RAFT)，允许通过适当改性的二硫酯控制结合反应性(或官能)基团。也可使用其它受控自由基聚合技术，例如原子转移自由基聚合(ATRP)。使用受控自由基聚合技术的一个优点是与传统自由基聚合相比较低的多分散性。关于其它聚合技术，例如阴离子聚合，也可通过适当选择的引发剂结合反应性物类。

[0064] 生物缀合化学为本领域的技术人员所了解。这些技术的代表性说明可见于 Bioconjugate Chemistry：Greg T. Hermanson，"Bioconjugate Techniques, 2nd edition"(生物缀合技术，第2版) Academic Press，2008；和Fluorophores：Joseph Lakowicz, "Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edition"(荧光光谱原理，第3版)，Springer，2006，二者的全部教导通过引用结合到本文中。
实施例

[0065] 实施例1. 合成对羟基化四苯基乙烯(TPE-OH)按照J. Org. Chern., 2005, 70, 3765中报告的文献工序制备这种化合物。在
250mL火焰干燥的圆底烧瓶中加入二苯基乙炔(4g, 22.5mmol)，加入对碘苯酚(14.8g,
67.5mmol)和苯基硼酸(8.16g, 67.5mmol)，并溶于100mL 80/20 DMF/H2O(v/v)，随后加入碳酸氢钾(6.7g, 67.5mmol)。将此反应混合物塞住，并经氮气吹洗，同时搅拌30分钟。30分钟后，加入PdCh(PhCNh催化剂(0.086g, 0.22mmol)，并将反应混合物在室温搅拌过夜。
将反应混合物用200mL水稀释，有机化合物萃取进入200mL二氯甲烷(两次)，并经MgSO4干燥。由于TPE-OH只微溶于己烷，通过己烷洗涤去除唯一的副产物(对羟基联苯)。提纯后分离3.6g TPE-OH。

[0066] 实施例2. 合成TPE-甲基丙烯酸酯单体(TPE-M-单体)将TPE-OH(2g, 6.57mmol)放入250mL火焰干燥的圆底烧瓶，并加入三乙胺(0.73g,
7.2mmol)。使此混合物溶于100mL二氯甲烷，将烧瓶塞好，并经氮气吹洗30分钟。稍后，使甲基丙烯酰氯(0.718g, 6.9mmol)溶于30mL二氯甲烷，滴加入放在冰浴的反应混合物。滴加超过30分钟后，使反应混合物温热至室温，并搅拌过夜。反应用100mL水猝灭，用100mL二氯甲烷萃取两次，有机层经MgSO4干燥。利用洗脱剂乙酸乙酯:己烷=10:90，用柱层析(二氧化硅)纯化产物。来自柱层析的第一洗脱级分为产物。产量：1.3g。

[0067] 实施例3：合成TPE-M-聚合物将TPE-M-单体(在甲苯中30%重量，0.3g在0.7g甲苯中)放入单颈圆底烧瓶，塞好，并经氮气吹洗30分钟。在尽可能多地除氧后，加入4%摩尔偶氮二异丁腈(AIBN)，将冷水冷凝器装到烧瓶，在80℃回流过夜。为了猝灭反应，用5mL二氯甲烷稀释反应混合物。将此反应混合物滴加到烧杯中的20mL甲醇，同时搅拌溶液。聚合物沉淀，过滤溶剂，分离0.2g聚合物。

[0068] 实施例4：合成TPE-M-聚合物-水溶物-1将TPE-M-单体(在甲苯中30%重量，0.3g在0.7g甲苯中)放入单颈圆底烧瓶，塞好，并经氮气吹洗30分钟。向此混合物加入20%摩尔APES-10(铵烯丙基聚乙氧(10)烷氧基化丙烯酸酯)作为水增溶单体。在尽可能除去所有氧后，加入4%摩尔AIBN，将冷水冷凝器装到烧瓶，同时使反应混合物在80℃回流过夜。完成后，用5mL二氯甲烷稀释反应混合物。
然后将此混合物滴加到烧杯中的20mL甲醇，同时搅拌溶液。聚合物沉淀，过滤溶剂，分离
0.2g聚合物。

[0069] 实施例5：另外的水溶性TPE-M-聚合物通过APES-10的%摩尔从20%摩尔改变到67%摩尔，伴随着增加的水溶解度，用类似工序制备TPE-M 聚合物的不同水溶性形式。也按照类似工序制备第二TPE-M-聚合物，其中用
2-丙烯酰胺基甲基丙磺酸作为水增溶单体代替APES-10。以50%摩尔比率试验此单体，发现比APES-10显示更好的水增溶作用。

[0070] 实施例6：另外的水溶性TPE-M-聚合物合成以上水溶性SEED簇。具体地讲，使四苯基乙烯甲基丙烯酸酯(TPEM)单体与2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPSAA)以1:1摩尔比反应，用偶氮二异丁腈(AIBN)作为自由基引发剂以0.04:1的AIBN:TPEM 摩尔比加入。使此混合物在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中在氮气下在80℃回流12小时，随后，将粗反应混合物倒入搅拌的丙酮溶液，以沉淀染料簇。
将沉淀物真空过滤，以去除有机物，并在室真空(house vacuum)下干燥聚合物。

[0071] 实施例7：水溶性TPE-M-聚合物的荧光对于吸光度/荧光研究，最初使染料簇以10.8mg/ml的浓度溶于二甲基亚砜(DMSO)。
将此溶液稀释到水中，以产生在水中5.4µg/ml至108µg/ml浓度的水溶液。过滤(0.2微米特氟隆膜)高浓度样品，在Brookhaven动态光散射装置上测定其流体动力学大小。发现染料簇初始批料的尺寸为18nm直径(由于簇在溶液中的低散射横截面，此尺寸为近似值)。

[0072] 为了显示染料簇性质，我们研究了浓度(通过吸光度测定)和荧光发射之间的关系。对于未结合的AIE染料，此关系为高度非线性，因为荧光的量子产额取决于染料周围的局部环境，并且对自由扩散染料有很低的量子产额，在染料开始聚集时有S形强度增加，而对于高浓度则为平台，其中染料分子完全聚集，并且所有染料分子在峰量子产额下发射。对于链结合的染料分子，预料此关系为线性，因为事实上染料分子由于链上的分子量近似而“预聚集”，因此，它们的环境不随浓度而改变，它们的荧光量子产额也不改变。我们的结果2
显示归一化吸光度和归一化发射之间的线性相关(R=0.999，对于5个浓度，斜率=1.039，图2)。

[0073] 等同方案本领域的技术人员应认识到或只用常规试验而能够确定本文所述具体程序的很多等同方案。认为这些等同方案应在本发明的范围内，并由以下权利要求覆盖。

标题	发布/更新时间	阅读量
半菁类荧光染料	2020-05-11	272
水溶性荧光菁染料	2020-05-12	785
香豆素荧光染料	2020-05-11	617
靶向荧光染料及其应用	2020-05-12	125
一种荧光染料及其应用	2020-05-12	833
功能性荧光染料	2020-05-11	148
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一种菁类荧光染料	2020-05-13	607
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高密度荧光染料簇

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