从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法
阅读：118发布：2023-03-02
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1.一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，其特征在于，该从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法包括以下步骤：
步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；
步骤二、特异性引物的制备；
步骤三、荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应；
步骤四、RealAmp标准曲线的构建；
步骤五、结果判断；
步骤一对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA的步骤：
按照1克土对应2ml的比例加入SPCB缓冲液，100μg/ml蛋白酶K 37℃处理30min-60min，然后终浓度为1％的SDS 65℃水浴1-2hr后，室温离心取上清，等体积的氯仿抽提一次去除蛋白，若抽提后界面还不清晰，使用氯仿抽提一次；离心后取上清，加入0.3M的NaAc pH 5.2和等体积的异丙醇-20℃1hr沉淀DNA，离心后用75％乙醇清洗1-3次，加入100μl的ddH2O；
SPCB缓冲液为100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，120mM Na3PO4，2％CTAB，1.5M NaCl，pH 8.0，2％巯基乙醇；
纯化步骤：G-50与PVPP混合制备纯化柱子，或采用Bio-rad的Micro Bio-Spin，过柱后保存DNA备用；
柱子制备：0.8ml G-50slurry加入离心管至13-14mm，在上面加入干的PVPP至5-7mm，然后两次加入100μl的水后350g 3min，最后在制备好的柱子中加入100μl的DNA，350g离心
1min，再次 离心纯化DNA；
步骤二特异性引物的制备具体方法如下：
1)根据Foc SCAR特异性序列GenBank登录号EF155535.1设计出2对特异性引物，包含外引物FocTR4-F3和FocTR4-B3和内引物FocTR4-FIP和FocTR4-BIP各一对；
2)由两对引物构成的引物混合液，其中FocTR4-F3即5′-CGAATGGCAAGAGTCTGTT-3′和FocTR4-B3即5′-TGTTCTGCCAGTTTGACG-3′为外引物，FocTR4-FIP即5′-
GAGCGCGGTGGCTCAATACGATACCTGTGAAGTCGC-3′和FocTR4-BIP即5′-
CGCTGGCTTCCGAAACTACTTGACAAGAACACCAGAAGC-3′为内引物，所述外引物FocTR4-F3和所述外引物FocTR4-B3的浓度分别为5pmol/μl；所述内引物FocTR4-FIP和所述内引物FocTR4-BIP的浓度均为40pmol/μl；
步骤三荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应具体方法为：
RealAmp 25μL反应体系：1μL DNA作为模板，2.5μL 10×Bst DNA polymerse buffer、
1.4mM dNTPs、0.8mM甜菜碱、8mM MgSO4、0.2μM的外引物FocTR4-B3和FocTR4-F3、1.6μM的内引物FocTR4-FIP和FocTR4-BIP、1μL Bst DNA polymerase 8U/μL，0.2μM SYTO-9荧光染料，补水至25μL，然后再加入等体系的石蜡油覆盖整个反应液防止挥发；RealAmp反应在ESE-Quant Tube Scanner上进行，63℃反应90min后80℃反应10min终止反应；
RealAmp反应前在反应管内盖上加入1μL 1:10倍稀释的SYBR Green I荧光染料，待反应结束后离心将SYBR Green I加入LAMP反应液中进行显色观察；
设置阳性对照反应时，用感染FOC的香蕉基因组总DNA代替；设置阴性对照反应时，用TE即100mM Tris-HCl pH 8.0与50mM EDTA代替，将含有配制好的反应溶液的反应管置于63℃反应90min；反应结束后显示屏上显示扩增曲线；
步骤四RealAmp标准曲线的构建方法如下：
采用RealAmp的外引物FocTR4-F3、FocTR4-B3，克隆该序列到pMD18-T载体测序正确后的质粒，命名为pMD18-T-FocR4，用于构建标准曲线；
香蕉枯萎病菌4号小种的PCR检测反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer，2.5mM dNTPs 2μL，5U/μL Taq聚合酶0.25μL，10pM引物FocTR4-F3、FocTR4-B3各1μL，1μL DNA，补水至25μL；
PCR反应的条件：94℃预变性3min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延长30s、进行30次循环；72℃延长7min；
反应结束后，取5μL反应产物，1％琼脂糖凝胶电泳后染色观察结果，PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将质粒命名为pMD18-T-FocR4，10倍梯度稀释后作为模板用于评估RealAmp的检测灵敏度并由此构建香蕉枯萎病菌4号小种的RealAmp标准曲线；
步骤五结果判断；
一种是定量检测结果的判断，在ESE-Quant Tube Scanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果；
第二种，反应结束后用手甩，或采用离心将反应管内盖上的SYBR Green I混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法
技术领域
[0001] 本发明属于香蕉枯萎病菌检测领域，尤其涉及一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法。
背景技术
[0002] 香蕉为芭蕉科芭蕉属植物，是热带亚热带地区重要的经济作物和粮食作物。香蕉枯萎病是香蕉产业的毁灭性病害，严重制约着我国香蕉产业健康发展。
[0003] 香蕉枯萎病病原菌为Fusarium oxysporum Schlevht.f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyd.&Hans（.Foc），曾用名Fusarium cubense E.F.Smith，属于半知菌类，瘤座菌目，镰孢菌属，中文名称为尖孢镰孢菌古巴专化型。该菌分为3个小种（race）。在我国，主要为1号小种（race1,R1）和4号小种（race4，R4）。1号小种发生历史悠久，主要侵染粉蕉等，可以通过改种Cavendish类香蕉来解决1号小种的危害。4号小种于1996年传入我国，严重危害我国香蕉产业的安全。4号小种又细分为亚热带4号小种（Subtropicalrace4,ST4）和热带4号小种(Tropicalrace4,TR4)。
[0004] 香蕉枯萎病的传播分远距离传播和近距离传播，远距离以病原菌随香蕉组培苗二级苗的调运为主，近距离传播是病原菌在蕉园内随土壤传播蔓延。Foc是一种维管束病害，也是热带重要的土传病害，Foc的厚垣孢子在土壤中可以存活很多年，一旦遇到寄主即可侵染发病。因此，在实际生产中迫切需要针对土壤的病原菌快速检测技术，用来检测组培苗二级苗土壤、新开辟蕉园土壤是否带菌以及疑似病株的快速诊断。因此，建立一套香蕉枯萎病病原菌4号小种快速、稳定的检测方法是我国香蕉安全生产的重要保证。
[0005] 近年来，有报道证实基于PCR的方法已经成功用于Foc的检测，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR检测技术需要特殊的仪器设备且检测成本较高，而且它的检测时间也还是比较长（2～3小时），不适合田间大规模的快速应用。此外，由于目前报道的PCR检测方法主要应用与感染的香蕉植株，没有针对土壤开发相关的快速诊断技术。因此，在加强香蕉苗木以及土壤病原菌的检疫监测中，迫切需要开发一种灵敏度高、操作简便、成本低廉且结果判断迅速的检测方法，在一定程度上可以取代PCR的检测方法。
[0006] DNA环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP）克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性（Notomi等，2000）。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术（LAMP）反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63℃保温1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。
[0007] 实时荧光核酸恒温扩增检测技术（real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification assay，简称RealAmp）是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，可以定量检测病原物，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。此外，SYBR GreenI是目前LAMP产物最灵敏的检测方法之一，但是在RealAmp中SYBR GreenI的加入可能会抑制LAMP的反应效率，因此，在实际操作中普遍采用SYTO-9荧光染料进行RealAmp反应，而把SYBRGreenI染色颜色判断结果作为定量检测的一种辅助判断措施。
[0008] Linetal.(2009)通过随机引物扩增RAPD获得一个Focrace4特异性的OPA02404RAPD分子标签（GenBank登录号EF155535.1），以此序列为基础设计特异引物检测Race4。并根据OPA02404序列设计了Focrace4的PCR特异性引物Foc-1/Foc-2(5′-CAGGGGATGTATGAGGAGGCT-3′/5′-GTGACAGCGTCGTCTAGTTCC-3′)，扩增片段大小为242bp，对香蕉组织进行快速检测分析。
[0009] Lietal.(2013)根据Focrace4特异性PCR引物Foc-1/Foc-2扩增序列进行测序后命名为Foc242，并根据此序列设计了FocSc-1/FocSc-2(5′-CAGGG GATGTATGAGGAGGCTAGGCTA-3′/5′-GTGACAGCGTCGTCTAGTTCCTTGGAG-3′)的real-timePCR引物，对疑似香蕉的叶片和假茎等组织进行定量Foc检测。
[0010] Ditaetal.(2010)通过分析香蕉枯萎病病原菌不同小种TEF-1α基因和IGS基因序列的分析得到，IGS基因具有足够的SNP可以用于设计引物特异性检查TR4，而TEF-1α基因不具备足够的SNP，序列相对保守无法区分不同的小种，因此，以IGS的SNP多态性为基础设计了热带4号小种（Tropicalrace4，TR4）的PCR扩增的特异性引物对FocTR4-F（5′-CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3′）/FocTR4-R（5′-CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3′）可以检测FocTR4，扩增片段大小为463bp。
[0011] Lietal.(2013)根据Focrace4RAPD特异性序列OPA0240（4 GenBank登录号EF155535.1）设计LAMP引物并应用该技术对感染的香蕉组织进行检测。
[0012] 目前，Linetal.(2009)、Ditaetal.(2010)建立的PCR检测方法，Lietal.(2013)建立的real-timePCR方法以及Lietal.(2013)建立的LAMP检测方法均有不足之处。
[0013] 第一，PCR及LAMP方法均无法进行定量检测，并且该技术仅针对香蕉组织，而不是针对土壤进行检测。第二，Real-timePCR虽然可以定量检测，也不针对土壤进行定量病原菌检测。此外，这些方法需要提取较高纯度的样品基因组DNA、用时较长，也不能现场检测土壤样品，且需要昂贵而精密的温度循环装置，必须借助电泳仪才能对判别扩增产物的阳性或阴性，成本高，不易操作，需要具有一定技术水平的专业人员才能开展检测工作。
发明内容
[0015] 本发明是这样实现的，一种从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法，该从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法包括以下步骤：
[0016] 步骤一、对被检样品进行预处理，提取被检样品的DNA；
[0017] 步骤二、特异性引物的制备；
[0018] 步骤三、荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应；
[0019] 步骤四、RealAmp标准曲线的构建；
[0020] 步骤五、结果判断。
[0021] 进一步，步骤一被检样品DNA提取的步骤：
[0022] 按照1克土对应2ml的比例加入SPCB缓冲液，100μg/ml蛋白酶K37℃处理30min-60min，然后终浓度为1%的SDS65℃度水浴1-2hr后，室温离心取上清，等体积的氯仿抽提一次去除蛋白，若抽提后界面还不清晰，可以考虑氯仿抽提一次；离心后取上清，加入0.3M的NaAcPh5.2和等体积的异丙醇-20℃1hr沉淀DNA，离心后用75%乙醇清洗1-3次，加入100μl的ddH2O；
[0023] SPCB缓冲液为100mmol/LTris-HCl，100mmol/LEDTA，120mMNa3PO4，2%CTAB，1.5MNaCl，pH8.0，2%巯基乙醇；
[0024] 纯化步骤：G-50与PVPP混合制备纯化柱子，也可采用Bio-rad的Micro Bio-Spin，过柱后保存DNA备用；
[0025] 柱子制备：0.8mlG-75slurry加入离心管约13-14mm，在上面加入干的PVPP约5-7mm，然后两次加入100ul的水后350×g3min，最后在制备好的柱子中加入100μl的土壤DNA，
350g离心1min，再次离心纯化DNA。
350g离心1min，再次离心纯化DNA。
[0026] 进一步，步骤二中特异性引物的制备具体方法如下：
[0027] 1）根据FocSCAR特异性序列GenBank登录号EF155535.1设计出2对特异性引物，包含内侧引物F3和B3和外侧引物FIP和BIP各一对；
[0028] 2）由两对引物构成的引物混合液，其中F3即5′-CGAATGGCAAGAGTCTGTT-3′和B3即5 ′- T G T T C T G C C A G T T T G A C G - 3 ′为 外 侧 引 物 ，F I P 即 5 ′-GAGCGCGGTGGCTCAATACGATACCTGTGAAGTCGC-3′和BIP即5′-
CGCTGGCTTCCGAAACTACTTGACAAGAACACCAGAAGC-3′为内侧引物，所述外引物FocTR4-F3和所述外引物FocTR4-B3的浓度分别为5pmol/μl；所述内引物FocTR4-FIP和所述内引物FocTR4-BIP的浓度均为40pmol/μl。
CGCTGGCTTCCGAAACTACTTGACAAGAACACCAGAAGC-3′为内侧引物，所述外引物FocTR4-F3和所述外引物FocTR4-B3的浓度分别为5pmol/μl；所述内引物FocTR4-FIP和所述内引物FocTR4-BIP的浓度均为40pmol/μl。
[0029] 进一步，步骤三荧光核酸恒温扩增检测技术RealAmp反应具体方法为：
[0030] 将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63℃保温90min进行循环链置换反应；
[0031] RealAmp25μL反应体系：1μL抽提的核酸DNA作为模板，2.5μL10×BstDNApolymersebuffer、1.4mMdNTPs、0.8mM甜菜碱、8mMMgSO4、0.2μM的外引物B3和F3、1.6μM的内引物FIP和BIP、1μL Bst DNA polymerase8U/μL，0.2μMSYTO-9荧光染料，补水至25μL，然后再加入等体系的石蜡油覆盖整个反应液防止挥发；
[0032] RealAmp反应在ESE-QuantTubeScanner上进行，63℃反应90min后80℃反应10min终止反应；
[0033] RealAmp反应前在反应管内盖上加如1μL1:10倍稀释的SYBRGreenI荧光染料，待反应结束后离心将SYBRGreenI加入LAMP反应液中进行显色观察；
[0034] 设置阳性对照反应时，用感染FOC的柑橘基因组总DNA代替；设置阴性对照反应时，用TE即100mMTris-HClpH8.0与50mMEDTA代替，将含有配制好的反应溶液的反应管置于63℃反应90min；反应结束后显示屏上显示扩增曲线。
[0035] 进一步，步骤四构建RealAmp标准曲线的方法如下：
[0036] 采用RealAmp的外侧引物F3/B3，克隆该序列到pMD18-T载体测序正确后的质粒，命名为pMD18-T-FocR4，用于构建标准曲线；
[0037] 香蕉枯萎病菌4号小种的PCR检测反应体系为：2.5μL10×PCRbuffer即Mg2+，2μLdNTPs即2.5mMeach，0.25μLTaq聚合酶5U/μL，引物F3/B3各1μL10pM，1μLDNA，补水至25μL；
[0039] 反应结束后，取5μL反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后染色观察结果，PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将该质粒命名为pMD18-T-FocR41.2ng/μL，10倍梯度稀释后作为模板用于评估RealAmp的检测灵敏度并由此构建香蕉枯萎病菌4号小种的RealAmp标准曲线。
[0040] 进一步，步骤五结果判断采用两种方法判断结果；
[0041] 一种是定量检测结果的判断，在ESE-QuantTubeScanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果；
[0042] 第二种，反应结束后用手甩，也可采用离心将反应管内盖上的SYBRGreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
[0043] 本发明提供的实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Real-time fluorescence loop-meidated isothermal amplification assay，简称RealAmp）是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，克服以往第一代LAMP检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。
[0044] RealAmp第一可以定量检测病原物，第二，由于LAMP的特性，BstDNApolymerase具有链置换能力，对土壤DNA提取物中包含的抑制物质具有很好的耐受性。第三，针对土壤开展检测工作。第四，采用不开盖（closed-tubedetection technique）不易受污染物的影响且能现场检测土壤样品，分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用。附图说明
[0045] 图1是本发明提供的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法流程图。
[0046] 图2是本发明实施例提供的Focrace4LAMP引物设计示意图。
[0047] 图3是本发明实施例提供的香蕉枯萎FocRace4RealAmp特异性测试图；
[0048] （A）以香蕉枯萎病病原菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubense(Foc)）1号小种（race1）、亚热带4号小种（SubtropicalRace4，ST4）、热带4号小种（Tropical Race4，TR4）、甜瓜蔓枯病菌（Mycosphaerella melonis）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerium）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）的DNA以及土壤、水为对照用来测试LAMP的特异性（分别对应编号的1-8），仅模板是FocRace4（TR4和ST4）基因组DNA的显色为绿色，其余均为橙色。
[0049] （B）使用香蕉枯萎病菌4号小种（Race4）特异性PCR检测引物Foc-1/Foc-2，扩增（A）中的1-8，仅模板是TR4和ST4基因组DNA显示有单一242bp条带，其余均无条带；“M”MarkerDL2000。
[0050] （C）SYBRGreenI染色法检测（A）中各个模板的RealAmp扩增产物，绿色是阳性，而橙色是阴性。
[0052] 图4是本发明实施例提供的Focrace4RealAmp检测的灵敏度及其标准曲线构建图；
[0053] （A）以pMD18-T-Foc质粒DNA为模板（1.2ng/μL）进行RealAmp灵敏性分析，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示RealAmp的检测下限约为1.2pg/μL。
[0054] （B）SYBRGreenI染色法检测（A）中各个模板的RealAmp扩增产物，辅助判断结果。绿色是阳性，而橙色是阴性，染色结果与(A)中的电泳检测结果一致。
[0055] （C）各浓度pMD18-T-Foc质粒DNAESE-Quant Tube Scanner仪器进行RealAmp扩增反应后的扩增曲线。X轴表示扩增时间（min），Y轴表示响应的荧光信号强度（mV）。
[0056] （D）香蕉枯萎病菌4号小种RealAmp扩增曲线的构建。不同浓度的起始模板DNA浓度与相应的Tt值之间的关系而构建，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间（Tt）。
[0057] 图5是本发明实施例提供的田间部分土壤样品香蕉枯萎病菌4号小种的定量检测分析图；
[0058] （A）ESE-QuantTubeScanner仪器进行RealAmp扩增反应后的扩增曲线，无菌水为阴性对照（Control）。以浓度为6.8×10-3ng的质粒DNA为阳性对照（编号为11），其余12，13，41，42，43和45为不同蕉园采集的土壤。
[0059] （B）依据标准曲线所计算出的每克土壤中的香蕉枯萎病菌4号小种的含量。编号同（A）。
具体实施方式
[0060] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0061] 图1示出了本发明提供的从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
[0062] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0063] 步骤一、对被检样品进行预处理，快速提取被检样品的DNA
[0064] DNA提取步骤：按照1克土对应2ml的比例加入SPCB缓冲液（100mmol/L Tris-HCl,100mmol/LEDTA,120mMNa3PO4，2%CTAB,1.5MNaCl,pH8.0，2%巯基乙醇），100μg/ml蛋白酶K37℃处理30min-60min，然后终浓度为1%的SDS65℃度水浴1-2hr后，（室温）离心取上清，等体积的氯仿抽提一次去除蛋白，如果抽提后界面还不清晰，可以考虑氯仿抽提一次。离心后取上清，加入0.3M的NaAc（Ph5.2）和等体积的异丙醇-20℃1hr沉淀DNA，离心后用75%乙醇清洗
1-3次，加入100μl的ddH2O。
1-3次，加入100μl的ddH2O。
[0065] 纯化步骤：G-50与PVPP混合制备纯化柱子（或者采用Bio-rad的Micro Bio-Spin），过柱后保存DNA备用。
[0066] 柱子制备：0.8mlG-75slurry加入离心管约13-14mm，在上面加入干的PVPP约5-7mm，然后两次加入100ul的水后350×g3min。最后在制备好的柱子中加入100μl的土壤DNA，
350g离心1min（离心让DNA进入G-75）,再次离心纯化DNA即可。
350g离心1min（离心让DNA进入G-75）,再次离心纯化DNA即可。
[0067] 步骤二、特异性引物的制备：
[0068] 根据FocSCAR特异性序列（GenBank登录号EF155535.1）设计出2对特异性引物，包含内侧引物（F3和B3）和外侧引物（FIP和BIP）各一对。由两对引物构成的引物混合液，其中F3（5′-CGAATGGCAAGAGTCTGTT-3′）和B3（5′-TGTTCTGCCAGTTTGACG-3′）为外侧引物，FIP（5′-GAGCGCGGTGGCTCAATACGATACCTGTGAAGTCGC-3′）和BIP（5′-CGCTGGCTTCCGAAACTACTTGACAAGAACACCAGAAGC-3′）为内侧引物，所述外引物FocTR4-F3和所述外引物FocTR4-B3的浓度分别为5pmol/μl；所述内引物FocTR4-FIP和所述内引物FocTR4-BIP的浓度均为40pmol/μl。
[0069] 表1Focrace4RealAmp特异性检测引物序列
[0070]
[0071] Focrace4LAMP引物设计示意如图2所示。
[0072] 步骤三、荧光核酸恒温扩增检测技术（RealAmp）反应
[0073] 将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63℃保温90min进行循环链置换反应。RealAmp是在ESE-Quant Tube Scanner上进行操作的，ESE-Quant Tube Scanner是一个热循环和荧光检测与一体的RealAmp扩增仪器，具有8个加热孔，仪器自身带有显示屏可以直接显示检测结果，还可以连接到电脑上由电脑控制。扩增结束后在显示屏上显示的扩增曲线有一下几个数值：
[0074] Tt值(threshold time,Tt)是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的时间，与荧光PCR中的Ct值比较类似。
[0075] 阈值（threshold）是指设定的荧光信号值。荧光信号值是指反应管中仪器测定的荧光信号强度，用milli-volts(mV)表示。
[0076] RealAmp25μL反应体系：1μL抽提的核酸DNA作为模板，2.5μL10×BstDNA polymerse buffer、1.4mM dNTPs、0.8mM甜菜碱、8mMMgSO4、0.2μM的外引物（B3和F3）、1.6μM的内引物（FIP和BIP）、1μLBstDNApolymerase（8U/μL），0.2μMSYTO-9荧光染料，补水至25μL，然后再加入等体系的石蜡油覆盖整个反应液防止挥发。RealAmp反应在ESE-Quant Tube Scanner(ESE Gmbh,Stockach,Germany)上进行，63℃反应90min后80℃反应10min终止反应。RealAmp反应前在反应管内盖上加如1μL1:10倍稀释的SYBRGreenI荧光染料，待反应结束后瞬时离心将SYBRGreenI加入LAMP反应液中进行显色观察，避免开盖检测气溶胶污染。设置阳性对照反应时，用感染FOC的柑橘基因组总DNA代替；设置阴性对照反应时，用TE（100mMTris-HCl（pH8.0），50mM EDTA）代替，将含有配制好的反应溶液的反应管置于63℃反应90min。反应结束后显示屏上显示扩增曲线，X轴表示扩增时间，Y轴显示荧光值。
[0077] 步骤四、RealAmp标准曲线的构建
[0078] 为了精确评估RealAmp的检测灵敏度并由此构建标准曲线，采用RealAmp的外侧引物F3/B3，该引物扩增的的包含整个RealAmp的扩增区间，因此，克隆该序列到pMD18-T载体测序正确后的质粒，命名为pMD18-T-FocR4，用于构建标准曲线。
[0079] 香蕉枯萎病菌4号小种的PCR检测反应体系为：2.5μL10×PCRbuffer（Mg2+），2μLdNTPs（2.5mMeach），0.25μLTaq聚合酶（5U/μL），引物F3/B3各1μL（10pM），1μLDNA，补水至25μL；PCR反应的条件：94℃预变性3min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延长30s、进行30次循环；72℃延长7min。反应结束后，取5μL反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳后染色观察结果。PCR扩增条带切胶回收连接pMD-18-T载体后测序正确后，将该质粒命名为pMD18-T-FocR4（1.2ng/μL），10倍梯度稀释后作为模板用于评估RealAmp的检测灵敏度并由此构建香蕉枯萎病菌4号小种的RealAmp标准曲线。标准曲线是根据不同稀释的模板pMD18-T-FocR4的起始质粒浓度与相应的Tt值之间的关系而构建的，X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模板扩增达到阈值所用的时间（Tt）。
[0080] 步骤五、结果判断
[0081] 本发明实施例采用两种方法判断结果，一种是定量检测结果的判断，直接在ESE-Quant Tube Scanner反应结束后，仪器自动根据标准曲线显示定量结果。另外，为了适应田间的快速结果判断，反应结束后用手甩或者瞬时离心将反应管内盖上的SYBR GreenI混入到反应液中，采用不开盖显色来判断结果，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。不开盖检测可以避免样品之间的交叉污染，而且可以作为定量检测结果之外的辅助判断方式。
[0082] 按照上述步骤开展LAMP检测的特异性、灵敏性及标准曲线的构建和田间应用分析。
[0083] RealAmp的特异性分析：以香蕉枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense(Foc)）1号小种（race1）、亚热带4号小种（SubtropicalRace4，ST4）、热带4号小种（TropicalRace4，TR4）、甜瓜蔓枯病菌（Mycosphaerella melonis）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）的DNA以及土壤、阴性对照来测试RealAmp反应的特异性，结果显示仅模板是Focrace4（包括ST4和TR4）基因组DNA的显色为绿色、表明为阳性，其余均为橙色、表明为阴性（见图3-C）；经2%琼脂糖凝胶电泳检测各个PCR管的产物，仅模板是Focrace4（ST4和TR4）基因组DNA显示有梯度条带，其余均无梯度条带（见图3-A），表明在RealAmp检测中只有阳性反应的才有梯度条带，而阴性反应的无梯度条带；参考Lin等（2009）设计的香蕉枯萎病race4特异性PCR检测引物Foc-1/Foc-2(5′-CAGGGGATGTATGAGGAGGCT3′/5′-
GTGACAGCGTCGTCTAGTTCC3′)，扩增用于特异性分析的供试病原菌，FocTR4和ST4基因组DNA扩增出大小为242bp的单一条带，其余均无条带（见图3-B）。LAMP显色和电泳分析与Lin等（2009）设计的Foc4号小种特异性检测结果一致，表明RealAmp检测的特异性。ESE-QuantTubeScanner仪器进行RealAmp扩增反应后的扩增曲线有2条，相应编号对应的是以香蕉枯萎病菌热带4号小种和亚热带4号小种DNA为模板的PCR管。
GTGACAGCGTCGTCTAGTTCC3′)，扩增用于特异性分析的供试病原菌，FocTR4和ST4基因组DNA扩增出大小为242bp的单一条带，其余均无条带（见图3-B）。LAMP显色和电泳分析与Lin等（2009）设计的Foc4号小种特异性检测结果一致，表明RealAmp检测的特异性。ESE-QuantTubeScanner仪器进行RealAmp扩增反应后的扩增曲线有2条，相应编号对应的是以香蕉枯萎病菌热带4号小种和亚热带4号小种DNA为模板的PCR管。
[0084] RealAmp灵敏性分析及标准曲线构建：以包含整个RealAmp扩增区间的质粒pMD-18-T-FocR4DNA为模板，10倍梯度系列将pMD-18-T-FocR4基因组DNA从1.2ng/μl依次稀释至-6 -5
1.2×10 ng/μl，以无菌水为阴性对照，结果表明，质粒DNA浓度在1.2ng/μl～1.2×10 ng/μl范围内的RealAmp反应产物SYBR GreenI染色后均显色为绿色，浓度为1.2×10-6ng/μl和阴性对照显色为橙色，表明RealAmp的检测下限为1.2×10-5ng/μl（见图4-B）；2%琼脂糖凝胶电泳检测各个RealAmp管的产物，质粒DNA浓度范围在1.2ng/μl～1.2×10-5ng/μl的产物电泳后EB染色后显示有梯度条带，其余均无梯度条带（见图4-A），表明RealAmp下限为1.2×
10-5ng/μl，浓度低于1.2×10-5ng/μl则检测不出。ESE-Quant Tube Scanner扩增反应后的扩增曲线显示RealAmp可以扩增6个数量级的模板DNA（见图4-C）。不同浓度的起始模板DNA与相应的Tt值之间存在线性关系。以X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模
2
板扩增达到阈值所用的时间（Tt），构建RealAmp检测的标准曲线y=-5.3x+50.3(R=0.9913)（见图4-D）。应用时，只需要知道扩增达到阈值所用的时间（Tt），就能求出土壤中香蕉枯萎病菌4号小种的含量。
1.2×10 ng/μl，以无菌水为阴性对照，结果表明，质粒DNA浓度在1.2ng/μl～1.2×10 ng/μl范围内的RealAmp反应产物SYBR GreenI染色后均显色为绿色，浓度为1.2×10-6ng/μl和阴性对照显色为橙色，表明RealAmp的检测下限为1.2×10-5ng/μl（见图4-B）；2%琼脂糖凝胶电泳检测各个RealAmp管的产物，质粒DNA浓度范围在1.2ng/μl～1.2×10-5ng/μl的产物电泳后EB染色后显示有梯度条带，其余均无梯度条带（见图4-A），表明RealAmp下限为1.2×
10-5ng/μl，浓度低于1.2×10-5ng/μl则检测不出。ESE-Quant Tube Scanner扩增反应后的扩增曲线显示RealAmp可以扩增6个数量级的模板DNA（见图4-C）。不同浓度的起始模板DNA与相应的Tt值之间存在线性关系。以X轴表示起始模板浓度的对数值，Y轴表示不同浓度模
2
板扩增达到阈值所用的时间（Tt），构建RealAmp检测的标准曲线y=-5.3x+50.3(R=0.9913)（见图4-D）。应用时，只需要知道扩增达到阈值所用的时间（Tt），就能求出土壤中香蕉枯萎病菌4号小种的含量。
[0085] RealAmp定量检测土壤样品：采集香蕉枯萎病发病蕉园的土壤和未发病蕉园的土壤6个，进行RealAmp定量检测，设置阳性对照和阴性对照，结果表明，发病蕉园的土壤检测为阳性以及部分未发病蕉园的土壤检测为阳性，可以将本发明的从土壤中环介导等温扩增技术快速检测Focrace4的方法应用到田间。
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